(TUGAS REKAYASA GENETIKA) POLYMERASE CHAIN REACTION/PCR

NUR ALFIAH IRFAYANTIISTIANAH PURNAMASARIJAYADIRORI ORYZA

DOSEN PENGAMPU : PROF.NATSIR DJIDE.,M.Si.,Apt

PROGRAM PASCASARJANA FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2014

BAB IPENDAHULUAN

Latar BelakangGenetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas) serta segala sluk beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan, ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pearisan sifat, bagaimana sifat keturunan ilmu itu diturunkan dari generasi kegenerasi serta variasi-variasi yang mungkin timbul didalamnya atau yang menyertainya. Pewarisan sifat tersebut dapat terjadi melalui proses seksual. Genetika berusaha membawakan material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan genetik), bagaimana informasi tersebut di ekspresikan ekspresi genetic dan bagaimana informasi tersebut dipindahkan dari individu satu ke individu lain. PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.

BAB IIPEMBAHASAN2.1. Pengertian PCR (Polimerase Chain Reaction)Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target. Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5 ke 3. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan. Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan menggunakan dua oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung 5dari dua untaian skuen target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer (primer PCR) untuk memungkikan DNA template dikopi oleh DNA polimerase. Untuk mendukung terjadinya annealing primer ini pada template pertama kali diperlukan untuk memisahkan untaian DNA substrat melalui pemanasan. Hampir semua aplikasi PCR mempekerjakan DNA polimerase yang stabil terhadap panas, seperti polimerase Taq. Awalnya enzim diisolasi dari bakteri Aquaticus Thermus. DNA polimerase enzimatis ini merakit sebuah untai DNA baru dari pembangunan blok DNA, nukleotida , dengan menggunakan DNA beruntai tunggal sebagai template dan oligonukleotida DNA (juga disebut primer DNA ), yang dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA. Sebagian besar metode PCR menggunakan siklus termal , yaitu, bergantian pemanasan dan pendinginan sampel PCR untuk serangkaian langkah pasti suhu. Langkah-langkah siklus termal yang diperlukan pertama yang secara fisik memisahkan dua helai dalam heliks ganda DNA pada suhu tinggi dalam proses yang disebut DNA leleh . Pada suhu yang lebih rendah, masing-masing untai kemudian digunakan sebagai template dalam sintesis DNA oleh polimerase DNA untuk selektif memperkuat DNA target. Selektivitas hasil PCR dari penggunaan primer yang komplementer ke wilayah yang ditargetkan untuk amplifikasi DNA di bawah kondisi spesifik siklus termal.Metode PCR dapat melipatgandakan suatu fragmen molekul DNA menjadi molekul DNA (110 bp / 5 x 10-19) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit (Newton and Graham, 1994).

Alat PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION)2.2. KomponenSelain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:a. PrimerPrimer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.b. dNTP (deoxynucleoside triphosphate)dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.c. BufferBuffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.d. Ion Logam Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion logam monovalen, kalsium (K+).2.3. Prinsip KerjaSecara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

Gambar proses prinsip kerja PCR (Polimerase Chain Reaction)1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 9496C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat (patokan) bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit.1. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 4560C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat \menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit.1. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara ksponensialPada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal.Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakanprimer maju(forward primer)danprimer mundur(reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5 DNA templat(ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5 ke 3 atau berarti dari ujung 3 ke 5 untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer.Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 220 2.20 = 1.048576 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.2.4. Perancangan PrimerTahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan.Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolatBacillustermofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strainPseudomonas fluorescens,P. mendocina, dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakandaerah lestari(conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan basa primer.Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakanprimerdegenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna (100%).Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinyaprimer-dimerakibat homologi sendiri(self-homology)atau homologi silang(cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinyasalah tempel(mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (Tm) masing-masing primer dan kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyaiTmyang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi.2.5 Alat-alat yang dibutuhkan dalam PCRReagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro antara lain(Mahmuddin (2010)):1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi1. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)1. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.1. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)1. Minyak mineral ringan1. Akrilamida (grade elektroforesis)1. N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)1. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)1. TEMED (N, N, NN Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)\Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)1. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler1. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)

2.6 Variasi PCRAda banyak variasi dari PCR yang umum di kenal, antara lain:1. Alel-spesifik PCR : atau kloning teknik diagnostik yang didasarkan pada -nukleotida polimorfisme tunggal (SNP) Hal ini membutuhkan pengetahuan sebelumnya dari urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel , dan menggunakan primer yang 3 'berakhir meliputi SNP. amplifikasi PCR dalam kondisi ketat jauh kurang efisien dalam adanya ketidaksesuaian antara template dan primer, amplifikasi sukses jadi dengan kehadiran sinyal primer spesifik-SNP dari SNP spesifik secara berurutan. 1. Polymerase Cycling Assembly (PCA): sintesis buatan urutan DNA yang panjang dengan melakukan PCR di kolam oligonukleotida panjang dengan segmen tumpang tindih pendek. The oligonukleotida bergantian antara rasa dan arah antisense, dan segmen tumpang tindih menentukan urutan fragmen PCR, sehingga selektif menghasilkan produk DNA panjang akhir.1. Asymmetric PCR : Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda. Hal ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi probing amplifikasi hanya satu dari dua untai komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti biasa, tetapi dengan kelebihan besar primer untuk untai yang ditargetkan untuk amplifikasi. Karena (lambat aritmatika amplifikasi) kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah digunakan Facebook, siklus PCR tambahan yang diperlukan. 1. Amplifikasi tergantung helikase : mirip dengan PCR tradisional, tetapi menggunakan suhu konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan annealing / siklus ekstensi. DNA helikase , sebuah enzim yang unwinds DNA, digunakan di tempat denaturasi termal.1. Hot Start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama proses set up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan memanaskan komponen reaksi terhadap temperatur leleh (misalnya, 95C) sebelum menambahkan polimerase. Khusus sistem enzim telah dikembangkan yang menghambat polimerase, aktivitas pada suhu sekitar, baik oleh mengikat dari antibodi atau oleh kehadiran inhibitor yang terikat kovalen yang terdisosiasi hanya setelah suhu aktivasi langkah-tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak aktif pada suhu kamar dan akan segera diaktifkan pada suhu perpanjangan.1. PCR spesifik Intersequence (ISSR): metode PCR untuk sidik jari DNA yang memperkuat daerah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan sidik jari yang unik dengan panjang fragmen diperkuat.1. Inverse PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit sekitar genom sisipan. Ini melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi diri, sehingga diketahui pada urutan kedua ujung urutan tidak diketahui. 1. Mediated PCR Ligasi : menggunakan linker DNA kecil diligasikan dengan DNA kepentingan dan beberapa primer anil ke linker DNA, tetapi telah digunakan untuk sekuensing DNA , berjalan genom , dan DNA footprinting.1. PCR spesifik Metilasi (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim Herman di Johns Hopkins School of Medicine dan digunakan untuk mendeteksi metilasi dari CpG pulau dalam DNA genom. DNA pertama diobati dengan natrium bisulfit, yang mengubah unmethylated basa sitosin ke urasil, yang diakui oleh primer PCR sebagai timin. Dua PCR kemudian dilakukan pada DNA dimodifikasi, menggunakan primer set identik kecuali pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada titik-titik ini, satu set primer mengakui DNA dengan sitosin untuk mengamplifikasi DNA alkohol, dan satu set mengakui DNA dengan urasil atau timin untuk mengamplifikasi DNA unmethylated. MSP menggunakan qPCR juga dapat dilakukan untuk mendapatkan informasi kuantitatif daripada kualitatif tentang metilasi.1. Miniprimer PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat memperpanjang dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10 nukleotida. Metode ini memungkinkan menargetkan untuk mengikat PCR primer daerah yang lebih kecil, dan digunakan untuk memperkuat sekuens DNA, seperti atau eukariotik 18S rRNA).1. Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA): izin beberapa sasaran diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga menghindari keterbatasan resolusi PCR multipleks.1. Multiplex-PCR : terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .1. Nested PCR : meningkatkan kekhususan amplifikasi DNA, dengan mengurangi latar belakang karena khusus non amplifikasi DNA. Dua set primer yang digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi pertama, sepasang primer digunakan untuk menghasilkan produk DNA, yang selain target yang dimaksud, masih dapat terdiri dari fragmen DNA non-khusus diperkuat. Produk (s) yang kemudian digunakan dalam PCR kedua dengan satu set primer yang mengikat situs sebagian atau seluruhnya berbeda dari dan terletak 3 'dari masing-masing primer yang digunakan dalam reaksi pertama. Nested PCR sering lebih berhasil dalam memperkuat fragmen spesifik DNA yang panjang dari PCR konvensional, tapi membutuhkan pengetahuan lebih rinci tentang urutan target.1. Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi (BUMN): sebuah rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk splice bersama lebih fragmen DNA atau dua yang berisi urutan komplementer. Hal ini digunakan untuk bergabung dengan potongan DNA yang mengandung gen, urutan peraturan, atau mutasi, teknik tersebut memungkinkan penciptaan DNA spesifik dan panjang konstruksi.1. Kuantitatif PCR (Q-PCR): digunakan untuk mengukur jumlah produk PCR (umum secara real-time). Ini secara kuantitatif jumlah ukuran mulai DNA, cDNA, atau RNA. Q-PCR biasanya digunakan untuk menentukan apakah urutan DNA hadir dalam sampel dan jumlah salinan dalam sampel. Kuantitatif real-time PCR memiliki tinggi tingkat yang sangat presisi. QRT-PCR metode menggunakan pewarna fluorescent, seperti Sybr Green, EvaGreen atau fluorophore DNA probe yang mengandung seperti TaqMan, untuk mengukur jumlah produk yang diperkuat secara real time. Hal ini juga kadang-kadang disingkat RT-PCR (R T ime Bit PCR) atau RQ-PCR. QRT-PCR atau RTQ-PCR sesuai kontraksi lebih, karena RT-PCR umumnya mengacu pada reverse transkripsi PCR (lihat di bawah), sering digunakan dalam hubungannya dengan Q-PCR.1. RT reverse transcription PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari RNA. Reverse transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA , yang kemudian diamplifikasi dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam profiling ekspresi , untuk menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentifikasi urutan dari transkrip RNA, termasuk start transkripsi dan situs penghentian. Jika urutan DNA genom gen diketahui, RT-PCR dapat digunakan untuk memetakan lokasi ekson dan intron dalam gen. 5 'akhir dari gen (sesuai dengan awal transkripsi) biasanya diidentifikasi oleh RACE-PCR (Rapid Amplifikasi cDNA End).1. PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR ): untuk isolasi dari suatu urutan yang tidak diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan diketahui, TAIL-PCR menggunakan sepasang nested primer dengan suhu yang berbeda anil; degenerate primer digunakan untuk memperkuat yang lain dari arah yang tidak diketahui. 1. Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR): sebuah varian dari PCR yang bertujuan untuk mengurangi latar belakang spesifik secara bertahap menurunkan suhu anil sebagai bersepeda PCR berlangsung. Suhu anil pada awal siklus biasanya beberapa derajat (3-5 C) di atas m T primer yang digunakan, sedangkan pada siklus kemudian, ini adalah beberapa derajat (3-5C) di bawah T primer m. Suhu tinggi memberikan spesifisitas yang lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih rendah izin lebih amplifikasi efisien dari produk tertentu terbentuk selama siklus awal. 2.7 Optimasi PCR Untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal perlu dilakukan optimasi proses PCR. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor seperti jenis polimerase DNA; suhu; konsentrasi, dalam hal ini berkaitan dengan dNTPs, MgCl2 dan DNA polimerase; buffer PCR dan waktu.1. Jenis polimerase DNAKemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses PCR yang terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang akan berbeda dengan untuk DNA rantai pendek. Penggunaan jenis DNA polimerase tergantung pada panjang DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari tiga kilobasa akan memerlukan jenis polimerase dengan aktivitas tinggi.2. Konsentrasi dNTPs, MgCl2; polimerase DNAKonsentrasi optimal dNTPs ditentukan oleh panjang target DNA yang diamplifikasi. Untuk panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya digunakan konsentrasi dNTPs sebanyak 100 uM, sedangkan untuk panjang target DNA lebih besar dari satu kilobasa diperlukan konsentrasi dNTPs sebanyak 200 uM. Umumnya konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0 1,5 mM. Konsentrasi MgCl2 yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR. Sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk non target yang disebabkan oleh terjadinya mispriming. Jumlah polimerase DNA yang digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua kilobasa diperlukan 1,25 2 unit per 50 uL campuran reaksi, sedangkan untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari dua kilobasa diperlukan 3 unit per50 uL campuran reaksi.3. SuhuPemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Suhu denaturasi DNA templat berkisar antara 93 95oC, ini semua tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah 94oC. Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 - 60oC Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm 5)oC sampai dengan (Tm + 5)oC. Dalam menentukan suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh eksperimen. Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada suhu 72oC karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR..4. Buffer PCRBuffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffer nya. Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu Low-salt buffer (pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan High-salt buffer (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Umumnya buffer PCR tersedia sesuai dengan jenis polimerase DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 5 kilobasa biasanya diperlukan low-salt buffer sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari lima kilobasa digunakan high-salt buffer.5. WaktuPemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi DNA templat umumnya dilakukan selama 30 90 detik, ini semua tergantung pada DNA templat yang digunakan. Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA. Sedangkan waktu denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan proses denaturasi tidak sempurna.Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang primer. Untuk panjang primer 18 22 basa cukup dengan 30 detik, sedangkan untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu annealing 60 detik.2.8. Aplikasi teknik PCRKary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

a. Isolasi GenKita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.b. DNA SequencingUrutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.c. ForensikIdentifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragud. Diagnosa PenyakitPenyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.Beberapa contoh agen yang dapat dideteksi menggunakan pemeriksaan amplifikasi asam nukleat diantaranya deteksi bakteri , virus, fungi maupun parasit. Selain deteksi bahan ini juga dapat menetukan sensitivitas, spesifitas dan kegunaan lainnya.

Contoh bakteri, virus, fungi

BakteriBordetella pertussisBorelia burdorferiChlamydia pneumoniaChlamydia trachomatisEscheria coliMycobacterium tubercolosisMycobacterium avium complexMycoplasma sppNeissheria gonorhoeaeStreptococcus pneumoniaStreptococcus pyogenesFungi dan parasitBabesia microtiCryptococcus neoformanCryptococcus parvumEntamoeba histolyticaFasiola hepaticaGiardia lambiaLeishmania donovaniLeishmania infantumPalsmodium falciparumPalsmodium vivaxPneumaocytis cariniiSchitostoma sppToxoplasma gomdiiTrichinella spiralisTrichomonas vaginalisTypanosoma cruziTypanosoma brucei

VirusCytomegolvirusEnterovirusHepaitis B Virus (HBV)Hepaitis A Virus (HAV)Herpes simple virus-1 (HSV-1)HIV (Human immunodefesiensi virus)Parvovirus B 19Varicella-Zozter virusWest nile virus

0. Deteksi Resistensi ObatDengan makin banyaknya mikroorganisme genetic resistensi antimikroba diketahui, metode amplifikasi asam nukeat terbukti berguna untuk mengkonfirmasi resistensi antimikroba pada isolate dilaboratorium dan untuk mendeteksi langsung pada specimen klinis. Amplifikasi penentu genetic dapat digunakan untuk mengkonfirmasi resistensi lebih berdasarkan genotif organism daripada variabilitas ekspresi resistensi fenotopik. Ini merupakan keuntungan deteksi resistensi secara molekuler, disamping itujuga memerlukan waktu yang lebih singkat dibandingakan dengan menggunakan teknik kultur konvensional.

Deteksi Resistensi Obat dengan Metode PCROrganismeResistensi ObatTarget Gen

Methichilin-Resistent Ttaphylococcus aureus dan coagulase- negative staphylococcusMetisilin dan Antibiotika B-laktamase yang lainmecA

Vancomycin-resisten Enterococcus sppVankomisisnVanA, vanB, vanC1 vanC2 dan VanC3

2.9 Kelebihan dan kekrangan teknik PCR1. Kelebihan1. Memiliki spesifisitas tinggi1. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama1. Dapat membedakan varian mikroorganisme1. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup1. Mudah di set up1. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuen DNA dalam genom bakteri hanya dengan mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR.1. Kekurangan1. Sangat mudah terkontaminasi1. Biaya peralatan dan reagen mahal1. Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten)1. Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya.

BAB IIIKESIMPULANReaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara dua puluh sampai tiga puluh kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap yaitu Tahap peleburan (melting) atau denaturasi, Tahap penempelan atau annealing dan Tahap pemanjangan atau elongasi. Lepas tahap ketika, siklus diulang kembali mulai tahap satu. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.

DAFTAR PUSTAKA1. Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed.,1. David, J. C, Jannet L.,Comparison of Vitek 32 and Microlog ML3 System for Identification of Select Biological Warfare Agents, Armed Force Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, DC, 2001de Nogueira L., Bittrich, V.P.C., Shepherd, G. J., Lopes A. V., and Marsaioli, A. J. 2001.1. Djide, M.N, (2006). Dasar dasar bioteknologi farmasi, Makassar1. Darmo Handoyo, 2001, General Principles and Implementation of Polymerase Chain Reaction, Pusat Studi Bioteknologi ,Universitas Surabaya1. Marlina, Radu, S., Kqueen, C. Y., Napis, S., Zakaria, Z., Mutalib, S. A. and Nishibuchi, M. Occurrence of tdh and trh genes in Vibrio parahaemolyticus isolated from Corbicula moltkiana Prime in West Sumatera, Indonesia. Southeast Asian Journal of Tropical Medical Public Health Vol.38 No. 2 March 2007.1. Marlina, Zulqifli, Anamerta, L., Revadiana, I., Radu, S., Kqueen, C. Y. and Nishibuchi, M. Identification of Vibrio parahaemolyticus from clinical samples in West Sumatera Using Polymerase Chain Reaction Methods. Acta Pharmaceutica Indonesia 31 (2): 2007, 96-99.1. Retnoningrum, D.S. 1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk diagnosis penyakit infeksi. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung: ITB.