LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM BIOANALISIS

PERCOBAAN 3

PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL

Disusun oleh:

Kelas/Golongan/Kelompok: 2010B/II/I

1. M. Fikarrotala G1F010040

2. Maulina G1F010042

3. Nurlaili Agustine G1F010044

4. Fitri Aprilia Junaedi G1F010046

5. Shinta Puspitasari G1F010048

Asisten : Soraya D.

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN

JURUSAN FARMASI

PURWOKERTO

2013

Percobaan 4

Penetapan Kadar Karbohidrat Total

A. Tujuan Percobaan

Mahasiswa dapat melakukan penetapan kadar karbohidrat total menggunakan metode

Enzimatik.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah tabung reaksi, mikropipet, dan

spektrofotometer uv-vis. Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah

reagen, standar kolesterol, serum darah, dan aquadest.

C. Prosedur Percobaan

Blanko

- diambil 20 µL- ditambahkan reagen sebanyak 2000 µL- dicampur- diinkubasi selama 20 menit pada suhu 20-25oC atau 10 menit

pada suhu 37oC- dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum di

daerah visibel (λ=500 nm)

Sampel/Standar

- diambil 20 µL- ditambahkan reagen sebanyak 2000 µL- dicampur- diinkubasi selama 20 menit pada suhu 20-25oC atau 10 menit

pada suhu 37oC- dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum di

daerah visibel (λ=500 nm)

Aquadest

Data

Sampel/standar

Data

D. Data Percobaan dan Perhitungan

Data Percobaan

λ= 500 nm

Absorbansi standar : 0, 836

Absorbansi sampel 1 : - 0,970

Absorbansi sampel 2 : 0,300

Absorbansi sampel 3 : 0,077

Absorbansi sampel 4 : 0,064

Perhitungan

- Sampel 1

Konsentrasi kolesterol = Absorbansi sampel1Absorbansi standar

x konsentrasi standar (mg/dL)

= −0,9700,836

x 100 mg/dL

= -116,029 mg/dL

- Sampel 2

Konsentrasi kolesterol = Absorbansi sampel2Absorbansi standar

x konsentrasi standar (mg/dL)

= 0,3000,836

x 100 mg/dL

= 753,588 mg/dL

- Sampel 3

Konsentrasi kolesterol = Absorbansi sampel3Absorbansi standar

x konsentrasi standar (mg/dL)

= 0,0770,836

x 100 mg/dL

= 9,211 mg/dL

- Sampel 4

Konsentrasi kolesterol = Absorbansi sampel3Absorbansi standar

x konsentrasi standar (mg/dL)

= 0,0640,836

x 100 mg/dL

= 7,656 mg/dL

- Konsentrasi kolesterol rata-rata = x1+x2+x 3

n

= 571,963+57,009+310,280

3

= 385.037,50 mg/dL

- SD dan CV

SD = 358,254

Jadi, konsetrasi kolesterol yang di dapat adalah sebesar 358,254 ± 221,621 mg/dL

E. Pembahasan

Penentuan kadar kolesterol dilakukan dalam beberapa tahap, diantaranya

yakni mempersiapkan larutan baku pembanding (standar) atau biasa kita kenal

sebagai larutan Blanko. Larutan blanko diambil dari reagen kit kolesterol untuk

perbandingan sampel dengan larutan baku satndar. Reagen kit yang digunakan kali ini

berisi Good’s buffer digunakan sebagai penyeimbangan pH dalam darah. Fenol dan 4-

aminoantypirine dapat menghasilkan senyawa quinoneimine yang dapat

menghasilkan warna. Kolesterol oksidase digunakan untuk mengoksidasi kolesterol

bebas menjadi kolestenon(kolesterol 3-one) dan menghasilkan Hidrogen peroksida,

sedangkan kolesterol esterase digunakan untuk menghidrolisis kolesterol ester

menjadi kolesterol bebas dan asam lemak.

Larutan baku standar dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan

menggunakan alat khusus yang kita ketahui yakni mikroipet. Alat yang biasa

digunakan untuk mengambil sampel maupun larutan baku standar adalah dengan

menggunakan mikropipet. Mikropipet yang digunakan juga mempunyai variasi

volume yang bereda-beda. Dalam praktikum ini kami menggunakan mikropipet yang

mempunyai ukuran 20 µl. Larutan blanko yang sudah dimasukkan ke dalam tabung

reaksi kemudian disimpan (inkubasi) selama 10 menit agar terjadinya reaksi yang

optimal minimal pada suhu ruangan (15-25 oC).. Proses inkubasi ini bertujuan

memberikan waktu untuk terjadinya reaksi antara kedua larutan dalam campuran

tersebut. Pengukuran blanko perlu dilakukan karena dikhawatirkan terjadi perubahan

reagen pada saat inkubasi dan memberikan serapan pada panjang gelombang

pengukuran. Saat proses inkubasi, terjadi reaksi antara reagen dengan kolesterol yang

terdapat pada larutan standard dan sampel. Setelah diinkubasi, kedua larutan yang

tadinya berwarna bening dalam masing-masing kuvet berubah menjadi warna merah

rosa. Warna merah tersebut menandakan telah terjadinya reaksi antara enzim dengan

kolesterol. Warna merah tersebut berasal dari senyawa quinoneimine, yang

merupakan hasil reaksi antara reagen dan kolesterol (Day,2002).

Blanko yang sudah disimpan kemudian diperiksa oleh instrumen

spektofotometri untuk mengetahui  panjang gelombang (λ) yang nantinya akan

digunakan dalam pemeriksaan sampel..Setelah itu lalu masuk ke dalam perlakuan

sampel darah yang akan digunakan dalam pemeriksaan kali ini. Sampel terbaik adalah

serum (berasal dari yang tidak hemolisis). Sama seperti pada blanko sampel juga

didiamkan 10 menit agar terjadinya reaksi yang optimal minimal pada suhu ruangan

(15-25 oC). Sampel dibaca pada spektrofotometri pada gelombang visible λ=500nm

dan menghasilkan absorbansi.

F. MONOGRAFI

1. Phosphate Buffer

Rumus Molekul : H4NaO5P

Berat Molekul : 137,992291

Densitas : 2,04 g/cm3

Sensitive : Higroskopis

Stabilitas : stabil dibawah kondisi normal (Msds, 2011).

2. Phenol

Fenol (C6H5OH), mengandung tidak kurang dari 99,0 %. Pemerian hablur bentuk

jarum atau massa hablur : tidak bewarna atau merah jambu; bau khas; kaustik.

Kelarutan larut dalam 12 bagian air; mudah larut dalam etanol, kloroform, eter,

gliserol, dan minyak lemak. Penyimpanan dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari

cahaya, ditempat sejuk. Khasiat dan penggunaan antiseptikum-ekstern (Anonim,

1979).

3. 4-aminoantypirine

Rumus Molekul : C11H13N3O

Berat Molekul : 203,24

Titik Leleh : 105-110o C

Titik Didih : 340o C

Densitas : 0,8 g/cm3

Kelarutan : larut dalam air

Sensitive : Higroskopis

Stabilitas : Stabil dibawah kondisi normal

Inkompatibilitas : agen oksidasi kuat, asam kuat (Msds, 2005).

4. Glucose Oxidase

Reagent ini digunakan untuk diagnosa in vitro penentuan kuantitatif glukosa dalam

serum, plasma atau urin manusia. Penyimpanan di tempat yang dingin dan terhindar

dari sinar matahari secara langsung, jangan disimpan dengan asam mineral kuat,

tembaga, mercuri, perak dan agen oksidasi. Reagent yang sudah dibuka stabil jika

disimpan pada suhu 2-8o C. Pemerian serbuk putih tanpa rasa, tidak larut dalam air,

pH 7,1 ± 0,1. Stabil dibawah kondisi normal yang digunakan. Inkompatibilitas dengan

asam mineral kuat (sulfur, nitrat dan hidrocloric) (Msds, 2009).

5. Peroxidase

Warna serbuk coklat-kemerahan atau merah muda gelap, larut dalam air.

Penyimpanan pada suhu -20o C, jangan disimpan dengan bahan yang inkompatibel.

Hindari kontak dengan mata, kulit, dan inhalasi (Msds, 2008).

6. Glukosa

Glukosa mengandung tidak kurang dari 99,0 % dan tidak lebih dari 101,5 %

C6H12O6 dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian, hablur tidak

berwarna, serbuk, hablur atau butiran putih; tidak berbau; rasa manis. Kelarutan,

mudah larut dalam air; sangat mudah larut dalam air mendidih; agak sukar larut dalam

etanol (95 %) P mendidih; sukar larut dalam etanol (95 %) P. Penyimpanan dalam

wadah tertutup baik. Khasiat dan penggunaan, kalorigenikum (Anonim, 1979).

G. Hasil vs pustaka

Pada proses pengambilan larutan, yaitu aquadest, reagen, dan sampel

dilakukan dengan menggunakan mikropipet (pipet piston). Hal ini dikarenakan jumlah

larutan yang diambil sangat sedikit yaitu 20 μL. Sebelum pipet piston digunakan,

bagian atas pipet yang disebut thumb knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk

memastikan lancarnya mikropipet. Setelah itu tip bersih dimasukkan ke dalam nozzle /

ujung pipet piston sampai pas (tidak jatuh). Thumb knob ditekan sampai hambatan

pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke dalam lagi karena cairan yang terambil

akan lebih besar daripada jumlah yang sebenarnya. Setelah itu, tip dimasukkan ke

dalam cairan sedalam 3-4 mm karena jika kurang dari nilai tersebut dikhawatirkan

cairan tidak terambil sempurna (ada gelembung udara yang terambil), sedangkan jika

lebih dari nilai tersebut dikhawatirkan terdapat kontaminan dari tip pipet. Selanjutnya

pipet ditahan dalam posisi standard kemudian tekanan dari thumb knob dilepaskan

sehingga cairan masuk ke tip. Ujung tip dipindahkan ke dalam kuvet. Untuk

mengeluarkan cairannya, thumb knob ditekan sampai hambatan kedua / second stop

atau ditekan semaksimal mungkin sehingga semua cairan keluar dari ujung tip. Pipet

piston digunakan dalam percobaan ini karena memiliki ketelitian, sensitivitas, dan

spesifisitas yang tinggi bila dibandingkan dengan pipet gelas. Pada kuvet blanko,

setelah dimasukkan aquadest dan larutan reagent, kuvet digoyang agar larutan

tercampur secara sempurna. Setelah itu kuvet diinkubasikan pada suhu ruang yaitu

27oC selama 10 menit. Proses inkubasi ini bertujuan memberikan waktu untuk

terjadinya reaksi antara kedua larutan dalam campuran tersebut. Inkubasi ini juga

dilakukan untuk kuvet standard an kuvet sampel. Pengukuran blanko perlu dilakukan

karena dikhawatirkan terjadi perubahan reagen pada saat inkubasi dan memberikan

serapan pada panjang gelombang pengukuran. Saat proses inkubasi, terjadi reaksi

antara reagen dengan kolesterol yang terdapat pada larutan tandard an sampel. Setelah

diinkubasi, kedua larutan yang tadinya berwarna bening dalam masing-masing kuvet

berubah menjadi warna merah rosa. Warna merah tersebut menandakan telah

terjadinya reaksi antara enzim dengan kolesterol. Warna merah tersebut berasal dari

senyawa quinoneimine, yang merupakan hasil reaksi antara reagen dan kolesterol

(Day,2002).

Reaksi yang terjadi yaitu sebagai berikut:

(Wirahadikusumah,1985).

Hydrogen peroksida + 4-aminoantipyrene + fenol quinonimine(merah)

+ 4H2O

(Wirahadikusumah,1985).

Perubahan warna (menjadi berwarna merah) diperlukan agar campuran larutan

dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis,

khususnya dengan sinar visibel. Quinoeimine akan terukur absorbansinya pada

panjang gelombang 498 nm dan nilai absorbansi tersebut sebanding dengan kadar

kolesterol dalam darah. Setelah inkubasi selesai, masing-masing larutan blanko,

standard dan sampel diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Pengukuran

dilakukan pada panjang gelombang 498 nm yang merupakan panjang gelombang

maksimum untuk quinoeimine. Untuk larutan sampel, pengukuran dilakukan

sebanyak empat kali agar kesalahan pada saat pengukuran dapat dihindari sehingga

hasilnya lebih akurat. Ketiga hasil yang didapat dirata-ratakan dan dihitung kadar

kolesterol dalam sampel (Nilawati,2008).

Absorbansi yang diperoleh pada saat pengukuran larutan sampel adalah

0,612 ; 0,061 dan 0,332. Sedangkan absorbansi larutan standar 200mg/dl adalah

0,214. Nilai dari kedua absorbansi tersebut dapat digunakan untuk menghitung kadar

kolesterol dalam sampel dengan menggunakan rumus :

(Nilawati,2008).

KESIMPULAN

Kolesterol adalah suatu zat lemak yang beredar di dalam darah, diproduksi oleh

hati dan sangat diperlukan oleh tubuh. Hasil praktikum ini didapatkan rata-rata kadar

kolesterolnya dalam darah yaitu 313,084 ± 257,488 Dari data tersebut diketahui

bahwa sampel darah manusia yang digunakan dalam percobaan memiliki nilai yang

lebih dari rentang daerah batas normal.

DAFTAR PUSTAKA

.

Anonim. 1979. Farmakope Indonesia Edisi Ketiga. Depkes RI. Jakarta.

Day, R. A. and A. L. Underwood, 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Penerbit Erlangga,

Jakarta.

Msds.2005. Material Safety Data Sheet, 4-aminoantypirine. http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927068 diakses tanggal 27 Mei 2013.

Msds. 2008. Material Safety Data Sheet, Peroxidase Ex. Horseradish. http://www.setonresourcecenter.com/msdshazcom/htdocs//MSDS/G/genzyme/Peroxidase-RZ%202.0.pdf diakses tanggal 27 Mei 2013.

Msds. 2009. Material Safety Data Sheet, Glucose Oxidase HP S100. http://www.setonresourcecenter.com/msdshazcom/htdocs/MSDS/G/genzyme/Glucose%20Oxidase%20HP%20S100.pdf diakses tanggal 27 Mei 2013.

Msds. 2011. Material Safety Data Sheet, Phosphate Buffer. http://www.cellsignal.com/support/msds/9872_pbs1x_MSDS.pdf diakses tanggal 27 Mei 2013.

Nilawati, S., Krisnatuti, D., Mahendra, B., Djing, OG., 2008, Care Yourself Kolesterol, Penebar Plus, Jakarta.

Wirahadikusumah. 1985, Metabolisme Energi, Karbohidrat & Lipid, ITB Press, Bandung. .