VISK Hur går vi tillväga för att analysera virus från

vattenprover?

Oslo Slutkonferens VISK

19 mars 2013

Fredrik Nyström

Agenda

• Problematiken kring virusanalyser i råvatten

• Analysmetodik för virus i:

– Råvatten

– Avloppsvatten

• Erfarenheter och möjligt vidare arbete

Analysering av virus i råvattenprover

• Problem: Direktanalys ej möjlig

– “Normalhalten” av virus i råvatten långt under känslighetsnivån i de molekylära analyserna.

– Någon form av anrikning behövs

Anrikning av virus från råvattenprov

• Stor volym • Låg koncentration

• Liten volym • Hög koncentration

Filtrering av råvattenprov

Norovirus transportegenskaper

• Vi utnyttjar norovirus transportegenskaper

– Dess isoelektriska punkt

– Aggregationsdynamik

– Vidhäftningsförmåga vid olika jonstyrkor

Da Silva et al., 2011. Environmental Science & Technology. “Adsorption and aggregation properties of norovirus GI and GII virus-like particles demonstrate differing responses to solution chemistry. “

Filtreringsmetoden i VISK för råvattenprover

• “Dead-end” filtrering

• Enkel adsorption / eluering

• Tre-stegs isoleringsmetod med två olika filter samt en mikrokoncentrator

Flödesschema

P U M P

F I L T E R

2 u m

Positive control

MNV-1

Flocculation

MgCl2

4.5 l

Source water

200 ul

Molecular analysis

F I L T E R

0 . 4 5 u m

Microconcentration

50,000 kDa

Flödesschema

P U M P

F I L T E R

2 u m

Positive control

MNV-1

Flocculation

MgCl2

4.5 l

Source water

200 ul

Molecular analysis

F I L T E R

0 . 4 5 u m

Microconcentration

50,000 kDa

Recovery: 0.01 – 15 %

Analysöversikt av råvattenprover

Virusanalys av avloppsvatten

• “Lättare” att arbeta med

– Högre viruskoncentrationer

– Enklare upparbetningsmetodik

100 gångers anrikning

PEG-fällning av avlopssvatten

System Biosciences http://www.systembio.com/

PCR METODIK

http://www.gmotesting.com

Erfarenheter av metoden

• Bra effektivitet under utvärdering

• Ojämn effektivitet under provtagning

– Känslig för heterogeniteten hos proverna

• Indikationer på relativt höga koncentrationer, men metodiken ej känslig nog för noggrann kvantifiering

• Vidare metodikutveckling

– Byte av metodik

– Öka provolymerna (ex. ultrafiltrering)

Tack för uppmärksamheten Frågor?

Stort tack till personal vid vattenverk samt avloppsreningsverk som hjälpt i studien. Tack till kollegor inom VISK-projektet.

Ultrafiltrering för detektion av mikroorganismer i vatten

Ronnie Eriksson

Livsmedelsverket

Metodkrav

• Användningsområden

– Kartläggningar

– Utbrottsutredningar

– Beredskap mot antagonistiska händelser

• Detektera virus, bakterier och parasiter från samma prov

• Typer av vatten och önskade volymer

– Dricksvatten, DR, (~200 L)

– Ytvatten, YV, (~40 - 50 L)

– Grundvatten (~100)

Hollow Fiber Ultrafilter

Vattenprov in

Filtrerat vatten Mikroorganismer

Stora molekyler

Filter ”Cut Off” Filter area Filtrering

Rexeed-25SX 30kD 2,5 m2 1,4 L/min

Vattenprov in

Filtrerat vatten

Hollow fiber

Dead End Filtrering

I fält Direkt från kranen Labb

Olika vatten olika resultat

Dricksvatten Sjövatten Eluat Ytråvatten Eluat

Badsjö 20 L Almunge vattenverk 40 L Görvelns vattenverk 40 L

Eluat

200 L Dricksvatten / 40 L Ytvatten -> 500 mL

”Dead end” Filtrering

Sekundär koncentrering DV 500 mL / YV 140-300 mL -> 2mL

Nukleinsyraextraktion 0,4-2 mL -> 50-100 µl

Realtids RT-PCR

Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000

Millipore Centricon-70 Polyetylenglykol (PEG)

Upprening 2 mL -> 2mL

Kloroform:Butanol Ingen

Qiagen QuantiTect Virus Invitrogen UltraSens Tataa Grandmaster Quanta Toughmix

Inhibitionsbortagning Zymo PCR Inhibitor removal Qiagen RNA Cleanup Kit Ingen

Biomeriux NucliSens MiniMAG Qiagen EZ1 Biorobot MN NucleoSpin® Virus

BSA T4 gene 32 protein Ingen

200 L Dricksvatten / 40 L Ytvatten -> 500 mL ”Dead end” Filtrering med ”Back flush” eluering

Sekundär koncentrering DV Centricon-70, 500 mL -> 2 mL

YV PEG, 150-300 mL -> 2 mL

Nukleinsyraextraktion NucliSens MiniMAG, 2 mL -> 100 µl

Realtids one-step RT-PCR Quanta Toughmix, 5 µL = 10 L DV / 0,6-1,2 L YV

Centrifugering ger pellet med bakterier och parasiter. Får även bort fast material.

Upprening Kloroform:Butanol, 2 mL -> 2 mL

Resultat

Utbyte från 40 L ytråvatten

MNV: Murint Norovirus FCV: Felint Calicivirus Noro. GGI: Norovirus Genogrupp I Noro. GGII: Norovirus Genogrupp II MS2: Bakteriofag MS2

VTEC Campylobakter Cryptosp. Giardia

Utbyte (%) 80 60 50 60

MNV FCV MS2

Utbyte (%) 18 12 89/44

Nv. GGI Nv. GGII FCV

Plasm. Ekv/L 100 <150 <100 U

Sensitivitet 200 L dricksvatten

Slutsatser - Filtrerar ”stora” volymer ytvatten (40 L) och dricksvatten (200 L) med UF

- Högt utbyte över UF (~90% MS2)

- Detekterar virus, bakterier och parasiter från samma prov

Problem

• Fortfarande inhibition i PCR som ökar med volymen

• Volymen vi faktiskt analyserar

• Hela eluatvolymen från UF utnyttjas inte till sek. konc.

Vi som arbetar med Ultrafiltrering

Magnus Simonsson

Ronnie Eriksson

Karin Jacobsson

Sofia Persson