ชอวชา : Analysis II เรอง : Solvents for HPLC วน เดอน ป ทเรยน : เวลาเรยน : อาจารยผสอน : อ.จนดา หวงบญสกล แกะโดย : ชะเอม พรฟโดย :ยยเหยน ฟนสวย55

Solvent for HPLC

อธบายเปนรปสามเหลยมพระมดโดยมนจะบอกวา

solvent ทงหมดเนยมนมเยอะนะ แตsolvent ทม

คณสมบตเหมะสม หรอมคาk’ ทดเนยกมนอยลง

มาอก สามเหลยมบนสดเลกๆคอ ม selectivity

เหมาะสมสด

Physical properties: คณสมบตทเหมาะสมของ mobile phase

ตองเขากนไดกบ detector

ตองมความบรสทธเพยงพอ

มจดเดอดและความหนดทเหมาะสม

ไมทาปฏกรยากบสารอนๆงาย ตองคอนขาง inert

หาซอไดงาย

ปลอดภยในการใชงาน

เขากนไดกบสารอนๆ โดยเฉพาะเมอใช reverse phase >>Solvent ทใชตองมขว จะไดเขากบน าได

ละลาย sample ได

มราคาเหมาะสม

Solvent Polarity Chart (อนนเหมอนของ column packing นะ>>อภนนทนาการโดย

ยยเหยน แตงกวเดอออเหยน ฟนใหญ แตนารากกก)

เปนการอธบาย Elution Strength อธบายความแรงของ Solvent นเปน Solvent ทเราใชใน

chromatography (ซงสามารถใชไดทง GC และ HPLC)

กรณแรก ex. C18 column (non-polar) ม MP

เปนน า (polar) เลอกเอา organic solvent พวกนมาผสมกบน า เพอปรบความแรง จะเหนลกศรไปทางซาย

แสดงวาเมอผสมกบน าจะมความแรงมากทสด

เชน ถาม MP เปน *50% methanol ในน า กบ *50% Acetonitrile ในน า MP 2 อนนอนไหนจะ

ออกมาไดเรวทสด คอ 50% Acetonitrile เพราะม Solvent strength สงกวา

กรณทสอง ใน HPLC ใชนอยมาก ทใชมากคอ

TLC หรอ Classical column จะเหนลกศรไปทางขวา ถาใช *50% Carbon tertrachloride ใน hexane

กบ *50% Methylene chloride ใน hexane ตวไหนจะพาสารออกมาไดเรวทสด คอ 50% Methylene chloride

เนองจาก Normal phase column เปน polar MP เปน non-polar เปนไปตาม like dissolves like

Reverse Phase Solvent Elution Strength

Strength

*

*

Normal Phase Solvent Elution Strength

*

*

Solvent กตวทจะใชกบ Reverse Phase ได ตวทจะใชกบ Reverse Phase ตองผสมเปนเนอเดยวกน

กบน าได ถามนแยกชนกบน าจะใชงานไมได

ถา C18 MP อาจจะเปน methanol 100% แตถาเราใช hexane ผานเขาไปใน column C18 จะเกดไรขน

คาตอบคอ hexane จะชะเอา C18 ออกมาหมดเลย

Isopropanol เปนตวทแรงทสด เราจะใชเมอเราจะทง column หรอจะลางซงตองใชในเวลาแปปเดยว

นะ บางคนอาจจะใช Alcohol ,Ethanol กไดแตปญหาคอ Alcohol ใน Ethanol มนมความหนดเยอะ จะม

ความดนเยอะดวย

ดงนนตวทนยมใชคอ Methanol และ Acetonitrile อาจารยบอกวาบางครงอาจารยจะใช

Tetrahydrofuran (THF) เพราะเปน miracle จะหยดลงไปนดเดยว เพอชวยเพมการแยก แตถาใชมากกจะไม

คงตว

Solvent strength and polarity

Polarity of pure solvents>>การหา polarity ของ solvents กรณใช column เปน normal phase

อยางเชนวา ถา column ทใชเปน silica เรมตนใช MP1 เปน Haxane แลวถดมาครงทสองใช MP2 เปน

Carbon tetrachloride เราจะดวาการใช solvent 2 ตวนม retention time ตางกนกเทา

สตรในการคานวณคอ

K1,K2 = คา Solvent strength (k’) ของ Solvent ท 1 และ 2

P1 , P2 = คา Parameter (P’) ของ Solvent ท 1 และ 2 เปนคาทใชวด Polarity ของ Solvent ไดจากการทดลอง

นะคานอะ!!

K2/K1 = 10(P1-P2)/2

Solvent Mixture

P’ = ØaPa + ØbPb

Øa , Øb = volume fractions ของ solvent A และ B

Pa , Pb = Polarity ของ pure solvent

เชน ถาเปลยนจาก 30% v ไปเปน 40 % v MeOH/H2O

โดย MeOH จะมคา Parameter คอ 5.1

H2O มคา Parameter คอ 10.2

คา P’ จะเปลยนไปประมาณ 0.5

คา k’ จะเปลยนไปประมาณ 1.7 เทา>> สมพนธกบ retention time เปลยนไป 1.7 เทาเชนกน

เมอมการคานวณแบบนเนยจะทาใหไมเสยเวลาในการทาหลายรอบ ไมเปลอง Solvent ดวย มนทาใหเราพอ

รไดวา หากตองการให MP ออกมาเรวหรอชากวาเกากเทา เราจะไดรเลยวาควรเปลยนมาใช solvent ท

เขมขนก % จงจะพอด

Solvent selectivity >> อนนจะเปลยน Solvent ไปเลย แตเมอกแคเปลยนความแรงนะ

เชน การใช MP เปน 25% CHCl3/hexane >>> อาจให retention time เหมาะสม แตแยกสารไมได

เลยตองการเปลยนไปใช ethyl ether/hexane แทน โดยเราจะคานวณวา ถาอยากได 25% CHCl3/hexane

จะตองใส ethyl ether/hexane ไปก % จงจะม polarity เทากน โดยถามนเทากนเนย Peak ทไดจะออกมา

ใกลเคยงกนนะ

P’ ของ CHCl3 = 4.4 (Pb)

P’ ของ ethyl ether = 2.9 (Pc)

Øb เปน volume fraction ของ CHCl3 มคา 0.25

ดงนน เพอนๆกแทนคาลงไปในสตรเลยนะ

Øc = 0.25(4.4/2.9)

= 38% v ethyl ether/hexane

Øc = Øb(Pb/Pc)

Classification of solvent selectivity การแบง solvent ออกเปนหมวดหม รปเปน triangle

แตอาจารยวาเปนสเหลยมคางหม ==” แบง solvent ออกเปน 8 กลม solvent ทอยในกลม

เดยวกนกจะมคณสมบตทางกายภาพ ทางเคมใกลเคยง

กน มคณสมบตตางๆคลายๆกน เชน ใช solvent เปน

methanol แลวลองเลอกเปลยน methyl ether เนยไม

ควรทานะ ไมคอยดหรอก เพราะมนอยในกลม

เดยวกน เราควรเปลยนไปใช solvent กลมอนทอย

ไกลๆกนเลย จะไดมความแตกตางกนมากๆ

**คณพระ!!! แตจากรปดไมออกเลย อะไรอยกลมไหน สงสยคงแคใหรหลกการเฉยๆ

ตวอยาง normal phase เปน silica เรมตนใช 20% CHCl3 in hexane ให k’ เหมาะสม แต Resolution ไมด

เรมตนคานวณ Polarity จาก P’ = ØaPa + ØbPb

P’ = (0.8)(0.0)+(0.2)(4.4) = 0.9

>>ตองการเปลยน MP ใหม Selectivity เพมขน วธการเลอก คอ เลอก solvent ใหอยคนละกลมกบ CHCl3

ตองเลอกกลมทอยไกลๆกนดวยนะ คณสมบตจะไดตางกนมากกจะให selectivity มาก ในทน CHCl3 อย

กลม 8 ควรเลอกใช solvent ใหม ใหอยในกลม 1 หรอกลม 5

งนสมมตวาจะเลอกใช methylene chloride(กลม 5) เรากตองมาคานวณ % ทจะใชดงน

กาหนดคาทใชแทนคาตางๆดงน

Pa คอ polarity ของ hexane กาหนดใหเทากบ 0.0

Pb คอ polarity ของ CHCl3 = 4.4

Pc คอ polarity ของ CH2Cl2 = 3,4

Øb คอ volume fraction ของ CHCl3 ทเทากบ 0.2 เพราะมาจาก 20/100>>20% จากโจทยไง

Øa คอ volume fraction ของ hexane เทากบ 0.8 กอกอนมน 20% ไง อนนกเลย 80% (เขา

ใจเนอะ??)

Øc = Øb(Pb/Pc)

Øc = 0.2(4.4/3.4)

= 26% CH2Cl2 in hexane

เพราะฉะนนแสดงวา 26% CH2Cl2 in hexane ตองม polarity เทากบ 20% CHCl3 in hexane วดออกมาสอง

ตวนจะได peak ท retention time เทากน

Solvent selectivity in Reverse phase (สไลดนเคากองงคกกกก เหมอนกนเพอนๆ ฟงสามรอบกอ

บเขาใจ สดความสามารถแรว อยาวากนนาTT)

Column เปน reverse phase เชน C18 (นยมใชกนเยอะนะอนน )

MP ประกอบดวยน า เปนตวกาหนด Solvent strength(k’)และ organic modifier เชน MeOH , CAN

คดยงไงมากไมร ไดสตมาอก Øc = Øb(Pw-Pb/Pw-Pc)

Øc = Øb(Sb/Sc)*** เราคดวาจาสตรนนะ เพราะเดยวมการคานวณในหนาถดไป

Pw คอ Polarity ของน า

S คอ Solvent strength ของ reverse phase

ดานลางคอพระมดของสารผสม ถาอาจารยใหพฒนาวธวเคราะห สมมตมยาใหม แตยงไมปรากฏในเภสช

ตารบ ใหหาวธวเคราะหยาน จะเรมตนทายงไง?

เรมแรกใหเอาน าผสมกบ 50%MeOH ลองฉดไปกอนดวา peak ออกมาเปนไง อยท Solvent front มย Peak

สวยงามมย หรอเปนกอน ทเรมตนดวยเมทานอลเพราะถกกวา ACN หลงจากนนถา Peak ยงไมสวยกใหลอง

ปรบ %MeoH ดวาม retention time เหมาะสมทประมาณไหน หลงจากนนกลองไปคานวณดวา ถาใชน ากบ

ACN จะใช ACN ก %(ACN selectivity ดกวา) Peak จงจะออกมาสวย ได retention time ทเหมาะสม

Solvent strength (reverse-phase LC) >> 8 ตวนนยมใชกนมากนะ คดวาจาๆไปบางกด

ในวงเลบคอคา S

Water (0.0) dioxane(3.5) MeOH(3.0) ethanol(3.6)

Acetonitrile(3.1) I-propanol(4.2) Acetone(3.4) tetrahydrofuran(4.4)

ตวอยาง ถาเรมแรกใช 50% MeOH/H2O หากตองการเปลยนเปน Tetrahydrofuran/H2O จะใชก %

Øc = Øb(Sb/Sc)

Øc = 0.5(3.0/4.4) = 34% THF/H2O

สงทเราจ าเปนตองค านงถงในการเลอก Solvent ส าหรบใชเปน MP Grade ของ Solvent

Solvent cut off point

ควรเลอกใช Solvent ทมความหนดตา และระเหยยาก ถา Solvent ระเหยงาย และ bpตา การทาแต

ละครงเนยจะเหลอปรมาณ MP ทไดไมเทากน

Solventทใชตองปลอดภยตอเราและสงแวดลอม

ราคาไมแพงมาก

หาซอไดงาย

ถาเอามาใชในงานวเคราะห ไมควรใช Solvent ท recycle ได