11

分子生物学技术分子生物学技术

22

第一节、重组第一节、重组 DNADNA 技术技术 -- 基因工程 基因工程 第二节、分子杂交及相关技术第二节、分子杂交及相关技术第三节、聚合酶链反应的原理和应用第三节、聚合酶链反应的原理和应用第四节、基因定位的常用方法第四节、基因定位的常用方法

33

分子生物学技术分子生物学技术

7070 年代以来年代以来 ,, 分子生物学技术迅速发展分子生物学技术迅速发展起来起来 ,, 使人们有可能进行人类基因组及单使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究个基因的结构研究 ,, 分析其功能特征分析其功能特征 ,, 了了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。些分子生物学技术予以介绍。

44

1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995

1944DNA 是遗传物质

1949Hbs 贫血1953 双螺旋

1956HbsGlu-Val

1966 遗传密码

第一个 R 酶1972 重组质粒

1975DNA 杂交

1977DNA 测序1981 转 G 小鼠

1983HD 病 G 定位

1985PCR

1986 位置克隆

1987G 剔除小鼠1989 位置克隆

1990 第一个基因治疗1995 细菌 G 组序列

1996 酵母基因组序列

现代分子遗传学发展

重要事件

55

第一节 重组第一节 重组 DNADNA 技术技术 -- 基因工程基因工程 重组重组 DNADNA 技术是现代分子生物技术发展中技术是现代分子生物技术发展中

最重要的成就之一。即是基因工程最重要的成就之一。即是基因工程 (Gene E(Gene Engineering)ngineering) 的核心技术。的核心技术。

重组重组 DNADNA 技术（技术（ Recombinant DNA TechRecombinant DNA Techniquenique ））是人类根据需要选择目的基因（是人类根据需要选择目的基因（ DDNANA 片段）在体外与基因运载体重组，转移片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。新的物种和治疗人类疾病的目的。

这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。发现和应用。

66

一、限制酶一、限制酶 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 (restrictive endonuclea(restrictive endonuclea

ses)ses) ，又称限制酶。是特异性地切断，又称限制酶。是特异性地切断 DNADNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。刀”）。

发现于原核生物体内，现已分离出发现于原核生物体内，现已分离出 100100 多种，多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNADNA 技术和基因诊断中重要的一类工具酶。技术和基因诊断中重要的一类工具酶。

77

11 、限制酶的命名、限制酶的命名 根据其来源命名。如：根据其来源命名。如： 属名 菌株名属名 菌株名 E E coco R I R I

种名 编号种名 编号 EcoRIEcoRI 来源于大肠杆菌来源于大肠杆菌 E.coliE.coli 的的 RY13RY13 菌菌

株株 ,I,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。指在该菌株中分离的第一个限制酶。

88

22 、限制酶识别序列和切割形成、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常每种限制酶能识别和切割的通常 44 ～～ 88 个核苷酸个核苷酸

序列，称为限制性位点或切点。序列，称为限制性位点或切点。  

如：如： Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’  

Bam HI 5’-GGATCC-3`Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端平末端 (blunt end) (blunt end) 对称轴切，连接效果差对称轴切，连接效果差　　 切割形成 粘性末端（　　 切割形成 粘性末端（ sticky endsticky end ）交错切。）交错切。

99

1010

部部分分常常用用限限制制酶酶及及切切点点

1111

互补末端连接互补末端连接

1212

产生相同序列的突出末端的不同片段产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：可有三种方式：

1)1) 用同一种限制酶切割；用同一种限制酶切割；2)2) 用识别相同靶序列的不同限制酶切割；用识别相同靶序列的不同限制酶切割；3)3) 用识别不同靶序列但可产生一致的粘用识别不同靶序列但可产生一致的粘

性末端的限制酶切割。性末端的限制酶切割。

1313

33 、特点：、特点： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断

中的重要用途：中的重要用途： 1) 1) 不论不论 DNADNA 的来源如何，同一种限制酶切割后的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的属的 DNADNA 重组。如人和质粒重组。如人和质粒 DNADNA 等。等。

2) 2) 用于人类基因组的用于人类基因组的 DNADNA 分析，具特定的酶切分析，具特定的酶切位点。位点。

3) Gene3) Gene 突变改变酶切位点的消失或新产生将改突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。

1414

二、基因运载体及其选择二、基因运载体及其选择 载体（载体（ VectorVector ）） :: 将外源目的将外源目的 DNADNA 导入受导入受

体细胞，并能自我复制和增殖的工具。体细胞，并能自我复制和增殖的工具。

1515

载体具以下特征载体具以下特征：： 1)1) 分子量小，便于携带较大的分子量小，便于携带较大的 DNADNA 片段，能进片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；入宿主细胞并在其中增殖；

2)2) 有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；切点；

3)3) 被切割后的载体，插入外源被切割后的载体，插入外源 DNADNA 后，不影响后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。基因）。

常用的载体有常用的载体有：质粒，：质粒， λλ 噬菌体，粘粒，噬菌体，粘粒， BACBAC ，，YACYAC ，， PIPI 等。等。

1616

（一）（一） .. 质粒质粒 plasmidplasmid

Plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环 DNADNA 分子。分子。         PBR322PBR322 大肠杆菌大肠杆菌 pSC101pSC101    Plasmid chromosomePlasmid chromosome     COIEICOIEI plasmid plasmid 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 pc194pc194 scp12scp12 真核生物真核生物 -- 酵母质粒酵母质粒

  

1717

常用的质粒如常用的质粒如 pUC19pUC19 ，多连接子，多连接子 MCSMCS 。插入外源基因片。插入外源基因片段长度约段长度约 10kb10kb 。将外源基因插入到。将外源基因插入到 MCSMCS 中，随质粒的表中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到 MCSMCS 后，后， β-β- 半乳半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色糖苷酶的活性丧失而不显兰色 -- 白色菌落。如果不插入外源白色菌落。如果不插入外源

基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。 EcoRI HindIII

Ori 复制起点

LacZ

APR

pUC19

1818

（二）（二） .λ-.λ- 噬菌体噬菌体 (λphage)(λphage)

是一种可在体外包装的细菌病毒是一种可在体外包装的细菌病毒 ,, 可高效感可高效感染大肠杆菌染大肠杆菌 .λ-.λ- 噬菌体噬菌体 DNADNA 是线状双链是线状双链 DNDNAA 分子分子 ,, 全长约全长约 50kb,50kb, 每条链各带每条链各带 12bp12bp 长长的单链互补末端的单链互补末端 -- 粘末端粘末端 (COS(COS 序列序列 )) 。进入。进入宿主细胞后不久，宿主细胞后不久， COSCOS 序列碱基配对环化。序列碱基配对环化。

改建后的改建后的 λλ 噬菌体发展了多种较大型的克隆噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：载体，如：

1919

11 、置换、置换 λλ 载体 – 溶解途径载体 – 溶解途径 载体和外源载体和外源 DNADNA 整合到宿主菌整合到宿主菌 DNADNA

中。可克隆中。可克隆 23kb23kb 的外源的外源 DNADNA 。。 22 、插入、插入 λλ 载体 – 裂解途径载体 – 裂解途径 DNADNA 在宿主细胞中复制，然后包装成在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆克隆 5kb5kb 的的 cDNAcDNA 。 。

2020

裂裂解解途途径径

2121

（（三）三） .. 粘粒粘粒 (cosmid vector)(cosmid vector)（（ 3030 ～～ 40kb40kb ））

是将质粒和 λ噬菌体改建的一种载体 . 它含 COS 序列 , 插入一小plasmid – 而得名 Cosmid 。改建后的粘粒含有 λ噬菌体的复制起点和 cos 末端。全长 8kb 。大片段外源 DNA 插入后，在体外包装进而被克隆。可包装 30 ～ 45kb 长的 DNA片段，多用于基因文库构建。

2222

(( 四四 ) ) 大片段大片段 DNADNA 克隆载体克隆载体

人类和哺乳动物的基因组很大，甚人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：至许多单个基因也相当大（如： DDMD gene 2300kbMD gene 2300kb ） ，克隆分析就） ，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：建的一些载体： BACBAC ，， PIPI ，， YACYAC等。等。

2323

11 、细菌人工染色体（、细菌人工染色体（ bacterial artificial chbacterial artificial ch

romosome,BACromosome,BAC ）） 优点：能携带大片段优点：能携带大片段 DNADNA ，，约约 300kb300kb 。。

在每个细胞中，一个载体在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高分子能繁殖多个拷贝，高产产 DNADNA 。。

缺点：会出现插入片段在缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克结构上的不稳定，导致克隆隆 DNADNA 部分的缺失或重部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载们采用低拷贝数复制子载体，如，体，如， E coliE coli 中的中的 FF 因因子。此质粒含有子。此质粒含有 22 种基因种基因（（ part A, part Bpart A, part B ）。每）。每个个 E coliE coli 能接受 能接受 >300kb>300kbDNADNA 片段。片段。

2424

22 、噬菌体、噬菌体 PIPI 载体和载体和 PACPAC

PIPI 噬菌体与噬菌体与 λλ 噬菌体一样，外有蛋白质噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（壳。内含相当大的（ 110110 ～～ 115kb115kb ））线性线性 DNADNA ，并在体外包装于，并在体外包装于 PIPI 壳内。壳内。PIPI 进入宿主细胞后环化，扩增。进入宿主细胞后环化，扩增。

19941994 年，有人将年，有人将 PIPI 和和 FF 因子克隆结合因子克隆结合产生产生 PIPI 人工染色体克隆系统人工染色体克隆系统 -----PAC-----PAC 。。

2525

33 、酵母人工染色体（、酵母人工染色体（ yeast artificial cyeast artificial chromosome, YAChromosome, YAC ））

适用适用于克于克隆大隆大片段片段DNADNA ，，0.0.22 ～～2Mb2Mb 。。

2626

YAC YAC 的主要功能成份有三：的主要功能成份有三： 11 ））着丝粒着丝粒：： mitosismitosis 姊妹染色单体和减姊妹染色单体和减 II同源染色体分离之必需。同源染色体分离之必需。

22 ））端粒：端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。袭。

33 ））自主复制序列（自主复制序列（ ARSARS ）元件）元件：是染色体：是染色体自主复制的复制起点。自主复制的复制起点。

构建构建 YACYAC 需要需要 44 个短序列：个短序列： 22 个端粒，着个端粒，着丝粒，丝粒， ARSARS 元件，与外源元件，与外源 DNADNA 连接成线性连接成线性DNADNA 分子，导入酵母细胞克隆。 分子，导入酵母细胞克隆。

2727

三、三、 DNADNA 重组与分子克隆重组与分子克隆化化

为获得所需的基因或特异序列，为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载需从细胞中分离得到目的基因与载体体 DNADNA 重组，并用适当方法在宿重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同主细胞中表达，扩增得到大量相同的的 DNADNA 片段，片段，称为称为 DNADNA 克隆，亦克隆，亦称分子克隆。称分子克隆。

2828

基本原理与过程：基本原理与过程： 　　 11 、分离纯化目的基因、分离纯化目的基因　　 22 、目的基因 、目的基因 + vector =+ vector = 重组重组 DNADNA 分子分子　　 33 、重组、重组 DNADNA 分子导入受体细胞，并在其内增殖。分子导入受体细胞，并在其内增殖。　　 44 、筛选含有重组、筛选含有重组 DNADNA 的细胞——细胞克隆（的细胞——细胞克隆（ cc

ell cloneell clone ），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。克隆移至液体培养基中进行扩增。

　　 55 、分离重组、分离重组 DNADNA 克隆：即收获扩增的培养细胞，克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组并选择分离重组 DNADNA 。 。

2929

分离纯化目的基因分离纯化目的基因目的基因 目的基因 + vector =+ vector = 重组重组 DNADNA 分子分子

3030

重组　　 DNA 和分子克隆

3131

重组重组 DNADNA 和分子克隆的几种方法：和分子克隆的几种方法：（（依目的基因的来源依目的基因的来源））

　　 11 、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆　　 22 、由特定、由特定 mRNAmRNA 逆转录合成逆转录合成 cDNAcDNA 后再后再

进行 进行 克隆克隆　　 33 、化学合成目的基因进行克隆、化学合成目的基因进行克隆　　 44 、、 PCRPCR 体外扩增目的片段进行克隆体外扩增目的片段进行克隆

3232

从基因从基因组中分组中分离目的离目的基因在基因在细胞中细胞中克隆克隆

3333

筛选含有重组筛选含有重组 DNADNA 的细胞——细胞克隆（的细胞——细胞克隆（ cell clonecell clone ））

3434

筛查含有目的基因的细胞克隆筛查含有目的基因的细胞克隆

3535

四、目的基因表达四、目的基因表达 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。 究。

重组重组 DNADNA 技术的另一目的是获得基因重组后技术的另一目的是获得基因重组后的产物——的产物—— RNARNA ，蛋白质。，蛋白质。

就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（等。此类克隆系统称为表达克隆。（ expressiexpression cloningon cloning ）） ..

3636

目的基目的基因表达因表达

3737

（一）．真核细胞的基因在原核细胞（一）．真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达 （细菌）中表达

原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如， RNARNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆

菌为宿主。菌为宿主。 真核多肽的表达要求：真核多肽的表达要求： 11 ）适当的）适当的 cDNAcDNA （完整的编码序列）；（完整的编码序列）； 22 ）适当的表达载体，提供特定多肽信息；）适当的表达载体，提供特定多肽信息； 33 ）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 ）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 产物特征：产物特征： 11 ）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定； 22 ）活性受限或无活性。）活性受限或无活性。

3838

(( 二二 )) 、真核细胞基因在真核细胞中表达、真核细胞基因在真核细胞中表达

真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。

应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。特定基因的表达。

产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。白的稳定和功能活性。

3939

五 五 、基因文库、基因文库

基因文库（基因文库（ gene librarygene library ）） ,, 应用应用 DNADNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNADNA 克隆。克隆。

4040

（（一）一）

构建基 构建基因组因组 DNDNAA 文库文库

4141

（（二）染色体特异的基因文库 二）染色体特异的基因文库 （ （ chromosome specific librarychromosome specific library ））

　　单个染色体 → 细胞克隆　　单个染色体 → 细胞克隆

（流式（流式 CC 仪）仪） 　　↓ 　　↓细胞 → 染色体细胞 → 染色体 　 　染色体文库染色体文库 　 　 染色体区带 → 区带特异染色体区带 → 区带特异 （显微切割 ）（显微切割 ） 　 ↓ 　 ↓ 　 　 DNADNA 文库文库

4242

（三）（三） cDNAcDNA 文库（文库（ cDNA librarycDNA library ）） cDNAcDNA 文文库构建：库构建：

特定组织特定组织细胞一细胞一定发育定发育阶段 总 阶段 总 mRNAmRNA