08 Galarza Mutaciones Resistencia Prueba Genotype

7/23/2019 08 Galarza Mutaciones Resistencia Prueba Genotype

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Genotype MTBDRplus

MSc Blgo. Marco A. Galarza Prez

Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular

Instituto Nacional de Saludmga arza ns.go .pe


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Genoma de Mycobacterium tuberculosis

Genoti ificacin: RFLP IS6110

Spoligotyping

MIRU

SNPs

MTBC MTBDRplus MTBDRslAS


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as cac n enera e genes e yco acter um tu ercu os s

Funcin N de

genes

% del

total

% del total con

capacidad codificante

Metabolismo de lpidos 225 5.7 9.3

Informacin de Vas 207 5.2 6.1

Pared celular rocesos celulares 517 13.0 15.5

RNAs estables 50 1.3 0.2

Elementos IS y bacterifagos 137 3.4 2.5. .

Metabolismo intermediario y respiracin 877 22.0 24.6

Protenas reguladoras 188 4.7 4.0

Virulencia, detoxificacin y adaptacin 91 2.3 2.4

Funcin hipottica conservada 911 22.9 18.4

Protenas de funcin desconocida 607 15.3 9.9


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Bases genticas de resistencia a drogas

Los estudios genticos han determinado que en el Complejo de,

antituberculosas es la consecuencias de mutaciones espontneasen genes codificantes de blancos de la droga o enzimas envueltas

.

La resistencia asociada a mutaciones cromosomales al azar han

sido descritas para todas las drogas de primera lnea. Sin embargolas alteraciones genticas en fenotipos MDR y poliresistentes anno han sido descri tas completamente, debido a que sonconsecuencia de adquisiciones secuenciales de mutaciones en

mltiples loci. Desafortunadamente las mltiples localizaciones delas mutaciones para cada droga pueden envolver ms de un gen odistintos locide un mismo gen.


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Esquema de los mecanismos moleculares de resistencia a drogas

de 1ra y 2da lnea

A: RNA polimerasa

B: gyrasa

2008.Tesis: Tello, C.


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Regiones genmicas asociadas con resistencia a drogas de 1era y 2da lnea

Antibitico Gen Producto Frecuencia de mutacin %

Estreptomicina rpsL

rrs

Prot. Ribosomal S12

RNAr 16S

60

< 10

Rifam icina r o Subunidad RNA ol > 95

Isoniacida

katGoxyR-ahpC

inhA

Catalasa-peroxidasaAlkilhidroxireductasa

Enoyl ACP reductasa

60-70 20

< 10

kasA

ndh

ketoacil ACP sintetasa

NADH deshidrogenasa

< 10

NA

Etambutol embCAB Arabinosiltransferasas70

Pyrazinamida pncA Amidasa 70-100

Etionamida inhA

ethA

Enoyl ACP reductasa

Flavoprot. monooxigenasa

< 10

NA

Kanamicina rrs RNAr 16S 65

Fluoroquinolonas gyrA

gyrB

Subunidad DNA girasa

Subunidad DNA girasa

> 90

NA

Capreomicina tlyA

rrs

RNAr metiltransferasa

RNAr 16S

NA

NAAcido para-aminosalicilico thyA Timidilato sintetasa NA


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Mutaciones en el gen rpo asociados con resistencia a Rifampicina en

81pb

*M.tuberculosisrpo genecodonsarenumberedaccordingtotherpo geneofE.coli


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Mutaciones en el gen gyrA asociadas con resistencia a

fluoroquinolonas en M. tuberculosis

pb


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RIF: 98.7%

INH: 92.0%

FLQ: 90.6%

CM: 88.4%AM: 86.7%

EM: 69.2%


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Tecnologa DNASTRIP

Extraccin DNA ResultadosDeteccinPCR

Rpido: los resultados de muestras pulmonares, extra pulmonares o decult ivo se pueden obtener en 48h.

ene c os e ra a ar con os s s emas e prue as -

Seguro: los controles internos documentan la validez de los resultados yaseguran los procedimientos de la prueba.

Fiable: combinacin de amplificacin especfica y la hibridacin garantizanla fiabilidad del dia nstico.

Fcil de usar: fcil de realizar la tcnica, adecuada para los laboratorio dereferencia.

Alta sensibilidad y especificidad: comprobado por varias publicaciones.

Rentable: un mnimo de equipos slo es necesario, lo que permite a todoslos laboratorios de una aplicacin rentable.

Disponibles de automatizacin: los laboratorios de alto flujo de muestraspue en aumen ar su e c enc a me an e e uso spos vos eautomatizacin de Hain Lifesciences.

.


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Etapas de la prueba molecular Genotype MTBDRplus

1.Extraccin de DNA:

Cualquiermtodode

extraccindeDNApuede

serutilizado

Cultivos con crecimientoen medio lquido o slido.

MezcladePNMque

2. Mltiplex PCR:

primers marcados con

contienenlaszonaswild

typeydemutacinparalos

genesrespectivos.

3. Hibridacin reversa:

Controldeconjugado,

controldeamplificacin,

esna ura zac n qu m ca Hibridacin

Lavado astringente

Reaccin de tincin mediada

,

gen,sondaswildtypey

sondasdemutacin

por AP (fosfatasa alcalina).


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Caractersticas del Genotype MTBDRplus

El Genotype MTBDRplus esta basado en

la Tecnologa DNA-STRIP y permite la

simultanea identi ficacin gentico

molecular de:

1. El complejo Mycobacterium tuberculosis

2. Resistencia a la rifampicina por la

deteccin de las mutaciones ms

comunes en el gen rpo.

3. Resistencia a la isoniacida por la

deteccin de las mutaciones ms

comunes en los genes katGe inhA.

A partir de muestras clnicas con

baciloscopa positiva o cultivos.


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Indicaciones para el uso de Genotype MTBDRplus

agn st co e pac entes

Despus de fracaso al tratamiento y recada.

Con anamnesis (signos y sntomas de la enfermedad) y que procedan de

zonas de alta prevalencia de MDR-TB.

En pases con alta prevalencia de tuberculosis y de alta carga de TB-MDR.

Para fines de seleccin en el desarrollo de lanes de accin es ecfica contra

la TB.

Beneficios venta as del uso de Genot e MTBDR lus

Permite el tratamiento temprano adecuado, lo que reduce la transmisin y

propagacin de la TB-MDR.

Se puede realizar a partir de un frotis positivo de muestra pulmonar depacientes y de cultivos.

Los resultados se obtienen en 48h en com aracin con los mtodos

convencionales que demoran de 1 a 2 meses.


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Caractersticas del Genotype MTBDRsl

El Genotype MTBDRsl permite lasimultanea identificacion geneticomolecular de:

1. El com le o M cobacteriumtuberculosis.

2. Resistencia a las Fluoroquinolonas,como ofloxacina y moxifloxacina por la

comunes en el gen gyrA.

3. Resistencia a los antibiticos

inyectables (viomicina, kanamicina,

deteccin de las ms comunesmutaciones en el gen rrs.

4. Resistencia al medicamento de primera

nea am u o por a e ecc n e asmutaciones ms comunes en el gen

embB.

A partir de muestras clinicas con

baciloscopia positiva o cultivos.


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Indicaciones para el uso de Genotype MTBDRsl

Diagnstico de pacientes

con TB-MDR, para recibir informacin sobre nuevas resistencias a

antibiticos.

Despus de fracaso al tratamiento y recada. En pases con un elevado uso de los medicamentos.

n as reg ones e a a carga - .

Beneficios y ventajas del uso de Genotype MTBDRsl Deteccin de TB-XDR en pacientes previamente diagnosticados como TB-

MDR.

Confirmacin de resultados or ruebas de susce tibilidad a dro as.

Minimizar los efectos secundarios extremos a travs de un esquema de

tratamiento adecuado.

, .


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Principio de la prueba molecular Genotype

Primersmarcados

conbiotina


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Extraccin DNA re aracin Mix PCR


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PCR e Hibridacin


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Resistencia a Rifampicina y/o

Isoniacida usando el Genotype

MTBDRplus

Interpretacin de resultados:

Resistencia a Fluoroquinolonas,

cclicos y Etambutol usando elGenotype MTBDRsl


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R

sl

Experiencia en el INS del uso de la metodologa Genotype

FLUJO DE TRABAJO: FASE 1

108 Mx Biolgicas:40 MDR/XDR

plus

31 MDR

9 XDRKitMTBD

80 cepas (24 LJ-OMS / 56 APP)

28 M. clnicas (Back ups)65 MDR

17 Monoresistentes10 XDR, 29 MDR

15 Monoresistentes

14 Monoresistentes(10 INH,4 RIF)Ki

tM

TBD

18 pansensibles(12 INH,3 RIF)

54 Pansensibles 54 Pansensibles

:

DRplus

67 MDR100 Mx Biolgicas:

Kit

MT

B

13 Monoresistentes

a INH

15 cultivos APP65 MDR

17 Monoresistentes

18 ansensibles

65 MDR

17 Monoresistentes

20 Pansensibles

,

18 pansensibles

Galarza et.al. datos no publicados


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Experiencia en el INS del uso de la metodologa Genotype

MTBDRplus

MTBDRsl

.

especificidad 95.0% de la pruebamolecular Genotype MTBDRplus

con res ecto a Rifam icina.

100.0% para las Fluoroquinolonas. Sensibilidad 87.5% y especificidad

Sensibilidad (97.0%) y

especif ic idad (98.7%) de la

rueba molecular Genot e

. .

Sensibilidad 81.3% y especificidad

100.0% para Kanamicina.

MTBDRplus para Isoniacida.

Se encontraron valores de

sensibilidad 97.1%

.

84.6% para Etambutol.

Se encontraron valores de

especif ic idad (94.2%) de laprueba Genotype MTBDRplus

para la condicin MDR.

.

especif icidad (100.0%) de la

prueba Genotype MTBDRslpara la

.

Galarza et.al. datos no publicados


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Realizar estudios en campo, con un mayor nmero de

muestras clnicas y evaluar los kits Genotype MTBDRplus y

Genotype MTBDRsl.

,

guiada por la situacin epidemiolgica y la identificacin de

los grupos de pacientes prevalentes o numerosos para losque es tcnicamente posible agilizar o mejorar el diagnstico

de TB.

mejorar la utilizacin de las herramientas ya introducidas y

guiar la racional incorporacin y aplicacin de nuevos

m o os mo ecu ares.


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Algoritmo bsico de Dx. de TB con uso de mtodos moleculares

Genotype MTBDRplus


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Documents

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