2006 年诺贝尔医学奖

演讲人： 魏玮

RNA 干扰机制

一 获奖者简介

安德鲁·法尔 (Andrew Fire) ·1959 年出生于美国加利福尼亚州圣克拉拉县

·1983 年获美国麻省理工学院生物学博士学位

·现任斯坦福大学斯坦福医学院病理学和遗传学教授

克雷格·梅洛（ Craig C. Mello ）

·1960 年 出生于美国

·1990 年获得哈佛大学生物学博士学位 · 现任美国哈佛大学马萨诸塞州医学院分子医学教授

二 RNAi 机制 1.RNAi 背景

● RNA interference 由双链 RNA （ Double Strand RNA 简称 dsRNA ）指导的，在特定酶参与下，以外源或内源 mRNA 为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象

● 生物界普遍存在的一种古老而进化的高度保守的生物学现象

● 存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的大多数真核生物中，原核生物暂未发现

2. RNAi 的发现☆ 1990 年，科学家 Rich Jorgensen 将产生紫色素的基因置于一个强启动子后导入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，但结果是：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色。当时认为这是导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，并将之称为协同抑制

☆ 1995 年，康奈尔大学的 Su Guo 博士在用反义 RNA 阻断线虫基因表达的试验中发现：反义 RNA （ anti sense RNA ）和正义 RNA （ sense RNA ）都阻断了基因的表达

☆ 1998 年， Andrew Fire 和 Craig Mello 将反义 RNA 和正义 RNA 同时注射到秀丽隐杆线虫（ Caenorhabditis elegans ）比单独注射反义 RNA 诱导基因沉默的效率高 10倍

3.RNAi 机理

3.1 dsRNA 的形成

◆ 基因组中 DNA 反向重复序列的转录产物

◆ DNA 同时转录了反义 RNA 和正义 RNA 的互相结合

◆ 病毒 RNA 复制中间体◆ 以细胞中单链 RNA 为模板，由细胞或病毒的 RNA 在有关酶的催化下合成 dsRNA 等

3.2 siRNA( 干扰性小 RNA small interfering RNA ，简称 siRNA) 的形成

▲ RNaseIII 家族中特异识别双链 RNA 的一员

▲ 含有解旋酶活性以及 dsRNA 结合域和 PAZ 结构

3.21 核酸内切酶 Dicer

（ 1 ） dsRNA 在细胞中大量扩增

（ 2 ） dsRNA 在细胞中达到一定量时，核酸内切酶Dicer识别并与之结合形成酶 -dsRNA 复合体

（ 3 ）核酸内切酶 Dicer 对 siRNA 进行切割，产生 21-23nt 长的 dsRNA小片段，即 siRNA

3.22 siRNA 形成过程

3.23 siRNA 的特征性结构：

※ siRNA 的序列与所作用的靶 mRNA 序列具有同源性

※ siRNA 两条单链末端为 5′ 端磷酸和 3′ 端羟基

※ 正义链与反义链各有 21 个碱基，其中 19个碱基配对，在每条链的 3′ 端都有 2 个不配对的碱基（图 1 ）。

图 1 siRNA示意图

3.3 RISC 的形成和发挥效应

siRNA 和核糖核酸酶复合物结合，形成 RNA 诱导的基因沉默复合体（ RNA-induced silencing complex, 简称 RISC ）

3.32 RISC 蛋白成分

内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶、同源RNA 链搜索活性酶、 Argonaute 等

3.31 RISC 的形成

☆ Argonaute有一个月牙型的底座由三部分组成，分别为 N- 端（ amino-terminal ）、中部（ middle ）和 PIWI区域（ PIWI domain ）。月牙底座上面有一个 PAZ部分，由茎杆结构支撑。 Argonature蛋白有一个凹槽贯穿整个蛋白，凹槽内壁带正电有利于与 RNA带负电的磷酸骨架结合

3.33 Argonaute蛋白

☆ RISC 的特有成分，被比喻成“切薄片的机器”。

图 2 siRNA引导 mRNA 被切割的模型

(1) RISC 中的 siRNA依赖 ATP 水解释放的能量而解旋，双链转变成单链而使复合体被激活，得到活性 RISC 。

(2) siRNA 解旋后， siRNA 单链的 3’端伸入 PAZ 的裂缝中，整个单链沿着 PAZ伸展开，同时目的片段 mRNA 结合于新月型底座。 siRNA 反义链与 mRNA 互补区域结合，形成双链

(3) 在离单链 siRNA5’端 9 个碱基处 ,由 RNA酶切割 mRNA ，阻断 RNA 的翻译，达到在 RNA水平上干扰基因表达的效果

3.33 效应阶段

紫色

正义 RNA段

蓝色

反义 RNA段

绿色

目标信使 RNA

图 4 RNAi原理示意图：

siRNA 形成后另外作为一种特殊引物 ,在RNA 依赖 RNA聚合酶（ RNA-dependent RNA polymerase ， 简称 RdRp) 作用下以靶 mRNA 为模板合成 dsRNA,后者在 Dicer 酶的作用下又可被降解形成新的 siRNA ，新生成的 siRNA再进入上述循环

3.34 siRNA 特殊的保障机制——随机降解性多聚酶链式反应

3.5 siRNA 目标位点的筛选

(1) 在预定沉默的 mRNA 中找一段 21nt的序列，起始是 AA

(2) 找 2～ 4个小片段的 RNA ，通过 SECs （ siRNA expression cassettes ，简称 SECs ）筛选最有效的 siRNA

(3) 在 19nt的 RNA片断中不能含有连续 4个 T或 A的区域

(4) 通过 BLAST 确定片断的特异性；

(5) 片断 GC% 应该在 30% ～ 50%

1. 开展基因治疗的新途径

一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性， 设计针对这一区段序列的 dsRNA 分子，只注射一种 dsRNA即可以产生多个基因表达同时降低的表现，也可同时注射多种 dsRNA 而将多个序列不相关的基因同时剔除。

三 RNAi 的应用

＊ 抗肿瘤治疗 RNAi可用于抑制癌基因的表达

＊ 传染性疾病 根据病原体如病毒、细菌等的致病基因序列，以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列有同源序列的 dsRNA ，转入动植物内使有关的疾病基因“沉默”，从而达到治疗的效果。

＊ AIDS治疗 利用 siRNA 抑制病毒再生或传染所需的蛋白质的生成。优势在于能够不损伤细胞而只抑制病毒蛋白质。

＊ 动物实验证明，通过 RNAi 的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”。

＊ 美国哈佛医学院的科学家成功地利用 RNA干扰技术治愈了实验鼠的肝炎。

2. 功能基因组的研究

＊由于 RNAi具有高度的序列专一性，可以准确地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，这样当某一特定基因被“沉默”后，其功能便反向的体现出来

＊ RNAi能够在哺乳动物中降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间，控制基因表达的部位

四 未解难题

★ RNA 干扰在患者体内的有效部位进行

★ 是否会影响目标基因以外的其他基因，引发副作用

Thank You ！