35
TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce

TECHNIKY PCR

  • Upload
    magee

  • View
    61

  • Download
    1

Embed Size (px)

DESCRIPTION

TECHNIKY PCR. PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce. Outline. Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymeráza Princip procesu PCR Optimalizace PCR Typy PCR Aplikace PCR a využití v praxi. Komponenty nukleových kyselin. Nukleotid DNA - PowerPoint PPT Presentation

Citation preview

Page 1: TECHNIKY PCR

TECHNIKY PCR

PCR - polymerase chain reaction

-polymerázová řetězová reakce

Page 2: TECHNIKY PCR

Outline

Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymeráza

Princip procesu PCR

Optimalizace PCR

Typy PCR

Aplikace PCR a využití v praxi

Page 3: TECHNIKY PCR

Komponenty nukleových kyselin

http://ntri.tamuk.edu/cell/nucleic.html

Nukleotid DNAdeoxyguanosid monofosfát (dGMP)

Page 4: TECHNIKY PCR

“Koncept párování bazí je striktně konzervativní“

From Dr. John C. Perez, Professor and Director of the Natural Toxins Research Initiative, Texas A&M http://ntri.tamuk.edu/cell/dna.html

Cytosine Guanine

Page 5: TECHNIKY PCR

Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr

konce dsDNA nejsou stejné

jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární

DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena

OH

HO

T A

G

T A

C

G C

5’ end 3’ end

5’ end3’ end

1

23

45

Page 6: TECHNIKY PCR

Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována

Singer, M., and P. Berg. 1991. Genes and Genomes. University Science Books, Mill Valley, CA. p. 49

Tm je závislá na: složení bazí rozpouštědle

iontové sílepH

délce DNA

Page 7: TECHNIKY PCR

DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/collaboration.html

separace řetězců syntéza krátkých

RNA primerů syntéza dvou

nových DNA helixů

podílí se enzymy:DNA primáza helikázaDNA polymerázaDNA ligáza SSB-proteiny

Page 8: TECHNIKY PCR

Vlastnosti DNA polymerázy

1. POLYMERÁZOVÁ AKTIVITA

Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec

Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3´OH konec.

2. 3'-5' exonukleázová aktivita -opravná funkce “proofreading”

3. 5´exonukleázová aktivita - odštěpuje RNA primer

Page 9: TECHNIKY PCR

DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym

1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerázy - DNA polymerase I

in vitro polymeráza vyžaduje pouze:4 deoxynukleotidy trifosfátydsDNA templátprimer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH

DNA Polymeráza

Page 10: TECHNIKY PCR

Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro

TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG

5’ 3’

3’ 5’

TTGAGAAAGGAATAAGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG3’ 5’

5’ 3’Forward primer

TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG

5’ 3’

3’ 5’

DNA POL

dNTPs

Page 11: TECHNIKY PCR

TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG

5’ 3’

3’ 5’

TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC TCTTTAGCTCATATACG

3’ 5’

5’ 3’

Reverse primer

TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG

5’ 3’

3’ 5’

dNTPs

DNA POL

GCATATACTCGATTTCT5’ 3’

Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro

Page 12: TECHNIKY PCR

PCR: Co to je?

Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA

Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika)

The idea

Ghobind Khorana 1971

Kary Mullis 1983

poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce

Page 13: TECHNIKY PCR

Řetězová reakce vychází z DNA replikace

Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty

potřeba silného enzymu (polymerázy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách

Polymeráza izolovaná z termofilní bacterie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymeráza

Jak funguje PCR

Page 14: TECHNIKY PCR

PCR komponenty

Templátová DNA

vzorek k amplifikaci

Primery

krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace

dATP, dTTP, dCTP, dGTP

volné stavební jednotky DNA

Thermostabilní DNA polymeráza (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2)

Page 15: TECHNIKY PCR

Proces PCR

Application

Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu

Proces

Page 16: TECHNIKY PCR

Problémy:

PCR je velmi citlivá na kontaminace

Častý problém - nespecifická amplifikace

Polymeráza pracuje i při nízských teplotách (e.g., během nastavování reakce)

“Hot start” PCR je řešení

Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu

“Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici: …gacgt, …gacga, …gacgg, …gacgc)

“Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech

Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí

Page 17: TECHNIKY PCR

Navrhování primerů

Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé

Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA

3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze

Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát)

Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2

Primery v jedné reakci by měli mít srovnatelné Tm

Vyvarovat se repetitivním sekvencím

Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery

Page 18: TECHNIKY PCR

Navrhování primerů

Příklad navržení primerů:

Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5´ku 3´konci

Cílová sekvence: (priming místo podtrženo):

5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’

Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’

Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’

Page 19: TECHNIKY PCR

Praktické provedení PCR

PCR se provádí v termocyklerech

kovový blok z ušlechtilého kovusnadné programovánívyhřívané víko

Page 20: TECHNIKY PCR

Praktické provedení PCR

objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL

složení:

• Templátová DNA 1-1000ng

• Primery 10 -20 pmols

• 10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl

• MgCl2 0.5 -3.0 mM

• 50 ųM každého nukleotidu dATP, dGTP, dTTP, dCTP

• 2 jednotky Taq polymerázy

Page 21: TECHNIKY PCR

Praktické provedení PCR

Počáteční denaturace 94oC 3-5 min

denaturace 94oC 30 sec

annealing ~55oC 30 sec

prodlužování 72oC 1min/kilobáze

počet cyklů 25-35 x

Page 22: TECHNIKY PCR

Praktické provedení PCR

agarozováelektroforéza

Page 23: TECHNIKY PCR

PCR Optimalizace

Složka Nízká specificita

Vysoká specificita

AnnealingTeplota - Tm

MgCl2

KCl

Enzym, Primer

pH nespecificky

Formamid

Nespecifická amplifikace

Page 24: TECHNIKY PCR

Základní typy PCR

RT PCR (reverse transcriptase PCR)

vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT

jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dTrandom hexamer primer

hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů

Page 25: TECHNIKY PCR

vychází z RT-PCR

používá se k hledání celé sekvence nového genu

nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu

vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)

RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends)

Page 26: TECHNIKY PCR

inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA

Page 27: TECHNIKY PCR

asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond

amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA

SEKVENCOVÁNÍ DNA•automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR•jednozkumavková reakce•PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)•dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery•velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře•fluorometr s automatickým vyhodnocením

Page 28: TECHNIKY PCR

multiplex PCR více amplifikací v jedné

zkumavce

lékařská diagnostika

nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR

zvyšování specificity PCR

Page 29: TECHNIKY PCR

long PCR amplifikace dlouhých úseků, polymerázové kokteily –

např. Klenowův fragment + Pfu polymeráza

Pwo polymeráza z Pyroccocus woesei

DNA polymeráza 5´-3´exonukleázováaktivita

3´-5´exonukleázováaktivita

délkaproduktu

f rekvence chyby

Taq + 3 kb 8.0 x 10-6

Pfu + 3 kb 1.3 x 10-6

Pwo + 3 kb 5.3 x 10-7

long PCR koktej l + + 20 kb 2.0 x 10-6

Page 30: TECHNIKY PCR

in situ RT PCR lokalizace translace a exprese

genů

Page 31: TECHNIKY PCR

real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu

využití fluorescence interkalačních barviv (etBr)

fluorometr je součástí termocykleru

Page 32: TECHNIKY PCR

Aplikace PCR a využití v praxi

DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ

1. detekce virových a bakteriálních onemocnění

Page 33: TECHNIKY PCR

Aplikace PCR a využití v praxi

DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ

2. detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA)

- AS PCR alelicky specifická PCRprimer navžen tak, že mutace odpovídá konci primeru

fragmety DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji

- Real time PCRpomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci

Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecív genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator

Page 34: TECHNIKY PCR

Aplikace PCR a využití v praxi

KRIMINALISTIKAVNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT

Page 35: TECHNIKY PCR

Aplikace PCR a využití v praxi

ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného

původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství

průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu)

identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin.

skot ovce prase koza TEST

EVOLUČNÍ BIOLOGIEORNITOLOGIE