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全长单链 PCR 产物整合到枯草芽孢杆菌体内. 齐鑫. 枯草芽孢杆菌. 芽孢杆菌属的一种,不致病 无荚膜,周生鞭毛,能运动。革兰氏阳性菌,芽孢 0.6 ~ 0.9×1.0 ~ 1.5 微米,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大 菌落表面粗糙不透明,污白色或微黄色,在液体培养基中生长时,常形成皱醭( b ú ) 可利用蛋白质、多种糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚 主要用于工业生产,有的菌株是 α- 淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌. 枯草芽孢杆菌生长条件. 最适温度: 32 ℃ 最适 pH 值: 7.0 最适转速: 120r/min - PowerPoint PPT Presentation
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枯草芽孢杆菌• 芽孢杆菌属的一种,不致病• 无荚膜,周生鞭毛,能运动。革兰氏阳性菌,芽孢 0.6 ~
0.9×1.0 ~ 1.5微米,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大
• 菌落表面粗糙不透明,污白色或微黄色,在液体培养基中生长时,常形成皱醭( b ú )
• 可利用蛋白质、多种糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚• 主要用于工业生产,有的菌株是 α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌
• 枯草芽孢杆菌具有同源重组机制,以前根据这一点研究过:
• gene disruption/replacement• Recombinational cloning• direct repeated (DR) sequences mediated in-
frame deletion • marker rescue system• Multimeric plasmid-based transformation • recombinational capture of PCR products
• 一些研究发现利用引入外源的重组系统比如 Cre system 和 λ Red proteins system,结合电转化,可以有效的进行枯草芽孢杆菌体内的重组。
• Cre system : P1噬菌体感染大肠杆菌,在溶源状态时是单拷贝质粒,在裂解状态时是作为线状双链 DNA包进噬菌体头部中。 P1编码的重组酶 Cre催化两个 loxP位点间的重组,被广泛应用。
• 2010 年,研究发现, λ 重组系统中,利用的是 dsDNA 降解为 ssDNA ,然后才进行重组。
• 这一点和枯草芽孢杆菌一致,外源 dsDNA到细胞表面时候会降解成为 ssDNA ,早在1991 年就发现了。
• 于是就有了一种新的方法• 利用单链 DNA 是否比双链 DNA 更加有效?
转化1 :线性化的 dsDNA2 :先导链 ssDNA3 :后随链 ssDNA4 :正对照: pMA5分别以这四种作为转化的底物,电转到
B.subtilis DL3p , B.subtilis DL3p 是 B.subtilis 168 的一种蛋白酶缺陷型菌株,即可以表达一些特定的蛋白。
计算转化效率方法• 孵育完涂板时,稀释 10000 倍涂在无 kana
的 LB 板上,计算菌落数量。(能成活的细胞数目)
• 正常的实验组,原浓度涂在有 kana 的 LB 板上。(进行正常的筛选)得到 CFU
• 两者数据相除,再除以 DNA 的质量( ug ),得到转化效率,单位为 CFU/ug DNA per viable cell
一些问题• 1. 在之前研究中大肠杆菌 ssDNA 的转化效
率不如 dsDNA 。• 造成的可能原因是 ssDNA 的二级结构不同。• 2.5’ 端的基团可以保护 5’ 端不受降解,明
显可以提高转化效率。
• 过富培养基上培养: 2% (w/v) yeast extract, 2.5% (w/v) tryptone, 3% (w/v) K2HPO4) containing 1% (w/v) starch
• 测定酶的活性使用 p-nitrophenyl 方法,进行分光光度法测量。
• B.subtilis DL3p :• 0.02±0.01 U/mg total protein• 转入 Lip2 基因的 B.subtilis DL3p :• 0.91±0.05 U/mg total protein.