11期 ·2559·

收稿日期：2019-01-14基金项目：上海市协同创新中心基金项目（ZF1206）；南京创业人才“321”计划项目（D-8005-14-0005）作者简介：*为通讯作者：宋增福（1971-），博士，副教授，主要从事水产病害防控技术研究工作，E-mail：zfsong@shou.edu.cn；张庆华

（1972-），博士，教授，主要从事水产动物疾病病原检测及免疫研究工作，E-mail：qhzhang@shou.edu.cn。童文涛（1992-），研究方向为水产微生态制剂研发，E-mail：1065686205@qq.com

具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化

童文涛1，2，陈 彪1，2，彭孟凡1，2，赵 祯1，2，肖 翎1，2，宋增福1，2*，张庆华1，3*

（1 水产科学国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306；2 国家水生动物病原库（上海海洋大学），上海 201306；3 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室（上海海洋大学），上海 201306）

摘要：【目的】优化具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）T-1株的培养基及发酵条件，进一步

提高其产孢量，为今后开发地衣芽孢杆菌制剂（抗菌益生菌）打下基础。【方法】在摇床发酵条件下，采用单因素试验筛

选T-1株的最佳培养条件，并确定影响发酵菌液活菌含量的主要影响因素。根据Plackett-Burman试验结果，筛选出影

响芽孢产量的2个最显著因素，以最陡爬坡试验确定其响应中心点和最佳浓度范围，然后通过Box-Behnken中心组合试

验和响应面分析获得最佳发酵培养条件。【结果】T-1株的最适发酵培养条件为温度37 ℃、盐度0.5%和pH 6.0，在此条

件下T-1株芽孢产量与培养时间呈正相关，在培养48~60 h期间其芽孢产量趋于稳定。在对T-1株芽孢产量影响较大

的6个因子［X1（糖蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5（摇床转速）和X6（接种量）］中，X2（可溶性淀粉）对

T-1株芽孢产量的影响达显著水平（P<0.05），X5（摇床转速）的影响达极显著水平（P<0.01），其他因子的影响均不显著

（P>0.05）。T-1株的最佳培养基为可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%和CaCl2 0.5%，在摇床转速218 r/min的培养条件

下，其芽孢产量较优化前采用初始基础培养基的芽孢产量提高6.25倍。【结论】具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1

株在优化后的发酵培养条件下，其芽孢产量较优化前明显提高，且延长菌株生长的稳定期，加上优化筛选出的培养基

是采用相对廉价且高效的原材料，有效节约了生产发酵成本，可在规模化生产上推广应用。

关键词：地衣芽孢杆菌；培养基；发酵条件；单因素试验；响应面分析法

中图分类号：S917.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2019）11-2559-08

南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2019，50（11）：2559-2566ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp://www.nfnyxb.comDOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.11.25

Optimization of culture media and fermentation conditions ofquorum sensing quenching bacteria Bacillus licheniformis T-1

TONG Wen-tao1，2，CHEN Biao1，2，PENG Meng-fan1，2，ZHAO Zhen1，2，XIAO Ling1，2，SONG Zeng-fu1，2*，ZHANG Qing-hua1，3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education，Shanghai Ocean University，Shanghai

201306，China；2National Pathogen Collection for Aquatic Animals，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，

China；3Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，

Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Abstract：【Objective】To optimize the culture medium and fermentation conditions of Bacillus licheniformis T-1 strainwith quorum induction quenching effect，further increase its spore production，lay the foundation for future developmentof Bacillus licheniformis preparations（antibacterial probiotics）.【Method】The optimum culture condition of T-1 bacterialstrain was screened and chosen in the way of single factor method under the shaking flask fermentation condition，and themain influencing factors affecting the live bacteria content of the fermentation broth were determined. According to theresults of Plackett -Burman test，the two most significant factors affecting spore yield were screened. The steepestclimbing test was used to determine the response center point and the optimal concentration range of the two factors，andthen the box-Behnken center combination test and response surface were used to obtain the best fermentation culture con-ditions.【Result】The optimal culture temperature was 37 ℃，the optimum growth salinity was 0.5% and the optimumgrowth pH was 6. Under this condition，the spore formation was in positive correlation with culture time. The sporulation

50卷南 方 农 业 学 报·2560·

0 引言

【研究意义】细菌的群体感应是其自体诱导现

象，细菌通过感知群体感应信号分子，调控毒力因子

表达及生物膜形成等生理现象（许玉彬等，2013）。

群体感应淬灭可通过降解群体感应信号分子或抑制

其合成而阻断病原菌毒力基因的表达，在不杀死病

原菌的基础上有效降低其致病性（王岩等，2017）。

目前，群体感应淬灭酶包括群体感应信号分子的内

酯酶、酰基水解酶及氧化酶还原酶3种，其中酰基高

丝氨酸内酯酶是发现最早和研究最深入的群体感应

淬灭酶。群体感应淬灭酶最早在芽孢杆菌240B1

（Bacillus sp. 240B1）中发现（Dong et al.，2000），随

后陆续在不同菌属中发现多种淬灭酶基因，包括

attM、ahlD、ytnP、ahlS和aidH等基因（Zhang et al.，

2002；Park et al.，2003；Mei et al.，2010；Morohoshi

et al.，2012；Schneider et al.，2012）。地衣芽孢杆菌

（Bacillus licheniformis）T-1株是国家水生动物病原

库从水产动物肠道分离筛选获得，具有良好的群体

感应淬灭效果，尤其对感染嗜水气单胞菌的斑马鱼

具有良好抗感染能力，具备开发成抗菌益生菌的潜

力（宋增福等，2015；Chen et al.，2019）。因此，优化

地衣芽孢杆菌T-1株的培养基及发酵条件，可为更好

地利用该菌进行后续发酵生产提供技术指导。【前人

研究进展】目前，关于芽孢杆菌培养基优化的研究已

有较多报道，且主要采用常规的正交试验设计进行

优化。洪剑辉（2015）通过正交试验设计对棘孢小单

孢菌产庆大霉素B发酵培养基进行优化，优化后其

产庆大霉素B量较原配方提高20%；刘宽博等（2016）

使用正交试验设计优化枯草芽孢杆菌C3的培养基

组成，优化后枯草芽孢杆菌C3的活菌数达7.1×1010

CFU/mL，细菌浓度提高7.89倍；邵帅（2016）以正交

试验设计优化夏孢生枝孢菌株的发酵条件及培养基

组分，优化后的菌株发酵上清液对黄曲霉毒素B1的

降解率提高1.40倍；Wang等（2017）采用正交试验设

计对食用真菌的发酵培养基进行优化，优化后其发

酵液中的黄酮类和可溶性蛋白分别为1.551和0.691

mg/mL；王忠忠和龚国利（2017）以正交试验设计优

化短小芽孢杆菌株M01抗菌活性物质的发酵工艺，

优化后其抑菌活性提高38.7%；叶碧霞等（2017）采用

正交试验设计对枯草芽孢杆菌的培养基及培养条件

进行优化，优化后的枯草芽孢杆菌数达1.03×1010

CFU/mL；陈海超等（2018）通过正交试验设计优化汉

逊氏葡糖酸醋杆菌培养条件，优化后细胞膜干重的

产量提高3倍；Liu等（2018）采用正交试验设计对巨

大芽孢杆菌的发酵培养基进行优化，优化后的发酵

液用于作物肥料，能使农作物产量提高25.91%；王海

德（2018）通过正交试验设计优化空气芽孢杆菌的培

养基组成，使其活菌数高达7.65×109 CFU/mL，细菌

浓度提高117倍；张同睿（2018）以正交试验设计对多

粘类芽孢杆菌SC2抗细菌活性物质的发酵条件及其

培养基配方进行优化，优化后抗菌物质的最终产量

约提高4倍。【本研究切入点】由于正交试验设计不能

给出明确的函数表达式以确定整个区域的最佳因素

组合及最佳响应值，难以获得理想的优化效果（李姝

江等，2019）；且单因素试验是通过逐个考察各因素

以修正其他因素，但各因素间存在交互作用，因此获

得的最佳条件并非最优条件。响应面分析是一种回

归分析方法，所求得的回归方程精度高，能研究多种

因素间的交互作用，且周期短和试验次数少；同时可

建立数学模型，通过多元二次回归方程来解决最优

组合受多个变量影响的问题（徐敏强，2018）。因此，

利用响应面分析法进行微生物培养基优化可获得良

好的效果，但至今未见以响应面分析法优化地衣芽

孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的研究报道。【拟解

决的关键问题】采用单因素试验和响应面分析法对

具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株的培养基

和发酵条件进行优化，进一步提高其产孢量，为后续

开发地衣芽孢杆菌制剂（抗菌益生菌）打下基础。

rate were stable between 48-60 h. Among the six factors that had great impact on the spore yield of T-1 strains［X1（molas-ses），X2（soluble starch），X3（yeast extract powder），X4（CaCl2），X5（shaker speed），and X6（inoculation amount）］，theeffect of X2（soluble starch）on the spore yield of T-1 strain reached a significant level（P<0.05），the effect of X5（shakerspeed）reached an extremely significant level（P<0.01），and the effects of other factors were not significant（P>0.05）. Theoptimal medium for T-1 strain was 1.11% soluble starch，0.3% yeast extract powder and 0.5% CaCl2. Under the cultureconditions of 218 r/min shaker speed，the spore yield of the T-1 strain was higher than that of the original basic mediumbefore optimization. The spore yield increased by 6.25 times.【Conclusion】Under the optimized fermentation conditions，B. licheniformis T-1 strain with quorum induction quenching can increase its spore yield greatly compared with the origi-nal method. Its stable period of growth also prolongs. Since the optimized media use cheap but high efficient raw materials，the fermentation costs can be reduced. This method can be applied in large-scale production in the future.

Key words：Bacillus licheniformis；media；fermentation conditions；single factor methodology；response surfacemethodology

11期 ·2561·

1 材料与方法

1. 1 试验材料

地衣芽孢杆菌T-1株由国家水生动物病原库筛

选获得，保藏于中国微生物保藏中心，保藏编号

CCTCC M2014049。LB培养基（牛肉膏5 g，蛋白胨

10 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2）

和LB液体培养基（蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠

5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4）自制，碳源（糖蜜、蔗

糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋

白胨）、氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉、黄

豆粉、KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）、无机盐（NaCl、

FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2

和ZnCl2）均为国产分析纯。主要仪器设备：超净工

作台（SJ-CJ-1FD）、恒温培养箱（LHP-100）、高速冷

冻离心机（KT7 - 900 - 430）、振荡培养箱（INNOVA

40R）、紫外分光光度计（UPG-722）和光照培养箱

（MGC-350BP）。

1. 2 T-1株最佳培养条件的单因素试验

1. 2. 1 最佳培养温度 参考陈海超等（2018）的方

法，将过夜培养菌液按1%比例接种到5 mL营养肉汤

试管中（pH 7.0），分别置于20、24、28、32、37、42、46

和50 ℃的摇床上振荡培养18 h后测OD600，确定T-1

株生长的最佳温度。每个温度组设3个平行。

1. 2. 2 最佳pH 参考叶碧霞等（2017）的方法，用

1 mol/L HCl或NaOH将培养基pH调至3.0、4.0、5.0、

6.0、7.0、8.0和9.0，将过夜培养菌液按1%比例接种到

5 mL营养肉汤试管中，置于37 ℃摇床上振荡培养

18 h后测OD600，确定T-1株生长的最佳pH。每个pH

设3个平行。

1. 2. 3 最佳盐度 参照胡桂萍等（2018）的方法，

将过夜培养菌液按1%比例接种到5 mL营养肉汤试

管中（pH 7.0），按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和

8.0%的梯度盐度进行摇床振荡培养18 h后测OD600，

确定T-1株生长的最佳盐度。每个盐度设3个平行。

1. 3 T-1株菌液OD600与活菌数量的关系

参考Ushakiranmayi等（2017）的方法，梯度稀释

待测菌液10-3~10-7，取稀释菌液200 µL均匀涂布于营

养琼脂培养基上，每个梯度重复3次，培养24 h后统

计活菌数。

1. 4 T-1株生长曲线绘制

参考叶碧霞等（2017）的方法，将T-1株的菌液按

1%比例接种到营养肉汤培养基中，37 ℃下摇床培养。

每4 h测量一次菌液OD600，以未接种菌液的培养基为

空白对照，绘制T-1株培养时间与OD600的生长曲线。

1. 5 T-1株活菌数、芽孢数与时间的关系

活菌数测定参考叶碧霞等（2017）的方法，将T-1

株菌液按1%比例接种到营养肉汤培养基中，37 ℃

下摇床培养，采用稀释涂布法分别对培养4、8、12、

16、20、24、36、48、60和72 h后的菌液进行活菌计数，

每个梯度重复3次，测出各时段的活菌数。芽孢数测

定参考Roy等（2013）的方法，将待测菌液置于80 ℃

水浴锅中水浴15 min，然后按活菌计数方法进行计

数，每个梯度重复3次，测量各时段的芽孢产量。

1. 6 发酵培养基组分单因素试验

1. 6. 1 最佳碳源筛选 分别选用葡萄糖、蔗糖、麦

芽糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋白胨作为

唯一碳源（1.0%），以牛肉浸粉为氮源（0.3%），装液

量150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养

54 h。按照碳源不同设8个试验组，每组3个平行，测

量菌液OD600及其芽孢产量。

1. 6. 2 最 佳 氮 源 筛 选 以最佳碳源为碳源

（1.0%），选取5种有机氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、

蛋白胨、玉米粉和黄豆粉）和4种无机氮源（KNO3、

NH4Cl、NH4NO3和尿素）作为氮源（0.3%），装液量

150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养

54 h。按照碳源不同设9个试验组，每组3个平行，测

量菌液OD600及其芽孢产量。

1. 6. 3 最佳无机盐筛选 在最佳碳源和氮源的基

础上，选取NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、

K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7种无机盐（0.5%），装液量

150 mL，接种量3%，37 ℃下摇床（150 r/min）培养

54 h。按照无机盐不同设7个试验组，每组3个平行，

测量菌液OD600及其芽孢产量。

1. 7 响应面分析法优化培养基成分及配比

1. 7. 1 Plackett-Burman试验设计 根据单因素试

验结果，确定6个对芽孢产量影响较大的因子。采用

Minitab 16.0中的Plackett-Burman试验设计筛选发酵

培养基中影响芽孢产量的主要因子，依次设为X1（糖

蜜）、X2（可溶性淀粉）、X3（酵母浸粉）、X4（CaCl2）、X5

（摇床转速）和X6（接种量），每个因素取高低两个水

平（El-Gherab et al.，2018）。

1. 7. 2 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验

设计得出的一次拟合方程确定因素取值中心点，并

确定主要因素的爬坡方向和变化步长；然后根据最

陡爬坡试验中菌液芽孢产量的变化趋势，确定Box-

Behnken试验设计的中心点及最适质量浓度范围

（El-Gherab et al.，2018）。

1. 7. 3 响应面分析 根据最陡爬坡试验结果，确

定Plackett-Burman试验设计中主要因素的最适质量

童文涛等：具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化

50卷南 方 农 业 学 报·2562·

浓度范围。采用Minitab 16.0中的Box-Behnken设计

3因素优化试验，通过响应面分析各因素间的相互

作用。

1. 8 统计分析

采用Excel 2010进行试验数据整理，利用Mini-

tab 16.0对单因素试验结果和响应面分析结果进行

方差分析，并通过最小显著性差异（LSD）进行多重

比较。

2 结果与分析

2. 1 T-1株最佳发酵培养条件的单因素试验结果

由图1-A可看出，菌液OD600随培养温度的升高

呈先升高后降低的变化趋势，于37 ℃时达最高值

（0.425），即T-1株的最佳生长温度为37 ℃。由图1-B

可看出，当pH由3.0逐渐上升至6.0时，菌液OD600随之

升高，但pH继续上升后菌液OD600开始降低，说明T-1

株适合在偏酸性环境下生长，最佳pH为6.0。由图1-C

可看出，当培养基盐度为0.5%时，菌液OD600达最高

值（0.453），但盐度继续增加时菌液OD600开始降低。

由图1-D可看出，当菌液OD600大于0.859后菌液OD600

与活菌数量间的关系趋于直线变化，当菌液OD600为

1.604时，活菌数量达5.0×109 CFU/mL。

2. 2 T-1株活菌数和芽孢产量与培养时间的关系

由T-1株在37 ℃下摇床（150 r/min）培养的生长

曲线（图2-A）可看出，0~4 h为菌株生长的迟缓期，4~

24 h为对数增长期，24~48 h菌株生长达稳定期，48 h

后为衰亡期。由图2-B可看出，T-1株的芽孢产量随

摇床培养时间的延长逐步增加，即与培养时间呈正

相关；培养至48 h后其活菌数呈下降趋势，而芽孢产

量依然呈增加趋势。T-1株的活菌数在培养48~60 h

期间其芽孢产量趋于稳定。

2. 3 T-1株最佳发酵培养基组分的单因素试验结果

2. 3. 1 最佳碳源筛选 以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、

图 1 T-1株最佳培养条件的单因素试验结果Fig.1 The single factor test results for the optimal culture conditions of strain T-1

图 2 T-1株生长曲线及其活菌数和芽孢产量的变化趋势Fig.2 The growth curve，viable count and spore formation capacity of the strain T-1

A：T-1株的生长曲线；B：T-1株活菌数和芽孢产量的变化趋势A：Growth curve of T-1 strain；B：Variation of viable count and spore formation of T-1 strain

温度（℃）Temperature

OD

600

A0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.00020 24 28 32 36 40 44 48 52

OD

600

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.0002.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

pH

B

OD

600

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.0000.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

盐度（%）Salinity

C

活菌数（

×10

9C

FU

/mL）

Via

ble

bact

eria

coun

t 6.0

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800

D

OD600

OD

600

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.00 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60

培养时间（h）Culture time

A

活菌数（

×10

9C

FU

/mL）

Via

ble

bact

eria

coun

t B

芽孢产量（

×10

8C

FU

/mL）

Spo

refo

rmat

ion

培养时间（h）Culture time

0 12 24 36 48 60 72

42.036.030.024.018.012.06.00.0

24.00

20.00

16.00

12.00

8.00

4.00

0.00

芽孢产量（×106 CFU/mL）Spore formation活菌数（×108 CFU/mL）Viable bacteria

11期 ·2563·

乳糖、糖蜜、可溶性淀粉、麸皮粉和蛋白胨等8种碳源

进行单因素试验，结果（表1）显示，可溶性淀粉组和

葡萄糖组的菌液OD600较高，分别为1.308和1.200，而

糖蜜组和可溶性淀粉组的芽孢产量较高，分别为

1.28×108和1.66×108 CFU/mL。综合生产成本及培养

效果，选取可溶性淀粉和糖蜜进行响应面分析。

2. 3. 2 最佳氮源筛选 选用5种有机氮源（牛肉浸

粉、酵母浸粉、蛋白胨、玉米粉和黄豆粉）和4种无机

氮源（KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素）进行单因素试

验，结果（表2）显示，酵母浸粉组的菌液OD600和芽孢

产量均最高，分别为1.853和4.30×108 CFU/mL，因此

选择酵母浸粉为最佳氮源。

2. 3. 3 最佳无机盐筛选 以可溶性淀粉为碳源、

酵母浸粉为氮源，选择NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·

7H2O、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2和ZnCl2等7种无机盐

进行单因素试验，结果（表3）显示，CaCl2组的菌液

OD600和芽孢产量均最高，分别为1.930和6.35×108

CFU/mL，因此选择CaCl2为最佳无机盐。

2. 4 响应面分析结果

2. 4. 1 Plackett-Burman试验结果 Plackett-Burman

试验设计采用n=12，对6个因素（X1、X2、X3、X4、X5和

X6）进行分析，并利用Minitab 16.0对试验结果（表4）

进行统计分析，结果（表5）表明，X2（可溶性淀粉）

对T-1株芽孢产量的影响达显著水平（P<0.05，下

同），而X5（摇床转速）对芽孢产量的影响达极显著水

平（P<0.01）。

2. 4. 2 最陡爬坡试验结果 由表5可知，X2（可溶性

淀粉）对T-1株芽孢产量具有显著负效应，因此最陡

爬坡试验应沿着可溶性淀粉浓度减少的方向进行设

计；而X5（摇床转速）对T-1株芽孢产量具有极显著正

效应，因此最陡爬坡试验应沿着转速升高的方向进

行设计。最陡爬坡试验结果（表6）表明，在可溶性淀

粉1.2%和摇床转速220 r/min附近区域时，T-1株的芽

孢产量达最高值（27.7×108 CFU/mL）。

2. 4. 3 Box-Behnken中心组合试验结果 根据最陡

爬坡试验结果（表6）设计Box-Behnken中心组合试

碳源Carbonsource葡萄糖 Glucose蔗糖 Sucrose麦芽糖 Maltose乳糖 Lactose糖蜜 Molasses可溶性淀粉 Soluble starch麸皮粉 Bran powder蛋白胨 Peptone

菌液OD600

Bactria solutionOD600

1.2001.0211.0430.9461.1631.3080.8291.167

芽孢产量（×108 CFU/mL）Spore formation

1.060.190.561.161.281.660.660.91

表 1 最佳碳源的筛选结果Table 1 The optimum carbon source selection

氮源Carbonsource牛肉浸粉 Beef extract powder酵母浸粉 Yeast extract powder蛋白胨 Peptone玉米粉 Corn flour黄豆粉 Soy flourKNO3

NH4ClNH4NO3

尿素 Urea

菌液OD600

Bactria solutionOD600

1.5991.8531.7431.2231.4010.7930.5520.5430.945

芽孢产量（×108 CFU/mL）Spore formation

0.654.302.050.270.680.490.030.050.27

表 2 最佳氮源的筛选结果Table 2 The optimum nitrogen source selection

表 3 最佳无机盐的筛选结果Table 3 The optimum inorganic salt selection

无机盐InorganicsaltNaClFeSO4·7H2OMgSO4·7H2OKH2PO4

K2HPO4

CaCl2

ZnCl2

菌液OD600

Bactria solutionOD600

1.6211.0171.8761.5431.4651.9300.046

芽孢产量（×108 CFU/mL）Spore formation

3.753.055.602.753.556.350.01

表 4 Plackett-Burman试验设计及结果Table 4 Plackett-Burman experimental design and result

试验Test

123456789101112

因素Factor

X1

-11-1-111-11-111-1

X2

-1-11111-1-11-11-1

X3

11-11-1-1-111-11-1

X4

11-11111-1-1-1-1-1

X5

1-1-1-1-111-1111-1

X6

-1111-1-11-1-111-1

菌液OD600

Bactria solutionOD600

1.8041.1911.2471.0371.1721.4061.8231.3411.7042.0131.6521.298

芽孢产量（×108 CFU/mL）Spore formation

2.151.051.401.031.152.062.431.652.093.032.081.45

运行序OperationorderX1

X2

X3

X4

X5

X6

因素Factor

糖蜜（%）可溶性淀粉（%）

酵母粉（%）CaCl2（%）

摇床转速（r/min）接种量（%）

低水平Lowlevel

11

0.30.51003

高水平Highlevel

22

0.61.02006

效应Effect

-0.0230-0.2087-0.0383-0.13700.51930.0397

T

-0.35-3.14-0.58-2.067.820.60

P

0.7430.0260.5890.0940.0010.576

表 5 Plackett-Burman试验设计各因素水平及效应Table 5 Plackett-Burman design experimental factors leveland effects

童文涛等：具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化

50卷南 方 农 业 学 报·2564·

验，其中可溶性淀粉和摇床转速的中心点分别为X1=

1.2%和X2=220 r/min，具体因素水平设计见表7。对

Box-Behnken中心组合试验结果（表8）进行方差分

析，可知回归模型的决定系数为93.54%，P=0.000，失

拟项P为0.764，表明拟合得到的回归模型显著且无

失拟现象。由表9可知，回归模型的线性和平方对菌

株芽孢产量的影响达显著水平，而交互作用对菌株

芽孢产量的影响不显著；拟合得到的二次回归方程

为Y芽孢产量=10.52+0.51X1-329.20X2-1.05X12-1.05X2

2 +

0.075X1X2。

利用响应优化器对拟合的二次回归方程进行

求值（图4），得知当X1=1.11%、X2=218.43 r/min时，

Y芽孢产量达最大值（10.59）。为进一步验证响应面分析

结果，进行3次重复试验，结果显示T-1株芽孢产量的

平均值为（10.52±4.50）×108 CFU/mL，与理论预测值

相近，说明该回归模型预测结果可靠。与优化前采

用初始基础培养基的T-1株芽孢产量（2.15×108 CFU/

mL）相比，优化后的T-1株芽孢产量提高6.25倍。

3 讨论

抗生素是目前水产养殖行业常用的化学防治

药物，但抗生素易使菌株产生耐药性，毒副作用强且

存在环境污染等缺点，欧盟已于2006年全面停止使

用抗生素作为饲料添加剂应用于水产养殖行业（倪

军等，2018），即目前迫切需要一种新型安全绿色无

污染的抗菌制剂来替代抗生素应用于水产养殖行

业，尤其在生态环境和食品安全越来越受到重视的

背景下，加快新型抗菌制剂的研制对促进水产养殖

业健康发展具有重要意义。在本课题组前期的研究

基础上，本研究采用单因素试验和响应面分析法对

地衣芽孢杆菌T-1株的发酵培养条件进行优化，结果

表明，以酵母浸粉为唯一氮源，T-1株的芽孢产量最

高（4.30×108 CFU/mL），是由于酵母浸粉富含蛋白

质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素和微量元素，

与朱天辉等（2013）的研究结果一致；以CaCl2为唯一

无机盐时，T-1株的芽孢产量明显高于其他无机盐，

是由于Ca2+在细胞中控制其体内的渗透压，且Ca2+是

某些生物酶的激活剂，能保障细胞正常的机体功能

和酶活特性，与林陈强等（2011）的研究结果一致。

编码Code

X1

X2

因素Factor

可溶性淀粉（%）转速（r/min）

水平 Level-1.4140.6343

205

-10.8210

01.2220

11.6230

1.4141.7657234.14

处理序号TreatmentNo.12345

可溶性淀粉（%）Soluble

0.60.81.01.21.4

转速（r/min）Rotation

speed160180200220240

菌液OD600

Bactria solutionOD600

1.6541.7972.1542.3272.298

芽孢产量（×108 CFU/mL）Spore formation

2.957.0512.9027.7016.90

表 6 最陡爬坡试验设计及结果Table 6 The steepest uphill experiment design and results

表 7 Box-Behnken中心组合试验因素设计水平Table 7 Box-Behnken center combination design factor level

表 8 Box-Behnken中心组合试验设计及其结果Table 8 The response surface design and experimental resultof central composite design

表 9 Box-Behnken中心组合试验方差分析结果Table 9 ANOVA of Box-Behnken central composite design

运行序Operationorder12345678910111213

X1

00-11000

-1.41410-10

1.414

X2

00-1100

1.4140-1

-1.414100

菌液OD600

Bactria solutionOD600

1.9711.9701.9431.8142.0421.9671.6721.9731.8131.9391.9012.0321.951

芽孢产量（×108 CFU/mL）Spore formation

11.2010.009.307.60

10.6010.207.908.808.009.008.60

10.608.10

来源 Source回归 Regression线性 LinearX1

X2

平方 SquareX1

2

X22

交互作用 InteractionX1X2

残差误差 Residual error失拟 Lack of fit纯误差 Pure error

df521121111734

Seq SS15.92362.23461.35310.881513.66655.94307.72350.02250.02251.09950.25150.8480

Adj SS15.92367.75000.01527.731513.66657.72357.72350.02250.02251.09950.25150.8480

Adj MS3.184723.875020.015197.731476.833267.723547.723540.022500.022500.157070.083830.21200

F20.2824.670.10

49.2243.5049.1749.170.140.14

0.40

P0.0000.0010.7650.0000.0000.0000.0000.7160.716

0.764

图 4 响应优化器对拟合二次回归方程的求值结果Fig.4 Evaluation of response optimizer to fitting quadratic re-

gression equation

11期 ·2565·

本研究基于单因素试验和Plackett-Burman试

验，筛选出对T-1株芽孢产量影响显著的2个因素分

别是可溶性淀粉和摇床转速，并通过最陡爬坡试验

找出这2个因素的中心点，然后利用响应面分析法中

的Box-Behnken中心组合试验设计筛选出最佳发酵

培养条件。结合T-1株的生物学特性及其培养基优化

条件，发现在温度37 ℃、pH 6.0、可溶性淀粉1.11%、

酵母浸粉0.3%、CaCl2 0.5%、摇床转速218 r/min的条

件下培养54 h，其芽孢产量为10.59×109 CFU/mL，较

优化前初始基础培养基的菌株芽孢产量提高6.25

倍。优化后的培养基能有效提高地衣芽孢杆菌T-1

株发酵产孢数量，保证微生态制剂的含菌量；此外，

优化筛选出的培养基是采用相对廉价且高效的原材

料，有效节约了生产发酵成本，可在规模化生产上推

广应用。

李冠杰等（2018）研究表明，地衣芽孢杆菌YDY

株的最适发酵条件为培养温度 37 ℃、pH 8.0、接种

量体积分数1%。王珊珊等（2018）研究发现，地衣芽

孢杆菌LS-1株的最适培养条件为培养温度40 ℃、初

始pH 12.0、接种量体积分数4%。在本研究的发酵

培养条件下，地衣芽孢杆菌T-1株的生长对数期为4~

24 h，即收集菌体的最佳时间为18~24 h，48 h后开始

进入衰亡期，与刘莹等（2006）研究发现T-1株从培养

21 h后进入衰亡期的结论相比，极大延长了地衣芽

孢杆菌生长的稳定期。T-1株在温度37 ℃、摇床转

速218 r/min的条件下培养48 h，其芽孢产量可达最

大值，与解顺昌等（2015）的研究结果基本一致。可

见，不同菌株的最佳发酵培养条件也不同，且差距较

大，但具体原因有待进一步研究验证。

4 结论

具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株在优

化后的发酵培养条件下，其芽孢产量较优化前明显

提高6.25倍，且延长菌株生长的稳定期，加上优化筛

选出的培养基是采用相对廉价且高效的原材料，有

效节约了生产发酵成本，可在规模化生产上推广

应用。

参考文献：

陈海超，王延斌，熊强. 2018. 醋酸菌发酵产细菌纤维素培养基和培养条件的优化［J］. 食品工业科技，39（3）：117-121.［Chen H C，Wang Y B，Xiong Q. 2018. Optimization offermentation medium and culture conditions of producingbacterial cellulose of Gluconacetobacter hensennii strain［J］. Science and Technology of Food Industry，39（3）：117-121.］

洪剑辉. 2015. 庆大霉素B发酵培养基的优化［J］. 食品与发酵

科技，51（3）：73-75.［Hong J H. 2015. Optimization of gen-tamicin B fermentation medium［J］. Food and FermentationTechnology，51（3）：73-75.］

胡桂萍，石旭平，叶川，双巧云，黎小萍，杨广，施龙清，张建华，曹红妹，饶连英，欧阳雪灵，杨帆 . 2018. 不动杆菌BCL-1固体发酵条件优化及其对茶鲜叶吡虫啉的降解［J］. 中国农学通报，34（20）：151-157.［Hu G P，Shi X P，Ye C，Shuang Q Y，Li X P，Yang G，Shi L Q，Zhang J H，Cao H M，Rao L Y，Ouyang X L，Yang F. 2018. Acineto-bacter sp. BCL-1：Optimization of its solid fermentationandimidaclorpid remediation potential on tea leaves［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，34（20）：151-157.］

李冠杰，王文丽，岳丹丹，赵俊杰，杨金星，慕琦. 2018. 地衣芽孢杆菌YDY高产吲哚乙酸发酵条件的优化［J］. 河南科学，36（1）：70-76.［Li G J，Wang W L，Yue D D，Zhao JJ，Yang J X，Mu Q. 2018. Optimization of high-yield in-dole acetic acid and fermentation conditions of Bacilluslicheniformis YDY［J］. Henan Science，36（1）：70-76.］

李姝江，王淋敏，谯天敏，韩珊，朱天辉. 2019. 利用响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌ZJ20发酵参数［J］. 西北农林科技大学学报（自然科学版），47（2）：88-96.［Li S J，Wang LM，Qiao T M，Han S，Zhu T H. 2019. Optimization ofBacillus velezensis ZJ20 fermentation paramenters by re-sponse surface methodology［J］. Journal of Northwest A &F University（Natural Science Edition），47（2）：88-96.］

林陈强，谢廼鸿，邱宏瑞，郑力，陈济琛. 2011. 地衣芽孢杆菌CHB6高芽孢形成率发酵条件的研究［J］. 热带作物学报，32（9）：1746-1749.［Lin C Q，Xie N H，Qiu H R，ZhengL，Chen J C. 2011. The fermentation conditions for highsporulation rate of Bacillus licheniformis CHB6［J］. Chi-nese Journal of Tropical Crops，32（9）：1746-1749.］

刘宽博，熊利霞，刘慧，张红星. 2016. 抗单增李斯特菌枯草芽孢杆菌C3增菌培养条件优化［J］. 中国酿造，35（2）：48-52.［Liu K B，Xiong L X，Liu H，Zhang H X. 2016.Optimization of proliferation medium composition andfermentation conditions of against Listeria monocyto-genes by Bacillus subtilis C3［J］. China Brewing，35（2）：48-52.］

刘莹，孙荣丹，杨翔华，佟明友，王丽. 2006. 地衣芽孢杆菌LNPU-1发酵条件研究及培养基优化［J］. 食品科技，（8）：28-30.［Liu Y，Sun R D，Yang X H，Tong M Y，WangL. 2006. Study and optimization of conditions on sub-merged fermentation of Bacillus licheniformis LNPU - 1［J］. Food Science and Technology，（8）：28-30.］

倪军，杨圆圆，林汉群，方伟. 2018. 噬菌体在水产养殖动物细菌性病害防控中的应用［J］. 海洋与渔业，（2）：58-59.［NiJ，Yang Y Y，Lin H Q，Fang W. 2018. Application ofphage in prevention and control of bacterial diseases inaquaculture animals［J］. Ocean and Fishery，（2）：58-59.］

邵帅. 2016. 微生物产黄曲霉毒素B1降解酶的发酵过程优化及其降解机制研究［D］. 武汉：湖北工业大学.［Shao S.2016. Optimization of fermentation process of AflatoxinB1-degrading enzyme produced by microorganism andstudy on the mechanisms［D］. Wuhan：Hubei Universityof Technology.］

宋增福，陈彪，郭婧，徐华东，任建峰，张庆华，董迎辉. 2015.具有群体感应抑制作用的地衣芽孢杆菌T-1的动物安全及生态评价［J］. 水产学报，39（9）：1395-1404.［Song ZF，Chen B，Guo J，Xu H D，Ren J F，Zhang Q H，Dong YH. 2015. Animal safety and ecological evaluation of Ba-cillus licheniformis T- 1 with quorum sensing inhibitoryeffect［J］. Journal of Fisheries of China，39（9）：1395-1404.］

童文涛等：具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化

50卷南 方 农 业 学 报·2566·

王海德. 2018. 溶磷解钾菌株的筛选及培养基优化［D］. 泰安：山东农业大学.［Wang H D. 2018. Study on phospho-rus-solubilizing phosphorus - dissolving and potassium-re-moving microorganism［D］. Tai’an：Shandong AgriculturalUniversity.］

王珊珊，陈燕，刘盾，陈玄阳，黄家驷，程爽. 2018. 地衣芽孢杆菌LS-1产蛋白酶发酵条件的优化［J］. 安徽农学通报，24（24）：22 - 24.［Wang S S，Chen Y，Liu D，Chen X Y，Huang J S，Cheng S. 2018. Optimization of fermentationconditions of a protease-producing strain LS-1［J］. AnhuiAgricultural Science Bulletin，24（24）：22-24.］

王岩，于雅萌，张静静，张晓华. 2017. 海洋微生物群体感应与群体感应淬灭的开发利用［J］. 生物资源，39（6）：413-422.［Wang Y，Yu Y M，Zhang J J，Zhang X H. 2017. Exploi-tation and application of quorum sensing and quorumquenching in marine microorganisms［J］. Biotic Resources，39（6）：413-422.］

王忠忠，龚国利. 2017. 短短芽孢杆菌M01产抗菌物质工艺条件优化及其主要抑菌成分探究［J］. 陕西科技大学学报，35（5）：145-150.［Wang Z Z，Gong G L. 2017. Optimiza-tion of technological conditions for production antibacte-rial substances from Brevibacillus brevis M01 and investi-gation of the main antibacterial components［J］. Journal ofShaanxi University of Science and Technology，35（5）：145-150.］

解顺昌，刘扬科，胡国春，成鹏，路广亮，李林. 2015. 地衣芽孢杆菌YTDY_01高产芽孢的培养基优化［J］. 生物技术世界，（10）：1-3.［Xie S C，Liu Y K，Hu G C，Cheng P，Lu GL，Li L. 2015. Optimization of conditions on submergedfermentation of Bacillus licheniformis YTDY-01［J］. Bio-tech World，（10）：1-3.］

徐敏强. 2018. 生物农药多杀菌素生产菌株的选育及发酵工艺优化研究［D］. 苏州：苏州科技大学.［Xu M Q. 2018.Breeding and fermentation researches on Saccharopolysporaspinosa producing biological pesticide of spinosad［D］. Suzhou：Suzhou University of Science and Techno-logy.］

许玉彬，张颖，王淼，王少伟，王刚. 2013. 细菌群体感应研究进展［J］. 河南农业科学，42（12）：16-19.［Xu Y B，Zhang Y，Wang M，Wang S W，Wang G. 2013. Research progresson bacteria quorum sensing［J］. Journal of Henan Agricul-tural Sciences，42（12）：16-19.］

叶碧霞，左勇，傅彬，张晶，张鑫. 2017. 一株枯草芽孢杆菌培养基及培养条件的优化［J］. 食品科技，42（1）：23-28.［YeB X，Zou Y，Fu B，Zhang J，Zhang X. 2017. Optimiza-tion of culture medium and growth condition of Bacillusfrom sweet sauce made of fermented flour［J］. Food Scienceand Technology，42（1）：23-28.］

张同睿. 2018. 多粘类芽孢杆菌SC2发酵条件优化及抑菌物质的分离纯化［D］. 泰安：山东农业大学.［Zhang T R.2018. Optimization of fermentation conditions and purifi-cation of antimicrobial lipopeptides produced by Paeniba-cillus polymyxa SC2 and separation of antibacterial sub-stances［D］. Tai’an：Shandong Agricultural University.］

朱天辉，李姝江，向潇潇，谯天敏. 2013. 地衣芽孢杆菌YB15发酵培养优化的研究［J］. 四川林业科技，34（1）：1-4.［ZhuT H，Li S J，Xiang X X，Qiao T M. 2013. A study of op-timal fermentation culture of Bacillus lincheniformis YB15［J］. Journal of Sichuan Forestry Science and Technology，34（1）：1-4.］

Chen B，Peng M，Tong W，Zhang Q，Song Z. 2019. The quo-rum quenching bacterium Bacillus licheniformis T-1 pro-

tects zebrafish against Aeromonas hydrophila infection［J］. Probiotics and Antimicrobial Proteins. doi: 10.1007 /s12602-018-9495-7.

Dong Y H，Xu J L，Li X Z，Zhang L H. 2000. Aiia，an en-zyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwiniacarotovora［J］. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，97（7）：3526-3531.

El-Gherab F Z R，Hassaine O，Zadi-Karam H，Karam N E.2018. Statistical optimization for the development of aculture medium based on the juice of waste-dates forgrowth of Lactococcus lactis，LCL strain by using thePlackett-Burman and response surface methodology［J］.Waste and Biomass Valorization，10（10）：2943-2957.

Liu J Z，Zhao L，Ma D，Sun X，Liu X L. 2018. Optimizationof solid fermentation process of Bacillus megaterium andits application in crop growth［C］//Liu H，Song C J，RamA. Advances in Applied Biotechnology. Proceedings ofthe 3rd International Conference on Applied Biotechnology.

Mei G Y，Yan X X，Turak A，Luo Z Q，Zhang L Q. 2010.Aidh，an alpha / beta-hydrolase fold family member froman Ochrobactrum sp. Strain，is a novel N-acylhomoserinelactonase［J］. Applied and Environmental Microbiology，76（15）：4933-4942.

Morohoshi T，Tominaga Y，Someya N，Ikeda T. 2012. Com-plete genome sequence and characterization of the N-ac-ylhomoserine lactone-degrading gene of the potato leaf-associated Solibacillus silvestris［J］. Journal of Bioscienceand Bioengineering，113（1）：20-25.

Park S，Lee S J，Oh T K，Oh J W，Koo B T，Yum D Y，Lee JK. 2003. Ahld，an N-acylhomoserineLactonase in Arthro-bacter sp.，and predicted homologues in other bacteria［J］. Microbiology，149（6）：1541-1550.

Roy T，Banerjee G，Dan S K，Ray K A. 2013. Optimizationof fermentation conditions for phytase production by twostrains of Bacillus licheniformis（LF1 and LH1） isolatedfrom the intestine of Rohu，Labeo rohita（Hamilton）［J］.Proceedings of the Zoological Society，66（1）：27-35.

Schneider J，Yepes A，Garcia-betancur J C，Westedt I，MielichB，López D. 2012. Streptomycin-induced expression inBacillus subtilis of YtnP，a lactonase-homologous proteinthat inhibits development and streptomycin production inStreptomyces griseus［J］. Applied and Environmental Mi-crobiology，78（2）：599-603.

Ushakiranmayi M，Muvva V，Sudhakar O，Rama K G V S，Babu R S. 2017. Optimization of operating conditions forthe production of enhanced antifungal metabolites fromStreptomonospora arabica VSM 25 by Full Factorial De-sign［J］. Journal of Young Pharmacists，9（3）：399-409.

Wang Y C，Yuan Z L，Tan X R，Ran Z H，Jin H. 2017. Opti-mization of medium components for the production offlavonoids and soluble protein with Phellinus igniarius inliquid culture［C］//Liu H，Song C J，Ram A. Advances inApplied Biotechnology. Proceedings of the 3rd InternationalConference on Applied Biotechnology.

Zhang H B，Wang L H，Zhang L H. 2002. Genetic control ofquorum-sensing signal turnover in Agrobacterium tumefa-ciens［J］. Proceedings of the National Academy of Scien-ces of the United States of America，99（7）：4638-4643.

（责任编辑 兰宗宝）