案基于UPLC/Q-Tof UNIFI平台的完整中药安全性检测方 ......©2018 Waters Corporation COMPANY CONFIDENTIAL 1 基于UPLC/Q-Tof UNIFI平台的完整中药安全性检测方

©2018 Waters Corporation 1COMPANY CONFIDENTIAL

基于UPLC/Q-Tof UNIFI平台的完整中药安全性检测方

案

沃特世科技（上海）有限公司

袁铭


真菌毒素

中药安全性相关的物质

残留农药

色素

保健品等掺西药掺假药材


中药安全新法规相继出台

中药配方颗粒

中药经典名方

2019.8.27

2019.8.16


Waters 中药分析平台

•高效、快速、可靠、耐用分离平台，液相系统金标准

•准确高效的信息化数据处理平台

•超高灵敏度，一针进样获得所有成分信息

ACQUITY UPLC® I-Class,ACQUITY UPLC BEH C18 Column

Xevo G2-XS Q-Tof MS

UNIFI Scientific Information System


UPLC/MS + UNIFI 能够解决的中药项目

中药物质基础研究

中药成分鉴定；

中药材溯源；

TCM数据库构建；

中药代谢产物鉴定

中药入血成分查找；

中药代谢产物分析；

筛查中药材的有害物质

农药；色素；毒素

中药保健品非法添加西药筛查

中药材掺伪鉴别

劣质药材代替优质药材

相似药材取代规定药材项目描述


解决思路

样品前处理

UPLC/QTof MSE

数据采集

UNIFI自动数据处理

目标成分匹配

导入数据库

自动给出报告

未知成分

确定元素组成

有害成分鉴定导入有害成分数据库

寻找特征性碎片

搜索在线数据库及网络

二级碎片结构确证


数据采集平台


n Xevo G2-XS QTOF 采用专利的MSE技术，实现一针进样同时得到所有化合物

的一级和二级质谱信息，用于结构的进一步确认

nXevo G2-XS QTOF采用专利的LockSpray技术，实时保证采集数据的准确度，

可以获得高准确度的质量数；高精度的质量数和同位素分布及二级碎片信息相结

合，准确给予分子式

准

全

Xevo G2-XS QTof 质谱数据采集优势


–一针进样同时获得母离子及碎片离子的高分

辨、高质量精确数据；

– MSE由“低碰撞能”与“高碰撞能”两种扫描交

替构成，分别记录母离子及碎片信息；

– MSE技术既是数据采集也是数据处理的技术；

MSE 数据专利采集技术


MSE 数据专利采集技术

§ 非数据依赖型的MSE采集技术,不损失数据,可实现一针进样同时得到一级和二级质谱信息，如

下图所示的正离子一级和二级质谱图

一级质谱图

二级质谱图


LockSpray–保证数据采集的准确性

校正试剂

样品

¡ 实时外标校正-保证数据准确性

¡ 双喷雾源及挡板设计-消除LE离子抑制及干扰

WatersLockSpray

¡ 一针包含LE及样品信息

¡ LE与待测化合物在不同通

道，无干扰

LE色谱及质谱图

样品色谱及质谱图


数据处理平台

¡ 包含保留时间及二级碎片的中药及保健品非法添加数据库

¡ 包含目标及非目标成分的快速匹配筛查流程


中药非法添加数据库

¡ 中药非法添加数据库共含有262个化合物，可根据中文名或英文名来进行检索


根据功效分类

¡ 非法添加库根据功效主要分为

以下几大类− 降高压类

− 降血糖类

− 调脂减肥类

− 补肾壮阳类

− 镇静催眠类

− 镇痛类

− 抗炎类

¡ 除了以上几大类外，还有其他

详细分类，并可自主选择中文

或英文信息，如右图所示


根据功效检索

¡ 检索数据库时，既可根据化合物名称检索，也可根据药效搜索某类化合物

¡ 下图通过“Item tag”选择降高压类的成分，则只搜索到降高压类的化合物，避免其他类

别化合物的干扰


条目构架基本信息

¡ 每个化合物条目都包含英文名、中文名、化学分子式、化学结构、精确

分子量、药效分类等基本信息

中英文名 CAS号

药效（中英文）

分子式

分子量结构式

化合物列表


保留时间及二级碎片

¡ 库中所有化合物均含有二级碎片，部分个化合物还包含保留时间信息，并可随时查

看

二级碎片保留时间加合离子及电荷


目标成分快速匹配


方法中数据库设置

¡ 方法设置时可根据样品宣传功效选择相应的库中成分，有目的的导入到分析方法中，再设置

相关阈值


¡ UNIFI 采用3D的数据处理方式，因此每个色谱峰包含了：

Ø 保留时间和峰宽

Ø 质荷比和质谱峰宽

Ø 峰的强度

¡ MSE结合3D的数据处理方式，可更加有效的进行数据处理

Ø 降低假阳性

Ø 可有效扣除基线背景噪音，使质谱图更加干净

Ø 可有效的进行高低能量谱图的匹配

Ø 可有效的进行同位素，加合离子和多聚体的匹配

此处的背景噪音在处理时会进行自动扣除

UNIFI特有的3D数据处理方式


非法添加成分库匹配

峰识别及匹配数据浏览标识匹配组分二级碎片匹配数据库导入

Good Match 中与数据库中匹配良好的组分信息列表

组分提取色谱图

二级碎片

母离子


根据特征碎片快速查找同药效的类似物或代谢物


特征性碎片查找

¡ 同药效化合物结构上看，属于一类或几类

¡ 同类结构相似化合物可能具有相同的特征性碎片

¡ 若添加药品中间体、结构改造物或衍生物，通过与非法添加库中成分匹配，可

能匹配不到

¡ 对特征性碎片通过UNIFI 中common fragment search 功能查找可能的结构类

似物，提高鉴定准确度和效率


Common fragment search 功能

¡ 分析方法中可设置特征碎片，帮助查找和结果确证 ¡ Elucidation工具中common fragment search功能寻找

样品中含有某特征碎片的所有成分

方法中设置特征碎片

分析结果显示含特征碎片的离子

特征碎片

含此碎片的成分

含此碎片提取色谱图


特征性二级碎片

¡ 具有以上二级碎片的可能是列表中相应化合物的结构类似物

功效结构类似物二级理论碎片

补肾壮阳

sildenafil 311.1503，283.1190vardenafil 461.1911，299.0957acetildenafil 353.1609thiosildenafil 299.0957tadalafil 262.0863，250.0863

减肥 Phenylpropanolamine，Ephedrine 117.0699，115.0543

抗抑郁Imipramine，Clomipramine 86.0965Maprotiline，Fluoxetine 117.0699

抗炎Betamethasone acetate，Betamethasone 415.2116，397.2010，147.0804，337.0798，

373.2010Hydrocortisone，Cortisone 121.0648

降糖 Tolbutamide，Gliclazide 91.0543

降压

Tolazoline，Indapamide 91.0543Prazosin，Doxazosin 247.1190

Nifedipine，Nicardipine，Nitrendipine 315.0975Losartan，Irbesartan 207.0917

Hydrochlorothiazide，Furosemide 204.9844Atenolol 133.0648，190.0863

雌激素 Estradiol 133.0648，145.0648镇静 Oxazepam，Clonazepam 241.0528镇痛 Phenacetin，Paracetamol 110.0601


完全未知组分的一步鉴定


未知组分鉴定

¡ 库中无匹配，且特征性碎片查找不到的情况，对未知组分进行鉴定

未知组分

元素组成分析在线库搜索二级碎片匹配确证

Discovery工具


Discovery 功能鉴定未知化合物

¡ Discovery功能一步完成对未知化合物进行元素组成，库搜索及碎片匹配

碎片匹配结果图

可能的成分

成分相关信息


未知中药丸剂中非法添加成分的筛查　　　

实际案例


第一步：样品的分离及数据采集

具体实验流程及结果分析


A. LC / UPLC 条件

LC系统：ACQUITY UPLC I-Class

Column: ACQUITY UPLC BEH C18（100*2.1mm,1.7 m）

Column Temperature 柱温: 45 C

Sample Temperature 样品室温度: 10 C

Mobile Phase A 流动相A: 0.1%甲酸/水

Mobile Phase B 流动相B: 0.1%甲酸/乙腈

Column Temperature 进样量: 0.2 L

Time�(min)

Flow(mL/min) %A %B Curve

0 0.4 95 5 Initial

0.5 0.4 95 5 6

9 0.4 30 70 6

10 0.4 30 70 6

12 0.4 5 95 6

14 0.4 5 95 6

17 0.4 95 5 1

B. MS 条件

MS系统: Xevo G2-XS QTof

Ion Mode 离子化模式: ESI+

Capillary Voltage 毛细管电压：3.0 kV

Cone Voltage 锥孔电压: 40 V

Source Temperature 源温度：120C

Desolvation Temperature 雾化气温度: 500C

Desolvation Gas Flow 雾化气流速: 900 L/h

Cone Gas Flow 锥孔气流速: 50 L/h

C. 软件

UNIFI 1.9.4

D. 样品处理

将此中药水丸研成粉末，称取0.5 g，加入5 mL甲醇，

超声20 min，过滤，后用甲醇稀释到1/100

Gradient 梯度表:

实验条件


总离子流图

¡ 样品的总离子流图如下所示


第二步：使用数据库，设定分析方法，通过UNIFI软件快速找出目标物

¡ UNIFI结合数据库，建立合适的分析方法，对一级二级质谱信息进行处理；再通过

Waters特有的工作流程快速筛选出目标物



数据自动处理后的显示界面

n UNIFI软件通过分析方法自动对数据进行处理后的结果如下，直接显示出鉴定的结果列表，通过workflow快速筛选出目标的组分

Workflow快速筛选结果

组分列表

提取离子流图一级质谱图

二级质谱图


通过Workflow直接筛选出目标组分

¡ 确认的组分通过workflow进行筛选，根据数据库中保留时间，二级碎片的匹配，快速筛选出3个目标组分


自动对二级碎片进行解析

¡ UNIFI软件可自动对二级碎片进行解析，图标处代表有具体结构式，鼠标放置于上即可显示结构，如下图为其中Pioglitazone （吡格列酮）二级碎片匹配示意图

[M+H]+



¡ Glibenclamide（格列苯脲）的二级质谱图信息及碎片解析情况如下

[M+H]+

[M+Na]+

[M+K]+



¡ Metformin（二甲双胍）的二级质谱图信息及碎片解析情况如下

[M+H]+


非目标组分查找

¡ 非目标组分可通过卤素查找（has Halogens）和共同碎片查找(Common fragment Ions)功能,如下图

5.58 min的成分，虽然库中没有匹配，但是与Glibenclamide 有相同的碎片成分，并且含有Cl元素，为可能

的非法添加成分


5.58 min非目标组分的确认

¡ 对于5.58 min成分，通过Discovery功能一步进行元素组成，在线库搜索及碎片匹配，根据匹配的碎片，

Predicted Intensity及Citations，判断，5.58 min的成分可能为Glibenclamide Impurity A



¡ Glibenclamide Impurity A（格列苯脲杂质A）的二级质谱图信息及碎片解析情况如下

[M+H]+

[M+Na]+

[M+K]+


最终样品中非法添加成分列表

¡ 上述步骤中通过保留时间、匹配碎片数、质量误差，二级碎片匹配图，同位素分布情况，最终确认以下4个成

分为非法添加成分

¡ 如果事先知道此保健品的功效，以在分析方法中只导入库中对应功效的成分即可，可以更加快速地排除假阳性

No. Component name Observed m/z Formula Mass error

(mDa)Observed RT (min) Response Adducts

1 Metformin（二甲双胍） 130.1087 C4H11N5 0 0.58 528756 +H2 Pioglitazone （吡格列酮） 357.1273 C19H20N2O3S 0.6 4.2 900080 +H, +Na

3 Glibenclamide Impurity A（格列苯脲杂质A） 369.0677 C16H17ClN2O4S 0.7 5.58 189063 +H

4 Glibenclamide（格列苯脲） 494.1522 C23H28ClN3O5S 1.1 7.63 1128690 +H, +Na

格列苯脲格列苯脲杂质A

结构类似物


第三步：使用UNIFI软件出具报告

n UNIFI是基于Oracle数据库的软件平台，法规依从性强，可根据用户需求定制报告。



UNIFI的报告编辑页面

右侧工具栏中条目直接拖入中间区域

即可使用

¡ 人性化的编辑页面，自定义报告模板，可达到所见即所得的报告结果


Waters解决方案

一次进样我们可以实现——

ü 目标筛查：是否添有常见非法添加，基于已

有数据库；

ü 非目标筛查：是否添有常见非法添加物的结

构改造物，特征离子筛查；

ü 未知判断：连接在线数据库，判断可能的非

法添加物；

一针进样，实现最完整的筛查

数据无损，永久可用，支持再分析

样品前处理

UPLC/QTof MSE

数据采集

UNIFI自动数据处理

目标成分匹配

导入数据库

自动给出报告

未知成分

确定元素组成

有害成分鉴定导入有害成分数据

库

寻找特征性碎片

搜索在线数据库及网络

二级碎片结构确证


Waters 中药分析平台


主要内容

¡ 中药安全性

¡ 中药有害成分筛查思路及流程

¡ 应用实例

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