第九章 第九章 微生物的分类、鉴定 微生物的分类、鉴定

TaxonomyTaxonomy 、、 IdentificationIdentification

微生物分类鉴定目的微生物分类鉴定目的 分类是人类认识微生物，进而利用和改造分类是人类认识微生物，进而利用和改造

微生物的一种手段，微生物工作者只有在微生物的一种手段，微生物工作者只有在掌握了分类学知识的基础上，才能对纷繁掌握了分类学知识的基础上，才能对纷繁的微生物类群有一清晰的轮廊，了解其亲的微生物类群有一清晰的轮廊，了解其亲缘关系与演化关系，为人类开发利用微生缘关系与演化关系，为人类开发利用微生物资源提供依据。物资源提供依据。

第一节 微 生 物 分 类 学第一节 微 生 物 分 类 学微生物分类学微生物分类学 (Taxonomy)(Taxonomy) 是一门是一门按微生物类群的亲缘关系把它们安排成条理清楚按微生物类群的亲缘关系把它们安排成条理清楚

的各种分类单元或分类群（的各种分类单元或分类群（ TaxonTaxon ）的科学）的科学 分类学的任务分类学的任务 分类（ 分类（ ClassificationClassification ）：是指根据相似性或）：是指根据相似性或亲缘关系，将一个生命有机体放在一个单元中 亲缘关系，将一个生命有机体放在一个单元中 命名（ 命名（ NomenclatureNomenclature ）：是按照国际命名）：是按照国际命名法规给予生命有机体一个科学的名称 法规给予生命有机体一个科学的名称 鉴定（ 鉴定（ IdentificationIdentification ）：是指确定一个新分）：是指确定一个新分

离物是否归属于某个已命名的分类单元的过程。离物是否归属于某个已命名的分类单元的过程。

一、微生物的分类单位（单元）一、微生物的分类单位（单元） 界（界（ KingdomKingdom ） ） 门（门（ Phylum or DivisionPhylum or Division ） ） 纲（纲（ ClassClass ） ） 目（目（ OrderOrder ） ） 科（科（ FamilyFamily ） ） 属（属（ GenusGenus ） ） 种（种（ SpeciesSpecies ） ） 种是最基本的分类单位。 种是最基本的分类单位。 但分类单元之间可加入亚门、亚纲、亚目、亚科但分类单元之间可加入亚门、亚纲、亚目、亚科

等次要分类单位。种以下又可分为亚种、变种、等次要分类单位。种以下又可分为亚种、变种、型、菌株等型、菌株等

微生物种与亚种的概念微生物种与亚种的概念 种 (Species) ：难下定义，无公认的

凡是于典型培养菌紧密相同的其他培养菌统一起来，区分为细菌的一个种（ Species ），即是以某个“典型菌株”为代表、十分类似的、与同属的其它物种有着明显差异的一大群菌株的总称。1987 年，国际细菌分类委员会颁布， DNA 同源≧ 70% ，而且其 Tm≦5oC 的菌群为一个种

典型菌株（模式种）：在微生物中作为一个种的典型、具体代表的菌株。

在微生物中，种还是一个抽象的概念，具有该种的许多典型性状的模式菌株才是具体的种。

亚种（ Subspecies) 在种内，有些菌株在遗传学上关系密切，

而且在表型上仅存在较小的某些差异，在种内分成 2 个或 2 个以上的分类单位，即为亚种

微生物亚种以下的变型分类微生物亚种以下的变型分类亚种以下 亚种以下 生物变型生物变型————表示特殊的生化或生理表示特殊的生化或生理

特征 特征 血清变型——表示抗原结构不同 血清变型——表示抗原结构不同 致病变型——表示某些寄主的专一致致病变型——表示某些寄主的专一致

病性 病性 噬菌变型——表示对噬菌体的特异性噬菌变型——表示对噬菌体的特异性

反应 反应 形态变型——表示特殊的形态特征形态变型——表示特殊的形态特征

微 生 物 的 菌 株微 生 物 的 菌 株 菌株菌株 (Strain)(Strain) 或称品系 或称品系 是指同种微生物不同来源的纯培养物即单个是指同种微生物不同来源的纯培养物即单个

分离物的纯培养后代，常以数字、字母、人名分离物的纯培养后代，常以数字、字母、人名或地名等表示或地名等表示

一种微生物的每一不同来源的纯培养物或纯分一种微生物的每一不同来源的纯培养物或纯分离物均可称为菌种的一个菌株。离物均可称为菌种的一个菌株。

（（ 11 ）菌株数目几乎是无数的）菌株数目几乎是无数的（（ 22 ）是遗传型纯的谱系）是遗传型纯的谱系（（ 33 ）同一菌种的不同菌株间，主要性状相同，）同一菌种的不同菌株间，主要性状相同，

其他次要性状可能相差较大其他次要性状可能相差较大（（ 44 ）菌株变异应表以新的菌株）菌株变异应表以新的菌株（（ 55 ）实际应用菌种时都要在种的后面标出该菌）实际应用菌种时都要在种的后面标出该菌

株的名称 株的名称

分离物是指已分离得到但未经鉴定的纯培分离物是指已分离得到但未经鉴定的纯培养物的后代即为分离物 养物的后代即为分离物

群群 (Group) (Group) 为工作方便而将近似的种或介于种间的菌株为工作方便而将近似的种或介于种间的菌株

按其形态或结合生理生化、生态特征归为若干按其形态或结合生理生化、生态特征归为若干类群。如放线菌中的链霉菌属内的种归为类群。如放线菌中的链霉菌属内的种归为 1212个类群个类群

二、微 生 物 的 命 名二、微 生 物 的 命 名 11 微生物名称有俗名（地区性）和学名（科学）微生物名称有俗名（地区性）和学名（科学） 微生物的命名按国际命名法命名，即微生物的命名按国际命名法命名，即 LinnaLinna所所创立的“双名法”创立的“双名法”

每一种微生物都用属与种命名，由每一种微生物都用属与种命名，由 22 个拉丁词个拉丁词或希腊词或拉丁化了的其他文字组成。属名和种或希腊词或拉丁化了的其他文字组成。属名和种名用斜体表达 名用斜体表达

属名在前，用拉丁名词表示微生物的构造、形属名在前，用拉丁名词表示微生物的构造、形态、某科学家名字等，描述微生物的主要特征。态、某科学家名字等，描述微生物的主要特征。第一字母大写 第一字母大写

种名在后，第一字母小写。用拉丁形容词表示，种名在后，第一字母小写。用拉丁形容词表示，描述微生物的色素、形状、来源、病名、地名、描述微生物的色素、形状、来源、病名、地名、某科学家的名字等等 某科学家的名字等等

在种名后，附上首次命名者的姓、现名定名人在种名后，附上首次命名者的姓、现名定名人和命名年份和命名年份 （正体），可省略。 （正体），可省略。

Bacillus subtilisBacillus subtilis （（ EhrenbergEhrenberg ） ） Cohn 1872Cohn 1872

微 生 物 的 命 名微 生 物 的 命 名 22 如命名对象是新种，需在种名后加如命名对象是新种，需在种名后加 sp.nsp.n

ov ov 或或 nov.sp(nov.sp( 即即 nova species) nova species) 如仅泛指某一属的微生物，或某属微生如仅泛指某一属的微生物，或某属微生

物内的某些种，则在属名后用物内的某些种，则在属名后用 sp.sp. （单数（单数时）或时）或 spp.spp. （复数时） （复数时）

当某种微生物是一个亚种（简称当某种微生物是一个亚种（简称 subspsubsp ）或）或变种（变种（ varvar ）时，学名应按三名法命名。）时，学名应按三名法命名。

如需表示变种，则在变种学名前加如需表示变种，则在变种学名前加 var., var., 变变种学名命名原则与种名的命名同 种学名命名原则与种名的命名同

StaphylococcusStaphylococcus aureus aureus Rosenbach Rosenbach 1884 1884 属名：葡萄球菌 种名：金黄色 命属名：葡萄球菌 种名：金黄色 命名者姓 命名年份名者姓 命名年份

Bacillus thuringiensisBacillus thuringiensis （（ subspsubsp ）） gallgalleriaeria

Bacillus subtilisBacillus subtilis var. var. niger niger Desulfotomaculum thermoacetoxidDesulfotomaculum thermoacetoxid

ans ans n. sp. Strain CAMZn. sp. Strain CAMZ

三、微生物系统发育分析三、微生物系统发育分析 由于现代分子生物学技术的迅速发展，正在形由于现代分子生物学技术的迅速发展，正在形

成一套与传统的分类鉴定方法完全不同的分类鉴成一套与传统的分类鉴定方法完全不同的分类鉴定技术与方法，从基因水平上分析各微生物种之定技术与方法，从基因水平上分析各微生物种之间的亲缘关系，即系统发育地位。 间的亲缘关系，即系统发育地位。

原核生物细胞中的原核生物细胞中的 16S rDNA 16S rDNA 和真核生物细和真核生物细胞中的胞中的 18S rDNA18S rDNA 的碱基序列都是十分保守的，的碱基序列都是十分保守的，不受微生物所处环境条件的变化、营养物质的丰不受微生物所处环境条件的变化、营养物质的丰缺的影响而有所变化，都可以看作为生物进化的缺的影响而有所变化，都可以看作为生物进化的时间标尺，记录着生物进化的真实痕迹。因此，时间标尺，记录着生物进化的真实痕迹。因此，分析原核生物细胞中的分析原核生物细胞中的 16S rDNA 16S rDNA 和真核生物和真核生物细胞中的细胞中的 18S rDNA18S rDNA 的碱基序列，比较所分析的碱基序列，比较所分析的微生物与其他微生物种之间的微生物与其他微生物种之间 16S rDNA16S rDNA 和和 1818S rDNAS rDNA 序列的同源性，可以真实地揭示它们亲序列的同源性，可以真实地揭示它们亲缘关系的距离和系统发育地位。缘关系的距离和系统发育地位。

系统发育研究方法系统发育研究方法 除了选择除了选择 16S rDNA16S rDNA 和和 18S rDNA18S rDNA 作序作序列分析进行系统发育比较外， 还可利用间列分析进行系统发育比较外， 还可利用间隔序列隔序列 (ITS)(ITS) 、某些发育较为古老而序列、某些发育较为古老而序列又较稳定的特异性酶的基因作序列分析，又较稳定的特异性酶的基因作序列分析，进行系统发育分析。 如在环境微生物研究进行系统发育分析。 如在环境微生物研究中，对于谷胱甘肽转移酶（中，对于谷胱甘肽转移酶（ GSTGST ）的基因）的基因序列分析所获得的系统发育鉴定结果与用序列分析所获得的系统发育鉴定结果与用其他方法所获得的结果具有十分吻合的一其他方法所获得的结果具有十分吻合的一致性。致性。

系统学系统学（（ systematicssystematics ）） 系统学（系统学（ systematicssystematics ）是研究生物多样性及其分类）是研究生物多样性及其分类

和演化关系的科学。和演化关系的科学。 分子系统学是检测、描述并揭示生物在分子水平上的多分子系统学是检测、描述并揭示生物在分子水平上的多样性及其演化规律的科学。研究内容包括了群体遗传结样性及其演化规律的科学。研究内容包括了群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化等领域。 构、分类学、系统发育和分子进化等领域。

群体遗传结构群体遗传结构 (population genetic structure)(population genetic structure) 是是指一个种内总的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，指一个种内总的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，是一个种最基础的遗传信息。 是一个种最基础的遗传信息。

分类学分类学 (taxonomy)(taxonomy) 是研究物种的界定和序级确定。是研究物种的界定和序级确定。系统发育关系系统发育关系 (phylogenetic relationship)(phylogenetic relationship) 和分子和分子进化进化 (molecular evolution)(molecular evolution) 是两个密切相关的过程。是两个密切相关的过程。

在利用现代分子生物学技术在分子和基因水平上获得大在利用现代分子生物学技术在分子和基因水平上获得大量的分类单元尤其是种的量的分类单元尤其是种的遗传信息遗传信息后，来推断和重建微后，来推断和重建微生物类群的演化历史和演化关系，即建立系统发育树。生物类群的演化历史和演化关系，即建立系统发育树。

第二节 原核微生物分类系统第二节 原核微生物分类系统一、原核微生物伯杰氏分类系统一、原核微生物伯杰氏分类系统 《伯杰氏细菌鉴定手册》 《伯杰氏细菌鉴定手册》 《伯杰氏系统细菌学手册》（《伯杰氏系统细菌学手册》（ 19801980 起，起， 11

984-1989984-1989 年陆续分四卷出版，第二版年陆续分四卷出版，第二版 20020000 分分 55卷陆续发行，古细菌两个门，细菌卷陆续发行，古细菌两个门，细菌 1166 个门）个门）

细 菌 分 类 系 统细 菌 分 类 系 统 最有代表性和最有影响的细菌分类系统 最有代表性和最有影响的细菌分类系统 《伯杰氏细菌鉴定手册》 （《伯杰氏细菌鉴定手册》 （ Bergey’s Bergey’s Manual of Determinative BacteriologManual of Determinative Bacteriology) 1923y) 1923 年年 , 1925, 1925 年年 , 1930, 1930 年年 , 1934, 1934 年年 ,, 1939 1939 年年 , 1948, 1948 年年 , 1957, 1957 年年 , 1974, 1974 年分年分别出版了第一至第八版，别出版了第一至第八版， 19941994 年出了第九年出了第九版 以形态、生理生化、版 以形态、生理生化、 G + C mol%G + C mol% 、生、生态分布等特征为主态分布等特征为主

《伯杰氏系统细菌学手册》（《伯杰氏系统细菌学手册》（ Bergey’s Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology) Manual of Systematic Bacteriology) second edition 2001 second edition 2001 以生理生化、以生理生化、 G + G + C mol%C mol% 、系统发育地位等为主——体现、系统发育地位等为主——体现了现代分子生物学的研究成果 尚未出齐了现代分子生物学的研究成果 尚未出齐

细菌的分类高级单位细菌的分类高级单位 原核生物界（原核生物界（ Procaryotae) Procaryotae) 薄壁菌门薄壁菌门 (Gracilicutes) (Gracilicutes) 暗细菌纲 暗细菌纲 (Scotobacteria) (Scotobacteria) 无氧光细菌纲无氧光细菌纲 (Anoxyphotobacteria) (Anoxyphotobacteria) 产氧光细菌纲产氧光细菌纲 (Oxyphotobacteria) (Oxyphotobacteria) 厚壁菌门厚壁菌门 (Fimicutes) (Fimicutes) 厚壁菌纲厚壁菌纲 (Fimibacteria) (Fimibacteria) 放线菌纲 放线菌纲 (Thallobacteria) (Thallobacteria) 软壁菌纲软壁菌纲 (Tenericutes) (Tenericutes) 柔膜菌纲 柔膜菌纲 (Mollicutes) (Mollicutes) 疵壁菌门疵壁菌门 (Mendosicutes) (Mendosicutes) 古细菌纲古细菌纲 (Archarbacteria)(Archarbacteria)

关于变形细菌关于变形细菌 ((ProteobacteriaProteobacteria)) 纲 纲 11 运用运用 DNA/RNADNA/RNA 杂交、杂交、 16S rRNA16S rRNA 编编

目法和目法和 16S rRNA16S rRNA 序列分析方法对序列分析方法对革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌系统发育研究的结果相当一致。系统发育研究的结果相当一致。在研究过程中，发现“紫细菌和相关细在研究过程中，发现“紫细菌和相关细菌”，尽管在表型和基因型方面很不一样菌”，尽管在表型和基因型方面很不一样即相当异源，但在系统发育树状图谱上具即相当异源，但在系统发育树状图谱上具有连续现象，相互之间的进化关系很为密有连续现象，相互之间的进化关系很为密切。切。 19881988 年，年， StackebrandtStackebrandt 等将这类等将这类革兰氏阴性细菌命名为“变形细菌”（革兰氏阴性细菌命名为“变形细菌”（ PrProteobacteriaoteobacteria ），其下由），其下由 a-a- 亚纲、亚纲、 b-b- 亚亚纲，纲， g-g- 亚纲、亚纲、 d-d- 亚纲和亚纲和 e-e- 亚纲。亚纲。

关于变形细菌关于变形细菌 ((ProteobacteriaProteobacteria)) 纲 纲 22 a-a- 亚纲包括一大群形态、生理和营养类型（光能自养型、化能亚纲包括一大群形态、生理和营养类型（光能自养型、化能

无机营养型和化能有机营养型）等表型特征十分不同的细菌，如无机营养型和化能有机营养型）等表型特征十分不同的细菌，如土壤杆菌（土壤杆菌（ AgrobacteriumAgrobacterium ）、根瘤菌）、根瘤菌 ((RhizobiumRhizobium)) 、红假、红假单胞菌单胞菌 ((RhodopseudomonasRhodopseudomonas)) 、发酵单胞菌、发酵单胞菌 ((ZymomonasZymomonas)) 、、副球菌等副球菌等 ((ParacoccusParacoccus)) 、立克次氏体（、立克次氏体（ RickettsiaRickettsia ）等。 ）等。

b-b- 亚纲由亚纲由WoeseWoese 于于 19841984 年提出，包括的菌群有色杆菌属年提出，包括的菌群有色杆菌属 ((CChromobacteriumhromobacterium)) ，水螺菌属，水螺菌属 ((AquaspirillumAquaspirillum)) ，紫色杆菌，紫色杆菌((JanthinobacteriumJanthinobacterium)) ，德克斯氏菌，德克斯氏菌 ((DerxiaDerxia)) ，丛毛单胞菌，丛毛单胞菌((ComamonasComamonas)) ，嗜木杆菌（，嗜木杆菌（ XylophilusXylophilus ）等。 ）等。

g-g- 亚纲由亚纲由Weose1985Weose1985 年提出，包括了肠杆菌科年提出，包括了肠杆菌科 (Enterobac(Enterobacteriaceae)teriaceae) ，气单胞菌科，气单胞菌科 (Aeromonadaceae)(Aeromonadaceae) ，弧菌科，弧菌科 (Vib(Vibrionaceae)rionaceae) ，巴斯德菌科，巴斯德菌科 (Pasteurellaceae)(Pasteurellaceae) ，假单胞菌，假单胞菌 ((PsPseudomonaseudomonas)) ，海洋螺菌，海洋螺菌 ((OceanospirillumOceanospirillum)) ，黄单胞菌，黄单胞菌 ((XXanthomonasanthomonas)) ，溶杆菌，溶杆菌 ((LysobacterLysobacter)) 等 等

d-d- 亚纲由分解代谢的硫酸盐还原细菌、元素硫还原细菌，蛭弧亚纲由分解代谢的硫酸盐还原细菌、元素硫还原细菌，蛭弧菌菌 ((BdellovibrioBdellovibrio)) 和黏细菌目和黏细菌目 (Myxococcales)(Myxococcales) 的的 66 个代表。 个代表。

e-e- 亚纲仅有弯曲杆菌亚纲仅有弯曲杆菌 ((CampylobacterCampylobacter)) 和螺杆菌和螺杆菌 ((HeliobacHeliobacterter)2)2 属。属。

二、 Ainsworth 等人的菌物分类系统纲要 90 年代初，提出以菌物代替真菌，目前认为菌

物与真菌两者的关系是：

已有记载的菌物有 7万 ~9万，地球上估计有 150万种。从 1729 年至今已有不下 10 余个有代表 性的菌物分类系统。目前， Ainsworth 菌物分类系统（ 1983 年第七版，中译名为《安 ·贝氏菌物词典》）得到学术界较广泛采用。第八版（ 1995 年）有变动，把菌物列入真核生物域的 3 个界中。

粘菌门

假菌门（卵菌类）

真菌门

菌物界 （ Mycetalia ）

第七版（第七版（ 19831983 ））

菌物界

粘菌门

真菌门

鞭毛菌亚门

壶菌纲

丝壶菌纲

卵菌纲

接合菌亚门

子囊菌亚门 : 无纲 , 直接分 37 个目

担子菌亚门

半知菌亚门

接合菌纲

毛菌纲

层菌纲腹菌纲

锈菌纲黑粉菌纲

腔孢菌纲

丝孢菌纲

第八版 (1995 年 ):

真核生物域

原生动物界

集孢粘菌门网柱粘菌门

粘菌门

肿根菌门

假菌界丝壶菌门

卵菌纲

网粘菌门

真菌界

子囊菌门

接合菌门

担子菌门壶菌门

有丝煲真菌类

第三节第三节

原核微生物的分类鉴定方法 原核微生物的分类鉴定方法

Classification and IdentificatClassification and Identificationion

of Procaryotesof Procaryotes

微生物的分类技术水平微生物的分类技术水平 微生物分类中使用的技术水平 微生物分类中使用的技术水平 细胞形态水平 细胞形态水平 细胞组分水平 细胞组分水平 蛋白质水平 蛋白质水平 基因组水平基因组水平

微生物的分类方法 微生物的分类方法 11 经典分类鉴定法 经典分类鉴定法 形态特征形态特征：：个体 群体 个体 群体 生理生化特征：营养要求（碳源，氮源，生 生理生化特征：营养要求（碳源，氮源，生

长因子）；代谢产物（种类，产量，显色反 长因子）；代谢产物（种类，产量，显色反应等）；酶（产酶种类，反应特性等） 应等）；酶（产酶种类，反应特性等）

生态学特征：生长温度，对氧需要，酸碱要生态学特征：生长温度，对氧需要，酸碱要求，宿主种类等 求，宿主种类等

血清学反应 血清学反应 噬菌体的敏感性 噬菌体的敏感性 其他其他

微生物的微型、简便、快速或自动化鉴定微生物的微型、简便、快速或自动化鉴定系统系统

APIAPI 细菌数值鉴定系统：同时鉴定细菌数值鉴定系统：同时鉴定 2020 项项以上生化指标，可鉴定细菌以上生化指标，可鉴定细菌 700700 多种多种

EnterotubeEnterotube 系统：肠管系统系统：肠管系统

Biolog Biolog 全自动和手动细菌鉴定系统 ：全自动和手动细菌鉴定系统 ： 11114040 种细菌和酵母菌 种细菌和酵母菌

微生物的分类方法微生物的分类方法 22 数值分类法又称阿得逊氏法数值分类法又称阿得逊氏法（（ AdansoniaAdansonia

n classification) n classification) 以两两菌株的形态、生理生化特征，对环以两两菌株的形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性及生态特征为依据由计境的反应和忍受性及生态特征为依据由计算机计算两者之间的总近似值，列出相似算机计算两者之间的总近似值，列出相似值矩阵，将相似度高的菌株列在一起，然值矩阵，将相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱（后将矩阵图转换成树状谱（ DendrograDendrogram)m) 的分类方法。的分类方法。

微生物的分类方法微生物的分类方法 33 化学分类法化学分类法（（ ChemotaxonomyChemotaxonomy ） ） 根据微生物细胞的特征性化学组成成根据微生物细胞的特征性化学组成成

分对微生物进行的分类方法分对微生物进行的分类方法 细胞壁成分、全细胞水解液的糖型、磷细胞壁成分、全细胞水解液的糖型、磷酸类脂成分、枝菌酸、醌类、气相色谱酸类脂成分、枝菌酸、醌类、气相色谱技术等技术等

微生物分类方法微生物分类方法 44 遗传学分类方法 遗传学分类方法

DNADNA 中中 G+CG+C含量百分比分析 含量百分比分析 细菌含量变化范围在细菌含量变化范围在 25%~75%25%~75% ，放，放线菌在线菌在 37% ~51%37% ~51% 。。 2 2 种之间差异超过种之间差异超过 110%0% ，肯定不是同一个种 ，肯定不是同一个种

DNA-DNADNA-DNA杂交 杂交 测定杂合的百分数，如同一种，应为测定杂合的百分数，如同一种，应为 11

00% 00% DNA-rRNADNA-rRNA 杂交 杂交

16SrRNA16SrRNA寡核苷酸的序列分析 寡核苷酸的序列分析 分析后作出相似性图，关系近的集中到一起，关分析后作出相似性图，关系近的集中到一起，关

系远的在图上占据不同的位置系远的在图上占据不同的位置

分离菌株分离菌株 16S rRNA16S rRNA 基因的分离基因的分离 从平板中直接挑取一环分离菌株细胞从平板中直接挑取一环分离菌株细胞 , , 加入加入 100100

μLμL 无菌重蒸无菌重蒸 H2OH2O 中中 , , 旋涡混匀后旋涡混匀后 , , 沸水浴沸水浴 2mi2min, 12 000r min-1n, 12 000r min-1 离心离心 5min, 5min, 上清液中即含上清液中即含 1616S rRNAS rRNA 基因，可直接用于基因，可直接用于 PCRPCR扩增。 扩增。

分离菌株分离菌株 16S rRNA 16S rRNA 基因的基因的 PCRPCR扩增和序列扩增和序列测定的一般步骤为：测定的一般步骤为： 16S rRNA16S rRNA 基因的基因的 PCRPCR引引物：物： 5‘-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3’5‘-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3’；；5‘-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3’5‘-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3’ 。扩。扩增反应体积增反应体积 5050LL ，反应条件为，反应条件为 95℃95℃预变性预变性 5mi5minn ，， 94℃94℃ 变性变性 1min1min ，， 55℃55℃退火退火 1min1min ，， 7272℃℃延伸延伸 2min2min ，共进行，共进行 2929 个循环，个循环， PCRPCR 反应在反应在PTC-200PTC-200 型热循环仪上进行。取型热循环仪上进行。取 55LL 反应液在反应液在 110g L-10g L-1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

PCRPCR产物测序可由专门技术公司完成。产物测序可由专门技术公司完成。

系统发育树的构建系统发育树的构建 测序得到分离菌株测序得到分离菌株 16S rDNA16S rDNA 部分序列，此序部分序列，此序列一般以列一般以 *.f.seq*.f.seq 形式保存，可以用写字板或形式保存，可以用写字板或 EEditsequenceditsequence 软件打开，将所得序列通过软件打开，将所得序列通过 BlastBlast程序与程序与 GenBankGenBank 中核酸数据进行比对分析中核酸数据进行比对分析 ( ( http://www.http://www.ncbincbi..nlmnlm..nihnih..govgov/blast/blast ) ) 。 。

具体步骤如下：点击网站中具体步骤如下：点击网站中 Nucleotide BLANucleotide BLASTST 下下 Nucleotide-nucleotide BLAST [blastNucleotide-nucleotide BLAST [blastn]n] 选项，将测序所得序列粘贴在“选项，将测序所得序列粘贴在“ search”search” 网网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“击核酸比对选项，即“ blast”blast” ，然后点击“，然后点击“ fformat”ormat” ，计算机自动开始搜索核苷酸数据库，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断而初步判断 16S rDNA16S rDNA 鉴定结果。鉴定结果。

遗传距离矩阵遗传距离矩阵 遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用 DNADNA

StarStar软件包中的软件包中的 MegAlignMegAlign 程序计算样本间的遗程序计算样本间的遗传距离。由传距离。由 GenBankGenBank 中得到相关菌株的序列，中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入与本研究分离菌株所测得序列一起输入 ClustalxClustalx1.81.8 程序进行程序进行 DNADNA 同源序列排列，并经人工仔细同源序列排列，并经人工仔细核查。 核查。

在此基础上，序列输入在此基础上，序列输入 Phylip3.6Phylip3.6软件包，以软件包，以简约法构建系统发育树。使用简约法构建系统发育树。使用 Kimura 2-paramKimura 2-parametereter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（ BBootstrapootstrap ）） 500500 次重复检测，次重复检测， DNADNA序列变异中序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。的转换和颠换赋于相同的加权值。