转录组 Trinity 组装软件介绍 微生物组： 曾柳红 2011-9-16

Outline

Why do we use Trinity ?

How does Trinity work ?

How to run Trinity ？

Why do we use Trinity ?• 转录组组装面临的挑战：﹡ 转录本覆盖度不均匀，一些转录本覆盖度很低，一些则会很高。﹡ 由于序列本身偏向性，转录本内 read 覆盖度可能不一致。﹡ 与一个测序正确但低表达的转录本相比，一个有测序错误但高表达的转录本，其表达丰度可能更高。﹡ 由于可变剪切，构建数据结构需考虑到一个基因有多个转录本的可能。﹡ 来自不同基因的重复序列可能给组装带来歧义。

Why do we use Trinity ?• 转录组组装方法：

• 把所有 reads 比对到一个未注释的参考基因组中，再通过 overlap 连接序列，横跨 reads 及paired-ends 间的交叉点。

Mapping-first

approaches

• 用 reads 直接组装Assembly-

first(de novo)

methords

ScriptureCufflinks

AbyssSOAPdenovoOasesTrinity

How does Trinity work ?• Trinity 破茧成蝶的过程Inchworm （ C+

+ ）Chrysalis (C++)

Butterfly (Java)

• Inchworm﹡ 构建 k-mer 库， K=25 。﹡ 从 k-mer 库中删除可能包含错误的 k-mer 。﹡ 选择最高频度的 k-mer 作为种子（不包括复杂度和单一的 k-mers, 一次用完即从 k-mer 库中剔除），用来 contig 组装。﹡ 延伸种子， k-1 个 overlap 关系。（ a greedy k-mer-based approach ）﹡ 延伸至不能再延伸，形成线性 contig﹡ 重复 3-5 ，直到 k-mer 库为空。

• Chrysalis﹡ 把可能存在可变剪切及其他平行基因的 contigs聚类。 聚类情况：（ 1 ）如果 contigs 间有 k-1 （ 25-1=24 ）个 overlap 。（ 2 ）如果两个 contig 各有（ k-1 ） /2 个 overlap 。﹡ 每个 contigs 集定义成一个 component ，对每个 component 构建 de Bruijn graphs （构建 de

Bruijn 图时， Trinity 利用 k-1mer 作为节点， SOAPdenovo 利用 k-mer 作为节点）﹡ 拿 reads 验证，看每个 component 的 reads 支持情况。

• Butterfly﹡graph simplification（ 1 ）合并在 de Bruijn 图中有连续节点的线性路径，以形成更长的序列。（ 2 ）剔除可能由于测序错误（只有极少 reads 支持）的分叉，使边均匀。 ( 多倍体多态性似乎比测序错误更常见，保留）

﹡plausible path scoring 用动态规划算法打分，鉴定被 reads 和 read pairs 支持的路径，剔除 reads 支持少的路径。

• Butterfly

• Butterfly

How to run Trinity• 在官网下载，解压缩。 make

http://sourceforge.net/projects/trinityrnaseq/• 目前版本 trinityrnaseq_r2011-08-20 （比原版本 trinityrnaseq-03122011 运行效率快很多）• perl

/ifs2/BC_MG/RNA/bin/denovo_2.0/trinityrnaseq_r2011-08-20/Trinity.pl --seqType fq --left *_1.fq --right *_2.fq --output outdir --min_contig_length 100 --paired_fragment_length 199 --run_butterfly --CPU 10

• 参数设置见： http://trinityrnaseq.sourceforge.net/#running_trinity

• 具体执行步骤（ 2011-08-20 版）CMD: java -jar util/ExitTester.jar 0CMD: java -jar util/ExitTester.jar 1CMD:util/fastQ_to_fastA.pl -I *_1.fq> left.faCMD: util/fastQ_to_fastA.pl -I *_2.fq> right.faCMD: cat left.fa right.fa > both.faCMD: util/strip_fasta_header.pl both.fa > both.fa.headlessCMD: trinity-plugins/kmer/meryl/meryl -v -B -m 25 -s both.fa.headless -o meryl_kmer_db -CCMD: kmer/meryl/meryl -Dt -n 1 -s meryl_kmer_db > meryl.kmers.min1.faCMD: Inchworm/bin/inchworm --kmers meryl.kmers.min1.fa --run_inchworm -K 25 -L 48 --monitor 1 --DS 2>monitor.out > inchworm.K25.L48.DS.faCMD: Chrysalis/Chrysalis -i both.fa -iworm inchworm.K25.L48.DS.fa -o chrysalis -min 100 -dist 199 -butterfly Butterfly/Butterfly.jarCMD: util/cmd_process_forker.pl -c outdir/chrysalis/quantifyGraph_commands --CPU 10 --shuffleCMD: touch outdir/chrysalis/quantifyGraph_commands.run.finishedCMD: util/cmd_process_forker.pl -c outdir/chrysalis/butterfly_commands.adj --CPU 10 --shuffleCMD: find ./chrysalis -name "*allProbPaths.fasta" -exec cat {} \; > Trinity.fasta

• 产生文件（夹）： ﹡ left.fa right.fa both.fa* inchworm.K25.L48.DS.fa meryl_kmer* meryl.kmers.min1.fa monitor.out chrysalis/ 及 Trinity.fasta( 为最终组装结果 )

﹡Trinity 最终组装成 contig ，不含 N ，而不是scaffold, 组装的序列也无须补洞、优化。

﹡Trinity 组装很占内存及空间，一般， 2G 以内包括2G clean data ， 4~15G 内存足够；若 clean data 大于 2G , 内存要设大于 15G,4G 以上就要大于 20G 内存。

• 文件内容说明：﹡ inchworm.K25.L48.DS.fa>a1;142 K: 25 length: 3697GGAGCTGGAGGCCCCCAGGCAACTACACCGTCCACGTA....

序列 id a1;平均 k-mer丰度值为 142，序列长 3697bp

﹡chrysalis intermediate outputs﹡chrysalis/RawComps.0/comp9.raw.graph :de Bruijn graph based on Inchworm contigs onlychrysalis/RawComps.0/comp9.raw.fasta :raw RNA-Seq reads that map to the Inchworm contigs based on k-mer composition*chrysalis outputs to be used by Butterfly as inputs*chrysalis/RawComps.0/comp9.out :the de Bruijn graph with edge weights incorporating the mapped readschrysalis/RawComps.0/comp9.reads :the read sequences and anchor points within the above graph

• 文件内容说明：﹡Trinity.fasta

>comp2_c0_seq1_FPKM_all:33112.497_FPKM_rel:9549.731_len:2433_path:[0,588,1077,1146] GAGCTCTTCAGGAGGGGGAATGTGCTTGTGGTTTTTGGTCTTGTGCATTTTGTGACAAAG… …

comp2: contig is derived from Chrysalis component # 2 c0: contig also corresponds to Butterfly sub-component # 0 (during graph compaction and pruning, some components are partitioned into disconnected subcomponents). seq1: contig sequence count from chrysalis component 2, butterfly subcomponent zero. If this subcomponent yields multiple sequences, these will have different seq numbers. len: contig 长度FPKM: 比对到多个路径的近似值

the end

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