МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ТУРКЕВИЧ МАРТА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК: 611.77-018.2:547.962]:[616-089.843:615.46]

ЕФЕКТИВНІСТЬ КОЛАГЕНОГЕНЕЗУ ШКІРИ ПРИ ВВЕДЕННІ

ІМПЛАНТАТІВ РІЗНОЇ ПРИРОДИ

(експериментально-патоморфологічне дослідження)

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2019

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професорПоспішіль Юрій Олексійович,Львівський національний медичний університетімені Данила Галицького МОЗ України,завідувач кафедри патологічної анатомії та судової медицини.

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Губіна-Вакулік Галина Іванівна,Харківський національний медичний університет МОЗ України,професор кафедри патологічної анатомії;

- доктор медичних наук, професор Гичка Сергій Григорович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України,завідувач кафедри патологічної анатомії №2,

Захист відбудеться «_24_» _квітня_ 2019 р. об _13 30 _ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському національному медичному університеті за адресою: 61022, м. Харків, пр. Науки, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського національного медичного університету за адресою: 61022, м. Харків, пр. Науки, 4.

Автореферат розісланий «____» ______________ 2019 р.

Вчений секретарспеціалізованої вченої ради,кандидат медичних наук, доцент О.М. Плітень

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протягом останніх 10 років стрімко розвивається така галузь медицини як естетична дерматологія. Одним із ключових завдань останньої є нівелювання візуальних та структурних змін в шкірі внаслідок процесів старіння. Зміни, що відбуваються у шкірі з віком, виникають внаслідок незворотнього генетично запрограмованого процесу. Старіння шкіри, обумовлене внутрішніми факторами, супроводжується різними гістологічними змінами у всіх її шарах, включаючи сплощення межі між епідермісом і дермою, зникнення сосочків дерми, зниження популяції меланоцитів і клітин Ланґерґанса в епідермісі, атрофію дерми, зниження кількості фібробластів, опасистих клітин, судин в шкірі, виснаження, фрагментація та зникнення еластичних волокон. Внутрішні чинники старіння призводять до функціональних змін шкіри: зменшення вироблення колагену I і III типів, зниження швидкості регенерації епідермісу і активності меланоцитів, збільшення ризику пошкодження шкіри, зниження здатності підтримки температури тіла (Виноградова Е.В., 1978; Деев А., 2007; Saladin S., Kenneth, 2010). У результаті цих змін шкіра втрачає еластичність і утворюються глибокі зморшки (Гарсия-Антон Х., 2006; Деев А., 2007; Коргунова Р.В., 2006; Кочергин Н.Г., 2007; Малышев В.В. и соавт., 2008; Скулачев В.П., 2013; Шишанова Н.Л., 2005; Florez Mendez M., 2008; McKee P.H. et al., 2005).

Такі зміни при старінні зумовлені перш за все поступовим руйнуванням колагену і еластину, що призводить до зменшення кількості міжклітинного матриксу, збіднення клітинного складу, запустіння мікроциркуляторного русла, зменшення міцності і еластичності дерми. Оскільки колагенові волокна є основним каркасним елементом дерми, зміни, що відбуваються з ними, вимагають детальнішого вивчення. Перспектива глибокого аналізу і розуміння процесів стимуляції колагеногенезу та біодеградації може мати суттєвий вплив на розробку нових методів вікової і лікувальної корекції, а також дозволить переглянути вже існуючі тактики на предмет їх раціональності та ефективності.

Колаген неоднорідний за своєю структурою і походженням. На даний час описано 20 його типів, що відрізняються за амінокислотною послідовністю і ступенем модифікації. Фібрилярний колаген – до нього відносять колаген I, III і V типів – це основна маса колагену в шкірі, що представляє собою волокна, сплетені з пучків фібрил.

95% всього колагену в дермі людини складають колаген I і III типів, які утворюють дуже міцні фібрили: приблизно 80–90% складає колаген I типу (V тип колагену морфологічно представляє собою гетеротипні фібрили колагену I типу) і 8–12% колаген III типу. Причому, колаген I типу – основний «дорослий» і «сильний» колаген, а колаген III типу – це колаген дерми ембріона, тобто дуже молодий колаген. Колаген V типу об'єднаний в фібрили з колагеном першого і третього типів, і бере участь в регуляції діаметра фібрил. Таким чином, саме колаген I і III типів є визначальним у забезпеченні тургору шкіри і зберіганні її основних властивостей (Батечко С.А. и соавт., 2007; Ермакова Е.Ю., 2005; Мацкевичус И.К., 1987).

Більшість методів, які використовуються в естетичній дерматології є

1

інвазивними, тобто передбачають травмування шкіри та підшкірної жирової клітковини. Серед малоінвазивних методів в естетичній дерматології широко використовуються різні за хімічним складом і морфологічною структурою імплантаційні нитки, як ті що резорбуються, так і перманентні (Каджая А. и соавт., 2012; Колмакова Е.Ф., 2006; Орасмяе Т., 2011; Суламанидзе М. и соавт., 2011; Суламанидзе М.А. и соавт., 2005; Юдін М.А., 2012; Fu X. et al., 2009).

Дані малоінвазивні втручання проводяться з метою репозиції тканин обличчя та розгладження зморшок. В основі методу їх імплантації лежить процес інтервенційного пошкодження глибоких шарів дерми з метою стимуляції запальних процесів, та, в подальшому, утворення надлишкового колагенового компонента навколо місця імплантації шовного матеріалу. Сам же нитковий імплантат за рахунок рельєфності поверхневої структури утворює додатковий фіксуючий каркасний компонент, що до моменту біодеградації виконує функцію ліфтингу.

Більшість виробників таких ниток декларують, що їхні імплантати викликають стимуляцію утворення колагену, тим самим «зупиняючи» процес старіння, хоча достовірних описаних в літературі даних, які б підтверджували ці положення, на сьогодні немає. Залишається на сьогодні також не вивченим, який саме тип колагену при цьому утворюється, які зміни колагеногенезу виникають безпосередньо після імплантації ниток і у віддаленому періоді, яка тривалість резорбції цих імплантатів, які інші морфологічні зміни (альтеративні, запальні, регенеративні, проліферативні) супроводжують колагеногенез на різних хронологічних етапах.

Таким чином, проведення морфологічного дослідження з вивчення кількісного та якісного складу колагену I і III типів, як основних типів колагену шкіри, в ділянках імплантації на різних хронологічних етапах дозволить отримати достовірні дані щодо стимуляції колагеногенезу, термінів резорбції імплантатів та інших морфологічних змін в місцях імплантації та прилеглих зонах при використанні агресивних методів косметичної дерматології, а саме імплантаційних ниток (як ниток, що резорбуються, так і перманентних). Це може дати об’єктивне обгрунтування доцільності застосування тих чи інших імплантатів різних за морфологічною структурою і хімічним складом з метою стимуляції колагеногенезу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проведена в рамках планової наукової теми кафедри дерматології, венерології Львівського національного медичного університету (ЛНМУ) імені Данила Галицького «Розробка прогностичних і діагностичних критеріїв, створення експериментальних моделей, вдосконалення лікування порушень метаболічних процесів при деяких хворобах внутрішніх органів та шкіри» (державний реєстраційний номер 0116U4004506; термін виконання: 2015–2018 роки). Дисертант є співвиконавцем зазначеної науково-дослідної роботи. Тема дисертації затверджена вченою радою медичного факультету №2 ЛНМУ (протокол №7 від 17.02.2016 р.).

Мета дослідження: встановити критерії ефективності колагеногенезу на підставі вивчення патоморфологічних змін у шкірі при експериментальному введенні перманентних імплантатів та імплантатів, що резорбуються, для оптимізації їх застосування в естетичній дерматології.

Завдання дослідження:

2

1. Дослідити в динаміці колагеногенез в ділянці ниткових імплантів.2. Встановити зв'язок між типом ниткових імплантатів та інтенсивністю

колагеногенезу.3. Визначити динаміку та терміни деградації резорбуючих імплантатів у шкірі

в експерименті.4. Виявити морфологічні зміни, що супроводжують колагеногенез на різних

хронологічних етапах в експерименті.5. На підставі проведення імуногістохімічних досліджень встановити якісний

склад колагену в периімплантних ділянках.6. Провести порівняльний аналіз експериментального дослідження

застосування імплантатів та встановити критерії ефективності колагеногенезу.Об’єкт дослідження – зміни в шкірі при експериментальному введенні

імплантатів.Предмет дослідження – колагеногенез та інші патоморфологічні зміни у шкірі

при експериментальному введенні перманентних імплантатів та імплантатів, що резорбуються.

Методи дослідження. При виконанні роботи були використані такі методи дослідження, як моделювання запальних та регенераторних процесів у шкірі білих щурів-самців при введенні косметичного шовного матеріалу з використанням гістологічних, гістохімічних, імуногістохімічних, морфометричних методик та статистичний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. За допомогою комплексу морфологічних (гістологічних, гістохімічних, імуногістохімічних), морфометричних методів дослідження та статистичного аналізу вперше виділено, описано та проведено зіставлення особливостей колагеногенезу в периімплантних ділянках в динаміці. На підставі проведених досліджень на 310 піддослідних білих щурах, яким були імплантовані 5 типів косметичних ниток різного хімічного складу і різної структури, що широко застосовуються в сучасній естетичній дерматології, було проаналізовано та вперше доведено, що при різних типах імплантатів спостерігалась різна інтенсивність колагеногенезу навколо місця «ушкодження» та утворення грануляційної і сполучної тканини. Вперше встановлено якісний склад колагену, що утворився та, відповідно, час його біодеградації. Уперше встановлено факт, що на інтенсивність колагеногенезу впливає як хімічний склад імплантата, зокрема наявність в ньому полімолочної кислоти, так і його структура (нитки з насічками та нитки-пружинки). Констатовано і науково обгрунтовано взаємозв’язок між регенераторними та запальними змінами в шкірі при використанні різних типів імплантатів. Уперше проведено порівняльний аналіз застосування імплантатів в експерименті та вперше встановлено критерії ефективності колагеногенезу.

Практичне значення одержаних результатів. Результати даної роботи можуть знайти широке застосування в естетичній дерматології та оптимізувати підхід практичних лікарів щодо використання різних видів імплантатів. Вони дозволяють підвищити як якість естетичної корекції, так і, в певній мірі, селекціонувати та оптимізувати окремі види резорбуючих та перманентних імплантатів у зв’язку з більшою їх ефективністю в процесі стимуляції колагеногенезу.

3

Матеріали дисертації впроваджені і використовуються в навчальному процесі кафедри патологічної анатомії та кафедри анатомії людини імені М.Г. Туркевича ВДНЗУ «Буковинський державний медичний університет»; кафедри гістології, цитології та ембріології ДВНЗ «Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського МОЗ України», кафедри клінічної анатомії та оперативної хірургії Вищого державного навчального закладу України «Українська медична стоматологічна академія»; кафедри патологічної анатомії і судової медицини Запорізького державного медичного університету МОЗ України; кафедри патологічної анатомії та судової медицини ЛНМУ імені Данила Галицького; у практичну діяльність КЗ ЛОР «Львівське обласне патологоанатомічне бюро» і КУ ЗОР «Запорізьке обласне патологоанатомічне бюро».

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійно виконаним дослідженням автора. Разом з науковим керівником сформульована ідея і тема дисертації, та визначена мета дослідження. Дисертант особисто сформулювала завдання роботи, налагодила методики дослідження, провела аналіз літературних даних за темою дисертації, здійснила патентно-інформаційний пошук та статистичний аналіз отриманих результатів. Самостійно відтворено експеримент, здійснено забір матеріалу для дослідження та проведені патогістологічні, гістохімічні та імуногістохімічні дослідження. Автором проведений аналіз отриманих даних, написані всі розділи дисертації та автореферат, сформульовані висновки дисертації і підготовані матеріали для впровадження отриманих результатів. У наукових роботах, надрукованих у співавторстві, автору належить фактичний матеріал і участь дисертанта є визначальною. Права співавторів публікацій порушені не були, конфлікти інтересів відсутні. Матеріали даної роботи не були використані в інших дисертаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи оприлюднені на науково-практичних конференціях: «Актуальні проблеми сучасної патоморфології та патофізіології» (Запоріжжя, 28–29 травня 2015); «Uzhhorod Medical Students’ Conference» (Ужгород, 20–23 квітня 2016); «Теорія та практика сучасної морфології» (Дніпро, 5–7 жовтня 2016); «Актуальні проблеми сучасної патологічної анатомії» (Київ, 26–27 квітня 2017); Загальноуніверситетська наукова конференція студентів та молодих вчених (Львів, 25–27 квітня 2018); Х конгрес Асоціації патологів України «Перспективи розвитку сучасної патології» (Яремче, 27–28 вересня 2018).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 11 наукових працях, у тому числі у 6 статтях, 4 з яких – у фахових виданнях України, усі включені до міжнародних наукометричних баз, 2 – у іноземних виданнях (США, Німеччина); 5 робіт оприлюднені в матеріалах науково-практичних конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 215 сторінках машинописного тексту (основний текст роботи становить 159 сторінок) і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел та додатків. Список джерел літератури включає 144 праці, з них 96 – кирилицею та 48 – латиною. Робота ілюстрована 90 рисунками і 14 таблицями.

4

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Експериментальне дослідження було проведене на 310 білих щурах-самцях, віком 2–2,5 міс., масою 100–130 г.

Експериментальні тварини загальною кількістю 310 особин, яких утримували згідно зі стандартними санітарними нормами в умовах віварію ЛНМУ імені Данила Галицького. Під час роботи з тваринами керувались «Загальними етичними принципами експериментів на тваринах» (Україна, 2001), узгодженими з вимогами «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, 1986), Законом України № 3447–IV від 21.02.2006 «Про захист тварин від жорстокого поводження», Гельсінською декларацією про гуманне ставлення до тварин. Матеріали науково-дослідної роботи розглянуто членами комісії з питань біоетики ЛНМУ імені Данила Галицького, протокол засідання №1 від 31 січня 2018 р.

Із метою виключення впливу на результат експерименту добового та сезонного ритму біологічної активності, досліди проводили в осінній період, завжди в ранковий час. Для дослідження були відібрані лише здорові щури.

Об’єктом дослідження була шкіра щурів з ділянки спини для унеможливлення деімплантації шовного матеріалу щуром.

Піддослідних тварин розподіляли на 5 груп в залежності від типу імплантату по 60 особин у кожній.

Експериментальні тварини кожної з цих 5 груп розподілено на 6 хронологічних підгруп по 10 щурів у кожній, в яких вивчались морфологічні зміни в шкірі у місці введення імплантатів на 14-й день з моменту втручання (перша підгрупа), на 30-й день (друга підгрупа), на 90-й день (третя підгрупа), на 180-й день (четверта підгрупа), на 365-й день (п’ята підгрупа) та 540-й день (шоста підгрупа). Окрему контрольну групу становили 10 щурів, яким проводилась імплантація такого ж шовного матеріалу з подальшим його видаленням одразу після маніпуляції. Для роботи були використані імплантати виробництва Aptos, а саме: Excellence Visage (EV), Nano Spring (NS), Aptos Spring (AS), Light Lift Thread (LLT) та Light Lift Spring (LLS).

Досліджуваний матеріал (шкіра) забирали після евтаназії тварин шляхом передозування діетилового ефірного наркозу.

Фіксацію матеріалу здійснювали у 10% забуференому розчині формаліну протягом 24 годин. Матеріал заливали у парафінові блоки касетного типу, з яких на ротаційному мікротомі Leica RM 2235 виготовляли зрізи товщиною 5–7 мкм.

Гістологічні зрізи фарбували гематоксиліном та еозином і згідно гістохімічної методики за Малорі (для візуалізації і диференціації колагенових та еластичних волокон). Для інтерпретації даних використовували напівкількісний метод визначення інтенсивності запальноклітинної інфільтрації, кількості колагенових волокон та ангіогенезу за сумою трьох плюсів: незначна – (+), помірна – (++), інтенсивна – (+++). Оцінювання проводилось при оптичному збільшенні ×100 (табл. 1).

Для визначення типу колагену проводили імуногістохімічне дослідження. В роботі було використано два основних первинних антитіла до колагенів щура: Anti-

5

Collagen I antibody (Abcam, ab34710) та Anti-Collagen III antibody [1E7-D7/Col3 (Abcam, ab23445).

Таблиця 1Критерії оцінки лейкоцитарної інфільтрації, наявності колагенових волокон та

кількості судин в полі зоруІнфільтрація Колагенові волокна Кількість судин у

полі зоруНезначна (+) До 30% поля зору До 30%

від площі дермиДо 10 судину полі зору

Помірна (++) Від 30% до 50% поля зору

Від 30% до 50%від площі дерми

10–20 судину полі зору

Інтенсивна (+++) Понад 50%поля зору

Понад 50%від площі дерми

Більше 20 судину полі зору

Для проведення статистичного дослідження було обрано два основні параметри для кожної ознаки – частота, з якою ознака виникає у групі, та інтенсивність проявів даної ознаки. Показник частоти ознаки відображали у відсотковому співвідношенні тварин, в яких було виявлено ознаку, в порівнянні із загальною кількістю тварин у групі. Показник інтенсивності відображали у вигляді M±m, де М – середнє значення показника суми плюсів, що вираховується тільки серед тварин, у яких наявний цей показник, m – середньоквадратична помилка від М. Для порівняння достовірності різниці між групами по частоті проявів ознаки був обраний хі-критерій Пірсона (2, Pearson’s chi-squared). Для порівняння достовірності за показником інтенсивності проявів ознаки між групами був обраний U критерій Мана-Уіттні. Рівень достовірності встановлено при p<0,05. Для проведення статистичного аналізу було використано програмне забезпечення In Vivo Stat v.3.0 та Sofa Stat v.1.4.6. Для формування бази даних, обрахунку отриманих даних та графічного представлення результатів використовувались електронні таблиці Libre Office Calc v.5.2.2.2 та Microsoft Office Excel 2007.

Для проведення морфометричного дослідження колагену периімплантних ділянок із використанням різних ниткових імплантатів було проведено фотографування імуногістохімічних зразків із використанням світлооптичного мікроскопу Meiji MT 4300 LED з об’єктивом ×10, окуляр ×10. Фотографували камерою Canon EOS 550D з перехідником MA150/50 та адаптером МА986 із збільшенням ×1.9. Калібрування, для проведення морфометрії, проводили за допомогою слайду Meiji MA285 з визначенням коефіцієнту співвідношення пікселя до мікрометра. Усі морфометричні дослідження проводили виключно з первинними, нередагованими фотографіями формату Jpeg роздільною здатністю 5184×3456 з однаковими калібровочними даними для кожного збільшення (співвідношення пікселів до мкм).

Товщину муфти вимірювали за допомогою програми Image J ver.1.48u із використанням інструменту «straightline» при калібруванні 3,06 пікселя на мікрометр на знімках, що були зроблені при встановленому об'єктиві ×10.

Щільність колагену муфти та щільність колагену у навколишніх тканинах

6

вимірювали шляхом конвертації знімків у чорно-білий формат з подальшим отриманням бінарного зображення за допомогою функції «threshold» програми Image J із встановленим порогом гістограми 150 (поріг був визначений експериментально, шляхом підбору з отриманням оптимального показника для виділення забарвлених ділянок).

Результати обрахунку в програмі Image J отримували у вигляді електронної таблиці у форматі csv з подальшим конвертуванням у файли формату xls.

Для визначення нормальності розподілу отриманих нами даних використовували аналіз гістограми розподілу, «ящики з вусами», показники коефіцієнтів асиметрії, ексцесу та, в окремих випадках, критерій Шапіро-Уілка. Для виявлення статистичної достовірності різниці між даними було використано непараметричний критерій H Краскела-Уолліса для трьох та більше незалежних груп із подальшим пост-хок аналізом із використанням тесту Дана (Dunn’s test).

Для аналізу отриманих результатів морфометричного дослідження було використано програмне забезпечення R Studio v. 1.1.442 та RCommander v.2.4-4. Для графічного представлення даних використовувались електронні таблиці Microsoft Excel 2010.

Результати досліджень та їх обговорення. Проведено аналіз результатів патоморфологічних досліджень лоскутів шкіри 310 білих щурів-самців, яким було імплантовано 5 типів косметологічного шовного матеріалу та 10 щурів контрольної групи, яким імплантат було видалено одразу після його введення. Співставлення морфологічних змін проводилось на шести хронологічних етапах: 14 днів, 30 днів, 90 днів, 180 днів, 365 та 540 днів.

Морфологічна картина шкіри 10 щурів контрольної групи на 30-й день відповідала типовій структурі шкіри щура (на відміну від 14-го дня, коли спостерігалась в дермі лімфоцитарна інфільтрація з домішком макрофагів). В дермі диференціюються мультифокальні скупчення потових та сальних залоз, значна кількість волосяних фолікулів. Сосочковий шар дерми фактично відсутній, що відповідає нормальній будові шкіри щура. Основна маса дерми представлена сітчастим шаром, що сформований із грубоволокнистих еозинофільних сполучнотканинних волокон, які формують пучки. Глибше розташований прошарок підшкірної жирової клітковини та поперечно-посмугований м’яз типової гістобудови, під яким розміщується незначна кількість сполучнотканинних волокон та поодинокі дрібні судини.

Дослідженням встановлено, що на 14-й день експерименту запальна інфільтрація в цілому спостерігалась у 100% тварин у серіях AS, LLT, LLS та EV – у зв’язку із травматизацією внаслідок імплантації, водночас у серії NS у 20% тварин інфільтратів не виявлено, що ймовірно було зумовлено порівняно меншим діаметром нитки та гладкістю поверхні. Загальний показник інтенсивності інфільтрації також був максимально виражений у серії LLS – 2,2±0,13, що статистично достовірно в порівнянні із серіями LLT та NS (p<0,05 та p<0,001 відповідно).

Щодо вмісту інфільтратів, то в них серед клітин переважали лімфоцити. У серіях AS, LLT та LLS їх було виявлено у 100% тварин, тоді як у серії NS лімфоцити в інфільтратах мали 80% тварин, а у серії EV – лише 50% тварин (різниця

7

статистично достовірна в порівнянні із серіями AS, LLT та LLS, р<0,01). Для серій AS та LLS також характерною була 100% наявність макрофагів, тоді як у серії NS макрофаги виявлені у 80% тварин, у серії LLT – у 60%, а мінімальне значення цього показника було у серії EV – 50% (статистично достовірна різниця між серіями AS, LLS та LLT, EV, р<0,05). Високий рівень капіляризації ділянки навколо шовного матеріалу спостерігався у серіях LLT, LLS та EV – у 100% тварин, у серії NS – у 80% тварин. У групі, де застосовувались нитки серії AS, капіляри в ділянці дослідження визначались в незначній кількості в усіх тварин (різниця статистично достовірна в порівнянні із усіма групами, р<0,001).

Колагенізація з наявністю ниток колагену була виявлена в 100% тварин усіх груп на 14-й день експерименту. Максимальне середнє значення суми плюсів ступеня колагенізації та кількості ниток колагену виявлено у групі із серією AS – 2,8±0,13 ps та 2,6±0,16 ps відповідно. Другою за цими показниками є група, в якій було використано імплантат LLT із значеннями 2,6±0,16 ps та 2,2±0,13 ps відповідно. Різниця статистично достовірна в порівнянні з показником колагенізації у серіях AS та LLT із серіями LLS та NS (р<0,05).

Встановлено, що на 30-й день експерименту у всіх групах спостерігалися лише прояви локальної інфільтрації в ділянці дослідження, при цьому її інтенсивність та розповсюдженість різко знизились. У серії EV локальна інфільтрація спостерігалась у 80% тварин, у серії NS – 60%, а у серіях LLS та AS – лише у 40% тварин (статистичної достовірності така різниця не мала). В серії LLT у жодної з тварини інфільтрації в ділянці дослідження не виявлено. За середнім значенням суми плюсів максимальний показник був у серії AS – 2,0±0 ps (незважаючи на менший відсоток тварин з інфільтрацією в групі), на другому місці була серія LLS з показником 1,5±0,29 ps.

В усіх тварин із проявами локальної запальної інфільтрації виявлено лімфоцити в ділянці дослідження. Макрофаги у ділянці інфільтрату виявлено лише у трьох групах: у серії NS у 60% тварин, у серіях LLS та AS – у 40% (p<0,05). Еозинофіли в інфільтратах виявлено у серіях AS та LLS у 40% тварин, у серії NS у 20% тварин та EV лише в одному випадку (10%).

Ознаки колагенізації візуалізувались у тварин усіх груп. Однак для цього терміну характерною була поява пучків колагенових волокон у ділянці дослідження. За цим показником лідерами були серії LLT та LLS, в яких у 100% тварин виявлено пучки колагенових волокон. У серії NS у 80% тварин були відмічені пучки, а у 20% лише нитки колагену, тоді як у серії EV таке співвідношення складало 60% на 40%.

На 90-й день дослідження різні показники інфільтрації продовжують знижуватись в усіх групах. У серія EV вогнищева інфільтрація виявлена лише у 20% тварин (у 80% на попередньому терміні), у серії NS – у 40% (у 60% на попередньому терміні). У серіях AS та LLS вогнищева інфільтрація наявна у 40% тварин (статистичної достовірності між групами цей показник не має). Лідером же за показником інтенсивності інфільтрації є серія NS – 1,5±0,29 ps. У серії LLT, як і на попередньому терміні, інфільтрацію не виявлено у жодної з тварин.

У локальному інфільтраті в усіх тварин, в яких його було виявлено, візуалізувались лімфоцити: у серіях NS, AS та LLS у 40% тварин, у серії EV – у 20% тварин. Макрофаги, в усіх випадках із показником в один плюс, виявлено у 40%

8

тварин в групі, де були застосовані нитки NS та у 20% тварин при використанні ниток AS та LLS. Еозинофіли, також із показником в один плюс в усіх випадках, виявлено у 40% тварин у серіях AS та LLS та у 20% тварин у серії NS.

Колагенізація виявлена у 100% тварин усіх груп, у 100% випадків вона супроводжувалась наявністю пучків колагенових волокон. За інтенсивністю формування пучків колагенових волокон переважала серія AS із показником 1,8±0,13 ps (різниця статистично достовірна при порівнянні із всіма групами, р<0,01).

Частка вогнищевої запальної інфільтрації в усіх групах на 180-й день експерименту переважно продовжувала знижуватись. У серіях AS, NS та LLS інфільтрати виявлено у 40% тварин, у серії EV – лише у 10%. В усіх випадках в інфільтратах виявлено лімфоцити. У серіях LLS, NS та EV в усіх тварин з інфільтратами виявлено макрофаги, а у серіях AS та LLS виявлено еозинофіли у 40% та 20% тварин відповідно, показник інтенсивності також мінімальний. Різниця показників між групами статистичного підтвердження не мала.

Колагенізація наявна майже у 100% тварин у всіх групах, окрім серії EV, де її частота становить 90%, різниця статистично достовірна у порівнянні із серіями EV, NS та LLS (р<0,001). Також максимальне значення інтенсивності колагенізації зафіксовано у групі, де застосовувались нитки AS із показником 2,6±0,16 ps. В усіх випадках виявлено пучки колагенових волокон, при цьому, мінімальне середнє значення суми плюсів спостерігалось у серії LLT, а максимальне, як і на попередньому терміні, – у серії AS і становить 1,8±0,13 ps, різниця статистично достовірна в порівнянні зі всіма іншими групами (р<0,05).

Встановлено, що на 365-й день дослідження показники інфільтрації досліджуваної ділянки залишалися майже без змін у всіх групах.

Показники колагенізації в усіх групах тварин не мали суттєвих змін у порівнянні з попереднім терміном спостереження. Відтак, колагенізація у ділянці дослідження була виявлена у 100% тварин.

Показники, що характеризували розвиток судинного русла в ділянці дослідження не мали суттєвої динаміки у порівнянні із попереднім терміном спостереження.

З’ясовано, що на 540-й день експерименту показники інфільтрації продовжують знижуватись в усіх групах тварин. Максимальна кількість локальних інфільтратів була зафіксована у серії AS – у 40% тварин. У серіях EV та LLS виявлено по 20% тварин, в яких наявні інфільтрати в ділянці дослідження, а у групі, в якій використовувались нитки NS, цей показник був лише 10%. В усіх випадках інфільтрати містили лімфоцити в мінімальній кількості.

Колагенізацію, як і на попередніх термінах, виявлено в усіх групах тварин. Інтенсивність її дещо знизилась у порівнянні із попереднім терміном спостереження у більшості груп, однак статистичної достовірності це зниження не мало. У серіях LLS, LLT, EV та NS в 60% випадків виявлено пучки колагенових волокон в ділянці дослідження з мінімальним показником. У серії AS пучки колагенових волокон з мінімальним показником було виявлено в 40% випадків, різниця статистично не достовірна у порівнянні зі всіма іншими групами.

При імуногістохімічному (ІГХ) визначенні ступеня експресії до колагену

9

І типу на 540 – й день експерименту, було встановлено, що різниці між серіями ниток немає. У всіх тварин виражена експресія (три або два плюси), слабка – відсутня (табл. 2). Характер розташування волокон колагену I типу у всіх нитках був концентричним у 100% дослідних тварин.

Експресія колагену III типу на 540 – й день експерименту здебільшого відсутня, а якщо і є – то лише слабка (табл. 3).

При використанні серії ниток LLT та AS у всіх 100% тварин розташування колагену III типу було вогнищевим. Це було достовірно (p<0,01) частіше, ніж при використанні ниток EV, де дана частка становила 0%; та LLS (20,00±12,65%) (табл. 4).

Таблиця 2Ступінь вираженості експресії до колагену I типу на 540 – й день експерименту

LLT AS EV NS LLSСер. кількість плюсів 2,9±0,10 3,0±0,00 3,0±0,00 2,8±0,13 3,0±0,00Частка (+++), % 70,00±9,49 90 100 70,00±12,65 90Частка (++), % 30,00±9,49 10 0 30,00±12,65 10

Таблиця 3Порівняльна характеристика колагену I та III типів на 540 – й день експерименту

LLT AS EV NS LLSколаген 1 типу 2,9±0,10 3,0±0,00 3,0±0,00 2,8±0,13 3,0±0,00колаген 3 типу 1,0±0,00* 1,0±0,00* 0,0±0,00* 0,6±0,16* 0,2±0,13*

Примітка: * – наявна достовірна різниця (p<0,01) порівняно з групою колаген І типу

Таблиця 4Характер розташування волокон колагену III типу на 540 – й день експерименту

LLT AS EV NS LLSЧастка концентрично, % 0 0 0 0 0Частка вогнищево, % 100**# 100**# 0 60,00±15,49* 20,00±12,65Не було взагалі ніякої 0**# 0**# 100 40,00±15,49* 80,00±12,65

Примітка: * – наявна достовірна різниця (p<0,05) порівняно з групою EV;** – наявна достовірна різниця (p<0,01) порівняно з групою EV;# – наявна достовірна різниця (p<0,01) порівняно з групою LLS.

За імуногістохімічно визначеною морфометричною характеристикою колаген І типу муфти у всіх зразках був представлений у вигляді суцільного шару із періодичними його потовщеннями та розшаруванням на 3–12 шарів товщиною 1–3 мкм кожен. Відповідно, максимальна щільність на одиницю площі перерізу була в ділянках із суцільним шаром, мінімальна – в ділянках із розшаруванням. Морфометричному аналізу не підлягав колаген ІІІ типу, оскільки його кількість в навколоімплантних зонах була екстремально малою.

Морфометричне дослідження ІГХ реакції до колагену І типу при використанні

10

серії Nano Spring виявило, що товщина муфти становить 25,99 [18,46; 35,78] мкм, що є середнім показником з поміж досліджених зразків. За щільністю колагену муфти даний матеріал характеризується одним із найбільших значень медіани – 95,67%. Щільність колагену при використанні матеріалу серії NS в ділянках, наближених до муфти, є однією із найбільших серед досліджених зразків і становить 25,33%, при цьому діапазон коливань щільності становить від 0,16% до 99,97%.

Морфометрична характеристика ІГХ реакції до колагену І типу при використанні серії Excellence Visage показала, що товщина колагенової муфти при використанні цього типу матеріалу характеризується найбільшим значенням медіани серед усіх досліджених зразків – 31,62 [19,72; 47,01] мкм, а окремі ділянки мають товщину 100–110 мкм при максимальному значенні 112,64 мкм. Значення щільності в цілому по вибірці становить 94,32%, однак її коливання підтверджуються і достатньо високим значенням показника міжквартильного розмаху, що становить 32,83. Значення показника щільності колагену тканин навколо муфти при використанні цього типу матеріалу є помірним серед усіх досліджених зразків, і становить 22,07%, що наближено до показника матеріалу LLT.

Морфометрична характеристика ІГХ реакції до колагену І типу при використанні серії Light Lift Spring показала, що товщина шару колагену муфти при використання матеріалу серії LLS характеризується одним із найбільших (на рівні із EV) показників – 29,88 [20,14; 49,85] мкм. При цьому наявний найбільший діапазон коливань показника товщини від мінімального значення у 10,89 мкм до максимального 170,32 мкм., показник щільності колагену муфти становить 96,36% при використанні матеріалу серії LLS. Щільність колагену тканин навколо муфти при використанні матеріалу серії LLS є найбільшою серед усіх досліджених зразків – її показник становить 27,98%, при цьому варіабельність щільності також висока, що підтверджується найбільшим, серед досліджених зразків, показником міжквартильного розмаху – 36,72.

Показники товщини та щільності колагенової муфти, а також щільності колагену у тканинах навколо муфти відображені у таблицях 5–7.

За результатами проведеного морфометричного дослідження ІГХ реакції до колагенів із використанням Н критерію Краскела-Уолліса для непов’язаних груп встановлено статистичну достовірність:

1) При проведенні попарного порівняння із використанням тесту Дана встановлено достовірність різниці товщини між матеріалами серії EV та AS (р<0,001), LLS та AS (р<0,001), EV та LLT (р<0,001), LLT та LLS (р<0,001), NS та LLT (р<0,001). При цьому різниця показників товщини муфти між наступними матеріалами була наближеною до достовірної: LLT та AS (р=0,06), NS та AS(р=0,05), NS та EV (р=0,06), NS та LLS (р=0,05).

2) При проведенні попарного порівняння із використанням тесту Дана встановлено достовірність різниці щільності колагену стінки муфти між матеріалами серії LLS та EV (р<0,01), LLT та LLS (р<0,01). При цьому різниця показників щільності колагену муфти між матеріалами серії LLS та AS була наближеною до достовірної (р=0,08).

3) При проведенні попарного порівняння із використанням тесту Дана

11

встановлено достовірність різниці щільності колагену тканин навколо муфти між матеріалами серії LLS та AS (р<0,001), NS та AS (р<0,01). При цьому різниця показників щільності колагену тканин навколо муфти між матеріалами серії LLS та EV була наближеною до достовірної (р=0,09).

Таблиця 5Показники морфометричного дослідження ІГХ реакції товщини колагенової муфти

(мкм)Група М SD IQR 25% Me 75%

AScol1 27.02 18.30 21.86 15.22 21.07 37.07EVcol1 36.68 20.79 27.29 19.72 31.62 47.01LLScol1 39.01 26.97 29.72 20.14 29.88 49.85LLTcol1 21.11 11.93 10.85 14.31 19.49 25.15NScol1 29.30 15.28 17.32 18.46 25.99 35.78М – середнє, SD – стандартне відхилення, IQR – міжквартильний розмах, 25%

– перший квартиль (25-й процентиль), Ме – медіана, 75% – третій квартиль (75-й процентиль).

Таблиця 6Показники морфометричного дослідження ІГХ реакції щільності колагену І типу

муфти (у відсотках площі колагену до загальної площі стінки муфти)Група М SE IQR 25% Me 75%

AScol1 84.81 1.32 26.81 72.70 91.66 99.51EVcol1 82.09 1.34 32.83 66.23 94.32 99.06LLScol1 88.12 0.71 18.90 81.10 96.36 100.00LLTcol1 85.27 1.45 21.71 76.28 92.03 97.99NScol1 81.16 1.26 34.44 65.56 95.67 100.00М – середнє, SD – стандартне відхилення, IQR – міжквартильний розмах, 25%

– перший квартиль (25-й процентиль), Ме – медіана, 75% – третій квартиль (75-й процентиль).

Таблиця 7Показники морфометричного дослідження ІГХ реакції щільності колагену І типу у тканинах навколо муфти (у відсотках площі колагену до загальної площі тканини)

Група М SE IQR 25% Me 75%AScol1 24.17 1.21 30.34 6.77 20.77 37.11EVcol1 25.15 1.47 23.71 11.79 22.07 35.51LLScol1 31.40 1.09 36.72 11.02 27.98 47.74LLTcol1 29.17 1.88 34.13 9.54 22.50 43.67NScol1 32.62 1.85 30.73 13.81 25.33 44.54М – середнє, SD – стандартне відхилення, IQR – міжквартильний розмах, 25%

– перший квартиль (25-й процентиль), Ме – медіана, 75% – третій квартиль (75-й процентиль).

12

Таким чином, при вивченні патоморфологічної картини дерми протягом більше, ніж 1,5 року після імплантації спеціальних ниток для «зміцнення» старіючої шкіри, було одержано результати, які демонструють особливості цих ниток. Найбільш інтенсивної колагенізації зазнавала дерма у щурів, яким імплантувався матеріал серії LLS, EV та NS за рахунок рельєфності нитки та наявності у їх складі полімолочної кислоти. Найбільш виражений ангіоматоз визначався у місці імплантації перманентної нитки серії AS, що разом із недостатньо високим рівнем колагенізації свідчить про невисоку її ефективність. При імплантації усіх серій ниток з'являвся запальний інфільтрат, як реакція організму на стороннє тіло. Однак, станом на останній день експерименту, кількість його була не суттєвою і не впливала в жодній мірі на досягнення ефекту. Окремо слід відмітити меншу доцільність використання серії ниток NS, оскільки останні зумовлюють незначну алергічну реакцію організму реципієнта з появою еозинофілів. Найбільшої уваги для використання в естетичній дерматології заслуговують матеріали серії LLS та EV, оскільки вони викликають найбільш виражений колагеногенез із найменш вираженою запальною та алергізуючою дією на організм.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вирішено актуальне клініко-морфологічне завдання, яке полягає у об’єктивному обґрунтуванні оптимальної пріоритетності застосування різних видів імплантаційних ниток з метою ліфтингової корекції та інгібіції процесів старіння шкіри, що реалізуються за рахунок стимуляції синтезу колагенів I та III типів, які мають тривалий час біодеградації.

1. При дослідженні колагеногенезу в периімплантній зоні виявлено, що у всіх групах піддослідних щурів на 14-й день дослідження визначалась велика кількість активних фібробластів. Починаючи з 30-го дня відбувалось формування грубих колагенових пучків, кількість яких залишалась стабільно високою протягом 90, 180 та 365 днів, а вже станом на 540-й день визначались сформовані стратифіковані пучки в меншій кількості, аніж на попередніх етапах (нитка LLT), що свідчило про різні терміни біодеградації колагену І та ІІІ типів.

2. Встановлено, що в залежності від типу імплантаційної нитки (її хімічний склад та структура) колагеногенез стимулюється неоднаково. На інтенсивність колагеноутворення в значній мірі впливає ступінь травматизації тканин, пов’язаний з рельєфністю та формою нитки, а також наявність у їх складі полімолочної кислоти. Саме тому найбільш ефективний колагеногенез спостерігався при використанні косметичних ниток, що мали форму пружинок або ниток з насічками у поєднанні з полімолочною кислотою (EV, LLS, AS). Окремої уваги заслуговує перманентна поліпропіленова нитка-пружинка AS, що хоч і не має в своєму складі полімолочної кислоти, але за рахунок своєї структури стимулює інтенсивний колагеногенез.

3. Станом на 540-й день експерименту жодна із резорбуючих ниток не деградувала повністю, що вкладається в рамки інформації, наданої виробником про час розпаду не менше 365 днів, та доцільність використання даних косметичних ниток в естетичній дерматології з метою тривалої ліфтингової корекції шкіри.

13

4. В динаміці експерименту (від 14-го до 540-го дня) запальна інфільтрація спостерігалась у всіх групах піддослідних тварин і змінювалась починаючи від поліморфноклітинної до мононнуклеарної. Найвищий показник інтенсивності запальної інфільтрації спостерігався у серії NS на 90-й день експерименту та становив 1,5±0,29 ps; тут же тривало персистували еозинофіли, що може вказувати на відсутність абсолютної інертності імплантату – слабку алергічну реакцію в дермі. На 540-й день експерименту виявлено, що інфільтрація запальними клітинами значно зменшувалась, та спостерігалась у 19,5% досліджуваних (в усіх групах, окрім серії LLT). Колагенізація в периімплантних ділянках спостерігалась при імплантації матеріалу усіх серій, однак, найбільш ефективна без ознак біодеградації, відбувалась у піддослідних, яким було імплантовано нитки серії EV та пружинної форми ниток серій LLS та NS.

5. При постановці імуногістохімічних реакцій виявлено, що якісний складу колагену у більшості серій (LLS, LLT, NS, AS) піддослідних включав І та ІІІ типи, однак у різному відсотковому співвідношенні. Найбільш інтенсивний колагеногенез спостерігався при застосуванні нитки серії EV, при імплантації якої утворився виключно колаген I типу (3,0±0,00 ps), що свідчить про його довготривалий ефект стимуляції та тривалий час біодеградації; колаген III типу – відсутній: 0,0±0,00 ps; p<0,01. Імплантаційна нитка серії NS виявилась менш ефективною, щодо стимуляції вироблення колагену I типу (2,8±0,13 ps) (p<0,01). Колагенізація в ділянці дослідження нитки серії LLS спостерігалась у всіх тварин впродовж усього періоду. Інтенсивність її коливалась від максимального показника на 30-й день (2,2±0,13 ps) до мінімального на 540-й день (1,6±0,16 ps (p<0,05)).

6. Морфометричний аналіз критеріїв ефективності колагеногенезу виявив, що за показниками товщини колагенової муфти, щільності її шарів та щільності колагену І типу в тканинах наближених до муфти, найвищі значення спостерігаються при застосуванні серії LLS (товщина – 29.88[20.14; 49.85] мкм, щільність – 96,36%, навколо муфти – 27,98 % відповідно), на другому місці за сукупністю трьох показників знаходяться матеріали серії NS (товщина – 25.99[18.46; 35.78] мкм, щільність – 95,67%, навколо муфти – 25,33%) та EV (товщина – 31.62[19.72; 47.01] мкм, щільність – 94,32 %, навколо муфти – 22,07%).

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Туркевич МО, Туркевич ОЮ. Естетична дерматологія, як сфера використання резорбуючих та перманентних імплантатів. Патоморфологічна оцінка ефективності. Вісник проблем біології та медицини. 2017; 3 (4): 319–323. (Дисертант провела аналіз літератури, сумісно із співавтором визначила проблемні питання, провела патоморфологічний аналіз даних, сформулювала висновки, підготувала статтю до друку)

2. Туркевич МО, Туркевич ОЮ. Аналіз морфологічних змін шкіри в ділянці навколо імплантату шовного матеріалу, що застосовується в естетичній медицині в некроптатах різних періодів. Вісник проблем біології та медицини. 2018; 1 (1) : 310–315. (Дисертант провела аналіз літератури, провела патоморфологічний аналіз автопсійного матеріалу, сумісно із співавтором узагальнила одержані дані,

14

сформулювала висновки, підготувала статтю до друку)3. Turkevych MO. Non-surgical tactics of ligature correction of facial soft tissue

age changes and substantiation of their use in cosmetic dermatology on the basic of pathomorphological investigations conducted. Deutscher wissenschaftsherold German Scientific Herald (Germany). 2017; 6: 26–30.

4. Туркевич МО, Туркевич ОЮ. Доцільність використання резорбуючих імплантатів у косметичній дерматології на підставі проведення порівняльної характеристики. Клінічна анатомія та оперативна хірургія. 2018; 17 (1): 54–61. (Дисертант провела аналіз літератури, патоморфологічний аналіз автопсійного матеріалу, сумісно із співавтором проаналізувала та узагальнила одержані результати та висновки, підготувала статтю до друку)

5. Туркевич МО, Поспішіль ЮО. Патоморфологічне дослідження м’яких тканин обличчя при застосуванні нехірургічної лігатурної корекції вікових змін шкіри. Art of Medicine. 2018; (3) : 145–152. (Дисертант провела аналіз літератури та сформулювала основну концепцію роботи, описала виявлені патоморфологічні зміни, разом із співавтором проаналізувала одержані дані, сформулювала висновки, підготувала статтю до друку)

6. Turkevych MO, Turkevych A, Kadjava A, Gold MH. Lotti T, Sulamanidze G. Pathomorphological criteria of use efficiency of resorbable and permanent implants in aesthetic medicine and cosmetic dermatology. J Cosmetic Dermatol. 2018; 17 (5): 643–944. (Дисертанту належить ідея роботи, сумісно із співавторами проведено патоморфологічний аналіз автопсійного матеріалу та узагальнення одержаних даних, підготувала статтю до друку)

7. Туркевич МО, Рібун БЙ, Панасюк ЄВ, Даньчук ОВ. Патоморфоз регенераторних змін у шкірі білих щурів в експерименті при введенні резорбуючих та перманентних імплантатів. Актуальні проблеми сучасної патоморфорогії та патофізіології: матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю, Запоріжжя, 2015; 27–29. (Дисертант провела аналіз літератури, провела забір матеріалу, сумісно із співавторами узагальнила та проаналізувала одержані дані, сформулювала висновки, підготувала тези до друку)

8. Туркевич МО, Поспішіль ЮО, Канарейкін АВ. Інтенсивність колагеногенезу у шкірі в експерименті внаслідок впливу імплантаційних матеріалів різної природи на трьох хронологічних етапах. Uzhhorod Medical Students’ Conference: матеріали XIV Міжнародної науково-практичної конференції Ужгород, 2016; 84. (Дисертант провела аналіз літератури, сумісно із співавторами визначила проблемні питання, узагальнила та проаналізувала одержані дані, сформулювала висновки, підготувала тези до друку)

9. Туркевич МО, Канарейкін АВ. Ефективність нео- та колагеногенезу у шкірі білих щурів в експерименті при введенні різного типу імплантатів. Теорія та практика сучасної морфології: матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю Дніпро; 2016; 157. (Дисертант провела аналіз літератури, разом із співавтором провела патоморфологічний аналіз даних, сформулювала висновки, підготувала тези до друку)

10. Туркевич МО. Резорбуючі та перманентні імплантати: Патоморфологічні критерії ефективності використання в естетичній дерматології. Актуальні проблеми

15

сучасної патологічної анатомії: матеріали науково-практичної конференції. Київ, 2017; 108–110.

11. Туркевич М.О. Імуногістохімічне визначення якісного складу колагену при введенні резорбуючих та перманентних імплантатів. Матеріали 79-ї Загальноуніверситетської наукової конференції студентів та молодих вчених. Львів, 2018; 44–45.

АНОТАЦІЯ

Туркевич М.О. Ефективність колагеногенезу шкіри при введенні імплантатів різної природи (експериментально-патоморфологічне дослідження). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук (доктора філософії) за спеціальністю 14.03.02 – патологічна анатомія. – Харківський національний медичний університет МОЗ України, Харків, 2019.

Дослідження шкіри в нормі та при введенні імплантатів різної структури та хімічного складу проводилось із використанням загальногістологічних, гістохімічних, імуногістохімічних та морфометричних методів. Показано позитивний вплив при введенні імплантатів на морфофункціональні особливості шкіри. При дослідженні морфологічних змін в периімплантній зоні виявлено, що у всіх групах піддослідних щурів на різних хронологічних етапах утворюється колаген з різним терміном біодеградації та у різних кількостях.

При дослідженні колагеногенезу в периімплантній зоні виявлено, що у всіх групах піддослідних щурів на 14-й день дослідження визначалась велика кількість активних фібробластів. Починаючи з 30-го дня відбувалось формування грубих колагенових пучків, кількість яких залишалась стабільно високою протягом 90, 180 та 365 днів, а вже станом на 540-й день визначались сформовані стратифіковані пучки в меншій кількості, аніж на попередніх етапах (нитка LLT), що свідчило про різні терміни біодеградації колагену І та ІІІ типів.

Встановлено, що в залежності від типу імплантаційної нитки (її хімічний склад та структура) колагеногенез стимулюється неоднаково. На інтенсивність колагеноутворення в значній мірі впливає ступінь травматизації тканин, пов’язаний з рельєфністю та формою нитки, а також наявність у їх складі полімолочної кислоти. Саме тому найбільш ефективний колагеногенез спостерігався при використанні косметичних ниток, що мали форму пружинок або ниток з насічками у поєднанні з полімолочною кислотою (EV, LLS, NS). Окремої уваги заслуговує перманентна поліпропіленова нитка-пружинка AS, що хоч і не має в своєму складі полімолочної кислоти, але за рахунок своєї структури стимулює інтенсивний колагеногенез.

Станом на 540-й день експерименту жодна із резорбуючих ниток не деградувала повністю, що вкладається в рамки інформації, наданої виробником про час розпаду не менше 365 днів, та доцільність використання даних косметичних ниток в естетичній дерматології з метою тривалої ліфтингової корекції шкіри.

При постановці імуногістохімічних реакцій виявлено, що якісний складу колагену у більшості груп (LLS, LLT, NS, AS) піддослідних включав І та ІІІ типи, однак у різному відсотковому співвідношенні. Найбільш інтенсивний колагеногенез

16

спостерігався при застосуванні нитки EV, при імплантації якої утворився виключно колаген I типу, що свідчить про його довготривалий ефект стимуляції та тривалий час біодеградації; колаген III типу – відсутній. Імплантаційна нитка NS виявилась менш ефективною, щодо стимуляції вироблення колагену I типу. Колагенізація в ділянці дослідження нитки LLS спостерігалась у всіх тварин впродовж усього періоду. Інтенсивність її коливалась від максимального показника на 30 день до мінімального на 540-й день.

Морфометричний аналіз критеріїв ефективності колагеногенезу виявив, що за показниками товщини колагенової муфти, щільності її шарів та щільності колагену І типу в тканинах наближених до муфти, найвищі значення спостерігаються при застосуванні серії LLS, на другому місці за сукупністю трьох показників знаходяться матеріали серії NS та EV.

Ключові слова: шкіра, щури, некроптат, колаген, колагеногенез, резорбуючі та перманентні імплантати, естетична дерматологія.

АННОТАЦИЯ

Туркевич М.А. Эффективность коллагеногенеза в коже при введении имплантатов различной природы (экспериментально-патоморфологическое исследования). – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук (доктора философии) по специальности 14.03.02 – патологическая анатомия. – Харьковский национальный медицинский университет МЗ Украины, Харьков, 2019.

При использовании общегистологических, гистохимических, иммуногистохимических и морфометрических методов проведено исследование кожи в норме и при введении имплантатов различной структуры и химического состава. Показано положительное влияние при введении имплантатов на морфофункциональные особенности кожи. При исследование морфологических изменений в периимплантной зоне обнаружено, что во всех группах подопытных крыс на разных хронологических этапах образуется коллаген с разным сроком биодеградации и в разных количествах.

При исследовании коллагеногенеза в периимплантной зоне обнаружено, что во всех группах подопытных крыс на 14-й день исследования определялась большое количество активных фибробластов. Начиная с 30-го дня происходило формирование грубых коллагеновых пучков, количество которых оставалась стабильно высокой в течение 90, 180 и 365 дней, а уже по состоянию на 540-й день определялись сформированные стратифицированные пучки в меньшем количестве, чем на предыдущих этапах (нить LLT), что свидетельствовало о разных сроках биодеградации коллагена I и III типов.

Установлено, что в зависимости от типа имплантационной нити (ее химического состава и структуры) коллагеногенез стимулируется по разному. На интенсивность коллагенообразования в значительной степени влияет степень травматизации тканей, связанный с рельефностью и форме нити, а также наличие в их составе полимолочной кислоты. Именно поэтому наиболее эффективный коллагеногенез наблюдался при использовании косметических нитей, которые

17

имели форму пружинок или нитей с насечками в сочетании с полимолочной кислотой (EV, LLS, NS). Отдельного внимания заслуживает перманентная полипропиленовая нить-пружинка AS, которая, хотя и не имеет в своем составе полимолочной кислоты, но за счет своей структуры стимулирует интенсивный коллагеногенез.

По состоянию на 540-й день эксперимента ни одна из резорбирующих нитей, не деградировала полностью, что укладывается в рамки информации, предоставленной производителем о времени распада не менее 365 дней, и целесообразности использования данных косметических нитей в эстетической дерматологии с целью длительной лифтинговой коррекции кожи.

При постановке иммуногистохимических реакций выявлено, что качественный состав коллагена в большинстве групп (LLS, LLT, NS, AS) испытуемых включал I и III тип, однако в различном процентном соотношении. Наиболее интенсивный коллагеногенез наблюдался при применении нити EV, при имплантации которой образовался исключительно коллаген I типа, что свидетельствует о его долговременном эффекте стимуляции и длительном времени биодеградации; коллаген III типа – отсутствует. Имплантационная нить NS оказалась менее эффективной, по стимуляции выработки коллагена I типа. Коллагенизация в области исследования нити LLS наблюдалась у всех животных в течение всего периода. Интенсивность ее колебалась от максимального показателя на 30 день до минимального на 540-й день.

Морфометрический анализ критериев эффективности коллагеногенеза обнаружил, что по показателям толщины коллагеновой муфты, плотности ее слоев, и плотности коллагена I типа, в тканях приближенных к муфте, высокие значения наблюдаются при применении серии LLS, на втором месте по совокупности трех показателей находятся материалы серии NS и EV.

Ключевые слова: кожа, крысы, некроптат, коллаген, коллагеногенез, резорбирующиеся и перманентные имплантаты, эстетическая дерматология.

SUMMARY

Turkevych M.O. Efficiency of collagenogenesis of a skin at introduction of implants of various nature (experimental-pathomorphological research). – The manuscript.

Thesis for a candidate degree in medical sciences (doctor of philosophy) in specialty 14.03.02 – pathological anatomy. – Kharkiv National Medical University of Ministry of Health Care of Ukraine, Kharkiv, 2019.

Nowadays, in Ukraine, widespread application of two main methods of correction of age-related skin changes has been found: tredlifting with polydioxanone and Aptos threads in various modifications. The verbal translation of the English word "thread lifting" means “thread tightening”. However, the term “tredlifting” is not new and involves a non-invasive surgical lifting of the face using special threads with microspheres/cones/teeth. The described method is also well-known and recognized throughout the world. However, despite a significant number of non-invasive interventions of this type, the issue of the effectiveness of collagenogenesis as a leading and prognostically meaningful criterion for

18

the quality of the provision of this range of services was not studied either in Ukraine or in the world as a whole:

- not determined the intensity of regenerative-inflammatory changes in the skin when using different types of implants;

- the effectiveness of collagenogenesis, its qualitative and quantitative composition in the structure of the connective tissue formed in the implantation zones and around the place of “injury” was not investigated;

- duration of implant persistence (except for data specified by the manufacturer) as a significant criterion of efficiency and expediency of their use is not studied.

The purpose of the work was to establish the qualitative and quantitative composition of collagen, which is formed at the place of introduction of resorbing and permanent implants on the basis of the study of pathomorphological changes in the skin. The tasks of the work concerned the study of morphological changes in the area of implantation of threads – the fact of collagen formation at various chronological stages; determination of qualitative composition of collagen formed in peri-implant zones; establishing the relationship between the type of implantation thread and the intensity of collagenogenesis; definition of the terms of degradation of investigated resorbing implants in the skin of the experimental rats; determination of the presence and qualitative composition of inflammatory infiltration in peri-implant sites. The object of the study was peri-implant skin zone of white rats. The subject of the study was pathomorphological changes (particularly, collagenogenesis) in the places where implants were introduced. The studies were conducted on 310 sexually mature white male rats of the Vistar line weighing 100–130 g. All animals were kept under vivarium of Danylo Halytsky Lviv National Medical University, experiments were conducted in accordance with the provisions of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used in experimental and other scientific purposes (Strasbourg, 1986), Council of Europe Directive 86/609 / EEC (1986), Law of Ukraine No. 3445-IV “Protection of Animals from Cruel Treatment”. Animals were withdrawn from the experiment by overdose of etheric anesthesia (exposure 5–7 minutes). During the work, the following research methods were used such as simulation of inflammatory and regenerative processes in the skin of white male rats at the introduction of suture material with subsequent histological, histochemical and immunohistochemical staining, photographing histological microphotographes. For statistical research, two basic parameters were chosen for each sign – the frequency with which the sign occurs in the group, and the intensity of manifestations of this trait. The frequency index of the sign was expressed as the percentage of animals in which the sign was detected, compared with the total number of animals in the group. The intensity index was reflected in the form M ± m, where M is the mean value of the sum of the pluses calculated only in the animals in which this indicator is available, m is the mean square error from M. To compare the validity of the difference between the groups in terms of the frequency of manifestations of the trait, Pearson Criteria ( 2, Pearson's chi-squared). In order to compare the reliability of the indicator of the intensity of manifestations of the features among the groups, U-criteria Man-Whitney was chosen. The level of reliability is set at p<0.05. For statistical analysis, the software InVivoStat v.3.0 and SofaStat v.1.4.6 were used. Libre Office Calc v.5.2.2.2 and Microsoft Office Excel 2007 spreadsheets were used to create the database, calculate the data obtained and graphically present the results.

19

Experimental animals of a total of 310 individuals were divided into 5 groups of 60 individuals, depending on the type of implant. The rats of all groups (14, 30, 90, 180, 365 and 540 days) were divided into 6 subgroups of 10 individuals. All 10 rats of each subgroup were implanted with the same type of suture material. The Aptos implants were used for work, namely: Excellence Visage (EV), Nano Spring (NS), Aptos Spring (AS), Light Lift Thread (LLT) and Light Lift Spring (LLS).

The examination of the normal skin and after introduction of implants of different structures and chemical composition was carried out using general histological, histochemical and immunohistochemical methods. It is shown positive effect on implant implantation on morphofunctional features of the skin. In dyslization of morphological changes in the perimplant zone, it was found that in all groups of experimental rats at different chronological stages formed collagen with different term of biodegradation and in different quantities.

It has been established that depending on the use of different types of implantation thread (chemical composition and structure), collagenogenesis is stimulated unevenly. Thus, the experiment has shown that the intensity of collagen formation is largely influenced by the degree of tissue trauma associated with the relief and the shape of the thread, as well as the presence of polylactic acid.

On the 540th day of the experiment, none of the resorbing threads degraded completely, which falls within the scope of information provided by the manufacturer about the time of degradation at least 365 days, and the feasibility of using these cosmetic threads in aesthetic dermatology for the purpose of prolonged lifting skin correction.

Specificity of the structure of implant threads, namely the shape of the spring (NS, AS, LLS), as a provocative factor for long-term alteration, causes long-term inflammatory response in tissues (including 90th day of the experiment).

When studying the qualitative composition of collagen, it was established that 1 type was formed in all groups of subjects, but in different quantity. After implantation of EV thread 100% collagen type I was formed. All other threads also stimulate the formation of collagen type I, but the ratio of it to collagen type 3 varies.

Key words: skin, rats, necroptate, collagen, collagenogenesis, resorbing and permanent implants, aesthetic dermatology.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, ОДИНИЦЬ, СКОРОЧЕНЬ І ТЕРМІНІВ

ІГХ – імуногістохімічнийЛНМУ – Львівський національний медичний університетAS – Aptos SpringEV – Excellence VisageLLS – Light Lift SpringLLT – Light Lift ThreadNS – Nano Springps – плюси

20