Upload
others
View
11
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
T.C SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
MEME KANSERİ HÜCRE HATLARI ÜZERİNE ÖKSE OTU
EKSTRAKTLARININ APOPTOTİK ETKİSİNİN
ARAŞTIRILMASI
Esin SAKALLI ÇETİN
DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN Prof. Dr. Nurten ÖZÇELİK
İKİNCİ DANIŞMAN Prof. Dr. Engin ULUKAYA
2011-ISPARTA
T.C SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
MEME KANSERİ HÜCRE HATLARI ÜZERİNE ÖKSE OTU
EKSTRAKTLARININ APOPTOTİK ETKİSİNİN
ARAŞTIRILMASI
ESİN SAKALLI ÇETİN
DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN Prof. Dr. Nurten ÖZÇELİK
İKİNCİ DANIŞMAN Prof. Dr. Engin ULUKAYA
Bu tez Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi tarafından1741-D-08 Proje numarası ile desteklenmiştir
Tez. No:
2011-ISPARTA
i
ÖNSÖZ
Lisansüstü eğitimim boyunca bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım, tez
çalışmalarım esnasında her türlü yardım, ilgi ve desteğini gördüğüm, öneri ve
eleştirileri ile beni daima yönlendiren değerli danışmanım ve Anabilim Dalı
Başkanımız Sayın Prof. Dr. Nurten ÖZÇELİK’e,
Çalışma konusunun belirlenmesinden, araştırmanın sonuçlanmasına kadar her
aşamasında desteğini ve fikirlerini esirgemeyen Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalından ikinci danışmanım Sayın Prof. Dr. Engin
ULUKAYA’ya,
Doktora tez çalışmalarımda yardımlarını gördüğüm Uludağ Üniversitesi Fen
Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümünden Sayın Yrd. Doç. Dr. Serap ÇELİKLER’e
Sayın Arş. Gör. Ferda ARI’ya Sayın Arş. Gör. Mehmet SARIMAHMUT’a ve Sayın
Yüksek Lisans Öğrencisi Buse CEVATEMRE’ye, Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya
Anabilim Dalından Sayın Uzm. Dr. Dilek ABİ YEĞİN’e ve Sayın Yrd. Doç. Dr.
Arzu YILMAZTEPE ORAL’a, Anadolu Üniversitesi Bitki İlaç ve Bilimsel
Araştırmalar Merkezi’nden (BİBAM) Sayın Doç.Dr. Lütfi GENÇ’e,
Laboratuar çalışmalarım sırasında yardım ve önerileri ile tezime katkıda
bulunan Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyeleri Sayın Prof.Dr. H. Ramazan
YILMAZ’a, Sayın Doç. Dr. Efkan UZ’a, Sayın Yrd. Doç. Dr. Nilüfer ŞAHİN
CALAPOĞLU’na ve Sayın Yrd. Doç. Dr. Pınar ASLAN KOŞAR’a asistan
arkadaşlarım Arş. Gör. Ayşe ALTUNBAŞAK’a ve Arş. Gör. Dilek AŞCI’ya
Çalışmaya mali destek veren Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel
Araştırma Projeleri Yönetim Birimine (1741-D-08) ve Sağlık Bilimleri Enstitüsü
personeline,
ii
İÇİNDEKİLER
ÖNSÖZ ......................................................................................................................... i
İÇİNDEKİLER .......................................................................................................... ii
TABLOLAR DİZİNİ ................................................................................................. v
ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................. vi
RESİMLER DİZİNİ ............................................................................................... viii
1. GİRİŞ ...................................................................................................................... 1
2. GENEL BİLGİLER ............................................................................................... 2 2.1. Meme Kanseri ................................................................................................... 2
2.1.1. Meme Kanserinde Risk Faktörleri .............................................................. 3
2.1.2. Meme Kanserinin Histopatolojik Sınıflaması ............................................ 7
2.1.3. Meme Kanserinin Evrelemesi ..................................................................... 7
2.1.4. Meme Kanseri Tedavisi .............................................................................. 9
2.1.5. Meme Kanserinde Kemoterapi ................................................................... 9
2.2. Viscum album L. Hakkında Genel Bilgiler ....................................................... 9
2.2.1. Viscum album L.’un Sistematiği ............................................................... 10
2.1.2. Viscum album L.’un Genel Özellikleri ..................................................... 11
2.1.3. Viscum album L. Genusunun Bileşikleri .................................................. 14
2.1.3.1. Lektinler ............................................................................................. 14
2.1.3.2. Viskotoksinler .................................................................................... 15
2.3. ÖKSE OTU (Viscum album) Ekstraktının Apoptozis Mekanizması .............. 15
3. GEREÇ ve YÖNTEM .......................................................................................... 22 3.1. Ekstraktların Hazırlanması .............................................................................. 22
3.2. Hücre Kültürü .................................................................................................. 23
3.3. Kullanılan Besiyerleri, Sıvıların Hazırlanması ............................................... 24
3.4. Hücrelerin Sayılması ....................................................................................... 25
3.5. Metiltiazoltetrazolium (MTT) Canlılık Metodu .............................................. 25
3.6. ATP Canlılık Testi ........................................................................................... 26
3.7. Tripan Blue Boyama Yöntemi ........................................................................ 27
3.8. Hematoksilen Boyama Yöntemi ..................................................................... 28
3.9. İkili Boyama (Double Staining) Yöntemi ....................................................... 29
3.10. Western Blot Yöntemi ................................................................................... 31
3.10.1. Hücre Lizisi ............................................................................................ 31
iii
3.10.2. Örnek yüklemesi ..................................................................................... 32
3.10.3. Elektroforez ............................................................................................ 32
3.10.4. Transfer ................................................................................................... 33
3.10.5. Deteksiyon .............................................................................................. 33
4. BULGULAR ......................................................................................................... 35 4.1. MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattında Sitotoksisite MTT ve ATP Canlılık Testi Bulguları ................................................................................. 35
4.1.1. MTT metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Endemik Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri ........................................................ 36
4.1.1.1. 24 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 37
4.1.1.2. 48 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 37
4.1.1.3. 72 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 40
4.1.1.4. İnterferansın Araştırılması ................................................................. 42
4.1.2. ATP Canlılık Metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Endemik Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri .......................................... 44
4.1.3. MTT Metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Ticari Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri ............................................... 44
4.1.3.1. 24 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 45
4.1.3.2. 48 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 47
4.1.3.3. 72 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 48
4.1.3.4. İnterferansın Araştırılması ................................................................. 50
4.1.4. ATP Canlılık Metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Ticari Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri ...................................... 51
4.2. Ökse Otu Ekstraktlarının MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Etkilerinin Mikroskopta Tespiti ................................................................ 52
4.2.1. Tripan Blue Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti ................................... 52
4.2.2. İkili Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti ............................................... 53
4.2.3. Hematoksilen Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti ................................ 55
4.3. MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattında Sitotoksisite MTT ve ATP Canlılık Testi Bulguları .......................................................................................... 59
4.3.1. MTT metodu ile MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Endemik Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri ........................................................ 59
4.3.1.1. 24 saatlik inkübasyon bulguları ......................................................... 60
4.3.1.2. 48 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 63
4.3.1.3. 72 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 64
4.3.1.4. İnterferansın Araştırılması ................................................................. 65
iv
4.3.2. ATP Canlılık Metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Endemik Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri .......................................... 65
4.3.3. MTT metodu ile MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Ticari Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri ....................................................................... 66
4.3.3.1. 24 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 66
4.3.3.2. 48 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 69
4.3.3.3. 72 Saatlik İnkübasyon Bulguları ........................................................ 70
4.3.3.4. İnterferansın Araştırılması ................................................................ 71
4.3.4. ATP Canlılık Testi ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Ticari Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri ............................................... 72
4.4. Ökse Otu Ekstraktlarının MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine Etkilerinin Mikroskopta Tespiti ............................................................................. 72
4.4.1. Tripan Blue Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti ................................... 73
4.4.2. İkili Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti ............................................... 73
4.4.3. Hematoksilen Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti ................................ 76
4.5. Ökse Otu Ekstraktlarının MDA-MB-231 ve MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hatları Üzerine Apoptotik Etkinin Western Blot Metodu ile Tespiti .......... 78
5. TARTIŞMA .......................................................................................................... 79
ÖZET ......................................................................................................................... 86
SUMMARY .............................................................................................................. 88
KAYNAKLAR ......................................................................................................... 90
v
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo 1. Uluslararası patentli ticari ökse otu (V. album) özütleri ve sahip oldukları aktiviteler. .................................................................................................................. 13
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1: Viscum album L.’nin Genel Görünümü ........................................................ 11
Şekil 2. Fas- fas ligand aracılı apoptosiz ................................................................... 18
Şekil 3. Fas reseptörleri ile sitokrom-c salınımı ........................................................ 18
Şekil 4.1. MTT metodu ile MDA-MB-231 hücrelerinin 570 nm’de verdikleri absorbans değerleri .................................................................................................... 35
Şekil 4.2. Endemik ökse otu ekstraktlarının 24. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi ....................................................... 37
Şekil 4.3: Endemik ökse otu ekstraktlarının 48. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi ....................................................... 38
Şekil 4.4: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi ...................................................... 40
Şekil 4.5: Endemik ökse otu ekstraktlarının PH’ları Ökse-Ç: 7.41, Ökse-B: 7.43 ve Ökse-K: 7.39 olarak ayarlandıktan sonra 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi ...................................................... 43
Şekil 4.6: Endemik ökse otu ekstraktlarının hücre ilave edilmeden 24 saat sonra MTT testi ile ölçülmesi .............................................................................................. 43
Şekil 4.7: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin ATP testi ile gösterilmesi ....................................................... 44
Şekil 4.8: Ticari ökse otu ekstraktlarının 24. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi ...................................................... 45
Şekil 4.9: Ticari ökse otu ekstraktlarının 48. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi ....................................................... 47
Şekil 4.10: Ticari ökse otu ekstraktlarının 72 saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi ....................................................... 49
Şekil 4.11: Ticari ökse otu ekstraktlarının hücre ilave edilmeden 24 saat sonra MTT testi ile gösterilmesi .......................................................................................... 51
Şekil 4.12: Ticari ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin ATP testi ile gösterilmesi ....................................................... 52
Şekil 4.13: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin tripan blue boyaması ile gösterilmesi .................................................. 53
Şekil 4.14: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin ikili boyama ile gösterilmesi ............................................................... 54
Şekil 4.15: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin hematoksilen boyama ile gösterilmesi. ................................................ 56
Şekil 4.16: Endemik ökse otu ekstraktlarının 24. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi. .................................................................. 60
vii
Şekil 4.17: Endemik ökse otu ekstraktlarının 48. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi. .................................................................. 64
Şekil 4.18: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi. ...................................................... 64
Şekil 4.19: Endemik ökse otu ekstraktlarının hücre ilave edilmeden 24 saat sonra MTT testi ile ölçülmesi. ............................................................................................. 65
Şekil 4.20: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin ATP testi ile gösterilmesi. ...................................................... 66
Şekil 4.21: Ticari ökse otu ekstraktlarının 24 saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi. .......................................................................... 67
Şekil 4.22: Ticari ökse otu ekstraktlarının 48 saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi. .......................................................................... 70
Şekil 4.23: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72 saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi. .................................................................. 71
Şekil 4.24: Ticari ökse otu ekstraktlarının hücre ilave edilmeden 24 saat sonra MTT testi ile ölçülmesi. ...................................................................................................... 71
Şekil 4.25: Ticari ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin ATP testi ile gösterilmesi. ........................................................................... 72
Şekil 4.26: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre soyu üzerine olan etkisinin tripan blue boyaması ile gösterilmesi. ......................................................... 73
Şekil 4.27: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin ikili boyama ile gösterilmesi. ...................................................................... 74
Şekil 4. 28: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin hematoksilen boyama ile gösterilmesi. ....................................................... 77
Şekil 4.29: Ökse-K ve Helixor-P ökse otu ekstraktlarının 24 ve 48 saat süreyle uygulanan MDA-MB-231 ve MCF-7 İnsan Meme Kanseri hücre hatları üzerine apoptotik etkilerinin western blot metodu ile gösterilmesi.
M: Marker, K: Kontrol, Ö-24: Ökse-K 24 saat uygulama, Ö-48: Ökse-K 48 saat uygulama, H-24: Helixor-P 24 saat uygulama, H-48: Helixor-P 48 saat uygulama .. 78
viii
RESİMLER DİZİNİ
Resim 4.1: MTT testinden önce pozitif kontrol MDA-MB-231hücreleri ................. 36 Resim 4.2: MTT testinden önce negatif kontrol MDA-MB-231 hücreleri ............... 36 Resim 4.5: 48 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x10) ...................................................................... 38 Resim 4.6: 48 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x20) ................ 38 Resim 4.7: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 39 Resim 4.8: 0.5 mg/ml Ökse-B uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 39 Resim 4.9: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 39 Resim 4.10: 0.5 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x20) ...................................................... 39 Resim 4.11: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 39 Şekil 4.12: 0.5 mg/ml Ökse-K uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 39 Resim 4.13: % 2.5 Alkol uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 40 Resim 4.14: % 1.2 Alkol uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 40 Resim 4.15: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x10) ...................................................................... 41 Resim 4.16: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x20) ................ 41 Resim 4.17: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 41 Resim 4.18: 0,5 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 41 Resim 4.19: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 41 Resim 4.20: 0,5 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 72saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 41 Resim 4.21:1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 42 Resim 4.22: 0,5 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 42 Resim 4.23: % 2.5 Alkol uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 42
ix
Resim 4.24: % 1.2 Alkol uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 42 Resim 4.25: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 Hücreleri (x10) ..................................................................... 45 Resim 4.26: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 Hücreleri (x20) ..................................................................... 45 Resim 4.27: 1.675 mg/ml Helixor A uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10) ........................................................................................................... 46 Resim 4.28: 0,5 mg/ml Helixor A uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10) ........................................................................................................... 46 Resim 4.29: 1.675 mg/ml Helixor P uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10) ........................................................................................................... 46 Resim 4.30: 0,5 mg/ml Helixor P uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10) ........................................................................................................... 46 Resim 4.31: 1.675 mg/ml Helixor M uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10) ........................................................................................................... 46 Resim 4.32: 0,5 mg/ml Helixor M uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10) ........................................................................................................... 46 Resim 4.33: 48 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x10) ...................................................................... 47 Resim 4.34: 48 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ................ 47 Resim 4.35: 1.675 mg/ml Helixor A uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 48 Resim 4.36: 1.675 mg/ml Helixor P uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 48 Resim 4.37: 1.675 mg/ml Helixor M uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 48 Resim 4.38: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x10) ...................................................................... 49 Resim 4.39: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ................ 49 Resim 4.40: 1.675 mg/ml Helixor A uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 Hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ..................................................... 49 Resim 4.41: 0,5 mg/ml Helixor A uygulamasından 72saat sonra MDA-MB-231 Hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ..................................................... 49 Resim 4.42: 1.675 mg/ml Helixor P uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 50 Resim 4.43: 0,5 mg/ml Helixor P uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 50 Resim 4.44: 1.675 mg/ml Helixor M uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 50
x
Resim 4.45: 0,5 mg/ml Helixor M uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 50 Resim 4.46: Hoechst ile 72 saat sonra boyanan canlı ve ölü kontrol MDA-MB-231 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 54 Resim 4.47: Propidium iyodür ile 72 saat sonra boyanan ölü kontrol MDA-MB-231 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 54 Resim 4.48: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MDA-MB-231 hücreleri (10x) ................................................ 54 Resim 4.49: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü MDA-MB-231 hücreleri (10x) ......................................................... 54 Resim 4.50: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MDA-MB-231 hücreleri (10x) ................................................ 55 Resim 4.50: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü MDA-MB-231 hücreleri (10x).............................................. 55 Resim 4.51: Hematoksilen ile 72 saat sonra boyanan kontrol MDA-MB-231 hücreleri ..................................................................................................................... 56 Resim 4.52: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MDA-MB-231 Hücreleri (20x) ................................................................... 56 Resim 4.53:1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MDA-MB-231 Hücreleri (10x) ................................................................... 56 Resim 4.54: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x20) ...................................................................... 57 Resim 4.55: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10) ........................................................................................................... 57 Resim 4.56: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10) ........................................................................................................... 57 Resim 4.57: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10) ........................................................................................................... 57 Resim 4.58: 1.675 mg/ml Helixor-A uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 57 Resim 4.59: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 57 Resim 4.60: 1.675 mg/ml Helixor-M uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 58 Resim 4.61: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x20) ...................................................................... 58 Resim 4.62: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10) ........................................................................................................... 58 Resim 4.63: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10) ........................................................................................................... 58 Resim 4.64: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 20) ........................................................................................................... 58
xi
Resim 4.65: 1.675 mg/ml Helixor-A uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 59 Resim 4.66: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 59 Resim 4.67: 1.675 mg/ml Helixor-M uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 59 Resim 4.68: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MCF-7 hücreleri (x10) .................................................................................. 61 Resim 4.69: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ............................. 61 Resim 4.70: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 61 Resim 4.71: 0.5 mg/ml Ökse-B uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ........................................................................... 61 Resim 4.72: 0.16 mg/ml Ökse-B uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 61 Resim 4.73: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 62 Resim 4.74: 0.5 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ........................................................................... 62 Resim 4.75: 0.16 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 62 Resim 4.76: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 62 Resim 4.77: 0.5 mg/ml Ökse-K uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 62 Resim 4.78: 0.16 mg/ml Ökse-K uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 63 Resim 4.79: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MCF-7 hücreleri (x10) .................................................................................. 67 Resim 4.80: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ............................. 67 Resim 4.81: 1.675 mg/ml Helixor-A uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 67 Resim 4.82: 0.5 mg/ml Helixor-A uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 67 Resim 4.83: 0.16 mg/ml Helixor-A uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 68 Resim 4.84: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 68 Resim 4.85: 0.5 mg/ml Helixor-P uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 68
xii
Resim 4.86: 0.16 mg/ml Helixor-P uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 68 Resim 4.87: 1.675 mg/ml Helixor-M uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 69 Resim 4.88: 0.5 mg/ml Helixor-M uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 69 Resim 4.89: 0.16 mg/ml Helixor-M uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10) ...................................................... 69 Resim 4.90: Hoechst ile 72 saat sonra boyanan canlı ve ölü kontrol MCF-7 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 75 Resim 4.91: Propidium iyodür ile 72 saat sonra boyanan ölü kontrol MCF-7 hücreleri (10x) ............................................................................................................ 75 Resim 4.92: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MCF-7 hücreleri (10x) ............................................................ 75 Resim 4.93: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü MCF-7 hücreleri (10x) ..................................................................... 75 Resim 4.94: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MCF-7 hücreleri (10x) ............................................................. 75 esim 4.95: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü MCF-7 hücreleri (10x) .......................................................................... 75 Resim 4.96: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MCF-7 hücreleri (10x) ............................................................. 76 Resim 4.97: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü - MCF-7 hücreleri (10x) ....................................................... 76 Resim 4.98: Hematoksilen ile 72 saat sonra boyanan kontrol MCF-7 hücreleri ....... 77 Resim 4.99: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MCF-7 Hücreleri (20x) ............................................................................... 77 Resim 4.100: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MCF-7 Hücreleri (20x) ................................................................................ 77 Resim 4.101:1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MCF-7 Hücreleri (10x) ................................................................................ 77
1
1. GİRİŞ
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanser tipi olup, kansere bağlı
ölümlerde akciğer kanserinden sonra ikinci sırada yer almaktadır. Son yıllarda meme
kanserinin tanı ve tedavisinde birçok ilacın kullanıma girmesine rağmen tedavinin
etkinliği tatmin edici şekilde artmamıştır. Bu nedenle halen riskli bir hastalık olma
özelliğini koruduğundan daha etkili tedavi şekillerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
Meme kanseri tedavilerinin uzun, pahalı ve bazen organ kaybına neden olması ve
hastalığın çabuk yayılabilmesi kadınlar arasında en önemli sorunlardan birini
oluşturmaktadır. Meme kanserinde erken tanı çok önemlidir. Evreleme açısından
heterojen bir grup olan meme kanserinin hangi evrede olduğu tespit edildikten sonra
uygun tedavi seçeneğine başlanmalıdır. (Spears and Bartlett 2009).
Geleneksel tedavilerde başarı sınırlı olduğundan, kanser hastalarının çoğu
komplementer ve alternetif tıptan köken alan tedavileri denenmektedir. Ökse otu
(Mistletoe, Viscum album L.) preperatları komplementer/ alternatif kanser terapisinin
en sık kullanılan formudur. Avrupa’da bu preparatlar sıklıkla standart kemoterapi
yada radyoterapi ile birlikte adjuvan tedavi protokollerinde kullanılır. Son yıllardaki
çalışmalar, ökse otu ekstraktlarının kültüre edilmiş insan tümör hücreleri ve
lenfositlerinin apoptotik yolla ölümlerini indüklediğini ve immün sistemi uyardığını
göstermektedir. Bu bulgular, pürifiye bileşenlerden ziyade tüm bitki ekstraktının
etkili bir immünositümulant ve anti tümör ajan olduğunu göstermektedir
(Eggenschwiler et al., 2007).
Bu çalışmada, ülkemizde yetişen endemik ökse otunun alt türlerine ait tüm
bitki ekstraktlarının, iki farklı meme kanseri hücre hattı üzerine apoptotik etkisi
araştırıldı. Aynı zamanda bu etki, Almanya’da ticari olarak üretilen ve tedavi
amacıyla kullanılan aynı alt türlere ait ekstraktların etkisi ile karşılaştırıldı. Daha ileri
ki çalışmalar için başlangıç niteliğinde olan bu çalışma ile ökse otunun sitotoksik
etkisinin ortaya konulması hedeflendi.
2
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Meme Kanseri
Bütün dünyada görülme sıklığı gittikçe artmakta olan meme kanseri, kadınlar
arasında en sık görülen kanser türüdür ve kansere bağlı ölüm nedenleri arasında ilk
sıralarda yer almaktadır (Aslan ve ark., 2007). Dünya Sağlık Örgütü (Word Health
Organization, WHO)’ne göre dünya genelinde her yıl 1,2 milyon kişi meme kanseri
tanısı almakta ve 500 000 kadarı bu hastalık nedeniyle hayatını kaybetmektedir (Ries
et al., 2007). National Cancer Instıtue (NCI), ABD genelinde 2008 yılı için
hesaplanan yeni meme kanseri vaka sayısını kadınlarda 182.460, erkeklerde 1990
vaka; beklenen ölümleri ise kadınlarda 40.480, erkeklerde 450 vaka olarak rapor
etmiştir. NCI 2000-2004 verilerine göre her sekiz kadından birinde hayatı boyunca
meme kanseri gelişebileceği ve her otuz kadından birinin meme kanseri nedeniyle
öleceği tahmin edilmektedir (Curado et al., 2003). Meme kanserli hastalarda tüm
evrelere göre 5 yıllık sağ kalım oranı, gelişmiş ülkelerde %73 iken, gelişmekte olan
ülkelerde %53 olarak bildirilmektedir. Aradaki bu önemli fark, gelişmiş olan
ülkelerde tarama mamografisi sayesinde erken tanı ve daha iyi tedavi olanakları ile
açıklanabilir. Meme kanseri fatalite hızı gelişmiş olan ülkelerde %30 (190 000 ölüm
/ 636 000 olgu), az gelişmiş ülkelerde ise %43 (221 000 ölüm / 514 000 olgu) ’dür
(Özmen ve ark., 2009).
Sağlık Bakanlığı verilerine göre, Türkiye’de 2005 yılında kadınlarda en sık
rastlanılan kanser türünün, %35,47’lik insidans ile meme kanseri olduğu
bildirilmektedir. Diğer kanser türleri sırasıyla deri, tiroid ve akciğer kanserleridir.
(http://www.saglik.gov.tr, Erişim tarihi:21.3.2010) Ülkemizde mevcut verilere göre
meme kanseri sıklığının, doğu bölgelerimizde 20/100 000, batı bölgelerimizde ise
40-50/100 000 oranında olduğu tahmin edilmektedir (Özmen ve ark., 2009). Bu
rakamlardan yola çıkılarak, Türkiye’de her yıl meme kanserine yakalanan kadın
sayısının on bin kadar olduğu hesaplanabilir. Ülkenin doğusu ile batısı arasındaki
sıklık farkı, Türkiye’nin batı bölgelerindeki yaşamın batı toplumlarındakine
benzerliğinden (“Westernizing life”) kaynaklanmaktadır. Kadınlarda erken menarş
(<12 yaş), geç doğum (>30 yaş), geç menopoz (>55 yaş), daha fazla hormon
replasman tedavisi alma, daha kısa laktasyon süresi ve beslenme alışkanlıklarındaki
3
değişiklikler, batı tipi yaşam biçiminin meme kanserinin insidans hızının artması ile
ilgili öğeleri arasında sayılabilir (Özmen ve ark., 2009).
2.1.1. Meme Kanserinde Risk Faktörleri
Yaş: Meme kanseri için önemli risk faktörlerinden birisi ilerleyen yaştır.
Meme kanseri tanısı konan kadınlar üzerinde yapılan çalışmalarda, %70’inin yaşının
50 yaş ve üzerinde olduğu ifade edilmekte ve riskin 4 kat daha fazla olduğunun altı
çizilmektedir (Somunoğlu 2007).
Ailesel meme kanseri hikayesi: Meme kanseri aile hikayesi olan kişilerde
meme kanserinin ortaya çıkma yaşı daha erken olup, hastalık bilateral olmaya
eğilimlidir ve hastalığın ortaya çıkışı özellikle annesinde meme kanseri olanlarda
daha da belirgindir (Telo 2006). Yapılan 52 epidemiyolojik çalışmada 80 yıllık
yaşam süresi boyunca meme kanseri oluşma riski %7.8 iken, birinci derece yakınında
(anne, kızkardeş veya kız evlat) meme kanseri hikayesi bulunanlarda riskin %13.3
olduğu, iki tane birinci derece yakında olması halinde ise riskin %21.1’e yükseldiği
gösterilmiştir (Bryant 2004, Campbell 2002, Rogers et al., 2002, Williams et al.,
2002, Smith et al., 2003).
Genetik Etkenler: Tüm meme kanserlerinin %5-10’nu kalıtımsaldır.
Genetik meme kanseri olgularında özellikle BRCA-1(Breast cancer susceptibility
gene-1), BRCA-2 (Breast cancer susceptibility gene-2), RB (Retinoblastoma) ve p-
53 gen mutasyonları etkili olmaktadır. Bunlar, tümör supresör genlerdir ve tahmini
olarak erken ortaya çıkan meme kanserlerinin ailesel grupta olanlarının yaklaşık
%50’sinde önem taşıdıkları bildirilmiştir. BRCA-1 geni, 17. kromozom üzerinde
bulunur, otozomal dominant geçiş gösterir, ailevi meme kanseri ve over kanserinde
etyolojik rol oynadığı kabul edilmektedir. 13. kromozom üzerinde bulunan BRCA-2
geni ailevi olgularda hastalığın erken ortaya çıkışında ve bilateral hastalıkta rol
oynamaktadır (Clamp et al., 2003). 70 yıllık yaşam süresi boyunca, BRCA-1 gen
defektli kadınların %85’inde, BRCA-2 defekti olan kadınların ise %87’sinde meme
kanserine yakalanma riski taşıdıkları bildirilmiştir (Bryant 2004). Resesif
Retinoblastoma geni 13. kromozom üzerinde bulunur ve bu kromozomda
heterojenitenin kaybı premenapozal meme kanserine neden olmaktadır. Kolon
kanserinde olduğu gibi 17. kromozomdaki P53 supressör geni de meme kanseri
4
gelişimin de önemli bir gendir ve genin kaybı ile meme kanseri arasında ilişki olduğu
gösterilmiştir. Yine erb-B–2 onkogeninin meme ve over kanseri prognozunu
belirlemede önemli bilgiler verdiği gösterilmiştir (Clamp et al., 2003).
Kişisel Meme Kanseri Hikayesi: Daha önce meme kanseri geçiren ve
tedavi olan kadınların, diğer memelerinde kanser gelişme olasılığının meme kanseri
teşhisi konulmamış kadınlara göre 3-4 kat daha fazla olduğu ifade edilmektedir
(Manjer et al., 2000, Campbell 2002)
Doğurganlık Hikayesi: Hiç doğum yapmamış ya da evlenmemiş
kadınlarda meme kanseri görülme olasılığı 1,4 kat daha fazla olduğu gösterilmiştir
(Darendeliler 1997). Kadınların ilk hamileliği ve ilk çocuğunu doğurma yaşı meme
kanserine yakalanma açısından önemlidir. Hamileliğin ilk üç aylık döneminde kan
östradiol düzeyindeki hızlı artış, ilk hamilelikte, takip eden hamileliklere nazaran çok
daha belirgindir. Artmış östradiol düzeyi kişi için kısa zamanda çok sayıda ovulatuar
dönem geçirmeye eşdeğerdir (Telo 2006). İlk hamileliğin yıllar boyunca prolaktin
düzeyinin düşük kalmasını sağladığı gösterilmiştir. Doğum yapmış kadınlarda
prolaktin düzeyinin, doğum yapmamış kadınlara göre daha düşük olmasının, erken
yaşta ilk doğumun koruyucu etkisini kısmen açıklayabilir (Telo 2006). Tam bir
gebelik yaşamayan bir kadında gebelik yaşayan bir kadına göre 1,5-2,5 kat risk artışı
söz konusudur. Artmış çocuk sayısıyla da riskin azalacağı gösterilmiştir (Yoo et al.,
2002). İlk çocuğunu 30 yaşından sonra doğuran kadınlarda meme kanseri görülme
oranı 20 yaşından önce doğuranlara göre iki kat daha fazla olduğu bildirilmiş olup en
fazla risk taşıyan grubun ise 35 yaşından sonra çocuk sahibi olan kadınların olduğu
ve bunların hiç çocuk sahibi olmayanlardan da daha fazla risk taşıdıkları
bildirilmiştir. (Russo et al., 2000, Campbell 2002; Clavel-Chapelon and Gerber 2002,
Cuzick 2003; Özdemir ve Çalışkan 2002)
Laktasyon: Postmenopozal kadınlardan, gebelik geçirmiş ve emzirmiş
olanlarda meme kanseri riski 4-7 kat azalmıştır. Emzirme süresinin artması ile risk
negatif bir ilişki içerisindedir (Yoo et al., 2002). Bir çalışmada 4–12 ay arasında
emziren kadınlarda riskin %11, iki sene veya daha fazla emzirenlerde ise %25
oranında azaldığı gösterilmiştir (Telo 2006).
Erken menarş: Kadınların adet görmeye erken yaşta başlamaları, bununla
birlikte ilerleyen yaşlarda menopoza girilmesi fertil çağı uzatmaktadır. Bu sırada
5
kadının daha uzun süre östrojen hormonu etkisi altında kaldığı bunun da meme
kanseri gelişme riskini yükselttiğine işaret edilmektedir (Manjer et al., 2000,
Campbell 2002; Clavel-Chapelon and Gerber 2002, Özdemir ve Çalışkan 2002,
Cuzick 2003, Kruk and Aboul-Enein 2003).
Geç menapoz: Geç menapoz da meme kanseri görülme olasılığını
arttırmaktadır. 55 yaşından sonra menapoza girenlerde 45 yaş öncesi girenlere oranla
2–4 kat artmış meme kanseri riski gösterilmiştir (Bernstein etal., 1994, Berkey et al.,
1999). Aktif menstruasyon dönemi 40 yıl ve daha fazla süren kadınların meme
kanser riski, aynı dönemi 30 yıl ya da daha az olan kadınlara göre iki kat daha
fazladır (Yoo et al., 2002).
Östrojen Replasmanı: Menopoz nedeniyle uzun süre (10 yıldan fazla)
östrojen tedavisi gören kadınlarda meme kanseri görülme riskinin yükseldiği ifade
edilmektedir (Manjer et al., 2000, Clavel- Chapelon and Gerber 2002, Cuzick 2003,
Driedger and Eyles 2001).
Doğum Kontrol Hapı Kullanılması: Oral kontraseptifler (OKS) ve
postmenopozal hormon replasman tedavisi gibi ekzojen seks steroidlerinin meme
kanseri riski ile ilişkisi olduğu rapor edilmiştir. Östrojen içeren OKS’lerin
ovulasyonu suprese ederken, meme hücrelerini de stimüle ederek, kanser riskini
arttırdığına dair düşünceler hala çelişkilidir (Clamp et al., 2003). 10 yıl boyunca OKS
kullanan genç bir kadında hiç OKS kullanmayan bir kadına göre meme kanseri
oluşma riski %36 artmaktadır (Telo 2006). Her ne kadar bu hapları kullanan
kadınlarda meme kanserine yakalanma açısından bir risk artışı olduğu ileri sürülse
de, 10 yıl önce doğum kontrol hapı kullanmayı bırakmış olan kadınlarda bu riskin
tamamen ortadan kalktığına da işaret edilmektedir (Driedger and Eyles 2001, Clavel-
Chapelon and Gerber 2002, Cuzick 2003).
Bunlarla birlikte çevresel faktörlerin de meme kanserine yakalanma riskini
yükselten faktörler arasında sayılmasının mümkün olduğuna dikkat çekilmektedir.
İyonizan Radyasyon: Puberte ve 30 yaş arası radyasyon tedavisi
alanlarda belirgin meme kanseri riski mevcuttur. Bu meme dokusunun en aktif ve
radyasyonun karsinojenik etkilerine en duyarlı olduğu dönemdir. Radyoterapinin bu
yaşta risk arzeden bir faktör olması hormon temelinde gerçekleşmesine bağlı olabilir
(Clemons et al., 2000).
6
Beslenme: Meme kanserinde uluslararası farklılıklar risk olarak dietsel
sebepleri akla getirmiştir. Çeşitli araştırıcılar yağdan fakir, meyve, sebze, lif ve
kompleks karbonhidratlardan zengin beslenmenin meme kanseri için daha düşük risk
olduğunu tespit etmişlerdir. Liften zengin gıdaların bağırsaktan östrojen
absorbsiyonunu engelleyerek meme kanserini önleyebileceği düşünülmektedir
(Scmizu et al., 1990).
Vücut Ağırlığı: Postmenapozal meme kanseri gelişim riski, kilolularda
veya obezlerde, zayıflara göre %30-%50 daha fazla bulunmuştur. Menapoz sonrası
adipoz dokunun asıl olumsuz yanı androjenlerin aromatizasyonu ile östrojen
üretmeleridir. (Ziegler et al., 1996, McTiernan 2003, Clamp et al., 2003).
Premenapozal dönemde tam ters olarak obezite ile daha düşük meme kanseri riski
olduğu gösterilmiştir (McTiernan 2003). Obez premenapozal kadınlarda uzamış
menstruasyon siklusları ve anovulatuar sikluslara eğilim, hedef meme hücrelerinde
net östrojen etkisinin azalmasına neden olduğu düşünülmektedir (Ziegler et al., 1996)
Alkol: Epidemiyolojik birçok çalışmada orta yada ağır dereceli alkol
alımıyla meme kanseri gelişim riskinin arttığı ve doza bağlı olarak riskin yükseldiği
saptanmıştır (McTiernan 2003). Alkol tüketimi ne olursa olsun hem premenapozal
hem de postmenapozal meme kanseri için artmış riskin olduğu gözlenmiştir. Alkol
alımı; folat, beta-karoten ve vitamin C gibi besinlerin alımını asgariye indirdiğinden
zararları belirgin hale getirmektedir. Alkolün, karsinojen detoksifikasyonunu inhibe
ederek, karsinojenlerin karaciğerdeki klirensini bozarak, DNA hasarına yol açarak
veya inaktif metabolitleri aktif hale getirerek, kokarsinojen olarak rol oynadığı
düşünülmektedir (Singletary and Gapstur 2001).
Sosyoekonomik durum: Sosyoekonomik açıdan düşük düzeyde bulunan
kişi ya da toplumlarda meme kanseri görülme oranı daha azdır. Sosyoekonomik
yönden gelişmiş toplumlarda meme kanserinin daha fazla görülme nedenleri arasında
doğurmama, emzirmeme, aşırı yağ tüketimi, alkol tüketimi sayılabilir (Özmen ve
ark., 2009)
7
2.1.2. Meme Kanserinin Histopatolojik Sınıflaması
I- Meme başının Paget hastalığı
II- Meme duktusları karsinomu
A-Noninfiltratif
B-İnfiltratif
1-Prodüktif fibrozis ile birlikte olan adenokarsinoma
2-Medüller karsinom
3-Komedo karsinom
4-Kolloid karsinom
5-Papiller karsinom
6-Tübüler karsinom
III- Lobüler karsinom
A- Noninfiltratif
B- İnfiltratif
IV- Memenin nadir karsinomları
V- Meme sarkomu (Haagensen 1986)
2.1.3. Meme Kanserinin Evrelemesi
TNM Sistemi (American Joint Committee’ye göre evreleme)
T : Tümör
N : Nodül
M : Uzak metastaz
T0: Tümör çok küçük palpe edilebilir değil
T1: 2 cm’den küçük tümör, hiçbir fiziksel belirti yok
T2: 2 cm’den büyük tümör, deride çekilme ve meme başında retraksiyon
8
T3: Tümörün boyutları 5 cm veya 5 cm’den büyük, cilt infiltrasyonu, deri
ödemi mevcut
T4: Tümörün boyutları belirsiz, cilt, meme başı retraksiyonu, ciltte
ülserasyon, pektoral kaslara veya göğüs duvarına infiltrasyon mevcut
N0: Koltuk altı gangliyon palpe edilmiyor
N1: Koltuk altı gangliyon 1 veya 2 palpe ediliyor, mobil
N2: Gangliyon 2’den fazla, kısmen mobil
N3: Koltuk altı gangliyon dolu, fiske
M0: Metastaz yok
M1: Metastaz bir yerde
M2: Metastaz birden fazla yerde
Evre TIS : İn situ karsinom
Evre I : T1 N0 M0
Evre II : T0 N1 M0
T1 N1 M0
T2 N0 M0
T2 N1 M0
Evre III a : T0 N2 M0
T1 N2 M0
T2 N2 M0
T3 N0 M0
T3 N1 M0
T3 N2 M0
Evre III b : Herhangi T N3 M0
Evre IV : Herhangi T herhangi N M1 (Rohan et al., 1993)
9
2.1.4. Meme Kanseri Tedavisi
Meme kanserinin tedavisinde kullanılan yöntemler temel olarak;
1) Cerrahi: Kanserli dokuyu ve çevresindeki invazyon riski taşıyan bir miktar
sağlıklı dokuyu alıp çıkartma işlemidir. Bazı durumlarda kanserli dokuyu cerrahi
müdahale ile çıkarmak imkânsız olabilir. Bu durumda radyoterapi veya kemoterapi
uygulanır.
2) Radyoterapi (Işın tedavisi): Uygun dozda ışın uygulayarak kanser
hücrelerinin öldürülmesi işlemidir.
3) Kemoterapi: Kanser hücrelerini öldürmek ya da tümör büyümesini
durdurmak üzere farklı ilaç veya ilaç kombinasyonlarının kullanılmasıdır.
4) Hormon Tedavisi: Kanser hücrelerinin büyümek için gereksinim duyduğu
hormonları engellemek amacı ile uygun hormonların hastaya verilmesi yöntemidir.
5) Adjuvan Tedavi: Bağışıklık sistemini güçlendirici, asıl tedaviye destek
olan yöntemler (Arı 2010).
2.1.5. Meme Kanserinde Kemoterapi
Meme kanserinde sistemik tedavinin esasını kemoterapi oluşturur. Tek başına
kullanılan sitotoksik ajanların çoğu ile vakaların % 20-35’inde kısmi yanıt (nadiren
tam) alınır. Remisyon sıklıkla 4-6 ay sürer. Kemoterapide genellikle birden fazla ila-
cın kombinasyonu kullanılır. Çünkü çoklu ilaç kullanımının kemoterapide daha etkili
olduğu belirlenmiştir (Sayek 2004). Metotreksat (M) 5-fluorourasil (F),
siklofosfamid (C), epirubisin (E), adriamisin (A) başlıca antikanser ilaçlar olup,
CMF, FAC, FEC, AC gibi kombinasyonları tedavide kullanılmaktadır. İkinci
kademede kemoterapi ilaçları ise vinerelbin ve taksanlardır (dosetaksel, paklitaksel).
Yine mitomisin C ve prednizon son evre hastalarda kullanılan ajanlardandır
(Vaclavikova et al., 2003, Sayek 2004, Mavroudis et al., 2009).
2.2. Viscum album L. Hakkında Genel Bilgiler
Tıbbi bitkilerden biri olan ökse otu (Viscum album) saçak köklerinin
yardımıyla köknar, çam, ladin gibi iğne yapraklı; elma, erik, kayısı, kiraz gibi meyve;
10
kavak kestane, kızılağaç, mese, söğüt gibi kış aylarında yapraklarını döken ağaçların
veya çalıların üzerinde yetisen yarı parazit bir bitkidir. Dallar üzerinde kümeler
halinde yetişir ve her mevsim yeşildir (Baytop 1984).
Ağustos-kasım aylarında meyve verir, meyveleri yaklaşık 1 cm çapında, küre
veya armut şeklinde, etli, beyazımsı, şeffaf ve tek tohumludur. Meyvelerinin
yapışkan, kaygan ve beyaz renkli olması nedeniyle Latince’de Viscum album olarak
adlandırılmıştır. Türkçe’de ‘Ökse otu’ olarak adlandırılması ise, kuşları yakalamak
amacıyla Viscum album’un meyvelerinde bulunan ‘vissin’ adlı yapışkan maddenin
çubuklar üzerine sürülerek ökse yapımında kullanılmasındandır (Baytop 1984, Ergun
ve Deliorman 1995).
Bu meyvelerin etli ve yumuşak olması, kuşlar tarafından beğenilerek
yenmesine sebep olur (Mandacı 1998). Meyveleri yiyen kuşların dışkılarıyla birlikte
ağaç dallarına düşen tohumlar üzerindeki yapışkan madde sayesinde dallara
yapışmakta ve ortamdaki ürik asit sayesinde çimlenip gelişmektedir (Becker 1986).
Dal üzerinde kabuk içlerine doğru emeçlerini salarak ksilem iletim demetlerinden
besin maddelerini alarak gelişir. Konakçıdan su ve minareleri alırken, fotosentez
yaparak kendi karbonhidratlarını üretir (Ergun ve ark., 1994, Becker 1986).
Avrupa’ da yetişen ve “European misletoe” olarak isimlendirilen Viscum
album L., Türkiye’de ökseotu, burç, purç, çekem, gevele, gökçe otu, gökçe, gövelek,
güvelek, çampir, gelimkara, pura, biriç ve fitri isimleriyle bilinmektedir. Tüm
dünyada genel olarak “mistletoe” adı kullanılır. Almanya’da “mitsel” haricinde
kullanılan diğer isimler; “gemeine nistel”, “weissemistel”, “alfolter”, “künt”:
İngiltere’de “mistletoe”, “mistle”, “masslinn”, “allheal”; Fransa’da “gui”, “gui
commun”, “morve”; İspanya’da “visco commun”, “almuerdago”, “alfueyo”;
İtalya’da “visco” , vischio”, “scaaggine” isimleri kullanılmaktadır (Önay 2002).
2.2.1. Viscum album L.’un Sistematiği
Divisio : Spermatophyta
Subdivisio : Angiospermae
Clasis : Dicotyledoneae
11
Subclasis : Rosidae
Ordo : Santalales
Form : Loranthaceae
Genus : Viscum album L. (Davis 1982).
Şekil 1: Viscum album L.’nin Genel Görünümü.
2.1.2. Viscum album L.’un Genel Özellikleri
Ökse otu Kuzey Avrupa’dan, Kuzeybatı Afrika’ya; Avrupa’dan Doğuya;
Güneybatı ve Orta Asya’dan Japonya’ya kadar geniş bir alanda yaşamaktadır.
Türkiye’de de çok geniş bir dağılım göstermekte ve bütün bölgelerde yetişmektedir
(Ergun ve ark., 1994, Miller 1982).
Ülkemizde Viscum cinsi, bir tür ve bu türe ait 3 alt tür ile temsil edilmektedir.
1. Viscum album ssp. album: Çoğunlukla yaprak döken diotik ağaçlar
üzerinde yaşar. Tohumlar genellikle üç köşeli, meyve çoğunlukla küresel, yaprak
boyu, eninin dört katından daha kısa. Yaprakları 1-3.7 cm boyunda, oblong, tam
kenarlı, paralel damarlı, derimsi, sarı-yeşil renktedir. Meyve genellikle küre şeklinde
etli, beyaz renkli, tek tohumlu. Edirne, Tekirdağ, Ankara, Çorum, Eskişehir ve
Isparta’da yetişir (Ergun ve ark., 1994, Davis 1982).
2. Viscum album ssp. abietis: Abies türleri üzerinde yaşar. Tohumlar oblong,
bombeli kenarlı, meyve çoğunlukla armut şeklinde, yaprak boyu, eninin dört
katından biraz uzun veya kısadır. Meyve sarı, yaprak boyu eninin dört katından daha
uzundur. Yapraklar 2.2-4.9 cm boyunda, oblong tam kenarlı 4-5 paralel damarlı,
12
derimsi, sarımsı- yeşil renktedir. Meyve ve tohum Viscum album L. ssp.
austriacum’a benzer şekildedir. Bolu’da yetişir (Ergun ve ark., 1994, Davis 1982).
3. Viscum album ssp. austriacum: Çoğunlukla Pinus türleri üzerinde yaşar.
Tohumlar oblong, bombeli kenarlı, meyve çoğunlukla armut şeklinde, yaprak boyu,
eninin dört katından biraz uzun veya kısadır. Meyve beyaz, yaprak boyu, eninin dört
katından daha kısa olup yaprakları 0.7-3.8 cm boyunda, oblong, tam kenarlı, 4-5
paralel damarlı, derimsi, yeşil renktedir. Meyve armutsu, etli, sarımsı renkli, tohum
tek, oblong, bombeli kenarlıdır. Ankara’da yetişir (Ergun ve ark., 1994, Davis 1982).
Yurdumuzda yaygın olan ve daha çok ılıman bölgelerde, ormanlık alanlarda
çeşitli ağaçların ve çalıların üzerinde yarı parazit olarak gelişen, 300-2000 m
yüksekliklerde rastlanılan bitki, Akdeniz Bölgesinde Isparta’da; Gelendost-Eğridir
arası, Eğridir Yukarı Gökdere Köyü-Sarı belen, Eğridir-Isparta yolu, Eğridir Yaka
Köyü Kapızderesi üstü kayalık yer civarında bol miktarda bulunmaktadır (Ergun ve
ark., 1994, Davis 1982).
Ökse otu çok eski bir tarihe sahiptir. Eski çağlarda Kuzey Avrupa’da yaşayan
Druidler ve diğer Pagan milletleri; özellikle ökse otunun meşe ağaçlarını enfekte
etmesi ve bu olayın nadir görülmesi sebebiyle, bitkiye karşı büyük saygı
duymuşlardır. Bitkinin tuhaf bir şekilde toprakta değil de ağaçların üzerinde
yetişmesi bitkiyi ilginç hale getirmiştir. O tarihten günümüze ökse otuna duyulan bu
saygı Hıristiyan geleneği olan Noel’de kapı girişlerine ökse otu asma geleneğine
dönüşmüştür (Walker 1983). İlk olarak M.Ö 305 yılında Yunanlı botanikçi
Theophrastus tarafından parazitik bir bitki olarak tanımlanmıştır. Carl Unnaeus’da
18. yy. da temel bir Avrupa türü olarak tanımlamış ve Viscum album olarak
isimlendirmiştir (Gill 1953), 20. yüzyılın başlarında Avustralyalı tıp doktoru Rudolf
Steiner (1861-1925) ökseotunun tedavi amaçlı kullanılması amacıyla değişik öneriler
getirmiş ve alternatif (antroposofikal) tıp ilaçları geliştirmiştir. Rudolf Steiner,
hastalara enjekte edilebilecek ökseotu özütleri çıkararak kanser hastaları üzerinde
alışılmamış tedavi yöntemleri kullanmıştır. Steiner böylece ökse otunun özellikle
kanser tedavisi ve modern bilim dünyasında ki araştırmalarda kullanılmasını
sağlamıştır (Urech 1993). Steiner’in bu çalışmaları Almanca konuşan ülkelerde
alternatif tedavi yöntemi olarak yaygınca kullanılmaya başlamıştır (Habeck 2003).
13
Ökse otundan elde edilen farklı ekstraktlar vazodilatör, sedatif, diüretik gibi
farmakolojik özellikleri nedeniyle halk arasında şiddetli baş ağrısı, baş dönmesi, sinir
bozukluğu, damar tıkanıklığı, romatizma ağrıları, çıban ve eklem iltihabı gibi bazı
hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır (Baytop 1984, Yesilada ve ark., 1998).
Ökse otu bitkisinden hazırlanan özütler tedavi amacıyla kullanılmak üzere
Almanya, Avusturya ve İsviçre’deki çeşitli firmalar tarafından tüm dünyaya
pazalanmaktadır. Bu ticari ürünler pek çok araştırmaya konu olmuş ve sahip
oldukları aktiviteleri bilim çevrelerince de desteklenmiştir (Tablo 1). Özütün
hazırlanma şekli ve bitkinin üzerinde yasadığı konakçı ağacın türüne göre bu
özütlerin kimyasal içerik açısından farklılık gösterdiği vurgulanmaktadır.
Tablo 1. Uluslararası patentli ticari ökse otu (V. album) özütleri ve sahip oldukları
aktiviteler.
Özüt Aktivitesi Kaynaklar Iscador ® Antikanser Maier G and Fiebig HH. 2002, Van Huyen JP
et al. 2002, Jach R et al. 2003, Kuttan G and Kuttan R. 1993
Doğal öldürücü hücreleri indükleyici
Kovacs E and Kuehn JJ. 2002, Stoss M et al. 1999
Kemoterapi ve radyasyonun etkisini azaltıcı
Harmsma M et al. 2004
İmmünmodülatör (immün sistemi düzenleyici)
Van Huyen JP et al. 2002, Maier G and Fiebig HH. 2002
Sitotoksik Kuttan G and Kuttan R. 1993 İmmünositümülan Stoss M et al. 1999, Kast A and Hauser SP.
1990 Anti -HIV Van Huyen JP et al. 2002, Mueller EA and
Anderer FA. 1990 Antinoeplastik Doser C et al. 1989 Helixor ® Antikanser Bussing A et al. 1999 Doğal öldürücü hücreleri
indükleyici Harmsma M et al. 2004, Stein GM and Berg PA. 1999
Sitotoksik Kunze E et al. 1997 İmmünositümülan Zarkovic N et al. 2001, Bussing A et al. 1998 İmmünmodülatör Zarkovic N et al. 2001, Bussing A et al. 1998,
Ziska P et al. 1991 Plenosol ® İmmünmodülatör Bussing A et al. 1998 Iserol ® Antikanser Hajto T et al. 2005 İmmünmodülatör Hajto T et al. 2005 Vysorel ® İmmünmodülatör Bussing A et al. 1998 Eurixor ® İmmünmodülatör Bussing A et al. 1998
14
2.1.3. Viscum album L. Genusunun Bileşikleri
Lektinler, alkaloidler, viskotoksinler, polisakkaritler, flavonoitler, fenolik
asitler, poliholozitler, fenilpropanlar ve lignanlar ökse otundaki aktif bileşenlerdir.
Bitkinin sitotoksik etkisinin ortaya konulduğu çalışmalarda lektinler ve
viskotoksinler ön plana çıkmaktadır (Ergun ve Deliorman 1995).
2.1.3.1. Lektinler
Ökse otu ekstraktında, 1000’den fazla protein içinde en iyi tanımlananı
lektinlerdir. Bunlar farklı şekerlere bağlanabilme özellikleri ile lektin I, II ve III
olmak üzere 3 gruba ayrılır. Lektin I, Dgalaktoza bağlanır; lektin II, D-galaktoz ve
Nasetil galaktozaminin her ikisine; lektin III, Nasetil galaktozamine bağlanır. Bu 3
çesit lektinin, tümör hücre kültürlerinde oldukça toksik olduğu bildirilmistir (Ziska et
al., 1991).
Ökse otu lektinleri, heterodimerik bitki toksinlerindendir. A ve B zincirleri
olmak üzere 2 farklı glikoprotein zincirden oluşurlar. İki zincir birbirine disülfit
bağlarıyla bağlanmıştır. B zinciri 34 kDa molekül ağırlığında bir proteindir, seker
bağlayan reseptörleri ile hücre yüzeyindeki seker uçlarına bağlanarak tüm lektinin
hücre içine girmesini sağlar. A zinciri 29 kDa ağırlığındadır, tüm aminoasit zinciri
tanımlanmış ve tip 2 ribozom inaktive eden proteinler olarak bilinen bitki
toksinlerinden abrin ve ricinle ilişkili olduğu bulunmuştur. Tüm lektinin hücre içine
girmesinden sonra, A zinciri 28S rRNA da tek adenozin rezidüsünü depürinize
ederek 60S ribozomal alt üniteyi katalitik olarak inaktive eder. A zinciri de ricin gibi,
sitotoksik etkisini protein sentezini inhibe ederek gösterir (Hajto et al., 2005).
Kore ökse otu (Viscum album var Coloratum),Viscum album’un alt
türlerinden biridir. 2000 yılında Park ve ark. yaptıkları çalısma ile Kore ökse otundan
izole edilen lektin II’nin, polisakkaritin ve viskotoksinin çesitli kanser hücrelerine
etkilerini araştırmışlar ve apoptozisi başlatmada en etkili olanın lektin II olduğunu
bulmuşlardır. Aynı grup önceki çalısmalarında da, Kore ökse otu lektin II’nin
özellikle kanser hücrelerinde apoptotik hücre ölümünü başlattığını ve normal
lenfositlere herhangi bir etkisinin olmadığını tespit etmistir (Park et al., 2000).
15
Değişik hücre tiplerinin lektinlerle inkübasyonları sonucunda; hücre şişmesi,
kromatin yoğunlaşması ve nükleer DNA’da kırıkların oluşması gibi apoptotik
değişimlerle bağlantılı hücre ölümleri gözlenmiştir. Ancak yapılan çalışmalar
sonucunda ökse otu lektinlerin programlı hücre ölümünü başlatan sinyal iletim
yolları ve mekanizmaları henüz açıklanamamıştır (Mockel et al., 1997).
2.1.3.2. Viskotoksinler
Viskotoksinler, Viscum album’un sitotoksik proteinlerinden biridir. Hücre
öldürücü etkileri olan viskotoksinlerin tümör hücrelerindeki sitolitik etkileri disülfür
gruplarıyla hücre membran fosfolipitlerinin etkileşiminden kaynaklanmaktadır
(Ergun ve Deliorman 1995). Viskotoksinler, üç disülfür köprüsü ile 46 amino asitten
oluşan tek polipeptit zincirine sahip bileşiklerdir. Bugüne kadar altı adet viskotoksin
tanımlanmış ve izole edilmiştir. Bunlar. Viskotoksin A1, Viskotoksin A2,
Viskotoksin A3, Viskotoksin B, Viskotoksin 1-Ps ve Viskotoksin U-Ps’dir (Ergun ve
Deliorman 1995).
Toksik proteinler olan viskotoksinler, α ve β-thionin’lerle ilişkilidir.
Viskotoksinlerin, insan granülosit ve lenfosit hücreleri üzerine etkisinin araştırıldığı
deneylerde, zarın geçirgenliğinin arttığı, sitoplazma ve kromatidin azaldığı,
kristaların kaybedilmesi ile mitokondrilerin şiştiği, reaktif oksijen radikallerinin
arttığı ve bu olayların devamında ikincil apoptosis olaylarının başlaması ile hücre
ölümü gözlenmiştir (Büssing et al., 1999).
2.3. ÖKSE OTU (Viscum album) Ekstraktının Apoptozis Mekanizması
Apoptozis; gelişmiş organizmalarda hücreler arası ilişkilerin gereği olarak
gereksinim duyulmayan, fonksiyonları bozulan, fazla üretilmiş, yaşlanmış, düzensiz
gelişmiş veya DNA’sında hasar olan hücrelerin çevreye zarar vermeden güvenli bir
şekilde yok edilmelerini sağlayan ve genetik olarak kontrol edilen programlı hücre
ölümüdür (Thompson 1999).
Yüksek organizmalarda hücre ölümü nekrozis ve apoptosiz olmak üzere iki
farklı mekanizma ile gerçekleşir. Nekrozis fizyolojik bir ölüm şekli olmasına
rağmen, apoptozis hem fizyolojik hem de patolojik şartlar altında meydana gelir
16
(Thompson 1999). Nekrozisde hücre içine aşırı sıvı girmesi sonucu hücre şişerken
(cell swelling), apoptotik hücre tam tersine küçülür (cell shrinkage). Nekrozisde
hücrelerin kromatin paterni hemen hemen normal iken apoptotik hücrede DNA,
internükleozomal bölgelerden yaklaşık 180-200 baz çifti (bç) veya bunun katları
boyutunda küçük DNA parçaları oluşturacak şekilde ayrılır bu durum agaroz jel
elektroforezinde merdiven görüntüsü yapısının ‘ladder pattern’ ortaya çıkmasına
neden olur ve kromatin nükleus membranının çevresinde toplanmış (chromatin
aggregation) ve yoğunlaşmış (chromatin condensation) şekildedir. Nekroza giden
hücrenin plazma membran bütünlüğü kaybolurken apoptotik hücrelerin membranı
sağlamdır; apoptozisin erken evresinde hücreler birleşme bölgelerinden ayrılır,
özelleşmiş yüzey organellerini kaybeder ve belirgin şekilde büzülür, bir kaç dakikada
hacimlerinin 1/3’ünü kaybederler, plazma membranında tomurcuklanmalar oluşur ve
hücre, sitoplazma ile çevrilmiş kromatin parçalarından oluşan apoptotik cisimciklere
(apoptotic bodies) parçalanır. Nekrozisde hücre içeriği dış ortama salıverildiğinden
inflamasyon reaksiyonu uyarılır ama apoptozisde apoptotik hücre veya cisimcikler
komşu hücreler veya makrofajlar tarafından fagosite edildiklerinden inflamasyon
oluşmaz (Huppertz et al., 1999, Willingham 1999, Barisic et al., 2003, Brouckaert et
al., 2004).
Apoptozisin moleküler mekanizması ile ilgili çalışmalar sonucu, kaspaz
(caspase-cysteine containing aspartate specific proteases) ailesinin doğrudan ya da
dolaylı yollardan apoptozisin hem biyokimyasal hem de morfolojik
değişikliklerinden sorumlu olduğu ortaya konulmuştur (Chang and Yang 2000).
Memelilerde en az 12 adet oldukları belirlenen kaspazlar, başlatıcı (-8, -9, -10) ve
sonlandırıcı (efektör) (-3, -6, -7) kaspazlar olmak üzere 2’ye ayrılmaktadır (Fadeel et
al., 2000). Efektör kaspazlar, DNA tamir enzimi olan PARP, retinoblastoma ve
MDM-2 gibi hücre siklusu düzenleyicileri, lamin, Gas2, gelsolin ve fodrin gibi hücre
iskeleti ve nukleusun yapısal proteinleri, PKC-δ gibi yasamsal proteinleri ayrıştırarak
inaktive eder ve hücre ölümüne neden olurlar (Enari et al., 1998). Hücrenin
apoptozise gidebilmesi için ilk önce ilgili genetik mekanizmayı harekete geçirecek
bir sinyalle karşılaşması gerekir. Bu sinyal, hücre içinden (DNA hasarı, hücre içi
Ca++ seviyesinde artış, PH’da düşme, metabolik veya hücre siklus bozuklukları)
veya hücre dışından (hipoksi, ısı, antikanser ilaçlar, radyasyon, gamma ve UV
17
ısınlar) gelebilir. Hücre dışından gelen sinyaller ölüm reseptörleri ve adaptör
proteinlerle, iç sinyaller ise mitokondri aracılığı ile iletilirler. İletilen sinyaller
başlatıcı kaspazları aktive eder, aktive olan başlatıcı kaspazlar ise zincirleme olarak
diğer kaspazları aktive eder (Fadeel et al., 2000).
Zara bağlı reseptörlerden ölüm reseptörleri, tümör nekroz faktör reseptör
(TNF-R) olarak adlandırılır ve proapoptotik sinyalleri hücre dışından hücre içine
taşır. Tanımlanan 20’den fazla TNFR vardır ve bunlar ölüm domaininin bulunup
bulunmamasına göre 2 gruba ayrılır (Locksley et al., 2001). Ölüm domaini bulunan
reseptörler, sinyal iletimini kaspaz aktivasyonuna ve apoptozise neden olarak
gerçekleştirirler. Örneğin; TNFR1 (p55, p60, CD120a) ve Fas (Apo-1, CD 95) ölüm
domaini içeren TNFR ilişkili reseptörlerdir, akış aşağı proteinler olan TNF reseptör
ilişkili ölüm domaini (TRADD) ve Fas ilişkili ölüm domain (FADD) proteinini
aktive ederler. FADD, kaspaz -3 ve -8’i aktive ederek kaspaz aktivasyonunu sağlar,
bu durum hedef proteinlerin yıkılmasına ve hücre içeriğinin bozulmasına neden olur
(Chinnaiyan et al., 1995).
Hücre dışından gelen sinyallerin oluşturduğu apoptoziste ölüm reseptörleri
görevlidir. Fas-fas ligand aracılı apoptozis, Fas (CD95, APO-1) hücre yüzey
reseptörü aracılığı ile oluşur. Fas ligandın fas reseptörüne bağlanması ile Fas
reseptörünün hücre içine bakan kısmında bulunan ölüm domaini, Fas adaptör proteini
(FADD) ölüm domaini ile birleşir ve ölüm başlatan sinyal kompleksini (DISC)
oluşturur. Komplex başlatıcı kaspaz olan prokaspaz-8’i aktifleştirir. Aktif hale gelen
kaspaz-8, sonlandırıcı kaspaz olan prokaspaz-3’ü aktifleştirerek hücreyi apoptozise
götürür (Şekil 2) (Wajant 2002).
TNF aracılı apoptoziste, bir sitokin olan TNF’nin TNF1 reseptörleri ile
birleşmesi sonucunda, reseptörün ölüm domaini, TNFR adaptör proteinin (TRADD)
ölüm domainine bağlanır. TRADD daha sonra FADD ile birleşerek prokaspaz-
8/FLICE’i aktiflestirir ve apoptozise neden olur (Mountz and Zhou 2001).
18
Şekil 2. Fas- fas ligand aracılı apoptosiz
İç sinyallerle oluşan apoptoziste mitokondri önemli rol oynar. Kemoteropatik
ajanların neden olduğu DNA hasarları, radyasyon ve büyüme faktörü eksikliği gibi
apoptotik sinyaller mitokondrinin dış zarında geçirgenlik artışına neden olur.
Geçirgenliğin artması, mitokondrinin 2 zarı arasında bulunan sitokrom c’nin sitozole
çıkmasına neden olur. Sitokrom c’nin salınımı Bcl-2 grubu proteinler tarafından
düzenlenir. Grubun antiapoptotik üyeleri olan Bcl-2 ve Bcl-xL sitokrom c salınımını
önlerken, proapoptotik üyeler olan Bax, Bad ve Bid salınımı artırır. Sitokrom c
sitoplazmada, apaf- 1, kaspaz-9 ve ATP ile birleşir. Bu yapıya apoptozom adı verilir.
Apoptozom sonlandırıcı kaspaz olan kaspaz-3’ü aktive ederek apoptozise neden olur
(White and McCubrey 2001, Korsmeyer 1999).
Sitokrom c’nin sitozole salınımında CD95 (Fas) reseptörlerine ligand
bağlanması ya da hücrelerin kemoteropatik ilaçlar ve UV ile muamele edilmesi gibi
değişik apoptotik durumlar etkilidir. CD95 aracılı apoptozisde, reseptörden gelen
sinyalle uyarılan kaspaz-8, Bcl-2 protein ailesine bağlı bir proapoptotik faktör olan
Bid’i proteolitik olarak ayrıştırır. Aktif hale geçen Bid (tBid) mitokondriye taşınır,
19
zar üzerinde bulunan bir başka proapoptotik protein olan Bad’ı aktifleştirir, sitokrom
c’nin salınımını sağlar ve apoptozomun oluşumuna neden olur. Apoptozom,
sonlandırıcı kaspaz-3’ü aktifleştirerek hücreyi apoptozise götürür (Şekil 3) (Esposti
2002, Rossi and Gaidano 2003).
Şekil 3. Fas reseptörleri ile sitokrom-c salınımı
Ökse otu lektinlerinin tümör hücreleri üzerindeki yıkıcı etkilerinin, JNK’nın
aktivasyonu aracılığıyla gerçekleştiği belirlenmiştir (Park et al., 2000). Ökse otu
lektin II’nin, zaman ve doza bağlı olarak, DNA’da kırıklar meydana getirerek agaroz
jelde merdiven görüntüsü almasına ve U937 hücrelerinde kaspaz -3, -8 ve -9’un
aktivasyonuna neden olduğu belirtilmektedir. Ayrıca ökse otu lektin II ile muamele
edilen U937 hücrelerinde, kaspazların katalitik aktivasyonu ile bağlantılı olarak,
PARP ve PKC-δ’ın her ikisinin de ayrıştığı bildirilmiştir (Kim et al., 2000).
Kemoteropatik ilaçlar, Fas/CD95 sinyal yolunu uyararak veya reaktif oksijen türleri
(ROS)’nin oluşmasını indükleyerek apoptozise neden olur (Simizu et al., 1998).
İlginçtir ki; lektin II’nin hem kaspaz-8/FLICE hem de kaspaz-9’u aktive ettiği
bulunmuştur. Kaspaz-8-proteazın aktivasyonu, CD95 gibi ölüm reseptörlerinin lektin
II’nin neden olduğu apoptoziste yer alabileceğini düşündürmüştür. Fakat ökse otu
lektin II’nin neden olduğu apoptoziste Fas ve Fas ligandın (FasL) ekspresyonunda bir
20
değişiklik gözlenmemiştir. Böyle bir durumda da Fas’ın lektin II’nin kendisi
tarafından oligomerize edilebileceği ihtimalinin hariç tutulmuş olabileceği üzerinde
durulmuştur. Kaspaz-9 proteaz ise apoptozisin sitokrom c yolunun uç kaspazıdır. Bu
yol mitokondriyal hasarı kaspaz aktivasyonuna bağlar. Lektin II’nin apoptozise
neden olan ROS’un oluşumunu indükleyerek kaspaz-9’u aktive ettiği
düşünülmektedir. Kim et al. (2001)’nın bu konuda yaptığı çalışmada; lektin II ile
muamele edilen U937 hücrelerinde önemli ölçüde hücre içi hidrojen peroksit (H2O2)
meydana geldiği görülmüştür. Artan H2O2’in hücre içinde oksidatif stresi arttırdığı ve
ROS’un temizlenmesi ile lektin II’nin neden olduğu apoptozisin inhibe edildiği
gözlenmiştir. Ayrıca lektin II’nin neden olduğu apoptozisin, redükte glutatyon
(GSH), asetilsistein (NAC), ebselen, mn (III) tetrakis (4-benzoic asid), porforin
klorid (mnTBP), katalaz ve pirolidin ditokarbamet (PDTC) gibi antioksidanlar
tarafından da inhibe edildiği gözlenmiştir. Bu antioksidanlar aynı zamanda lektin II
ile muamele edilmiş insan leukemia (HL-60), Jurkat ve Molt gibi T hücrelerinde de
apoptozisi önlemişlerdir. Buradaki bulgular, ROS’un ökse otu lektin II’nin neden
olduğu apoptoziste kritik bir role sahip olabileceği yönündedir. Ökse otu lektin II’nin
ROS oluşumuna neden olduğu mekanizma henüz tam olarak açıklanamamasına
rağmen, Kore ökse otu lektin II tarafından oluşturulan hücre içi H2O2’in,
JNK/SAPK aktivasyonunu, sitokrom c çıkısını ve kaspaz aktivasyonunu içeren hücre
içi sinyal yolunu uyardığı bilinmektedir (Kim et al., 2003)
Bantel et al. (1999)’nın yaptığı benzer bir çalışmada, ökse otu lektin I (ML I)
ile muamele edilen hücrelerde kaspaz -3, -8 ve -9 aktive olmuş ve devamında
apoptotik hücre ölümü gerçekleşmiştir. Kaspaz -8’in aktive olması CD95 yolunun
ML I’in neden olduğu apoptoziste yer alabileceğini düşündürmüştür. CD95’in
uyarılması için de ligandının veya direkt lektinin reseptörle çapraz bağlanması
gerekmektedir. ML I’in neden olduğu apoptozisde CD95’in varlığını ispatlamak için,
CD95’e direnç için seçilmiş Jurkat T hücre klonları kullanılmıştır. Bu hücrelerde
meydana gelen apoptosizin yabanıl tipte hücrelerle benzer olması, ML I’in neden
olduğu sitotoksitede CD95’in yer almadığını göstermiştir. Çalışmanın devamında,
ML I ile muameleden sonra mitokondri kontrol yolunun başlatılıp başlatılmadığı
araştırılmış ve kaspaz -9’un proteolitik aktivasyonuyla ilişkili olarak ML I’in
sitokrom c’nin salınımına neden olduğu bulunmuştur. Normalde CD95 ile uyarılan
21
kaspaz 8’in aktivasyonundan sonra Bid sitokrom c salınımına neden olurken,
hücrenin ML I’le muamelesinden sonra Bid’in parçalandığı belirlenmiştir. Sonuç
olarak bu bulgular, ML I’in kaspaz -3, -8 ve -9’u aktive ettiğini ve apoptozisi ölüm
reseptörlerinden bağımsız olarak mitokondri kontrol yoluyla uyardığını
göstermektedir (Bantel et al., 1999).
Ökse otu lektinin apoptozisi indüklemesi kanser tedavisinde ilginç bir
teröpatik strateji sağlar. Park et al. yaptıkları çalışmalarda ökse otu lektin II ile
muamele edilmiş transforme kanser hücrelerinin normal hücrelere oranla apoptotik
hücre ölümü için daha hassas oldukları bulunmuştur (Park et al., 2000). Flow
sitometrik analizler sonucunda, lektin II’nin normal nötrofil ve lenfositlerin
apoptozisini indüklemediği belirlenmiştir. Lektin II yalnızca U937 hücrelerinde değil
aynı zamanda hastalardan alınan akut leukemik hücrelerde, HL-60, Jurkat, RAW
264.7 ve insan kolon kanseri DLD1 hücrelerinde de apoptozisi indüklemiştir.
(Mockel et al., 1997) Siegle et al. pürifiye edilmiş lektin II’nin insan akciğer hücresi
A549’da doksorubisin, sisplatin ve taksol gibi standart kanser ilaçları ile kombine
edilerek sitotoksisitesinin arttırılması yönünde kullanılabileceğini belirterek ökse otu
terapisi için yeni klinik bir bakış açısı önermektedir (Siegle et al., 2001). Ökse otu
lektinlerinin apoptotik sürecin aktivasyonunu sağlayacak antikanser özelliklerinin
olduğunu belirten önemli kanıtlar bulunmasına rağmen, apoptotik mekanizmanın
işleyişi hakkında henüz çok az bilgi elde edilebilmiştir (Kim et al., 2000).
22
3. GEREÇ ve YÖNTEM
3.1. Ekstraktların Hazırlanması
Ticari ökse otu ekstraktları olan Helixor® A (50mg/ml), Helixor® P
(50mg/ml) ve Helixor® M (50mg/ml), Helixor Heilmittel (Germany) firmasından
alındı.
Endemik ökse otları ise Isparta-Çünür mahallesinden badem (Amygdalis
orientalis) dalları üzerinden (Viscum album ssp. album)(Ökse-B), Isparta-Keçiborlu
ilçesinden Çam (Pinus nigra) dalları üzerinden (Viscum album ssp. austriacum)
(Ökse-Ç) ve Antalya-Akseki toros dağlarından Köknar (Abies concolor ) dalları
üzerinden (Viscum album ssp. abietis) 2007 yılı Ocak ve Şubat aylarında toplandı.
Bitkiler Süleyman Demirel Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü’nde
tür tayini yapıldıktan sonra herbaryuma kaydedildi.
Ökse otları kurutulduktan sonra toz edilmiş yaprak ve sap kısımları (30 g)
120 ml % 96’lık etanolle (Merck, Darmstadt, Germany) Soxhlet aleti kullanılarak 24
saat süreyle ekstrakte edildi. Ekstrakt 0.22µm enjektör filtre (Millipore, Millex GP
Ireland) ile süzüldü, sıvı ekstrakt daha sonra soğutuldu ve rotary evaporator
kullanılarak 30-45ºC’de yoğunlaştırıldı. Yoğunlaştırılan ekstrakt Anadolu
Üniversitesi Bitki İlaç ve Bilimsel Araştırmalar Merkezi’nde (BİBAM)
liyofilizatörde liyofilize hale getirildi ve -20ºC’de saklandı (Khan et al., 1988,
Çelikler ve ark., 2008).
Endemik ökse otu ekstraktları hassas terazide 150 mg tartıldı, hücre hattına
uygun 3 ml besiyeri içinde çözüldü (Ökse-K, 1.5ml etil alkol (Merck, Darmstadt,
Germany) içinde 3 dak. vortexle çözüldükten sonra 1.5 ml besiyeri ilave edildi),
0.22µm filtre (Millipore, Millex GP Ireland) ile süzülerek steril hale getirildi.
Her bir ekstrakt TİK (Test edilen ilaç konsantrasyonu) olarak belirlenen altı
farklı (1,675 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,16 mg/ml, 0.05mg/ml, 0,0016 mg/ml ve 0.0005
mg/ml) konsantrasyonda hazırlandı. TİK farmakokinetik ve klinik değerlendirme
bilgileri ile belirlenmiş ve kabul edilmiş ilaç konsantrasyon birimidir. TİK test edilen
ilaçların standart bir dozuna bağlı olarak in vivo erişilebilir plazma konsantrasyonları
ile ilişkilidir ve doz bağımlı etkilerinin tanımlanmasını sağlar. İlaçlar için önce 800
23
% TİK dozu hesaplanır ve sitotoksisite testlerinde 200% TİK, 100% TİK, 50% TİK,
25% TİK, 12.5% TİK ve 6.12% TİK’ konsantrasyonları kullanılır. 200% TİK
suprafarmakolojik dozdur, 100% TİK yaklaşık plazma konsantrasyonudur ve 25- 0
% TİK düşük dozlardır. Bitki ekstraktları için 800 % TİK ise DMSO veya alkol ile
hazırlanmışsa % 0.1, sulu ekstrakt ise % 10 oranında hazırlanır.
3.2. Hücre Kültürü
Hücre kültürü, hücrelerin kontrollü şartlar altında yetiştirilmesi sürecidir.
Ticari olarak Amerika Hücre Kültür Koleksiyonundan satın alınan MDA-MB-231 ve
MCF-7 insan meme kanser hücre soyları kriyovial (Cryogenic vial, Corning, ABD)
kaplar içerisinde -196 0C’de sıvı nitrojen tankında saklandı. Kullanılan hücre
hatlarının özellikleri aşağıda belirtilen şekildedir.
MDA-MB-231 Hücre soyu: İnsan meme kanseri hücre hattı
Östrojen reseptörü (-)
E-kaderin (-)
Kaspaz 2: (+), Kaspaz 3: (+)
Yüksek oranda yayılabilir
MCF-7 Hücre soyu: İnsan meme kanseri hücre soyu
Östrojen reseptörü (+)
E-kaderin (+)
Kaspaz 2: (+/-), Kaspaz 3: (-)
Daha az oranda yayılabilen
Hücreler çoğaltılmak amacıyla sıvı nitrojen tankından alınarak 56 0C’deki
sıcak su banyosunda hızlı bir şekilde çözüldü. Kriyovialin içindeki hücre
süspansiyonu 5 ml besiyeri içeren falkon tüpe (15 ml sterile polypropylene cnical
bottom Screw cap tup 92159, Biolab, Macaristan) yavaşça aktarıldı. Tüp 800 rpm’de
5 dk santrifüj (Hettich Rotina 35R, Almanya) edildikten sonra üst sıvı kısmı atıldı.
Hücre pelleti 1 ml hücre besiyeri ortamı içerisinde iyice çözüldükten sonra üzerlerine
4 ml besiyeri eklendi. 5 ml’lik hücre süspansiyonları 25 cm2’lik kültür kabına (25
24
cm2, Tissue culture flasks, TTP, İsviçre) aktarıldı. 37 oC’de, %5 CO2’li etüvde
(Sanyo, Japonya) inkübasyona bırakıldı. Ertesi gün hücre besiyeri ortamı yenilenerek
hücrelerin büyümeleri sağlandı. Kültür kabı her gün mikroskop (İnverted
microscope, CKX41, Olympus, Almanya) altında kontrol edildi ve hücrelerin kültür
kap yüzeylerini tamamen kaplamış (konfluent) olduklarında tripsinizasyon işlemi ile
daha büyük hacimli 75 cm2 kültür kaplarına (75 cm2, Tissue culture flasks, TTP,
İsviçre) aktarıldı. Tripsinizasyon işlemi için konfluent hücrelerin üzerindeki besiyeri
aspire edilerek uzaklaştırıldı. Hücrelerin serumdan arındırılmak için Tuzlu Fosfat
Tamponu (PBS, Dulbecco’s Phosphat Buffered Saline 10x; Sigma, D1283, ABD) ile
yıkandı. PBS aspire edilerek uzaklaştırıldıktan sonra hücrelere 0.5 ml tripsin
solüsyonu eklenerek 370C’de, %5 CO2’li ortamda inkübe edildi. Mikroskop altında
hücre kabından ayrıldığı kontrol edilen hücrelere 5 ml besiyeri ortamı eklenerek
hücre süspansiyonu falkon tüpe (15 ml sterile polypropylene cnical bottom Screw
cap tup 92159, Biolab, Macaristan) aktarıldı. Tüp 800 rpm’de 5 dk santrifüj
edildikten sonra üst sıvı kısmı atıldı. Elde edilen Hücre pelleti 1 ml hücre besiyeri
ortamı içerisinde iyice çözüldükten sonra üzerlerine 9 ml besiyeri eklendi. 10 ml’lik
hücre süspansiyonları 75 cm2’lik kültür kabına aktarıldı. 370C’de, %5 CO2’li
ortamda kültüre edildi. Bu şekilde hücrelerin istenilen sayıya ulaşıncaya kadar
çoğaltılmaları sağlandı.
3.3. Kullanılan Besiyerleri, Sıvıların Hazırlanması
MDA-MB-231 Hücre soyu için kullanılan besiyeri ortamı için %5 Newborn
calf serum (Hyclone USA), %1 L-glutamin (292.3 mg/ml) (EuroClone Europe), %1
Penisilin-G (100 U/ml)-Streptomisin (100µg/ml), (Hyclone, USA) içeren RPMI 1640
(Hyclone, USA) solüsyonu kullanıldı.
MCF-7 insan meme kanseri hücre soyu için %10 Fetal bovin serum
(Biochrom AG, Berlin, Almanya), %1 Penisilin-G (100 U/ml) Streptomisin
(100µg/ml), (Hyclone, USA) içeren RPMI 1640 (Hyclone, USA) solüsyonu
kullanıldı.
25
3.4. Hücrelerin Sayılması
Hücreleri sayabilmek amacıyla tripsinizasyon işlemi sonucunda elde edilen
hücre süspansiyonundan 20 μl alınarak ependorf tüpe alındı. Üzerine eşit miktarda
Tripan Blue (Trypan Blue Solution % 0.5, Biological Industries, Israil) boyası
konarak iyice karışması sağlandı. Bu karışımdan 12 μl alıp Toma lamına konarak
lamın ortasında bulunan 16 bölme sayıldı. Bulunan sayı sulandırma katsayısı ile
çarpılarak 1 ml medyumda ne kadar hücre olduğu bulundu.
3.5. Metiltiazoltetrazolium (MTT) Canlılık Metodu
MTT metodu ile bir hücre topluluğundaki canlı hücrelerin oranı kolorimetrik
yöntemle kantitatif olarak saptanabilmektedir. Yaşayan hücrelerde mitokondride
bulunan‘‘süksinat dehidrogenaz’’ enziminin aktivitesi gözlenirken, ölen hücrelerde
gözlenmemektedir. Total dehidrogenaz aktivitesi ile canlı hücre sayısı arasında doğru
ilişki olduğu Mosmann (1983) tarafından gösterilmiştir. Böylece, ortama konulan
ektraktlara yanıt olarak eğer hücreler ölürse, enzim aktivitelerinin azaldığı veya
kaybolduğu gözlenmektedir. Bunun için, hücreler bu enzimlerin değişime uğrattığı 3-
(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolimbromid (MTT) maddesine maruz
bırakılmaktadır. Canlı hücrelerde mitokondride bulunan bu enzimin aktivitesi ile
MTT boyasının tetrazolium halkası parçalanmakta, bunun sonucunda soluk sarı
renkli MTT boyası koyu mavi-mor formazan ürününe (kristallerine) dönüşmektedir.
Ardından bu kristaller SDS (eritici tampon) kullanılarak suda çözünür hale
getirmekte ve oluşturdukları renk şiddeti spektrofotometre ile ölçülmektedir.
Başlangıçta aynı sayıda ekilmiş ve hiç ekstrakt uygulanmamış kontrol hücrelerindeki
renk şiddeti ile oranlanarak ekstrakt uygulanmış hücrelerdeki ölüm oranı (yüzdesi)
hesaplanmaktadır.
MTT testi için, 96 kuyucuklu düz plaklara ( Tissue Cultue Test plates, 96
wells Flat, Orange Scientific, Belçika) 133 µl besiyeri içinde 200 TİK, 100 TİK, 50
TİK, 25 TİK, 12,5 TİK ve 6 TİK konsatrasyonlarında hazırlanan ekstrakt
konsantrasyonları hazırlandı, üzerine MDA-MB-231 ve MCF-7 hücreleri sayılarak
200μl besiyeri içerisinde 5x103 hücre/kuyucuk olacak şekilde (3 tekrarlı) 96
kuyucuklu plaklara ekildi. Ekstrakt uygulamasını takiben hücreler 24, 48 ve 72 saat
26
inkübasyona bırakıldı. Hücrelerde 1M H2O2, ölümün negatif kontrolü (minumum
canlılık, MI) olarak kullanıldı. Pozitif kontrol (maksimum canlılık, MO) olarak
sadece besiyeri ortamı içerisinde ekilen hücreler kullanıldı. Ökse-K % 50 oranında
alkolle çözülerek hazırlandığı için % 2,5 ve % 1,5 alkol uygulanarak kontrol
hazırlandı
MTT kimyasalı 5 mg/ml PBS tamponu içerisinde pH 7.2 olacak şekilde stok
olarak hazırlandı. Hazırlanan MTT çözeltisi filtre edilerek steril hale getirildi. 24, 48
ve 72 saat sonra MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerine her bir kuyucuğa 25 μl MTT
çözeltisi eklendikten sonra hücreler 37ºC’de 4 saat süreyle karanlıkta inkübasyona
bırakıldı.
Oluşan formazon bileşiklerini çözünür hale getirebilmek için bütün
kuyucukların üzerine %10’luk SDS solüsyonundan 100µl olacak şekilde eklenerek
18 saat, 37°C’de %5’lik CO2’li etüvde inkübe edildi. İnkübasyon süresi sonunda
hücrelerde oluşan renk şiddeti spektrofotometrede (FLASHScan S12, Analytik Jena
AG, Almanya) 570nm dalga boyunda ölçüldü. Okunan absorbanslar kullanılarak
hücrelerin % canlılık oranları hesaplandı.
% Canlılık hesabı:
MTT testi sonunda yaşayan hücrelerde koyu mavi farmazon kristalleri
gözlendi, buna karşılık ölen hücrelerde bu kristaller gözlenmedi. Ekstrakt uygulanan
hücrelerin canlılıkları (Örnek C) ekstrakt uygulanmamış kontrol hücreleri referans
alınarak hesaplandı (Ökse-K için alkol uygulanan kontrol hücreleri referans alındı)
ve bu değer %100 canlılık (Maksimum canlılık, MaxC) olarak belirlendi. Hidrojen
peroksit (H2O2) uygulanan hücreler, minumum canlılık seviyesinin (Minumum
canlılık, MinC) hesaplanmasında referans olarak alındı. Tüm bu değerler ile
aşağıdaki formül kullanılarak hücrelerde inkübasyon süresi sonunda oluşan %
canlılık oranları hesaplandı.
Canlılık (%) = [100 x (ÖrnekC - MinC)/(MaxC - MinC)].
3.6. ATP Canlılık Testi
ATP testi hücre içerisindeki intraselüler ATP içeriğinin ölçülmesi esasına
dayanan yüksek duyarlılığa sahip bir yöntemdir (Andreotti et al., 1995). İntrasellüler
27
ATP içeriğinin seviyesi yaşayan hücrelerin sayısının belirlenmesinde kullanılan bir
göstergedir.
MTT testi için, 96 kuyucuklu düz plaklara ( Tissue Cultue Test plates, 96
wells Flat, Orange Scientific, Belçika) 133 µl besiyeri içinde 200 TİK, 100 TİK, 50
TİK, 25 TİK, 12,5 TİK ve 6 TİK konsatrasyonlarında hazırlanan ekstrakt
konsantrasyonları hazırlandı, üzerine MDA-MB-231 ve MCF-7 hücreleri sayılarak
200μl besiyeri içerisinde 5x103 hücre/kuyucuk olacak şekilde (3 tekrarlı) 96
kuyucuklu plaklara ekildi. Ekstrakt uygulamasını takiben hücreler 24, 48 ve 72 saat
inkübasyona bırakıldı. Hücrelerde 1M H2O2, ölümün negatif kontrolü (minumum
canlılık, MI) olarak kullanıldı. Pozitif kontrol (maksimum canlılık, MO) olarak
sadece besiyeri ortamı içerisinde ekilen hücreler kullanıldı. 24, 48 ve 72 saatlik
inkübasyonların sonunda intraselüler ATP içeriği ATP-TCA kiti (DCS Innovative
Diagnostica-Systeme, Hamburg, Almanya) kullanılarak belirlendi. ATP-kitinin
içinde yer alan hücre lizis tamponu kullanılarak (50µl/kuyucuk) hücre içerisindeki
ATP elde edildi. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübasyonu takiben kuyucukların
içerisinden 50’şer μl alınıp luminometrik ölçüme uygun beyaz plaklara (Microfluor 2
white, flat bottom 96 well microtiter plates, Thermolab Systems, İngiltere) aktarıldı.
Üzerlerine 50µl/kuyucuk lusiferin-lusiferaz enzimi içeren solüsyon ilave edildi.
Sonuçta, elde edilen ATP miktarı aşağıda formüle edildiği şekilde lusiferin-lusiferaz
bioluminesans reaksiyonu yardımıyla ölçme zamanı 1 saniye olacak şekilde
luminometre (Bio-Tek, Winooski, USA) kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar rölatif ışık
ünitesi (RLU) olarak verildi. Böylece ilaç uygulanan ve uygulanmayan hücrelerin
RLU değerlerine göre ekstraktların sitotoksik etkileri hakkında bilgi edinildi.
Lusiferaz
ATP + Lusiferin + O2 → → → → → → → → AMP + 2Pi + CO2 + Foton (RLU)
3.7. Tripan Blue Boyama Yöntemi
Tripan boyama için 6 kuyucuklu düz plaklara ( Tissue Cultue Test plates, 6
wells Flat, Orange Scientific, Belçika) 200 TİK ekstrakt konsantrasyonları
hazırlandı, üzerine MDA-MB-231 ve MCF-7 hücreleri sayılarak 2 ml besiyeri
28
içerisinde 500x103 hücre/kuyucuk olacak şekilde (3 tekrarlı) 6 kuyucuklu plaklara
ekildi. 72 saat sonra tripan boyama prosedürü uygulandı.
Altı kuyucuklu plaklara ekili hücrelerin üzerlerindeki süpernatanlar falkon
tüpe (15 ml sterile polypropylene cnical bottom Screw cap tup 92159, Biolab,
Macaristan) toplandı.
Hücrelerin üzerine 1 ml PBS (Dulbecco’s Phosphat Buffered Saline 10x;
Sigma, D1283, ABD) ilave edilip kalan hücrelerde toplanarak aynı falkon tüplere
konuldu.
Hücre kültür kaplarındaki hücrelerin üzerine 200 µl tripsin ilave edildi. 4
dakika 37°C derecede bekletildi.
2 ml besiyeri ilave edilip aynı falkon tüplere toplandı.
4 dakika santrifüj edilip süpernatanı atıldı.
Üzerlerine hücre hattına uygun besiyeri ilave edildi,
Elde edilen hücre süspansiyonundan 20 μl alınarak ependorf tüpe alındı.
Üzerine eşit miktarda Tripan Blue (Trypan Blue Solution % 0.5, Biological
Industries, Israil) boyası konarak iyice karışması sağlandı.
Bu karışımdan 12 μl alıp Toma lamına konarak boyanmış (ölü) ve
boyanmamış (canlı) hücreler sayılarak % ölüm oranları hesaplandı.
% Ölüm Oranı= Ölü hücre sayısı/ml x100
Toplam hücre sayısı/ml
3.8. Hematoksilen Boyama Yöntemi
Hematoksilen boyama için 6 kuyucuklu düz plaklara (Tissue Cultue Test
plates, 6 wells Flat, Orange Scientific, Belçika) 200 TİK ekstrakt konsantrasyonları
hazırlandı, üzerine MDA-MB-231 ve MCF-7 hücreleri sayılarak 2 ml besiyeri
içerisinde 500x103 hücre/kuyucuk olacak şekilde (3 tekrarlı) 6 kuyucuklu plaklara
ekildi. 72 saat sonra hematoksilen boyama prosedürü uygulandı.
29
Altı kuyucuklu düz plaklara ekili hücrelerin üzerlerindeki süpernatanlar
falkon tüpe (15 ml sterile polypropylene cnical bottom Screw cap tup 92159, Biolab,
Macaristan) toplandı.
Hücrelerin üzerine 1 ml PBS (Dulbecco’s Phosphat Buffered Saline 10x;
Sigma, D1283, ABD) ilave edilip kalan hücrelerde toplanarak aynı falkon tüplere
konuldu.
Hücre kültür kaplarındaki hücrelerin üzerine 200 µl tripsin ilave edildi. 4
dakika 37°C derecede bekletildi.
2 ml besiyeri ilave edilip aynı falkon tüplere toplandı.
4 dakika santrifüj edilip süpernatanı atıldı.
pellet üzerine 1 ml PBS ilave edilip tek hücre süspansiyonu oluşturacak
şekilde hazırlandı.
Sitosantrifüj lam’ları (poli L lizinli!) etiketlendi, hücrelerin toplanacağı
bölge işaretlendi, sitosantrifüj içine yerleştirildi, ardından 1 ml’lik hücre
süspansiyonunun tamamı eklendi.
2.200 rpm’de 4 dakika sitosantrifüj edildi.
Lam’lar çıkartılır ve oda ısısında bir gece kurumaya bırakıldı.
Lam’lar şaleye dizilir, önceden buzdolabında soğutulan % 100 metanol
ilave edilerek 15 dak. buzdolabında bekletilir
Lam’lar PBS ile 3x5 dak. yıkanır.
Lam’ların üzerini tamamen kaplayacak şekilde hematoksilen damlatıldı ve
5 sn. bekletildikten sonra önce musluk suyundan sonra distile sudan geçirildi.
Gliserol damlatıp lamelle kapatıldı. Lamelin çevresine kapatıcı sürülerek
hava alması engellendi. Mikroskop altında incelendi.
3.9. İkili Boyama (Double Staining) Yöntemi
İkili boyama için 6 kuyucuklu düz plaklara (Tissue Cultue Test plates, 6 wells
Flat, Orange Scientific, Belçika) 200 TİK ekstrakt konsantrasyonları hazırlandı,
üzerine MDA-MB-231 ve MCF-7 hücreleri sayılarak 2 ml besiyeri içerisinde
30
500x103 hücre/kuyucuk olacak şekilde (3 tekrarlı) 6 kuyucuklu plaklara ekildi. 72
saat sonra ikili boyama prosedürü uygulandı.
Stok çözeltileri: Stok çözeltiler PBS içinde hazırlandı.
RNAse (Ribonuclease A, R-500, Sigma) 100 mg / ml
PI (Propidium Iodide, P-4170, Sigma) 100 µg / ml
Hoechst dye (33342, Applichem Biochemica) 200 µg / ml
Çalışma çözeltisi: 10 ml PBS içine;
100 µl PI stok
100 µl RNAse stok
500 µl Hoechst (33342) stoktan ilave edilerek hazırlandı.
Altı kuyucuklu düz plaklara ekili hücrelerin üzerlerindeki süpernatanlar
falkon tüpe (15 ml sterile polypropylene cnical bottom Screw cap tup 92159, Biolab,
Macaristan) toplandı.
Hücrelerin üzerine 1 ml PBS (Dulbecco’s Phosphat Buffered Saline 10x;
Sigma, D1283, ABD) ilave edilip kalan hücrelerde toplanarak aynı falkon tüplere
konuldu.
Hücre kültür kaplarındaki hücrelerin üzerine 200 µl tripsin ilave edildi. 4
dakika 37°C derecede bekletildi.
2 ml besiyeri ilave edilip aynı falkon tüplere toplandı.
4 dakika santrifüj edilip süpernatanı atıldı.
Üzerlerine 100 µl double staining çalışma çözeltisi ilave edilip, karıştırıldı.
Falkon tüpler alüminyum folyo ile kaplandı, karanlıkta 15-20 dakika 37
derecede inkübe edildi.
Temiz bir lam üzerine bu solüsyondan 17 mikrolitre konularak lamelle
kapatıldı
Lamelin çevresine kapatıcı sürülerek hava alması engellendi. İnvert
mikroskop (İnverted microscope, CKX41, Olympus, Almanya) altında incelendi.
31
3.10. Western Blot Yöntemi
Western blot, bir protein karışımı içindeki belirli bir proteini ve büyüklüğünü
saptamak için kullanılan nicel bir yöntemdir. Bu metot istenilen bir proteine karşı
yönlendirilen yüksek kalitede bir antikor kullanımına bağlıdır. Bu antikor prob olarak
kullanılarak ilgili protein bir karışımın içinden saptanabilir. Western blot hücrede ne
kadar protein biriktiğini gösterir
3.10.1. Hücre Lizisi
Hücre lizisi için 25 cm2’lik kültür kabında (25 cm2, Tissue culture flasks,
TTP, İsviçre) konfluent olan hücreler 200 TİK ekstrakt konsantrasyonları ile
muamele edildi. 24 ve 48 saat sonra kültür kaplarında ekili hücrelerin üzerindeki
süpernatanlar buz üzerindeki falkon tüplere toplandı. Kültür kaplarına 10 ml soğuk
PBS (+40C) konuldu ve scraperla (Grainer Bio-one, Almanya) hücreler kültür
kaplarından kazınarak falkon tüplere toplandı. 1000g’de 5 dak. +40C’de santrifüj
edildikten sonra süpernatanı atıldı. Hücreler daha sonra 300 μl lizis solüsyonu
konularak ependorf tüplere aktarıldı ve 15 saniye sonikasyona konularak
homogenizasyon sağlandı. Isı banyosunda 65 0C’de 15 dak bekletildi ve -20’ye
kaldırıldı.
Lizis solusyonu:
Madde Stok Final
Tris-HCl 1.5 M pH 6.8 2.038 ml 62.5 mM
Üre 18.2 g 6 M
Gliserol (%100) 5 ml %10
SDS (%10) 10 ml %2
Bromophenol blue (%1) 62.5 ul %0.00125
B-mercaptoethanol 2.5 ml %5
32
3.10.2. Örnek yüklemesi
Örnekler sample bufferla birlikte hazırlandığı için doğrudan aşağıda belirtilen
miktarlarda jele yüklenir. Örnekler 300 µL lizis solüsyonu içinde bulunur.
Aşağıda belirtilen hacimlerde yükleme yapılır:
Örnek no Yüklenen (µl) Örnek
1 5 Marker
2 20 MCF-7 Konrol
3 20 MCF-7 Ökse-K 24 saat
4 20 MCF-7 Ökse-K 48 saat
5 20 MCF-7 Helixor-P 24 saat
6 20 MCF-7 Helixor-P 48 saat
7 20 MDA-MB-231 Konrol
8 20 MDA-MB-231 Ökse-K 24 saat
9 20 MDA-MB-231 Ökse-K 48 saat
10 20 MDA-MB-231 Helixor-P 24 saat
11 20 MDA-MB-231 Helixor-P 48 saat
12 5 Marker
3.10.3. Elektroforez
Jel: Invitrogen NuPAGE Novex Mini Gel, Bis-Tris %4-12 gradient
(NP0322BOX), 12 kuyucuklu jel kullanılır.
Marker: Amersham High Range Rainbow MW Markers (RPN756E) (örnek
no 1 & 12)
Running buffer:
NuPAGE® MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)
(NP0002)
Ultrapure su (dH2O) ile 20 kat sulandırılır. pH ayarlanmaz.
33
20 ml MES Running Buffer
380 ml dH2O
Güç kaynağı: Labnet Power Station 200
Elektroforez süresi 1 saat ve voltaj 150 V’tur.
Elektroforez sonrasında jelin sol üst köşesi kesilerek transfer öncesinde dH2O
bulunan kapta kısa bir süre bekletilir.
3.10.4. Transfer
Dry blotting yapılır. Invitrogen iBlot cihazı kullanılır. Protokole uygun olarak
düzenek kurulur. Alttan üste: bakır anot ve nitroseluloz membran (ikisi birlikte), jel,
bakır katot ve sünger cihaza yerleştirilir. Cihazın kapağı kapatılır. P3 (Program 3)’te
8 dakika boyunca transfer gerçekleştirilir
Transfer cihazı: iBlot™ Gel Transfer Device (IB1001)
Sarf malzeme: iBlot™ Transfer Stack, Mini (Nitrocellulose, 0.2 μm)
(IB3010-02)
3.10.5. Deteksiyon
Deteksiyon kiti: Invitrogen, Western Breeze Chemiluminescent
Immunodetection System (WB7106)
Blocker/Diluent (Part A) - Concentrated buffered saline solution containing
detergent
Blocker/Diluent (Part B) - Concentrated Hammersten casein solution
Wash Solution (16X) - Concentrated buffered saline solution containing
detergent
Secondary Antibody Solution - Ready-to-use solution of alkaline
phosphatase-conjugated, affinity purified, anti-rabbit IgG, goat conjugate
Chemiluminescent Substrate - Ready-to-use solution of CDP-Star®
chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase
Chemiluminescent Substrate Enhancer - Nitro-Block-II. enhancer for blots
on NC membranes
34
Primer antikor: Cell Signalling, PARP (46D11) Rabbit mAb (9532)
1:1000 oranında 10 ml“blocking solution”a eklenerek
hazırlanır.
Shaker: Mini Rocker MR-1
Film: Thermo Scientific - CL-XPosure Film (#34090)
Invitrogen deteksiyon kiti protokolü takip edilir:
Blocking solution:
14 ml dH2O
4 ml Blocker/Diluent (Part A)
ml Blocker/Diluent (Part B)
Yıkama solusyonu:
150 ml dH2O
10 ml Wash Solution (16X)
Substrat solusyonu:
2.375 ml Chemiluminescent Substrate
0.125 ml Chemiluminescent Substrate Enhancer
- 2x5 dk 20 ml dH2O yıkaması
- 30 dk 10 ml Blocking solution ile shakerda inkübasyon
- 2x5 dk 20 ml dH2O yıkaması
- 1 saat 10 ml primer antikor solusyonu shakerda inkübasyon
- 4x5 dk 20 ml yıkama solusyonu ile elde yıkama
- 30 dk 10 ml Secondary Antibody Solution eklenir ve shakerda
inkübe edilir
- 4x5 dk 20 ml yıkama solusyonu ile elde yıkama
- 3x2 dk 20 ml dH2O yıkaması
- Hazırlanan Substrat solusyonunun tamamı membran üzerine
yavaşça dökülür.
- Karanlıkta 5 dakika inkübe edilir
- Karanlıkta üzerine film kapatılarak görüntüleme yapılır (1 saat).
35
4. BULGULAR
4.1. MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattında Sitotoksisite
MTT ve ATP Canlılık Testi Bulguları
Sitotoksisite bulgularında, MTT metoduna uygun olan hücre sayısını
belirlemek için MDA-MB-231 hücreleri kullanıldı. Farklı sayılarda MDA-MB-231
hücrelerinin MTT testiyle verdiği absorbanslar ölçüldü. Böylece total dehidrogenaz
aktivitesi ile hücre sayısı arasında doğrusal ilişki olduğu belirlendi (şekil 4.1.).
Alınan sonuçlara uygun sayıda hücreler sitotoksisite testlerinde kullanıldı. Bu
sonuçlar MCF-7 hücreleri için de referans olarak alındı.
y = 3E-05x + 0,0742R² = 0,9617
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
1,4000
1,6000
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000
Abs
orba
ns
Hücre sayısı
Şekil 4.1. MTT metodu ile MDA-MB-231 hücrelerinin 570 nm’de verdikleri absorbans değerleri.
Hücrelerde ökse otu ekstraktları uygulamalarından sonra olabilecek
değişimleri değerlendirebilmek ve hataları en aza indirebilmek amacıyla pozitif
(maksimum canlılık) ve negatif (minimum canlılık) kontrol hücreleri kullanıldı. Bu
hücrelerin genel görünümü referans olarak alınan MDA-MB-231 hücreleri için resim
4.1. ve resim 4.2.’de görülmektedir.
36
Resim 4.1: MTT testinden önce pozitif kontrol MDA-MB-231hücreleri
Resim 4.2: MTT testinden önce negatif kontrol MDA-MB-231 hücreleri.
Ayrıca MTT testi sonucunda oluşan koyu mavi renkli formazon bileşiklerinin
pozitif ve negatif kontrol gruplarında genel görünümleri resim 4.3 ve resim 4.4’de
görülmektedir.
Resim 4.3: MTT testinden sonra oluşan pozitif kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristallerinin görünümü.
Resim 4.4: MTT testinden sonra oluşan negatif kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristallerinin görünümü.
4.1.1. MTT metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı
Üzerine Endemik Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ökse otu ekstraktlarının, MDA-MB-231
insan meme kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine olan etkisini belirleyebilmek
için MTT testi yapıldı. Hücrelere endemik ökse otu ekstraktlarının altı farklı dozu
1.675, 0.50, 0.16, 0.05, 0.016, 0.05 mg/ml uygulandı. Üç ayrı plak’a ekilen hücre
dizileri 24, 48 ve 72 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Ortaya çıkan % canlılıklar
37
sırasıyla şekil 4.2, 4.3 ve 4.4’de gösterildi. MTT testi uygulamasından 48 ve 72 saat
sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazan kristallerinin görüntüleri 10x
ve 20x objektif ile inverted mikroskop altında fotoğraflandı.
4.1.1.1. 24 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Hücrelere 24 saat süreyle endemik ökse otu ekstraktları uygulandığında
ortaya çıkan MTT sonuçları şekil 4,2’de gösterildi. Mikroskobik incelemede
ekstraktların tüm dozlarının MDA-MB-231 hücrelerinin büyümelerini engellemediği
gözlendiği halde MTT canlılık testi sonuçlarında 1.675, 0.50 ve 0.16 mg/ml dozlarda
interferanstan dolayı % canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok daha fazla olduğu
gözlendi (şekil 4.2).
Şekil 4.2. Endemik ökse otu ekstraktlarının 24. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
4.1.1.2. 48 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Ekstrakların uygulanmasından 48 saat sonra ortaya çıkan MTT canlılık testi
sonuçları şekil 4.3’de gösterildi. Mikroskobik inceleme sonucu yalnız Ökse-K
ekstraktının 1.675 mg/ml dozunda sitotoksik etki gözlenirken her üç ekstraktın da
1.675, 0.50 ve 0.16 mg/ml dozlarının uygulandığı kuyucukların taban yüzeyinde
kirlilik ve tortu gözlendi (resim 4.5-4.12). MTT sonuçlarına göre bu üç dozda yine
interferanstan dolayı % canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok daha fazla olduğu
38
gözlendi (şekil 4.3). Ökse-K % 50 oranında alkolle çözülerek hazırlandığı için % 2,5
ve % 1,5 alkol uygulanarak kontrol hazırlandı. Mikroskopta incelendiğinde 48 saat
sonunda alkol kontrollerinin maksimum canlılık görülen kontrol hücrelerinden farklı
olmadığı görüldü (resim 4.13 ve resim 4.14).
Şekil 4.3: Endemik ökse otu ekstraktlarının 48. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
Resim 4.5: 48 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x10)
Resim 4.6: 48 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x20)
39
Resim 4.7: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.8: 0.5 mg/ml Ökse-B uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.9: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.10: 0.5 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x20)
Resim 4.11: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Şekil 4.12: 0.5 mg/ml Ökse-K uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
40
Resim 4.13: % 2.5 Alkol uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.14: % 1.2 Alkol uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
4.1.1.3. 72 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Uygulamadan 72 saat sonra ortaya çıkan MTT canlılık testi sonuçları Şekil 4.4’de gösterildi. Mikroskobik incelemede her üç ekstraktın da 1.675, 0.50 ve 0.16 mg/ml dozlarının uygulandığı kuyucuklarda özellikle Ökse-Ç ekstraktının 1.675 mg/ml dozunun uygulandığı kuyucukta (resim 4.19) kirliliğin daha da arttığı gözlendi. MTT sonuçlarına göre bu üç dozda yine interferanstan dolayı % canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok daha fazla olduğu gözlendi Mikroskobik görüntü sonuçlarına göre ise sitotoksik etki Ökse-B ve Ökse-K ekstraktlarının 1.675 ve 0.50 mg/ml dozlarında gözlenirken (resim 4.17, 4.18, 4.21, 4.22) 72 saat sonunda da alkol kontrollerinin maksimum canlılık görülen kontrol hücrelerinden farklı olmadığı görüldü (resim 4.23, 4.24).
Şekil 4.4: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine
olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
41
Resim 4.15: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x10)
Resim 4.16: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x20)
Resim 4.17: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.18: 0,5 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.19: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.20: 0,5 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 72saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
42
Resim 4.21:1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.22: 0,5 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.23: % 2.5 Alkol uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.24: % 1.2 Alkol uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
4.1.1.4. İnterferansın Araştırılması
İnterferansın oluşmasında endemik ökse otu ekstraktların PH’larının etkili
olabileceği düşünülerek PH’ları ölçüldü; Ökse-B: 7.80, Ökse-Ç: 7.83 ve Ökse-K:
7.39 olarak bulundu. PH’ları sırasıyla 7.41, 7.43 ve 7.39 olarak ayarlandı ve yeni bir
plak’a ekstrakların yine altı farklı dozu (1.675, 0.50, 0.16, 0.05, 0.016, 0.05 mg/ml)
uygulanarak MTT canlılık testi yapıldı. Ortaya çıkan MTT canlılık testi sonuçları
şekil 4.5’da gösterildi. Buna göre her üç endemik ökse otu ekstraktının 1.675, 0.50
ve 0.16mg/ml dozlarında interferans gözlendi ve bu üç dozda % canlılığın kontrol
hücrelerine oranla çok daha fazla olduğu görüldü.
43
Şekil 4.5: Endemik ökse otu ekstraktlarının PH’ları Ökse-Ç: 7.41, Ökse-B: 7.43 ve Ökse-K: 7.39 olarak ayarlandıktan sonra 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin
MTT testi ile gösterilmesi.
İnterferansın, ekstraktların PH’larından kaynaklanmadığı tespit edilince
neden kaynaklandığını anlamak için hücre hattı ilave etmeden yalnız endemik ökse
otu ekstraktlarının yüksek üç dozu 1.675, 0.50, 0,16 mg/ml yeni bir plak’a
uygulanarak MTT canlılık testi yapıldı. Üç dozda % canlılığın kontrol hücrelerinden
çok daha fazla olduğu gözlendi (Şekil 4.6).
Şekil 4.6: Endemik ökse otu ekstraktlarının hücre ilave edilmeden 24 saat sonra MTT testi ile ölçülmesi.
44
4.1.2. ATP Canlılık Metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri
Hücre Hattı Üzerine Endemik Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ökse otu ekstraktlarının, MDA-MB-231
insan meme kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine olan sitotoksik etkisini
belirleyebilmek için ATP canlılık testi yapıldı. Yüksek üç dozu 1.675, 0.50 ve 0,16
mg/ml uygulanan endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre
soylarında intrasellüler ATP miktarına olan etkisi şekil 4.7’de gösterildi. Buna göre
1.675 mg/ml dozda üç endemik ökse otu ekstraktında sitotoksik etki gözlenirken,
0.50 mg/ml dozda Ökse-K’nın Ökse-B’ye oranla, 0,16 mg/ml dozda Ökse-K’nın
diğerlerine oranla daha sitotoksik olduğu gözlendi.
Şekil 4.7: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin ATP testi ile gösterilmesi.
4.1.3. MTT Metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı
Üzerine Ticari Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri
Helixor A, Helixor P ve Helixor M ticari ökse otu ekstraktlarının, MDA-MB-
231 insan meme kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine olan etkisini
belirleyebilmek için MTT canlılık testi yapıldı. Hücrelere ticari ökse otu
ekstraktlarının altı farklı dozu 1.675, 0.50, 0.16, 0.05, 0.016, 0.05 mg/ml uygulandı.
3 ayrı plak’a ekilen hücre dizileri 24, 48 ve 72 saat süreyle inkübasyona bırakıldı.
Ortaya çıkan % canlılıklar sırasıyla şekil 4.8, 4.9, 4.10’da gösterildi. Fotoğraflama
45
işlemi 24. saatte MTT testi uygulamasından önce, 48 ve 72. saatte MTT
uygulamasından sonra (MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazan kristalleri)
10x ve 20x objektif ile inverted mikroskop altında yapıldı.
4.1.3.1. 24 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Hücrelere 24 saat süreyle ticari ökse otu ekstraktları uygulandığında ortaya
çıkan MTT sonuçları şekil 4.8’de gösterildi. Mikroskobik incelemede ekstraktların
MDA-MB-231 hücrelerinin büyümelerini engellemediği (resim 4.27-4.32)
gözlendiği halde MTT canlılık testi sonuçlarında özellikle 1.675, 0.50 ve 0,16 mg/ml
dozlarında olmak üzere tüm dozlarda % canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok
düşük olduğu gözlendi (Şekil 4.8).
Şekil 4.8: Ticari ökse otu ekstraktlarının 24. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
Resim 4.25: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 Hücreleri (x10)
Resim 4.26: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 Hücreleri (x20)
46
Resim 4.27: 1.675 mg/ml Helixor A uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10)
Resim 4.28: 0,5 mg/ml Helixor A uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10)
Resim 4.29: 1.675 mg/ml Helixor P uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10)
Resim 4.30: 0,5 mg/ml Helixor P uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10)
Resim 4.31: 1.675 mg/ml Helixor M uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10)
Resim 4.32: 0,5 mg/ml Helixor M uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 Hücreleri (x10)
47
4.1.3.2. 48 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Ekstrakların uygulanmasından 48 saat sonra ortaya çıkan MTT canlılık testi
sonuçları Şekil 4.9’da gösterildi. Mikroskobik inceleme sonucu yalnız Helixor-P’nin
1.675 mg/ml dozunda (resim 4.36) kontrole oranla hücre sayısında biraz azalma
gözlenirken 24 saat sonraki MTT grafiğinde görüldüğü gibi her üç ekstraktın da
özellikle 1.675, 0.50 ve 0,16 mg/ml dozlarında olmak üzere tüm dozlarda %
canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok düşük olduğu gözlendi (şekil 4.9).
Şekil 4.9: Ticari ökse otu ekstraktlarının 48. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
Resim 4.33: 48 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x10)
Resim 4.34: 48 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
48
Resim 4.35: 1.675 mg/ml Helixor A uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.36: 1.675 mg/ml Helixor P uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.37: 1.675 mg/ml Helixor M uygulamasından 48 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
4.1.3.3. 72 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Uygulamadan 72 saat sonra ortaya çıkan MTT canlılık testi sonuçları şekil
4.10’de gösterildi. Mikroskobik incelemede her üç ekstraktın da 1.675 mg/ml
dozlarında (Şekil 4.40, 4.42, 4.44) ve Helixor-A ve Helixor-P’nin 0,5 mg/ml dozunda
(Şekil 4.41, 4.43) kontrole oranla hücre sayısında azalma gözlendi. 24 ve 48 saat
sonraki MTT testinde olduğu gibi her üç ekstraktın da özellikle 1.675, 0.50 ve 0,16
mg/ml dozlarında olmak üzere tüm dozlarda % canlılığın kontrol hücrelerine oranla
çok düşük olduğu gözlendi (şekil 4.10).
49
Şekil 4.10: Ticari ökse otu ekstraktlarının 72 saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
Resim 4.38: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x10)
Resim 4.39: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.40: 1.675 mg/ml Helixor A uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 Hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.41: 0,5 mg/ml Helixor A uygulamasından 72saat sonra MDA-MB-231 Hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
50
Resim 4.42: 1.675 mg/ml Helixor P uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.43: 0,5 mg/ml Helixor P uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.44: 1.675 mg/ml Helixor M uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.45: 0,5 mg/ml Helixor M uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
4.1.3.4. İnterferansın Araştırılması
Helixor-A, Helixor-P ve Helixor-M ticari ökse otu ekstraktlarında 1.675, 0.50
ve 0,16 mg/ml dozlarda 24, 48 ve 72 saatlik uygulama sonucu MTT testinde %
canlılığın kontrole oranla düşük olmasının nedenini araştırmak amacıyla, hücre hattı
ilave etmeden yalnız ticari ökse otu ekstraktlarının yüksek üç dozu (1.675, 0.50, 0,16
mg/ml) yeni bir plate uygulanarak MTT canlılık testi yapıldı. Tüm ekstraktlarda üç
dozda da yine % canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok düşük olduğu gözlendi
(Şekil 4.11).
51
Şekil 4.11: Ticari ökse otu ekstraktlarının hücre ilave edilmeden 24 saat sonra MTT testi ile gösterilmesi.
4.1.4. ATP Canlılık Metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri
Hücre Hattı Üzerine Ticari Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri
Helixor-A, Helixor-P ve Helixor-M ticari ökse otu ekstraktlarının, MDA-MB-
231 insan meme kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine olan sitotoksik etkisini
belirleyebilmek için ATP canlılık testi yapıldı. Yüksek üç dozu (1.675, 0.50 ve 0,16
mg/ml) uygulanan ticari ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre
soylarında intrasellüler ATP miktarına olan etkisi şekil 4.12’de gösterildi. Buna göre
1.675 mg/ml dozda Helixor-A ve Helixor-P’de sitotoksik etki gözlenirken, 0.50
mg/ml dozda Helixor-P’nin Helixor-A’ya oranla, daha sitotoksik olduğu gözlendi.
52
Şekil 4.12: Ticari ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin ATP testi ile gösterilmesi.
4.2. Ökse Otu Ekstraktlarının MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre
Hattı Üzerine Etkilerinin Mikroskopta Tespiti
Ökse otu ekstraktlarının uygulanması ile gerçekleşen hücre ölümünün
apoptosiz veya nekrozisle mi ortaya çıktığını belirlemek amacıyla hücre ölümü
gözlenen MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri hücrelerinin mikroskopta tespiti için
tripan blue ile boyama, ikili boyama (hoechst boya ve propidium iyodür) ve
hematoksilen boyama yapıldı.
4.2.1. Tripan Blue Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ve Helixor A, Helixor P ve Helixor M
ticari ökse otu ekstraktlarının MDA-MB-231 insan meme kanseri hücre hatlarının
canlılığı üzerine olan etkisini belirleyebilmek için MTT ve ATP canlılık testlerine ek
olarak hücreler tripan blue ile boyandı. Hücrelere endemik ve ticari ökse otu
ekstraktlarının 1.675 mg/ml dozu uygulandı ve 72 saat süreyle inkübasyona bırakıldı.
Daha sonra boyanmış (ölü) ve boyanmamış (canlı) hücreler toma lamı üzerinde
inverted ışık mikroskop yardımıyla sayılarak % ölüm oranları hesaplandı. Grafik
(şekil 4.13) incelendiğinde Ökse-B, Ökse-Ç, Helixor-A ve Helixor-M ile muamele
53
edilen hücrelerde % 20 oranında ölüm tespit edildi. Ökse-K ile muamele edilen
hücrelerde ölüm oranı % 69 iken Helixor-P’de % 58 bulundu.
Şekil 4.13: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin tripan blue boyaması ile gösterilmesi.
4.2.2. İkili Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ve Helixor A, Helixor P ve Helixor M
ticari ökse otu ekstraktlarının 1.675 mg/ml dozunun uygulandığı MDA-MB-231
İnsan Meme Kanseri hücrelerinde 72 saat sonunda canlı ve ölü hücre ayrımını
yapabilmek için, canlı veya ölü tüm hücreleri boyayabilen Hoechst boyası ile sadece
ölü hücreleri boyayabilen bir başka boya propidium iyodür beraber kullanıldı.
Nukleusları Hoechst boyasıyla mavi renk boyanmış canlı ve ölü hücreler ile
nukleusları propidium iyodür boyasıyla kırmızı renk boyanmış ölü hücreler floresan
mikroskobunda sayılarak % ölüm oranları hesaplandı, grafik şekil 4.14’da gösterildi.
Boyanan hücrelerin fotoğraflanması 10x ve 20x objektif ile floresan mikroskobu
altında yapıldı (resim 4.46-4.50).
Ticari ökse otu ekstraktlarından Helixor A ve Helixor M’nin uygulanan
dozlarında endemik ökse otu ekstraktlarından Ökse-B ve Ökse-Ç’ye oranla ölüm
yüzdeleri daha düşük gözlendi. Ökse-K uygulanan hücrelerde ise Helixor-P
uygulanan hücrelere oranla ölüm yüzdesi fazla bulundu (Şekil 4.14).
54
Şekil 4.14: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin ikili boyama ile gösterilmesi.
Resim 4.46: Hoechst ile 72 saat sonra boyanan canlı ve ölü kontrol MDA-MB-231 hücreleri (10x)
Resim 4.47: Propidium iyodür ile 72 saat sonra boyanan ölü kontrol MDA-MB-231 hücreleri (10x)
Resim 4.48: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MDA-MB-231 hücreleri (10x)
Resim 4.49: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü MDA-MB-231 hücreleri (10x)
55
Resim 4.50: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MDA-MB-231 hücreleri (10x)
Resim 4.50: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü MDA-MB-231 hücreleri (10x)
4.2.3. Hematoksilen Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ve Helixor A, Helixor P ve Helixor M
ticari ökse otu ekstraktlarının 1.675 mg/ml dozu uygulanan MDA-MB-231 İnsan
Meme Kanseri hücreleri 24 ve 72 saatlik inkübasyon sonunda 6 kuyucuklu plaklarda
fotoğraflandı. Resim 4.58-4.60’da görüldüğü gibi her üç Helixor’un etkisi 24. saatte
başlarken endemik ökse otu ekstraktlarının etkisi 72. saatte görülmektedir (resim
4.61-4.63). Ökse otu ekstraktlarının uygulandığı MDA-MB-231 hücrelerinde 72 saat
sonunda morfolojilerini incelemek amacıyla hematoksilen boyama yapıldı.
Nükleusları düzgün ve mavi renk boyanmış hücreler ışık mikroskobunda sayılarak %
oranları hesaplandı, grafik şekil 4.15’de gösterildi. Elde edilen sonuçlara göre,
endemik ökse otu ekstraktlarından Ökse-Ç ve ticari ökse otu ekstraktlarından Helixor
M’nin uygulanan dozlarında kontrol hücrelerine oranla hücre sayısında bir değişiklik
gözlenmezken Ökse-B ve Helixor-A’da hücre sayısının azaldığı, bu azalmanın
özellikle Ökse-K ve Helixor-P’de çok fazla olduğu gözlendi. Ayrıca Ökse-B, Ökse-
Ç, Helixor A ve Helixor M ekstraktlarının uygulandığı hücrelerde kontrol hücrelerine
kıyasla hücre morfolojilerinde değişim gözlenmedi. Ökse-K uygulanan hücrelerde
hücre zarları parçalanmış ve nükleusları kontrole oranla daha koyu mavi boyanmıştı
(Şekil 4.52). Helixor-P uygulanan hücrelerde ise hücre zarlarının tamamiyle
parçalandığı gözlendi (Şekil 4.53).
56
Şekil 4.15: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin hematoksilen boyama ile gösterilmesi.
Resim 4.51: Hematoksilen ile 72 saat sonra boyanan kontrol MDA-MB-231hücreleri
Resim 4.52: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MDA-MB-231 Hücreleri (20x)
Resim 4.53:1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MDA-MB-231 Hücreleri (10x)
57
Resim 4.54: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x20)
Resim 4.55: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10)
Resim 4.56: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10)
Resim 4.57: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10)
Resim 4.58: 1.675 mg/ml Helixor-A uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x)
Resim 4.59: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x)
58
Resim 4.60: 1.675 mg/ml Helixor-M uygulamasından 24 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x)
Resim 4.61: 72 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MDA-MB-231 hücreleri (x20)
Resim 4.62: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10)
Resim 4.63: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 10)
Resim 4.64: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (x 20)
59
Resim 4.65: 1.675 mg/ml Helixor-A uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x)
Resim 4.66: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x)
Resim 4.67: 1.675 mg/ml Helixor-M uygulamasından 72 saat sonra MDA-MB-231 hücreleri (10x)
4.3. MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattında Sitotoksisite MTT ve
ATP Canlılık Testi Bulguları
4.3.1. MTT metodu ile MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine
Endemik Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ökse otu ekstraktlarının, MCF-7 insan
meme kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine olan etkisini belirleyebilmek için
MTT canlılık testi yapıldı. Hücrelere endemik ökse otu ekstraktlarının altı farklı dozu
1.675, 0.50, 0.16, 0.05, 0.016, 0.05 mg/ml uygulandı. Üç ayrı plak’a ekilen hücre
hatları 24, 48 ve 72 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Ortaya çıkan % canlılıklar
sırasıyla şekil 4.16, 4.17, 4.18’de gösterildi. MTT testi uygulamasından 24 saat sonra
60
MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazan kristallerinin görüntüleri 10x ve 20x objektif
ile inverted mikroskop altında fotoğraflandı.
4.3.1.1. 24 saatlik inkübasyon bulguları
Hücrelere 24 saat süreyle endemik ökse otu ekstraktları uygulandığında
ortaya çıkan MTT sonuçları şekil 4.16’da gösterildi. Mikroskobik incelemede her üç
ekstraktın da 1.675 ve 0.50 mg/ml dozlarının MCF-7 hücrelerinin büyümelerini
tamamen engellediği gözlendi (resim 4.70, 4.71, 4.73, 4.74, 4.76, 4.77). Ökse-B ve
Ökse-K’nın 0.16 mg/ml dozlarında % 50 büyümenin engellendiği, Ökse-Ç’nin aynı
dozunda diğer iki ekstrakta oranla etkinin daha az olduğu gözlendi (resim 4.72, 4.75,
4.78). MTT canlılık testi sonuçlarında MDA-MB-231 hücreleri ile benzer şekilde
1.675, 0.50 ve 0.16 mg/ml dozlarda interferanstan dolayı % canlılığın kontrol
hücrelerine oranla çok daha fazla olduğu gözlendi (şekil 4.16).
Şekil 4.16: Endemik ökse otu ekstraktlarının 24. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
61
Resim 4.68: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MCF-7 hücreleri (x10)
Resim 4.69: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.70: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.71: 0.5 mg/ml Ökse-B uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.72: 0.16 mg/ml Ökse-B uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
62
Resim 4.73: 1.675 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.74: 0.5 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.75: 0.16 mg/ml Ökse-Ç uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.76: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.77: 0.5 mg/ml Ökse-K uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
63
Resim 4.78: 0.16 mg/ml Ökse-K uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
4.3.1.2. 48 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Ekstrakların uygulanmasından 48 saat sonra ortaya çıkan MTT canlılık testi
sonuçları Şekil 4.17’de gösterildi. Mikroskobik inceleme sonucu her üç ekstraktın
1.675 ve 0.50 mg/ml dozlarının MCF-7 hücrelerinin büyümelerini tamamen
engellediği gözlenirken 0.16 mg/ml dozda 24 saatlik inkübasyon bulgularıyla orantılı
olarak toksik etkinin biraz daha arttığı gözlendi. MDA-MB-231 hücrelerinin 48
saatlik inkübasyona ait mikroskobik görüntülerde olduğu gibi her üç ekstraktın da
1.675, 0.50 ve 0.16 mg/ml dozlarının uygulandığı kuyucukların taban yüzeyinde
kirlilik ve tortu gözlendi. MTT sonuçlarına göre bu üç dozda toksik etki
gözlenmesine rağmen yine interferanstan dolayı % canlılığın kontrol hücrelerine
oranla fazla olduğu gözlendi (şekil 4.17).
64
Şekil 4.17: Endemik ökse otu ekstraktlarının 48. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
4.3.1.3. 72 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Uygulamadan 72 saat sonra ortaya çıkan MTT canlılık testi sonuçları şekil
4.18’de gösterildi. Mikroskobik incelemede her üç ekstraktın 1.675, 0.50 ve 0.16
mg/ml dozlarının uygulandığı kuyucuklarda MCF-7 hücrelerinin büyümelerini
tamamen engellediği gözlenirken kuyucuklarda kirliliğin daha da arttığı gözlendi.
MTT sonuçlarına göre bu üç dozda yine interferanstan dolayı % canlılığın kontrol
hücrelerine oranla çok daha fazla olduğu gözlendi.
Şekil 4.18: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
65
4.3.1.4. İnterferansın Araştırılması
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ökse otu ekstraktlarında 1.675, 0.50 ve
0,16 mg/ml dozlarda 24, 48 ve 72 saatlik uygulama sonucu MTT testinde %
canlılığın kontrole oranla yüksek olmasının nedenini araştırmak amacıyla, hücre hattı
ilave etmeden yalnız endemik ökse otu ekstraktlarının yüksek üç dozu 1.675, 0.50,
0,16 mg/ml yeni bir plate uygulanarak MTT canlılık testi yapıldı. Üç dozda yine %
canlılığın kontrol hücrelerinden çok daha fazla olduğu gözlendi (Şekil 4.19).
Şekil 4.19: Endemik ökse otu ekstraktlarının hücre ilave edilmeden 24 saat sonra MTT testi ile ölçülmesi.
4.3.2. ATP Canlılık Metodu ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri
Hücre Hattı Üzerine Endemik Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ökse otu ekstraktlarının, MCF-7 insan
meme kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine olan sitotoksik etkisini
belirleyebilmek için ATP canlılık testi yapıldı. Yüksek üç dozu (1.675, 0.50 ve 0,16
mg/ml) uygulanan endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre
hatlarında intrasellüler ATP miktarına olan etkisi şekil 4.20’de gösterildi. Buna göre
1.675 mg/ml dozda üç endemik ökse otu ekstraktında sitotoksik etki gözlenirken,
0.50 mg/ml ve 0,16 mg/ml dozlarda Ökse-B’nin diğerlerine oranla daha sitotoksik
olduğu gözlendi.
66
Şekil 4.20: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı üzerine olan etkisinin ATP testi ile gösterilmesi.
4.3.3. MTT metodu ile MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı Üzerine
Ticari Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri
Helixor A, Helixor P ve Helixor M ticari ökse otu ekstraktlarının, MCF-7
insan meme kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine olan etkisini belirleyebilmek
için MTT canlılık testi yapıldı. Hücrelere ticari ökse otu ekstraktlarının altı farklı
dozu 1.675, 0.50, 0.16, 0.05, 0.016, 0.05 mg/ml uygulandı. Üç ayrı plak’a ekilen
hücre dizileri 24, 48 ve 72 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Ortaya çıkan %
canlılıklar sırasıyla şekil 4.21, 4.22 ve 4.23’de gösterildi. Fotoğraflama işlemi 24.
saatte MTT testi uygulamasından sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazan
kristalleri 10x objektif ile inverted mikroskop altında yapıldı.
4.3.3.1. 24 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Hücrelere 24 saat süreyle ticari ökse otu ekstraktları uygulandığında ortaya
çıkan MTT sonuçları şekil 4.21’de gösterildi. Mikroskobik incelemede ekstraktların
MCF-7 hücrelerinin büyümelerini engellemediği (resim 4.81-4.89) gözlendiği halde
MTT canlılık testi sonuçlarında özellikle 1.675, 0.50 ve 0,16 mg/ml dozlarında
olmak üzere tüm dozlarda % canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok düşük olduğu
gözlendi (Şekil 4.21).
67
Şekil 4.21: Ticari ökse otu ekstraktlarının 24 saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
Resim 4.79: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum inhibisyon (MI) görülen kontrol MCF-7 hücreleri (x10)
Resim 4.80: 24 saatlik inkübasyon sonunda maksimum canlılık (MO) görülen kontrol MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.81: 1.675 mg/ml Helixor-A uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.82: 0.5 mg/ml Helixor-A uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
68
Resim 4.83: 0.16 mg/ml Helixor-A uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.84: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.85: 0.5 mg/ml Helixor-P uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.86: 0.16 mg/ml Helixor-P uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
69
Resim 4.87: 1.675 mg/ml Helixor-M uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.88: 0.5 mg/ml Helixor-M uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
Resim 4.89: 0.16 mg/ml Helixor-M uygulamasından 24 saat sonra MCF-7 hücrelerinde gözlenen formazon kristalleri (x10)
4.3.3.2. 48 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Ekstrakların uygulanmasından 48 saat sonra ortaya çıkan MTT canlılık testi
sonuçları şekil 4.22’de gösterildi. Mikroskobik inceleme sonucu yalnız Helixor-P’nin
1.675 mg/ml dozunda kontrole oranla hücre sayısında biraz azalma gözlenirken 24
saatlik inkübasyon sonrası MTT grafiğinde olduğu gibi her üç ekstraktın da özellikle
1.675, 0.50 ve 0,16 mg/ml dozlarında olmak üzere tüm dozlarda % canlılığın kontrol
hücrelerine oranla çok düşük olduğu gözlendi (şekil 4.22).
70
Şekil 4.22: Ticari ökse otu ekstraktlarının 48 saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT testi ile gösterilmesi.
4.3.3.3. 72 Saatlik İnkübasyon Bulguları
Uygulamadan 72 saat sonra ortaya çıkan MTT canlılık testi sonuçları şekil
23’de gösterildi. Mikroskobik incelemede her üç ekstraktın 1.675 mg/ml dozlarında
ve Helixor-P’nin 0,5 ve 0,16 mg/ml dozunda diğer iki ekstrakta oranla hücre
sayısında azalma gözlendi. 24 ve 48 saat sonraki MTT grafiğinde olduğu gibi her üç
ekstraktın da özellikle 1.675, 0.50 ve 0,16 mg/ml dozlarında olmak üzere tüm
dozlarda % canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok düşük olduğu gözlendi (şekil
23).
71
Şekil 4.23: Endemik ökse otu ekstraktlarının 72 saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin MTT
testi ile gösterilmesi.
4.3.3.4. İnterferansın Araştırılması
Helixor-A, Helixor-P ve Helixor-M ticari ökse otu ekstraktlarının 1.675, 0.50
ve 0,16 mg/ml dozlarında 24, 48 ve 72 saat sonrası MTT grafiğinde % canlılığın
kontrole oranla düşük olmasının nedenini araştırmak amacıyla, hücre hattı ilave
etmeden yalnız ticari ökse otu ekstraktlarının yüksek üç dozu 1.675, 0.50, 0,16
mg/ml yeni bir plate uygulanarak MTT canlılık testi yapıldı. Tüm ekstraktlarda üç
dozda da % canlılığın kontrol hücrelerine oranla çok düşük olduğu gözlendi (şekil
4.24).
Şekil 4.24: Ticari ökse otu ekstraktlarının hücre ilave edilmeden 24 saat sonra MTT testi ile
ölçülmesi.
72
4.3.4. ATP Canlılık Testi ile MDA-MB-231 İnsan Meme Kanseri Hücre
Hattı Üzerine Ticari Ökse Otu Ekstraktlarının Etkileri
Helixor-A, Helixor-P ve Helixor-M ticari ökse otu ekstraktlarının, MCF-7
insan meme kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine olan sitotoksik etkisini
belirleyebilmek için ATP canlılık testi yapıldı. Yüksek üç dozu (1.675, 0.50 ve 0,16
mg/ml) uygulanan ticari ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre hatlarında
intrasellüler ATP miktarına olan etkisi şekil 4.25’de gösterildi. Buna göre her üç
dozda Helixor-P’nin diğerlerine oranla daha sitotoksik olduğu gözlendi.
Şekil 4.25: Ticari ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin ATP testi ile gösterilmesi.
4.4. Ökse Otu Ekstraktlarının MCF-7 İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı
Üzerine Etkilerinin Mikroskopta Tespiti
Ökse otu ekstraktlarının uygulanması ile gerçekleşen hücre ölümünün
apoptosiz veya nekrozisle mi ortaya çıktığını belirlemek amacıyla hücre ölümü
gözlenen MCF-7 İnsan Meme Kanseri hücrelerinin mikroskopta tespiti için tripan
blue ile boyama, ikili boyama (hoechst boya ve propidium iyodür) ve hematoksilen
boyama yapıldı.
73
4.4.1. Tripan Blue Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ve Helixor A, Helixor P ve Helixor M
ticari ökse otu ekstraktlarının MCF-7 insan meme kanseri hücre hatlarının canlılığı
üzerine olan etkisini belirleyebilmek için MTT ve ATP canlılık testlerine ek olarak
hücreler tripan blue ile boyandı. Hücrelere endemik ve ticari ökse otu ekstraktlarının
1.675 mg/ml dozu uygulandı ve 72 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Daha sonra
boyanmış (ölü) ve boyanmamış (canlı) hücreler toma lamı üzerinde invert mikroskop
yardımıyla sayılarak % ölüm oranları hesaplandı. Grafik (şekil 4.26) incelendiğinde
Ökse-B, Ökse-Ç, Helixor-A ve Helixor-M ile muamele edilen hücrelerde % 20
oranında ölüm tespit edildi. Ökse-K ile muamele edilen hücrelerde ise ölüm oranı %
54 iken Helixor-P’de % 50 bulundu.
Şekil 4.26: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre soyu üzerine olan etkisinin tripan blue boyaması ile gösterilmesi.
4.4.2. İkili Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ve Helixor A, Helixor P ve Helixor M
ticari ökse otu ekstraktlarının 1.675 mg/ml dozunun uygulandığı MCF-7 insan meme
kanseri hücre hatlarında 72 saat sonunda canlı ve ölü hücre ayrımını yapabilmek için,
canlı veya ölü tüm hücreleri boyayabilen Hoechst boyası ile sadece ölü hücreleri
boyayabilen bir başka boya propidium iyodür beraber kullanıldı. Nukleusları
74
Hoechst boyasıyla mavi renk boyanmış canlı ve ölü hücreler ile nukleusları
propidium iyodür boyasıyla kırmızı renk boyanmış ölü hücreler floresan
mikroskobunda sayılarak % ölüm oranları hesaplandı, grafik şekil 4.27’de gösterildi.
Boyanan hücrelerin fotoğraflanması 10x ve 20x objektif ile floresan mikroskobu
altında yapıldı (resim 4.92-4.97).
Sonuçlar incelendiğinde ticari ökse otu ekstraktlarından Helixor A ve Helixor
M’nin uygulanan dozlarında endemik ökse otu ekstraktlarından Ökse-B ve Ökse-
Ç’ye oranla ölüm yüzdeleri daha düşük gözlendi. Ökse-K (%80) uygulanan
hücrelerde ise Helixor-P (%30) uygulanan hücrelere oranla ölüm yüzdesi çok daha
fazla bulundu (Şekil 4.27).
Şekil 4.27: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin ikili boyama ile gösterilmesi.
75
Resim 4.90: Hoechst ile 72 saat sonra boyanan canlı ve ölü kontrol MCF-7 hücreleri (10x)
Resim 4.91: Propidium iyodür ile 72 saat sonra boyanan ölü kontrol MCF-7 hücreleri (10x)
Resim 4.92: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MCF-7 hücreleri (10x)
Resim 4.93: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü MCF-7 hücreleri (10x)
Resim 4.94: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MCF-7 hücreleri (10x)
Resim 4.95: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü MCF-7 hücreleri (10x)
76
Resim 4.96: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Hoechst ile boyanan canlı ve ölü MCF-7 hücreleri (10x)
Resim 4.97: 1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Propidium iyodür ile boyanan ölü - MCF-7 hücreleri (10x)
4.4.3. Hematoksilen Boyama ile Hücre Ölümünün Tespiti
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K endemik ve Helixor A, Helixor P ve Helixor M
ticari ökse otu ekstraktlarının 1.675 mg/ml dozu uygulanan MCF-7 İnsan Meme
Kanseri hücrelerinin 72 saat sonunda morfolojilerini incelemek amacıyla
hematoksilen boyama yapıldı. Nükleusları düzgün ve mavi renk boyanmış hücreler
ışık mikroskobunda sayılarak % oranları hesaplandı, grafik şekil 4.28’de gösterildi.
Elde edilen sonuçlara göre, endemik ökse otu ekstraktlarından Ökse-Ç ve ticari ökse
otu ekstraktlarından Helixor M’nin uygulanan dozlarında kontrol hücrelerine oranla
hücre sayısında bir değişiklik gözlenmezken Ökse-B’de Helixor-A’ya oranla hücre
sayısının azaldığı, bu azalmanın özellikle Ökse-K ve Helixor-P’de çok fazla olduğu
gözlendi. Ayrıca Ökse-B, Ökse-Ç, Helixor A ve Helixor M ekstraktlarının
uygulandığı hücrelerde kontrol hücrelerine kıyasla hücre morfolojilerinde değişim
gözlenmedi. Ökse-K uygulanan hücrelerde yoğunluğun çok azaldığı, bazı hücrelerin
çok fazla parçalandığı hatta nükleuslarının olmadığı, olan nükleuslarında küçük
olduğu gözlendi. Helixor-P uygulanan hücrelerde ise yoğunluğun azaldığı ve
nükleusların kontrole benzediği gözlendi (resim 4.99-101).
77
Şekil 4. 28: Ökse otu ekstraktlarının 72. saatte MCF-7 hücre hattı üzerine olan etkisinin hematoksilen
boyama ile gösterilmesi.
Resim 4.98: Hematoksilen ile 72 saat sonra boyanan kontrol MCF-7 hücreleri
Resim 4.99: 1.675 mg/ml Ökse-B uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MCF-7 Hücreleri (20x)
Resim 4.100: 1.675 mg/ml Ökse-K uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MCF-7 Hücreleri (20x)
Resim 4.101:1.675 mg/ml Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra Hematosilen ile boyanan MCF-7 Hücreleri (10x)
78
4.5. Ökse Otu Ekstraktlarının MDA-MB-231 ve MCF-7 İnsan Meme
Kanseri Hücre Hatları Üzerine Apoptotik Etkinin Western Blot Metodu ile
Tespiti
Ökse-K endemik ve Helixor-P ticari ökse otu ekstraktlarının 24 ve 48 saat
süreyle 1.675 mg/ml dozu uygulanan MDA-MB-231 ve MCF-7 İnsan Meme Kanseri
hücre hatlarında apoptotik etkiyi incelemek amacıyla western blot metodu yapıldı.
MDA hücre hatlarında yalnız Helixor-P uygulananlarda 116 kDa molekül
ağırlığındaki PARP’ ın kırılarak 89 kDa ağırlığında band oluşturduğu gözlendi. MCF
hücre hatlarında ise Helixor-P uygulananlarda ve 48 saat süreyle Ökse-K
uygulananlarda PARP’ın kırılarak aktive olduğu tespit edildi.
Şekil 4.29: Ökse-K ve Helixor-P ökse otu ekstraktlarının 24 ve 48 saat süreyle uygulanan MDA-MB-231 ve MCF-7 İnsan Meme Kanseri hücre hatları üzerine apoptotik etkilerinin
western blot metodu ile gösterilmesi. M: Marker, K: Kontrol, Ö-24: Ökse-K 24 saat uygulama, Ö-48: Ökse-K 48 saat uygulama,
H-24: Helixor-P 24 saat uygulama, H-48: Helixor-P 48 saat uygulama
79
5. TARTIŞMA
Her yıl 1.2 milyon kişiyi etkileyen meme kanseri, kadınlarda en sık rastlanan
kanser tipidir. Meme kanserinin sık görülmesi, sıklığının giderek artması, erken
evrelerde teşhis ve tedavi edilebilir olması, meme kanserinin önemini daha da
arttırmaktadır (Parkin 2002). Meme kanserinin erken evresinde tedavilerde gözlenen
ilerlemelere karşın birçok kadında hastalık tekrar etmekte ve metastaz oluşmaktadır.
Metastatik hastalıkta uygulanan tedavi stratejileri sınırlı olmakla birlikte asıl odak
nokta medikal tedavi yöntemidir. Klasik tedavi yöntemlerinin kanser tedavisindeki
önemi tartışılmazdır (Aggarwal and Shishir 2006). Ancak kanser vakalarının
sayısının artışı ve kullanılan ilaçlara karşı direnç, yeni teşhis ve tedavi yöntemlerine
duyulan ihtiyacı artırmaktadır. Geleneksel tedavilerde başarı sınırlı olduğundan,
kanser hastalarının çoğu komplementer ve alternetif tıptan köken alan tedavileri
denemektedir. Viscum album preperatları komplementer/ alternatif kanser terapisinin
en sık kullanılan formudur. Bu preparatlar sıklıkla standart kemoterapi yada
radyoterapi ile birlikte adjuvan tedavi protokollerinde kullanılır. Post-operatif
tedaviyle birlikte kombine tedavi hastanın yaşam kalitesini artırır ve meme kanserli
hastalarda nüksetme aralığını artırır (Eggenschwiler et al., 2007).
Ökse otu ile ilgili 1926’dan bu yana çok sayıda çalışma yapılmış ve
Avrupa’da preperatları kanser tedavisinde adjuvan olarak kullanılagelmektedir. Son
yıllardaki çalışmalar, ökse otu ekstraktlarının kültüre edilmiş insan tümör
hücrelerinin apoptotik yolla ölümlerini indüklediğini ve immün sistemi uyardığını
göstermektedir (Park et al.,2000).
Apoptozisi indüklemesi ve bu yolla hücrenin apoptotik ölümüne neden
olması bakımından ökse otunun kanser tedavisinde önemi büyüktür. Pürifiye edilmiş
lektin II’nin insan akciğer kanser hücresi A549’da doxorubicin, sisplatin ve taxol
gibi standart kanser ilaçları ile kombine edilerek sitotoksik etkisi araştırılmış, çalışma
sonucunda, ökse otunun sitotoksisitenin arttırılması yönünde kullanılabileceği
belirtilerek ökse otu terapisi için yeni klinik bir bakış açısı önerilmiştir (Siegle et
al.,2001).
Bu çalışmada, endemik ökse otunun alt türlerine ait tüm bitki ekstraktları olan
Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K ekstraktlarının, MDA-MB-231 östrojen reseptörü negatif
80
ve MCF-7 östrojen reseptörü pozitif olan iki farklı meme kanseri hücre hattı üzerine
apoptotik etkisi araştırıldı. Bu etki, Almanya’da ticari olarak üretilen ve tedavi
amacıyla kullanılan aynı alt türlere ait Helixor-A, Helixor-P ve Helixor-M
ekstraktları’nın etkileri ile karşılaştırıldı.
Ökse otu ekstraktlarının kanser hücreleri üzerine olan sitotoksisitelerini
değerlendirmek için çok sık kullanılan ve aynı zamanda ucuz olan, hücrelerdeki
dehidrogenaz aktivitesini ölçen, kolorimetrik bir yöntem olan MTT metodu bu
çalışmada da öncelikle tercih edildi. Ekstraktların MDA-MB-231 ve MCF-7 hücre
hatlarında büyümeye etkileri incelenip, yüzde canlılıkları hesaplandı.
Khil et al., (2007) kore ökse otu lektininin kolon kanseri, epidermal kanser ve
normal hücre hatları üzerine sitotoksik etkisi MTT metodu ile araştırılmıştır. Lektinin
10, 25, 50 ve 100 ng/ml dozlarının 24 saat süreyle uygulandığı hücre hatlarında
zaman ve doza bağlı olarak en güçlü sitotoksik etkinin kolon kanseri hücrelerine
olduğu, epidermal kanser hücreleri üzerine ise bu etkinin az olduğu normal hücreler
üzerine ise etkinin olmadığı bulunmuştur.
Zuzak et al.,(2006) Sekiz farklı ağaç (Iscucin Abietis, Pini, Populi, Mali,
Salicis, Crataegi, Quercus and Tiliae) üzerinden toplayarak hazırladıkları ökse otu
ekstraktlarının dört farlı medullablastoma hücre hattı (Daoy, D342, D425 and UW-
288-2) üzerine sitotoksik etkilerini MTT metoduyla incelenmiş ve önemli ölçüde
büyüme inhibisyonuna neden olduklarını bulmuşlardır. Bu inhibisyonun kullanılan
ökse otu ekstraktlarının lektin içerikleri ile doğru orantılı olduğu ve ölüm şekillerinin
apoptosizle gerçekleştiğini bildirmişlerdir.
Knöpfl-Sidler et al., (2005)’nın yaptıkları bir araştırmada, Iscador M (20
mg/ml), Iscador Q (20 mg/ml) ve Abnobaviscum Fraxini -2 (20 mg/ml) ticari ökse
otu ekstralarının HELA-S3, MOLT-4, MFM-223, COR-L51, KPL-1 and VM-CUB1
tümör hücre hatlarında önemli ölçüde büyüme inhibisyonuna neden olduklarını MTT
metodu ile tespit etmişlerdir. Hücre proliferasyonu ve mitokondriyal aktivite
yönünden değerlendirildiğinde Abnobaviscum Fraxini’nin diğer iki ekstrakta oranla
daha güçlü inhibitör etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Viscotoksin ve lektinler izole
edilerek uygulandıklarında tüm bitki ekstraktlarından daha az etkili oldukları
vurgulanmıştır. Zarković et al. (1998) bu bulguyu desteklemektedir. İzole lektin-I ve
81
tüm ökse otu ekstraktı İsorel’in B16F10 melanoma hücre hatları üzerine büyüme
etkileri kıyaslandığında İsorel’in lektinden daha etkili olduğu MTT metodu ile
gösterilmiş hatta bu etki, farelere B16F10 melanoma hücre hatları enjekte edilerek
oluşturulan kanser modellerinde tümör nodüllerinin sayısının azalması ile de
desteklenmiştir.
MTT testi kullanılarak ökse otu ekstraktlarının kanser hücre hatları üzerine
sitotoksik etkilerini gösteren benzer çalışmalar yapılmıştır. (Hunziker-Basler et al.,
2007, Eggenschwiler et al., 2006, Urech et al., 2006, Styczynski and Wysocki 2006,
Kim et al., 2004, Kong et al., 2004).
Çalışmamızda, MTT canlılık metoduna göre endemik ökse otu ekstraktlarının
uygulanan yüksek üç dozunda (1.675, 0.50, 0.16 mg/ml) MDA-MB-231 ve MCF-7
hücrelerinde tüm uygulama saatlerinde sitotoksik etki gözlense de gözlenmese de %
canlılığın kontrole oranla çok daha fazla olduğu gözlendi. Bunun üzerine hiç hücre
hattı ilave etmeden yalnız endemik ökse otu ekstraktlarının yüksek üç dozu (1.675,
0.50, 0,16 mg/ml) yeni bir plate uygulanarak MTT canlılık testi yapıldı. Üç dozda
yine % canlılığın kontrol hücrelerinden çok daha fazla olduğu bulundu (Pozitif yönde
interferans). Ticari ökse otu ekstraktlarında ise tam tersi bir durum gözlendi yani
ticari ökse otu ekstraktlarının uygulanan yüksek üç dozunda (1.675, 0.50, 0.16
mg/ml) MDA-MB-231 ve MCF-7 hücrelerinde sitotoksik etki gözlenmese de tüm
uygulama saatlerinde % canlılığın kontrole oranla çok daha düşük olduğu tespit
edildi. Endemik ökse otu ekstraktlarında olduğu gibi hiç hücre hattı ilave etmeden
yalnız ticari ökse otu ekstraktlarının yüksek üç dozu (1.675, 0.50, 0,16 mg/ml) yeni
bir plate uygulanarak MTT canlılık testi yapıldı. Üç dozda yine % canlılığın kontrole
oranla çok daha düşük olduğu gözlendi (Negatif yönde interferans). Her iki
durumunda bitki içeriğinin, MTT metodu için kullanılan SDS ve MTT ile kimyasal
etkileşiminden kaynaklanabileceği düşünülmektedir.
Bu etkileşimden dolayı MTT sonuçları ile mikroskobik inceleme sonuçları da
birbirinden farklıdır. Özellikle üç endemik ökse otu ekstraktının 1.675 ve 0.50 mg/ml
dozlarında MCF-7 hücrelerinin büyümelerini ilk 24 saatte % 90 oranında engellediği
mikroskopta tespit edildiği halde MTT sonuçlarına göre aynı dozlarda % canlılığın
kontrol hücrelerinden % 50-80 oranında daha fazla olduğu gözlendi. Ökse-K’nın
82
1.675 mg/ml dozu uygulanan MDA-MB-231 hücre hatlarında, endemik ökse otu
ekstraktlarının ilk sitotoksik etki 48 saat sonunda görüldüğü halde MTT sonucuna
göre % 93 oranında canlılık tespit edilmektedir. Ticari ökse otu ekstraktlarında ise
tam ters yönde MTT sonuçları ile mikroskop görüntüleri uyumsuzluk
göstermektedir. Ticari ökse otu ekstraktlarının uygulanan dozlarında her iki hücre
hattında da mikroskop görüntülerinde 24 ve 48 saatlik inkübasyonlarda hiç hücre
ölümü gözlenmezken, MTT sonuçlarında canlılığın % 1-50 arasında değiştiği
görülmektedir.
İnterferanstan dolayı hem endemik hem de ticari ökse otu ekstraktlarında
MTT sonuçları ile mikroskobik görüntülerin farklılık göstermesi nedeniyle ökse otu
ekstraktlarının sitotoksik etkisini doğrulamak için 72 saatlik inkübasyon sonunda
ATP canlılık testi yapıldı. Hücre içerisindeki intraselüler ATP içeriğinin ölçülmesi
esasına dayanan, yüksek duyarlılığa sahip bir yöntem olan ATP-TCA metodunda,
canlı hücrelerdeki ATP’nin lusiferin ile reaksiyonunu takiben ortaya çıkan luminesan
ışımanın ölçümüne dayanmaktadır. Oluşan ATP canlı hücre sayısı ile direkt orantılı
bir değerdir ( Andreotti et al.,1995).
ATP canlılık metoduna göre, MDA-MB-231 hücre hattında endemik ökse
otlarından Ökse-K’nın 1.675 ve 0.50 mg/ml dozlarda Ökse-B’ye oranla, ticari ökse
otlarında ise Helixor-P’nin aynı dozlarda Helixor-A’ya oranla daha sitotoksik olduğu
bulundu. MCF-7 hücre hattında ise endemik ökse otlarından Ökse-B’nin Ökse-K’ya
oranla, ticari ökse otlarında ise Helixor-P’nin diğer iki ekstrakta oranla daha
sitotoksik olduğu görüldü.
MDA-MB-231 hücre hattı için tripan blue, ikili boyama ve hematoksilen
boyama sonuçları ATP canlılık testi ile benzer sonuçları verirken, MCF-7 hücre
hattında farklılık gözlenmektedir. Her üç boyama sonucu da endemik ökse otlarından
Ökse-K’nın sitotosik etkisinin, Ökse-B’den daha fazla olduğunu ortaya koymaktadır.
Bu durum hücrelerin, ATP canlılık testinin yapıldığı 96 kuyucuklu platelerdeki 0,37
cm2’lik büyüme alanındaki davranışı ile boyamalar için kullanılan daha geniş yüzey
alanına sahip 6 kuyucuklu platelerdeki 9,46 cm2’lik büyüme alanındaki davranışı ile
fark olduğunu göstermektedir. Bu farklılık ticari ökse otu ekstraktlarının, MDA-MB-
231 hücreleri üzerine etkisini incelemek için yapılan hematoksilen boyamada 24 ve
83
72 saatlik inkübasyon sonunda 6 kuyucuklu plateler fotoğraflanmıştır. Şekil.. ‘de
görüldüğü gibi her üç Helixor’un etkisi 24. saatte başlarkenMTT testi için ekim
yapılan 96 kuyucuklu platelerde Helixorların sitotoksik etkisi 72. saatte görülmüştür
(Şekil).
Hücre ölüm şeklinin belirlenmesinde ikili boyama ve hematoksilen boyama
birlikte değerlendirildi. Hematoksilen boyamada MDA-MB-231 hücre hatlarında
endemik ökse otu ekstraktlarından Ökse-K uygulananlarda ve ticari ökse otu
ekstraktlarından Helixor-P uygulananlarda hücre membranlarının parçalandığı
gözlendi. İkili boyama sonuçları değerlendirildiğinde, 1.675 mg/ml Ökse-K
uygulanan MDA-MB-231 hücrelerinde propidium iyodür ile boyanan ölü hücre
sayısı Helixor-P uygulananlara oranla daha fazla olduğu görülmektedir. İkili
boyamada propidium iyodürün, membran bütünlüğü bozulan hücrelerin dolayısıyla
nekrozla ölen hücrelerin nükleuslarını boyadığı bilinmektedir. Hücre kültürü
ortamında apoptoza giden hücrelerin başlangıçta hücre membranları bütünlüğünü
korumasına rağmen ileri dönemlerde in vivo ortamdaki gibi etrafındaki makrofajlar
tarafından fagosite edilemeyeceklerinden sekonder nekroz gelişir. Böylece membran
bütünlükleri bozulduğu için hücreler non-vital boyalarla (propidium iyodürle)
boyanma özelliği kazanmaya başlar (Ulukaya 2003). Bu nedenle ikili boyamada
Ökse-K ve Helixor-P uygulamasından 72 saat sonra propidium iyodür ile boyanan
ölü MDA-MB-231 hücrelerinin ölümünün nekrozdan mı yoksa sekonder nekrozdan
mı olduğu bilinmemektedir. Bu durumun uygulama süresinin uzun olmasından
kaynaklandığına karar verilmiştir. Benzer durum MCF-7 hücre hattıyla yapılan
çalışmalar içinde geçerlidir. Mevcut uygulama süresinde hücrelerin çoğu membran
bütünlüğünü kaybettiği için karşılaştırma hücre yoğunluğuna bakılarak yapılmıştır.
Hematoksilen boyamada MCF-7 hücre hatlarında, MDA-MB-231 hücre hatlarında
olduğu gibi endemik ökse otlarından Ökse-K’nın ticari ökse otlarından da Helixor-
P’nin diğer ekstraktlara oranla daha fazla hücre ölümüne neden olduğu bulunmuştur.
İkili boyama sonuçları değerlendirildiğinde, 1.675 mg/ml Ökse-K uygulanan MCF-7
hücrelerinde propidium iyodür ile boyanan ölü hücre sayısı Helixor-P uygulananlara
oranla daha fazla olduğu görülmektedir. Ancak ölümlerin nekrozdan mı yoksa
sekonder nekrozdan mı kaynaklandığı bilinmemektedir.
84
Endemik ve Ticari ökse otu ekstraktlarının MDA-MB-231 ve MCF-7 hücre
hatlarında neden oldukları ölüm türlerinin araştırılması ve apoptosizin gösterilmesi
amacıyla western blot yöntemi kullanıldı. Bu yöntemde tez planlanırken apoptosizi
doğrulamak için aktif kaspaz-3 tayininin yapılması planlanmıştı fakat MCF-7 hücre
hatlarında kaspaz-3 geninin mutasyona uğraması nedeniyle (Janicke 2009) her iki
hücre hattında da aktif olan ve ökse otu ekstraktının apoptotik mekanizmasında
kırılarak aktive olduğu bilinen PARP (Poly-ADP-riboz polimeraz) proteininin
aktivasyonu incelendi. Çalışma sonucunda, MDA hücre hatlarında yalnız Helixor-P
uygulananlarda apoptotik ölüm gözlenirken, MCF hücre hatlarında Helixor-P ve 48
saat süreyle Ökse-K uygulananlarda apoptotik ölüm gözlendi.
Kim et al. (2002) tarafından ökse otu lektin-II’nin U937 miyeloid lösemi
hücre hatlarında apoptotik etkisinin araştırıldığı çalışmada, apoptosiz
mekanizmasında yer alan kaspaz-3, kaspaz-9, JNK (c-Jun-N-terminal kinaz), PKC-δ
(Protein kinaz C-δ) ve PARP’ın aktivasyonuna bakılmış ve 116 kDa ağırlığındaki
PARP’ ın kırılarak 85 kDa band oluşturduğu gözlenmiştir. Kim et al. (2001)
tarafından yapılan bir başka çalışmada interferon-γ ile muamele edilen U937
miyeloid lösemi hücre hatlarında, Fas (CD95/APO-1) ve FasL ekspresyonu ile PARP
ve JNK aktivasyonu western blotla araştırılmıştır. Araştırma sonunda interferon-γ ile
muamele edilen hücrelerde Fas ve FasL ekspresyonunun artmadığı, normal U937
hücrelerinde olduğu gibi PARP ve JNK aktivasyonunun olduğu gözlenmiştir.
Meşe üzerinde yetişen ökse otundan hazırlanan ve standardize edilmiş
miktarda lektinleri içeren fermente ekstrakt VA Qu FrF’ın insan venöz endotel hücre
hatlarına (HUVEC) apoptotik etkisi Duong Van Huyen et al. (2002) tarafından
araştırılmış ve sonuçları doğrulamak için western blotla PARP’ın aktivasyonuna
bakılmış ve 116 kDa ağırlığındaki PARP’ ın kırılarak 85 kDa band oluşturduğu
gözlenmiştir
Lyu et al. (2001) kore ökse otu lektininin (Viscum album var. coloratum
agglutinin, VCA) HL-60 akut premyeloid lösemi hücre hattı üzerine apoptotik
etkisinin araştırıldığı çalışmada western blotla kaspaz-3 ve PARP aktivasyonu
gösterilmiştir.
85
Bugüne kadar ökse otunun apoptozisi indüklemesi ile ilgili yapılan çalışmalar
incelendiğinde, çalışmaların büyük çoğunluğunun ülkemizde yetişen türden farklı bir
tür olan Kore ökse otu (Korean mistletoe, Viscum album var. coloratum) ve lektinleri
ile yapılmış olduğu görülmektedir. Ülkemizde yetişen endemik ökse otu türü olan
Avrupa ökse otu (European mistletoe, Viscum album L.) ile ilgili yapılan
çalışmaların sayısı çok sınırlıdır, kullanılan alt türler bizim ülkemizde yetişenlerden
farklıdır ve çalışmaların tamamı ticari olarak hazırlanmış ökse otu preperatları
kullanılarak yapılmıştır. Bu bağlamda endemik Avrupa ökse otunun üç farklı alt
türüne ait liyofilize ekstraktların meme kanseri hücre hatları üzerine apoptotik
etkilerinin ticari ökse otu ekstraktlarıyla kıyaslanarak incelenmesinin literatürde
önemli bir boşluğu dolduracağına inanmaktayız.
MTT sonuçlarına göre endemik ökse otu ekstraktlarında ölüm olduğu halde
pozitif interferanstan dolayı canlılığın daha fazla gözlenmesi, ticari ökse otu
ekstraktlarında tersi bir durum olarak ölüm olmamasına rağmen negatif
interferanstan dolayı canlılığın çok düşük bulanması, MTT yönteminin tek başına
kullanılacak güvenilir bir yöntem olmadığını göstermektedir.
Ökse otu ekstraktının sitotoksik etkilerini belirlemek amacıyla yapılan
araştırmalarda, MTT canlılık testi ile mikroskobik inceleme birlikte yapılmalıdır.
86
ÖZET
Meme Kanseri Hücre Hatları Üzerine Ökse Otu Ekstraktlarının Apoptotik
Etkisinin Araştırılması
Meme kanserinin erken evresinde tedavilerde gözlenen ilerlemelere karşın birçok kadında hastalık tekrar etmekte ve metastaz oluşmaktadır. Geleneksel tedavilerde başarı sınırlı olduğundan, kanser hastalarının çoğu komplementer ve alternetif tıptan köken alan tedavileri denemektedir. Ökse otu preperatları komplementer/alternatif kanser terapisinin en sık kullanılan formudur. Apoptozisi indüklemesi ve bu yolla hücrenin apoptotik ölümüne neden olması bakımından ökse otunun kanser tedavisinde önemi büyüktür. Standart kanser ilaçları ile kombine edilerek sitotoksik etkisinin araştırıldığı çalışmalarda ökse otunun sitotoksisitenin arttırılması yönünde kullanılabileceği belirtilerek ökse otu terapisi için yeni klinik bakış açısı önerilmektedir.
Bu çalışmada, endemik ökse otunun alt türlerine ait tüm bitki ekstraktları Ökse-B, Ökse-Ç ve Ökse-K ekstraktlarının, MDA-MB-231 östrojen reseptörü negatif ve MCF-7 östrojen reseptörü pozitif olan iki farklı meme kanseri hücre hattı üzerine apoptotik etkisi araştırıldı. Bu etki, Almanya’da ticari olarak üretilen ve tedavi amacıyla kullanılan aynı alt türlere ait Helixor-A, Helixor-P ve Helixor-M ekstraktları’nın etkileri ile karşılaştırıldı.
Ökse otu ekstraktlarının sitotoksik etkileri MTT ve ATP canlılık testleri ile belirlendi. MTT sonuçları ile mikroskobik inceleme sonuçları birbirinden farklı bulundu. MTT sonuçlarına göre endemik ökse otu ekstraktlarında ölüm olduğu halde pozitif interferanstan dolayı % canlılık daha fazla gözlendi. Ticari ökse otu ekstraktlarında tersi bir durum olarak ölüm olmamasına rağmen negatif interferanstan dolayı % canlılık çok düşük olarak bulundu. İnterferansın, bitki içeriğinin MTT metodu için kullanılan kimyasallarla etkileşiminden kaynaklanabileceği düşünülmektedir.
Ökse otu ekstraktlarının, sitotoksik etkisini doğrulamak için ATP canlılık testi yapıldı. ATP canlılık metoduna göre, MDA-MB-231 hücre hattında endemik ökse otlarından Ökse-K’nın Ökse-B’ye oranla, ticari ökse otlarında ise Helixor-P’nin Helixor-A’ya oranla daha sitotoksik olduğu bulundu. MCF-7 hücre hattında ise endemik ökse otlarından Ökse-B’nin Ökse-K’ya oranla, ticari ökse otlarında ise Helixor-P’nin diğer iki ekstrakta oranla daha sitotoksik olduğu görüldü.
MDA-MB-231 hücre hattı için tripan blue, ikili boyama ve hematoksilen boyama sonuçları ATP canlılık testi ile benzer sonuçları verirken, MCF-7 hücre hattında farklılık gözlendi. Her üç boyama sonucun da endemik ökse otlarından Ökse-K’nın sitotosik etkisinin, Ökse-B’den daha fazla olduğu görüldü.
Hücre ölüm şeklinin belirlenmesinde ikili boyama ve hematoksilen boyama birlikte değerlendirildi. Hematoksilen boyamada, MDA-MB-231 ve MCF-7 hücre hatlarında, endemik ökse otu ekstraktlarından Ökse-K uygulananlarda ve ticari ökse otu ekstraktlarından Helixor-P uygulananlarda hücre membranlarının parçalandığı gözlendi. Bu durumun, uygulama süresinin uzun olmasından kaynaklandığına karar
87
verildi. İkili boyama sonuçları değerlendirildiğinde, Ökse-K uygulanan MDA-MB-231 ve MCF-7 hücrelerinde propidium iyodür ile boyanan ölü hücre sayısı Helixor-P uygulananlara oranla daha fazla olduğu görüldü. Ancak ölümlerin nekrozdan mı yoksa sekonder nekrozdan mı kaynaklandığı bilinmemektedir.
Endemik ve Ticari ökse otu ekstraktlarının MDA-MB-231 ve MCF-7 hücre hatlarında neden oldukları ölüm türlerinin araştırılması ve apoptozisin gösterilmesi amacıyla western blot yöntemi kullanılarak PARP (Poly-ADP-riboz polimeraz) proteininin aktivasyonu incelendi. Çalışma sonucunda, MDA hücre hatlarında yalnız Helixor-P uygulananlarda apoptotik ölüm gözlenirken, MCF hücre hatlarında Helixor-P ve 48 saat süreyle Ökse-K uygulananlarda apoptotik ölüm gözlendi.
Endemik ökse otunun üç farklı alt türüne ait liyofilize ekstraktların, meme kanseri hücre hatları üzerine sitotoksik etkilerinin ticari ökse otu ekstraktlarıyla kıyaslanarak incelenmesinin literatürde önemli bir boşluğu dolduracağına inanmaktayız.
Anahtar kelimeler: Meme kanseri, Apoptozis, Ökse otu, Helixor
88
SUMMARY
Investigation of The Apoptotic Effect of Mistletoe Extracts on The Breast Carcinoma Cell Lines
Despite the advancements in the treatment of the early stage of breast cancer, disease repeats in many women and metastase occurs. Because of the limitations of the traditional treatments, most of the cancer patients try complementary or alternative treatments. Mistletoe preparates are the most common form of the complementary/alternative cancer therapy. In terms of inducing of apoptosis and by the way causing the apoptotic death of the cell, mistletoe is very important in the treatment of the cancer. In the researchs of cytotoxicity effects of mistletoe with the combination of standart cancer medicines, a new approach was suggested for the mistletoe treatment in the way of enhancement of the cytotoxicity.
In this study, apoptotic effects of the whole extracts of the all sub-species of mistletoe; Mistletoe-B, Mistletoe-Ç and Mistletoe-K was researched on the two different breast cell lines: MDA-MB-231 ostrogen receptor negative and MCF-7 ostrogen receptor positive. This effect was matched with the extracts produced in Germany and used for treatment, Helixor-A, Helixor-P and Helixor-M extracts of the same sub-species.
Cytotoxic effects of the mistletoe extracts was determined with MTT and ATP recurring tests. MTT results and microscobic examination results were different. According to MTT results, percent-liveliness was observed because of the positive interferrence despite the death in the mistletoe extracts. On the contrary that there is no death, percent-livelines was too low in the commercial extracts because of the negative interferrence. It is suggested that interferrence may be caused by the interaction with the chemicals used for MTT method.
ATP liveliness test was done for the confirmation of the cytotoxic effects of the mistletoe extracts. To the ATP liveliness method, endemic mistletoes Mistletoe-K was more cytotoxic than Mistletoe-B and commercial mistletoes Helixor-P was more cytotoxic than Helixor-A in the MDA-MB-231 cell lines. In the MCF-7 cell lines endemic mistletoes Mistletoe-B was more cytotoxic than Mistletoe-K, commercial mistletoes Helixor-P was more cytotoxic than the other two extracts.
Tripan blue, couple staining and hemotoxilen staining results was similar to the ATP liveliness test in the MDA-MB-231 cell lines but difference was observed in the MCF-7 cell lines. It was observed that Mistletoe-K was more cytotoxic than Mistletoe-B in the three staining results.
Couple staining and hemotoxilen staining was used together to determine the death of the cell. In hemotoxilen staiting, it was observed that cell membranes was destroyed in MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines where applied endemic mistletoes Mistletoe-K and commercial mistletoes Helixor-P extracts. It was decided that this situation was derived from the long application time. When the results of the couple staining results evaluated, dead cell count stained with propidium was more in the mistletoe applied MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines than Helixor-P applied cell
89
lines. But its unknown whether the deaths resulted from necrosis or secondary necrosis.
PARP (Poly-ADP-riboz polymerase) protein activation was examined by western blot to Show apoptosis and investigation of the death types caused by endemic and commercial mistletoes in MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines. In the study, in the MDA cell lines, apoptotic death was observed only in Helixor-P applied ones. In MCF cell lines, apoptotic cell death was observed in Helixor-P and 48-hours Mistletoe-K applied ones.
We believe that cytotoxic examination of the lyophillised endemic extracts of 3 different mistletoe sub-species matched with commercial mistletoe extracts on the breast cell lines will fill the important space in the literatures.
Key Words: Breast cancer, Apoptosis, Mistletoe, Helixor
90
KAYNAKLAR
Aggarwal B.B., Shishir S. Molecular Targets of Dietary Agents for Prevention and Therapy of Cancer, J Biochemical Pharmacology 2006; 10:1016
Andreottı Pe, Cree Ia, Kurbacher Cm, Hartmann Dm, Lınder D, Harel G, Gleıberman I, Caruso Pa, Rıcks Sh, Untch M, ET AL. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Research 1995; 55: 5276-5282,
Anne McTiernan.Behavioral risk factors in breast cancer:can be modified?.The oncologist. 2003; 8: 326–334.
Arı F. Gen Metilasyonu İnhibitörü Desaitabin’in Meme Kanseri Tedavisindeki Yerinin in vitro Araştırılması. Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü 2010
Aslan A, Temiz M, Yiğit Y, Can R, Canbolant E, Yiğit F. Hemşirelik Yüksek Okulu Öğrencilerinin Meme Kanseri Hakkında Bilgi, Tutum ve Davranışları. TSK Koruyucu Hekimlik Bülteni, 2007: 6 (3)
Bantel H, Engels IH, Voelter W, Schulze-Osthoff K, Wesselborg S. Mistletoe lectin activates caspase-8/FLICE independently of death receptor signaling and enhances anticancer drug-induced apoptosis. Cancer Res 1999;59: 2083-90.
Barısıc, K., J. Petrık, L. Rumora. Biochemistry of Apoptotic Cell Death. Acta Pharmaceutica2003; 53(3):151-164.
Baytop T. Türkiye’de Bitkiler ile Tedavi. 40, İstanbul: Sanal Matbacılık 1984:203-4.
Becker, H. Botany Of European Mislettoe(Viscum Album L.). Oncolocy 1986, 43 (1): 2-7.
Berkey C.S., Frazier A.L., Gardner J.D. and Colditz G.A Adolescence and breast carcinoma risk. Cancer, 1999; 85: 2400-9.
Bernstein L., Henderson B.E., Hanisch R., Sullivan-Halley J. and Ross R.K. Physical exercise and reduced risk of breast cancer in young women. J Natl Cancer Inst. 1994; 86:1403-8.
Breast Cancer Research and Treatment; 74:187-192.
Brouckaert, G., M. Kalaı, D.V. Krysko, X. Saelens, D. Vercammen, M. Ndlovu, G. Haegeman, K. D'herde, P. Vandenabeele. Phagocytosis Of Necrotic Cells By Macrophages İs Phosphatidylserine Dependent And Does Not Induce İnflammatory Cytokine Production. Molecular Biology Of The Cell 2004; 15(3):1089-1100.
Bryant H. Breast Cancer in Canadian Women. BMC Women’s Health. 2004; 4: 1–12.
Büssing A, Stein G.M, Wagner M, Wagner B, Schaller G, Pfüller U, Schietzel M. Accidental cell death and generation of reactive oxygen intermediates in human lymphocytes induced by thionins from Viscum album L. Eur. J. Biochem. 1999; 262:79-87.
Campbell J.B. (2002) Breast Cancer-Race, Ethnicity, and Survival: Aliterature Review.
Celikler S, Yildiz G, Vatan O and Bilaloglu R. In vitro Antigenotoxicity of Ulva rigida C. Agardh (Chlorophyceae) extract against induction of chromosome aberration, sister chromatid exchange and micronuclei by mutagenic agent MMC. Biomedical and Environmental Sciences 2008; 21, 492-498
Chang HY, Yang X. “Proteases for cell suicide: Functions and regulation of caspases.” Microbiol Mol Biol Rev 2000;64:4:821-46.
91
Chinnaiyan AM, O’Rourke K, Tewari M, Dixit VM. FADD, a novel death domain-containing protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosis. Cell 1995;81:505-12.
Clamp A,Danson S,Clemons M. Hormonal and genetic risk factors for breast cancer. Surg JR Coll Surg Edinb Irel.2003;23–31.
Clavel-Chapelon F, Gerber M. Reproductive Factors and Breast Cancer Risk. Do They Differ According to Age At Diagnosis? Breast Cancer Research and Treatment 2002;72:107-115
Clemons, M, Loijens, L, Goss, P. Breast cancer risk following irradiation for Hodgkin’s disease. Cancer Treat Rev. 2000; 26: 291–302.
Curado M. P., B. Edwards, H. R. Shin, H. Storm, J. Ferlay, M. Heanue and P. Boyle.Cancer Incidence in Five Continents Vol. VIII. IARC Scientific Publication No. 1160. 2007:782.
Cuzick J. Epidemiology of Breast Cancer. The Breast 2003;12:405-411.
Darendeliler E. Meme kanserinin epidemiyolojisi ve etyolojisi. Topuz E (editör). Meme Kanseri Biyoloji, Tanı, Evreleme Tedavi. 3.baskı, İstanbul Üniversitesi, Onkoloji Enstitüsü Yayınları, 1997; 16–32.
Davis, P.H. Flora of Turkey and the East Aegean Islands. Vol:7, Edinburg; University Press, 1982.
Driedger S.M., Eyles J. Organochlorines and Breast Cancer: The Uses of Scientific Evidence in Claimsmanking. Social Science and Medicine 2001;52:1589-1605.
Eggenschwiler J, Balthazar L, Stritt B, Pruntsch D, Ramos M, Urech K, Rist L, Simões-Wüst A P. and Viviani A. Mistletoe lectin is not the only cytotoxic component in fermented preparations of Viscum album from white fir (Abies pectinata). BMC Complementary and Alternative Medicine 2007, 7:14
Eggenschwiler J, Patrignani A, Wagner U, Rehrauer H, Schlapbach R, Rist L, Ramos MH, Viviani A. Gene expression profiles of different breast cancer cells compared with their responsiveness to fermented mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador from oak (Quercus), pine (Pinus), white fir (Abies) and apple tree (Malus) in vitro. Arzneimittelforschung. 2006;56(6A):483-96.
Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 1998;391:43-50.
Ergun F, Deliorman D, Şener B. Viscum album L. (Ökse otu) (Loranthaceae) bitkisinin morfolojik özellikleri ve Türkiye’deki yayılışı hakkında bazı araştırmalar. OT Sistematik Botanik Dergisi 1994; 1(2):47-61.
Ergun F, Deliorman D. Viscum album L. (Ökse otu) bitkisinin kimyasal bileşimi. Ankara Ecz. Fak. Dergisi 1995; 24(2):95-107.
Esposti MD. The roles of Bid. Apoptosis 2002;7:433-40.
Fadeel B, Orrenius S, Zhivotovsky B. The most unkindest cut of all: On the multiple roles of mammalian caspases. Leukemia 2000;14:1514-25.
Gıll, L.S. (1953). Plant Diseases the Yearbook of Agriculture. U.S Depertment of Agriculture, 77-73, Washington, D.C.
Haagensen CD. Diseases of Breast. 3rd edition. Philadelphia: WB Saunders; 1986.
92
Habeck, M. Mistletoe Compound Enters Clinical Trials, DDT 2003; 8 (2):52-53
Hajto T, Hostanska K, Berki T, Palinkas L, Boldizsar F, Nemeth P. Oncopharmacological Perspectives of a Plant Lectin (Viscum album Agglutinin-I): Overview of Recent Results from In vitro Experiments and In vivo Animal Models, and Their Possible Relevance for Clinical Applications. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:59-67.
Hunziker-Basler N, Zuzak TJ, Eggenschwiler J, Rist L, Simões-Wüst AP, Viviani A. Prolonged cytotoxic effect of aqueous extracts from dried viscum album on bladder cancer cells. Pharmazie. 2007;62(3):237-8.
Huppertz, B., H.G. Frank, P. Kaufmann. The Apoptosis Cascade; Morphological And İmmunohistochemical Methods For Its Visualization. Anatomy And Embryology, 1999; 200(1):1-18.
İskender Sayek. Temel Cerrahi 3. Baskı Ankara: Güneş Kitapevi Ltd.Şti. 2004 s.989
Janicke R U. MCF-7 breast carcinoma cells do not express caspase-3. Breast Cancer Res Treat 2009; 117:219–221
Khan N H, Nur-E Kamal M S A, Rahman M . Antibacterial activity of Euphorbia thymifolia Linn. Indian J Med Res, 1988; 87: 395–397.
Khil LY, Kim W, Lyu S, Park WB, Yoon JW, Jun HS. Mechanisms involved in Korean mistletoe lectin-induced apoptosis of cancer cells. World J Gastroenterol. 2007; 13(20):2811-8.
Kim MS, Lee J, Lee KM, Yang SH, Choi S, Chung SY, et al. Involvement of hydrogen peroxide in mistletoe lectin- II-induced apoptosis of myeloleukemic U937 cells. Life Sci 2003;73:1231-43.
Kim MS, Lee J, So HS, Lee KM, Jung BH, Chung SY, et al. Gamma-interferon (IFN-gamma) augments apoptotic response to mistletoe lectin-II via upregulation of Fas/Fas L expression and caspase activation in human myeloid U937 cells. Immunopharmacol Immunotoxicol 2001;23: 55-66.
Kim MS, So HS, Lee KM, Park JS, Lee JH, Moon SK, et al. Activation of caspase cascades in Korean mistletoe (Viscum album var. coloratum) lectin-II-induced apoptosis of human myeloleukemic U937 cells. Gen Pharmacol 2000;34:349-55.
Kim W-H, Park WB, Gao Bin, Jung M-H. Crirical Role of Reactive Oxygen Species and Mitochondrial Membrane Potential İn Korean Mistletoe Lectin-Induced Apoptosis in Human Hepatocarcinoma Cells. Mol. Pharmacol. 2004; 66: 1383-1396
Knöpfl-Sidler F, Viviani A, Rist L, Hensel A. Human cancer cells exhibit in vitro individual receptiveness towards different mistletoe extracts. Pharmazie, 2005;60(6):448-54.
Kong JL, Du XB, Fan CX, Xu JF, Zheng XJ. [Determination of primary structure of a novel peptide from mistletoe and its antitumor activity].Yao Xue Xue Bao. 2004;39(10):813-7.
Korsmeyer SJ. BCL-2 gene family and the regulation of programmed cell death. Cancer Res 1999;59(7): 1693s-700s.
Kruk J. and Aboul-Enein H.Y. Occupational Physical Activity and The Risk of Breast Cancer. Cancer Detection and Prevention 2003; 27:187-192.
Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. The TNF and TNF receptor superfamilies: Integrating mammalian biology. Cell 2001;104:487-501.
93
Mandacı, S. Balıkesir İli Tarım Ve Orman Alanlarında Ökseotları, Zararları, Koruma Ve Savaş Yöntemleri. “Yüksek Lisans Tezi” (Uludağ Üniversitesi). 1998
Manjer J., Berglund B.L., Garne J.P., Janzon L., Malina J. Breast Cancer Incidence in Relation to Smoking Cessation. Breast Cancer Research and Treatment 2000;61:121-129.
Mavroudıs, DP. Papakotoulas, A. Ardavanıs, K. Syrıgos, S. Kakolyrıs, N. Zıras, C. Kouroussıs, N. Malamos, A. Polyzos, C. Chrıstophyllakıs, N. Kentepozıdıs, V. Georgoulıas. Randomized Phase III Trial Comparing Docetaxel Plus Epirubicin Versus Docetaxel Plus Capecitabine As First-Line Treatment İn Women With Advanced Breast Cancer. Annals Of Oncology, 2009; 21(1):48-54.
Miller AG. Viscum album L. in ‘Flora of Turkey and the East Aegean Islands’. 7, Davis: P.H. Ed., 1982.
Mockel B, Schwarz T, Zinke H, Eck J, Langer M, Lentzen H. Effects of mistletoe lectin I on human blood cell lines and peripheral blood cells. Cytotoxicity, apoptosis and induction of cytokines. Arzneimittelforschung 1997;47: 1145-51
Mountz JD Zhou T. Apoptosis and autoimmunity. In: Kopman WJ, ed. A Textbook of Rheumatology: Arthritis and Allied Conditions. 14th ed. Lippincott: Williams & Wilkins; 2001.
Önay, E. Farklı Konakçı Ağaçlar Üzerinde Yaşayan Ökseotu (Viscum Album L.) Bitkisinde Biyokimyasal Analizler. “Yüksek Lisans Tezi” (İstanbul Üniversitesi). 2002
Özdemir O. ve Çalışkan D. Meme Kanserinin Erken Tanısında Kullanılan Yöntemler. Sağlık ve Toplum 2002;12(4):10-14.
Özmen V, Fidaner C, Aksaz E, Bayol Ü, Dede İ, Göker E ve ark. Türkiye’de meme kanseri erken tanı ve tarama programlarının hazırlanması “sağlık bakanlığı meme kanseri erken tanı ve tarama alt kurulu raporu” The Journal of Breast Health 2009: 5(3);125-134.
Park R, Kim MS, So HS, Jung BH, Moon SR, Chung SY, et al. Activation of c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) in mistletoe lectin II-induced apoptosis of human myeloleukemic U937 cells. Biochem Pharmacol 2000;60:1685-91.
Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P: Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin 2005; 55:74-108. (PMID: 15761078)
Ries LAG, Melbert D, Krapcho M, et al., eds. SEER Cancer Statistics Review,1975-2004, National Cancer Institute. Bethesda, http://seer.cancer.gov/csr/1975_2004/, based on November 2006 SEER data submission, posted to the SEER Web site, 2007.
Rogers C., Thompson K., Robinson S. Intoducing A Breast Health Strategy into Schools. Health Education 2002;12(3):106-112.
Rohan TH; Howe GR, Friendenrich CM et. al: Dietary fiber vitamins A, C, and E risk of breast cancer. A cohort study. Cancer Causes Control. 1993; 4: 29-35.
Rossi D, Gaidano G. Messengers of cell death: Apoptotic signaling in health and disease. Haematologica 2003;88: 212-8.
Russo J., Hu Y.F., Yang X. and Russo I.H. Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer. J Natl Cancer Inst Monogr; 2000: 27 17-37
Scmızu, Y., H. Kato, W.J. Schull. Studies of The Mortality of A-Bomb Survivors. 9. Mortality, 1950-1985: Part 2. Cancer Mortality Based on The Recently Revised Doses (DS86). Radiation Research 1990; 121(2):120-141.
94
Siegle I, Fritz P, McClellan M, Gutzeit S, Murdter TE. Combined cytotoxic action of Viscum album agglutinin-1 and anticancer agents against human A549 lung cancer cells. Anticancer Res 2001;21(4A):2687-91.
Simizu S, Takada M, Umezawa K, Imoto M. Requirement of caspase-3(-like) protease-mediated hydrogen peroxide production for apoptosis induced by various anticancer drugs. J Biol Chem 1998;273:26900-7.
Singletary KW, Gapstur SM. Alcohol and breast cancer: review of epidemiologic and experimental evidence and potencial mechanisms. JAMA. 2001; 286: 2143–2151.
Smith R.A., Cokkinides V., Von Eschenbach A.C., Levin B., Cohen C., Runow.cz C.D., Sener S., Saslow D., Eyre H.J. American Cancer Society Guidelines for the Early Detection of Cancer. CA Cancer Journal for Clinicians January-February 2002;52(1):8-22.
Somunoğlu S. Meme kanserinde risk faktörleri. Fırat Sağlık Hizmetleri Dergisi 2007; 2: 2-12.
Spears, M., J.M. Bartlett. Human Epidermal Growth Factor Receptor Dimerization Analysis in Breast Cancer Diagnosis: Potential for Improving Testing Accuracy and Treatment Selection. Moleculer Diagnosis Therapy, 2009; 13(6):359-365.
Styczynski J, Wysocki M. Alternative medicine remedies might stimulate viability of leukemic cells. Pediatr Blood Cancer. 2006; 46(1):94-8.
Telo S. Meme Kanseri Oluşturulan Ratlarda Isırgan Otunun Antioksidan Enzimler Üzerine Etkilerinin İncelenmesi F.Ü. Tıp Fakültesi Biyokimya Ve Klinik Biyokimya Anabilim Dalı Uzmanlık Tezi 2006
Thompson, C.B. Apoptozis. In: Paul WE (eds). Fundemental immunology. Lippincott-Raven Publishers; 1999; 107-138.
Ulukaya E. Apoptozis Ders Notları. Erişim: [http://biyokimya.uludag.edu.tr/ apoptozisdersnotu.pdf] Erişim tarihi: 04.05.2007.
Urech K, Buessing A, Thalmann G, Schaefermeyer H, Heusser P. Antiproliferative effects of mistletoe (Viscum album L.) extract in urinary bladder carcinoma cell lines. Anticancer Res. 2006;26(4B):3049-55.
Urech, K. Mistletoe Constituents and Cancer Therapy. J. Anthroposophical Med 1993;10:54–63.
Vaclavikova R, Horsky S, Simek P, Gut I (2003) The paclitaksel metabolism in rat and human liver microsomes is inhibited by phenolic antioksidants. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol 368:200-209
Wajant H. The Fas signaling pathway: More than a paradigm. Science 2002;296:1635-6.
Walker BG. The Woman’s Encyclopedia of Myths and Secrets. San Francisco: Harper & Row, 1983; 661–3.
White MK, McCubrey JA. Suppression of apoptosis: Role in cell growth and neoplasia. Leukemia 2001;15:1011-21.
Williams T., Clarke VA., Savage S. Women’s Perceptions of Familial Aspects of Breast Cancer. Health Education 2002;102(2):50-59.
Willingham, M.C. Cytochemical Methods for The Detection of Apoptosis. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 1999; 47(9):1101-1109.
95
Yesilada E, Deliorman D, Ergun F, Takaishi Y, Ono Y. Effects of the Turkish subspecies of Viscum album on macrophage-derived cytokines. J Ethnopharmacol 1998;61:195-200.
Yoo KY, Kang D, Park SK, Kim SU, Kim SU, Shin A, Yoon H, Ahn SH, Noh DY, Choe KJ. Epidemiology of breast cancer in Korea: occurrence, high-risk groups, and prevention. Korean Med Sci. 2002; 17: 1–6.
Zarković N, Kalisnik T, Loncarić I, Borović S, Mang S, Kissel D, Konitzer M, Jurin M, Grainza S. Comparison of the effects of Viscum album lectin ML-1 and fresh plant extract (Isorel) on the cell growth in vitro and tumorigenicity of melanoma B16F10. Cancer Biother Radiopharm. 1998;13(2):121-31.
Ziegler RG, Hoover RN, Nomura AM et al. Relative weight, weight chance, height, and breast cancer risk in Asian-American women. J Nathl Cancer Inst. 1996; 88: 650–660.
Ziska P, Gelbin M, Franz H. Interaction of mistletoe lectins ML-I, ML-II and ML-III with carbohydrates. In: Franz H, Bog-Hansen TC, eds. Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry. Berlin: Walter de Gruyter; 1991. p.10-3.
Zuzak TJ, Rist L, Eggenschwiler J, Grotzer MA, Viviani A. Paediatric medulloblastoma cells are susceptible to Viscum album (Mistletoe) preparations. Anticancer Res. 2006; 26(5A):3485-92.
96
ÖZGEÇMİŞ
1978 yılında Isparta’da doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini Isparta’da
tamamladı. 2001 yılında Orta Doğu Teknik Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi
Biyoloji bölümünde lisans öğrenimini tamamladı. 2002 yılında Süleyman Demirel
Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalında yüksek
lisans öğrenimine ve Araştırma Görevlisi olarak göreve başladı. 2005 tarihinde
Süleyman Demirel Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Anabilim
Dalında doktora eğitimine başladı.