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1. INTRODUCCIÓN
Algunos problemas en la producción de semillas pueden ser atribuidos a un
insuficiente rendimiento en semillas (número de semillas por fruto), un incremento
en frutos abortados, malas germinaciones de polen y una falta de sincronización de
la floración de las líneas denominadas machos con aquellas denominadas hembras,
cuando se trata de híbridos.
Parte de estos problemas puede ser atribuido a que durante la formación del grano
de polen, los factores genéticos, químicos y ambientales condicionan su fertilidad, y
afecten su calidad.
Una vez que el polen es liberado por las anteras, se vuelve un organismo frágil y
sensible a las condiciones externas, ya que la apertura de las anteras en la
maduración se acompaña de una pérdida de agua por parte del grano de polen, lo
cual reduce considerablemente su metabolismo. Sin embargo, este metabolismo
reducido favorece su dispersión y le permite sobrevivir durante el transporte hacia el
estigma femenino, en el cual se rehidrata para poder germinar. Para ello, el grano
de polen debe poseer una gran adaptabilidad morfológica para responder a estos
cambios de humedad, siendo la exina lo que permite estos cambios de volumen a
nivel de las aperturas.
Esta reducción en el metabolismo afecta la viabilidad del polen, lo cual se traduce
en que los productores deben manejar también ciertas metodologías para poder
estimarla y técnicas para conservar el polen durante un tiempo más prolongado sin
que se vea mayormente afectado.
Este interés por conservar el polen, surge debido a que se hace muy difícil tener la
cantidad suficiente de flores de las plantas de la línea macho, para polinizar todas
las flores de las plantas de la línea hembra durante todo el proceso de producción.
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Incluso, no basta con que los productores logren desfasar la floración, lo que les
permitiría evitar una sobrecarga de trabajo en la polinización y además, evitar la
pérdida de flores de las plantas de la línea hembra, que no serían polinizadas por
falta de polen en el día adecuado para su polinización.
Por otro lado, la preservación de la viabilidad del polen es de gran valor para
cultivadores y genetistas al eliminar los problemas de tiempo y espacio que se
presentan al hacer polinización artificial (KHOSH-KHUI, BASSIRI y NIKNEJAD,
1976).
YATES y SPARKS (1990) coinciden en que las estrategias de conservación de
germoplasma pueden ser eficientes, económicas y permiten ahorrar espacio.
Además, estos métodos pueden ser apropiados como un suplemento a los clásicos
sistemas de preservación usados en semillas y material vegetativo.
La calidad del polen es primordial para que la fecundación sea exitosa. De ocurrir
alteraciones en la calidad, podría afectarse principalmente la capacidad del polen de
germinar y de optimizar la suerte de obtener una buena cuaja y un buen llenado de
frutos. Es justamente en este ámbito donde se espera encontrar un método de
conservación adaptable para polen de tomate, lo cual sumado a costos y eficiencia,
refleje la calidad de éste a través de pruebas de viabilidad in vitro, y que, a su vez,
se correlacione con los resultados in vivo.
Ante el problema planteado, esta investigación propone el logro de los siguientes
objetivos:
1. Evaluar tres métodos de conservación de polen de tomate, sometido a
distintos tiempos de almacenaje.
2. Evaluar una metodología de estimación de viabilidad in vitro para polen de
tomate.
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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. El grano de polen:
El polen es el gameto masculino, generalmente de color amarillo, que en madurez
floral o antesis, se libera de los órganos masculinos de la flor, los estambres.
Después de un trayecto más o menos largo en el aire, los granos de polen se
adosan a los estigmas. Si existe compatibilidad, estos granos germinan y forman un
tubo polínico que se introduce en el pistilo o gineceo, la parte femenina de la flor
(GOURRET y MISSET, 1989).
2.1.1. Biología del polen
Los granos de polen de las angiospermas son bi o tricelulares y haploides. Una o
dos células reproductivas, muy reducidas, se encuentran envueltas dentro del
citoplasma de la célula vegetativa. Ésta posee un núcleo voluminoso y un
citoplasma rico en organelos y reservas (GOURRET y MISSET, 1989).
ESAU (1985) señala que el desarrollo del tejido esporógeno en la antera implica
ciertos fenómenos que caracterizan la formación de la membrana. Las células que
sufren la meiosis, las células madres del polen, están muy compactas en las
primeras etapas del desarrollo, y se van separando entre sí, mientras que el
protoplasto se redondea y llega a quedar incluido en una membrana gruesa y
gelatinosa que ha sido identificada como callosa. Ésta es designada como
membrana de la célula madre del polen o membrana especial.
La meiosis normal da lugar a la formación de cuatro núcleos, los núcleos de las
microsporas (ESAU, 1985).
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Las microsporas, aún envueltas de callosa, comienzan a formar un esporodermo
bajo la forma de una primexina. Más tarde la callosa desaparece y las cuatro
microsporas se separan. Éstas aumentan considerablemente en volumen. El núcleo
haploide de las microsporas se divide una o dos veces, generando así un conjunto
bi o tricelular llamado grano de polen. La célula vegetativa que recubre en un
citoplasma una o dos células reproductivas, se carga de reservas provenientes de
una fuente celular llamada fuente nutritiva o tapete (GOURRET y MISSET, 1989).
ESAU (1985) agrega que las células del tapete se caracterizan por su protoplasto,
que se tiñe densamente, y por tener núcleos destacados. En algunas angiospermas
el tapete permanece como capa bien definida, funcionando aparentemente como
tejido secretor, hasta que el polen madura. Sin embargo, en muchas otras, las
membranas adquieren el aspecto de masas plasmodiales, que se van
desintegrando a medida que el polen se desarrolla. El tapete interviene en la
nutrición de las células madres del polen y de las microsporas jóvenes. Estudios
ultraestructurales indican que el material de la membrana exterior del polen (exina)
es sintetizado por el tapete (HESLOP-HARRISON y HESLOP-HARRISON, 1970).
GOURRET y MISSET (1989) indican que el polen está limitado por una membrana
citoplasmática, una pared celulósica, la intina, y por la exina. La exina es una pared
ornamentada, constituida por un material resistente y flexible que es la
esporopolenina. Ésta comprende numerosas zonas más delgadas y menos
resistentes de forma alargada (colpos) o redondeadas (poros) que son las aperturas
por donde sale el tubo polínico. Por su parte, ESAU (1985) agrega que la exina está
formada principalmente por una sustancia lipoide, la esporopolenina, que es menos
soluble que la cutina o la suberina.
La mayoría de los granos de polen tienen surcos o colpos, lugares donde la exina es
muy delgada y la intina se encuentra bien desarrollada. El número de colpos puede
variar de uno a muchos. El tubo polínico emerge a través del orificio en el momento
de la germinación del grano de polen empujando hacia un lado la intina. Los colpos
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son considerados también como las partes flexibles de la esporodermis, que
permiten el cambio de forma y tamaño del grano de polen originado por la variación
del contenido de agua (ESAU, 1985).
BREWBAKER (1959) añade que los granos con tres surcos (tricolpatos), se definen
como binucleados debido a dos divisiones seguidas: separación de microsporas y
antesis respectivamente.
Por su parte, la intina no tiene ornamentaciones y se forma principalmente de
poliurónidos o por una mezcla de poliurónidos y polisacáridos, pero en su parte
interna contiene también celulosa (ESAU, 1985).
El grano de polen es rico en carbohidratos (8-15%), lípidos (1-20%), proteínas y
aminoácidos, vitaminas y enzimas. En Solanáceas, por ejemplo, no se le ha
encontrado clorofila y raramente antocianos. Comúnmente se encuentran
carotenoides en especies polinizadas por insectos, mientras que pigmentos no
carotenoides han sido detectados en polen de flores polinizadas por viento
(BREWBAKER, 1959).
2.1.2. Diseminación del grano de polen y polinización
Según BAKKER (1989), dependiendo de las condiciones de luz, las anteras abren
dos a ocho horas después que el sol ha salido para permitir que el polen se
disemine y caiga al estigma.
En la mayoría de las plantas, la diseminación del polen se realiza por dehiscencia,
esto es por abertura espontánea de la antera. Esta abertura o estomio puede ser
una hendidura longitudinal localizada entre los dos lóculos de cada media antera
(ESAU, 1985).
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La dehiscencia normalmente ocurre a continuación de la antesis y, en algunos
casos ocurre en forma simultánea con ella (COCHRAN, 1938). Antes de la
dehiscencia puede romperse la separación entre los dos lóculos del mismo lóbulo.
Después de esta desintegración, solamente una capa celular, la epidermis, separa
el lóculo del exterior en la región de la dehiscencia. Esta parte de la epidermis
consta particularmente de pequeñas células y se rompe fácilmente cuando el polen
está maduro (ESAU, 1985).
Una vez maduro, y cuando logra tener contacto con un estigma hembra compatible,
el grano de polen se rehidrata rápidamente y emite un tubo polínico que va a
conducir sus células espermáticas y su núcleo vegetativo a través de los tejidos del
estilo, hasta un óvulo. Esta rehidratación consecutiva es indispensable en la
germinación del grano de polen, y por ende para una buena fecundación o
polinización (NEGRE, 2000). Esta importancia de la humedad la apoya un estudio
realizado por VAN HOOT y VAN RAVESTIJIN (1963) en tomate (Lycopersicon
esculentum Mill.), donde confirman que la alta humedad, aún cuando puede tender
a mantener el polen dentro de las anteras, también promueve la germinación del
polen y mejora la adhesión de éste a la superficie estigmática de la flor.
La duración de la viabilidad del polen varía considerablemente entre las diferentes
especies, y se relaciona con el tipo de polinización. En general, plantas con
polinización entomófila poseen un polen con una viabilidad mayor que aquellas
polinizadas con el viento (NEPI y PACINI, 1993).
En polinización artificial, KING (1961), trabajando con varias especies forestales,
ornamentales, hortícolas y frutales, descubrió que en ocasiones es necesario hacer
un pretratamiento del polen, si el grano no se ha separado totalmente de las anteras
o si la dehiscencia es incompleta. Este tratamiento consiste en someter el polen a
secado por una o varias horas a 90º F (32,2º C), lo que eventualmente podría
provocar una pérdida en la viabilidad de éste.
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2.2. Viabilidad del grano de polen:
La preservación de la viabilidad del polen es de gran valor para cultivadores y
genetistas, al eliminar los problemas de tiempo y espacio que se presentan al hacer
polinización artificial (KHOSH-KHUI, BASSIRI y NIKNEJAD, 1976).
2.2.1. Factores que afectan la viabilidad
La esterilidad observada al estado de grano de polen es comúnmente el efecto
tardío de una alteración, invisible en la mayoría de los casos, afectando el proceso
normal de génesis del grano de polen que se ubica en forma más precoz. Después
de la emisión fuera de la zona polínica, el grano de polen tiene una duración de vida
variable (generalmente corta), dependiendo notablemente de las condiciones
atmosféricas (NEGRE, 2000).
La viabilidad del polen de diversas especies es afectada por factores ambientales
como:
-altas y bajas temperaturas (RYLSKI y SPIGELMAN, 1982; CHARLES y HARRIS,
1972);
-humedad y estrés hídrico (KUO, PENG y TSAY, 1981; SAINI y ASPINALL, 1981);
-fotoperíodo e intensidad de luz (FIONA, 1988);
-concentración de CO2 y O2 (SAHAR y SPIEGEL-ROY, 1980), entre otros.
Dentro de los factores que afectan la viabilidad del polen, se ha estudiado que las
bajas temperaturas causan infertilidad en muchas especies, como por ejemplo,
berenjena, cebolla, sorgo y pimentón. En flores de pimentón, bajas temperaturas
(18º C día/15º C noche) producen estambres carpeloides y polen no viable
(POLOWICK y SAWHNEY, 1985).
La capacidad de germinación del polen se puede ver afectada por la temperatura
antes y durante la antesis (JOHRI y VASIL, 1961). COCHRAN (1938) señala que en
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pimentón (Capsicum annuum L.), temperaturas bajo los 23,8º C retardan todo el
mecanismo de antesis y dehiscencia.
La germinación del polen es influenciada también por la edad y la madurez de éste
(JOHRI y VASIL, 1961). Los granos de polen muestran gran variabilidad cuando son
cosechados desde diferentes anteras de una flor o aún desde la misma antera
(KUO, PENG y TSAY, 1981; JOHRI y VASIL, 1961; KING, 1961; SMITH, 1932), y si
se cosecha de una flor antes de la antesis puede que eventualmente no germine
(MORTENSON, PELOQUIN y HOUGAS, 1964).
2.2.2. Pruebas de viabilidad de polen
De acuerdo a STANLEY y LINSKENS (1974), los principales factores que afectan la
germinación del polen son:
-Factores primarios: temperatura, pH, oxígeno, presión osmótica, humedad,
cationes (Ca++, K+, metales pesados), aniones (BO3---, PO4-), carbohidratos.
-Factores secundarios: hormonas de crecimiento, CO2, micronutrientes, irradiación.
Como una alternativa para mediar la problemática de la pérdida de viabilidad
ocasionada por los factores citados anteriormente, se han adaptado numerosos
métodos para estimarla. Éstos pueden separarse en dos categorías:
• In vitro: se estudia o se pone a germinar el polen en condiciones de laboratorio.
• In vivo o In situ: se pone a germinar el polen sobre el estigma de una planta
femenina.
2.2.2.1. Pruebas practicadas in vitro
Para determinar la viabilidad del polen a nivel de laboratorio, existen varias pruebas,
entre éstas: germinación, actividad enzimática y tinción del citoplasma de granos de
polen (HESLOP-HARRISON, HESLOP-HARRISON y SHIVANNA, 1984).
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-Prueba de germinación
Esta prueba simula el crecimiento del tubo polínico en los tejidos estilares. En
efecto, el medio utilizado se asemeja a la composición del mucílago del estigma
(BREWBAKER y KWACK, 1963). Los protocolos cambian según el vegetal y los
autores, pero la mayoría utiliza el medio elaborado en 1963, medio Brewbaker y
Kwack o medio BK (RIHOVA, HRABETOVA y TUPY, 1996; LANSAC et al., 1994;
MERCADO, FERNÁNDEZ-MUÑOZ y QUESADA, 1994; DEMEKE y HUGUES,
1991; LEDUC, MONNIER y DOUGLAS, 1990; ALEXANDER y GANESHAN, 1989;
HICKS, STEPHENS y WEIGLE, 1987; JAMES, ARIYANAYAGAM y DUNCAN,
1987; PFAHLER y LISKENS, 1973).
La germinación in vitro implica hacer germinar el polen en un medio artificial y
determinar la viabilidad y crecimiento del tubo polínico (WEAVER y TIMM, 1989;
LEVY, RABINOWITCH y KEDER, 1978; CHARLES y HARRIS, 1972; ABDALLA y
VERKERK, 1968; HOWLETT, 1936). El procedimiento requiere mucho menos
tiempo (cerca de 1,5 horas) que la aproximación in vivo, y se puede adaptar como
una metodología de rutina para varias muestras (BARRY y UDDIN, 1988; HESLOP-
HARRISON, HESLOP-HARRISON y SHIVANNA, 1984).
Las pruebas de germinación en medios artificiales son frecuentemente usadas para
determinar la viabilidad de muestras de polen almacenado y fresco. Las variables
como por ejemplo, factores quimiotrópicos, nivel de pH, contenido de boro-azúcar y
efectos de la población de polen, deben ser considerados, en parte para las
respuestas erráticas de la germinación in vitro del polen (HAUSER y MORRISON,
1964).
Normalmente, los granos de polen no germinan satisfactoriamente en agua, pero las
soluciones acuosas de sacarosa (ocasionalmente otros azúcares también) con o sin
la adición de sustancias accesorias, producen buenos resultados (JOHRI y VASIL,
1961).
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La cantidad y densidad de polen también afecta la germinación y el largo del tubo
polínico. Una cantidad similar de granos de polen tiene que ser entonces extendida
uniformemente en el medio para obtener resultados comparables (VISSER, 1955).
Confirmando lo anterior, FRANKLIN (1981) sostiene que se ha encontrado un efecto
de estimulación mutua en la germinación del polen. Cuando los granos de polen han
sido desigualmente distribuidos sobre el medio, existen grupos localizados que
pueden lograr una germinación mayor que los granos únicos. Debido a una
competencia entre los tubos polínicos, esta distribución causa dificultad en el conteo
adecuado de la muestra de granos y en la determinación de la germinación actual
de grupos.
Para ello, STANLEY y LISKENS (1974), sugieren que un tamaño de muestra de 200
granos de polen por placa puede ser satisfactorio.
Se plantea que la adición externa de azúcares a los medios de germinación in vitro,
tiene sólo un rol osmótico y no son utilizados por el tubo para ningún propósito
nutricional (MARTIN, 1959). Por el contrario, JOHRI y VASIL (1961), son partidarios
de adicionar azúcares en el medio de germinación como material nutriente para el
crecimiento de los tubos polínicos.
IWANAMI y NAKAMURA (1972) mencionan que al momento de la dehiscencia, los
granos de polen usualmente contienen glucosa, sacarosa o fructosa como alimentos
de reserva.
BREWBAKER y KWACK (1963) postulan que generalmente concentraciones de
azúcar sobre el 40% no mejoran el crecimiento, mientras que aquellas bajo el 2%
incrementan el reventamiento del polen y de los tubos.
En análisis cuantitativos se encontró que los granos de polen requieren, a menudo,
la misma concentración de ácido bórico presente en la secreción estigmática
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(JOHRI y VASIL, 1961). Más aún, los mismos autores concluyen que el boro juega
un rol estratégico en la germinación del polen.
Según JOHRI y VASIL (1961) el rol del boro en la germinación y crecimiento del
tubo polínico sería triple: (a) promueve la absorción y el metabolismo del azúcar
formando complejos azúcar-boro, (b) incrementa la captación de oxígeno, y (c) está
envuelto en la síntesis de materiales pécticos de la pared del tubo polínico que está
en activa elongación.
MORTENSON, PELOQUIN y HOUGAS (1964) plantean que el mejor resultado en
cuanto a germinación de polen de Solanum sp se obtiene en una solución con 20%
de sacarosa y 50 mg/l de ácido bórico.
Sólo en 1963, con la investigación realizada por BREWBAKER y KWACK, se
determinó el importante rol del calcio, potasio, magnesio y sodio en la germinación
del polen.
El calcio se encuentra en baja cantidad en los granos de polen, promediando
alrededor de un 0,03%, y se le relaciona con las pectinas. Parece probable que el
mejoramiento de la germinación y el crecimiento del tubo polínico se deba
primeramente al aferramiento del calcio en los grupos pectato-carboxílicos a lo largo
de la pared del polen (BREWBAKER y KWACK, 1963).
Los mismos autores indican que la adición de agar a los medios de germinación no
incrementa la germinación, sin embargo, permite en algunos tipos de polen,
aumentar el largo del tubo.
-Prueba de tinción con sales de tetrazolio
Esta prueba pertenece al grupo de las pruebas citológicas, cuya característica es
entregar una indicación colorimétrica de la actividad metabólica de los granos de
polen luego de su rehidratación y permiten estimar la viabilidad del polen. Estas
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pruebas permiten (a) teñir los constituyentes específicos de los granos de polen
maduros: almidón y callosa en particular gracias al azul de anilina o al yoduro de
potasio (DUMAS et al., 1984), (b) teñir simultáneamente la pared y el protoplasma
(ALEXANDER, 1969), e (c) indicar la presencia de enzimas funcionales como
peroxidasa, esterasa y deshidrogenasa (IBORRA et al., 1992).
VIEITEZ (1952) acota que en general las soluciones neutras de tetrazolium
incoloras son reducidas tomando color rojo debido a la formación de trifenil
formazán reducido, en presencia de ciertos sistemas enzimáticos contenidos en las
células vivas. SARVELLA (1964) añade que la tinción de tetrazolio es reducida a
rojo-formazán por las enzimas deshidrogenasas de los tejidos vivos.
HAUSER y MORRISON (1964) señalan que, asumiendo la reducción in vitro del
nitro azul tetrazolio como prueba válida para la actividad de la succínico
deshidrogenasa en el Ciclo de Krebs, se podría discriminar entre aquellos granos
que tienen metabolismo oxidativo, y que presentan viabilidad potencial de aquellos
que no lo poseen. Estos últimos se asumen no viables.
Los mismos autores mencionan que el nitro azul tetrazolio podría ser útil en
determinar si un factor ambiental determinado (temperatura, pH, humedad) afecta la
capacidad del polen para llevar a cabo el metabolismo oxidativo.
Existe una temperatura óptima para toda reacción enzimática, aunque no siempre
es un punto fijo, sino que puede depender de la cantidad de enzima presente en el
medio reaccionante (VISSER, 1955). La reacción a 20º C no solamente es lenta,
sino que también es poco intensa. El polen positivo aparece primero de color rosado
que gradualmente se va haciendo más intenso para finalizar con la coloración roja
(VIEITEZ, 1952).
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-Prueba de reacción fluorocromática (FCR)
Esta prueba se basa en dos principios como es la integridad de la membrana
plasmática y la presencia de una esterasa activa en la célula.
El principio de esta prueba lo explican DUMAS et al. (1984) y HESLOP-HARRISON
y HESLOP-HARRISON (1970), señalando que un sustrato no fluorescente, el
diacetato de fluoresceína, molécula apolar, se pone en contacto con el polen y
penetra al interior de su membrana. El sustrato sufre una hidrólisis al interior de la
célula vegetativa siempre que la esterasa esté activa. La membrana, si es íntegra,
no es permeable a los productos de la hidrólisis, como por ejemplo la fluoresceína,
molécula polar que se torna cada vez más fluorescente. Los granos de polen que
posean esas dos características, emiten entonces una fluorescencia verde cuando
se excitan con luz azul bajo la observación de un microscopio de fluorescencia.
Por el contrario, si la célula está muerta o tiene su membrana desestructurada, la
célula no fluoresce (HESLOP-HARRISON, HESLOP-HARRISON y SHIVANNA,
1984; HESLOP-HARRISON y HESLOP-HARRISON, 1970; ROTMAND y
PAPERMASTER, 1966). Eventualmente, células dañadas o anormales pierden su
fluorescencia debido a que pierden su contenido intracelular en el medio de
preparación de la prueba (ABDUL-BAKI, 1992). STADELMAN y KINZEL (1972)
apoyan señalando que la lectura se detecta con la fluorescencia debido a que la
fluoresceína se acumula intracelularmente.
Más tarde, HESLOP-HARRISON, HESLOP-HARRISON y SHIVANNA (1984)
confirman que uno de los factores que puede relacionarse estrechamente con la
viabilidad de la célula vegetativa del gametofito macho es el estado del plasmalema.
En la integridad de ese último, sería útil el uso de la prueba de diacetato de
fluoresceína.
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Esta prueba ha sido usada satisfactoriamente en la determinación de la viabilidad
del polen de más de 30 especies, incluyendo cebolla, impatiens, caña de azúcar y
tomate (WIDRLECHNER et al., 1983).
La prueba FCR tiene la ventaja de ser muy rápida y fácil de interpretar, aún cuando
requiera invertir en un microscopio de epifluorescencia. Sin embargo, no es segura
en un 100%, ya que se pueden contar como vivos ciertos granos de polen
inmaduros (incapaces de germinar), o incluso como muertos ciertos granos donde la
membrana se desestructuró debido a la deshidratación y que fecundarían un óvulo
normalmente después de la rehidratación. En efecto, la deshidratación del polen
encadena una desestructuración de la membrana plasmática (debido a la
inestabilidad de la bicapa lipídica) (SHIVANNA, LINSKENS y CRESTI, 1991;
SHIVANNA y HESLOP-HARRISON, 1981).
2.2.2.2. Pruebas practicadas in vivo
Una aproximación de las pruebas in vivo implica ubicar el polen en el estigma de las
flores emasculadas y determinar el número de tubos polínicos en el estilo
(DEMPSEY, 1970; ABDALLA y VERKERK, 1968; VAN HOOT y VAN RAVESTIJIN,
1963) o bien determinar el número de semillas a la maduración de los frutos
(MAISONNEUVE y PHILOUSE, 1982; EL AHMADI y STEVENS, 1979; MCGUIRE,
1952). Sin embargo, estas metodologías requieren tiempo y son impracticables para
probar un número elevado de muestras.
Más aún, la producción de semillas no depende solamente de la fertilización, sino
también del desarrollo del ovario posterior a la polinización, de la receptividad del
pistilo y de las reacciones incompatibles (BARRY y UDDIN, 1988; HESLOP-
HARRISONN, HESLOP-HARRISON y SHIVANNA, 1984).
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- Marchitez de la flor: Se observa una marchitez de los pétalos con el cierre de la flor
al cabo de 48 horas si es que ocurrió la fecundación. El problema es que este
método no es cuantitativo (VAN INGHELANDT, 1999).
- Germinación in situ: Se puede observar el crecimiento del tubo polínico
directamente sobre la planta, en los tejidos del estilo y obtener una apreciación
directa bajo condiciones reales de la aptitud del polen para germinar. Para ello
existen varios métodos: (a) de tinción, los cuales diferencian en verde los granos de
polen vacíos o no germinados, y en rosado los tubos polínicos (LEWIS, 1979); o
bien en azul oscuro el polen y su tubo, y en verde los tejidos estilares
(ALEXANDER, 1987); o simplemente los granos germinados o no en azul (DIONNE
y SPICER, 1958); (b) técnicas de fluorescencia (TAN, 1984; MARTIN, 1959).
- Rendimiento: Esta prueba consiste en ver si se produjo cuaja y en qué proporción,
contando el número de semillas por fruto. Es la prueba más próxima a la realidad,
ya que el objetivo de estos experimentos es producir semillas. Sin embargo, posee
un inconveniente, ya que puede intervenir otro factor además de la calidad del
polen, como por ejemplo, las condiciones de polinización y el efecto de la hembra
(VAN INGHELANDT, 1999).
- Germinación de las semillas: Se ha destacado una influencia de la facultad
germinativa del polen sobre el porcentaje de germinación de las semillas
producidas, factor muy importante para la calidad de las semillas comerciales. Sin
embargo, aún queda mucho por investigar (VAN INGHELANDT, 1999).
2.3. Conservación del polen:
En 1950 ya se plantea la posibilidad de almacenar polen de diversas especies con
el fin de realizar polinización artificial de alta viabilidad (GRIGGS, VANSELL y
REINHARDT, 1950).
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JOHRI y VASIL (1961) señalan que no conocen métodos de almacenaje de polen,
pero que postulan que es improbable que el polen almacenado retenga su viabilidad
en áreas donde prevalecen condiciones de alta humedad y alta temperatura.
Polen de pecana (Carya illinoinensis) al secarlo a 35º C por una hora pierde 4% de
su peso fresco, preservando la viabilidad, pero al aumentar el tiempo de secado la
viabilidad decrece. Polen no secado y almacenado a –12º C por dos años tiene
viabilidad nula pese a haber sido bien conservado en bolsas herméticas. El grano de
polen pierde más rápidamente su viabilidad si no está seco (YATES et al., 1991).
Por otra parte, KING (1961) plantea que la baja temperatura incrementa la viabilidad
del polen almacenado. Además, tratar la muestra con un prefrío de 15-30 segundos
aparentemente no tendría ventajas. Sí sería necesario combinar este almacenaje a
baja temperatura con un proceso preliminar de desgasificado de la muestra.
VISSER (1955) aclara que los granos de polen que han sido almacenados resisten
bien la deshidratación y germinan mejor en soluciones con bajo contenido de
azúcares.
En relación al efecto de la humedad y la temperatura en el almacenaje de polen,
JOHRI y VASIL (1961), explican que el polen de tomate (Lycopersicon esculentum
Mill.) sobrevive por cuatro días bajo condiciones de laboratorio y de él se obtienen
frutos normales; el polen viejo produce frutos de reducido tamaño. También,
concluyen que el almacenaje a bajas humedades triplica el promedio de longevidad
del polen.
Polen de algunos cultivos hortícolas pueden sobrevivir por algunos meses con
viabilidad decreciente, a temperaturas justo por debajo de la congelación y con una
humedad relativa del ambiente controlada, si el polen no es disturbado (KING,
1961).
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VISSER (1955) plantea dos tipos de almacenaje promisorios: congelado a –20º C y
conservación en oxígeno líquido; pero este último es generalmente impracticable.
Otra posibilidad es un congelado en seco, sometiendo la muestra a un baño de hielo
seco con acetona a –60º C y vacío a 5-250 mm Hg.
PARFITT y ALMEHDI (1983) señalan que al haber pérdidas en viabilidad durante el
congelado o en el deshielo de las muestras de polen se usarían crioprotectores.
En vid, el almacenaje de polen en nitrógeno líquido es conveniente y seguro en
términos de fallas en el suministro de energía, además el polen puede ser usado
inmediatamente después del deshielo pues no requiere crioprotectores (PARFITT y
ALMEHDI, 1983). Al respecto, YATES, THOMPSON y GILES (1986) citan
soluciones de sacarosa al 15% y dimetil sulfoxido al 0,01% (DMSO) como buenos
crioprotectores de polen.
WEATHERHEAD, GROUT y HENSHAW (1978) obtuvieron un almacenaje
criogénico de polen bastante satisfactorio en S. tuberosum, ante lo cual sugieren
que el tomate por pertenecer al mismo género pudiera expresar los mismos
resultados.
Posteriormente, otros autores también lograron los mismos resultados en diversas
especies, incluyendo Clianthus formosus (G. Don) Ford and Vickery (HUGUES, LEE
y TOWILL, 1991), Juglans regia L. (LUZA y POLITO, 1988) y Panax ginseng L.
(ZHANG et al., 1993).
VISSER (1955) logró hacer germinar polen de tomate almacenado a –190º C
durante dos años y a –20º C durante tres años. Con el último tratamiento obtuvo dos
frutos con semillas. En contraste, MCGUIRE (1952) encontró que polen de tomate
almacenado a 0º C no era funcional después de seis meses de almacenaje.
18
SACKS y STCLAIR (1996) demostraron que flores de tomate polinizadas con
muestras de polen almacenadas durante cinco semanas a –80º C, con o sin
refrigeración a 4º C por 20 horas, tuvieron un número de frutos y de semillas viables
por fruto similares a aquellas polinizadas con polen fresco.
JOHRI y VASIL (1961) señalan que cuando la humedad relativa fluctúa
frecuentemente durante el almacenaje, la viabilidad se pierde rápidamente. También
plantean que esto puede deberse a que el polen no soporta variaciones extremas en
su medio ambiente.
Posteriormente, LISKENS (1964) plantea que la humedad del aire durante el
almacenaje juega un papel decisivo en la longevidad del polen. Además, la gran
mayoría de las especies de polen investigadas mantienen su vitalidad con bajas
humedades relativas (0-30%). También señala que el polen de la mayoría de las
especies investigadas pierde su viabilidad tanto a altas como a bajas humedades,
mientras que la longevidad fue mayor con humedad relativa de 6 a 80%.
Polen de nogal inglés (Juglans sp.) almacenado a -20º C bajo condiciones de
humedad relativa controlada a través de soluciones salinas, retiene su viabilidad por
más de un año (LEE, THOMAS y BUCHMANN, 1985).
LISKENS (1964) agrega que la viabilidad del polen durante el almacenaje depende
del grado en que su actividad vital es reducida, sin disminuir el poder de
germinación. El autor también menciona que la longevidad generalmente se
incrementa con la reducción de la humedad relativa durante el almacenaje, pero en
casos especiales, el contenido de agua no puede ser llevado bajo un nivel crítico.
En esos casos, un alto contenido de agua es indispensable para la longevidad.
Parece ser que el grado de humedad es el factor más importante en el almacenaje
del polen. Sin embargo, otros factores se discuten. Con la disminución en el
contenido de humedad en el polen, no sólo aumenta ésta la resistencia a la
19
temperatura, sino también aumenta la resistencia contra venenos y daños
mecánicos (LISKENS, 1964).
La longevidad del polen almacenado incrementa cuando disminuye el contenido de
humedad. Un alto contenido de humedad permite una gran actividad metabólica y
también promueve la actividad destructiva de hongos y bacterias contaminantes.
Todo método de almacenaje está diseñado para reducir rápidamente el contenido
de humedad del polen fresco (25-35%) y asegurar un mínimo de fluctuación en la
humedad durante el período de almacenaje (FRANKLIN, 1981).
En el caso de Rosa sp., un 50% de humedad fue lo mejor para mantener la
viabilidad del polen (KHOSK-KHUI, BASSIRI y NIKNEJAD, 1976).
Además de la temperatura y la humedad, existen otros factores atmosféricos que
también influyen en la viabilidad del polen. Es así como JOHRI y VASIL (1961)
afirman que altas concentraciones de dióxido de carbono (el cual es obtenido
automáticamente cuando el polen se almacena sobre hielo seco), también
incrementan la longevidad, mientras que el almacenaje en oxígeno puro es menos
favorable.
LISKENS (1964) menciona que la principal razón para la disminución de la vitalidad
en almacenaje se encuentra en el hecho que bajo condiciones fisiológicas normales
el consumo de sustrato respiratorio es normal, lo cual conduce al agotamiento de las
sustancias de reserva. Agrega también que el mecanismo por el cual las células del
polen mantienen su viabilidad está relacionado con la tasa de respiración
intracelular durante el período de almacenaje y que el consumo de enzimas y
hormonas de crecimiento, también juegan un rol.
La nutrición mineral de la planta durante el desarrollo del polen también influye en la
longevidad y, por otra parte, la influencia de la contaminación bacteriana durante el
20
almacenaje no debe ser descuidada, ni tampoco el efecto destructivo de la luz
ultravioleta en relación con la disminución de la viabilidad (LISKENS, 1964).
Las condiciones de almacenaje son específicas para cada especie vegetal; por
ejemplo, el polen de algunas gramíneas necesita baja temperatura y alta humedad
(KHOSH-KHUI, BASSIRI y NIKNEJAD, 1976).
Según CONNOR y TOWILL (1993), la deshidratación es un parámetro que juega un
gran rol en la conservación del polen. Otro parámetro importante es la temperatura
(MAGUIRE y SEDGLET, 1997; RAJASEKHARAN et al., 1994; BARNABAS, 1984).
Experiencias anteriores definieron condiciones de conservación del polen, ya sea a
temperatura ambiente, al refrigerador a 4º C o al congelador a –18º C. En todos los
casos, VAN INGHELANDT (1999) demostró que una deshidratación previa era
necesaria.
21
3. MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio se llevó a cabo en la empresa Semillas Limagrain de Chile Ltda.,
ubicada en la localidad de Olmué, 32º 59’ Latitud Sur y 71º 11’ Longitud Oeste, a 8,3
km de la ciudad de Limache, perteneciente a la V Región de Valparaíso. Dicho
estudio se realizó desde marzo del 2003 a marzo del 2004.
3.1. Ensayo 1: Evaluación de metodologías de conservación de polen sometido a
distintos tiempos de almacenaje:
El ensayo se realizó en un invernadero frío, donde se establecieron seis variedades
correspondientes a la línea parental macho (Fla7775, 98NC111, Dylan, Xavier,
Torindo y Nicolas) y una única línea parental hembra (Nikon) para la especie
tomate.
La elección de las variedades se basó en evitar los problemas de incompatibilidad
entre hembra y macho, dado que estos seis híbridos ya son conocidos y son
actualmente variedades comerciales.
El invernadero consistió en una estructura metálica circular con cubierta de malla
Rashel de 80% blanca y polietileno de 0,2 mm de espesor, orientada en sentido
norte-sur. Las dimensiones eran de 32 m de largo, 8 m de ancho y 3,8 m de alto
(Figura 1). La elección de este tipo de estructura fue en base a la única alternativa
disponible en el predio para establecer el ensayo.
Para el almácigo de cada variedad se usó repique y trasplante a contenedor. El
macho se sembró el 06 de junio del 2003, 20 días antes que la hembra. Antes de la
plantación las mesas fueron fumigadas con bromuro de metilo.
22
FIGURA 1. Invernadero circular frío de estructura metálica con dimensiones de 32 m x 8 m x 3,8 m, donde se realizó el ensayo.
23
Las mesas de cultivo se distanciaron en 1,8 m y permitieron diseñar la plantación
con doble hilera de plantas, a 30 y 50 cm sobre la hilera para machos y hembra
respectivamente, y 60 cm entre plantas para ambos. Las mesas se acolcharon con
polietileno bicolor (naranjo/negro) de 150 micrones de espesor.
El diseño de plantación se adecuó en cuatro mesas de cultivo para realizar cuatro
repeticiones de cada cruce. En cada mesa se establecieron las seis variedades
macho en la forma de seis miniparcelas que consistían en 10 plantas macho para
ocho plantas hembras respectivamente. Por lo tanto, el macho tenía en total un
número de 40 plantas y 32 plantas hembras por cruce. La distribución de las
miniparcelas, en sus cuatro repeticiones, fue completamente al azar (Figura 2).
La hembra correspondió a una variedad determinada alta y su conducción se
intervino guiándola entre tres a cuatro ejes en altura con cinta de polietileno con el
fin de facilitar el manejo de las plantas, la emasculación y la polinización.
Los bloques de ocho plantas hembras se subdividieron en dos plantas para realizar
la polinización con el polen de los siguientes cuatro tratamientos:
T1: Testigo. Polen fresco.
T2: Polen almacenado en congelador a –18º C.
T3: Polen almacenado 24 horas en congelador a -18º C y luego almacenado en
nitrógeno líquido a -196º C.
T4: Polen almacenado en nitrógeno líquido a -196º C.
24
FIGURA 2. Distribución de las seis miniparcelas macho-hembra, de las variedades de tomate que forman parte del estudio, con sus cuatro repeticiones.
25
- Tratamiento polen fresco (T1)
Este tratamiento consistió en recolectar flores abiertas y semiabiertas de cada uno
de los machos, en forma separada, y se procedió a la extracción de los estambres,
para ser sometidos a un sistema de secado utilizado por la empresa, consistente en
luz infra roja a una temperatura entre 20-25º C durante 24 horas. Luego, se tamizó
el polen con filtros de mallas desinfectados con alcohol, así como también cada
implemento utilizado.
La recolección fue realizada en tres ocasiones, con el fin de hacer coincidir las
fechas de polinización con los tres tiempos de almacenaje de los otros tres
tratamientos.
El polen fresco fue almacenado en tubos eppendorf de 1,5 ml.
- Tratamientos de almacenaje (T2, T3 y T4)
La metodología de recolección fue la misma descrita anteriormente, y se realizó en
una ocasión, una semana antes a la primera recolección del polen para el T1.
Una vez obtenido el stock total de polen de cada variedad, se procedió a dividir cada
una de ellas en tres cantidades por igual, correspondiendo a los tres tipos de
almacenaje. A su vez, cada una de estas 18 muestras fue divida en tres cantidades
por igual, correspondiendo a cada tiempo de almacenaje. Este stock (54 muestras)
fue el que se utilizó posteriormente para la polinización manual a cada tiempo de
almacenaje.
Las tres muestras de polen por variedad para el T2 fueron almacenadas en tubos
eppendorf de 1,5 ml, en un refrigerador casero a -18º C, durante una semana, dos
semanas y tres semanas respectivamente.
Las tres muestras de polen por variedad para el T3 fueron almacenadas en tubos
eppendorf de 1,5 ml, durante 24 horas a -18º C, y luego en viales criogénicos de 2
26
ml, en nitrógeno líquido a -196º C, durante una semana, dos semanas y tres
semanas respectivamente.
Las tres muestras de polen por variedad para el T4 fueron almacenadas en viales
criogénicos de 2 ml, en nitrógeno líquido a -196º C, durante una semana, dos
semanas y tres semanas respectivamente.
El tratamiento de congelación en nitrógeno líquido a –196º C fue realizado en un
contenedor de 15 litros marca Lynde.
Cada una de las muestras fue descongelada al cumplir su tiempo de almacenaje. La
descongelación se hizo durante 24 horas a 5º C en un refrigerador casero.
Cada una de las muestras de polen fresco y polen almacenado fue utilizada en la
polinización, sobre un grupo de cinco flores, sobre cada una de las dos plantas
hembras que le correspondía, es decir, se polinizaron 10 flores por tratamiento para
cada tiempo. Por su parte, la polinización del polen fresco se hizo junto a cada fecha
de polinización de los tratamientos, para hacer la comparación correspondiente.
Las flores de la línea hembra se emascularon en estado verde, sacando el cono
estaminal en forma manual. A este nivel los pétalos aún no alcanzan su color final.
El marcaje se hizo dejando sólo dos sépalos.
La polinización se hizo 48 horas después de la emasculación en estado de flor con
pétalos amarillos y abiertos.
La polinización se hizo en horarios de 10:00 a 12:30 hr. Se polinizó con tubos
plásticos de 4 mm de diámetro y con abertura en el cilindro para tocar el estigma.
Cada tratamiento se evaluó in vitro e in vivo por las metodologías que se señalan a
continuación.
27
3.2. Ensayo 2: Evaluación de una metodología de estimación de calidad in vitro, y
relación entre viabilidad de polen in vitro e in vivo:
Para evaluar la viabilidad in vitro del polen se tomaron pequeñas muestras (la punta
de un alfiler) de polen fresco y seco, del stock total recolectado para ser
almacenado, considerada ésta como la primera prueba de viabilidad realizada para
todas las variedades. Luego se evaluó la viabilidad de las muestras en el día de la
polinización, de acuerdo a su tipo de conservación y tiempo de almacenaje, junto
con el polen fresco cosechado 48 horas antes al día de la polinización. De esta
manera se permitió evaluar el efecto del almacenaje sobre la calidad del polen.
La metodología elegida para evaluar la calidad del polen fue la prueba de reacción
fluorocromática (FCR), por su facilidad, fiabilidad y rapidez en entregar los
resultados. Esta prueba ha sido ampliamente investigada y utilizada por HESLOP-
HARRISON, HESLOP-HARRISON y SHIVANNA (1984), quienes sugirieron que
el medio contenga lo siguiente:
-Solución 1: Sacarosa al 20% en agua destilada
-Solución 2: Diacetato de Fluoresceína (FDA) en acetona (2 mg FDA por mL de
acetona)
La metodología de esta prueba consistió en hacer cuatro repeticiones por muestra
de polen, sobre dos portaobjetos limpios y desinfectados. A cada portaobjetos se le
aplicó una gota de la solución 2 en cada extremo y se esperó hasta que la acetona
se evaporara. Sobre esta solución ya seca, se aplicó una gota de la solución 1. Se
espolvoreó la muestra de polen (punta de un alfiler) sobre cada gota y se cubrió con
un cubreobjetos. Se esperó cinco minutos para realizar la lectura.
La lectura y conteo se realizaron para las cuatro repeticiones bajo un microscopio de
epifluorescencia con objetivo de 10x marca Nikon. Se contaron los granos ubicados
al centro de la muestra y no se contaron aquellas agrupaciones de granos, ya que
28
esto puede distorsionar el conteo. Los granos considerados viables fueron sólo
aquellos que emitieron una marcada fluorescencia (Figura 3). Como mínimo se
contaron 200 granos en total por repetición (granos viables + granos no viables) y se
calculó el porcentaje de viabilidad. El conteo se realizó con la ayuda de un contador
manual.
La base de esta prueba explicada por HESLOP-HARRISON y HESLOP-HARRISON
(1970) y DUMAS et al. (1984) se muestra en el Anexo 1.
3.3. Evaluaciones:
Para evaluar la capacidad germinativa in vivo se cosecharon todos los frutos de
tomate maduros (rojos), debidamente marcados. De estos frutos se registró lo
siguiente:
-número de frutos cosechados
-número de semillas por fruto
La cosecha se pudo relacionar con la viabilidad del polen, ya que los frutos tenían la
marca que identificaba el día de la polinización y el tratamiento aplicado.
Los resultados de los ensayos 1 y 2 se analizaron en conjunto con el fin de
determinar qué almacenaje fue mejor y qué relación tuvieron con los resultados in
vitro e in vivo.
Para el análisis estadístico del número de frutos y número de semillas, se aplicó el
modelo Completo al Azar con arreglo factorial de 4x3, considerando un error del 5%.
29
Yij = µ + Ci + Tj + CTij + εjjk
Yij : variable respuesta (número de frutos, número de semillas)
µ : media general
Ci : i-ésima forma de conservación
Tj : j-ésimo tiempo de almacenaje
CTij : interacción entre conservación y tiempo
εjjk : error experimental ∼ N(0;σ2)
Para el análisis de las correlaciones, se aplicó el coeficiente de correlación de
Pearson, determinando su significancia con el test t-Student al 5%.
30
FIGURA 3. Fluorescencia emitida por un grano de polen de tomate considerado viable, obtenida por la prueba de reacción fluorocromática (FCR), y observada bajo microscopio a epifluorescencia.
31
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Relación entre metodologías de conservación de polen sometido a distintos
tiempos de almacenaje:
4.1.1. Relación con el número de frutos
Los resultados de esta investigación se presentan en los Cuadros 1 a 6. El número
potencial total de frutos obtenidos es 40.
Los resultados obtenidos indican que existen diferencias estadísticas en los
diferentes tratamientos y en sus tiempos de almacenaje.
CUADRO 1. Promedio del número de frutos de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad 98NC111, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 6,1 c 6,1 c 5,9 cCongelado a -18ºC. 5,2 a 4,9 a 4,8 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido 5,4 b 5,8 b c 4,6 aNitrógeno Líquido 6,0 c 6,0 c 5,8 b c CUADRO 2. Promedio del número de frutos de tomate resultantes de las
polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Dylan, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 9,3 c 8,5 b c 7,8 bCongelado a -18ºC. 7,5 b 5,0 a 5,4 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido 5,6 a 4,6 a 4,9 aNitrógeno Líquido 8,8 c 8,2 b 8,1 b
32
CUADRO 3. Promedio del número de frutos de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Fla7775, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 7,6 c 7,4 c 7,3 cCongelado a -18ºC. 7,3 b 5,1 a 5,5 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido 5,2 a 4,9 a 5,0 aNitrógeno Líquido 7,0 b 6,5 b 6,2 b
CUADRO 4. Promedio del número de frutos de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Nicolas, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 6,6 c 6,6 c 6,5 cCongelado a -18ºC. 6,0 b 5,1 a 4,5 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido 5,3 a 5,6 a b 5,4 aNitrógeno Líquido 6,3 c 5,7 b 6,1 b c
CUADRO 5. Promedio del número de frutos de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Torindo, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 6,4 b 6,2 b 6,8 cCongelado a -18ºC. 5,1 a 4,9 a 4,5 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido 5,6 a b 5,4 a 4,3 aNitrógeno Líquido 5,9 b 6,1 b 6,2 b
33
CUADRO 6. Promedio del número de frutos de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Xavier, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 7,7 c 7,3 c 6,6 b cCongelado a -18ºC. 6,3 b 5,8 a b 5,0 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido 4,8 a 5,1 a 5,0 aNitrógeno Líquido 6,6 b c 6,0 b 6,4 b
Los resultados muestran que el tratamiento de polinización con polen fresco siempre
demuestra ser la metodología más conveniente, al lograr un promedio de frutos
mayor para los distintos tiempos de almacenaje. Por su parte, el tratamiento con
nitrógeno líquido resultó tener el promedio de frutos más alto comparado con los
otros dos tratamientos de conservación. Entre los tres tipos de almacenaje, se
esperaba que el nitrógeno líquido presentara los promedios de frutos más altos a
medida que aumentaba el tiempo de almacenaje, al inhibir el metabolismo a -196º C
y favorecer con esto la reducción en la pérdida de la viabilidad. Sin embargo,
referente a esto último, los resultados no son concluyentes y no fueron los
esperados.
Uno de los factores que pudieron alterar los resultados es la situación estresante de
cambios de temperatura y humedad relativa a la cual se vieron afectadas las
muestras de polen. JACQUET (1990) menciona que previo a la conservación es
necesaria una deshidratación del polen con el fin de reducir la tasa de humedad de
éste. Esta reducción debe realizarse a tal punto de evitar la formación de cristales
de agua al alcanzar los -196º C. En el protocolo de esta investigación, la
deshidratación no fue estudiada y se realizó solamente un secado del polen según
la metodología descrita anteriormente, de 20-25º C durante 24 horas.
A su vez, JACQUET (1990) sostiene que para hacer uso del polen congelado en
nitrógeno líquido es necesaria una descongelación previa. Ésta se efectúa pasando
34
los tubos cerrados por baño maría durante uno a dos minutos a 37º C. Es
importante supervisar que el agua no penetre al interior de los tubos, logrando una
descongelación homogénea. De lo contrario, si el polen no se descongela, al tener
contacto con el aire se deshidrata y muere. En el protocolo de esta investigación, la
descongelación consistió en pasar las muestras a 5º C durante 24 horas en un
refrigerador casero, probablemente reduciendo la viabilidad del grano.
Las hipótesis anteriores también las plantean LUZA y POLITO (1988), quienes
trabajaron con polen de pistacho y concluyeron que algunas muestras de polen
podían responder en forma diferenciada a las condiciones dadas, ya sea por su
edad o por estar sujetas a condiciones de estrés durante el almacenaje. Esto
significa que las diferencias observadas exclusivamente en el polen fresco, pueden
deberse a la edad de éste o bien a las condiciones ambientales existentes el día de
la cosecha de las flores.
Por otro lado, la investigación se realizó en un invernadero frío, en una época (fines
septiembre - octubre) en la cual aún pueden haber cambios importantes en las
temperaturas noche/día. MAISONNEUVE (1978) postula que bajas temperaturas
pueden afectar de manera importante la cuaja. Si éstas intervienen durante los 10
días después de la polinización, el resultado puede ser bueno, pero si las plantas se
ven expuestas a 10º C dos semanas antes de la polinización (durante la formación
del polen), el resultado puede ser detrimental. Además, las bajas temperaturas
afectarán la cantidad y calidad de polen producido y su posterior germinación se
retrasará.
En polen de tomate, MAISONNEUVE (1982) indica que no hay mayores efectos en
la calidad del polen cuando se registran temperaturas nocturnas de 5-7º C contra
20º C durante el día. Sin embargo, con temperaturas bajas durante la noche y el día
(2-6º C la noche, 7-8º C el día), la calidad del polen de las flores se reduce.
35
4.1.2. Relación con el número de semillas
Los resultados de esta investigación se presentan en los Cuadros 7 a 12.
Los resultados obtenidos indican que existen diferencias estadísticas en los
diferentes tratamientos y en sus tiempos de almacenaje.
CUADRO 7. Promedio del número de semillas de tomate resultantes de las polinizaciones con polen bajo distintos tratamientos de conservación de la variedad 98NC111, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 158,3 c 140,9 b c 128,7 bCongelado a -18ºC. 119,5 a 117,4 a 93,0 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido150,0 c 125,1 b 111,7 aNitrógeno Líquido 149,1 c 125,8 b 123,3 b
CUADRO 8. Promedio del número de semillas de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Dylan, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 270,1 c 239,3 b c 117,6 aCongelado a -18ºC. 264,0 c 237,0 b c 136,9 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido 278,4 c 148,3 b 100,5 aNitrógeno Líquido 241,0 b c 177,5 b 145,3 b
36
CUADRO 9. Promedio del número de semillas de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Fla7775, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 220,8 c 167,9 b 128,2 aCongelado a -18ºC. 158,4 b 125,3 a 127,2 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido199,2 b c 136,7 a 131,5 aNitrógeno Líquido 215,2 c 130,8 a 124,2 a
CUADRO 10. Promedio del número de semillas de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Nicolas, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 154,0 c 133,8 a b 141,3 bCongelado a -18ºC. 133,0 b 124,2 a 117,9 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido160,4 c 126,9 a 121,2 aNitrógeno Líquido 155,2 b c 131,1 b 128,4 a
CUADRO 11. Promedio del número de semillas de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Torindo, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 136,8 c 136,4 c 117,0 bCongelado a -18ºC. 102,5 a b 98,5 a 74,6 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido125,4 b c 112,6 b 87,8 aNitrógeno Líquido 134,3 c 118,5 b 111,6 b
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CUADRO 12. Promedio del número de semillas de tomate resultantes de las polinizaciones con polen sometido a distintos tratamientos de conservación de la variedad Xavier, a distintos tiempos de almacenaje.
Tiempos de Almacenaje
Conservación 1 Semana 2 Semanas 3 SemanasFresco (sin almacenaje) 185,6 d 127,3 a 134,8 a bCongelado a -18ºC. 144,2 b 121,9 a 124,8 aCong. 24 hr a -18ºC. y N. Líquido166,8 b c 133,5 a b 117,7 aNitrógeno Líquido 170,5 c 174,2 c 134,6 a b
Los resultados muestran que el rendimiento en frutos y semillas son cada vez
menores a medida que aumentaba el tiempo de conservación. Esto resulta más
inquietante en el tratamiento con nitrógeno líquido, ya que según PARFITT y
ALMEHDI (1983) a -196º C (nitrógeno líquido) las actividades metabólicas están
casi ausentes, incluyendo procesos químicos y bioquímicos que, aún cuando
pueden reducir la viabilidad de semillas y otros tejidos vegetales, al almacenar
tejidos en nitrógeno líquido no hay cambios significativos en sus niveles de
viabilidad por largo tiempo. LISKENS (1964) también señala que en teoría la
actividad fisiológica del polen puede ausentarse a -190º C, y por lo tanto,
almacenajes a esta temperatura puede ser ilimitado sin una disminución en el
porcentaje de germinación.
Una hipótesis es que esta disminución en el porcentaje de germinación sí haya
ocurrido, generando una tasa de fecundación de óvulos menor, mientras el polen se
conservaba por más tiempo, o bien que el sustrato de las plantas madres, muy poco
enriquecido en un principio, no permitió una alimentación correcta de los frutos. Por
otra parte, las plantas se vieron atacadas por cancro bacteriano (Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis), enfermedad que produce una marchitez
parcial en ellas y donde los haces vasculares adquieren una tonalidad café,
generalmente provocando la muerte. Si bien, en el ensayo ninguna planta murió a
causa de esta patología, es posible que aquellas más afectadas hayan regularizado
la carga frutal y por ende el rendimiento en semillas.
38
4.2. Relación entre el número de frutos, número de semillas y el porcentaje de
viabilidad, en cada una de las variedades:
Los resultados de esta investigación se presentan en los Cuadros 13 a 18, que
corresponden a las correlaciones obtenidas.
CUADRO 13. Correlaciones del Nº de frutos, Nº de semillas y porcentaje de viabilidad en tomate variedad 98NC111.
Nº Frutos Nº Semillas % Viabilidad Nº Frutos 1 Nº Semillas 0,0459 1 (0,31) n.s. % Viabilidad 0,3511 0,6597 1 (3,16) * (5,95) * * Indica diferencias significativas al 5% () Estadístico de prueba distribución t-student, valor tabla t0.975(46)=2.015
Se determinó que existe una asociación directamente proporcional entre el número
de semillas y el porcentaje de viabilidad de polen. Así también, existe una
asociación directamente proporcional entre el número de frutos y el porcentaje de
viabilidad de polen.
CUADRO 14. Correlaciones del Nº de frutos, Nº de semillas y porcentaje de viabilidad en tomate variedad Dylan.
Nº Frutos Nº Semillas % Viabilidad Nº Frutos 1 Nº Semillas 0,3119 1 (2,23) * % Viabilidad 0,3289 0,3419 1 (3,06 * (2,96) * * Indica diferencias significativas al 5% () Estadístico de prueba distribución t-student, valor tabla t0.975(46)=2.015
39
Se determinó que existe una asociación directamente proporcional entre todos los
factores.
CUADRO 15. Correlaciones del Nº de frutos, Nº de semillas y porcentaje de viabilidad en tomate variedad Fla 7775.
Nº Frutos Nº Semillas % Viabilidad Nº Frutos 1 Nº Semillas 0,4285 1 (3,46) * % Viabilidad -0,008 0,4752 1 (0,05) n.s. (3,66) * * Indica diferencias significativas al 5% () Estadístico de prueba distribución t-student, valor tabla t0.975(46)=2.015
Se determinó que existe una asociación directamente proporcional entre el número
de semillas y el porcentaje de viabilidad. Así también, existe una asociación
directamente proporcional entre el número de frutos y el número de semillas.
CUADRO 16. Correlaciones del Nº de frutos, Nº de semillas y porcentaje de viabilidad en tomate variedad Nicolas.
Nº Frutos Nº Semillas % Viabilidad Nº Frutos 1 Nº Semillas -0,183 1 (1,26) n.s. % Viabilidad -0,076 0,6213 1 (0,52) n.s. (5,38) * * Indica diferencias significativas al 5% () Estadístico de prueba distribución t-student, valor tabla t0.975(46)=2.015
Se determinó que existe una asociación directamente proporcional entre el número
de semillas y el porcentaje de viabilidad.
40
CUADRO 17. Correlaciones del Nº de frutos, Nº de semillas y porcentaje de viabilidad en tomate variedad Torindo.
Nº Frutos Nº Semillas % Viabilidad Nº Frutos 1 Nº Semillas 0,4294 1 (4,25) * % Viabilidad 0,3949 0,5342 1 (2,95) * (4,29) * * Indica diferencias significativas al 5% () Estadístico de prueba distribución t-student, valor tabla t0.975(46)=2.015
Se determinó que existe una asociación directamente proporcional entre todos los
factores.
CUADRO 18. Correlaciones del Nº de frutos, Nº de semillas y porcentaje de viabilidad en tomate variedad Xavier.
Nº Frutos Nº Semillas % Viabilidad Nº Frutos 1 Nº Semillas 0,1937 1 (1,34) n.s. % Viabilidad 0,298 0,6255 1 (3,67) * (5,44) * * Indica diferencias significativas al 5% () Estadístico de prueba distribución t-student, valor tabla t0.975(46)=2.015
Se determinó que existe una asociación directamente proporcional entre el número
de semillas y el porcentaje de viabilidad. Así también, existe una asociación
directamente proporcional entre el número de frutos y el porcentaje de viabilidad.
Los resultados de estos análisis de correlaciones varían de acuerdo a la variedad,
sin embargo, la tendencia es a mostrar que existe una relación directa entre el
porcentaje de viabilidad del polen y el número de frutos, así como también con el
41
número de semillas. Esto ya lo habían postulado YATES et al. en 1991, recalcando
la importancia que existe entre la proporcionalidad del número de semillas frente al
número de granos capaces de fecundar.
De los resultados anteriores no se puede confirmar que exista una relación
directamente proporcional entre el número de frutos y el número de semillas, lo cual
se observa claramente en el análisis anterior, donde a mayor número de frutos no
necesariamente existe un mayor número de semillas. Pero sí queda claro que con
tres semanas de almacenaje, el número de semillas decae, producto de la muerte
del polen. SMITH (1932) le atribuyó a esta misma situación una causa de estímulo
hormonal. El autor plantea que este estímulo provoca la producción de frutos, pero
no el desarrollo de semillas, ya que los granos de polen son inviables para la
formación del tubo polínico, y por ende, para la formación de semillas. Con otra
propuesta a la misma problemática, COCHRAN (1938) atribuye esta diferencia a un
problema ambiental, argumentando que descubrió que la partenocarpia no se debía
a la falta de germinación del polen, sino que el tubo fracasaba al tratar de alcanzar
el saco embrionario, cuando se sometía a cambios bruscos de temperatura.
42
5. CONCLUSIONES
De los tres métodos de conservación de polen estudiados, la conservación en
nitrógeno líquido evaluada presentó los resultados más cercanos al uso de polen
fresco, en cuanto a la obtención de un mayor número de frutos y un mayor número
de semillas, siendo específico para cada variedad evaluada. Las bajas en los
rendimientos a través del tiempo de almacenaje, se adjudican más a una condición
de estrés ambiental que al método por sí solo. Sin embargo, el tamaño de la
muestra de polen, las condiciones ambientales (temperatura y humedad),
factibilidad de rehidratación y de descongelado, en especial en almacenajes a bajas
temperaturas, deben seguir siendo evaluados.
La metodología de estimación de viabilidad de polen de tomate in vitro evaluada
(prueba de reacción fluorocromática) reflejó una positiva correlación con los
resultados in vivo. A través de este método, nuevamente se demuestra que la
conservación de polen con nitrógeno líquido ofrece la mayor permanencia de la
viabilidad del polen.
La viabilidad del polen decrece en forma significativa cuando es sometido a
sucesivas condiciones de estrés ambientales.
Para todas las metodologías estudiadas, y en las condiciones investigadas, se
demuestra que polinizaciones diarias, todavía son preferibles con el uso de polen
fresco.
43
EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE POLEN SOMETIDOS A DISTINTOS TIEMPOS DE ALMACENAJE
EN TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.).
6. RESUMEN
Para mejorar la producción de semillas híbridas existe la alternativa de sincronizar la floración de los parentales machos y hembras con el fin de ahorrar tiempo. Sin embargo, para ello se requiere usar la técnica de conservación y reutilización del polen. Así, se hace necesario encontrar una metodología que permita testear la viabilidad del polen de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.). En este estudio, se describió una metodología para testear la viabilidad del polen de tomate, a través de la prueba de reacción fluorocromática (FCR) usando diacetato de fluoresceína. La viablidad del polen puede ser evaluada en cinco minutos determinando el porcentaje de granos de polen normales (redondos, lisos) fluorescentes de una muestra. Este porcentaje obtenido tuvo una alta correlación con el número de frutos y semillas evaluadas, lo que sugiere que esta prueba es una buena metodología para estimar la viabilidad del polen de tomate. Se investigó también el efecto de la conservación del polen sobre el rendimiento en frutos y semillas en tomate. Para ello, se evaluaron seis variedades después de ser almacenadas bajo tres tipos de conservación a 1, 2 y 3 semanas de almacenaje. Se polinizaron flores con muestras de polen almacenadas por tres semanas a -196º C, y los resultados fueron muy similares comparados a los resultados obtenidos con flores polinizadas con polen fresco, lo que sugiere que este tipo de conservación es el mejor para tomate. Cuando se utilizó polen de Dylan, Fla7775, Xavier, Nicolas, Torindo y 98NC111 para polinizar Nikon, el número de frutos y semillas varió significativamente. En general, la calidad del polen disminuyó en la segunda y tercera semana de almacenaje, por lo tanto se hace necesario seguir investigando para encontrar la mejor metodología de conservación. Estos resultados podrían ser útiles para construir un banco de polen y esta investigación sugiere que la crioconservación puede ser usada satisfactoriamente para los investigadores de tomate.
44
ASSESSMENT OF DIFFERENT POLLEN STORAGE METHODOLOGIES FOR TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.).
7. ABSTRACT
To improve hybrid seed production in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.), and to save time, flowering of male and female parents can be synchronized. However, to do this, a technique for pollen storage and re-use is required. It is also necessary to find a method for testing tomato pollen viability.
In this study a procedure to determine pollen viability in tomato using a fluorescein diacetate (FDA) test is described. Pollen viability can be evaluated in five minutes by determining the percentage of normal fluorescent pollen grains (round, and smooth) in a sample. This percentage had a high correlation for the number of fruits and seeds studied, suggesting that fluorescence is a good method for estimating tomato pollen viability.
The influence of the effect of pollen storage on fruit yields and seed production in tomato was also studied. Six varieties were assessed after three storage treatments: 1, 2 and 3 weeks. Flowers were pollinated with pollen samples stored for three weeks at -196º C. They had similar fruit set and number of seeds per fruit as those pollinated with fresh pollen, suggesting that this treatment is the best storage of tomato pollen. When cryogenically stored pollen of ‘Dylan’, ‘Fla7775’, ‘Xavier’, ‘Nicolas’, ‘Torindo’ and ‘98NC111’ was used to pollinate ‘Nikon’, the number of fruits and seeds formed per fruit differed significantly. Generally, pollen quality decreased by the second and third week of storage, so continued research will be necessary to find the best storage methodology. These results could be useful in the construction of a pollen data bank and this study suggests that pollen cryopreservation can be used successfully for tomato breeding.
45
8. LITERATURA CITADA ABDALLA, A. A. and VERKERK, K. 1968. Growth, flowering and fruit-set of the
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ANEXO 1. Prueba de reacción fluorocromática (FCR) y permeabilidad de la
membrana plasmática (DUMAS et al., 1984).
