การโคลนและการแสดงออกของยน mpdB ทเกยวของกบการยอยยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออนโดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน

โดย นายเมธส สวนจนทร

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2556 ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

การโคลนและการแสดงออกของยน mpdB ทเกยวของกบการยอยยาฆาแมลงเมทธล พาราไธออนโดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน

โดย นายเมธส สวนจนทร

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2556

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

CLONING AND EXPRESSION OF mpdB GENE RESPONSIBLE FOR METHYL PARATHION DEGRADATION USING A VECTOR DESIGNED FOR PROTEIN

SECRETION

By Mr. Mathus Suanjan

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree Master of Science Program in Biotechnology

Department of Biotechnology Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2013

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

สำนกหอ

สมดกลาง

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “การโคลนและการแสดงออกของยน mpdB ทเกยวของกบการยอยยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออนโดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน” เสนอโดย นายเมธส สวนจนทร เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

……........................................................... (รองศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ) คณบดบณฑตวทยาลย

วนท..........เดอน.................... พ.ศ........... อาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1. ผชวยศาสตราจารย ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ 2. ผชวยศาสตราจารย ดร.บษราภรณ งามปญญา 3. อาจารย ดร.รจกาญจน นาสนท คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ .................................................... ประธานกรรมการ (อาจารย ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ (อาจารย ดร.อญชรา วบลยจนทร) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.บษราภรณ งามปญญา) ............/......................../..............

.................................................... กรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ) ............/......................../.............. .................................................... กรรมการ (อาจารย ดร.รจกาญจน นาสนท) ............/......................../..............

สำนกหอ

สมดกลาง

ง

53401208 : สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ ค าส าคญ : เมทธลพาราไธออนไฮโดรเลส/ยน mpdB/การหลงเอนไซมออกนอกเซลล เมธส สวนจนทร : การโคลนและการแสดงออกของยน mpdB ทเกยวของกบการยอย ยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออน โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน.อาจารยทปรกษาวทยานพนธ : ผศ.ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ , ผศ.ดร.บษราภรณ งามปญญา และ อ.ดร. รจกาญจน นาสนท. 125 หนา.

ยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออน (methyl parathion; MP) จดเปนสารทมความเปนพษสงเปนอนตรายตอมนษยและสงแวดลอม ในประเทศไทยมการคนพบเชอ Burkholderia cepacia ทสามารถผลตเอนไซมเมธลพาราไธออนไฮโดรเลส (methyl parathion hydrolase; MPH) โดยไดมการโคลนยน mpdB และท าการแสดงออกใน E. coli แตอยางไรกตามการไดมาซงเอนไซมท าไดยาก เนองจากขอเสยบางประการของการผลตเอนไซมภายในเซลล เชน เอนไซมทไดจะอยในรปของโปรตนทไมละลายน า และยงตองการกระบวนการในการแตกเซลล ซงเปนวธการทยงยากซบซอน ดงนนงานวจยนจงมความสนใจทจะศกษาการผลตเอนไซม MPH โดยการหลงออกส periplasmic space หรอสอาหารเลยงเชอ โดยท าการโคลนยน mpdB เขาสพลาสมด pHisFlag-1 ซงเปนพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตนออกส periplasmic space ทมการเตมล าดบนวคลโอไทดทสราง polyhistidine ซงจะชวยใหงายตอการแยกบรสทธโปรตน และการแสดงออกใน E. coli จากการทดสอบกจกรรมของเอนไซม MPH โดยวธ microtiter plate MPH assay พบวารคอมบแนนทโคลนทไดมการแสดงออกและผลตเอนไซม MPH ทสามารถยอยสลาย MP ไดเปนสเหลองของพาราไนโตรฟนอล (p-nitrophenol; PNP) ท าการตรวจสอบความสามารถในการแสดงออกของเอนไซม MPH ทหลงออกนอกเซลล โดยทดสอบบนอาหารแขง MP agar ทม MP พบวาปรากฏสเหลองของ PNP รอบๆ โคโลน (yellow halo) ของรคอมบแนนทโคลน แสดงใหเหนวา รคอมบแนนทโคลนทไดมความสามารถในการผลตเอนไซม MPH ใหหลงออกนอกเซลล เอนไซม MPH ทไดจากสวนของ periplasmic space และอาหารเลยงเชอ ถกท าใหบรสทธโดยใช cobalt column พบวาเอนไซมบรสทธทไดมคา specific activity เทากบ 9.03 และ 3.44 U/mg ตามล าดบ และมขนาดประมาณ 36 kDa ซงเปนขนาดของเอนไซม MPH ทมขนาดประมาณ 35 kDa รวมอยกบ polyhistidine-tag ทมขนาดประมาณ 0.84 kDa จากการวเคราะหดวย zymogram analysis ปรากฏแถบสเหลองของ PNP ทต าแหนงของแถบโปรตนขนาด 36 kDa จงยนยนไดวาแถบโปรตนนนเปน MPH จรง

ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2556 ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1. ....................... 2. ....................... 3. .......................

สำนกหอ

สมดกลาง

จ

53401208 : MAJOR : BIOTECHNOLOGY KEY WORD : METHYL PARATHION HYDROLASE/mpdB GENE/ PERIPLAMIC SECRETION MATHUS SUANJAN : CLONING AND EXPRESSION OF mpdB GENE RESPONSIBLE FOR METHYL PARATHION DEGRADATION USING A VECTOR DESIGNED FOR PROTEIN SECRETION. THESIS ADVISORS : ASST.PROF.JESDAWAN WICHITWECHKARN,Ph.D.,ASST.PROF.BUDSARAPRON NGAMPANYA,Ph.D.,AND RUJIKAN NASANIT,Ph.D. 125 pp.

Methyl parathion (MP) pesticide widely used in many developing countries is highly toxic, imposing threats to human health and environment. The MP-degrading Burkholderia cepacia indigenous to Thailand have been reported to produce methyl parathion hydrolase (MPH), an enzyme capable of degrading this insecticide. Its gene, mpdB, was previously cloned in E. coli, and the expression, purification and characterization of the recombinant MPH were performed. However, because of some difficulties and disadvantages of intracellular enzyme production such as protein insolubility and complicated cell lysis, this research then aims at an attempt to secrete MPH into either periplasmic space or culture medium. This was done by subcloning the mpdB gene into E. coli using expression vector pHisFlag-1, a vector designed for periplasmic expression. The coding sequence for polyhistidines added to its C-terminus would allow easier purification by metal affinity column. Using microtiter plate MPH assay, the recombinant clone was shown to produce MPH with enzymatic activity for degrading MP to the yellow-colored hydrolytic product, p-nitrophenol (PNP). The expressed enzyme was observed as yellow halo around the colony on MP agar plate assay, indicating the secretion of MPH. The recombinant MPH, as a polyhistidine C-terminal fusion protein, were separated from periplasmic fraction and culture medium fractions and purified by cobalt column. The specific activities of these purified proteins are 9.03 and 3.44 U/mg protein, respectively. The purified recombinant MPH was shown to have the molecular weight of about 36 kDa, corresponding to the 35 kDa of MPH and 0.84 kDa of polyhistidine-tag. The zymogram analysis revealed yellow color at the position of the 36-kDa protein band, confirming that the band was MPH.

Department of Biotechnology Graduate School, Silpakorn University Student's signature ........................................ Academic Year 2013 Thesis Advisors' signature 1. ....................... 2. ....................... 3. .......................

สำนกหอ

สมดกลาง

ฉ

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบนส าเรจไดดวยความกรณาอยางยงของ ผศ.ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ อาจารย ทปรกษาวทยานพนธหลก ผศ.ดร.บษราภรณ งามปญญา และอ .ดร.รจกาญจน นาสนท อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม ทไดใหความร ค าปรกษา ขอแนะน าตางๆ และชวยเหลอในการวางแผนการวจย ตลอดจนใหค าแนะน าในการแกปญหาในการท าวจย จนกระทงส าเรจลลวงไปไดดวยด พรอมทงตรวจทานแกไขวทยานพนธฉบบนใหถกตองจนเสรจสมบรณ ผวจยขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ โอกาสน

ขอกราบขอบพระคณ อ.ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม และอ.ดร.อญชรา วบลยจนทร ทใหความกรณาเปนคณะกรรมการในการสอบวทยานพนธ พรอมทงใหค าปรกษาและขอเสนอแนะเพมเตมในการวจย ตลอดจนแกไขปรบปรงวทยานพนธฉบบนใหถกตองและสมบรณมากยงขน

ขอกราบขอบพระคณคณาจารยประจ าภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากรทกทาน ทมอบวชาความรทเปนพนฐานในการน ามาประยกตใชในการศกษาวจยในครงนเปนอยางมาก

ขอกราบขอบพระคณ รศ.ดร.มณฑารพ ยมาภย สาขาเทคโนโลยชวภาพ ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ทใหความอนเคราะหพลาสมด pHisFlag-1

ขอกราบขอบพระคณ ผศ.ดร.ส เชษฐ สมหเสนโต หวหนาภาควชาเทคโนโลยอาหาร คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม และ ผศ.ดร.เอกพนธ บางยขน หวหนาภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร ทใหความอนเคราะหในการใชเครองมอ ตลอดจนนกวทยาศาสตรและเจาหนาททกทานทอ านวยความสะดวกในการใชเครองมอของภาควชาตอการศกษาวจยในครงนเปนอยางด

ขอขอบพระคณนกวทยาศาสตร และเจาหนาทภาควชาเทคโนโลยชวภาพทกทานทใหความสะดวกในการด าเนนการดานเอกสารตางๆ และใหความชวยเหลอในดานเครองมอ อปกรณ และสารเคมตลอดการวจย ครงน

ขอขอบพระคณส านกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต (วช.) โครงการทนอดหนนการวจย ประเภทบณฑตศกษา ประจ าปงบประมาณ 2556, ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ และบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ทไดใหทนสนบสนนในการท าวจยครงน

ขอบคณพๆ เพอนๆ และนองๆ นกศกษาปรญญาโททกคน รวมทงเพอนๆ ทใหความชวยเหลอและค าแนะน าในหลายๆ เรองทเปนประโยชนตอการท าวจยน รวมทงนองๆ ในหองแลบทกคนทท าใหเกดบรรยากาศทดในการท างานวจย

และทส าคญยงขอกราบขอบพระคณ คณพอ คณแม พสาว และทกคนในครอบครว ส าหรบก าลงใจ ซงเปนสงทเปนพลงผลกดนในการท าวจย รวมทงความชวยเหลอในดานตางๆ ตลอดการท าวทยานพนธจนส าเรจลลวงไดดวยด

ประโยชนและประสบการณทไดรบจากการศกษาวจยในครงน ผวจยจะน าไปประยกตใชในการด าเนนชวต และการท างานโดยเตมก าลงความร ความสามารถ เพอใหกอประโยชนสงสดท งตอตนเอง สงคม และประเทศชาตตอไป

สำนกหอ

สมดกลาง

ช

สารบญ หนา บทคดยอภาษาไทย .................................................................................................................... ง บทคดยอภาษาองกฤษ ............................................................................................................... จ กตตกรรมประกาศ ..................................................................................................................... ฉ สารบญตาราง ............................................................................................................................ ฌ สารบญภาพ ............................................................................................................................... ญ บทท 1 บทน า .............................................................................................................................. 1 ความส าคญและทมาของปญหา .............................................................................. 1 วตถประสงค ........................................................................................................... 2 ขอบเขตงานวจย ...................................................................................................... 3 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ ..................................................................................... 3 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ ....................................................................................... 4 ยาฆาแมลงประเภทออรกาโนฟอสเฟต ................................................................... 4 เมทธลพาราไธออน ................................................................................................. 19

เชอ Burkholderia cepacia ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP ............................. 34 รายงานการวจยทเกยวของ ...................................................................................... 35 3 วธด าเนนการวจย ............................................................................................................ 42 เชอแบคทเรยทใชในการวจย .................................................................................. 42 ดเอนเอพาหะทใชในการวจย .................................................................................. 43 ไพรเมอรทใชในการวจย ......................................................................................... 47 ดเอนเอมาตรฐาน .................................................................................................... 47 โปรตนมาตรฐาน .................................................................................................... 47 เอนไซมทใชในการวจย .......................................................................................... 47 ชดทดสอบส าเรจรป ................................................................................................ 47 คอลมนส าหรบท าบรสทธ ...................................................................................... 48

สำนกหอ

สมดกลาง

ซ

บทท หนา สารเคม ........................................................................................................................... 48 เครองมอ ......................................................................................................................... 50 อปกรณอนๆ ................................................................................................................... 51 วธด าเนนการวจย ............................................................................................................ 52

การสรางรคอมบแนนทโคลนทมยน mpdB โดยใชพาหะทออกแบบ เพอการหลงโปรตน ................................................................................................ 52

การแสดงออกของเอนไซม MPH ........................................................................... 63 การสกดเอนไซม MPH จากสวนตางๆ ของเซลล ................................................... 64 การแยกบรสทธรคอมบแนนทเอนไซม MPH ........................................................ 65 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis ... 67 การวเคราะหโปรตนดวยเทคนค Zymogram .......................................................... 68 การหาคาปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford Protein Assay ....................................... 69

การหาคากจกรรม (Activity) ของเอนไซม MPH ดวยวธสเปกโทรโฟโตเมทร ...... 69 4 ผลและวจารณผลการทดลอง .......................................................................................... 71

การสรางรคอมบแนนทโคลนทมยน mpdB โดยใชพาหะทออกแบบ เพอการหลงโปรตน ................................................................................................ 71

การแสดงออกและแยกบรสทธเอนไซม MPH ........................................................ 83 5 สรปผลการวจย ............................................................................................................... 92 รายการอางอง ............................................................................................................................ 94 ภาคผนวก .................................................................................................................................. 101 ภาคผนวก ก ............................................................................................................... 102 ภาคผนวก ข ............................................................................................................... 107 ภาคผนวก ค ............................................................................................................... 115 ภาคผนวก ง ................................................................................................................ 122 ประวตผวจย .............................................................................................................................. 124

สำนกหอ

สมดกลาง

ฌ

สารบญตาราง ตารางท หนา 1 ระดบอนตรายของยาฆาแมลงประเภท OP ................................................................ 6 2 รายชอสารก าจดแมลงน าเขาในป พ.ศ. 2530 ทมปรมาณสงสด 10 ชนดแรก ........... 15 3 ระดบสารพษตกคางประเภท OP ในดนเปน ppm (mg/kg) จากแหลงเกษตรกรรม

ทวประเทศ ส ารวจและวเคราะหผลระหวางป พ.ศ. 2530-2531 ........................ 16 4 ระดบสารพษตกคางประเภท OP ในน าจากแหลงน าทวไป และแหลงเกษตรกรรม

เปน ppb (µg/l) ส ารวจและวเคราะหผลระหวางป พ.ศ. 2530-2531 .................. 17 5 ชนดของจลนทรยทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงได ................................................. 27 6 จ านวนตวอยางของผกและผลไมทตรวจพบสารพษตกคาง ....................................... 29 7 ชนดและปรมาณของสารพษตกคางทตรวจพบในผกและผลไม ............................... 30 8 วตถอนตรายทหามใช ตามประกาศกระทรวงอตสาหกรรม เรอง บญชรายชอ

วตถอนตราย (ฉบบท 2) พ.ศ. 2547 มผลบงคบใชเมอวนท 19 ตลาคม 2547 จ านวน 2 ชนด .................................................................................................... 32

9 รายชอชนดพช ประเทศและเชอจลนทรย หรอสงอนใดทเปนอนตรายตอสขภาพ ของมนษย ตามประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ เรอง ก าหนดพช เปนพชควบคมเฉพาะ พ.ศ. 2556 ........................................................................ 33

10 เชอแบคทเรยทใชเปนเซลลเจาบาน เพอเพมปรมาณพลาสมด และท าการแสดงออกของยน mpdB .................................................................... 42

11 ไพรเมอรทใชในการวจย ........................................................................................... 47 12 การแยกบรสทธเอนไซม MPH ในสวนของอาหารเลยงเชอ ...................................... 86 13 การแยกบรสทธเอนไซม MPH ในสวนของเพอรพลาสซม ....................................... 87 14 อตราสวนของสารในการเตรยม phosphate buffer .................................................... 111 15 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ PNP กบคาการดดกลนแสงท

ความยาวคลนท 410 นาโนเมตร ......................................................................... 116 16 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ BSA กบคาการดดกลนแสงท

ความยาวคลนท 595 นาโนเมตร ......................................................................... 118 17 ความสมพนธระหวางคา log น าหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบคา Rf .......... 119

สำนกหอ

สมดกลาง

ญ

สารบญภาพ ภาพท หนา 1 สตรโครงสรางทวไปของยาฆาแมลงประเภท OP ..................................................... 4 2 ตวอยางสตรโครงสรางของยาฆาแมลงประเภท OP .................................................. 6 3 การเปลยนแปลงสตรโครงสรางของยาฆาแมลงฟอสฟอโรไธโอเนทส

เปนสารในรปทออกฤทธ (ฟอสเฟต) .................................................................. 8 4 การสลายตวของยาฆาแมลง ฟอสฟามดอน และไดเมโธเอท ..................................... 9 5 การสลายตวของยาฆาแมลงโฟเรต ............................................................................ 10 6 ปฏกรยาการเปลยนแปลงยาฆาแมลงพาราไธออน .................................................... 10 7 การยบย งการท างานของเอนไซมเอสเทอเรสโดยสารประกอบ OP ........................... 13 8 การใชทดนในประเทศไทย ป 2553 ........................................................................... 14 9 สตรโครงสรางของ MP ............................................................................................. 19 10 กระบวนการเมตาบอลซมของ MP ในสตวเลยงลกดวยนม ....................................... 21 11 proposed pathways ของ MP ในจลนทรยโดยทวไป ................................................. 24 12 การกระตน (activation) ของ MP ใหเปลยนเปน active metabolite

ซงออกฤทธโดยการจบกบเอนไซม acetylcholinesterase และยบย ง การท างานของเอนไซม ...................................................................................... 26

13 องคประกอบของ signal peptide sequence ซงประกอบดวย N- H- และ C-domain ........................................................................................ 39

14 recombinant protein ทหลงออกนอกเซลลโดยอาศย type II mechanism และ วธการในการหลง recombinant proteins ออกจาก periplasmic space ................ 40

15 แผนภาพโครงสรางของดเอนเอพาหะ pTA2 ............................................................. 44 16 ล าดบนวคลโอไทดบรเวณ multiple cloning site (MCS)

ของดเอนเอพาหะ pTA2 ..................................................................................... 44 17 แผนภาพโครงสรางของดเอนเอพาหะ pFlag-CTS .................................................... 45 18 ต าแหนงของลกษณะพเศษของดเอนเอพาหะ pFlag-CTS ......................................... 45 19 แผนภาพโครงสรางของดเอนเอพาหะ pHisFlag-1 .................................................... 46 20 ล าดบนวคลโอไทดของเชอแบคทเรย Plesiomonas sp. สายพนธ M6

(accession number: AF338729) ......................................................................... 55 21 ชนสวนดเอนเอของยน mpdB ทไดจากการเพมจ านวนโดยวธพซอาร ...................... 72

สำนกหอ

สมดกลาง

ฎ

ภาพท หนา 22 แผนภาพการโคลนยน mpdB พลาสมด pTA2 ........................................................... 73 23 การวเคราะหรคอมบแนนทดเอนเอดวยวธ restriction analysis ของรคอมบแนนท

พลาสมด pTA2 ทมยน mpdB โดยการตดดวยเอนไซม EcoRI, XhoI และ KpnI ............................................................................................................ 74

24 การแยกบรสทธชนยน mpdB ทผานการตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI จากเจลอะกาโรสโดยวธส าเรจรป E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit ..................... 75

25 การแยกบรสทธพลาสมด pHisFlag-1 ทผานการตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI จากเจลอะกาโรสโดยวธส าเรจรป E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit ..................... 76

26 แผนภาพรคอมบแนนทพลาสมด pHF1 (พลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB) .......... 77 27 แผนภาพการโคลนยน mpdB พลาสมด pHisFlag-1 .................................................. 78 28 การทดสอบกจกรรมของเอนไซม MPH ในการคดเลอกทรานสฟอรแมนท

โดยวธ microtiter plate MPH assay .................................................................... 79 29 การวเคราะหรคอมบแนนทดเอนเอดวยวธ restriction analysis ของรคอมบแนนท

พลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB โดยการตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI ............................................................................................................ 80

30 การเปรยบเทยบความเหมอนของล าดบนวคลโอไทดของยน mpdB จากรคอมบแนนทโคลนทท าการคดเลอกไดกบล าดบนวคลโอไทดจาก เชอ Burkholderia cepacia .................................................................................. 81

31 การทดสอบกจกรรมของเอนไซม MPH บน MP agar plate ...................................... 82 32 ปรมาณเอนไซม MPH ในสวนตางๆ ของเซลล ......................................................... 84 33 แผนผงขนตอนการแยกบรสทธเอนไซม MPH จากอาหารเลยงเชอ

โดยใชคอลมน HisPure cobalt column .............................................................. 85 34 แผนผงขนตอนการแยกบรสทธเอนไซม MPH จากเพอรพลาสซม

โดยใชคอลมน HisPure cobalt column .............................................................. 86 35 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE ในสวนอาหารเลยงเชอ

ของโปรตนในแตละขนตอนของการแยกบรสทธเอนไซม โดยใช HisPure cobalt spin column ................................................................... 89

สำนกหอ

สมดกลาง

ฏ

ภาพท หนา 36 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE ในสวนเพอรพลาสซม

ของโปรตนในแตละขนตอนของการแยกบรสทธเอนไซม โดยใช HisPure cobalt spin column ................................................................... 89

37 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE และเทคนค zymogram analysis ในสวนของอาหารเลยงเชอโดยใช HisPure cobalt spin column ....................... 90

38 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE และเทคนค zymogram analysis ในสวนของเพอรพลาสซม โดยใช HisPure cobalt column ................................ 91

39 กราฟมาตรฐานของ PNP ........................................................................................... 117 40 กราฟมาตรฐานของ BSA โดยการวเคราะหดวยวธ Bradford method ....................... 118 41 กราฟแสดงความสมพนธระหวางน าหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐาน

กบการเคลอนทสมพทธ (Rf) ใน 12 เปอรเซนต SDS-PAGE ............................. 120

สำนกหอ

สมดกลาง

1

บทท 1

บทน า

ความส าคญและทมาของปญหา ปจจบนทวโลกไดใหความส าคญกบความปลอดภยดานอาหารเปนอยางมาก ประเทศไทย ซงอยภายใตระบบเกษตรเชงพาณชย ทเนนการสงออกไปยงตางประเทศจงจ าเปนตองเตรยมความพรอมทจะปฏบตตามกฎเกณฑดานการผลตสนคาใหไดมาตรฐานและคณภาพเปนทยอมรบในระดบสากล อยางไรกตามในชวงหลายสบปทผานมา ยาฆาแมลงในกลมออรกาโนฟอสเฟต (organophosphate; OP) ไดแก เมทธลพาราไธออน (methyl parathion; MP) ไดถกน ามาใชอยางกวางขวางในบรเวณทเปนแหลงเกษตรกรรมของไทย โดยใชเปนยาฆาแมลง (insecticide) ยาฆาเชอรา (fungicides) และสารก าจดศตรพช (pesticide) ซงการใชสารเหลานในภาคเกษตรกรรมมปรมาณมากขนอยางตอเนอง จงสงผลใหสารพษเหลานตกคางในสงแวดลอมทงแหลงดน แหลงน า และ ในผลตผลทางการเกษตร ซงจะสงผลกระทบตอเศรษฐกจและการสงออกสนคาเกษตรของไทย (Konstantinou และคณะ, 2006; Siddavattam และคณะ, 2006; Yang และคณะ, 2008) ดงนนจงจ าเปนตองมการตรวจสอบผลตผลและผลตภณฑเกษตรใหมคณภาพตามมาตรฐานสากล ซงวธการก าจด และ/หรอ ตรวจสอบการตกคางของยาฆาแมลงในกลมน โดยวธทางชวภาพเปนวธหนงทมประสทธภาพสง งาย ราคาถก และมความปลอดภยสงเมอเทยบกบวธทางเคม ในประเทศไทยมการคนพบเชอ Burkholderia cepacia ทไดจากการคดแยก (isolation) จากดน ซงมยน mpdB ทสามารถผลตเอนไซมเมทธลพาราไธออนไฮโดรเลส (methyl parathion hydrolase; MPH) (Keprasertsup และคณะ, 2001) โดยไดมการโคลนยน mpdB เขาสพลาสมด pGEX-6P-1 และท าการแสดงออกใน E. coli ซงเอนไซม MPH ทไดนถกน ามาศกษาตอเพอการประยกตใชในการตรวจสอบการตกคางของยาฆาแมลงในกลมน เชน น ามาสรางเปนไบโอเซนเซอรส าหรบตรวจวดยาฆาแมลงในกลม OP ทมความจ าเพาะสง (Wongthianlai และคณะ, 2007; Anh และคณะ, 2011; Ekkhunnatham และคณะ, 2010; Ekkhunnatham และคณะ, 2012) แตอยางไรกตามการไดมาซงเอนไซมท าไดยาก เนองจากการผลตเอนไซมภายในเซลล (intracellular production) จะท าใหเอนไซมทไดอยในรปของโปรตนทไมละลายน า (inclusion body) หรอเอนไซมอาจถกยอยสลายโดยเอนไซม protease และยงตองการกระบวนการในการแตกเซลล (cell lysis) ซงเปนวธการทยงยากซบซอน รวมท ง

สำนกหอ

สมดกลาง

2

เสยคาใชจายในการท าใหเสยสภาพของโปรตน (denaturation) และกระบวนการ refold โปรตนกอนการท าบรสทธ (Suppaluknaree และคณะ, 2007) ดงนนผลผลตสดทายทไดจากการท าบรสทธจงมปรมาณทต า (Ekkhunnatham และคณะ, 2012) มหลายเทคนคทพฒนาเพอแกไขปญหาเหลานโดยเทคนคหนง ไดแก การหลงโปรตนออกส periplasmic space หรออาหารเลยงเชอ (culture medium) (Yoon และคณะ, 2010) งานวจยนจงไดท าการศกษาเพอแกไขปญหาดงกลาวขางตน โดยการผลตรคอมบแนนทเอนไซม MPH ใหหลงโปรตนออกนอกเซลลของ E. coli ซงการหลงของโปรตนออกนอกเซลลนจะอาศยการท างานของ signal peptide (Choi and Lee, 2004; Mergulhao และคณะ, 2005; Yoon และคณะ, 2010) ขอดของกระบวนการนคอ รคอมบแนนทเอนไซมทไดจะมผลผลต และมกจกรรมของเอนไซม (activity) ทสง มความเสถยร (stability) สง มการละลาย (solubility) ทด และมปรมาณผลผลตทสง รวมทงงายตอการท าบรสทธเนองจากใน periplasmic space มโปรตนชนดอนๆ ทปนเปอนอยต า อกทงภายใน periplasmic space จะพบ protease activity ต ากวาไซโตพลาสซมมาก (Choi and Lee, 2004; Yamabhai และคณะ, 2008) แตอยางไรกตามยงไมมการศกษาทเกยวของกบการผลตและการหลงเอนไซม MPH ออกนอกเซลลในระบบการแสดงออกของ E. coli เทาใดนก ดงนนงานวจยนจงไดท าการศกษาการโคลนและการแสดงออกของยน mpdB จากเชอ Burkholderia cepacia ใน E. coli เพอใหเกดการหลงของเอนไซม MPH ออกนอกเซลล ซงจะสามารถน ามาใชเปนแหลงในการผลตเอนไซม MPH ทมประสทธภาพสง งายตอการน าไปใช และชวยลดตนทนในการผลตเอนไซมนได เพอประโยชนในการน าเอนไซมทไดจากงานวจยมาพฒนาตอยอดเปนนวตกรรมและผลตภณฑทจะชวยตรวจสอบ หรอก าจด/ลดการปนเปอนของยาฆาแมลงในกลมน ในแหลงทรพยากรดนและน าใหอยในสภาพสมดลเปนการรกษาสภาพแวดลอมใหเกดความยงยนตอไปในอนาคต และเปนการเพมคณภาพผลผลตทางการเกษตรใหมมาตรฐานเพยงพอในการสงออก ซงจะกอใหเกดความปลอดภยอาหารดานพช และเปนการเพมมลคาสนคาเกษตรไดอกดวย

วตถประสงค 1. เพอท าการโคลนยนเมทธลพาราไธออนไฮโดรเลส (mpdB gene) ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออน (MP) โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตนได

2. เพอศกษาการผลตและแยกบรสทธเอนไซมเมทธลพาราไธออนไฮโดรเลส (MPH) ทเกดจากการแสดงออกของโคลน mpd ลกผสม

สำนกหอ

สมดกลาง

3

ขอบเขตงานวจย 1. ศกษาการโคลนยนยอยสลายเมทธลพาราไธออน (mpdB gene) ใน E. coli โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน 2. ศกษาการแสดงออกและการหลงเอนไซมเมทธลพาราไธออนไฮโดรเลส ออกนอกเซลลใน E. coli 3. ศกษาการผลตและแยกบรสทธเอนไซมเมทธลพาราไธออนไฮโดรเลส จากโคลน mpdB ลกผสม ประโยชนทคาดวาจะไดรบ นกวจยสามารถผลตเชอทไดรบการถายโอนโคลน mpdB ลกผสม โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงเอนไซม MPH และสามารถผลตและหลงเอนไซม MPH จากโคลน mpdB ลกผสม ซงงายตอการท าบรสทธ มการละลาย (solubility) ทด และมกจกรรมของเอนไซมทสงได

หากสามารถโคลนยน mpdB น ซงมคณสมบตในการยอยสลายยาฆาแมลงในกลม OP และสามารถท าใหเอนไซม MPH ทผลตจากยน mpdB หลงออกมาจากโคลน กจะน ามาใชเปนแหลงในการผลตเอนไซม MPH ทมประสทธภาพสง งายตอการน าไปใช และชวยลดตนทนในการผลตเอนไซมนได กจะเปนความส าเรจทส าคญ ซงท าใหงายตอการน าไปประยกตใชในการก าจด และ/หรอ ตรวจสอบการตกคางของยาฆาแมลงในกลมนทปนเปอนอยในแหลงทรพยากรดนและน าใหอยในสภาพสมดลเปนการรกษาสภาพแวดลอมใหเกดความยงยนตอไปในอนาคต และเปนการเพมคณภาพผลผลตทางการเกษตรใหเปนไปตามมาตรฐานการสงออก อนเปนการเพมมลคาผลตผลทางดานการเกษตรอกทางหนงดวย

สำนกหอ

สมดกลาง

4

บทท 2

เอกสารและงานวจยทเกยวของ

1. ยาฆาแมลงประเภทออรกาโนฟอสเฟต (Organophosphate Insecticides) ออรกาโนฟอสเฟต (organophosphate; OP) เปนยาฆาแมลงทนยมใชกนอยางแพรหลายในประเทศเกษตรกรรม โดยเปนยาฆาแมลงกลมใหญทสดทใชในปจจบน แทนทยาฆาแมลงประเภทออรกาโนคลอรน (organochlorine insecticides) เนองจากมความสามารถในการฆาแมลงไดอยางกวางขวางมากกวายาฆาแมลงประเภทออรกาโนคลอรน และไมมความคงทน อยางไรกตามยาฆาแมลงประเภทนมความเปนพษตอมนษยและสตวมกระดกสนหลงสงกวายาฆาแมลงประเภทออรกาโนคลอรน และเมอเปรยบเทยบปญหาการเกดภาวะเปนพษจากสารเคมทางการเกษตรแลว OP จดเปนสาเหตอนดบตนๆ ของปญหาดงกลาว ทงยงเปนปญหาทพบบอยและเปนสาเหตทมอตราการตายสง (ดพรอม ไชยวงศเกยรต, 2527 และ Perry และคณะ,1998)

1.1 สตรโครงสรางของยาฆาแมลงประเภท OP ยาฆาแมลงประเภท OP มสารอนทรยทมฟอสฟอรสเปนองคประกอบส าคญ

โดยมสตรโครงสรางทวไป (general structure) ดงน

ภาพท 1 สตรโครงสรางทวไปของยาฆาแมลงประเภท OP ทมา: http://www.ams.ac.ir/AIM/08111/0015.html

สำนกหอ

สมดกลาง

5

1.2 คณสมบตของสาร OP ซงจะมฤทธฆาแมลงได จากสตรโครงสรางในภาพท 1 สามารถอธบายถงคณสมบตของสาร OP ทจะมฤทธเปน

ยาฆาแมลงได ดงน 1.2.1 ซลเฟอรหรอออกซเจนตองเชอมโดยตรงกบฟอสฟอรส ซงมวาเลนซเปนหา

(pentavalent phosphorus) 1.2.2 R1 และ R2 ตองเปนกลมอลคอกซ (alkoxy), อลคล (alkyl) หรอ อะมโน (amino) 1.2.3 X คอ กลมเอซล (acyl) ตองเปนกลมทมประจลบในกรดอนทรย หรออนนทรย เชน

ฟลโอรน (fluorine), ไซยาเนท (cyanate), ไธโอไซยาเนท (thiocyanate) หรอตองเปนสวนหนงของกรด เชน สวนอนอล (enol), เมอแคบโต (mercapto) เปนตน

1.3 ประเภทของยาฆาแมลงประเภท OP ยาฆาแมลงประเภท OP แบงไดเปน 2 กลม ไดแก 1.3.1 กลมไดเมททอกซ (dimethoxy) ยาฆาแมลงประเภท OP กลมน เปนสารแปร

(derivative) ไดโดยงายของกรดฟอสฟอรกทประกอบดวยโซคารบอนส นๆ ตอเนองกนใน ทางตรง โดยมสตรโครงสรางหลกของยาฆาแมลงในกลมน ดงแสดงในรปท 2 (A) ซงไดแก มาลาไธออน (malathion), ไตรคลอรฟอน (trichlorfon), โมโนโครฟอส (monochlophos), คาร-โบฟโนไธออน (carbophenothion), คมาฟอส (coumaphos), ครฟอเมต (crufomate) , ไดคลอรวอส (dichlorvos), เฟนไธออน (fenthion), เมวนฟอส (mevinphos), รอนเนล (runnel) และฟอสฟา- มดอน (phosphamidon) มการน ามาลาไธออนมาใชในครวเรอนและสตวเลยง ไตรคลอรฟอนใชในทางการเกษตรกบพชและการควบคมแมลงวนในฟารม ยาฆาแมลงกลมนมสารดดซมมาก เชน ไดเมโธเอท (dimethoate), ไดโครโตฟอส (dicrotophos), และไดซลโฟตอน (dicylphoton)

1.3.2 กลมไดเอททอกซ (diethoxy) ยาฆาแมลงในกลมนมสตรโครงสรางหลก ดงแสดงในรปท 2 (B) ยาฆาแมลงในกลมนจะมความคงทนสงกวาและมพษตกคางนานกวายาฆาแมลงในกลมไดเมททอกซ ตวอยางยาฆาแมลงในกลมนคอ ดมตอน (demeton), ไดอาซนอน (diazinon), โฟเรต (phorate) และทอพพ (TEPP)

สำนกหอ

สมดกลาง

6

ภาพท 2 ตวอยางสตรโครงสรางของยาฆาแมลงประเภท OP

A ไดเมททอกซ (dimethoxy) B ไดเอททอกซ (diethoxy)

1.4 ระดบอนตรายของยาฆาแมลงประเภท OP

ปจจบนนมการผลตยาฆาแมลงประเภท OP ในรปแบบการคาประมาณ 100 ชนด แบงตามระดบอนตรายโดยใชคาแอลด 50 (LD50) เปนเกณฑ ดงแสดงในตารางท 1 ตารางท 1 ระดบอนตรายของยาฆาแมลงประเภท OP ประเภท ระดบอนตราย คาแอลด 50 ส าหรบหน (mg/kg)

พษทางปาก พษทางผวหนง

ยาผง ยาน า ยาผง ยาน า

Ia

Ib

II

III

อนตรายรายแรงทสด

อนตรายรายแรงสง

อนตรายรายแรงปานกลาง

อนตรายต า

<5

5-50

50-500

>500

<20

20-200

200-2,000

>2,000

<10

10-100

100-1,000

>1,000

<40

40-400

400-4,000

>4,000

ทมา: ดพรอม ไชยวงศเกยรต, 2527

7

ตวอยางของยาฆาแมลงประเภททมอนตรายรายแรงทสด ไดแก 1. ออลลคารบ เชน เทมค 2. เดมตอน เชน ซสตอกซ, ,โซลวเรกซ 3. ไดซลโฟตอน เชน ไดซสตอน, โซลวเรกซ, ไธโอเดมตอน 4. เมวนฟอส เชน ฟอสดรน, ฟนฟอส, ฟอสฟน 5. พาราไธออน เชน โฟลดอล อ 605, พาราดอล, พาราทอกซ 6. ฟอเรท เชน ไธเมท, แกรนนทอกซ 7. ชราดาน หรอ โอเอมพเอ เชน ไดแพค, เพสตอกซ 3, ไซแตม 8. เทพพ เชน ฟอสเวกซ, นฟอส, คลเลกซ 9. ไธโอนาซน เชน ไซเนม, นมาฟอส, ซโนฟอส

ตวอยางของยาฆาแมลงประเภททมอนตรายรายแรงสง ไดแก 1. ออลดรน เชน ออลเดรกซ, ออลไดรท, อโกรดน 2. ไดโครโตฟอส เชน ไบดรน, คารบครอน, เอคตาฟอส 3. คารโบฟโนไธออน เชน ไตรไธออน 4. ไดโคลวอส หรอ ดดวพ เชน แอทการด, เดเดวบ, โนโกส, วาโปนา 5. ดลดรน เชน ดลเดรกซ, ดลไดรท, เอนโดซน 6. เอนดรน เชน ไดรนาฟอก, เอนเดรกซ, เฮกซาดรน 7. เมทธลพาราไธออน เชน อรามล, มาลโซล, โฟลดอล-เอม, เมตาฟอส

ตวอยางของยาฆาแมลงประเภททมอนตรายปานกลาง ไดแก 1. อซนฟอสเมธล เชน เบนไธออน, กซาไธออน, กไธออน 2. บเอชช และ ลนเดน 3. คลอรเดน เชน คลอรเดน, คลอรดลล 4. คมาฟอส เชน โค-ราล, เบยเออร 21/199 5. ไดอารซโนน เชน แอลฟาทอกซ, บาซดน, สเปคตราไซด 6. ไดเมโธเอท เชน ไซกอน, รดไมท โรเกอร 7. เอนโดซลเฟน เชน ไธโอดาน, เบโอสท, โอเนกซ 8. เฟนไธออน เชน เบยโทกซ, เลเบซด, เมอรแคปโตฟอส

8

ตวอยางของยาฆาแมลงประเภททมอนตรายต า ไดแก 1. เทมฟอส เชน อะเบท 2. อราไมท เชน อราไซด 3. คารบารล เชน เซวน, เอส-85 4. คลอโรเบนซเลท เชน อคาราแบน, คอพไมท 5. ดดด 6. ไดโคฟอล เชน เคลเธน 7. มาลาไธออน

(ดพรอม ไชยวงศเกยรต, 2527)

1.5 การเปลยนแปลงสตรโครงสรางของยาฆาแมลงประเภท OP ในพชและสตว ในสตวเลยงลกดวยนม มการเปลยนแปลงสารแปลกปลอมทเขาไปในรางกายโดยท าใหอย

ในรปซงมประจมากขน จงละลายน าไดดขน และถกก าจดออกจากรางกายทางปสสาวะในรปดงกลาว หรอในรปของคอนจเกตส (conjugates) สวนพชมกจะเปลยนแปลงสารแปลกปลอมใหอยในรปซงจะท าปฏกรยากบเพปไทด (peptides) โปรตน หรอคารโบไฮเดรต

การเปลยนแปลงสตรโครงสรางของยาฆาแมลงประเภท OP ในสตวเลยงลกดวยนม การเปลยนแปลงสวนใหญเกดขนทตบ ซงมเอนไซมเอสเทอเรส (esterase) อยเปนจ านวนมาก ปฏกรยาทเกยวของกบการเปลยนแปลงสตรโครงสรางของยาฆาแมลงประเภท OP ทส าคญ ไดแก

1.5.1 ปฏกรยาการเปลยนกลมไธโอโน (thiono) เปนกลมออกโซ (oxo) ซงปฏกรยาการเกดออกซเดชนของซลเฟอรจะเปลยนสารฟอสฟอโรไธโอเนทส (phosphorothionates) เปนฟอสเฟต (phosphate) ปฏกรยาดงกลาวเปนปฏกรยาซงท าใหไดสารมฤทธเกดขนทสวนไมโครโซม (microsome) ของตบโดยม NADPH2 และออกซเจน ดงแสดงในภาพท 3

ภาพท 3 การเปลยนแปลงสตรโครงสรางของยาฆาแมลงฟอสฟอโรไธโอเนทสเปนสารในรปท ออกฤทธ (ฟอสเฟต) ทมา : พาลาภ สงหเสน, 2531

9

1.5.2 ปฏกรยาออกซเดทฟดอลคเลชน (oxidative dealkylation) เปนปฏกรยาซงกลมอลคลเชอมกบไนโตรเจน จะถกก าจดออกโดยปฏกรยาออกซเดทฟดอลคลเลชน เชน การทยาฆาแมลง ไดเมโธเอท (dimethoate) และฟอสฟามดอน (phosphamidon) ดงแสดงในภาพท 4 และยาฆาแมลง

เชน ไดโครโทฟอส (dicrotophos), โอเอมพเอ (OMPA) และเอโซดรน (azodrin®) สลายตวได เอไมดทไมมการแทนท

ภาพท 4 การสลายตวของยาฆาแมลง ฟอสฟามดอน และไดเมโธเอท ทมา: พาลาภ สงหเสน, 2531

1.5.3 ปฏกรยาออกซเดชนของไธโออเธอรส (oxidation of thioethers) เปนปฏกรยาการสลายตวทมความส าคญปฏกรยาหนง ซงเปนการเปลยนยาฆาแมลงประเภท OP ทเปนไธโออเธอรใหเปนสารซลฟอกไซด (sulfoxides) และซลโฟน (sulfones) เชน การสลายตวของยาฆาแมลงโฟเรต (phorate) ดงแสดงในภาพท 5

10

ภาพท 5 การสลายตวของยาฆาแมลงโฟเรต ทมา : พาลาภ สงหเสน, 2531

1.5.4 ปฏกรยารดกชน (reduction) เปนปฏกรยาทเกดขนพรอมๆกบปฏกรยาออกซเดชนของไธโอโนซลเฟอรและปฏกรยาไฮโดรไลซส ตวอยางเชน การเกดปฏกรยารดคชน โดยใชเอนไซมซงเปลยนแปลงกลมไนโตรของพาราไธออน (parathion) เปนกลมอะมโน ดงแสดงในภาพท 6

ภาพท 6 ปฏกรยาการเปลยนแปลงยาฆาแมลงพาราไธออน ทมา : พาลาภ สงหเสน, 2531

11

1.5.5 ปฏกรยาไฮโดรไลซส (hydrolysis) เปนปฏกรยาทเกดรวมกบปฏกรยาการสลายตวอนแทบทกแบบ เอนไซมทใชในปฏกรยานมกเรยกวา ฟอสฟาเทส (phosphatase) หรออาจเรยกตามชอของสารทถกเปลยนแปลง เชน พาราออกซอนเนส (paraoxonase) เปนตน ปฏกรยาไฮโดรไลซสโดยเอนไซม เปนปฏกรยาทส าคญทสดในการท าให OP หมดฤทธ ขณะทในปฏกรยาการเกดพษจะเกดขน เมอกลมฟอสฟอรลถกยายไปใหแกกลมซรนแอลกอฮอล (serine-alcohol group) ในเอนไซมโคลนเอสเทอเรส (cholinesterase) ปฏกรยาทงสองจะแขงขนกน ฤทธของยาฆาแมลง OP จะสงสดเมอยาฆาแมลงเขาสรางกาย และขนสงภายในรางกายในรปทไมไวตอการเกดไฮโดรไลซสทท าใหหมดฤทธ และยาฆาแมลงในรปทถกขนสงควรถกเปลยนแปลงเปนรปทออกฤทธทจดออกฤทธ (site of action)

1.5.6 ปฏกรยาคอนจเกชน (conjugation) เปนปฏกรยาทน าไปสการเกดสารไรพษซงละลายน าได และจะถกก าจดออกจากสตวหรอสะสมไวในพช

1.6 กลไกการออกฤทธของยาฆาแมลงประเภท OP ระบบประสาทโดยสงเขปของสตวเลยงลกดวยนม ประกอบดวยระบบประสาทสวนกลาง

(central nervous system) และระบบประสาทสวนปลาย (peripheral nervous system) ระบบประสาทสวนกลางประกอบดวย สมองและไขสนหลง ท าหนาทเปนระบบกลางในการผสมผสาน (integration) โดยใชเซลลประสาทจ านวนลานๆเซลล สวนระบบประสาทสวนปลาย ประกอบดวยระบบยอย คอ ระบบโซมาตค (somatic system) ซงเปนระบบทท าหนาทควบคมการเคลอนไหว โดยมการท างานของกลามเนอสนองตอบการกระตนจากสงแวดลอม และระบบประสาทอตโนมต (autonomic nervous system) ซงควบคมการท างานของกลามเนออวยวะภายในและตอมตางๆ ระบบนถกควบคมโดยระบบยอยสองระบบ ซงออกฤทธตรงขามกน และสงมชวตไมสามารถบงคบได (involuntary) ระบบยอยดงกลาว ไดแก ระบบประสาทซมปาเธตค (sympathetic nervous system) และระบบพาราซมปาเธตค (parasympathetic nervous system) ระบบซมปาเธตค (sympathetic) ประกอบดวยปมประสาท (ganglia) ขนาดใหญตอกนอยนอกระบบประสาทสวนกลาง แบงออกเปนชวงๆ โดยสญญาณจะสงผานชองวางซนแนปสทอยบรเวณปมประสาท (synaptic gaps) โดยสอเคมอะซตลโคลน เสนประสาทในชวงทตอจากสมองสวนกลางมายงปมประสาท ซงเราเรยกวา เสนประสาทแอคซอนกอนปมประสาท (preganglionic axon) เสนประสาทในชวงทตอจากปมประสาทไปยงอวยวะ เชน กลามเนอหรอตอม เราเรยกวาเสน ประสาทแอคซอนหลงปมประสาท (postganglionic axon) ซงสอเคมแอดรนะลน (adrenaline) หรอ นอรแอดรนะลน (noradenaline) เปนสารสอสญญาณสงผานชองวางซนแนปสไปยงกลามเนอหรอตอม (ยกเวนตอมเหงอและตอมแอดรนล (adrenals) ซงใชสอเคมอะซตลคอลน) สวนระบบ

12

พาราซมปาเธตคจะมขนาดของปมประสาทเลกกวา กระจายอยทวไปในสวนตางๆของรางกายสวนมากมกพบทางดานขวาของอวยวะตางๆจงท าใหเสนประสาทแอคซอนหลงปมประสาทส นกวาระบบพาราซมปาเธตคมสารสอประสาททงกอนและหลงปมประสาทเปนอะซตลคอลน ตวอยางการควบคมซงตรงกนขามกบระบบซมปาเธตคและพาราซมปาเธตค เชน ระบบซมปาเธตค ท าใหเกดการเรงการเตนของหวใจ การลดการเคลอนไหวของทางเดนอาหาร การหรมานตา การหยดย งการหลงน าลาย ในขณะทระบบพาราซมปาเธตคท าใหการเตนของหวใจชาลง เพมการเคลอนไหวของทางเดนอาหาร เปนตน ในการทสอเคมอะซตลคอลนจะท าหนาทในการสอสญญาณไดนน สอเคมอะซตลคอลนซงจดทางเคมอยในพวกเอสเทอรจะตองถกยายไปทอน หรอถกท าใหหมดฤทธลงภายในเวลาอน รวดเรวระยะเวลาหนงซงขนอยกบลกษณะเฉพาะของแหลงออกฤทธ ในสวนของเหลวและเนอเยอของรางกาย มเอนไซมซงเรยกวาเอนไซมอะซตลคอลนเอสเทอเรส (acetylcholinesterase หรอ AChE) สามารถไฮโดรไลสอะซตลคอลนใหเปนคอลน และกรดอะซตค พบวาสารซงมฤทธตานเอนไซมอะซตลคอลนเอสเทอเรสเกอบทงหมดออกฤทธโดยการยบย งการท างานของเอนไซมอะซตลคอลนเอสเทอเรสน ยาฆาแมลงประเภท OP จะออกฤทธโดยไปยบย งการท างานของเอนไซมอะซตลคอลน เอสเทอเรส ดงแสดงในภาพท 7 โดยในขนแรก เอนไซมจะจบกบสารประกอบ OP ในรปของสารประกอบเชงซอนทสามารถยอนกลบได (reversible complex) จากนนเอนไซมจะถกฟอสฟอ- รเลท (phosphorylated) แลวปลอยสารประกอบ OP (leaving group) ซงในขนตอนนจะใชระยะเวลานาน และในขนสดทายจะเกดปฏกรยาไฮโดรไลซสไดเอนไซมอะซตลคอลนเอสเทอเรสและฟอสเฟต เนองจากในขนตอนเหลานใชระยะเวลานานในการเกดปฏกรยา ท าใหเกดการสะสมของอะซตลคอลนทซนแนปสของเสนประสาท ดงนนจงท าใหเกดการกระตนปลายประสาทเพมขนอยางมาก ในกรณรนแรงจะท าใหสงมชวตถงแกชวตได

13

ภาพท 7 การยบย งการท างานของเอนไซมเอสเทอเรสโดยสารประกอบ OP ทมา : Perry และคณะ, 1998

1.7 อาการพษของยาฆาแมลงประเภท OP 1.7.1 อาการแบบมสคารนค (muscarinic signs and symptoms) จดรบสมผสมสคารนค

(muscarinic receptors) ส าหรบอะซตลคอลนพบสวนใหญทกลามเนอเรยบ หวใจและตอมมทอ อาการทเกดขนในระยะแรกคอ เบออาหาร คลนไส อาเจยน ทองเดน น าตาไหล เหงอออก มานตาหดตว ถายอจจาระ และปสสาวะโดยกลนไมอย การเกรงของหลอดลม หลอดลมมเมอก และเสมหะมาก เปนตน

1.7.2 อาการแบบนโคตนค (nicotinic signs and symptoms) อาการแบบนเกดขน เนองจากการสะสมของอะซตลคอลนทปลายประสาทมอเตอรและทซนแนปสของระบบประสาทอตโนมต อาการทเกดขนคอ กลามเนอถกกระตนมากกวาปกต มการกระตกของกลามเนอทหนา หนงตา ลน ถาอาการรนแรงขนจะพบวากระตกมากขนทวรางกาย ตอมาจงจะมอาการออนเพลยตามกลามเนอทวไป และเกดเปนอมพาตของกลามเนอในทสด

1.7.3 อาการทางสมอง เนองจากความผดปกตของระบบประสาทสวนกลาง อาการทพบไดแก มนศรษะ ปวดศรษะ งง และกระสบกระสาย ตนตกใจงาย อารมณพลงพลาน ถาอาการมากอาจชกและหมดสตได ผปวยทมอาการรนแรงมากอาจถงตายไดเนองจากระบบหายใจลมเหลว (respiratory failure) ซงอาจเกดขนไดจากหลอดลมตบตน กลามเนอของระบบหายใจเปนอมพาต และศนยการควบคมการหายใจในสมองหยดท างาน ในรายทมอาการไมรนแรงนก อาการจะดขนใน 2-3 วน แตจะออนเพลย ไมมแรงเปนเวลานาน (พาลาภ สงหเสน, 2531)

14

1.8 ผลกระทบของยาฆาแมลงประเภท OP ตอสงแวดลอม ประเทศไทยเปนประเทศเกษตรกรรมมพนททงหมดประมาณ 320.6 ลานไร โดยเมอแบงเนอ

ทการใชทดนออกเปน 3 ประเภทใหญๆ ไดแก 1.เนอทปาไม 2.เนอทถอครองทางการเกษตร และ 3.เนอทนอกการเกษตร โดยในป 2553 ประเทศไทยมเนอทถอครองทางการเกษตรมากทสดกลาวคอเปนเนอทถอครองทางการเกษตรถง 151.9 ลานไร (รอยละ 47.31) รองลงมาคอเนอทปาไม 107.2 ลานไร (รอยละ 33.41) สวนเนอทนอกการเกษตรมจ านวนเพยง 61.5 ลานไร (รอยละ 19.28) ซงเปนประเภททนอยทสด ดงแสดงในภาพท 8

ภาพท 8 การใชทดนในประเทศไทย ป 2553 ทมา: เอกสารสถตการเกษตรของประเทศไทย ป 2554 ส านกงานเศรษฐกจการเกษตร เนองจากประเทศไทยตงอยในเขตศนยสตร ภมอากาศรอนชน ฝนตกชก มความเหมาะสมส าหรบโรคและแมลงทจะแพรขยายพนธไดอยางด ทงชนดและปรมาณ การแกไขปญหาศตรพชทปฏบตกนอยอยางแพรหลายในปจจบนของเกษตรกรคอ การใชสารปองกนและก าจดศตรพชในการปองกนและก าจดโรคแมลง และวชพช ท าใหมแนวโนมการน าเขาสารปองกนก าจดศตรพชสงขนทกป สารก าจดแมลงทนยมใชกนมากในประเทศไทย โดยมปรมาณน าเขาสงสด 10 ชนดแรกในป พ.ศ. 2530 ดงแสดงในตารางท 2

15

ตารางท 2 รายชอสารก าจดแมลงน าเขาในป พ.ศ. 2530 ทมปรมาณสงสด 10 ชนดแรก Type of Insecticide Quantity (kg) Value (B) 1. Methyl parathion 1,538,599 83,927,568

2. Monocrotophos 951,043 96,042,709

3. Methamidophos 417,452 45,273,444

4. Dimethoate 415,650 34,131,532

5. Methomyl 358,296 130,693,483

6. Malathion 309,354 17,965,900

7. Carbaryl 242,150 25,006,268

8. Mevinphos 240,691 18,803,315

9. Carbofuran 204,661 71,077,271

10. Ethyl parathion 174,038 34,131,532

Other (58 types) 1,821,361 207,920,359 Total 6,673,295 764,937,381 ทมา: นวลศร ทยาพชร, 2533

ปญหาเกยวกบสารปองกนก าจดศตรพชตกคางในสงแวดลอมนน มไดเกดขนเฉพาะพนท ทมการใชสารเหลานเทานน แตสามารถแพรกระจายและตกคางในบรเวณกวางได ซงกอใหเกดปญหาสงแวดลอมตามมา เรมจากสารพษตกคางในดนและล าตนพชหลงจากการฉดพน จะเกดการสะสมสวนหนง บางสวนฟ งกระจายในบรรยากาศ และบางสวนซมลงไปในดน สวนใหญจะถก ฝนชะ แลวพดพาไปกบน าหนาดนไหลลงสแหลงน า จากนนจะเกดการถายทอดสารเหลานผาน หวงโซอาหารเขาสสงมชวตตางๆ ตอไป

1.8.1 การแพรกระจายของสารปองกนก าจดศตรพชในดน ในการเพาะปลกพชน น เกษตรกรสวนใหญตองใชสารปองกนก าจดศตรพชท ง

กอนปลก ขณะทพชก าลงเตบโต และกอนการเกบเกยว ดนจงเปนแหลงรองรบสารเหลานโดยตรง นอกจาก นสารปองกนก าจดศตรพชบางชนดยงนยมใชในอาคารบานเรอนดวย ท าใหโอกาสทสารเหลานจะสะสมในดนจงมมากยงขน สารปองกนก าจดศตรพชทตกคางอยในดน อาจมการเปลยนแปลงไปในหลายลกษณะไดแก

16

1.8.1.1 การสลายตวโดยปฏกรยาทางเคม (chemical decomposition) 1.8.1.2 การสลายตวโดยแสง (photodegradation) 1.8.1.3 การสลายตวโดยถกจลนทรยยอยสลาย (microbial degradation) 1.8.1.4 การระเหยจากดนสบรรยากาศ (volatilization) 1.8.1.5 การเคลอนยายไปสแหลงน า (movement by runoff and water-table) 1.8.1.6 การเขาสสงมชวต (plant or organism uptake)

จากการศกษาปรมาณสารตกคางของสารปองกนและก าจดศตรพชในประเทศไทย ตรวจพบสารตกคางในดนอยมากทงชนดและปรมาณ กระจายไปตามดนเกษตรกรรมตางๆ ทวประเทศ ดงแสดงในตารางท 3 ตารางท 3 ระดบสารพษตกคางประเภท OP ในดนเปน ppm (mg/kg) จากแหลงเกษตรกรรมทวประเทศ ส ารวจและวเคราะหผลระหวางป พ.ศ. 2530-2531

Organophosphate

pesticide

No. of positive sample

% of positive sample

concentration (ppm)

Range Average

Dimethoate

Diazinon

Methyl parathion

Malathion Parathion

31

49

59

10

26

10.26

63.64

76.62

12.99

33.77

tr – 0.051

tr – 0.054

tr – 0.475

tr – 0.009

tr – 0.018

0.016

0.010

0.023

0.004

0.005

Total 77 samples; tr = trace (less than 0.001 ppm) ทมา: นวลศร ทยาพชร, 2533

1.8.2 การแพรกระจายของสารปองกนก าจดศตรพชในแหลงน า การปนเปอนของสารปองกนก าจดศตรพชในแหลงน าน น มาจากหลายสาเหตดงตอไปน

1.8.2.1 การฉดพนสารปองกนก าจดศตรพชลงสแหลงน าโดยตรง 1.8.2.2 การกดชะดนของฝนและน าไหลบาหนาดนผานพนททมการใชสารปองกน

ก าจดศตรพชกอนลงสแหลงน า 1.8.2.3 การระบายน าทงจากบานเรอนและโรงงานอตสาหกรรมทใชสารปองกนก าจด

ศตรพชลงสแหลงน า โดยมไดมวธก าจดสารปองกนก าจดศตรพช

17

1.8.2.4 การทงหรอลางภาชนะทบรรจสารปองกนก าจดศตรพชลงสแหลงน า 1.8.2.5 การใชสารปองกนก าจดศตรพชในบรเวณพนทการเกษตรใกลกบแหลงน า

ส าหรบประเทศไทย มการตรวจสอบชนดและปรมาณสารพษตกคางในแหลงน าทวไปและแหลงน าในแปลงเกษตรกรรมทวประเทศ ในป พ.ศ. 2530-2531 จ านวน 149 ตวอยาง พบสารในกลม OP จ านวน 3 ชนด โดยสารในกลมนทพบมากทสดคอ MP ความเขมขน 0.68 ppb ดงแสดงในตารางท 4

นอกจากนยงมการตรวจวเคราะหสารพษตกคางในดนตะกอนจากแหลงน าตางๆ ทวประเทศ จ านวน 71 ตวอยาง ตรวจพบสารตกคางกลม OP 5 ชนด ไดแก ไดเมทโธเอท, ไดอะซนอน, เมทธลพาราไธออน, มาลาไธออน และพาราไธออน ตารางท 4 ระดบสารพษตกคางประเภท OP ในน าจากแหลงน าทวไป และแหลงเกษตรกรรมเปน ppb (µg/l) ส ารวจและวเคราะหผลระหวางป พ.ศ. 2530-2531

Organophosphate pesticide

No. of positive sample

% of positive sample

ppb (g/l)

Range Average Dimethoate

Diazinon

Methyl parathion

Matathion

Parathion

1

4

5

0

0

0.67

2.68

3.36

0

0

tr-0.06

tr-0.28

tr-068

ND

ND

0.06

0.15

ND

ND

ND

Total 149 samples ND = Non detectable tr = trace (less than 0.01 ppb) ทมา : นวลศร ทยาพชร, 2533

1.8.3 การตกคางของสารปองกนก าจดศตรพชในพชอาหาร พชสามารถรบสารปองกนก าจดศตรพชไดหลายทาง เชน การฉดพนลงบนพชโดยตรง

พชอาจดดซมจากดนหรอมากบน า หรอจากสารพษทปลวอยในอากาศ โดยสวนใหญเกษตรกร มกใชสารปองกนก าจดศตรพชเกนความจ าเปน จนเปนอนตรายตอพชหรอเกดการสะสมในพช ท าใหเกดสารตกคางในพช

18

1.8.4 การตกคางของสารปองกนก าจดศตรพชในสตว สาเหตทสตวไดรบสารปองกนก าจดศตรพช เนองจากสตวไดรบสารปองกนก าจด

ศตรพชโดยตรงจากการฉดพน เพอปองกนหรอท าลายแมลงทเปนศตรพช สตวสามารถรบสารเขาสรางกายได 3 ทาง คอ ทางอาหาร ทางการหายใจ และทางผวหนง ปรมาณสารทสตวไดรบเขาไปนนอาจไมมากพอทจะท าอนตรายกบสตว แตกอาจเกดการสะสมในเนอเยอและอวยวะตางๆ ของสตวได

1.8.4.1 สตวไดรบสารปองกนก าจดศตรพชโดยทางออม กลาวคอสตวกนอาหารตามล าดบขนในหวงโซอาหาร ถาผผลตหรอพชมสารพษตกคางอย สตวจะไดรบสารพษและสะสมในรางกายได โดยเฉพาะในสตวน า ทมการปนเปอนของสารปองกนก าจดศตรพชจะสามารถสะสมสารพษไดจากหวงโซอาหารของแหลงน านน ไดมผรายงานถงความเปนพษเฉยบพลนของยาฆาแมลงประเภท OP ตอปลา ไดแก อาการวายน ารวดเรวอยางผดปกต อาการชกกระตก เปนตน ปลาบลกล (bluegill, Lepomis macrochirus) ทไดรบยาฆาแมลงมาลาไธออน จะมลกษณะกางครบจนสดกอนตาย และปลาทไดรบยาฆาแมลงชนดนขนาดต าเพยง 10 ppm เปนเวลานานๆ อาจ ใหก าเนดลกทมความผดปกตทางโครงสรางของกระดกสนหลงได นอกจากนยง พบวายาฆาแมลงประเภท OP มพษตอผงโดยท าใหน าและน าหวานซงเปนอาหารของผงปะปนดวยสารพษ

1.8.4.2 การตกคางของสารปองกนก าจดศตรพชในมนษย มนษยกเชนเดยวกนกบสตวทงหลาย ทสามารถรบสารปองกนก าจดศตรพชได 2 ทาง คอ โดยทางตรงจากการฉดพน ไดแก ผทเกยวของกบสาร เชน เกษตรกร ประชาชนทใชสารเหลานตามบานเรอน หรอคนงานในโรงงานทเกยวของกบสารพษ เมอไดรบสารเขาไปในปรมาณมากพอกจะแสดงอาการพษไดอกทางหนงคอ โดยทางออม จากการกนอาหารหรอดมน าทมสารพษเจอปนอย เชน บรโภคขาว ผก ผลไม เนอสตว ไข เปนตน (พาลาภ สงหเสน, 2531 และนวลศร ทยาพชร, 2533)

19

2. เมทธลพาราไธออน (Methyl Parathion) 2.1 การบงชลกษณะและคณสมบต (Identification and Properties)

เมทธลพาราไธออน (methyl parathion; MP) เปนยาฆาแมลงในกลม OP ชนดหนงมชอทางเคม (chemical name) หลายชอไดแก o,o-dimethyl o-(4-nitrophenyl) ester หรอ o,o-dimethyl o-p-nitrophenyl phosphorothiate หรอ phosphorothioic acid หรอ o,o-dimethyl o-4-nitrophenyl phosphorothiate (IUPAC systematic name) นอกจากนยงมชออนๆ (synonyms) อก เชน alenthione, Bayer E-601, carthion M, demethylfenitrothion dimethyl parathiofolidol-M, malatyr, demethylfenitrothion dimethyl parathion, folidol-M, metacid, methaphos, methylfolidol, nitrox, vofatox และชอทางการคา (trade name) เชน A-Gro, Folidol M, Metacide, Methyl-E 605, Metron, M-Parathion, Nitrox, Paratox, Paridol, Vofatox, Wofatox

สตรโมเลกลของ MP คอ C8H10O5NSP และมสตรโครงสราง ดงแสดงในภาพท 9

ภาพท 9 สตรโครงสรางของ MP ทมา: http://www.pesticideinfo.org/ChemGifs/PC35110.gif

โดย MP ทบรสทธมลกษณะเปนผลกไมมส มน าหนกโมเลกล (molecular weight) 263.22 มจดหลอมเหลว (melting point) ท 35-36 องศาเซลเซยส มจดเดอด (boiling point) ท 160 องศา-เซลเซยส ทความดน 1 มลลเมตรของปรอท สามารถละลายไดดในสารอนทรยทกชนด เสถยร (stability) ในสภาพสารละลายทเปนกลางและกรดทอณหภมปกต แตจะถก hydrolyze โดยดาง และสลายตวเลกนอยท 100 องศาเซลเซยส

20

2.2 กรรมวธการผลตและการน าไปใช (Production Processes and Uses) ในวงการอตสาหกรรม MP ไดจากปฏกรยาของ dimethyl chlorothiophos-phate กบ p-

nitrophenol โดยมตวเรงปฏกรยา คอ hydrogen chloride หรอ sodium p-nitrophenolate ปฏกรยาจะเกดขนในน าในรปของสารทจบตวกบน าและน ามนไดด (emulsifier) ตวอยางเชน ammonium naphthenate หรอ amines หรอสารละลายอนทรย

ซง MP เปนสารก าจดแมลงทใชในทางการเกษตรไดอยางกวางขวางโดยมประสทธภาพสงในการปองกนก าจดศตรพชหลายชนดทงประเภทปากดดหรอปากกด (sucking and biting) โดยเฉพาะ ดวงงวงเจาะสมอฝาย (cotton bollweevil) นอกจากนยงใชก าจดแมลง หมด ไร หนอนผเสอ หนอนกอชนดตางๆ หนอนมวนใบ หนอนกระท หนอนใยผก หนอนคบ หนอนกดกนใบ แมลงชนดทมปากดด ไดแก เพลยชนดตางๆ แมลงชนดอนๆ เชน บว ดวงดด มวนตางๆ และแมลงหวขาว MP ถกน าไปใชในพชสวน สม กาแฟ ชา องน พชไร แตงโม ยาสบ ออย ฝาย สบปะรด ขาว ขาวโพด ขาวฟาง ธญพช สตรอเบอร มนฝรง พชตระกลถวเชน ถวลสง พชผก และไมดอก ไมประดบทวไป (กรมควบคมมลพษ, 2541)

2.3 กระบวนการเมตาบอลซม และการขบถายในสงมชวต (Metabolism and Excretion) สงมชวตสามารถดดซม MP ผานปาก ผวหนง และการหายใจ โดยจะแพรกระจายอยาง

รวดเรวไปตามเนอเยอของรางกาย ซงสามารถตรวจสอบไดภายใน 1-2 ชวโมง หลงจากไดรบสาร การเปลยน MP เปนเมทธลพาราออกซอน (methylparaoxon) เกดขนภายในเวลาไมกนาทหลงจากไดรบสาร และกระบวนการก าจดพษ (metabolism and detoxification) จาก MP และเมทธล พาราออกซอนจะเกดขนทตบเปนสวนใหญ โดยปฏกรยา oxidation, hydrolysis และ demethylation หรอ dealkylation ดวยการ reduce glutathione (GSH) ไดเปน o-methyl-o-p-nitrophenyl phosphorothioate หรอ dimethyl phosphorothioic หรอ dimethyl phosphorothioic acids และ p-nitrophenol ดงแสดงในรปท 9 ดงนนจงสามารถตรวจสอบปรมาณ MP ทไดรบจากปรมาณ p-nitrophenol ทถกขบออกมากบปสสาวะ โดยพบวา p-nitrophenol จะถกขบออกมารอยละ 60 ภายใน 4 ชวโมง และขบออกมาทงหมดภายใน 24 ชวโมง

21

ภาพท 10 กระบวนการเมตาบอลซมของ MP ในสตวเลยงลกดวยนม ทมา: http://www.inchem.org/documents/jmpr/jmpmono/v95pr14.htm

2.4 ความเปนพษตอสตวเลยงลกดวยนม (Mammalian Toxicity) ฝ นผง MP เขาสรางกายมนษยโดยการสดดมเขาไปในปรมาณความเขมขนของ MP เทากบ

0.4-11 มลลกรมตอลกบาศกเมตร ซงจะมผลท าใหการท างานของเอนไซม cholinesterase ลดลง หลายวน

2.4.1 อาการไดรบพษอยางเฉยบพลนจาก MP แยกไดเปน 3 กลมหลกๆ ตามกลไกการ ออกฤทธทเกดขนดงน

2.4.1.1 ฤทธมสคารนค มผลมาจากการกระตน M-cholinergic receptor เปนการกระตนระบบประสาทพาราซมพาเธตค มผลตอกลามเนอเรยบเกดการหดตวทระบบทางเดนอาหาร มอาการคลนไส อาเจยน ปวดเกรงในทองและทองเดน น าลายออกมากผดปกต เหงอออก ส าหรบระบบการหายใจมอาการแนนในอก หายใจมเสยงหวด มผลตอกลามเนอหวใจท าใหเตนชาลง ความดนโลหตต า สงหลงเพมมากขน และรมานตาหด

22

2.4.1.2 ฤทธนโคตนค มผลมาจากการกระตน N-cholinergic receptor เปนการกระตนระบบประสาทซมพาเธตคและกลามเนอลาย ท าใหมฤทธตรงขามกบการกระตนระบบพารา ซมพาเธตค ซงอาการของผไดรบพษทแสดงอาการซมพาเธตค จะมอาการหวใจเตนเรว รมานตาขยาย ความดนโลหตสงมการกระตกของกลามเนอบรเวณเปลอกตา ใบหนา และคอ กลามเนอออนแอ โดยในระยะแรกจะแสดงอาการเดนทางซมพาเธตค แตตอมาจะแสดงอาการเดนทางพารา ซมพาเธตค สวนการกระตนกลามเนอลายท motor end plate ท าใหกลามเนอออนก าลง ในทสดจะเกดอมพาตโดยเฉพาะกลามเนอทใชในการหายใจ

2.4.1.3 ฤทธตอระบบประสาทสวนกลาง อาจมผลมาจากการกระตนระบบ central M-cholinergic ท าใหมอาการวงเวยน ความคดฟ งซาน การเคลอนไหวเปะปะ พดไมชด การหายใจผดปกต ไมมปฏกรยาโตตอบตอสงกระตน มการกระตกของกลามเนอ การชกเกรงของกลามเนออยางรนแรง มการสบสนทางจต ชก อาการโคมา และหมดสต

2.4.2 สวนอาการทไดรบพษจาก MP อาจแยกประเภทตามความรนแรงของอาการได 3 ประเภท คอ

2.4.2.1 อ าการข น เลกนอย ผ ป วยย งพอ ทจะ เค ลอนไหวไดโดยไ มตอง รบ ความชวยเหลอ มกแสดงอาการคลนเหยน น าลายออกมากผดปกต น าตาไหล อาเจยน ปวดทอง ทองรวง ไมอยากรบประทานอาหาร ออนเพลย ปวดศรษะ ทรงตวล าบาก ในทางตรงกนขาม อาจมอาการงวงนอน กลามเนอบด เหงอออกมาก การหายใจผดปกต หวใจเตนชาสลบกบเตนเรว หายใจมเสยงหวด เนองจาก MP มผลท าใหการท างานของเอนไซม acetylcholinesterase ในเมดเลอดแดง และการท างานของเอนไซม cholinesterase ใน serum ของเลอดลดลงถง 50 % การท างานของเอนไซมดงกลาวสามารถกลบสสภาวะปกตไดอยางรวดเรวในกรณทการไดรบพษอยในขนเลกนอย

2.4.2.2 อาการขนปานกลาง ผปวยไมสามารถเคลอนไหวได หากไมไดรบความชวยเหลอจะแสดงลกษณะตางๆทบรเวณระบบประสาทสวนกลาง และระบบประสาทอตโนมต อวยวะทเกยวของกบระบบหายใจ ระบบทเกยวกบหวใจและหลอดเลอด และระบบทางเดนอาหาร ผปวยมกแสดงอาการน าลายออกมากผดปกต อาเจยนมอาการเสยดทอง (โดยเฉพาะบรเวณสะดอ) ทองรวงและเหงอออกมาก กลามเนอบด มอสน ตากระตก กลามเนอไมประสานงานกน การหายใจล าบาก ความดนโลหตสง อณหภมของรางกายอยในชวง 37.2-38.8 องศาเซลเซยส การท างานของเอนไซม acetylcholinesterase ในเมดเลอดแดง และการท างานของเอนไซม cholinesterase ใน serum ของเลอดมเพยง 10-20 %

23

2.4.2.3 อาการขนรนแรง ผปวยไมสามารถเคลอนไหวและมความสบสนทางจตใจเกดขนจะแสดงอาการชก และเกดความผดปกตของระบบหายใจ กลามเนอบดทวรางกายอตรา การหาย ใจมากกวา 40 ครงตอนาท บรเวณปลายแขนขาเขยวเนองจากการขาดออกซเจน ปฏกรยาโตตอบตอสงกระตนเกดขนอยางแผวเบา อณหภมในรางกายเพมสงขนเทากบ 39 องศาเซลเซยส การถายอจจาระและปสสาวะเกดขนโดยไมรตว มานตาหร การท างานของเอนไซม acetylcholinesterase ในเมดเลอดแดง และการท างานของเอนไซม cholinesterase ใน serum ของเลอดจะลดลงหรอถกยบย งอยางสนเชง การไดรบพษอยางเฉยบพลนของ MP เปนผลเนองมาจากการยบย งการท างานของ acetylcholinesterase ตรงบรเวณปลายประสาท ซงจะท าใหการสะสมของ endogenous acetylcholine อาการทปรากฏ ไดแก เหงอออก มน าลายไหล ทองรวง อาการโคมา และตายเนองจากระบบหายใจลมเหลว

2.5 การทดสอบความเปนไปในสงแวดลอม (Environmental Fate Tests) 2.5.1 การยอยสลายโดยชววธและการเปลยนรปโดยชววธ (Biodegradation and

Biotransformation) การยอยสลายโดยชววธของ MP พบวาสารชนดนสามารถสลายตวไดดวยจลนทรยท

อาศยอยในดน ซง pathway ในการยอยสลาย MP ของจลนทรยเกยวของกบปฏกรยา hydrolysis และปฏกรยา reduction ดงแสดงในภาพท 10

ปฏกรยา hydrolysis ของ MP เกดทพนธะ nitrophenyl (C-O-P) แลวไดผลผลตเปนพาราไนโตรฟนอล (p-nitrophenol; PNP) และกรดไดเมทธลไธโอฟอสฟอรค (dimethyl thiophosphoric acid) หลงจากนนจะเกดกระบวนการ metabolism ของ PNP ไดเปนไนไตรท (nitrite) และไฮโดรควโนน (hydroquinone) หรอพาราไนโตรเคทคอล (p-nitrocatechol) ปฏกรยา reduction ของ MP เกดทกลมไนโตร (nitro group) ไดเปนอะมโนเมทธลพาราไธออน (aminomethyl-parathion) ซงจะถกไฮโดรไลส (hydrolyse) ตอไปไดพาราอะมโนฟนอล (p-aminophenol) และกรดไดเมทธลไธโอฟอสฟอรค (dimethylthiophosphoric acid) อยางไรกตาม PNP ซงเปน metabolite ของ MP ในปฏกรยา hydrolysis สามารถถกรดวซเปนพาราอะมโนฟนอลในสภาวะไรอากาศ (Keprasertsup, 1995)

24

ภาพท 11 Proposed pathways ของ MP ในจลนทรยโดยทวไป ทมา: Keprasertsup, 1995

2.5.2 การยอยสลายโดยแสง (Photodegradation) การยอยสลายโดยแสงของ MP สามารถถกยอยสลายไดเปน dimethyl thiophosphoric

acid, paranitrophenol และ methyl paraoxon ในสภาพแวดลอมหลงจาก 8 ชวโมงไปแลวกระบวนการเกด methyl paraoxon โดยอาศยแสงอลตราไวโอเลตจะเกดเพมขน

25

2.5.3 การแตกตวท าปฏกรยากบน า (Hydrolysis) การแตกตวท าปฏกรยากบน าของ MP ขนกบคาพเอช และอณหภมทเพมขนการแตก

ตวท าปฏกรยากบน า 50% ณ อณหภม 20 องศาเซลเซยส ใชระยะเวลา 175 วน ในขณะทพเอชเทากบ 1-5 ทอณหภม 40 และ 50 องศาเซลเซยส ใชระยะเวลา 5 วน และ 4 วน ตามล าดบ และเมอ พเอชเทากบ 12 ทอณหภม 70 องศาเซลเซยส ใชระยะเวลาเพยง 12 ชวโมงเทานน ในขณะทพเอชเทากบ 6-7 และ 9 ทอณหภม 70 องศาเซลเซยส ใชระยะเวลาในการแตกตวท าปฏกรยากบน าเพยง 6.9 และ 1.5 ชวโมง ตามล าดบ

อตราการแตกตวท าปฏกรยากบน าโดยดาง (alkali) ของ MP เทากบ 4.3 ซงสงกวาพาราไธออน ครงชวต (half-life) ของ MP ทอณหภม 70 องศาเซลเซยส ในเอทานอล ซงมพเอชเทากบ 6.0 และในสารละลายบฟเฟอร (1:4) มคาครงชวตเทากบ 8.4 ชวโมง

จากการศกษาของ Douglas M. Munnecke (1974) พบวาเอนไซมทเตรยมไดจากแบคทเรยท าใหเกดการแตกตวท าปฏกรยากบน าไดอยางรวดเรวกวาการแตกตวท าปฏกรยากบน าดวยสารเคม โดยทครงชวตของสารละลายสตรผสมเจอจางของสารเคมปองกนก าจดศตรพชและสตว อยในชวง 27-80 ชวโมง และการท างานของเอนไซมดงกลาวไมถกขดขวางโดยผงซกฟอกและองคประกอบตวท าละลายทเปนสตรผสมทางการคา

2.5.4 การกลายเปนไอ (Evaporation) การกลายเปนไอจากพนผวดนของ MP ขนกบปรมาณความเขมขนของ MP ในดน

และอตราการเคลอนยายอากาศเหนอผวดน ดชนการกลายเปนไอเทากบ 4 หรออตราการกลายเปนไอเทากบ 7-14 กโลกรมตอพนท 1 เฮคตารตอป

2.5.5 การเปลยนเปนออกซไดส (Oxidation) การเปลยนเปนออกซไดส เปนการลดก ามะถนทรวมตวอยใน MP โดยล าพงแลว MP

ไมสามารถกระตนฤทธ (active) ได ตองอาศยการกระตนฤทธจากระบบเอนไซมทท าใหเกดกระบวนการเปลยนเปนออกซไดส (mixed-function oxidases: MFO) ซงปรากฏในรางกายของแมลง สตวทดลอง และคน ระบบเอนไซมดงกลาวอยใน microsome และตองอาศย NADPH และ O2 ในการท างานดวย ดงภาพตอไปน

26

ภาพท 12 การกระตน (activation) ของ MP ใหเปลยนเปน active metabolite ซงออกฤทธโดยการจบกบเอนไซม acetylcholinesterase และยบย งการท างานของเอนไซม ทมา: พรพมล เจรญสง, 2533

2.6 การแพรกระจายสสงแวดลอม (Environmental Exposure) การกระจายของ MP ในอากาศ น า ดน และในสงมชวตในสงแวดลอม มกเกดขนจากปจจย

ทางกายภาพ เคม และชวภาพ การแพรกระจายของ MP ในอากาศสวนใหญเกดจากการฉดพน ท าใหละอองฟ งกระจาย และการระเหยของน าจากใบไมและผวดน พบวาระดบ MP ใน ชนบรรยากาศบรเวณพนทท าการเกษตรมคาสงสดประมาณ 70 นาโนกรมตอตารางเมตร และลดลงสระดบปกตเมอผานไป 9 วน

จากการศกษาระดบ MP ในดน พบวา MP สามารถคงสภาพในดนไดนานกวาในอากาศหรอในน า โดยระยะเวลาทอยในดนจะแตกตางกนไปขนอยกบชนดของดน เชน MP ในดนทรายจะสลายไดเรวกวาในดนเหนยว การยอยสลาย MP ในสตวและการขบถายของเสยเกดขนภายในเวลาสนๆ อยางไรกตาม กระบวนการเหลานจะเกดในสตวเลยงลกดวยนมและสตวปกไดรวดเรวกวาสตวทมกระดกสนหลงชนต าและสตวไมมกระดกสนหลง

แนวทางการยอยสลาย MP ในสงแวดลอมทส าคญทสด คอ การยอยสลายดวยจลนทรย เนองจากในสงแวดลอมมจลนทรยหลายชนดทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงได โดยมรายงานการวจยมากมายเกยวกบการศกษาจลนทรยทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงได ดงแสดงในตารางท 5

27

ตารางท 5 ชนดของจลนทรยทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงได Compound microorganism

Parathion

Bacillus Arthrobacter Flavobacterium sp. ATCC 27551

Pseudomonas sp. ATCC 29353

Pseudomonas spp. Pseudomonas sp. Pseudomonas strain CTP-01

Pseudomonas diminuta MG

Pseudomonas sp. strain SC

Methyl parathion

Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. isolate 50541

Flavobacterium sp. ATCC 27551

Plesiomonas sp. M6

Burkholderia cepacia

Aufwuchs

p-Nitrophenol

Flavobacterium sp. Pseudomonas spp. PNP-1, 2, and 3

Pseudomonas sp. isolate 50445

Moraxella sp. Pseudomonas strain 24

ทมา: ดดแปลงจาก Chaudhry, 1994

28

ตารางท 5 (ตอ) ชนดของจลนทรยทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงได Compound microorganism

Diazinon

Flavobacterium sp. ATCC 27551 Pseudomonas sp. ATCC 29353

Pseudomonas spp. Pseudomonas sp. Arthrobacter sp. SB3 and SB4

Isofenphos Arthrobacter sp. Pseudomonas sp.

Fenetrothion Flavobacterium sp. ATCC 27551

Dichlorovos Pseudomonas aeruginosa sp. Pseudomonas sp.

Coumaphos Isolates B-1, B-2, and B-3

Mathidathion Bacillus coagulans

2.7 ผลกระทบตอสงมชวตในสงแวดลอม (Effects on Organisms in the Environment) ยาฆาแมลง MP เปนยาฆาแมลงในกลม OP ทใชปองกนและก าจดแมลงซงเกษตรกรนยมใช

กนอยางแพรหลาย โดยในป พ.ศ. 2536 มสถตการน าเขามาใชในประเทศไทยสงเปนอนดบท 3 ของสารก าจดศตรพชในกลมเดยวกน คดเปนปรมาณทน าเขา 1,117 ตน หรอเปนมลคากวา 70 ลานบาท จากการทมการใช MP อยางแพรหลายเปนเหตใหตรวจพบการปนเปอนและตกคางอยในผลตผลทางการเกษตร เชน พช ผก และผลไมชนดตางๆ รวมทงแหลงในพนทเพาะปลก แหลงน าธรรมชาตและดนเกษตรกรรมอยเสมอ (กรมวชาการเกษตร, 2537)

ส าหรบผลกระทบของ MP ตอสงมชวตทอยในน าพบวา ในสตวไมมกระดกสนหลงทอาศยอยในน า มคาความเปนพษของ MP ในรปของคา LC50 (Lethal Concentration; ความเขมขนของสารทท าใหสงมชวตทศกษาลดลง 50%) อยในชวงนอยกวา 1-40 ไมโครกรมตอลตร สตวจ าพวกหอยมคา LC50 อยในชวง 12-25 มลลกรมตอลตร ปลาทะเลและปลาน าจดสวนใหญ มคา LC50 อยในชวง 6-25 มลลกรมตอลตร ดงนนควรหลกเลยงการฉดพน MP ใกลแหลงน า เชน หนองน า

29

แมน า และทะเลสาบ ในสภาวะทมลมแรงส าหรบผลกระทบของ MP ตอสตวปก มการศกษาในหองปฏบตการพบวา MP มคาความเปนพษตอนกในรปของคา LD50 (Lethal Dose; ปรมาณสารพษทใชตอน าหนกของสงมชวตทท าใหสงมชวตทศกษาลดลง 50%) ทใหทางปากอยในชวง 3-8 มลลกรมตอกโลกรมของน าหนกตว ส าหรบประเทศไทย กรมวชาการเกษตรไดศกษาสารพษตกคางในผกและผลไม โดยสมเกบตวอยางผกและผลไมในทองทจงหวดตางๆ เชน นครปฐม อางทอง นนทบร ปทมธาน และชลบร เปนตน มาวเคราะหชนดและปรมาณของสารตกคางในผลตผลเหลานนพบวา ตวอยางทวเคราะหทงหมดมสารพษตกคางของยาฆาแมลงปนเปอนอยประมาณรอยละ 75 ของตวอยางทงหมด ดงแสดงในตารางท 6 และตารางท 7 นอกจากนยงพบวา ในตวอยางสมทน ามาวเคราะหรอยละ 12.8 ของตวอยางทงหมด มปรมาณ MP เกนคา ความปลอดภยทก าหนดไว (0.2 ppm) รอยละ 1.4 ของตวอยางทงหมด (กรมวชาการเกษตร, 2538)

ตารางท 6 จ านวนตวอยางของผกและผลไมทตรวจพบสารพษตกคาง

Commodity No. of samples analysed

Samples found

No. (%) Grape 156 139 89.1 Tangerine 70 51 72.8 Brassica 15 5 33.3 Cabbage 123 51 41.5 Cauliflower 12 4 33.3 Corn, baby 26 5 19.2 Cowpea 30 8 26.7 Cucumber 20 8 40 Ipomoea (morning glory) 16 5 31.2 Kale 76 40 52.6 Mushroom 21 3 14.3 Tomato 26 6 23.1 ทมา: กรมวชาการเกษตร, 2538

30

ตารางท 7 ชนดและปรมาณของสารพษตกคางทตรวจพบในผกและผลไม

Commodity (No. of samples analyzed)

Pesticide Range of residue (ppm)

Total found

Total violations

Codex MRL (ppm)

Grape (156) captan <0.01-1.91 47 dimethoate 0.01-0.07 26 methomyl 0.01-1.07 29 monocrotophos 0.02-1.58 117 40 0.2

Tangerine (70) dimethoate 0.01-1.31 33 malathion 0.03-1.07 10 4 monocrotophos 0.01-1.72 7 0.2 Parathion-methyl

0.01-0.99 9 1 0.2

ทมา: กรมวชาการเกษตร, 2538

จากรายงานการวจยในแงตางๆ ของ MP จะเหนไดวา MP เปนยาฆาแมลงในกลม OP ชนดหนงทมความเปนพษสง สามารถซมผานปาก ผวหนง และการหายใจ หากไดรบในปรมาณมากอาจท าใหเสยชวตได โดยในประเทศสหรฐอเมรกา และประเทศในกลมสหภาพยโรปไดมการประกาศหามใชยาฆาแมลงชนดนในพนทการเกษตรแลว ประเทศไทยซงมการใชยาฆาแมลงชนดนมาเปนระยะเวลานานตงแตป พ.ศ. 2490 จงเกดความตระหนกถงอนตรายจากความเปนพษของ MP โดยในป พ.ศ. 2547 ประเทศไทยไดประกาศหามใชยาฆาแมลงชนดนในพนทเกษตรกรรม โดยประกาศเปนวตถอนตรายชนดท 4 ทหามมใหมการผลต การน าเขา การสงออก หรอการมไวในครอบครอง ตามประกาศกระทรวงอตสาหกรรม เรอง บญชรายชอวตถอนตราย (ฉบบท 2) พ.ศ. 2547 แลว ดงแสดงในตารางท 8 แตอยางไรกตามในประเทศไทยยงขาดความเขมงวด และ ไมมการตรวจสอบตดตามการใชยาฆาแมลงชนดนอยางตอเนอง รวมทงขาดแผนการทชดเจนและเพยงพอในการควบคมการตลาด และการใชสารเคมก าจดศตรพชทงในระดบชาตและระดบทองถน ดงนนการจ าหนายสารเคมก าจดศตรพชในประเทศไทยจงไมมการควบคมทชดเจนแตอยางใด จง ท าใหยงมการจ าหนายและใชยาฆาแมลงชนดนกนอยางแพรหลายแมจะถกขนบญชเปนวตถอนตรายแลวกตาม โดยจะเหนไดจากรายงานการตรวจสอบสารพษตกคางในตวอยางพชแปลงของส านกวจยและพฒนาการเกษตร เขต 5 กรมวชาการเกษตร ในเขตจงหวดกาญจนบร สพรรณบร

31

ราชบร เพชรบร นครปฐม สมทรสาคร และสมทรสงคราม ในเดอนมกราคม พ.ศ. 2548 ถงกนยายน พ.ศ. 2551 พบวายงมการตรวจพบ MP ตกคางอยในผลผลตทางการเกษตรอย (สนย นเทศพตรพงศ, 2552) ซงจากการใชสารเคมชนดนอยางตอเนองของเกษตรกรจงกอใหเกดการตกคางของสารเคมในแหลงดน แหลงน า และในผลผลตทางการเกษตร ซงจะสงผลกระทบโดยกอใหเกดปญหาตอสขภาพของเกษตรกรและผบรโภค เกดปญหาสงแวดลอม รวมทงเปนปจจยทท าใหเกดความสญเสยทางเศรษฐกจทงในระยะสนและระยะยาว ยงไปกวานนยงมการตรวจพบสารเคมก าจดศตรพชทไดหามใชในประเทศ หรอหามใชในพชบางชนดในผกสงออกจากประเทศไทย สงผลใหคณภาพของสนคาเกษตรสงออกทมคณภาพต าจากการปนเปอนของสารเคมทใชในการเกษตรท าใหสนคาทไดไมเปนไปตามขอก าหนดในการสงสนคาเกษตรไปยงประเทศตางๆ ตามมาตรฐานของประเทศคคานนๆ โดยเมอไมนานมานไดมการประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ เรองก าหนดพชเปนพชควบคมเฉพาะ พ.ศ. 2556 ในการควบคมพชทจะสงออกไปนอกราชอาณาจกรไทยจะตองผานการตรวจสอบเชอจลนทรย หรอสงอนใดทเปนอนตรายตอสขภาพของมนษย ดงแสดงในตารางท 9 ซงจะเหนไดวาสารในกลม OP โดยเฉพาะยาฆาแมลง MP ถกจดเปนสารเคมทประเทศคคาในหลายประเทศไมอนญาตใหใช ดวยเหตนเองประเทศไทยจงมความจ าเปนอยางยงทจะตองศกษาหาวธยอยสลายและลดการปนเปอน รวมทงวธการตรวจสอบยาฆาแมลง MP ทมประสทธภาพสงสด และไมเปนอนตรายตอสงแวดลอม ซงวธการยอยสลายยาฆาแมลงดวยจลนทรยจดเปนวธทมประสทธภาพสงสด ราคาถกทสด และไมเปนอนตรายตอสงแวดลอม (Munnecke และคณะ, 1974) ดงนนในการศกษาการโคลนและการแสดงออกเอนไซมของยนทสามารถยอยสลาย ยาฆาแมลง MP และยาฆาแมลงชนดอนๆ ในกลม OP ในเชอจลนทรยทหลงเอนไซมออกมานอกเซลล ซงจะท าใหงายตอการผลตและการน าเอนไซมไปใช จงเปนความรพนฐานเพอน าไปประยกตใชในการเปนแหลงผลตเอนไซมเพอใชในการตรวจวด ลดหรอก าจดสารพษจาก ยาฆาแมลงในสงแวดลอม และผลผลตทางการเกษตรตอไป

32

ตารางท 8 วตถอนตรายทหามใช ตามประกาศกระทรวงอตสาหกรรม เรอง บญชรายชอวตถอนตราย (ฉบบท 2) พ.ศ. 2547 มผลบงคบใชเมอวนท 19 ตลาคม 2547 จ านวน 2 ชนด

ล าดบท ชอวตถอนตราย ประเภทการใช เดอน ป ทหาม เหตผล

1 parathion methyl สารก าจดแมลง ตลาคม 2547 - มพษเฉยบพลนสง - ประเทศทพฒนาแลวบางประเทศหามใชแลว

2 endosulfan (ยกเวน CS formulation)

สารก าจดแมลง ตลาคม 2547 - เปนพษตอปลาและสตวนาตางๆ สงมาก มการน าไปใชผดวตถประสงคจากท ขนทะเบยนไว โดยน าไปใชก าจดหอยเชอรในนาขาวท าใหปลาและสตวน าตาย กอใหเกดผลกระทบตอสงแวดลอม โดยเฉพาะเมอมการรวไหลออกจากนาขาว

ทมา: กรมโรงงานอตสาหกรรม, 2547

33

ตารางท 9 รายชอชนดพช ประเทศและเชอจลนทรย หรอสงอนใดทเปนอนตรายตอสขภาพของมนษย ตามประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ เรอง ก าหนดพชเปนพชควบคมเฉพาะ พ.ศ. 2556

ชนดพช ประเทศ เชอจลนทรย หรอสงอนใดทเปนอนตราย

ตอสขภาพของมนษย ทเรยน ล าไย ลนจ มงคด สมโอ มะมวง ขง ถวฝกยาว คะนา กวางตง พรก หนอไมฝรง ผกชไทย มะเขอ กระเจยบเขยว เฉพาะทเปนพชผกสดและผลไมสด

สหภาพยโรป นอรเวย สมาพนธรฐสวส

กลม ออรกาโนฟอสเฟต (Organophosphates) : ไดคลอรวอส (dichlorvos,DDVP), เมทามโดฟอส (methamidophos), ไดอะซนนอน (diazinon), คอรไพรฟอส (chlorpyrifos), พรมฟอสเอทล (pirimiphos ethyl), พรมฟอส-เมทล (pirimiphos-methyl), พาราไทออน (parathion), พาราไทออนเมทล (parathion methyl), เมวนฟอส (mevinphos), มาลาไทออน (malathion), โพรฟโนฟอส (profenofos), โพรไทโอฟอส (prothiophos), โมโนโครโทฟอส (monocrotophos), ไดเมโทเอต (dimethoate), โอเมโทเอต (omethoate), ไดโครโทฟอส (dicrotophos), โฟซาโลน (phosalone), ไตรอะโซฟอส (triazophos), เฟนโทรไทออน (fenitrothion), เมทดาไทออน (methidathion), อไทออน (ethion), อพเอน (EPN) และ อะซนฟอส- เอทล ( azinphos-ethyl) กลมไพเรทรอยด (Pyrethroids) : เพอรเมทรน (permethrin), ไซเพอรเมทรน (cypermethrin), ไซฮาโลทรน (cyhalothrin), เฟนวาเลอเรต (fenvalerate), ไซฟลทรน(cyfluthrin) และ เดลทาเมทรน (deltamethrin) กลมอนๆ : เอนโดซลแฟน (Endosulfan) คารบาเมต (Carbamate) โพรพโคนาโซล (Propiconazole) เฉพาะมะมวง (ญปน)

ทเรยน ล าไย ลนจ มงคด สมโอ มะมวง ขง ถวฝกยาว คะนา กวางตง พรก หนอไมฝรง ผกชไทย กระเจยบเขยว เฉพาะทเปนพชผกสดและผลไมสด

สงคโปร

ทเรยน ล าไย ลนจ มงคด สมโอ มะมวง ขง ถวฝกยาว คะนา กวางตง พรก หนอไมฝรง ผกชไทย กระเจยบเขยว ขนฉาย ผกชฝรง ผกชลาว โหระพา กะเพรา ผกคะแยง ยหรา แมงลก สะระแหน ผกแพรว ใบบวบก ถวลนเตา กะหล าปล สมปอย ชะอม ใบมะกรด ผกกระเฉด ตะไคร ผกเปด เฉพาะทเปนพชผกสดและผลไมสด

ญปน

ทมา: กรมวชาการเกษตร, 2556

34

ตารางท 9 (ตอ) รายชอชนดพช ประเทศและเชอจลนทรย หรอสงอนใดทเปนอนตรายตอสขภาพของมนษย ตามประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ เรอง ก าหนดพชเปนพชควบคมเฉพาะ พ.ศ. 2556

ชนดพช ประเทศ เชอจลนทรย หรอสงอนใดทเปนอนตราย

ตอสขภาพของมนษย พรก ถวฝกยาว หนอไมฝรง ผกชไทย ผกชฝรง กะเพรา โหระพา สะระแหน ขนฉาย ผกคะแยง ผกแพรว ตนหอม กยชาย ชะอม ตะไคร ผกบง ผกแวน ผกกระเฉด ใบบวบก ใบชะพล ผกโขม ผกปลง เฉพาะทเปนพชผกสดและผลไมสด

สหภาพยโรป นอรเวย ไอซแลนด

เอสเชอรเชย โคไล (Escherichia coli) ซลโมเนลลา สปชส (Salmonella spp.)

ล าไยสด สาธารณรฐประชาชน จน

ซลเฟอรไดออกไซด (SO2)

เมลดแมงลก ลกเดอย พรกแหง ญปน อะฟลาทอกซน (Aflatoxin) 3. เชอ Burkholderia cepacia ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP (Keprasertsup และคณะ, 2001)

เชอแบคทเรย Burkholderia cepacia ทใชในงานวจยนเปนแบคทเรยทยอมตดสแกรมลบ มรปรางเปนทอน โคโลนมลกษณะสขาว ทบแสง ขนาดเลก ตองการอากาศในการเจรญ เตบโต(aerobic bacteria) และใหผลบวกกบปฏกรยาออกซเดสและคะตาเลส (oxidase-positive and catalase-positive)

เชอแบคทเรยตวนเแยกไดจากพนทเกษตรกรรมในเขตตลงชน บางกอกนอย กรงเทพมหานคร สามารถเจรญเตบโตไดทอณหภมหอง (26±2 องศาเซลเซยส) และมคณสมบตในการยอยสลายและสามารถใชยาฆาแมลง MP เปนแหลงคารบอนเพยงแหลงเดยวในการเจรญเตบโต โดยเชอแบคทเรยตวนจะยอยสลายยาฆาแมลง MP เปน PNP นอกจากนยงสามารถยอยสลาย PNP ตอไปไดอกดวย การเลยงเชอจะเลยงในอาหารทประกอบดวยแรธาตทจ าเปน (Basal Mineral Medium, BMM) ทม MP ความเขมขน 50 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยเชอแบคทเรยจะสามารถยอยสลาย

35

ยาฆาแมลงไดหมดภายในเวลา 12-18 ชวโมง สงเกตไดจากอาหารเลยงเชอทเปลยนจากสเขยว ปนเหลองเปนสขาวขน โดยเอนไซมทใชยอยสลาย MP เปนmembrane bound และมการ แสดงออกแบบเหนยวน า นอกจากนเชอแบคทเรยตวนยงสามารถยอยสลายมาลาไธออน และ ไดเมโธเอท ซงเปนยาฆาแมลงในกลม OP ไดอกดวยเนองจากเชอตวนสามารถเจรญเตบโตในอาหารเลยงเชอทมยาฆาแมลงเหลานเปนแหลงคารบอนเพยงแหลงเดยวไดทงในอาหารแขงและอาหารเหลว (เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ และคณะ, 2543) 4. รายงานการวจยทเกยวของ ซงในป ค.ศ. 1996 มรายงานการโคลนและหาล าดบนวคลโอไทดของยน organophosphorus acid anhydrolase (opa A) ของเชอแบคทเรย Aeromonas sp. JD 6.5 ทสามารถยอยสลายสารประกอบประเภท OP แลวเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดของยน opa A กบล าดบนวคลโอไทดของยน opd ของเชอแบคทเรย Pseudomonas diminuta MG และเชอแบคทเรย Flavobacterium sp. ATCC 27551 พบวา ล าดบนวคลโอไทดของยนทงสองไมม homology กน (Cheng และคณะ, 1996) ตอมามรายงานวายน opd A ของเชอแบคทเรย Agrobacterium radiobactor P230 ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงประเภท OP มล าดบนวคลโอไทดคลายกบยน opd ของเชอแบคทเรย Brevundimonas diminuta MG (Pseudomonas diminuta MG) และเชอแบคทเรย Flavobacterium sp. ATCC 27551 แตเอนไซม Opd A ทถก encode จากยน opd A สามารถไฮไดรไลซยาฆาแมลงประเภท OP ไดหลายชนดกวาเอนไซม OPH ทถก encode จากยน opd (Horne และคณะ, 2002)

ป ค.ศ. 1998 มรายงานการโคลนยน phn E และ glp T ซงเปนยนทเกยวของกบการสงผาน (transport) ยาฆาแมลงไดไอโซโพรพลฟลออโรฟอสเฟต (diisopropyl fluorophosphate) ของเชอ Eschericia coli K-12 โดยพบวายนทง 2 ชนดนท าใหเชอ Eschericia coli K-12 สามารถยอยสลายยาฆาแมลงไดไอโซโพรพลฟลออโรฟอสเฟตไดดขน (Elashvili และคณะ, 1998) และยน phn ของเชอ Burkholderia sp. RP007 ทสามารถยอยสลาย polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) มล าดบนวคลโอไทดทแตกตางจากยนอนทสามารถยอยสลาย PAH ได (Laurie and Jones, 1999) ป ค.ศ. 1999 มรายงานการคดแยกเชอจลนทรย Pseudomonas sp. A3 จากดนซงพบวา Pseudomonas sp. A3 สามารถยอยสลาย methyl parathion, malathion, monocrotophos และ diazinon ซง Pseudomonas sp. A3 จะเปลยน methyl parathion ไปเปนแหลงคารบอนและฟอสฟอรสเพอใชในการเจรญเตบโต (Ramanathan and Lalithakumari, 1999)

36

ป ค.ศ. 2001 มรายงานการคดแยกเชอจลนทรยจากแหลงเกษตรกรรมในประเทศไทยโดยการน าดนจากการเกษตรไปเลยงใน basal mineral medium (BBM) ทมกลโคสและไมมกลโคส และอาหารทงสองชนดจะม MP เปนสวนประกอบ จากการทดลองสามารถคดแยก Burkholderia cepacia ออกมาจาก mixed culture ใน BMM ทไมมกลโคส และพบวา Burkholderia cepacia เปนแบคทเรยทสามารถยอยสลาย MP ไดด และเชอชนดนสามารถเจรญในอาหาร BMM ทม pH อยในชวง 4-8 และความเขมขนของเกลอ 0-3.5% เมอทดลองเพมกลโคสลงในอาหารพบวาการเพมกลโคสไมมผลในการเพมความสามารถในการยอย MP (Keprasertsup และคณะ, 2001)

ในป ค.ศ. 2002 มรายงานการคดแยกแบคทเรยชนดหนงออกจากดนสกปรกรอบๆโรงงานผลตยาฆาแมลง โดยแบคทเรยชนดนสามารถยอยสลาย MP ไดอยางสมบรณ และเมอจ าแนกชนดของแบคทเรยชนดนพบวาอยในจ าพวก Pseudomonas sp. WBC-3 แบคทเรยชนดนมความสามารถในการตานทานความเขมขนของ MP สงถง 800 มลลกรมตอลตร ในอาหารพนฐานและสามารถเพมความตานทานไดถง 2000 มลลกรมตอลตร ในอาหารทม 0.1% glucose และนอกจากนแบคทเรยชนดนยงสามารถยอยสลายยาฆาแมลงในกลมของ OP และสารประกอบ aromatic (Chen และคณะ, 2002)

ป ค.ศ. 2003 มรายงานการศกษาสวนของพลาสมด pPDL2 จากเชอ Flavobacterium sp. และ พลาสมด pCMS1 จากเชอ Pseudomonas diminuta ซงทงสองพลาสมดมสวนทมขนาด 5.1 kb ซงมยน organophosphate-degrading (opd) โดยพบวาพลาสมด pPDl2 นนมยน opd อยระหวาง ISFlsp1 และ Tn-3 และม open reading frame (orf243) ซง code ใหโพลเปปไทดขนาด 27 kDa ซงสามารถยอยสลาย PNP (Siddavattam และคณะ, 2003)

ป ค.ศ. 2004 มรายงานการศกษาการแสดงออก การแยกบรสทธ และการหาคณลกษณะของยนเมทธลพาราไธออนไฮโดรเลส (mpd gene) โดยการท า PCR และแสดงออกใน E. coli ในรปแบบของฟวชนโปรตน (hexa - His C - terminal fusion protein) และแยกบรสทธเอนไซมโดยใช metal - affinity chromatography column ซงจากการศกษา enzyme activity และ zymogram ของเอนไซมทแยกไดพบวา เอนไซมทอยในรปทแอคทฟ (active form) เกดจาก precursor protein ทมขนาดใหญกวาโดยการตด signal peptide ในบรเวณ N-terminal ของสายโปรตนออกไปและผลทไดแสดงใหเหนวาเอนไซม MPH เปนโมโนเมอร (Fu และคณะ, 2004)

ป ค.ศ. 2005 มรายงานการศกษาการพฒนาการแสดงออกของยนทสรางเอนไซมเมทธล พาราไธออนไฮโดรเลส (methyl parathion-degrading; mpd gene) ใน E. coli โดยท าการโคลนยนไวภายใตการควบคมของ P43 promoter และเพมล าดบนวคลโอไทดของ signal peptide ของ Bacillus subtilis (nprB gene) จากการศกษาพบวามการแสดงออกของยนในระดบสงและมการหลงเอนไซม

37

ออกนอกเซลลโดยเอนไซมทไดมความสามารถในการยอยสลาย MP ไดอยางมประสทธภาพ(Zhang และคณะ, 2005)

ส าหรบการศกษาเกยวกบเชอ Burkholderia cepacia ในประเทศไทยพบวามรายงานการแยกเชอ Burkholderia cepacia ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP และ PNP จากดนทท าการเกษตรในประเทศไทย โดยพบวาเชอตวนสามารถใช MP เปนแหลงคารบอนเพยงแหลงเดยวในการเจรญเตบโต (Keprasertsup และคณะ, 2001) และในปเดยวกนน ไดมการแยกบรสทธเอนไซม MPH จากเชอตวน พบวาเอนไซมชนดนมขนาดประมาณ 35 กโลดาลตน และวเคราะหกรดอะมโนทปลายดาน N-terminus ได 40 amino acid residues (เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ และ บญศร จงเสรจต, 2544)

ป พ.ศ. 2547 มรายงานการบงชและศกษาลกษณะของยน mpdB จากเชอ Burkholderia cepacia โดยพบวาเมอน าแบคทเรยชนดนไปหาล าดบนวคลโอไทดดวยเทคนค polymerase chain reaction (PCR) ล าดบนวคลโอไทดของยน mpdB ทสมบรณตรวจหาไดจากการท า PCR และสวน ORF ทสมบรณขนาด 996 bp แปลรหสเปนกรดอะมโนได 331 ตว ล าดบนวคลโอไทดของยนและล าดบกรดอะมโนทวเคราะหได มความเหมอนกบยน mpd ของเชอ Plesiomonas sp. M6 คดเปน 99% และ 98% ตามล าดบ และเหมอนกบยน organophosphate pesticide hydrolase ของ Ochrobactrum sp. Mp-3 คดเปน 99% และ 99% ตามล าดบ ซงล าดบนวคลโอไทดและกรดอะมโนทวเคราะหไดมความแตกตางจากยน opd ของเชอ Flavobacterium sp. ATCC 27551 โดยมเปอรเซนตความเหมอนเพยง 2% และ 10% ตามล าดบ แสดงวายน mpdB ทไดอยในกลมของยน mpd ซงมความแตกตางจากยนในกลม opd (เสาวลกษณ วงคเทยนหลาย, 2547)

ป พ.ศ. 2549 มรายงานการบงช การศกษาลกษณะ และการศกษาการแสดงออกของยนใน วถการยอยสลายยาฆาแมลง MP จากเชอ Burkholderia cepacia โดยพบวาโคลนของยน mpdB ใน expression vector pGEX-4T-2 ซงเปนพลาสมดส าหรบการแสดงออกทม glutathione-S-transferase (GST) tag สามารถใหผลการแสดงออกของเอนไซม MPH ไดสง ในการท าบรสทธโปรตนจะอยในรปฟวสชนโปรตนโดยม GST-tag protein เชอมตดอย อยางไรกตาม MPH ทผลตจากรคอมบแนนทโคลนสวนใหญอยในรปทไมละลายน า จงท าการละลายดวย 8 โมลาร urea แลวท าการ refold โปรตนกอน แลวจงน ามาท าใหบรสทธดวย GSTrapp FF affinity column พรอมกบการตด GST ออกจากเอนไซม จาก SDS-PAGE พบวารคอมบแนนท MPH ทแยกไดมความบรสทธสงและมน าหนกโมเลกลประมาณ 35 kDa specific activity ของ MPH หลงท าใหบรสทธแลวม คา 166.6 unit/mg protein ไดผลผลตในปรมาณทสงถง 60% และมคาความบรสทธ 6.1 เทา (วรฬห ศภลกษณนาร, 2549)

38

ป ค.ศ. 2012 มรายงานการแยกบรสทธ และการศกษาคณลกษณะของเอนไซม MPH จากเชอ Burkholderia cepacia ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงในกลม OP โดยพบวาสามารถแยกบรสทธเอนไซม MPH จากเชอ Burkholderia cepacia ทมขนาด 35 กโลดาลตน และมคา pI เทากบ 8.5 โดยใชวธทางโครมาโตกราฟฟ ซงอาศยขนตอนในการแยกบรสทธเอนไซมน 3 ขนตอนโดยใชคอลมน Resource S, Sephadex G100 และ Octyl Sepharose 4FF ตามล าดบ และยงสามารถแยกบรสทธรคอมบแนนทเอนไซม MPH ทผลตไดจากรคอมบแนนทโคลน E. coli ทมพลาสมด pGT1 (pGEX-4T-2::mpdB) โดยเอนไซมทไดจะอยในรปของ GST-MPH fusion protein ซงท าใหงายแกการแยกบรสทธเอนไซมโดยอาศยเพยงขนตอนเดยวโดยใชคอลมน GSTPrep FF affinity column ซงไดเอนไซมบรสทธทขนาด 35 กโลดาลตน เชนกน คา specific activity ของเอนไซม MPH บรสทธมคา 1,600 unit/mg protein ไดผลผลตในปรมาณ 75% และมคาความบรสทธ 39 เทา เมอเทยบกบเอนไซมทผลตไดจากเชอ Burkholderia cepacia โดยอณหภมและพเอชทเหมาะสมทสดตอกจกรรมเอนไซมอยท 25OC และพเอช 9.0 ตามล าดบ รวมทงเอนไซมมความเสถยรทอณหภม 4OC นาน 48 ชวโมง และทพเอช 6-7 นาน 8-15 ชวโมง (Ekkhunnatham และคณะ, 2012)

การแสดงออกของรคอมบแนนทโปรตนภายในเซลล E. coli มปญหาหลายประการเพราะ

ถงแมวาแบคทเรยแกรมลบจ าพวก E. coli ถกใชอยางกวางขวางในการผลตรคอมบแนนทโปรตนในอตสาหกรรมตางๆ ดวยคณสมบตทโดดเดนของ E. coli เชน E. coli สามารถเจรญเตบโตไดรวดเรว, งายตอการเพาะลยง, สามารถเพาะเลยงทความหนาแนนเซลลสง และสามารถผลตรคอมบแนนทโปรตนไดมากกวา 50 เปอรเซนต จากโปรตนทแสดงออกทงหมดภายในเซลล แตอยางไรกตาม E. coli ทงสายพนธทใชในหองปฏบตการและในอตสาหกรรมโดยทวไปจะไมสามารถหลงโปรตนออกนอกเซลลได (Choi and Lee, 2004; Pines and Inouye, 1999; Yamabhai และคณะ, 2008; Yoon และคณะ, 2010) นอกจากนนการ overexpression ของโปรตนทผลตขนภายในเซลลนนมกพบอยในรปทไมละลายน า เนองจากการผลตโปรตนในเซลลเปนจ านวนมาก จงเกดการรวมตวกนของโปรตนและตกตะกอนในลกษณะทเรยกวา inclusion body ซงในการแยกบรสทธโปรตนจงตองใชวธการทยงยากซบซอน เสยคาใชจายในการ denaturation และกระบวนการ refold โปรตนกอนการท าบรสทธ จงท าใหผลผลตสดทายทไดจากการท าบรสทธมปรมาณทต า (Suppaluknaree และคณะ, 2007; Yoon และคณะ, 2010) ดงนนวธการหลงโปรตนออกนอกเซลลของ E. coli จงมขอดเมอเปรยบเทยบกบการผลตภายในเซลล ตวอยางเชน การแยกและการท าบรสทธของรคอมบแนนทโปรตนสามารถท าไดงาย เนองจากการหลงของรคอมบแนนทโปรตน

39

ออกมานอกเซลลนน จะชวยลดการปนเปอนจากโปรตนชนดอนๆ ทอยภายในเซลลและลดการเกด proteolytic degradation จาก protease ทอยภายในเซลล (Yoon และคณะ, 2010)

การหลงโปรตนออกนอกเซลลในแบคทเรยแกรมลบจ าพวก E. coli โปรตนจะถกสงผานเยอหมชนใน (inner-membrane) ไปยง periplasmic space และหลงออกสอาหารเลยงเชอในทสด (Thanassi and Hultgren, 2000) โดยระบบการหลงโปรตนออกนอกเซลลของ E. coli มหลายระบบทแตกตางกน ไดแก type I, type II, type III, type IV และ type V โดย type II เปนระบบทนยมใชโดยทวไป ประกอบดวย 2 ขนตอน ไดแก 1. periplasmic translocation ซงจะประกอบดวย pathway หลก 3 pathway ไดแก SecB-dependent pathway, signal recognition particle (SRP) และ twin-arginine translocation (TAT) pathway และ 2. extracellular transport เปนการหลงออกนอกเซลลของ periplasmic protein ซงจะอาศยการท างานของ secreton ทประกอบดวยโปรตน 12-16 โมเลกล (Mergulhao และคณะ, 2005) โดย Sec-dependent pathway ไดมการศกษาและประสบความส าเรจในการหลงโปรตนชนดตางๆ ออกส periplasmic space หรออาหารเลยงเชอ (Kang และคณะ,2006; Songsiriritthigul และคณะ,2010; Yamabhai และคณะ, 2008) ซงโปรตนทหลงผาน Sec-dependent pathway จะประกอบดวย amino-terminal signal peptide ทมขนาดประมาณ 15–50 amino acid ท าหนาทเปน recognition signal ซง signal sequence โดยทวไปจะประกอบดวย positively charged amino terminus (n-region) ทมความยาวประมาณ 2-10 amino acid, central hydrophobic core (h-region) ทมความยาวประมาณ 6–15 amino acid และ polar cleavage region (c-region) ซงเปนต าแหนงทถกจดจ าโดย signal peptidase ดงแสดงในรปท 13 โดย signal sequence ทใชในการผลต รคอมบแนนทโปรตนใหหลงออกนอกเซลลโดยอาศย Sec-dependent pathway ใน E. coli ไดแก outer membrane protein A (OmpA), pectate lysate from Erwinia carotovora (PelB), alkaline phosphatase (PhoA), endoxylanase from Bacillus sp. (Enx) และ heat-stable enterotoxin II (SthII) เปนตน (Choi and Lee, 2004; Mergulhao และคณะ, 2005)

ภาพท 13 องคประกอบของ signal peptide sequence ซงประกอบดวย N- H- และ C-domain ทมา: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Signal_sequence.svg?uselang=de

40

โดยกระบวนการหลงโปรตนจะอาศยการจบกนระหวาง cytosolic chaperone SecB กบ unfold preprotein ทม N-terminal signal peptide และน าโปรตนเคลอนผาน inner membrane-bound SecA เมอ preprotein ถกสงไปยง inner-membrane ผานทาง SecYEG โดยอาศยพลงงานจาก ATP hydrolysis และ proton-motive force (PMF) ซงในขนตอนน signal peptide จะถกก าจดออกโดย signal peptidase สวนการหลงของโปรตนออกมานอกเซลลจะเกดจากการรวของโปรตนจาก periplasmic space เขาสอาหารเลยงเชอ โดยอาศยการท างานของ secreton หรอเปนผลมาจากการเพม permeability ของเยอหมเซลล ในชวงระยะเวลาระหวางการเหนยวน าดวยตวเหนยวน า (inducer) โปรตนทมขนาดเลกทหลงเขาส periplasmic space จะสามารถหลงเขาสอาหารเลยงเชอไดดกวาโปรตนทมขนาดใหญ (Choi and Lee, 2004; Mergulhao และคณะ, 2005; Yamabhai และคณะ, 2008) แสดงดงภาพท 14

ภาพท 14 recombinant protein ทหลงออกนอกเซลลโดยอาศย type II mechanism และวธการในการหลง recombinant proteins ออกจาก periplasmic space ทมา: Mergulhao และคณะ, 2005

41

ซงในป ค.ศ. 2005 มรายงานการศกษาทเกยวของกบการหลงเอนไซม OPH ออกส periplasmic space ใน E. coli โดยอาศย twin-arginine signal sequence โดยใช twin-arginine translocation (Tat) pathway พบวาประสบความส าเรจในการใช Tat pathway ส าหรบการหลงเอนไซม OPH ออกส periplasmic space และเมอท าการแยก (isolate) และตรวจวดกจกรรมของเอนไซม OPH ในสวนของ periplasmic fraction พบกจกรรมของเอนไซม OPH ประมาณ 22% เมอเปรยบเทยบกบเอนไซม OPH ทผลตภายในเซลล ซงพบกจกรรมของเอนไซมเพยง 1.7% ของกจกรรมเอนไซมทผลตใน periplasmic fraction แสดงใหเหนวามการหลง OPH ออกส periplasmic space ได (Kang และคณะ, 2005)

ในป ค.ศ. 2006 มรายงานการศกษาทเกยวของกบการหลงเอนไซม OPH ออกส periplasmic space ใน E. coli โดยอาศย pelB signal sequence โดยใช secretory (sec) pathway พบวาประสบความส าเรจในการแสดงออกของเอนไซม OPH ใหหลงเขาส periplasmic space และเมอวดกจกรรมของเอนไซมในสวนของ periplasmic fraction พบวากจกรรมของเอนไซม OPH มคากจกรรมของเอนไซมทพบใน periplasmic space ประมาณ 67% ของกจกรรมเอนไซมใน total cell lysate (Kang และคณะ,2006)

ในป ค.ศ. 2010 มรายงานการศกษาทเกยวของกบการ cotranslocation ของเอนไซม MPH และ OPH ใน periplasmic space และผวเซลลใน E. coli โดยใช twin-arginine translocation (Tat) pathway และ ice nucleation protein (INP) display system ตามล าดบ ซงพบวาสามารถผลตเอนไซมทง MPH และ OPH ใหหลงออกมายง periplasmic space และผวเซลล ตามล าดบ โดยสามารถวดคากจกรรมเอนไซมของ periplasmic fraction และ outer membrane fraction มคาประมาณ 35% และ 50% ของกจกรรมเอนไซมใน cell lysate ตามล าดบ (Yang และคณะ, 2010)

และจากงานวจยทผานมานนยงไมมการผลตเอนไซม MPH ทหลงออกมานอกเซลล โดยใช OmpA signal sequence ผานทาง SecB-dependent pathway ดงนนงานวจยนจงสนใจทจะศกษาการโคลนและการแสดงออกของยน mpdB เพอผลตเอนไซม MPH โดยใช พลาสมด pHisFlag-1 ทประกอบดวย OmpA signal sequence ซงออกแบบเพอการหลงโปรตน ซงหากงานวจยนส าเรจลงไดกจะเปนการเพมชองทางในการผลตเอนไซม MPH ทงายตอการท าบรสทธ มการละลาย (solubility) ทด และยงเปนการชวยลดตนทนในการผลตเอนไซมเพอน าไปประยกตใชตอไป

42

บทท 3

อปกรณและวธการด าเนนงานวจย

อปกรณทใชในการวจย

1. เชอแบคทเรยทใชในการวจย เชอแบคทเรยทใชในการวจยนเปนเชอ BpGP คอ เชอ E. coli สายพนธ BL21 ทมรคอม- บแนนทพลาสมด pGEX-6P-1 ทมยน mpdB จากเชอ Burkholderia cepacia ทสามารถยอยสลาย ยาฆาแมลง MP ทไดจากการทดลองกอนหนา จากภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร (วรฬห ศภลกษณนาร, 2549) และเชอ E. coli สายพนธ DH5α ทมพลาสมด pHisFlag-1 โดยไดรบความอนเคราะหจาก รศ.ดร.มณฑารพ ยมาภย สาขาเทคโนโลยชวภาพ ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

เชอแบคทเรยทใชเปนเซลลเจาบาน (host cell) เพอเพมปรมาณพลาสมดและท าการแสดงออกของยน mpdB ดงแสดงในตารางท 10

ตารางท 10 เชอแบคทเรยทใชเปนเซลลเจาบาน เพอเพมปรมาณพลาสมด และท าการแสดงออกของยนทสรางเอนไซม MPH

แบคทเรย จโนไทป แหลงทมา Escherichia coli สายพนธ DH5α

F- lend A1 hsd R17 (r-km

+k) supE44

thi-1 recA1 gyr A (Nalr) relA1 (lacIZYA-argF ) U169deoR (80dlac(lacZ)M15)

Ausubel, 1997

Escherichia coli สายพนธ BL21 (DE3) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB

-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

Invitrogen, USA

43

2. ดเอนเอพาหะ (vector) ทใชในการวจย 2.1 พลาสมด pTA2 (Toyobo, Japan)

พลาสมด pTA2 (Toyobo, Japan) เปนดเอนเอพาหะทใชส าหรบการโคลนในระบบ TA cloning ของชนสวนดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดเอนเอดวยวธพซอารโดยใชเอนไซม Taq DNA polymerase ซงจะมการเตมดออกซอะดโนซนไตรฟอสเฟส (dATP) ทปลาย 3’ ของ ชนดเอนเอทเพมปรมาณได จะท าใหชนดเอนเอทไดมปลาย overhang dA ทปลาย 3’ จงท าใหงายตอการเชอมตอเขาสพลาสมด pTA2 ทมปลาย overhang dT ทปลาย 5’ ตรงบรเวณ multiple cloning site (MCS) นอกจากนพลาสมด pTA2 ยงมยนตานทานตอยาปฏชวนะแอมพซลลน (ampicillin resistance gene) และยน lacZ ทท าหนาทเปน positive selective gene ท าใหสามารถคดเลอกทรานสฟอรแมนททมรคอมบแนนทพลาสมดโดยเทคนค blue-white selection ได และยงมต าแหนงตดจ าเพาะของเอนไซม EcoRI ครอมระหวางต าแหนงของ insert ท าใหสามารถตรวจสอบขนาดของ insert ดวยวธ restriction analysisไดดวยเอนไซม EcoRI เพยงชนดเดยว ดงแสดงในรปท 15 และ 16

2.2 พลาสมด pHisFlag-1 พลาสมด pHisFlag-1 ทใชในงานวจยน ไดรบความอนเคราะหจาก รศ. ดร.มณฑารพ ยมาภย

สาขาเทคโนโลยชวภาพ ส านกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ซงดดแปลงมาจากพลาสมด pFLAG-CTS โดยไดมการเตมยนทสราง histidine-tag protein ทางดาน downstream ของ multiple cloning site (MCS) ท าใหเกด fusion protein จากการแสดงออกของ ยนทโคลนเขาส MCS ซงชวยใหงายตอการแยกโปรตนทแสดงออกจากยนทตองการในกระบวนการท าบรสทธโปรตน สวนทางดาน upstream ของ MCS จะเชอมตออยกบ outer membrane protein A (OmpA) signal sequence ทสราง OmpA signal peptide ขนาด 21 amino acid ซงจะชวยน า fusion protein ใหหลงออกนอกเซลลในเซลลเจาบานทเปน E. coli ซง OmpA signal peptide นจะถกตดออกจาก fusion protein โดยเอนไซม signal peptidase ในระหวางกระบวนการน าสงโปรตนผานเยอหมเซลลชนใน (inner-membrane) ไปยง periplasmic space พลาสมดนประกอบดวยโปรโมเตอร (promoter) ชนด tac promoter ซงโปรโมเตอรนเกดจากการรวมกนระหวาง -35 consensus sequence ของ trp promoter และ -10 consensus sequence ของ lac promoter โดยควบคมในสวนของ lac operator, Shine-Dalgarno ribosome binding site, start codon (ATG) ซงจะท าใหมการแสดงออกของยนในระดบทสงและสามารถเหนยวน าใหเกดการแสดงออกของยนดวย isopropyl--D-thiogalactopyranoside (IPTG) นอกจากนภายในพลาสมด pHisFlag-1 ยงประกอบดวยยนเครองหมายในการคดเลอก (selectable marker) ไดแกยน -lactamase ซงเปน ยนตานทานยาปฎชวนะแอมพซลลน (ampicillin resistance gene; ampr) ทจะผลตเอนไซม -

44

lactamase ทสามารถยอยสลายยาปฎชวนะแอมพซลลน (ampicillin) ท าใหสามารถคดเลอกเซลล เจาบาน (E. coli) ทไดรบการถายโอนพลาสมดชนดนได ดงแสดงในรปท 17, 18 และ 19

ภาพท 15 แผนภาพโครงสรางของดเอนเอพาหะ pTA2 ทมา: http://www.toyobo.co.jp/e/bio

ภาพท 16 ล าดบนวคลโอไทดบรเวณ multiple cloning site (MCS) ของดเอนเอพาหะ pTA2 ทมา: http://www.toyobo.co.jp/e/bio

45

ภาพท 17 แผนภาพโครงสรางของดเอนเอพาหะ pFlag-CTS ทมา: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/cloning-and-expression/vector-systems/vector-maps.html

ภาพท 18 ต าแหนงของลกษณะพเศษของดเอนเอพาหะ pFlag-CTS ทมา: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/life-science/cloning-and-expression/feature-maps/pflag-cts.gif

46

ภาพท

19 แผ

นภาพ

โครงสร

างขอ

งดเอน

เอพาห

ะ pHi

sFlag

-1

47

3. ไพรเมอรทใชในการวจย ไพรเมอรทใชในการวจย ดงแสดงในตารางท 11

ตารางท 11 ไพรเมอรทใชในการวจย ไพรเมอร ล าดบนวคลโอไทด (5’ 3’)

XhoI-mpd_F GATCTCGAG GCC GCA CCG CAG GTG CG KpnI-mpd_R GATGGTACC CTT GGG GTT GAC GAC CGA G

4. ดเอนเอมาตรฐาน (Standard DNA Marker)

4.1 DNA ladder ขนาด 1 kb (Biolabs, UK) 4.2 DNA ladder ขนาด 1 kb (Fermentas, USA) 4.3 DNA ladder ขนาด 100 bp (Fermentas, USA)

5. โปรตนมาตรฐาน (Standard Protein Marker)

5.1 Protein Marker Broad Range 2- 212 kDa (Biolabs, UK) 5.2 Prestained SDS-PAGE Standards (BIO-RAD, USA)

6. เอนไซม (Enzyme) ทใชในการวจย 6.1 เอนไซม RNase A (Amresco, USA) 6.2 เอนไซมตดจ าเพาะ (restriction enzyme) ทใชในงานวจย คอ EcoRI (Fermentas, USA),

XhoI (New England Biolabs, USA) และKpnI (Toyobo, Japan) 6.3 เอนไซม T4 DNA ligase (Fermentas, USA) 6.4 เอนไซม Taq DNA polymerase (Biolabs, USA)

7. ชดทดสอบส าเรจรป 7.1 ชดสกดดเอนเอออกจากเจล E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit (Omeka bio-tek, USA) 7.2 ชดโคลนผลผลตจากปฏกรยาพซอาร TArget CloneTM (Toyobo, Japan) 7.3 ชดสกดพลาสมดดเอนเอจากเชอแบคทเรย PrestoTM Mini Plasmid Kit (Geneaid, Taiwan) 7.4 ชดตรวจวดโปรตน Bio-Rad Bradford protein assay (BIO-RAD, USA)

48

8. คอลมนส าหรบท าบรสทธ 8.1 HisPur™ Cobalt Chromatography Cartridges (Thermo Scientific, USA) 8.2 HisPur™ Cobalt Spin Column (Thermo Scientific, USA)

9. สารเคม ชอสารเคม บรษทผผลต 9.1 absolute ethanol Lab Scan, Thailand 9.2 30% acrylamide AppliChem, Germany

9.3 agar Scharlau, USA 9.4 agarose LAB M, UK 9.5 ammonium persulfate (APS) BIO BASIC INC., USA

9.6 ammonium sulfate QRëC, New Zealand 9.7 ampicillin Fluka, USA 9.8 bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, USA 9.9 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranoside (X-gal) Promega, USA 9.10 bromophenol blue Fluka, USA 9.11 calcium chloride Merck, Germany 9.12 chloroform Merck, Germany

9.13 coomassie brilliant blue R-250 Fluka, UK 9.14 dNTPs Promega, USA 9.15 ethanol BHD Analar, USA 9.16 ethidium bromide Sigma, USA 9.17 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Amresco, USA 9.18 glacial acetic acid Lab Scan, Thailand 9.19 glucose Fluka, USA

9.20 glycerol Amresco, USA 9.21glycine Fluka, USA

9.22 hydrocloric acid Lab Scan, Thailand 9.23 imidazole Bio Basic, Canada 9.24 isoamyl alcohol Merck, Germany

49

ชอสารเคม บรษทผผลต 9.25 isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) Amresco, USA 9.26 magnesium sulfate Merck, Germany 9.27 mercaptoethanol ACROS Organics, USA 9.28 methanol PROLABO, USA

9.29 methyl parathion Sigma-Aldrich, USA 9.30 4-nitrophenol Merck, Germany 9.31 phenol : chloroform Amresco, USA 9.32 sodium acetate Lab Scan, Thailand 9.33 sodium bicarbonate Lab Scan, Thailand 9.34 sodium chloride Fluka, USA 9.35 sodium dodecyl sulfate (SDS) Fluka, USA 9.36 sodium phosphate Riedel-de Haën, Germany 9.37 sodium hydroxide Akzo Nobel, Netherland 9.38 sucrose Fluka, USA 9.39 N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine (TEMED) Fluka, USA 9.40 tris-base Sigma-Aldrich, USA 9.41 99% triton X-100 Amresco, USA 9.42 tryptone LAB M, UK 9.43 tween 80 Amresco, USA 9.44 Xylene cyanal FF Fluka, USA 9.45 yeast extract LAB M, UK

50

10. เครองมอ 10.1 autoclave รน Ss-325 (Tomy, Japan) 10.2 autoclave รน sx-700 (Tomy, Japan) 10.3 biological safety cabinet class II type AIB3 (Nuaire, USA) 10.4 centrifuge รน GS-15R centrifuge (Beckman, USA) 10.5 centrifuge รน RC6 (Sorvall, USA) 10.6 centrifuge รน MIKRO 120 (Hettich Zentrifugen, Germany) 10.7 centrifuge รน Universal 12 (Hettich Zentrifugen, Germany) 10.8 deionizer pure UV ultrapure water system (Thermo Fisher Scientific, USA) 10.9 desicator No. 5311 (Nalgene Labware, USA) 10.10 fast protein liquid chromatography (FPLC) รน ÄKTAFPLC (Amersham Pharmacia,

Sweden) 10.11 gel document รน Multi Genius (Syngene, UK) 10.12 geneamp PCR system 2400 (Perkin Elmer, USA) 10.13 hot air oven Model ULM 500 (Memmert, Germany) 10.14 incubator shaker (Shel Lab, USA) 10.15 micro reader รน Sunrise-Basic TECAN (TECAN, Switzerland) 10.16 mini-PROTEAN® Tetra System (BIO-RAD, USA) 10.17 mini SUBTM DNA CELL (BIO-RAD, USA) 10.18 power supply (power PAC 3000) (BIO-RAD, USA) 10.19 spectrophotometer รน gensys 8 (Spectronic Instrument, UK) 10.20 sonicator (Vibra Cell, USA) 10.21 UV – transluminator (Fotodyne Incorporated, USA) 10.22 vortex (Scientific Industries, USA) 10.23 water bath (Scientific Promotion,Thailand) 10.24 เครองเขยาควบคมอณหภม รน Classic C24 (New Brunswick Scientific, USA) 10.25 เครองชง 2 และ 4 ต าแหนง (Sartorius, Germany) 10.26 เครองผลตน ากลน รน Maxima LS. Model (ELGA, UK) 10.27 เครองวดความเปนกรด-ดาง (Schott, Germany)

51

11. อปกรณอนๆ 11.1 aluminum foil 11.2 autopipette 11.3 beaker 11.4 biotech regenerated cellulose (RC) membrane (Spectrum Labs, USA) 11.5 centrifuge tube 11.6 cylinder 11.7 erlenmeyer flask 11.8 forcep 11.9 glass pipette 11.10 parafilm 11.12 loop 11.13 microplate 11.14 microtube 11.15 pastuer pipette 11.16 petridish 11.17 rack 11.18 spreader 11.19 syringe 11.20 syringe filter sterile ขนาด 0.45 micrometers (Corning, Germany) 11.21 vivaspin 6 และ 20 molecular weight cut off (MWCO) ขนาด 10 kDa (GE Healthcare,

Sweden) 11.22 ตะเกยงแอลกอฮอล 11.23 ถงพลาสตก 11.24 ส าล 11.25 ไมจมฟนปราศจากเชอ

52

วธด าเนนการวจย

1. การสรางรคอมบแนนทโคลนทมยน mpdB โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน

1.1 การเตรยมชนสวนดเอนเอของยน mpdB 1.1.1 การสกดพลาสมดดเอนเอจากเชอจลนทรยทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP ดวยวธ

rapid alkaline extraction (Sambrook และคณะ, 1989) ท าการเพาะเลยงเชอ BpGP (เชอ E. coli สายพนธ BL21 ทมรคอมบแนนทพลาสมด

pGEX-6P-1 ทมยน mpdB) ทไดจากการทดลองกอนหนาน (วรฬห ศภลกษณนาร, 2549) มาเลยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร ทมยาปฎชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท นาน 16-18 ชวโมง จากนนตกตะกอนเซลลโดยถายเชอจลนทรย ปรมาตร 1.5 มลลลตร ลงในหลอดไมโครเซนตรฟวจ น าไปปนเหวยงตกตะกอนเซลลทความเรว 8,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท จากนนเทสวนใสทง เตมเซลลทยงเหลออยลงในหลอดไมโครเซนตรฟวจหลอดเดม ปนเหวยงตกตะกอนเซลลจนกระทงเซลลหมด ลางตะกอนเซลลโดยการละลายตะกอนเซลลดวยบฟเฟอร GTE ปรมาตร 1 มลลลตร ปนเหวยงเกบตะกอนเซลลทความเรว 8,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท จ านวน 2 ครง จากนนละลายตะกอนเซลลดวยบฟเฟอร GTE ปรมาตร 50 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยใช vortex แลวท าใหเซลลแตกโดยการเตม alkaline SDS ปรมาตรหลอดละ 300 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยกลบหวทายหลอดอยางเบามอ ประมาณ 4-6 ครง น าไปแชในน าแขงนาน 10 นาท จากนนเตมสารละลายโซเดยมอะซเตต ความเขมขน 3 โมลาร พเอช 4.8 ปรมาตร 200 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยกลบหวทายหลอดอยางเบามอ ประมาณ 4-6 ครง น าไปแชในน าแขงนาน 5 นาท แลวปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท น าสวนใสทไดมาถายใสหลอดไมโครเซนตรฟวจ หลอดใหม ท าการก าจดโปรตนและเศษเซลลโดยการเตมสารละลาย phenol:chloroform:isoamyl alcohol (อตราสวน 25:24:1 โดยปรมาตร) ปรมาตร 1 เทาของสารละลายสวนใสทได ผสมใหเขากน โดยกลบหวทายหลอดอยางเบามอ ประมาณ 4-6 ครง จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 8,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท ดดสารละลายชนบนถายใสหลอดเซนตรฟวจหลอดใหม แลวท าการก าจดสารละลาย phenol สวนเกนโดยการเตมสารละลาย chloroform:isoamyl alcohol (อตราสวน 24:1 โดยปรมาตร) ปรมาตร 1 เทาของสารละลายชนบนทได ผสมใหเขากนโดยกลบหวทายหลอดอยางเบามอ ประมาณ 4-6 ครง น าไปปนเหวยงทความเรว 8,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท จากนนดดสารละลายช นบนถายใสหลอดเซนตรฟวจหลอดใหม ท าการตกตะกอนดเอนเอโดยเตมเอทธานอล ความเขมขน 95 เปอรเซนต ในปรมาตร 2 เทาของสารละลายชนบนทได น ามาแชเยน

53

ทอณหภม –80 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท จากนนปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท นาน 10 นาท เทสารละลายสวนใสทง แลวลางตะกอนดเอนเอดวยเอทธานอล ความเขมขน 70 เปอรเซนต ปรมาตร 200 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสารละลายสวนใสทง แลวท าใหตะกอนดเอนเอแหงดวยเครองดดความชนสญญากาศ จากนน ท าการละลายตะกอนดเอนเอดวยบฟเฟอร TE พเอช 8.0 ปรมาตร 20 ไมโครลตร เกบทอณหภม –20 องศาเซลเซยส จนกวาจะน าไปใชตอไป

1.1.2 การออกแบบไพรเมอรตอยน mpdB ท าการออกแบบไพรเมอรจากขอมลล าดบนวคลโอไทดของเชอแบคทเรย Plesiomonas

sp. สายพนธ M6 หมายเลข accession number AF338729 ของ GenBank ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP (Zhongli และคณะ, 2001) ทม homology กบล าดบนวคลโอไทดทถอดรหสมาจาก ล าดบของกรดอะมโนดาน N-terminus ของเชอ Burkholderia cepacia ซงมผวจยไวกอนหนาน (เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ และ บญศร จงเสรจต , 2544) โดยพจารณาจาก open reading frame (ORF) ของยนทสรางเอนไซม MPH ทมล าดบนวคลโอไทดในต าแหนงท 723-1718 (Zhongli และคณะ, 2001) ซงท าการออกแบบไพรเมอรเฉพาะในสวนของยนท code ใหเอนไซม MPH (mature MPH) โดยไมรวมกบ signal sequence เดมของเอนไซมทประกอบดวยกรดอะมโนจ านวน 35 ตว ซงมล าดบนวคลโอไทดในต าแหนงท 723-827 (Fu และคณะ, 2004) รวมทงออกแบบใหไมม stop codon (TGA) ทล าดบนวคลโอไทดในต าแหนงท 1718 (Zhongli และคณะ, 2001; Fu และคณะ, 2004) เนองจากพลาสมด pHisFlag-1 ทใชในการทดลองนทางดาน upstream ของ multiple cloning site (MCS) จะม OmpA signal sequence ท code ให OmpA signal peptide ทางดาน N-terminus ของฟวชนโปรตน และทางดาน downstream ของ MCS จะม polyhistidine-tag (His-tag) sequence ท code ให His-tag ทางดาน C-terminus (His C–terminal fusion protein) ของฟวชนโปรตน ดงนนการโคลนยน mpdB ทไมม stop codon เขาส MCS ของพลาสมมด pHisFlag-1 จะท าใหไดเอนไซมMPH ทได ทม OmpA signal peptide ทางดาน N-terminus และ His-tag ทางดาน C-terminus ซงจะท าใหงายแกการแยกบรสทธเอนไซม MPH โดยใช metal – affinity chromatography column และออกแบบใหมต าแหนงของเอนไซมตดจ าเพาะส าหรบเอนไซม XhoI ในสวนของฟอรเวรดไพรเมอร (forward primer) และ KpnI ในสวนของรเวรสไพรเมอร (reverse primer) เพอใชในการโคลน ยน mpdB เขาส expression vector pHisFlag-1 ซงเปนพลาสมดทออกแบบมาเพอการหลงโปรตน โดยไพรเมอรทใชในการศกษามล าดบนวคลโอไทดดงน

54

ไพรเมอร XhoI-mpd_F มล าดบนวคลโอไทดเปน 5’ GATCTCGAG GCC GCA CCG CAG GTG CG 3’

ไพรเมอร KpnI-mpd_R มล าดบนวคลโอไทดเปน 5’ GATGGTACC CTT GGG GTT GAC GAC CGA G 3’

โดยบรเวณทขดเสนใตคอต าแหนงของเอนไซมตดจ าเพาะส าหรบเอนไซม XhoI ในไพรเมอร XhoI-mpd_F และ KpnI ในไพรเมอร KpnI-mpd_R โดยล าดบนวคลโอไทดของเชอแบคทเรย Plesiomonas sp. สายพนธ M6 หมายเลข accession number AF338729 ของ GenBank และต าแหนงของไพรเมอรทออกแบบตอยน mpdB แสดงในภาพท 20

1.1.3 การเพมปรมาณชนดเอนเอดวยเทคนคพซอาร หลงจากท าการสกดพลาสมดดเอนเอจากเชอ E. coli สายพนธ BL21 ทมรคอมบแนนท

พลาสมด pGEX-6P-1 ทมยน mpdB น ามาท าการเพมปรมาณยน mpdB โดยเทคนคพซอาร ซงในปฏกรยาพซอารมองคประกอบดงน

สารละลายบฟเฟอร Taq ทมแมกนเซยมคลอไรด (10 เทา) ความเขมขน 1 เทา ดออกซนวคลโอไทดไตรฟอสเฟตผสม (dNTPs mix) ความเขมขน 0.2 มลลโมลาร ไพรเมอร XhoI-mpd_F ความเขมขน 0.5 ไมโครโมลาร ไพรเมอร KpnI-mpd_R ความเขมขน 0.5 ไมโครโมลาร เอนไซม Taq DNA polymerase ความเขมขน 1 หนวย ดเอนเอแมแบบ (รคอมบแนนทพลาสมดในขอ 1.1.1) ความเขมขน 1 ไมโครกรม

แลวปรบปรมาตรของปฏกรยาดวยน าปราศจากไอออนจนมปรมาตรสดทายเปน 20 ไมโครลตร ผสมใหเขากน น าไปปนในเครองปนเหวยงเวลาประมาณ 3-4 วนาท เพอใหสวนผสมรวมกนทกนหลอด จากนนน าเขาเครอง GeneAmp PCR System 2400 โดยใชสภาวะในการท าปฏกรยาดงน

Initial denaturation 94 องศาเซลเซยส 5 นาท Denaturation 94 องศาเซลเซยส 30 นาท

Annealing 56 องศาเซลเซยส 30 วนาท Extension 72 องศาเซลเซยส 1.10 นาท Final extension 72 องศาเซลเซยส 10 นาท Hold 4 องศาเซลเซยส ∞

30 รอบ

55

1 ggatctgctc cagcgtcagc tccgggccca gcgggtcgcg ctcctggtac atctggccat 61 tgaccatgag catgcgcagc gccgggttgg tggagtagct ggaaccgccg acggccactt 121 tcggcagggc gttgcgcaca tcgggtggca ggtcggccac ggcatagacg cgcggctcgt 181 tggccgtgag cgcgtcggtg gcggcggccc ggcggcggct gcgcgcaccg ccttcgggcg 241 ccgaggcgtc gggtgtgctt tcgacggcgg tcacggcggt gatctgcggc accggcaggg 301 cggcagcggg cgggggcgac accgtgggcg gcggcaggct ggcggccacc gggctgcccg 361 cgtggatgcg caccgtgacc gggttgacca gatacagcac caccaggccg gccacagcca 421 caccggcggt gaccaccggc cacagccaca ccggccgctc ggtgcccgcc acgtcgctgc 481 cgggcatcac ctgctgggtg tgcagccccg gcaccgagcc gcgcccgcgg tcggactccg 541 cgcgtttgag ggcgtcaagg atgtaggaca tggcgtcgtc ggctgggcag ggtggcggcg 601 aaaaccggaa gcatacaggg cgccggcccg cgccggtgca ccgggcaacc ccgatgttgc 661 aaagccgttg caatctcggt atactccggc gcgagtccat gcccacccac aaggaaatca 721 ccatgcccct gaagaaccgc ttgctggccc gcctgtcctg tgttgcggcc gtggtggccg 781 ccacggccgc cgttgcaccg ttgacgctgg tgtccaccgc ccacgccgcc gcaccgcagg 841 tgcgcacctc ggcccccggc tactaccgga tgctgctggg cgacttcgaa atcaccgcgc 901 tgtcggacgg cacggtggcg ctgccggtcg acaagcggct gaaccagccg gccccgaaga 961 cgcagagcgc gctggccaag tccttccaga aagcgccgct cgaaacctcg gtcaccggtt 1021 acctcgtcaa caccggctcc aagctggtgc tggtggacac cggcgcggcc ggcctgttcg

1081 gccccaccct gggccggctg gcggccaacc tcaaggccgc aggctatcag cccgagcagg

1141 tcgacgagat ctacatcacc cacatgcacc ccgaccacgt gggcggcttg atggtgggtg

1201 agcaactggc gttcccgaac gcggtggtgc gtgcggacca gaaagaagcc gatttctggc

1261 tcagccagac caacctcgac aaggccccgg acgacgagag caaaggcttc ttcaaaggcg

1321 ccatggcctc gctgaacccc tatgtgaagg ccggcaagtt caagcctttc tcggggaaca

1381 ccgacctggt gcccggcatc aaagcgctgg ccagccacgg ccacaccccg ggccacacca

1441 cctacgtggt cgaaagccag gggcaaaagc tcgccctgct cggcgacctg atactcgtcg

1501 ccgcggtgca gttcgacgac cccagcgtca cgaaccagct cgacatcgac ggcaagtccg

1561 ccgcggtgga gcgcaagaag gccttcgcgg atgccgccaa gggcggctac ctgatcgcgg

1621 cgagccacct gccgttcccc ggcatcggcc acatccgcgc cgaaggcaag ggctaccgtt

1681 tcgtgccggt gaactactcg gtcgtcaacc ccaagtgact gggcagtggc cgccttgccc

1741 gcaccgttag gggtggcagg cggccgcgcg ctcgcgcagc agcgcctcct cgcggcggtt

1801 gcgcgcaagg tcggcggcaa cgaggtaggc cgcacgcgcc tcggcgcggc gacccaggcg

1861 ctgcagcagg tcggcccgca cgctgggcag caggtggtac tgctggaacc ggggctccag

1921 cgcgagcccg tccaccaggg ccagcgcctc ggccggacca cgggcctgcc ccacggccac

1981 cgcgcggttc agcgccacca ccggtgaagg catgacctgc agcagcccgt cgtacagggc

2041 cacgatgcgc gaccagtcgg tcgcgccggg cgtgacggcg cgcgcatggc aggcagcgat

2101 cgcggcctgc agcgcatagg ggccatgccc gcggtcctgc acggccagca gcccctcggc

2161 ccgcgccagg gccgccagcc cccggcggat c

ภาพท 20 ล าดบนวคลโอไทดของเชอแบคทเรย Plesiomonas sp. สายพนธ M6 (accession number: AF338729) โดยบรเวณแถบสเขยว แสดงต าแหนงของ start codon, แถบสเหลอง แสดงต าแหนงของ signal sequence, แถบสแดง แสดงต าแหนงของไพรเมอร และแถบสฟา แสดงต าแหนงของ stop codon

56

1.1.4 การแยกวเคราะหดเอนเอดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโตรโฟเรซส (Agarose Gel Electrophoresis)

หลงจากท าการเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนคพซอารแลว ท าการตรวจสอบชนสวน ดเอนเอทเพมปรมาณไดโดยการน ามาแยกวเคราะหดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโตรโฟเรซส โดยการเตรยมเจลอะกาโรส ความเขมขน 1 เปอรเซนต ละลายอะกาโรสในบฟเฟอร 1X TAE พเอช 8.0 ดวยความรอน จากนนท าใหเยนลงจนมอณหภมประมาณ 55 องศาเซลเซยส เทเจลลงในถาดเจล (chamber) พรอมเสยบหว (comb) แลวทงใหเจลแขงตวทอณหภมหอง ประมาณ 30 นาท จงดงหวออก เทบฟเฟอร 1X TAE พเอช 8.0 ใหทวมแผนเจลอะกาโรสทแขงตว จากนนผสมสารละลายดเอนเอกบ 6X loading buffer ในอตราสวน 3 ตอ 1 แลวหยอดสารละลายผสมทได ลงในหลมของเจลอะกาโรส จากนนท าอเลกโตรโฟเรซสทความตางศกยไฟฟาคงทท 80 โวลต นาน 90 นาท ยอมเจลดวยสารละลายเอธเดยมโบรไมด ความเขมขน 0.5 ไมโครกรมตอมลลลตร นาน 15 นาท น าไปตรวจดแถบดเอนเอภายใตแสงอลตราไวโอเลต

1.1.5 การแยกดเอนเอใหบรสทธจากเจลอะกาโรส โดยใชชดสกดดเอนเอส าเรจรป E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit

หลงจากแยกว เคราะหดเอนเอดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโตรโฟเรซส แลว ท าการตรวจสอบแถบของดเอนเอภายใตแสงอลตราไวโอเลต จากนนใชใบมดทสะอาดปราศจากเชอตดลงบนแผนเจลบรเวณทมดเอนเอทตองการ น าชนเจลทไดใสลงในหลอดไมโครเซนตรฟวจ ททราบน าหนก แลวน าไปชงน าหนกเพอหาน าหนกของชนเจล ท าการสกดแยกบรสทธดเอนเอ จากเจลอะกาโรสตามวธในคมอของ E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit โดยการเตมบฟเฟอร binding (XP2) ในอตราสวน 1 มลลลตร ตอ 1 กรม ของชนเจลทตดได จากนนน าไปบมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส นานประมาณ 7 นาท โดยผสมสารละลายใหเขากนโดยการ vortex ทกๆ 2-3 นาท หรอจนกระทงชนเจลละลายหมด จากนนดดสารละลายผสมดเอนเอและอะกาโรส ปรมาตร 700 ไมโครลตร ใสลงใน HiBind DNA mini column ทบรรจอยในหลอด collection ขนาด 2 มลลลตร น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท เทของเหลวในหลอด collection ทง แลวน า HiBind DNA mini column บรรจลงในหลอด collection ตามเดม ท าเชนเดมจนกวาสารละลายจะหมด จากนนท าการลางคอลมนโดยการเตมบฟเฟอร binding (XP2) ปรมาตร 300 ไมโครลตร ลงใน HiBind DNA mini column น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท เทของเหลวในหลอด collection ทง แลวน า HiBind DNA mini column ใสลงในหลอด collection ตามเดม จากนนท าการลางคอลมนโดยการเตมบฟเฟอร SPW Wash ปรมาตร 700 ไมโครลตร ลงใน HiBind DNA mini column น าไปปนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท

57

นาน 1 นาท เทของเหลวในหลอด collection ทง แลวน า HiBind DNA mini column ใสลงในหลอด collection ตามเดม จากนนท าคอลมนใหแหงโดยการปนเหวยงทความเรว 13,000 รอบตอนาท นาน 2 นาท เพอก าจดเอทานอลทเปนองคประกอบของบฟเฟอร SPW Wash ออกจากคอลมน จากนนยาย HiBind DNA mini column ใสลงในหลอดไมโครเซนตรฟวจขนาด 1.5 มลลลตร แลวท าการชะดเอนเอออกจากคอลมนโดยการเตมบฟเฟอร elution ปรมาตร 30-50 ไมโครลตร ลงใน HiBind DNA mini column ตงทงไว 1 นาท จากนนปนเหวยงทความเรว 13,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท เกบสารละลายดเอนเอทไดทอณหภม -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะน าไปใชตอไป

1.2 การโคลนยน mpdB 1.2.1 การเชอมตอยน mpdB เขากบดเอนเอพาหะ pTA2 โดยวธส าเรจรปโดยใช TArget

CloneTM ส าหรบชนสวนดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดเอนเอดวยเอนไซม Taq DNA polymerase

น าชนสวนดเอนเอทไดจากปฏกรยาพซอารทผานการท าบรสทธโดยชดสกดดเอนเอส าเรจรป E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit ทเตรยมไดจากขอ 1.1.5 มาท าการเชอมเขากบพลาสมด pTA2 ตามวธทอธบายไวในคมอของ TArget Clone/ TArget Clone -Plus- เนองจากชนดเอนเอ ทไดรบจากการเพมปรมาณดวยวธพซอารโดยใชเอนไซม Taq DNA polymerase จะมการเตม ดออกซอะดโนซนไตรฟอสเฟส (dATP) ทปลาย 3’ ของชนดเอนเอทเพมปรมาณได จะท าใหชน ดเอนเอทไดมปลาย overhang dAทปลาย 3’ จงท าใหงายตอการเชอมตอเขาสพลาสมด pTA2 ทมปลาย overhang dT ทปลาย 5’ ตรงบรเวณ multiple cloning site (MCS) โดยปฏกรยาการเชอมตอ ดเอนเอมองคประกอบดงน

สารละลายบฟเฟอร ligation (2 เทา) ความเขมขน 1 เทา พลาสมด pTA2: ชนสวนดเอนเอ (1: 3) พลาสมด pTA2 (50 ng/µl) ความเขมขน 50 นาโนกรม

ชนสวนดเอนเอ (ดเอนเอทไดจากขอ 1.1.5) ความเขมขน 150 นาโนกรม เอนไซม T4 DNA ligase (Toyobo, Japan) ความเขมขน 1 หนวย

แลวปรบปรมาตรของปฏกรยาดวยน าปราศจากไอออนจนมปรมาตรสดทายเปน 10 ไมโครลตร ผสมใหเขากน น าไปปนในเครองปนเหวยงเวลาประมาณ 3-4 วนาท เพอใหสวนผสมรวมกนทกนหลอด แลวน าไปบมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นานขามคน หลงจากนนท าการหยดปฏกรยา ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะน าไปใชตอไป

58

1.2.2 การเตรยม Competent Cell เชอ E. coli สายพนธ DH5α น าเชอ E. coli สายพนธ DH5α ทเจรญบนอาหารแขง LB มาเลยงในอาหารเหลว LB

ปรมาตร 20 มลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท ทงไวขามคน จากนนท าการถายเชอลงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร บมท 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท น าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 600 นาโนเมตร จนมคาประมาณ 0.2-0.5 จากนนน าไปแชในอางน าแขง นาน 10 นาท แลวท าการตกตะกอนเซลลโดยถายเชอจลนทรยลงในหลอดเซนตรฟวจ น าไปปนเหวยงทความเรว 2,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท เทสวนใสทง เตมเซลลทยงเหลออยลงในหลอดหลอดเซนตรฟวจหลอดเดม ปนเหวยงตกตะกอนเซลลจนกระทงเซลลหมด ลางตะกอนเซลลโดยการละลายตะกอนเซลลดวยสารละลายแคลเซยมคลอไรด ความเขมขน 0.1 โมลาร ทเยน ปรมาตร 2 มลลลตร จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 2,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท เทสวนใสทง จากนนละลายตะกอนเซลลดวยสารละลายแคลเซยมคลอไรด ความเขมขน 0.1 โมลาร ทเยน ปรมาตร 2 มลลลตร แชในอางน าแขงนาน 30 นาท จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 2,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท เทสวนใสทง แลวละลายตะกอนเซลลดวยสารละลายแคลเซยมคลอไรด ความเขมขน 0.1 โมลาร ทเยน ปรมาตร 1 มลลลตร

1.2.3 การถายโอนรคอมบแนนทพลาสมดเขาสเซลลเจาบาน E. coli สายพนธ DH5α หลงจากเตรยม competent cell ของเชอ E. coli สายพนธ DH5α ตามวธในขอ 1.2.2 แลว

น า competent cell ทได ปรมาตร 200 ไมโครลตร ใสลงในหลอดไมโครเซนตรฟวจ จากนนเตม รคอมบแนนทพลาสมดทท าการเชอมตอยนทสรางเอนไซม MPH เขากบพลาสมด pTA2 ทเตรยมไดจากขอ 1.2.1 ปรมาตร 10 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยใชไมโครปเปตดดขนลงเบาๆ น าไปแชน าแขงนาน 30 นาท จากนนยายไปบมทอณหภม 42 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท แลวยายไปแชน าแขงนาน 5 นาท เตมอาหารเหลว LB ปรมาตร 800 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรว 200 รอบตอนาท นาน 1 ชวโมง จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 5000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสวนใสทง แลวละลายตะกอนเซลลดวยอาหารเหลว LB ปรมาตร 100 ไมโครลตร น าเชอทไดไปเกลยลงบนอาหารแขง LB ทประกอบดวยยาปฏชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร, IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร และ X-gal ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 16-18 ชวโมง หลงจากนนท าการคดเลอกทรานสฟอรแมนทดวยวธ blue-white selection โดยเลอกโคโลนทมสขาวมาท าการตรวจสอบทรานสฟอรแมนทตอไป

59

1.2.4 การสกดรคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทมยน mpdB จากทรานสฟอรแมนท หลงจากท าการถายโอนรคอมบแนนทพลาสมดเขาสเชอ E. coli สายพนธ DH5α แลว

น าทรานสฟอรแมนททคดเลอกไดจากขอ 1.2.3 มาท าการสกดพลาสมด โดยน ามาเลยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร ทมยาปฎชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท นาน 16-18 ชวโมง และท าการสกดพลาสมดเชนเดยวกบวธในขอ 1.1.1 จากนนท าการวเคราะหรคอมบแนนทพลาสมดทสกดไดตอไป

1.2.5 การวเคราะหรคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทมยน mpdB (pTA2::mpdB) ดวยวธ Restriction Analysis

หลงจากท าการเพมปรมาณรคอมบแนนทพลาสมด และท าการสกดรคอมบแนนท พลาสมดจากทรานสฟอรแมนททคดเลอกไดแลว ท าการตรวจสอบรคอมบแนนทพลาสมดทสกดไดจากขอ 1.2.4 โดยการตดรคอมบแนนทพลาสมดเพอตรวจสอบชนสวนดเอนเอของยน mpdB ดวยเอนไซม EcoRI, XhoI และ KpnI โดยผสมสารละลายในปฏกรยาการตดรคอมบแนนทพลาสมดใหเขากน แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นานขามคน หยดปฏกรยาโดยบมท อณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท แลวท าการตรวจสอบดเอนเอดวยเทคนคอะกาโรสเจล อเลกโทรโฟรซสโดยด าเนนการเชนเดยวกบวธในขอ 1.1.4 โดยใช 1 kb DNA ladder เปน ดเอนเอมาตรฐาน

1.3 การสบโคลนยน mpdB 1.3.1 การเตรยมชนดเอนเอของยน mpdB จากเชอ E. coli สายพนธ DH5α ทมพลาสมด

pTA::mpdB ส าหรบการสบโคลน หลงจากท าการคดเลอกและตรวจสอบทรานสฟอรแมนททมพลาสมด pTA2::mpdB

แลว ท าการเพาะเลยงทรานสฟอรแมนท E. coli สายพนธ DH5α ทมพลาสมด pTA2::mpdB น เพอเพมปรมาณรคอมบแนนทพลาสมด โดยน ามาเลยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร ทม ยาปฎชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท นาน 16-18 ชวโมง แลวท าการสกดพลาสมดโดยด าเนนการเชนเดยวกบวธในขอ 1.1.1 จากนนท าการตดรคอมบแนนทพลาสมดทสกดได ดวยเอนไซม XhoI และ KpnI โดยผสมสารละลายในปฏกรยาการตดรคอมบแนนทพลาสมดใหเขากน แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นานขามคน หยดปฏกรยาโดยบมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท แลวท าการตรวจสอบชนสวนดเอนเอทได โดยการแยกวเคราะหดเอนเอดวยเทคนค อะกาโรสเจลอเลกโทรโฟรซส จากนนท าการแยกชนดเอนเอบรเวณยน mpdB ใหบรสทธจากเจล

60

อะกาโรส โดยใชชดสกดดเอนเอส าเรจรป โดยด าเนนการเชนเดยวกบวธในขอ 1.1.4 และขอ 1.1.5 ตามล าดบ

1.3.2 การเตรยมพลาสมด pHisFlag-1 ส าหรบการสบโคลน ท าการเตรยมพลาสมดทใชในการเชอมตอกบชนดเอนเอของยน mpdB ทเตรยมไดจาก

ขอ 1.3.1 โดยท าการเพาะเลยงเชอ E. coli สายพนธ DH5α ทมพลาสมด pHisFlag-1 มาเลยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร ทมยาปฎชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท นาน 16-18 ชวโมง แลวท าการสกดพลาสมดโดยด าเนนการเชนเดยวกบวธในขอ 1.1.1 จากน นท าการตด รคอมบแนนทพลาสมดทสกดได ดวยเอนไซม XhoI และ KpnI โดยผสมสารละลายในปฏกรยาการตดพลาสมดใหเขากน แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นานขามคน หยดปฏกรยาโดยบมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท แลวท าการตรวจสอบชนสวนดเอนเอทไดโดยการ แยกวเคราะหดเอนเอดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรโฟรซส จากนนท าการแยกชนดเอนเอบรเวณพลาสมด pHisFlag-1 ใหบรสทธจากเจลอะกาโรส โดยใชชดสกดดเอนเอส าเรจรป โดยด าเนนการเชนเดยวกบวธในขอ 1.1.4 และขอ 1.1.5 ตามล าดบ

1.3.3 การเชอมตอยน mpdB เขากบพลาสมด pHisFlag-1 น าชนสวนดเอนเอของยน mpdB ทเตรยมไดในขอ 1.3.1 และชนสวนของพลาสมด

pHisFlag-1 ทเตรยมไดในขอ 1.3.2 มาท าการเชอมตอชนสวนดเอนเอทง 2 เขาดวยกน โดยปฏกรยาทใชในการเชอมตอดเอนเอมองคประกอบดงน สารละลายบฟเฟอร ligation (10 เทา) ปรมาตร 1 ไมโครลตร พลาสมด pHisFlag-1: ชนสวนดเอนเอ (1: 3) พลาสมด pHisFlag-1 (ดเอนเอทไดจากขอ 1.3.2) ปรมาตร 1 ไมโครลตร

ชนสวนดเอนเอ (ดเอนเอทไดจากขอ 1.3.1) ปรมาตร 5 ไมโครลตร เอนไซม T4 DNA ligase ปรมาตร 1 ไมโครลตร

แลวปรบปรมาตรของปฏกรยาดวยน าปราศจากไอออนจนมปรมาตรสดทายเปน 10 ไมโครลตร ผสมใหเขากน น าไปปนในเครองปนเหวยงเวลาประมาณ 3-4 วนาท เพอใหสวนผสมรวมกนทกนหลอด แลวน าไปบมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นานขามคน หลงจากนนท าการหยดปฏกรยาทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะน าไปใชตอไป

61

1.3.4 การถายโอนรคอมบแนนทพลาสมดเขาสเซลลเจาบาน E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทเหมาะสมในการผลตโปรตน

หลงจากท าการเชอมตอยน mpdB เขากบพลาสมด pHisFlag-1 แลว ท าการถายโอน รคอมบแนนทพลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB เขาสเซลลเจาบาน E. coli สายพนธ BL21 (DE3) โดยน าเชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทเจรญบนอาหารแขง LB มาเลยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท ทงไวขามคน จากนนท าการถายเชอลงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร บมท 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท น าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 600 นาโนเมตร จนมคาประมาณ 0.2-0.5 จากนนน าไปแชในอางน าแขง นาน 10 นาท จากนนตกตะกอนเซลลโดยถายเชอจลนทรยลงในหลอดเซนตรฟวจ น าไปปนเหวยงทความเรว 2000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท เทสวนใสทง เตมเซลลทยงเหลออยลงในหลอดหลอดเซนตรฟวจหลอดเดม ปนเหวยงตกตะกอนเซลลจนกระทงเซลลหมด ลางตะกอนเซลลโดยการละลายตะกอนเซลลดวยสารละลายแคลเซยมคลอไรด ความเขมขน 0.1 โมลาร ทเยน ปรมาตร 2 มลลลตร จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 2000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท เทสวนใสทง จากนนละลายตะกอนเซลลดวยสารละลายแคลเซยมคลอไรด ความเขมขน 0.1 โมลาร ทเยน ปรมาตร 2 มลลลตร แชในอางน าแขง นาน 30 นาท จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 2000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท เทสวนใสทง แลวละลายตะกอนเซลลดวยสารละลายแคลเซยมคลอไรด ความเขมขน 0.1 โมลาร ทเยน ปรมาตร 1 มลลลตร จากนนแบงเซลลทเตรยมไดใสหลอดไมโครเซนตรฟวจ ปรมาตร 200 ไมโครลตร แลวเตมรคอมบแนนทพลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB ปรมาตร 10 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยใชไมโครปเปตดดขนลงเบาๆ น าไปแชน าแขงนาน 30 นาท จากนนยายไปบมทอณหภม 42 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท แลวยายไปแชน าแขงนาน 5 นาท เตมอาหารเหลว LB ปรมาตร 800 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรว 200 รอบตอนาท นาน 1 ชวโมง จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 5000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสวนใสทง แลวละลายตะกอนเซลลดวยอาหารเหลว LB ปรมาตร 100 ไมโครลตร น าเชอทไดไปเกลยลงบนอาหารแขง LB ทประกอบดวยยาปฏชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 16-18 ชวโมง แลวท าการคดเลอกและตรวจสอบทรานสฟอรแมนททไดตอไป

1.4 การตรวจสอบทรานสฟอรแมนท หลงจากท าการถายโอนรคอมบแนนทพลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB เขาสเซลลเจาบาน

E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ท าการตรวจสอบทรานสฟอรแมนททไดโดยวธดงตอไปน

62

1.4.1 การตรวจสอบทรานสฟอรแมนทโดยการทดสอบกจกรรม (Activity) ของเอนไซม MPH ดวยวธ Microtiter Plate MPH Assay

ท าการตรวจสอบทรานสฟอรแมนททสามารถยอยสลาย MP โดยการทดสอบกจกรรมของเอนไซม MPH ดวยวธ microtiter plate MPH assay โดยคดเลอกโคโลนของทรานสฟอรแมนททไดจากขอ 1.3.4 โดยใชไมจมฟนทปราศจากเชอจลนทรยเขยโคโลนของทรานสฟอรแมนทมาเลยงในอาหารแขง LB ทมยาปฎชวนะแอมพซลนความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และ IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร โดยก าหนดหมายเลขในแตละโคโลน บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นานขามคน จากนนทดสอบกจกรรมของเอนไซม MPH ของแตละโคโลน โดยใชไมจมฟนทปราศจากเชอจลนทรยเขยโคโลนของทรานสฟอรแมนทในแตละหมายเลข ทตองการทดสอบใสลงใน 96-well microtiter plate ทม substrate mixture (MP ความเขมขน 50 ไมโครกรมตอมลลลตร, Tris-HCl พเอช 8.5 ความเขมขน 25 มลลโมลาร และ triton X-100 ความเขมขน 0.1 เปอรเซนต) ปรมาตร 100 ไมโครลตร สงเกตการเปลยนสเปนสเหลองของ PNP ซงเปนผลตภณฑทไดจากการยอยสลาย MP ทเกดขนใน substrate mixture โดยเปรยบเทยบกบ ตวควบคม (positive control คอ microtiter plate ทม substrate mixture และเชอ E. coli สายพนธ BL21 ทมรคอมบแนนทพลาสมด pGEX-6P-1 ทมยน mpdB ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP, negative control คอ microtiter plate ทม substrate mixture และเชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมพลาสมด pHisFlag-1 และ microtiter plate ทมเฉพาะ substrate mixture เพยงอยางเดยว) จากนนน าทรานสฟอรแมนททใหสเหลองมาท าการตรวจสอบรคอมบแนนทโคลนตอไป

1.4.2 การตรวจสอบทรานสฟอรแมนทดวยวธ Restriction Analysis ท าการตรวจสอบทรานสฟอรแมนทดวยวธ restriction analysis โดยน าทรานส-

ฟอรแมนททได มาท าการสกดรคอมบแนนทพลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB โดยด าเนนการเชนเดยวกบวธในขอ 1.1.1 จากนนท าการวเคราะหรคอมบแนนทพลาสมดทสกดได โดยการตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ XhoI และ KpnI โดยด าเนนการเชนเดยวกบวธในขอ 1.2.5 แลวท าการตรวจสอบดเอนเอดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรโฟรซสโดยด าเนนการเชนเดยวกบวธในขอ 1.1.4 โดยใช 1 kb DNA ladder เปนดเอนเอมาตรฐาน

1.4.3 การหาล าดบนวคลโอไทด การวเคราะหหาล าดบนวคลโอไทดของรคอมบแนนทโคลนทผานการตรวจสอบแลว

จากขอ 1.4.2 โดยสงว เคราะหหาล าดบนวคลโอไทดทบรษทแปซฟค ไซเอนซ จงหวดกรงเทพมหานคร ประเทศไทย

63

1.4.4 การวเคราะหล าดบนวคลโอไทด การคนหาขอมลเกยวกบล าดบนวคลโอไทดและการวเคราะหความเหมอนของล าดบ

นวคลโอไทด โดยใชโปรแกรม basis local alignment tool (BLAST) จากเวบไซต National for Biotechnology Information (NCBI)

1.4.5 การทดสอบกจกรรม (Activity) ของเอนไซม MPH บน MP Agar Plate หลงจากท าการตรวจสอบทรานสฟอรแมนท และวเคราะหล าดบนวคลโอไทดของ รคอมบแนนทโคลนแลว น าทรานสฟอรแมนททไดรบการตรวจสอบแลว มาเลยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร ทมยาปฎชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท นาน 16-18 ชวโมง แลวน ามาท า point inoculation ลงบนอาหารแขง LB ทมยาปฎชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร, IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร และ MP ความเขมขน 50 ไมโครกรมตอมลลลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นานขามคน สงเกตสเหลองรอบโคโลน (hydrolytic clear zone) โดยเปรยบเทยบกบตวควบคม E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมพลาสมด pHisFlag-1 ซง ใชเปน negative control

2. การแสดงออกของเอนไซม MPH หลงจากท าการโคลนยน mpdB เขาสพลาสมด pHisFlag-1 ทออกแบบเพอการหลงโปรตน และถายโอนเขาสเซลลเจาบาน E. coli สายพนธ BL21 (DE3) แลวน า E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมรคอมบแนนทพลาสมดทไดรบการตรวจสอบแลว มาเลยงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 20 มลลลตร ทมยาปฎชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท นาน 16-18 ชวโมง เพอใชเปนกลาเชอเรมตน (start culture) จากนนท าการถายเลยงกลาเชอเรมตนลงในอาหารเหลว LB ปรมาตร 1,000 มลลลตร ทมยาปฎชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ในอตราสวน 1 ตอ 100 บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาทความเรวรอบ 200 รอบตอนาท จนกระทงวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 600 นาโนเมตร จนมคาประมาณ 0.2 จากนนเหนยวน าใหเกดการผลตเอนไซม MPH ดวย IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร น าไปบมตอทอณหภม 23 องศาเซลเซยส เขยาทความเรว 200 รอบตอนาท นาน 20 ชวโมง

64

3. การสกดเอนไซม MPH จากสวนตางๆ ของเซลล 3.1 การสกดเอนไซม MPH จากอาหารเลยงเชอ

หลงจากทท าการแสดงออกเอนไซม MPH แลว น าเซลลทเพาะเลยงไดจากขอ 2 ไปแชในน าแขงนาน 5 นาท ปนเหวยงเกบตะกอนเซลลทความเรว 8,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศา-เซลเซยส นาน 10 นาท ท าการเกบตะกอนเซลลและสารละลายสวนใส โดยสารละลาย สวนใสทได น าไปตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต ทความเขมขนของเกลอเทากบคาเปอรเซนตความอมตว (% saturation) ท 80 เปอรเซนต โดยจ านวนกรมของแอมโมเนยมซลเฟตทเตมลงในสารละลายเพอใหไดคาเปอรเซนตความอมตว (% saturation) ท 80 เปอรเซนต เปน ไปตามสมการทแสดงการค านวณไวในภาคผนวก ค โดยเตมเกลอลงในสารละลายทละนอย กวนสารละลายตลอดเวลาในทเยน นานขามคน แลวปนเหวยงตกตะกอนโปรตนทความเรว 10,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท จากนนละลายตะกอนโปรตนดวยบฟเฟอรฟอสเฟต พเอช 6.0 ความเขมขน 50 มลลโมลาร ปรมาตร 1-2 เทาของตะกอน เกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส โดยสารละลายทไดในสวนนจะเกบเปนสวนของ culture medium fraction

3.2 การสกดเอนไซม MPH จากเพอรพลาสซม (Neu และคณะ, 1965) หลงจากท าการปนเหวยงเกบตะกอนเซลลจากอาหารเลยงเชอแลว น าตะกอนเซลลทได

จากขอ 3.1 มาลางดวยบฟเฟอร Tris-HCl พเอช 8.0 ความเขมขน 10 มลลโมลาร ปรมาตร 40 มลลลตรตอกรมเซลล แลวปนเหวยงเกบตะกอนเซลลทความเรว 8,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เทสารละลายสวนใสทง ลางตะกอนเซลลซ าอกครงหนง จากนนน าตะกอนเซลลทไดมาสกดเอนไซม โดยละลายตะกอนเซลลดวยบฟเฟอร osmotic shock (Tris-HCl พเอช 8.0 ความเขมขน 30 มลลโมลาร, EDTA ความเขมขน 1 มลลโมลาร, ซโครส ความเขมขน 500 มลลโมลาร) ทเยน ปรมาตร 40 มลลลตรตอกรมเซลล จากนนน ามาบมในน าแขงนาน 5 นาท แลวปนเหวยงทความเรว 8,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เทสารละลายสวนใสทง ละลายตะกอนเซลลโดยเรวดวยน ากลนทผานการฆาเชอทเยน ปรมาตร 25 มลลลตรตอกรมเซลล จากนนน ามาบมและเขยาบอยๆ ในน าแขงนาน 5 นาท แลวปนเหวยงทความเรว 8,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท เกบตะกอนเซลลและสารละลายสวนใส จากนนน าสารละลายโปรตนจากสวนใสทไดมาท าใหเขมขนขนโดยใช Vivaspin 20 (molecular weight cut off: MWCO, 10 kDa polyethersulphone: PES) (GE Healthcare, Sweden) เกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส โดยสารละลายทไดในสวนนจะเกบเปนสวนของ periplasmic fraction

65

3.3 การสกดเอนไซม MPH จากไซโตพลาสซม (Yamabhai และคณะ, 2008) หลงจากท าการสกดเอนไซมจาก periplasmic space แลว น าตะกอนเซลลทไดหลงจากการสกด

เอนไซมในขอ 3.2 มาละลายตะกอนดวยบฟเฟอร Tris-HCl พเอช 8.0 ความเขมขน 50 มลลโมลาร ปรมาตร 10 มลลลตร แลวท าการแตกเซลลโดยใชเครองแตกเซลลดวยคลนความถสง (sonicator) (Vibra Cell, USA) ทความถ 60 แอมพลจด, pulser 6 วนาท นาน 10 นาท แลวก าจดเศษเซลลออกโดยปนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท เกบสวนใสไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส โดยสารละลายทไดในสวนนจะเกบเปนสวนของ cytoplasmic fraction ซงจะน าไปวเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford และหาคากจกรรมของเอนไซม MPH ตอไป

4. การแยกบรสทธรคอมบแนนทเอนไซม MPH

4.1 การท าไดอะไลซส (Dialysis) 4.1.1 การเตรยมถงไดอะไลซส

กอนการท าไดอะไลซสโปรตนจะตองน าถงส าหรบท าไดอะไลซสมาท าการเตรยม (pre-treatment) เพอใหมขนาดของรพรนใกลเคยงกน และเพอก าจดโลหะหนกทปนเปอนมากบ ถงไดอะไลซส โดยน าถงส าหรบท าไดอะไลซส มาตดใหไดความยาวตามตองการ แลวแชลงในสารละลายโซเดยมไบคารบอเนต ความเขมขน 2 เปอรเซนต ทประกอบดวย EDTA ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต นาน 10 นาท โดยในระหวางทตมใหถงไดอะไลซสจมอยในสารละลายโดยใช ขวดรปชมพทบรรจน า กดอยดานบน จากนนเทสารละลายทง แลวเตมน าปราศจากไอออนลงไปแทน ตมตออกนาน 10 นาท เปลยนน าปราศจากไอออนแลวตมอกครงหนง ทงไวใหเยน เกบถงส าหรบท าไดอะไลซสทเตรยมไดในเอทานอล ความเขมขน 20 เปอรเซนต โดยปรมาตร ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส โดยเกบไดนานประมาณ 3 เดอน

4.1.2 การก าจดเกลอแอมโมเนยมซลเฟต และการเปลยนบฟเฟอรโดยวธไดอะไลซส หลงจากท าการแสดงออกและสกดเอนไซม MPH จากสวนตางๆ แลว น าสารละลาย

โปรตนทไดจากขอ 3.1 และ 3.2 มาท าไดอะไลซส (dialysis) เพอก าจดเกลอแอมโมเนยมซลเฟต และท าการเปลยนบฟเฟอรของสารละลายโปรตน ตามล าดบ โดยน าถงส าหรบท าไดอะไลซสทผานการเตรยมในขอ 4.1.1 มาผกปลายดานหนง ดดสารละลายโปรตนใสลงในถงส าหรบท าไดอะไลซส แลวผกปลายดานบนใหแนน จากนนแชถงส าหรบท าไดอะไลซสทภายในบรรจสารละลายโปรตนลงในบฟเฟอรฟอสเฟต พเอช 6.0 ความเขมขน 50 มลลโมลาร ทเยน โดยใชอตราสวนระหวางสารละลายโปรตนภายในถงส าหรบท าไดอะไลซสตอสารละลายบฟเฟอรฟอสเฟต พเอช 6.0

66

ความเขมขน 50 มลลโมลาร ในอตราสวน 1 มลลลตร ตอ 100 มลลลตร ท าการกวนดวยเครองกวนแมเหลกตลอดเวลาทความเรวต า ตงทงไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 2-3 ชวโมง จากนนท าการเปลยนบฟเฟอร แลวกวนตอไปทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 4-5 ชวโมง จากนนท าการเปลยนบฟเฟอรอกครงหนง กวนตอไปทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ทงไวนานขามคน น าโปรตนทท าการไดอะไลซสแลวไปท าใหเขมขนขนโดยใช Vivaspin 20 (MWCO, 10 kDa PES) เกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะน าไปวเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford, หาคากจกรรมของเอนไซม MPH และแยกบรสทธโปรตนดวยวธทางโครมาโตกราฟฟตอไป

4.2 การแยกบรสทธโปรตน หลงจากทท าการไดอะไลซสโปรตนทสกดไดจากสวนตางๆ แลว น าโปรตนทผานการ

ไดอะไลซสมาท าบรสทธเอนไซม MPH โดยใชแอฟฟนตคอลมน (affinity column) คอ cobalt column โดยคอลมนนสามารถจบกบ histidine-tag protein ทเชอมอยกบรคอมบแนนทเอนไซม MPH ได โดยท าการเชอมตอคอลมนเขากบเครอง Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) (Amersham Pharmacia, Sweden) จากนนลางคอลมนดวยน าปราศจากไอออน ปรมาตร 3-5 เทาของความจคอลมน เพอก าจดบฟเฟอรทใชในการเกบคอลมน (storage buffer) จากนนท าสมดล (equilibrate) คอลมนดวย binding buffer (โซเดยมฟอสเฟต ความเขมขน 50 มลลโมลาร, โซเดยมคลอไรด ความเขมขน 300 มลลโมลาร, อมดาโซล ความเขมขน 5-10 มลลโมลาร, พเอช 7.4) ปรมาตรอยางนอย 5 เทาของความจคอลมน โดยควบคมอตราการไหลของ binding buffer ใหมอตราเรวประมาณ 1 มลลลตรตอนาท จากน นท าการเตรยมสารละลายโปรตน โดยเจอจางสารละลายโปรตนดวย binding buffer ในอตราสวน 1 ตอ 1 ท าการฉดสารละลายโปรตนเขาไปในคอลมนโดยใชเขมฉด ลางคอลมนดวย binding buffer ปรมาตรอยางนอย 10-15 เทาของความจคอลมน หรอจนกวา baseline เรยบ (steady baseline) แลวท าการซะโปรตนออกจากคอลมนดวย elution buffer (โซเดยมฟอสเฟต ความเขมขน 50 มลลโมลาร, โซเดยมคลอไรด ความเขมขน 300 มลลโมลาร, อมดาโซล ความเขมขน 150 มลลโมลาร, พเอช 7.4) ปรมาตรอยางนอย 5 เทาของความจคอลมน โดยควบคมอตราการไหลของelution buffer ใหมอตราเรวประมาณ 1 มลลลตรตอนาท จากนนน าตวอยางโปรตนทผานคอลมน ทมกจกรรมของเอนไซมมารวมกนและท าใหเขมขนขน โดยใช Vivaspin 6 (MWCO, 10 kDa PES) เกบเอนไซมไวในสารละลายบฟเฟอร Tris-HCl พเอช 8.0 ความเขมขน 50 มลลโมลาร ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอใชในการแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), เทคนค zymogram analysis, หาปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford และหาคากจกรรมของเอนไซม MPH ตอไป สวนคอลมนทใชจะเกบไวในเอทานอล ความเขมขน 20 เปอรเซนต ทอณหภม 4-30 องศาเซลเซยส

67

5. การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) (Sambrook และคณะ 1989) น าโปรตนทไดในสวนตางๆ มาแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) โดยด าเนนวธการดงตอไปน

5.1 การเตรยมแผนเจลส าหรบแยกวเคราะหโปรตน ส าหรบแผนเจลแบบ 12% (ชน separating gel) ปรมาตร 5 มลลลตร ผสมสารตางๆ ดงน สารละลายอะครลาไมด ความเขมขน 30 เปอรเซนต 2.0 มลลลตร สารละลายบฟเฟอร This HCl ความเขมขน 1.5 โมลาร, พเอช 8.8 1.3 มลลลตร สารละลาย SDS ความเขมขน 10 เปอรเซนต 50.0 ไมโครลตร น าปราศจากไอออน 1.6 มลลลตร จากนนเตม สารละลายแอมโมเนยม เปอรซลเฟต ความเขมขน 10 เปอรเซนต* 50.0 ไมโครลตร TEMED 2.0 ไมโครลตร *เตรยมใหมกอนใชทกครง

ผสมใหเขากน จากน นเตรยมกระจกส าหรบการเตรยมเจลใหสะอาด และน าไปประกอบกบ electrophoresis set เทสารละลายทเตรยมไดลงในชองวางของแผนกระจกหลอเจลทไดประกอบ ไวแลว เตมน าปราศจากไอออนทบลงบนผวเจลทงไวจนเจลแขงตว ประมาณ 30 นาท แลวเท น ากลนออกและซบใหแหง

ส าหรบแผนเจลแบบ 5% (ชน staking gel) ปรมาตร 2 มลลลตร ผสมสารละลายตางๆดงน สารละลายอะครลาไมด ความเขมขน 30 เปอรเซนต 330.0 ไมโครลตร สารละลายบฟเฟอร This HCl ความเขมขน 0.5 โมลาร, พเอช 6.8 250.0 ไมโครลตร สารละลาย SDS ความเขมขน 10 เปอรเซนต 20.0 ไมโครลตร น าปราศจากไอออน 1.4 มลลลตร จากนนเตม สารละลายแอมโมเนยม เปอรซลเฟต ความเขมขน 10 เปอรเซนต* 20.0 ไมโครลตร TEMED 2.0 ไมโครลตร *เตรยมใหมกอนใชทกครง

68

ผสมใหเขากนและเททบลงบนเจลชนแรกทแขงตวแลว สอดแผนก าหนดรองเจลลงบนเจล ทยงไมแขงตวทนท ระวงอยาใหเกดฟองอากาศ ทงไวจนเจลแขงตว ประมาณ 30 นาท ดงแผนก าหนดรองเจลออกลางเจลดวยน าปราศจากไอออนและเตรยมประกอบชดวเคราะห Mini-Protein system เตมบฟเฟอร Tris-glycine running ความเขมขน 1 เทา ใหทวมแผนเจลทงสวนบนและสวนลาง

5.2 การเตรยมโปรตนเพอวเคราะห น าโปรตนทไดในขนตอนตางๆ ปรมาตร 50 ไมโครลตร มาผสมกบสสงเคราะห (4X gel

loading dye) ปรมาตร 50 ไมโครลตร แลวน าไปตมในน าทอณหภม 95 องศาเซลเซยส นาน 3-5 นาท แลวท าการแยกวเคราะหโปรตนตวอยางดวยวธ SDS-PAGE โดยใชชดวเคราะห Mini-Protein system ตอไป

5.3 การแยกโปรตนดวยกระแสไฟฟา หยอดโปรตนทเตรยมไดจากขอ 5.2 ปรมาตร 20 ไมโครลตร และสารละลายโปรตน

มาตรฐาน ปรมาตร 10 ไมโครลตร ลงในชองเจล ตอขวไฟฟา แลวท าการแยกวเคราะหโปรตนดวยกระแสไฟฟาโดยใชกระแสไฟฟาคงท ท 25 มลลแอมแปร ใชเวลาประมาณ 60 นาท หรอจนสของ bromphenol blue วงจนชดขอบแผนเจลดานลางสดของกระจก ถอดขวไฟฟาออก แกะแผนเจลออกจากกระจก และยอมแผนเจลดวยสารละลาย staining เปนเวลา 1.5 ชวโมง และลางสทมากเกนโดยการแชแผนเจลในสารละลาย destaining I ทงไว 1.5 ชวโมง จากนนแชแผนเจลในสารละลาย destaining II ทงไวขามคน สงเกตแถบโปรตนทปรากฏขน

6. การวเคราะหโปรตนดวยเทคนค Zymogram analysis (ดดแปลงจากวธของ Granelli-Piperno และคณะ, 1978; Vassalli และคณะ, 1984; Li และคณะ, 2001; Malone และคณะ, 2002) น าโปรตนทไดจากการแยกบรสทธเอนไซม MPH มาท าการเตรยมตวอยางโปรตนโดยด าเนนการตามวธในขอ 5.2 โดยใชสสงเคราะห (4X gel loading dye) ทปราศจากสารรดวซงเอเจนต (reducing agent) แลวท าการแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE โดยด าเนนการตามวธในขอ 5.1 และ 5.3 ตามล าดบ โดยไมท าการยอมแผนเจลดวยสารละลาย staining จากนนน าแผนเจลทไดมาลางดวยสารละลาย triton X-100 ความเขมขน 2.5 เปอรเซนต ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท จ านวน 2 ครง จากนนลางแผนเจลดวยบฟเฟอร Tris-HCl พเอช 8.0 ความเขมขน 0.1 โมลาร ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท จ านวน 2 ครง แลวน าแผนเจลทไดวางลงบนอาหารแขง LB ทม MP ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร สงเกตแถบสเหลองของ PNP ทปรากฏขน

69

7. การหาคาปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford Protein Assay น าโปรตนทไดในขนตอนตางๆ มาวเคราะหหาคาปรมาณโปรตนโดยใชชดตรวจวดโปรตนส าเรจรป Bio-Rad Bradford protein assay โดยด าเนนวธการดงตอไปน

7.1 การเตรยมกราฟมาตรฐานของโปรตน ท าการวเคราะหความเขมขนของโปรตนดวยวธ Bradford (Bradford M., 1976) โดยใช

สารละลาย bovine serum albumin (BSA) เปนสารมาตรฐาน ท าโดยเตรยมสารละลาย BSA ทมความเขมขนตางๆ ไดแก 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, และ 0.5 ไมโครกรมตอมลลลตร จากนนน าสารละลาย BSA ในแตละความเขมขน ปรมาตร 10 ไมโครลตร ใสลงในไมโครเพลท เตมสารละลาย Bradford dry reagent ปรมาตร 200 ไมโครลตร ผสมใหเขากน แลวตงทงไว 5 นาท ทอณหภมหอง จากนนน าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 595 นาโนเมตร บนทกผลการทดลองทได ค านวณเปนกราฟมาตรฐานโปรตน

7.2 การวดปรมาณของโปรตน น าโปรตนตวอยางทไดในขนตอนตางๆ มาวเคราะหหาคาปรมาณโปรตน โดยน าโปรตน

ตวอยาง ปรมาตร 10 ไมโครลตร ใสลงในไมโครเพลท เตมสารละลาย Bradford dry reagent ปรมาตร 200 ไมโครลตร ผสมใหเขากน แลวตงทงไว 5 นาท ทอณหภมหอง จากนนน าไปวดคา การดดกลนแสงทความยาวคลน 595 นาโนเมตร บนทกผลการทดลองทได ค านวณคาปรมาณโปรตนโดยการเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานโปรตน

8. การหาคากจกรรม (Activity) ของเอนไซม MPH ดวยวธสเปกโทรโฟโตเมทร (ดดแปลงจากวธ

ของ Guoping และคณะ, 2004) น าโปรตนทไดในขนตอนตางๆ มาวเคราะหหาคากจกรรมของเอนไซม MPH โดยด าเนนวธการดงตอไปน

8.1 การเตรยมกราฟมาตรฐานของ PNP เตรยม PNP ทมความเขมขนตางๆ ไดแก 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 และ

100 ไมโครโมลาร โดยละลายดวยสารละลาย assay buffer (บฟเฟอร Tris-HCl พเอช 8.0 ความเขมขน 50 มลลโมลาร, โซเดยมคลอไรด ความเขมขนเขมขน 0.1 โมลาร, Tween 80 ความเขมขน 0.1 เปอรเซนต โดยปรมาตร) ปรมาตร 1 มลลลตร จากนนน าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 410 นาโนเมตร โดยเปรยบเทยบกบตวควบคม (negative control ทม assay buffer เพยงอยางเดยว) บนทกผลการทดลองทได ค านวณเปนกราฟมาตรฐาน PNP

70

8.2 การวดคากจกรรมของเอนไซม MPH น าโปรตนทไดในขนตอนตางๆ มาวเคราะหหาคากจกรรมของเอนไซม MPH โดยน า

สารละลาย assay buffer (บฟเฟอร Tris-HCl พเอช 8.0 ความเขมขน 50 มลลโมลาร, โซเดยม- คลอไรด ความเขมขนเขมขน 0.1 โมลาร, Tween 80 ความเขมขน 0.1 เปอรเซนต โดยปรมาตร) ทมMP ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 960 ไมโครลตร ใสลงในหลอดไมโคร เซนตรฟวจ ขนาด 1.5 มลลลตร แลวเตมเอนไซม MPH ปรมาตร 40 ไมโครลตร ผสมใหเขากน แลวบมทอณหภม 25 องศาเซลเซยส ทงไว 5 นาท น าสารละลายทไดไปวดคาการดดกลนแสง ดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลน 410 นาโนเมตร ซงจะวดสเหลองของ PNP โดยเปรยบเทยบกบตวควบคม (negative control ทม assay buffer เพยงอยางเดยว) บนทกผลการทดลองทได ค านวณคากจกรรมของเอนไซมโดยการเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐาน PNP ก าหนดให 1 หนวย (Unit, U) คอ ปรมาณของเอนไซม MPH ทท าใหเกด 1 ไมโครโมล ของ PNP ในเวลา 1 นาท

71

บทท 4

ผลและวจารณผลการทดลอง

1. การสรางรคอมบแนนทโคลนทมยน mpdB โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน จากการสกดพลาสมดดเอนเอจากรคอมบแนนทโคลนทมยน mpdB ของเชอแบคทเรย Burkholderia cepacia ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP ทไดจากการทดลองกอนหนาน (วรฬห ศภลกษณนาร, 2549) ตามวธมาตรฐานของ Sambrook และคณะ (1989) มาใชเปนดเอนเอแมแบบ (DNA template) ในปฏกรยาพซอาร โดยใชคไพรเมอร XhoI-mpd_F และ KpnI-mpd_R ซงออกแบบไพรเมอรจากขอมลล าดบนวคลโอไทดของเชอแบคทเรย Plesiomonas sp. สายพนธ M6 (accession number: AF338729) ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP (Zhongli et al., 2001) ทม homology กบล าดบนวคลโอไทดทถอดรหสมาจากล าดบของกรดอะมโนดาน N-terminus ของเชอ Burkholderia cepacia ซงมผวจยไวกอนหนาน (เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ และ บญศร จงเสรจต, 2544; Ekkhunnatham และคณะ, 2012) โดยออกแบบเฉพาะในสวนของยนท code ใหเอนไซม MPH ซงไมรวมกบล าดบนวคลโอไทดในสวนของ signal sequence เดมของเอนไซม (mature MPH) โดยเพมต าแหนงตดเอนไซม (restriction site) ของเอนไซมตดจ าเพาะส าหรบเอนไซม XhoI และ KpnI เพอใหงายตอการโคลนเขาสพลาสมด pHisFlag-1 จากผลการทดลองเมอตรวจดแถบดเอนเอดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโตรโฟเรซสเปรยบเทยบกบแถบดเอนเอมาตรฐาน 1 kb DNA Ladder และ 100 bp DNA Ladder พบวาปรากฏแถบดเอนเอทมขนาดประมาณ 900 bp ซงเปนขนาดทใกลเคยงกบขนาดของยน mpdB ทใชเปนดเอนเอแมแบบ ดงแสดงในภาพท 21 จากนนเลอกชนดเอนเอทขนาด 900 bp ทไดจากการเพมจ านวนโดยวธพซอารน มาท าบรสทธ ดเอนเอดวยวธส าเรจรป E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit และเชอมตอดเอนเอทไดเขากบ ดเอนเอพาหะ pTA2 โดยภาพรวมของขนตอนในการสรางรคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทมยน mpdB แสดงในภาพท 22

72

ภาพท 21 ชนสวนดเอนเอของยน mpdB ทไดจากการเพมจ านวนโดยวธพซอาร โดยชองท 1 คอ แถบดเอนเอมาตรฐาน 1 kb DNA ladder, ชองท 2 คอ ชนสวนยน mpdB ทเพมปรมาณได และ ชองท 3 คอ แถบดเอนเอมาตรฐาน 100 bp DNA ladder แลวถายโอนรคอมบแนนทพลาสมดทไดเขาสเซลลเจาบาน E. coli สายพนธ DH5α ท าการคดเลอกทรานสฟอรแมนทดวยวธ blue-white selection พบวามโคโลนสขาวเกดขนจ านวนมาก โดยคดเลอกโคโลนสขาวเหลาน มาสกดพลาสมดแลวท าการวเคราะหหาโคโลนทมชนดเอนเอโดยวธ restriction analysis

73

ภาพท 22 แผนภาพการโคลนยนทสรางเอนไซม MPH เขาสพลาสมด pTA2

หลงจากท าการวเคราะหหาโคโลนทมชนดเอนเอโดยวธ restriction analysis โดยการตด รคอมบแนนทพลาสมดดวยเอนไซม EcoRI, XhoI และ KpnI เพอตรวจสอบขนาดของ insert โดยตรวจดแถบดเอนเอดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโตรโฟเรซสเปรยบเทยบกบแถบดเอนเอมาตรฐาน 1 kb DNA Ladder พบวารคอมบแนนทพลาสมดทตดดวยเอนไซม EcoRI, เอนไซม XhoI เพยงเอนไซมเดยว และตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI จะปรากฏแถบดเอนเอทมขนาดประมาณ 900 bp ซงเปนขนาดทใกลเคยงกบขนาดของยน mpdB และขนาดประมาณ 2,900 bp ซงใกลเคยงกบขนาดของพลาสมด pTA2 โดยจากผลการทดลองทตดรคอมบแนนทพลาสมดดวยเอนไซม EcoRI เพยงเอนไซมเดยว จะปรากฏแถบดเอนเอเกดขน 2 แถบนน เนองจากต าแหนงตดจ าเพาะของเอนไซม EcoRI จะอยครอมระหวางต าแหนงของ insert ดงนนเมอท าการตดรคอมบแนนทพลาสมดดวยเอนไซมชนดนจงปรากฏแถบดเอนเอเกดขน 2 แถบ ซงเปนขนาดของยนและขนาดของพลาดมด

74

ตามล าดบ โดยใหผลเชนเดยวกนในการตดดวยเอนไซม XhoI เพยงเอนไซมเดยว และเมอตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI ซงมต าแหนงตดเอนไซมทไดท าการออกแบบไวบนชนดเอนเอ ดงนนเมอตดดวยเอนไซม 2 ชนดนจงปรากฎแถบดเอนเอทขนาดประมาณ 900 bp และขนาดประมาณ 2,900 bp เชนเดยวกนอกดวย และเมอตดรคอมบแนนทพลาสมดดวยเอนไซม KpnI เพยงเอนไซมเดยว พบวาจะปรากฏแถบดเอนเอทมขนาดประมาณ 3,800 bp ซงเปนขนาดทใกลเคยงกบขนาดของยน mpdB รวมกบพลาสมด pTA2 จากผลการทดลองจงเปนการยนยนไดวาทรานสฟอรแมนททคดเลอกไดมยนทสรางเอนไซม MPH อย และโคลนอยในพลาดมดทถกตอง ดงแสดงในภาพท 23

ภาพท 23 การวเคราะหรคอมบแนนทดเอนเอดวยวธ restriction analysis ของรคอมบแนนท พลาสมด pTA2 ทมยน mpdB โดยการตดดวยเอนไซม EcoRI, XhoI และ KpnI โดยชองท 1 และ 3 คอ แถบดเอนเอมาตรฐาน 1 kb DNA ladder, ชองท 2 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทมยน mpdB ทตดดวยเอนไซม EcoRI, ชองท 4 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทมยน mpdB ทตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI, ชองท 5 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทมยน mpdB ทตดดวยเอนไซม XhoI, ชองท 6 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทมยน mpdB ทตดดวยเอนไซม KpnI และ ชองท 7 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทมยน mpdB

75

จากนนผวจยไดเลอกโคลน pTA2 ทมยน mpdB ทไดท าการตรวจสอบยนยนแลววามยนดงกลาวจรง เพอเตรยมชนดเอนเอขนาดประมาณ 900 bp ทใชในการสบโคลนเขาสพลาสมด pHisFlag-1 ส าหรบการแสดงออกของเอนไซม MPH โดยน ารคอมบแนนทพลาสมด pTA2 ทม ยน mpdB จากรคอมบแนนทโคลนทคดเลอกได มาตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI ในการเตรยม พลาสมด pHisFlag-1 จะเรมจากท าการสกดพลาสมดจากเซลลเจาบาน E. coli สายพนธ DH5 ทมพลาสมด pHisFlag-1 มาตดพลาสมด pHisFlag-1 ดวยเอนไซม XhoI และ KpnI เชนเดยวกบ การตด insert (mpdB gene) แลวท าการแยก insert และพลาสมดทผานการตดแลวแยกบรสทธจากเจลอะกาโรสดวยวธส าเรจรป E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit และท าการตรวจสอบดเอนเอท แยกบรสทธไดดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโตรโฟเรซส โดยปรากฏแถบดเอนเอทขนาดประมาณ 900 bp ซงเปนขนาดทใกลเคยงกบขนาดของยน mpdB และปรากฏแถบดเอนเอทขนาดประมาณ 5,400 bp ซงใกลเคยงกบขนาดของพลาสมด pHisFlag-1 ดงแสดงในภาพท 24 และ 25 ตามล าดบ ท าใหแนใจไดวาชนดเอนเอและพลาสมดทไดนนมความถกตอง

ภาพท 24 การแยกบรสทธชนยน mpdB ทผานการตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI จากเจล อะกาโรสโดยวธส าเรจรป E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit โดยชองท 1 คอ แถบดเอนเอมาตรฐาน 1 kb DNA ladder, ชองท 2 คอ ชนยน mpdB ทผานการแยกบรสทธจากเจลอะกาโรส

76

ภาพท 25 การแยกบรสทธพลาสมด pHisFlag-1 ทผานการตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI จากเจลอะกาโรสโดยวธส าเรจรป E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit โดยชองท 1 คอ แถบดเอนเอมาตรฐาน 1 kb DNA ladder, ชองท 2 และ 3 คอ พลาสมด pHisFlag-1 ทผานการแยกบรสทธจากเจลอะกาโรส เมอไดชนดเอนเอและพลาสมดทผานการแยกบรสทธแลว ท าการเชอมตอชนดเอนเอและ พลาสมดนเขาดวยกนไดเปนรคอมบแนนทพลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB และตงชอใหกบ รคอมบแนนทพลาสมดทได โดยก าหนดให pHF1 คอ พลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB (pHisFlag-1::mpdB) ดงแสดงในภาพท 26 โดยภาพรวมของขนตอนในการสรางรคอมบแนนท พลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB แสดงในภาพท 27 แลวถายโอนรคอมบแนนทดเอนเอทไดเขาสเซลลเจาบาน E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ท าการตรวจสอบทรานสฟอรแมนททไดดวยการทดสอบกจกรรมของเอนไซม MPH โดยวธ microtiter plate MPH assay พบวาทรานสฟอรแมนท ทไดสามารถแสดงออกและผลตเอนไซม MPH ทสามารถยอยสลาย MP โดยเปลยนสของ substrate mixture ทม MP ความเขมขน 50 ไมโครกรมตอมลลลตร ไดเปนสเหลองของ PNP ซงเปนผลตภณฑทไดจากการยอยสลาย MP เชนเดยวกบเชอ E. coli สายพนธ BL21 ทมรคอมบแนนท พลาสมด pGEX-6P-1::mpdB ทใชเปน positive control จะปรากฏสเหลองของ PNP เชนเดยวกน และเมอเปรยบเทยบกบเชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมพลาสมด pHisFlag-1 และ substrate

77

mixture เพยงอยางเดยว ทใชเปน negative control จะเหนไดวาไมมสเหลองของ PNP เกดขน ดงแสดงในภาพท 28

ภาพท 26 แผนภาพรคอมบแนนทพลาสมด pHF1 (พลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB)

78

ภาพท 27 แผนภาพการโคลนยน mpdB เขาสพลาสมด pHisFlag-1

79

ภาพท 28 การทดสอบกจกรรมของเอนไซม MPH ในการคดเลอกทรานสฟอรแมนท โดยวธ microtiter plate MPH assay โดยหลมท 1 คอ microtiter well ทม substrate mixture และเชอ E. coli สายพนธ BL21 ทมรคอมบแนนทพลาสมด pGEX-6P-1::mpdB (positive control), หลมท 2 คอ microtiter well ทม substrate mixture และเชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมรคอมบแนนท พลาสมด pHF1, หลมท 3 คอ microtiter well ทม substrate mixture และเชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมพลาสมด pHisFlag-1 และหลมท 4 คอ microtiter well ทม substrate mixture เพยงอยางเดยว จากนนน าทรานสฟอรแมนททสามารถยอยสลาย MP ได มาตรวจสอบเพอยนยนการมอยของยน mpdB ดวยวธ restriction analysis โดยท าสกดพลาสมดและตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI เพอตรวจสอบขนาดของ insert โดยตรวจดแถบดเอนเอดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโตรโฟเรซสเปรยบเทยบกบแถบดเอนเอมาตรฐาน 1 kb DNA Ladder พบวารคอมบแนนทพลาสมดทตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI จะปรากฏแถบดเอนเอทขนาดประมาณ 900 bp และ 5,400 bp ซงเปนขนาดทใกลเคยงกบขนาดของยน mpdB และพลาสมด pHisFlag-1 ตามล าดบ และเมอตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ XhoI หรอ KpnI เพยงเอนไซมเดยว จะปรากฏแถบดเอนเอทขนาดประมาณ 6,300 bp ซงเปนขนาดทใกลเคยงกบขนาดของขนาดของยน mpdB รวมกบพลาสมด pHisFlag-1 จงเปนการยนยนไดวาทรานสฟอรแมนททคดเลอกไดมยน mpdB อย และโคลนอยในพลาดมด ทถกตอง ดงแสดงในภาพท 29

80

ภาพท 29 การวเคราะหรคอมบแนนทดเอนเอดวยวธ restriction analysis ของรคอมบแนนท พลาสมด pHF1 โดยการตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI โดยชองท 1 คอ แถบดเอนเอมาตรฐาน 1 kb DNA ladder, ชองท 2 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pHF1 ทตดดวยเอนไซม XhoI และ KpnI, ชองท 3 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pHF1 ทตดดวยเอนไซม XhoI เพยงเอนไซมเดยว, ชองท 4 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pHF1 ทตดดวยเอนไซม KpnI เพยงเอนไซมเดยว, ชองท 5 คอ รคอมบแนนทพลาสมด pHF1 และชองท 6 คอ แถบดเอนเอมาตรฐาน 100 bp DNA ladder จากนนน ารคอมบแนนทพลาสมดทตรวจสอบแลววามยน mpdB มาท าการวเคราะหเพอยนยนผลการทดลองทได โดยสงไปวเคราะหหาล าดบนวคลโอไทดของ insert ทบรษทแปซฟค ไซเอนซ ประเทศไทย และตรวจสอบความเหมอนกบล าดบนวคลโอไทดของ Burkholderia cepacia หมายเลข accession number DQ001540 ของ GenBank โดยใชบางสวนของนวคลโอไทด ทไดมาจากการสงไปวเคราะหล าดบนวคลโอไทด พบวาล าดบนวคลโอไทดของรคอมบแนนทโคลนทคดเลอกไดมความเหมอนกบล าดบนวคลโอไทดของยน mpdB ของเชอ Burkholderia cepacia คดเปน 100 เปอรเซนต ดงแสดงในภาพท 30

81

ภาพท 30 การเปรยบเทยบความเหมอนของล าดบนวคลโอไทดของยน mpdB จากรคอมบแนนทโคลนทท าการคดเลอกไดกบล าดบนวคลโอไทดจากเชอ Burkholderia cepacia (โดย Query คอ ล าดบนวคลโอไทดของยน mpdB จากรคอมบแนนทโคลนทท าการคดเลอกได และ Sbjct คอ ล าดบนวคลโอไทดของยน mpdB จากเชอ Burkholderia cepacia)

82

จากน นน ารคอมบแนนทโคลนทคดเลอกได มาตรวจสอบความสามารถในการผลตเอนไซม MPH ใหหลงออกนอกเซลล โดยทดสอบบนอาหารแขง MP agar ทม MP ความเขมขน 50 ไมโครกรมตอมลลลตร, ยาปฎชวนะแอมพซลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และ IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นานขามคน พบวาปรากฏสเหลองรอบๆ รคอมบแนนทโคโลน (yellow halo) เมอเปรยบเทยบกบเชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมพลาสมด pHisFlag-1 ทใชเปน negative control จะเหนไดวาไมปรากฏสเหลองรอบๆ โคโลน ดงแสดงในภาพท 31 แสดงใหเหนวารคอมบแนนทโคลนมความสามารถในการผลตเอนไซม MPH ใหหลงออกนอกเซลลได และต งชอใหกบรคอมบแนนทโคลนทท าการตรวจสอบแลวโดยก าหนดให BpHF คอ เชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมรคอมบแนนทพลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB จากนนผวจยไดน ารคอมบแนนทโคลน BpHF น ไปศกษาการแสดงออกของยนและการแยกบรสทธรคอมบแนนทเอนไซม MPH ตอไป

ภาพท 31 การทดสอบกจกรรมของเอนไซม MPH บน MP agar plate โดย A คอ เชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมรคอมบแนนทพลาสมด pHF1 และ B คอ เชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมพลาสมด pHisFlag-1 (negative control)

83

2. การแสดงออกและแยกบรสทธเอนไซม MPH ในการแสดงออกและการแยกบรสทธเอนไซม MPH จากรคอมบแนนทโคลน BpHF ทม

รคอมบแนนทพลาสมด pHF1 ทอยภายใตการควบคมของ tac promoter และสามารถเหนยวน าใหเกดการแสดงออกของยนดวย IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร ท าการเพาะเลยงในอาหารเลยงเชอปรมาตร 1,000 มลลลตร ทอณหภม 23 องศาเซลเซยส หลงจากเหนยวน าเปนเวลา 20 ชวโมง ท าการสกดเอนไซม MPH ในสวนของอาหารเลยงเชอ, เพอรพลาสซม และไซโตพลาสซม พบวา คากจกรรมของเอนไซม MPH ทถกผลตโดยรคอมบแนนทโคลน BpHF เทากบ 2 หนวยตอมลลลตร โดยเอนไซมในสวนของไซโตพลาสซมมมากทสด (53%) รองลงมา คอ ในอาหารเลยงเชอ (46%) และเพอรพลาสซม (1%) ตามล าดบ ดงแสดงในภาพท 32 แลวจงเลอกเอนไซม MPH จากสวนอาหารเลยงเชอ และเพอรพลาสซม ไปใชในการแยกบรสทธเอนไซม โดยน าเอนไซม MPH หยาบจากขนตอนการแสดงออกเอนไซมในสวนของอาหารเลยงเชอทไดจากการตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต และในสวนของเพอรพลาสซมทไดจากการสกดเอนไซมโดยวธ osmotic shock มาท าการเตรยมเอนไซมกอนการแยกบรสทธ โดยน าสารละลายโปรตนมาท าใหเขมขนขนและท าไดอะไลซส เพอก าจดเกลอและการเปลยนบฟเฟอร แลวน ามาแยกบรสทธโดยวธการทงายในขนตอนเดยว โดยใชแอฟฟนตคอลมน HisPure cobalt column ทจบจ าเพาะกบ polyhistidine-tag protein ของรคอมบแนนทโปรตน โดยโปรตนจะถกชะออกจากคอลมนดวยสารละลาย elution buffer ทมอมดาโซล ความเขมขน 150 มลลโมลาร แบบครงเดยว (one-step) โดยภาพรวมของขนตอนในการแสดงออกและแยกบรสทธเอนไซม MPH ในสวนของอาหารเลยงเชอ และเพอรพลาสซม แสดงในภาพท 33 และ 34 ตามล าดบ การแยกบรสทธเอนไซม MPH ในสวนของอาหารเลยงเชอ เรมจากเอนไซม MPH หยาบ 0.31 หนวยตอมลลลตร หลงจากผานคอลมน HisPure cobalt spin column ไดความบรสทธ (fold) เทากบ 93.0 เทา ไดผลทงหมด (yield) เทากบ 46.2 เปอรเซนต และไดคากจกรรมจ าเพาะ (specific activity) เทากบ 3.44 หนวยตอมลลกรมโปรตน ดงแสดงในตารางท 12 และการแยกบรสทธเอนไซม MPH ในสวนของเพอรพลาสซม เรมจากเอนไซม MPH หยาบ 0.02 หนวยตอมลลลตร หลงจากผานคอลมน HisPure cobalt chromatography cartridges ไดความบรสทธ (fold) เทากบ 10,777.95 เทา ไดผลทงหมด (yield) เทากบ 935.4 เปอรเซนต และไดคากจกรรมจ าเพาะ (specific activity) เทากบ 9.03 หนวยตอมลลกรมโปรตน ดงแสดงในตารางท 13 แตเมอน าไปเปรยบเทยบกบคากจกรรมจ าเพาะของเอนไซม MPH ทไดจากเชอ BpGT ทผลตเอนไซม MPH ภายในเซลล มคากจกรรมจ าเพาะเทากบ 1611.81 (อนรทธ เอกคณธรรม, 2552; Ekkhunnatham และคณะ, 2012) ซงจะเหนไดวาเอนไซมทงจากสวนของอาหารเลยงเชอ และเพอรพลาสซมทไดจากการทดลองน มคากจกรรมจ าเพาะของ

84

เอนไซมนอยกวามาก อาจเปนผลมาจากการหลงโปรตนออกมาในปรมาณทต า ซงจดเปนขอเสยหลกทส าคญประการหนงของการผลตเอนไซมใหหลงออกนอกเซลลใน E. coli อาจเนองมาจากความไมสมบรณของการน าสงโปรตนผานเยอหมเซลลชนใน หรออตราการแสดงออกทสงของยนภายใตการควบคมของ strong promoter และการเหนยวน าดวย IPTG ทความเขมขนสงเกนไป ซงจะท าใหเกดการผลตโปรตนทมากเกนอตราการน าสงโปรตนผานเยอหมเซลลชนใน เนองจากการขาดแคลนโปรตนทเปนองคประกอบของกลไกการหลงโปรตน (transport machinery) ทจะชวยในการน าสงโปรตนทตองการออกนอกเซลล กอใหเกดการสะสมของโปรตนภายในเซลลในรปของโปรตนทไมละลายน า (inclusion body) จงท าใหเกดการหลงโปรตนออกนอกเซลลในปรมาณ ทต า (Ayadi-Zouari และคณะ, 2012; Mergulhao และคณะ 2004; Mergulhao และคณะ 2005; Robben และคณะ, 2006) ซงจะเหนไดวาความสมดลของอตราในการแสดงออกของยน และอตราการน าสงโปรตนออกนอกเซลล เปนสงส าคญทจะตองควบคมใหเกดความเหมาะสมเพอใหเกด การหลงโปรตนออกนอกเซลลไดในปรมาณทสง (Azaman และคณะ, 2010) ดงนนจ าเปนตองศกษาหาสภาวะทเหมาะสมทสดในการเพาะเลยงรคอมบแนนทโคลน BpHF น เพอผลตเอนไซม MPH ใหหลงออกนอกเซลลและใหไดคากจกรรมของเอนไซมสงสดตอไป

ภาพท 32 ปรมาณเอนไซม MPH ในสวนตางๆ ของเซลล

Cytoplasmic fraction:

53%

Periplasmic fraction:

1%

Medium fraction:

46%

85

ภาพท 33 แผนผงขนตอนการแยกบรสทธเอนไซม MPH จากอาหารเลยงเชอ โดยใชคอลมน HisPure cobalt column

86

ภาพท 34 แผนผงขนตอนการแยกบรสทธเอนไซม MPH จากเพอรพลาสซมโดยใชคอลมน HisPure cobalt column ตารางท 12 การแยกบรสทธเอนไซม MPH ในสวนของอาหารเลยงเชอ

Purification Step

Activity (U/ml)

Total Activity

(U)

Protein (mg/ml)

Total Protein (mg)

Specific Activity (U/mg)

Purification (fold)

Yield (%)

Crude extract 0.31 0.61 8.28 16.55 0.04 1 100 HisPur™ Cobalt spin column

0.14 0.28 0.04 0.08 3.44 93.0 46.2

87

ตารางท 13 การแยกบรสทธเอนไซม MPH ในสวนของเพอรพลาสซม

Purification Step

Activity (U/ml)

Total Activity

(U)

Protein (mg/ml)

Total Protein (mg)

Specific Activity (U/mg)

Purification (fold)

Yield (%)

Crude extract 0.02 0.04 22.25 44.50 0.001 1 100 HisPur™ Cobalt spin column + Ultrafiltation

1.74 0.35 0.19 0.039 9.03 10777.95 935.4

จากการวเคราะหหามวลโมเลกลของเอนไซม MPH ดวยเทคนค SDS-PAGE ทไดจากการแยกบรสทธเอนไซมทไดในสวนของอาหารเลยงเชอ และเพอรพลาสซมโดยเมอเปรยบเทยบขนาดของแถบโปรตนทไดจากการชะจากคอลมน ท เกดขนกบแถบโปรตนมาตรฐาน พบวาปรากฎ แถบโปรตนทขนาดประมาณ 36 กโลดาลตน ซงเปนขนาดของเอนไซม MPH ทมขนาดประมาณ 35 กโลดาลตน (Zhongli และคณะ, 2001; Fu และคณะ, 2004; Ekkhunnatham และคณะ, 2012) รวมอยกบ polyhistidine-tag ทมขนาดประมาณ 0.84 กโลดาลตน (Terpe, 2003) ดงแสดงในภาพท 35 และ 36 ตามล าดบ แตอยางไรกตามจากผลการทดลองยงพบแถบโปรตนทขนาดอนๆ อกหลายแถบ จงจ าเปนตองท าการวเคราะหกจกรรมของเอนไซม MPH บนแผนเจล SDS-PAGE เพอยนยนแถบโปรตนทขนาดประมาณ 36 กโลดาลตน ทไดจากเอนไซมในสวนของอาหารเลยงเชอ และ เพอรพลาสซมทไดจากการชะออกจากคอลมนดวยเทคนค zymogram analysis พบวาปรากฏแถบ สเหลองของ PNP จากการยอยสลาย MP โดยเอนไซม MPH ทขนาดประมาณ 36 กโลดาลตน เพยงแถบเดยว ดงแสดงในภาพท 37 และ 38 ตามล าดบ จงเปนการยนยนไดวาแถบโปรตนท ขนาดประมาณ 36 กโลดาลตน ทไดนเปนแถบโปรตนของเอนไซม MPH ดงนนจากผลการทดลองทไดแสดงใหเหนวาสามารถท าบรสทธเอนไซม MPH ทหลงออกสอาหารเลยงเชอ และ เพอรพลาสซม โดยอาศยการท างานของ OmpA signal peptide ทจะน าเอนไซม MPH ใหหลงออกส periplasmic space ตามระบบการหลงโปรตนออกนอกเซลลของ E. coli ชนด type II โดยอาศยการท างานของกลไกการท างาน SecB-dependent pathway (Mergulhao และคณะ, 2005) แตอยางไรกตามกลไกในการหลงเอนไซมออกสอาหารเลยงเชอยงไมทราบแนชด (Mergulhao และคณะ, 2005) แตจากผลการทดลองทพบเอนไซมในสวนของอาหารเลยงเชอนน อาจเกดจากการรวของเอนไซม

88

MPH จากสวนของเพอรพลาสซมผานเยอหมเซลลชนนอกในการเลยงทมการเขยาเปนระยะเวลานาน (20 ชวโมง) หรอในระหวางการแบงเซลลของแบคทเรย (Cornelis, 2000; Marco, 2009; Yamabhai และคณะ, 2008) และจากผลการทดลองแมวาจะพบโปรตนชนดอนทไดมาจากขนตอนการชะคอลมนนอกเหนอจากเอนไซม MPH กตาม แตจะเหนไดวาโปรตนทปนเปอนออกมานนเปนเพยงสวนนอยเมอเทยบกบโปรตนทงหมดทผานคอลมน (โปรตนในสวน flow through) ซงอาจเปนโปรตนทลางออกจากคอลมนไมหมดในขนตอนการลางดวย wash buffer เนองจากความเขมขนของอมดาโซลทใชใน wash buffer ยงไมเหมาะสมในการลางโปรตนแหลานออกจากคอลมน หรอความเขมขนอมดาโซลทใชในการซะโปรตนออกจากคอลมนยงไมเหมาะสมทจะชะโปรตนทตองการออกจากคอลมนโดยปราศจากโปรตนชนดอนทไมตองการออกมาดวย แตอยางไรกตามหากตองการเอนไซมทมความบรสทธสงจ าเปนตองศกษาหาความเขนขนของอมดาโซล ทเหมาะสมทสดทใชในการลางหรอชะคอลมน หรออาจน าโปรตนทแยกบรสทธไดไปแยกบรสทธเพมดวยวธอนตอไป เพอใหไดโปรตนทบรสทธปราศจากโปรตนชนดอนทไมตองการได และ จากผลการทดลองยงเปนการยนยนไดอกดวยวารคอมบแนนทโคลน BpHF ทได สามารถผลตเอนไซม MPH ใหหลงเอนไซมออนออกนอกเซลลได แมวาเอนไซม MPH ทไดจากการทดลองนยงมการผลตไดในปรมาณทต า เมอเปรยบเทยบกบการผลตเอนไซม MPH ในระบบการแสดงออกภายในเซลล ของโคลน BpGT (วรฬห ศภลกษณนาร, 2549; อนรทธ เอกคณธรรม, 2552) แตอยางไรกตามการไดมาซงเอนไซมจากงานวจยนท าไดงายกวาการผลตเอนไซมภายในเซลล อาศยเพยงการใชสารละลายบฟเฟอร osmotic shock ในการสกดเอนไซมออกจากเพอรพลาสซม และกระบวนการตกตะกอนโปรตนของเอนไซมทไดในสวนของอาหารเลยงเชอ ซงไมจ าเปนตองใชกระบวนการแตกเซลลทยงยาก และกระบวนการท าใหเสยสภาพของโปรตน (denaturation) รวมทงกระบวนการ refold โปรตนกอนการท าบรสทธ เหมอนการผลตเอนไซมภายในเซลล ซงวธการผลตเอนไซมใหหลงออกมานอกเซลลนจงจดเปนวธการทงาย ประหยดเวลา และมราคาถก เหมาะแกการน าไปประยกตใชเปนแหลงในการผลตเอนไซม MPH ตอไปได

89

ภาพท 35 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE ในสวนอาหารเลยงเชอของโปรตนในแตละขนตอนของการแยกบรสทธเอนไซมโดยใช HisPure cobalt spin column โดยชองท 1 คอ แถบโปรตนมาตรฐาน, ชองท 2 คอ flow through, ชองท 3-6 คอ โปรตนทไดจากการลางคอลมนดวย wash buffer ครงท 1-4 และชองท 7-10 คอ เอนไซม MPH ทไดจากการชะคอลมนครงท 1-4

ภาพท 36 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE ในสวนเพอรพลาสซม ของโปรตนในแตละขนตอนของการแยกบรสทธเอนไซมโดยใช HisPure cobalt spin column โดยชองท 1 คอ แถบโปรตนมาตรฐาน, ชองท 2 คอ flow through, ชองท 3-5 คอ โปรตนทไดจากการลางคอลมนดวย wash buffer ครงท 3, 5 และ 7, ชองท 6-10 คอเอนไซม MPH ทไดจากการชะคอลมนครงท 1-5

90

ภาพท 37 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE และเทคนค zymogram analysis ในสวนของอาหารเลยงเชอโดยใช HisPure cobalt spin column โดย panel A คอ โปรตนในแตละขนตอนของการแยกบรสทธเอนไซม, ชองท 1 คอ แถบโปรตนมาตรฐาน, ชองท 2 คอ flow through, ชองท 3 คอ เอนไซม MPH ทไดจากการชะคอลมน และ panel B คอ zymogram analysis ของเอนไซม MPH ทไดจากการแยกบรสทธ

91

ภาพท 38 การแยกวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE และเทคนค zymogram analysis ในสวนของเพอรพลาสซม โดยใช HisPure cobalt column โดย panel A คอ โปรตนในแตละข นตอนของการแยกบรสทธ เอนไซม, ชองท 1 คอ แถบโปรตนมาตรฐาน , ชองท 2 คอ flow through, ชองท 3 คอ เอนไซม MPH ทไดจากการชะคอลมน และ panel B คอ zymogram analysis ของเอนไซม MPH ทไดจากการแยกบรสทธ

92

บทท 5

สรปผลการวจย

ในงานวจยนไดศกษาเกยวกบการโคลนและการแสดงออกของยน mpdB ทเกยวของกบการยอยยาฆาแมลง MP โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตนใน E. coli รวมถงการน าเอนไซม MPH ทแสดงออกโดยการหลงออกนอกเซลลไปแยกบรสทธเอนไซม การศกษาการโคลนและการแสดงออกของยน mpdB โดยน ายน mpdB ของเชอแบคทเรย Burkholderia cepacia ทสามารถยอยสลายยาฆา MP ไปใชเปนดเอนเอแมแบบในปฏกรยาพซอารเพอเพมจ านวนชนยน โดยใชคไพรเมอรซงออกแบบไพรเมอรจากขอมลล าดบนวคลโอไทดของเชอแบคทเรย Plesiomonas sp. สายพนธ M6 หมายเลข accession number AF338729 ของ GenBank ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลง MP (Zhongli et al., 2001) ทม homology กบล าดบ นวคลโอไทดทถอดรหสมาจากล าดบของกรดอะมโนดาน N-terminus ของเชอ Burkholderia cepacia ซงมผวจยไวกอนหนาน (เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ และ บญศร จงเสรจต , 2544; Ekkhunnatham และคณะ, 2012) โดยออกแบบเฉพาะในสวนของยนท code ใหเอนไซม MPH ซงไมรวมกบล าดบนวคลโอไทดในสวนของ signal sequence เดมของเอนไซม (mature MPH) และท าการโคลนยนทสรางเอนไซม MPH น เขาสพลาสมด pHisFlag-1 โดยใหชอรคอมบแนนทพลาสมดเปน pHF1 ซงคอ พลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB (pHisFlag-1::mpdB) และเมอน าล าดบ นวคลโอไทดของชนดเอนเอนไปเปรยบเทยบความเหมอนกบล าดบนวคลโอไทดของ Burkholderia cepacia หมายเลข accession number DQ001540 ของ GenBank พบวาล าดบนวคลโอไทดทไดมความเหมอนกบล าดบนวคลโอไทดของยน mpdB ของเชอ Burkholderia cepacia คดเปน 100 เปอรเซนต แลวถายโอนรคอมบแนนทพลาสมดทไดเขาสเซลลเจาบาน E. coli สายพนธ BL21 (DE3) โดยใหชอรคอมบแนนทโคลนเปน BpHF ซงคอ เชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทม รคอมบแนนทพลาสมด pHisFlag-1 ทมยน mpdB โดยรคอมบแนนทโคลน BpHF นมความสามารถในการผลตเอนไซม MPH ใหหลงออกนอกเซลล โดยสามารถหลงเอนไซม MPH ออกมายอยสลายยาฆาแมลง MP ปรากฏเปนสเหลองของ PNP รอบๆ โคโลน (yellow halo) ของเชอ BpHF นได

93

การศกษาการผลตและแยกบรสทธเอนไซม MPH จากรคอมบแนนทโคลน BpHF พบวา เชอ BpHF สามารถผลตเอนไซมใหหลงออกสเพอรพลาสซม และอาหารเลยงเชอ โดยสามารถ แยกบรสทธเอนไซม MPH จากโปรตนทไดใน 2 สวนนไดงาย โดยใช HisPure cobalt column และ จากผลการวเคราะหเอนไซม MPH ดวยเทคนค SDS-PAGE และเทคนค zymogram analysis พบวาเอนไซม MPH ทแยกบรสทธไดมขนาดประมาณ 36 กโลดาลตน โดยปรากฏแถบโปรตนและ แถบสเหลองของ PNP ในแผนเจล SDS-PAGE และแผนเจล zymogram analysis ตามล าดบ ซงเปนขนาดของเอนไซม MPH ทมขนาดประมาณ 35 กโลดาลตน (Zhongli และคณะ, 2001; Fu และ คณะ, 2004; Ekkhunnatham และคณะ, 2012) รวมอยกบ polyhistidine-tag ทมขนาดประมาณ 0.84 กโลดาลตน (Terpe, 2003) จะเหนไดวารคอมบแนนทโคลน BpHF นมความสามารถในการผลตเอนไซม MPH ใหหลงออกนอกเซลล และสามารถท าบรสทธเอนไซมในสวนของเพอรพลาสซม และอาหารเลยงเชอได ดงนนจงมความเปนไปไดทจะน าโคลน BpHF น มาใชเปนแหลงในการผลตเอนไซม MPH ทงายตอการผลตและการน าไปใช รวมทงเปนการชวยลดตนทนในการผลตเอนไซมนได แตอยางไรกตามการผลตเอนไซม MPH จากรคอมบแนนทโคลน BpHF นยงมปรมาณทต า จงจะตองท าการศกษาถงรปแบบในการแสดงออกของเอนไซม MPH (expression profile) ของโปรตนทไดในสวนตางๆ ของเซลล ไดแก โปรตนในสวนของอาหารเลยงเชอ เพอรพลาสซม ไซโตพลาสซม และตะกอนเซลลทไดหลงจากการสกดโปรตนในสวนของไซโตพลาสซม รวมทงตะกอนเซลลทไดจากขนตอนกอนและหลงการเหนยวน าดวย IPTG เพอเปนการยนยนวาโปรตนทแสดงออกจาก รคอมบแนนทโคลนอยในรปทละลายน า (soluble protein) หรออยในรปทไมละลายน า (inclusion body) มากกวากน รวมทงเพอดระดบการแสดงออกของเอนไซม MPH นอกดวย ซงจะเปนขอมลพนฐานทเปนประโยชนเพอน ามาใชประกอบการพจารณาในการหาสภาวะทเหมาะสมทสดในการผลตเอนไซม MPH ใหหลงออกนอกเซลล และศกษาการแยกบรสทธเอนไซม MPH ทหลงออกนอกเซลล โดยศกษาโปรตนจากทกสวนทไดจากการท าบรสทธดวยการวดคากจกรรมเอนไซมรวมกบการวเคราะหโปรตนดวยเทคนค SDS-PAGE เพอศกษาถงประสทธภาพในการแยกบรสทธเอนไซม MPH โดยใช cobalt column และศกษาหาสภาวะในการแยกบรสทธเอนไซมโดยวธนตอไป เพอใชเปนแหลงในการผลตเอนไซม MPH ทมประสทธภาพสง ในการประยกตใชใหเปนประโยชนตอไป นอกจากนอาจน าเอนไซมทไดจากงานวจยมาพฒนาตอยอดเปนนวตกรรมหรอผลตภณฑทจะชวยตรวจสอบหรอก าจด/ลดการปนเปอนของยาฆาแมลงในกลมนในสภาพแวดลอมและผลผลตทางการเกษตรเพอเปนการเพมคณภาพสนคาใหมมาตรฐานเพยงพอในการสงออก ซงจะกอใหเกดความปลอดภยอาหารดานพช และเปนการเพมมลคาสนคาเกษตรไดอกดวย

94

บรรณานกรม

กรมควบคมมลพษ. กองจดการสารอนตรายและกากของเสย. ฝายสารอนตรายจากสาธารณสข (2541) เอกสารชดสารเคมเฉพาะเรอง (monograph) เมทธลพาราไธออน (methyl parathion); โรงพมพกรมควบคมมลพษ, กรงเทพมหานคร, 180.

กรมโรงงานอตสาหกรรม. ส านกควบคมวตถอนตราย (2547) ประกาศกระทรวงอตสาหกรรม เรอง บญชรายชอวตถอนตราย (ฉบบท 2) พ.ศ. 2547; กรมโรงงานอตสาหกรรม, กรงเทพมหานคร, 8-11.

กรมวชาการเกษตร. กองวตถมพษการเกษตร (2537) รายงานผลการคนควาวจยฉบบเตมประจ าป 2537; กรมวชาการเกษตร, กรงเทพมหานคร, 35.

กรมวชาการเกษตร. กองวตถมพษการเกษตร (2538) การประชมวชาการกองวตถมพษการเกษตร ครงท 1; กรมวชาการเกษตร, กรงเทพมหานคร, 100-102.

กรมวชาการเกษตร. กองควบคมพชและวสดการเกษตร (2556) ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ เรอง ก าหนดพชเปนพชควบคมเฉพาะ พ.ศ. 2556; กรมวชาการเกษตร, กรงเทพมหานคร, 12.

เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ, บญศร จงเสรจตต และ วนเพญ แยมขนทอง (2543) การศกษา ขนตนของการวเคราะหในระดบยนของเชอ Pseudomonas sp. ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออน; การประชมวชาการวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงประเทศไทยครงท 26, กรงเทพมหานคร.

เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ และบญศร จงเสรจตต (2544) การศกษาขนตนของการวเคราะหในระดบยนของเชอ Pseudomonase sp. ทสามารถยอยสลายยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออน; รายงานการวจย พฒนาและวศวกรรม ฉบบสมบรณ ทเสนอตอส านกงานพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงชาต ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต, นครปฐม, 30-34.

พาลาภ สงหเสน (2531) พษของยาฆาแมลงตอผใชและสงแวดลอม; ส านกพมพจฬาลงกรณ มหาวทยาลย, กรงเทพมหานคร, 25-65.

พรพมล เจรญสง (2533) เมทธลพาราไธออน; เอกสารเผยแพรทางวชาการ, ส านกงานคณะกรรม การสงแวดลอมแหงชาต, กรงเทพมหานคร, 14.

ดพรอม ไชยวงศเกยรต (2527) ยาฆาแมลง; ชมรมถายทอดเทคโนโลยการ เกษตร มก. บางเขน, กรงเทพมหานคร, 55-71.

95

นวลศร ทยาพชร (2541) ปญหาสารพษทางการเกษตรในประเทศไทย; รายงานวชาการ, กรมวชาการเกษตร, กรงเทพมหานคร, 13-41.

วรฬท ศภลกษณนาร (2549) การบงช การศกษาลกษณะ และการศกษาการแสดงออกของยนในวถการยอยสลายยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออนของเชอ Burkholderia cepacia; วทยานพนธปรญญามหาบณฑต สาขาเทคโนโลยชวภาพ, มหาวทยาลยศลปากรม, นครปฐม.

สนย นเทศพตรพงศ (2552) ตรวจสอบสารพษตกคางในตวอยางพชแปลง; จดหมายขาวผลใบ, กรมวชาการเกษตร, กรงเทพมหานคร, 12(1):12-15.

เสาวลกษณ วงคเทยนหลาย (2547) การบงชและการศกษาคณลกษณะของยนเมทธลพาราไธออนไฮโดรเลสจากเชอ Burkholderia cepacia; วทยานพนธปรญญามหาบณฑต สาขาเทคโนโลยชวภาพ, มหาวทยาลยศลปากร, นครปฐม.

ส านกงานเศรษฐกจการเกษตร. กระทรวงเกษตรและสหกรณ (2554) เอกสารสถตการเกษตรของประเทศไทย ป 2554; ส านกงานเศรษฐกจการเกษตร, กรงเทพมหานคร, 153-165.

Ausubel, Frederick A. (1997) Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons Inc., New York

Anh, D.H., Cheunrungsikul, K., Wichitwechkarn, J. and Surareungchai, W. (2011) A Colorimetric Assay for Determination of Methyl Parathion Using Recombinant Methyl Parathion Hydrolase. Biotechnology Journal, 6(5):565-571.

Ayadi-Zouari, D., Kammoun, R., Jemli, S., Chouayekh, H. and Bejar, S. (2012) Secretion of Cyclodextrin Glucanotransferase in E. coli Using Bacillus subtilis Lipase Signal Peptide and Optimization of Culture Medium. Indian Journal of Experimental Biology, 50:72-79.

Azaman, S.N.A., Ramanan, R.N., Tan, J.S., Rahim, R.A., Abdullah, M.P. and Ariff, A.B. (2010) Screening for the Optimal Induction Parameters for Periplasmic Producing Interferon-α2b in Escherichia coli. African Journal of Biotechnology, 9(38):6345-6354.

Bradford, M.M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, 72:248-254.

Chaudhry, G. R. (1994) Biological Degradation and Bioremediation of Toxic Chemicals; Colorcarft Ltd., Hong Kong, 203.

96

Chen, Y., Zhang, X., Liu, H., Wang, Y. and Xia, X. (2002) Study on Pseudomonas sp. WBC-3 Capable of Complete Degradation of Methyl Parathion. Wei Sheng Wu Xue Bao 42, 490–497.

Cheng, T.C., Harvey, S.P. and Chen, G.L. (1996) Cloning and Expression of a Gene Encoding a Bacterial Enzyme for Decontamination of Organophosphorus Nerve Agents and Nucleotide Sequence of the Enzyme. Applied and Environmental Microbiology, 62(5):1636-41.

Choi, J.H. and Lee, S.Y. (2004) Secretory and Extracellular Production of Recombinant Proteins Using Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology, 64(5):625-635.

Cornelis, P. (2000) Expressing Genes in Different Escherichia coli Compartments. Current Opinion in Biotechnology, 11:450–454.

Ekkhunnatham, A., Jongsareejit, B., Yamkunthong, W. and Wichitwechkarn, J. (2012) Purification and Characterization of Methyl Parathion Hydrolase from Burkholderia cepacia Capable of Degrading Organophosphate Insecticides. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28:1739-1746.

Ekkhunnatham, A., Wichitwechkarn, J. and Surareungchai, W. (2010) Development of Biosensor for Pesticide Detection Using Methyl Parathion Hydrolase from Recombinant MPD Clone. Proceedings of Pure and Applied Chemistry Conference 2010. Ubonratchathani.

Elashvili, I., DeFrank, J.J. and Culotta,V.C. (1998) phnE and glpT Genes Enhance Utilization of Organophosphates in Escherichia coli K-12. Applied Microbiology and Biotechnology, 64:2601-2608.

Fu, G., Cui, Z., Huang, T. and Li, S. (2004) Expression, Purification, and Characterization of a Novel Methyl Parathion Hydrolase. Protein Expression and Purification, 36(2):170-176.

Granelli-Piperno, A. and Reich, E. (1978) A Study of Proteases and Protease–Inhibitor Complexes in Biological Xuids. Journal of Experimental Medicine, 148:223–234.

Guoping, F., Zhongli, C., Tingting, H. and Shunpeng, L. (2004) Expression, Purification and Characterization of Novel Methyl Parathion Hydrolase. Protein Expression and Purification, 36:170-176

97

Horne, I., Sutherland, T.D., Harcourt, R.L., Russell, R.J. and Oakeshott, J.G. (2002) Identification of an opd (Organophosphate Degradation) Gene in an Agrobacterium Isolate. Applied and Environmental Microbiology, 68(7):3371-3376.

Kang, D.G., Choi, S.S. and Cha, H.J. (2006) Enhanced Biodegradation of Toxic Organophosphate Compounds Using Recombinant Escherichia coli with Sec Pathway-Driven Periplasmic Secretion of Organophosphorus Hydrolase. Journal of Biotechnology, 22:406-410.

Kang, D.G., Lim, G. and Cha, H.J. (2005) Functional Periplasmic Secretion of Organophosphorous Hydrolase Using the Twin-Arginine Translocation Pathway in Escherichia coli. Journal of Biotechnology, 118:379-385.

Keprasertsup, C. (1995) Degradation of Methyl Parathion in an Aqueous Medium by Soil Bacteria; Master Degree of Science (Environmental Biology), Mahidol University, 45.

Keprasertsup, C., Upatham, S., Sukhapanth, N. and Prempree, P. (2001) Degradation of Methyl Parathion in an Aqueous Medium by Soil Bacteria. Science Asia, 27:261-270.

Konstantinou, I.K., Hela, D.G. and Albanis, T.A. (2006) The Status of Pesticide Pollution in Surface Waters (Rivers and Lakes) of Greece. Part I. Review on occurrence and levels. Environmental Pollution, 141(3):555-570.

Laurie, A.D. and Lloyd-Jones, G. (1999) The phn Genes of Burkholderia sp. strain RP007 Constitute a Divergent Gene Cluster for Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Catabolism. Journal of Bacteriology, 181(2):531-540.

Li, C., Zhang, J., Jiang, Y., Gurewich, V., Chen, Y. and Liu, J.N. (2001) Urokinase-Type Plasminogen Activator Up-Regulates. Its Own Expression by Endothelial Cells and Monocytes via the u-PAR Pathway. Thrombosis Research, 103:221–232.

Malone, A.S., Shellhammer, T.H. and Courtney, P.D. (2002) Effects of High Pressure on the Viability, Morphology, Lysis, and Cell Wall Hydrolase Activity of Lactococcus lactis subsp. Cremoris. Applied and Environmental Microbiology, 68:4357–4363.

Marco, A.D. (2009) Strategies for Successful Recombinant Expression of Disulfide Bond-Dependent Proteins in Escherichia coli. Microbial Cell Factories, 8:26.

Mergulhao, F.J.M., Summers, D.K. and Monteiro, G.A. (2005) Recombinant Protein Secretion in Escherichia coli. Biotechnology Advances, 23(3):177-202.

98

Mergulhao, F.J.M., Taipa, M.A., Cabral, J.M.S. and Monteiro, G.A. (2004) Evaluation of Bottlenecks in Proinsulin Secretion by Escherichia coli. Journal of Biotechnology, 109:31-43.

Methyl parathion Structure [Online], accessed 1 May 2011. Available from http://www.pesticideinfo.org/ChemGifs/PC35110.gif

Munnecke, D.M. and Hsieh, D.P.H. (1974) Microbial Decontamination of Parathion and p-Nitrophenol in Aqueous Media. Applied and Environmental Microbiology, 2(28): 2212-2217.

Neu, H.C. and Heppel, L.A. (1965) The Release of Enzymes from Escherichia coli by Osmotic Shock and During the Formation of Spheroplasts. Journal of Biological Chemistry, 240:3685-3692.

Organophosphate Structure [Online], accessed 1 May 2011. Available from http://www.ams.ac.ir/AIM/08111/0015.html

Perry, A.S., Yamamoto, I., Ishaaya, I. and Perry, R.Y. (1998) Insecticides in Agriculture and Environment Retrospects and Prospects; Narosa Publishing House, New Dehli, 61.

pFlag-CTS [Online], accessed 11 April 2014. Available from http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/cloning-and-expression/vector-systems/vector-maps.html

pFlag-CTS Features [Online], accessed 11 April 2014. Available from http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/life-science/cloning-and-expression/feature-maps/pflag-cts.gif

Pines, O. and Inouye, M. (1999) Expression and Secretion of Protein in E. coli. Molecular Biotechnology, 12:25-33.

Ramanathan, M. and Lalithakumari, D. (1999) Complete Mineralization of Methyl Parathion by Pseudomonas sp. A3. Applied Biochemistry and Biotechnology, 80(1):1-12.

Robbens, J., De Coen, W., Fiers, W. and Remaut, E. (2006) Improved Periplasmic Production of Biologically Active Murine Interleukin-2 in Escherichia coli through a Single Amino Acid Change at the Cleavage Site. Process Biochemistry, 41:1343-1346.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd

ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

99

Siddavattam, D., Khajamohiddin, S., Manavathi, B., Pakala, S.B. and Merrick, M. (2003) Transposon-Like Organization of the Plasmid-Borne Organophosphate Degradation (opd) Gene Cluster Found in Flavobacterium sp. Applied and Environmental Microbiology, 69(5):2533-39.

Siddavattam, D., Raju, E.R., Paul, P.V.E. and Merrick, M. (2006) Overexpression of Parathion Hydrolase in Escherichia coli Stimulates the Synthesis of Outer Membrane Porin OmpF. Pesticide Biochemistry and Physiology, 86:146-150.

Songsiriritthigul, C., Buranabanyat, B., Haltrich, D. and Yamabhai, M. (2010) Efficcient Recombinant Expression and Secretion of a Thermostable GH26 Mannan Endo-1,4--Mannosidase from Bacillus licheniformis in Escherichia coli. Microbial Cell Factories, 9:20.

Suppaluknaree, W., Ekkunatham, A. and Wichitwechkarn, J. (2007) Purification and Characterization of Methyl Parathion Hydrolase from Cloned mpd Gene. Proceedings in 33th Congress on Science and Technology of Thailand. Nakhon Si Thammarat.

TArget Clone/ Target Clone-Plus- [Online], accessed 11 April 2014. Available from http://www.toyobo.co.jp/e/bio

Terpe, K. (2003) Overview of Tag Protein Fusions: from Molecular and Biochemical Fundamentals to Commercial Systems. Microbiol Biotechnol, 60:523-533.

Thanassi, D.G. and Hultgren, S.J. (2000) Multiple Pathways Allow Protein Secretion Across the Bacterial Outer Membrane. Cell Biology, 12:420-430.

Vassalli, J.D., Dayer, J.M. and Wohlwen, A. (1984) Concomitant Secretion of Prourokinase and of a Plasminogen Activator Inhibitor by Cultured Human Monocytes Macrophages. Journal of Experimental Medicine, 159:1653–1658.

Wikipedia the free encyclopedia. Signal Peptide Sequence Structure [Online], accessed 1 May 2011. Available from http://commons.wikimedia.org/wiki/ File:Signal_sequence.svg?uselang=de

Wongthianlai, S., Chimthong, S., Srirattana, K. and Wichitwechkarn, J. (2007) Identification, Cloning, and Expression of mpd Gene Coding for Methyl Parathion Hydrolase from Burkholderia cepacia. Proceedings in 33th Congress on Science and Technology of Thailand. Nakhon Si Thammarat.

100

Yamabhai, M., Emrat, S., Sukasem, S., Pesatcha, P., Jaruseranee, N. and Buranabanyat, B. (2008) Secretion of Recombinant Bacillus Hydrolytic Enzymes Using Escherichia coli Expression Systems. Journal of Biotechnology, 133(1):50-57.

Yang, C., Freudl, R., Qiao, C. and Mulchandani, A. (2010) Cotranslocation of Methyl Parathion Hydrolase to the Periplasm and of Organophosphorus Hydrolase to the Cell Surface of Escherichia coli by the Tat Pathway and Ice Nucleation Protein Display System. Applied and Environmental Microbiology, 76(2):434-440.

Yang, W., Zhou, Y.F., Dai, H.P., Bi, L.J., Zhang, Z.P., Zhang, H.X., Leng, Y. and Zhang, X.E. (2008) Application of Methyl Parathion Hydrolase (MPH) as a Labeling Enzyme. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 390:2133-2140.

Yoon, S.H., Kim, S.K. and Kim, J.F. (2010) Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Biotechnology, 4:23-29.

Zhang, X.Z., Cui, Z.L., Hong, Q. and Li, S.P. (2005) High-Level Expression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subtilis WB800. Applied and Environmental Microbiology, 71(7):4101-4103.

Zhongli, C., Shupeng, L. and Guoping, F. (2001) Isolation of Methyl Parathion-Degrading Strain M6 and Cloning of the Methyl Parathion Hydrolase Gene. Applied and Environmental Microbiology, 10(67):4922-4925.

ภาคผนวก

ภาคผนวก ก

103

อาหารเลยงเชอแบคทเรย

1. อาหารเหลว Luria-Bertani (LB broth) เตรยมสารเคมดงตวอยางตอไปน

Tryptone 10 กรม Yeast extract 5 กรม Sodium chloride 10 กรม

น าสวนประกอบทงหมดละลายในน าปรมาตร 1 ลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน แบงใสภาชนะตามตองการ น าไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท 2. อาหารแขง Luria-Bertani (LB agar)

เตรยมสารเคมดงตวอยางตอไปน Tryptone 10 กรม Yeast extract 5 กรม Sodium chloride 10 กรม Agar 14 กรม

น าสวนประกอบทงหมดละลายในน าปรมาตร 1 ลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน น าไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท ตงทงไวจนกระทงของเหลวมอณหภมประมาณ 55-60 องศาเซลเซยส แบงใสภาชนะตามตองการในสภาวะปลอดเชอ

3. อาหารเหลว Luria-Bertani ทมยาปฎชวนะแอมพซลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร (LB+ampicillin broth)

เตรยมสารเคมดงตวอยางตอไปน Tryptone 10 กรม Yeast extract 5 กรม Sodium chloride 10 กรม Ampicillin (10 mg/ml) 10 มลลลตร

น าสวนประกอบทงหมดยกเวนยาปฏชวนะแอมพซลน (ampicillin) ละลายในน าปรมาตร 1 ลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน น าไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15

104

ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท ตงทงไวจนกระทงของเหลวมอณหภมประมาณ 55-60 องศา-เซลเซยส ท าการเตมยาปฏชวนะแอมพซลน ความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 มลลลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน แบงใสภาชนะตามตองการในสภาวะปลอดเชอ 4. อาหารแขง Luria-Bertani ทมยาปฎชวนะแอมพซลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร (LB+ampicillin agar)

เตรยมสารเคมดงตวอยางตอไปน Tryptone 10 กรม Yeast extract 5 กรม Sodium chloride 10 กรม Agar 14 กรม Ampicillin (10 mg/ml) 10 มลลลตร

น าสวนประกอบทงหมดยกเวนยาปฏชวนะแอมพซลน (ampicillin) ละลายในน าปรมาตร 1 ลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน น าไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท ต งทงไวจนกระทงของเหลวมอณหภมประมาณ 55-60 องศาเซลเซยส ท าการเตมยาปฏชวนะแอมพซลนความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 มลลลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน แบงใสภาชนะตามตองการในสภาวะปลอดเชอ

5. อาหารแขง Luria-Bertani ทมยาปฎชวนะแอมพซลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และ IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร (LB+ampicillin+IPTG agar)

เตรยมสารเคมดงตวอยางตอไปน Tryptone 10 กรม Yeast extract 5 กรม Sodium chloride 10 กรม Agar 14 กรม Ampicillin (10 mg/ml) 10 มลลลตร IPTG (0.4 M) 2.5 มลลลตร

น าสวนประกอบทงหมดยกเวนยาปฏชวนะแอมพซลน (ampicillin) และ IPTG มาละลายในน าปรมาตร 1 ลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน น าไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท ตงทงไวจนกระทงของเหลวมอณหภมประมาณ

105

55-60 องศาเซลเซยส ท าการเตมยาปฏชวนะแอมพซลน ความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 มลลลตร และ IPTG ความเขมขน 0.4 โมลาร ปรมาตร 2.5 มลลลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน แบงใสภาชนะตามตองการในสภาวะปลอดเชอ 6. อาหารแขง Luria-Bertani ทมยาปฎชวนะแอมพซลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร, IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร และ X-gal ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร (LB+ampicillin+IPTG+X-gal agar)

เตรยมสารเคมดงตวอยางตอไปน Tryptone 10 กรม Yeast extract 5 กรม Sodium chloride 10 กรม Agar 14 กรม Ampicillin (10 mg/ml) 10 มลลลตร IPTG (0.4 M) 2.5 มลลลตร X-gal (20 mg/ml) 5 มลลลตร

น าสวนประกอบทงหมดยกเวนยาปฏชวนะแอมพซลน (ampicillin), IPTG และ X-gal มาละลายในน าปรมาตร 1 ลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน น าไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท ตงทงไวจนกระทงของเหลวมอณหภมประมาณ 55-60 องศาเซลเซยส ท าการเตมยาปฏชวนะแอมพซลน ความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 มลลลตร, IPTG ความเขมขน 0.4 โมลาร ปรมาตร 2.5 มลลลตร และ X-gal ความเขมขน 20 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 5 มลลลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน แบงใสภาชนะตามตองการในสภาวะปลอดเชอ

106

7. อาหารแขง Luria-Bertani ทมยาปฎชวนะแอมพซลน ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร, IPTG ความเขมขน 1 มลลโมลาร และ methyl parathion ความเขมขน 50 ไมโครกรมตอมลลลตร (MP agar)

เตรยมสารเคมดงตวอยางตอไปน Tryptone 10 กรม Yeast extract 5 กรม Sodium chloride 10 กรม Agar 14 กรม Ampicillin (10 mg/ml) 10 มลลลตร IPTG (0.4 M) 2.5 มลลลตร Filter sterile methyl parathion (26.32 mg/ml) 1.9 มลลลตร

น าสวนประกอบทงหมดยกเวนยาปฏชวนะแอมพซลน (ampicillin), IPTG และ methyl parathion มาละลายในน าปรมาตร 1 ลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน น าไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท ตงทงไวจนกระทงของเหลวมอณหภมประมาณ 55-60 องศาเซลเซยส ท าการเตมยาปฏชวนะแอมพซลน ความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 มลลลตร, IPTG ความเขมขน 0.4 โมลาร ปรมาตร 2.5 มลลลตร และ methyl parathion ความเขมขน 26.32 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 1.9 มลลลตร ผสมใหเปนเนอเดยวกน แบงใสภาชนะตามตองการในสภาวะปลอดเชอ

ภาคผนวก ข

108

สารเคม

1. สารละลาย Glucose/Tris/EDTA พเอช 8.0 (GTE buffer) เตรยมสารเคมดงตอไปน

Glucose 9.01 กรม Tris base 3.03 กรม EDTA 2.92 กรม

น าสวนประกอบทงหมดผสมใหเขากนในน ากลน 800 มลลลตร ปรบพเอชดวยกรด HCl จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 8.0 แลวท าการปรบปรมาตรเปน 1,000 มลลลตร ดวยน ากลน น าสารละลายไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท

2. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 2 นอรมอล (2 N NaOH)

ละลายสาร NaOH 4 กรม ในน ากลนปรมาตร 30 มลลลตร ปรบปรมาตรใหได 50 มลลลตร ดวยน ากลน น าสารละลายทเตรยมไดไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท

3. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 0.2 นอรมอล ตอโซเดยมโดดซลซลเฟต ความเขมขน 1 เปอรเซนต (0.2 N NaOH: 1%SDS)

ผสมสารละลาย NaOH ความเขมขน 2 นอรมอล และ SDS ความเขมขน 10 เปอรเซนต เจอจางสารละลายดวยน ากลนทผานการฆาเชอแลว จนสารละลายมความเขมขนสดทายเปน NaOH ความเขมขน 0.2 นอรมอล และ SDS ความเขมขน 1 เปอรเซนต ควรท าการเตรยมสารละลายผสมนใหมทกครงกอนใช

4. สารละลายโซเดยมอะซเตต ความเขมขน 3 โมลาร พเอช 4.8 (3 M sodium acetate pH 4.8)

ละลาย sodium acetate 24.6 กรม ในน ากลนปรมาตร 80 มลลลตร ละลายใหเขากน ปรบพเอชดวยกรด glacial acetate จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 4.8 แลวท าการปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน ากลน น าสารละลายทเตรยมได ไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท

109

5. สารละลายโซเดยมคลอไรด ความเขมขน 5 โมลาร (5 M NaCl) ละลาย NaCl 29.2 กรม ในน ากลน แลวท าการปรบปรมาตรเปน100 มลลลตร น าสารละลายท

เตรยมได ไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท 6. สารละลาย 1 โมลาร Tris-HCl พเอช 8.0

ละลาย Tris base 121.14 กรม ในน ากลน 800 มลลลตร ปรบพเอชดวยกรด HCl จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 8.0 แลวท าการปรบปรมาตรเปน 1,000 มลลลตร ดวยน ากลน น าสารละลายไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท 7. สารละลาย 0.5 โมลาร EDTA พเอช 8.0

ละลาย EDTA 181.64 กรม ในน ากลนปรมาตร 800 มลลลตร กวนจนลละลาย เตมเกลด NaOH ลงไปจนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 8.0 ซงเปนพเอชท EDTA ละลายหมดพอด แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร น าสารละลายทเตรยมได ไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท

8. สารละลาย Tris/EDTA พเอช 7.8 (TE buffer, pH 8.0; 10 mM Tris, 1 mM EDTA)

ละลาย Tris base 1.21 กรม และ EDTA 0.29 กรม ในน ากลน ปรมาตร 800 มลลลตร ปรบพเอช ดวยกรด HCl จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 8.0 แลวปรบปรมาตรเปน 1,000 มลลลตร น าสารละลายทเตรยมได ไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท

9. สารละลายยาปฏชวนะแอมพซลน ความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร (10 mg/ml Ampicillin)

ละลายยาปฏชวนะแอมพซลน 0.5 กรม ในน ากลนและปรบปรมาตรเปน 50 มลลลตร ผสมสารละลายใหเขากน ท าการปลอดเชอโดยการกรองผานเมมเบรนขนาด 0.2 ไมครอน ทผานการฆาเชอแลว ลงสภาชนะทปลอดเชอ และเกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส

110

10. สารละลาย TAE buffer ความเขมขน 10 เทา (10X TAE buffer) ละลาย Tris base 242 กรม แลวตวงสารตางๆ ใหไดปรมาตรดงตอไปน

glacial acetic acid ปรมาตร 57.1 มลลลตร 0.5 โมลาร EDTA พเอช 8.0 ปรมาตร 100 มลลลตร

ผสมสารละลายทงหมดใหเขากน แลวปรบพเอชของสารละลายดวยกรด glacial acetic จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 8.0 น าสารละลายทเตรยมไดไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท 11. สารละลายเอธเดยมโบรไมด ความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร (10 mg/ml Ethidium bromide)

ละลาย Ethidium bromide 1 กรม ในน ากลนปลอดเชอ 100 มลลลตร และใชเครองแกวทผานการฆาเชอแลว กวนจนละลายดวยแทงแมเหลก (ใชเวลาหลายชวโมง) เกบใสขวดสชาหมดวยกระดาษฟอยล และเกบใหพนแสง (ในระหวางการเตรยม สวมถงมอและระวงอยาหายใจเอาผง เอธเดยมโบรไมดเขาไปในระหวางการชง เนองจากผงของสารนคอนขางละเอยดและเบา และสารนมคณสมบตเปน strong mutagen) 12. สารละลายแคลเซยมคลอไรด ความเขมขน 0.1 โมลาร (0.1 M CaCl2)

ละลาย CaCl2.2H2O 1.47 กรม ในน ากลนและปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร น าสารละลาย ทเตรยมได ไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท

13. สารละลาย Isopropylthio-β-D-Galactoside ความเขมขน 0.4 โมลาร (0.4 M IPTG)

ละลาย IPTG 0.954 กรม ในน ากลนและปรบปรมาตรเปน 10 มลลลตร ผสมสารละลายให เขากน ท าการปลอดเชอโดยการกรองผานเมมเบรนขนาด 0.2 ไมครอน ทผานการฆาเชอแลว ลงสภาชนะทปลอดเชอ และเกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส 14. สารละลายกรดไฮโดรคลอรก ความเขมขน 1 โมลาร (1 M HCl)

เตมกรด concentrated HCl ปรมตร 86.2 มลลลตร ลงในน ากลน ปรมาตร 913.18 มลลลตร ผสมใหเขากน (ควรท าในตดดควน เพราะไอกรดของกรดไฮโดรคลอรกจะเกดเปนควนฟ งกระจาย ซงเปนอนตรายเมอสดดมเขาไป)

111

15. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ความเขมขน 1 โมลาร (1 M NaOH) ละลาย NaOH 40 กรม ในน ากลน ในน ากลน ปรมาตร 800 มลลลตร ผสมใหเขากนและปรบ

ปรมาตรเปน 1,000 มลลลตร 16. สารละลายบฟเฟอร osmotic shock (30 mM Tris-HCl พเอช 8.0, 1 mM EDTA และ 500 mM sucrose)

ละลาย Tris-HCl 3.63 กรม, EDTA 0.29 กรม และ sucrose 171.15 กรม ในน ากลน ปรมาตร 800 มลลลตร ปรบพเอช ดวยกรด HCl จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 8.0 แลวปรบปรมาตรเปน 1,000 มลลลตร น าสารละลายทเตรยมได ไปนงฆาเชอดวยความรอน 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท 17. สารละลายบฟเฟอรฟอสเฟต ความเขมขน 50 มลลโมลาร พเอช 6.0 (50 mM Phosphate buffer, pH 6.0)

17.1 ละลาย dibasic sodium phosphate (MW 174.18) 1.7418 กรม ในน ากลนปรมาตร 200 มลลลตร

17.2 ละลาย monobasic sodium phosphate (MW 136.09) 1.3609 กรม ในน ากลนปรมาตร 200 มลลลตร

ผสมสารละลายทง 2 ชนด ตามอตราสวนทแสดงในตารางท 14

ตารางท 14 อตราสวนของสารในการเตรยม phosphate buffer pH K2HPO4 (ml) KH2PO4 (ml) Total volume (ml) 6 12.3 87.7 100

18. สารละลาย Binding Buffer (50 mM โซเดยมฟอสเฟต, 300 mM โซเดยมคลอไรด และ 10 mM อมดาโซล, พเอช 7.4)

ละลาย NaH2PO4·2H2O 3.90 กรม, NaCl 8.77 กรม และ imidazole 0.34 กรม ในน าปราศจากไอออน ปรมาตร 400 มลลลตร ปรบพเอช ดวย 1 N NaOH จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 7.4 แลวปรบปรมาตรเปน 500 มลลลตร

112

19. สารละลาย Elution Buffer (50 mM โซเดยมฟอสเฟต, 300 mM โซเดยมคลอไรด และ 150 mM อมดาโซล, พเอช 7.4)

ละลาย NaH2PO4·2H2O 3.90 กรม, NaCl 8.77 กรม และ imidazole 5.11 กรม ในน าปราศจากไอออน ปรมาตร 400 มลลลตร ปรบพเอช ดวย 2 N HCl จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 7.4 แลวปรบปรมาตรเปน 500 มลลลตร 20. สารละลาย Bis-Acrylamide ความเขมขน 30 เปอรเซนต โดยน าหนกตอปรมาตร

เตรยมสารเคมดงน Acrylamide 29 กรม Bis-Acrylamide 1 กรม

ละลายสารเคมดงกลาวดวยน าปราศจากไอออนปรมาตร 100 มลลลตร ผสมใหเขากนเกบสารละลายใสขวดสชาหรอขวดทหอดวยกระดาษฟอยล เกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส (สารละลายสามารถเกบไวไดนาน 1 เดอน)

21. สารละลาย Tris-HCl ความเขมขน 0.5 โมลาร พเอช 6.8

ละลาย Tris base 6.06 กรม ในน าปราศจากไอออน ปรมาตร 80 มลลลตร ปรบพเอชดวย กรด HCl จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 8.0 แลวท าการปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน

22. สารละลาย Tris-HCl ความเขมขน 1.5 โมลาร พเอช 8.8

ละลาย Tris base 18.17 กรม ในน าปราศจากไอออนประมาณ 80 มลลลตร ปรบพเอชดวย กรด HCl จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 8.0 แลวท าการปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน

113

23. สารละลาย Electrophoresis Buffer ความเขมขน 10 เทา พเอช 8.3 เตรยมสารเคมดงตอไปน

Tris base 30.29 กรม Glycine 144 กรม SDS 10 กรม

ละลายสารเคมท งหมดดวยน าปราศจากไอออนและปรบปรมาตรเปน 1 ,000 มลลลตร ตรวจสอบวดคาพเอชของสารละลาย โดยคาพเอชของสารละลายควรมคาเทากบ 8.3 (หรออยในชวง 8.1-8.5) หามปรบคาพเอชของสารละลายดวยกรดหรอดางโดยเดดขาด 24. สารละลาย Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) ความเขมขน 10 เปอรเซนต โดยน าหนกตอปรมาตร

ละลาย SDS 10 กรม ในน าปราศจากไอออน ปรมาตร 80 มลลลตร อนดวยความรอนเลกนอย เพอชวยใหละลายดขน แลวท าการปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน เกบทอณหภมหอง

25. สารละลาย Ammonium Persulphate ความเขมขน 10 เปอรเซนต โดยน าหนกตอปรมาตร

ละลาย ammonium persulphate 0.1 กรม ในน าปราศจากไอออน ปรมาตร 1 มลลลตร เกบไวในทเยน (ควรเตรยมสารละลายใหมทกครงกอนใช) 26. สารละลายส าหรบยอมสโปรตน (Staining Solution)

เตรยมสารเคมดงตอไปน Coomassie brilliant blue R-250 0.25 กรม Methanol 100 มลลลตร Acetic acid 25 มลลลตร

น าสารเคมทงหมดผสมใหเขากน แลวท าการปรบปรมาตรเปน 250 มลลลตร ดวยน ากลน

114

27. สารละลายส าหรบลางสยอม 26.1 Destain solution I

เตรยมสารเคมดงตอไปน Methanol 125 มลลลตร Acetic acid 25 มลลลตร

ผสมใหเขากน แลวท าการปรบปรมาตรเปน 250 มลลลตร ดวยน ากลน 26.2 Destain solution II

เตรยมสารเคมดงตอไปน Methanol 12.5 มลลลตร Acetic acid 17.5 มลลลตร

ผสมใหเขากน แลวท าการปรบปรมาตรเปน 250 มลลลตร ดวยน ากลน 28. สารละลายสสงเคราะหส าหรบผสมกบโปรตน ความเขมขน 4 เทา (4X gel loading dye)

เตรยมสารเคมดงตอไปน น าปราศจากไอออน 4.6 มลลลตร 10% (w/v) SDS 4.8 มลลลตร Glycerol 2.4 มลลลตร β- mercaptoethanol 1.2 มลลลตร 0.05% (w/v) Bromophenol blue 0.006 กรม 0.5 M Tris-HCl พเอช 6.8 3.0 มลลลตร

น าสารเคมทงหมดผสมใหเขากน ปรบพเอชดวยกรด HCl จนกระทงสารละลายมคาพเอชเทากบ 7.5 แลวปรบปรมาตรเปน 16 มลลลตร

ภาคผนวก ค

116

การค านวณคาพารามเตอรตางๆ

1. กราฟมาตรฐานของ PNP จากวธสเปกโทรโฟโตเมทร 1.1 เตรยม PNP ทมความเขมขนตางๆ ไดแก 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 และ 100

ไมโครโมลาร โดยละลายดวยสารละลาย assay buffer (บฟเฟอร Tris-HCl พเอช 8.0 ความเขมขน 50 มลลโมลาร, โซเดยมคลอไรด ความเขมขนเขมขน 0.1 โมลาร, Tween 80 ความเขมขน 0.1 เปอรเซนต โดยปรมาตร) ปรมาตร 1 มลลลตร

1.2 วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 410 นาโนเมตร บนทกผลการทดลองทได และค านวณเปนกราฟมาตรฐาน PNP ดงตารางท 15 และภาพท 39 ตามล าดบ

ตารางท 15 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ PNP กบคาการดดกลนแสงทความยาวคลนท

410 นาโนเมตร

ความเขมขนของ PNP (µM) OD410

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย 0.0 0 0 0 0.000 1.0 0.016 0.018 0.014 0.016 2.0 0.033 0.023 0.019 0.025 5.0 0.076 0.071 0.067 0.071 10 0.148 0.149 0.159 0.152 20 0.294 0.295 0.299 0.296 30 0.465 0.484 0.473 0.474 40 0.617 0.598 0.612 0.609 50 0.739 0.751 0.73 0.740 60 0.893 0.872 0.902 0.889 70 0.982 0.991 1.021 0.998 80 1.146 1.14 1.153 1.146 90 1.274 1.303 1.271 1.283 100 1.412 1.421 1.418 1.417

117

ภาพท 39 กราฟมาตรฐานของ PNP

1.3 การค านวณหาคากจกรรมของเอนไซม MPH โดยใชสตรดงตอไปน

คากจกรรมของเอนไซม = [

( )

]

2. กราฟมาตรฐานสารละลายโปรตน (Bovine Serum Albumin)

2.1 เตรยมสารละลาย Bovine serum albumin (BSA) ทความเขมขน 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 และ 0.5 มลลกรมตอมลลลตรในน ากลน

2.2 ปเปตสารละลาย BSA ในแตละความเขมขนใส 96 wells plate หลมละ 10 ไมโครลตร และเตม Bradford dye reagent ปรมาตร 200 ไมโครลตร ทงทอณหภมหอง 5 นาท

2.3 วดคาการดดกลนแสงดวยเครอง microplate reader ทความยาวคลน 595 นาโนเมตร บนทกผลการทดลองทได และค านวณเปนกราฟมาตรฐานความเขมขนของโปรตนกบคาการดดกลนแสง ดงตารางท 16 และภาพท 40 ตามล าดบ

y = 0.0144x R² = 0.9985

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

คากา

รดดก

ลนแส

งท 41

0 นาโน

เมตร

ความเขมขนของพาราไนโตรฟนอล (µM)

118

ตารางท 16 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ BSA กบคาการดดกลนแสงทความยาวคลนท 595 นาโนเมตร

ความเขมขน BSA (mg/ml) OD595

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย 0.0 0.000 0.000 0.000 0.000 0.1 0.165 0.188 0.150 0.168 0.2 0.333 0.277 0.322 0.311 0.3 0.447 0.453 0.467 0.456 0.4 0.560 0.569 0.561 0.563 0.5 0.755 0.745 0.719 0.740

ภาพท 40 กราฟมาตรฐานของ BSA โดยการวเคราะหดวยวธ Bradford method

y = 1.4741x R² = 0.9958

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

คาการด

ดกลน

แสง 5

95 nm

ความเขมขนของ BSA (mg/ml)

119

2.4 การหาปรมาณโปรตน จากกราฟมาตรฐานของโปรตน จะไดสมการ y = 1.4741x โดย y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 595 นาโนเมตร

x คอ ความเขมขนของโปรตน (มลลกรม/มลลลตร)

สามารถค านวณหาปรมาณโปรตนไดดงน

protein (mg/ml) =

x dilution factor

3. กราฟโปรตนมาตรฐานของ SDS-PAGE

3.1 จากผลการทดลองหาน าหนกโมเลกลโดยวธ SDS-PAGE สามารถวดหาระยะการเคลอนทของแถบโปรตนมาตรฐานแตละชนด และระยะการเคลอนทของ loading dye เพอหาคาการเคลอนทสมพทธ (Rf) ดงน

Rf = ระยะการเคลอนทของแถบโปรตน

ระยะการเคลอนทของ

3.2 เขยนกราฟความสมพนธระหวางคา log น าหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบคา Rf โดย

ใชตารางท 17 เพอค านวณหาน าหนกโมเลกลของแถบโปรตน ตารางท 17 ความสมพนธระหวางคา log น าหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบคา Rf

Protein marker MW (kDa)

log MW ระยะการเคลอนท ของแถบโปรตน

(cm)

ระยะการเคลอนท ของ loading dye

(cm) Rf

Maltose-binding protein 42.7 1.630 2.55 5.75 0.443

Thioredoxin reductase 34.6 1.539 3.15 5.75 0.548

Triosephosphate isomerase 27.0 1.431 3.9 5.75 0.678

Trypsin inhibitor 20.0 1.301 4.8 5.75 0.835

Lysozyme 14.3 1.155 5.65 5.75 0.983

120

ภาพท 41 กราฟแสดงความสมพนธระหวางน าหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐาน กบการเคลอนทสมพทธ (Rf) ใน 12 เปอรเซนต SDS-PAGE จากกราฟกราฟแสดงความสมพนธระหวางน าหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐาน กบการเคลอนทสมพทธ (Rf) ทแสดงในภาพท 40 จะไดสมการ y = - 0.8712x + 2.019

โดย y คอ คา log Molecular Weight x คอ คา Rf

วดระยะการเคลอนทของแถบโปรตนตวอยางทผานการแยกบรสทธได 3.05 เซนตเมตร และระยะการเคลอนทของ loading dye ได 5.75 เซนตเมตร

Rf =

= 0.5304

คา Rf ของแถบโปรตนตวอยางทผานการแยกบรสทธเทากบ 0.5304

y = -0.8712x + 2.019 R² = 0.9988

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

log M

W

Rf

121

ค านวณหาคา MW จากสมการจจะได

log MW = - 0.8712(0.5304) + 2.019 MW = 10(1.557) = 36.05 ดงนน โปรตนตวอยางทผานการแยกบรสทธมน าหนกโมเลกลประมาณ 36.05 กโลดาลตน

4. การค านวณปรมาณเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทใชในการตกตะกอนโปรตน คาความเขมขนของเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทใชในการตกตะกอนโปรตนนยมแสดงเปน คาเปอรเซนตความอมตว (% saturation) โดยจ านวนกรมของเกลอแอมโมเนยมซลเฟต (g) ทเตมลงในสารละลาย 1,000 มลลลตร ทอณหภม 20 องศาเซลเซยส เพอใหไดความเขมขนทตองค านวณไดจากสมการ ดงน

จ านวนกรมของเกลอแอมโมเนยมซลเฟต (g) = ( )

เมอ S1 คอ ความเขมขนของเกลอแอมโมเนยมซลเฟต (% saturation) เรมตน

S2 คอ ความเขมขนของเกลอแอมโมเนยมซลเฟต (% saturation) สดทาย การค านวณจ านวนกรมของเกลอแอมโมเนยมซลเฟต ตองการตกตะกอนโปรตนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟตทความเขมขน 80 เปอรเซนต โดยมปรมาตรสารละลาย 1,000 มลลลตร ค านวณโดยแทนคาในสมการดงน

S1 ในกรณนยงไมมการเตมเกลอแอมโมเนยมซลเฟตลงในสารตวอยางมากอน ดงนนความเขมขนของเกลอแอมโมเนยมซลเฟตเรมตนในสารละลายตวอยางจงมคาเทากบ 0 เปอรเซนต

S2 ในกรณนความเขมขนของเกลอแอมโมเนยมซลเฟตสดทายทตองการคอ 80 เปอรเซนต แทนคาในสมการ

จ านวนกรมของเกลอแอมโมเนยมซลเฟต (g) = ( )

( ) = 561.05 กรม

ดงนนตองชงเกลอแอมโมเนยมซลเฟตจ านวน 561.05 กรม เตมลงในสารตวอยาง ปรมาตร 1,000 มลลลตร

ภาคผนวก ง

123

ค าอธบายสญลกษณและค ายอ

AchE acetyl cholinesterase ampr ampicillin resistance gene APS ammonium persulfate bp base pair BSA bovine serum albumin EDTA ethylene diamine tetraacetic acid FPLC fast protein in liquid chromatography His-tag polyhistidin-tag IPTG isopropyl- -D-thiogalactopyranoside kb kilobase kDa kilodalton LB Luria-Bertani LD lethal dose MCS multiple cloning site MP methyl parathion mpdB methyl parathion-degrading gene MPH methy parathion hydrolase MWCO molecular weight cut off opa organophosphorus acid anhydrolase gene opd organophosphate- degrading gene OPH organophosphorus hydrolase PCR polymerase chain reaction PES polyethersulphone PNP para-nitrophenol SDS sodium dodecyl sulfate TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine U Unit X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranoside

124

ประวตผวจย

ชอ-สกล นายเมธส สวนจนทร Mr. Mathus Suanchan

วน เดอน ปเกด 5 สงหาคม 2530 ทอย 15 หมท 4 ต าบลจอมปลวก อ าเภอบางคนท จงหวดสมทรสงคราม 75120 ประวตการศกษา

พ.ศ. 2548 ส าเรจการศกษาในระดบมธยมศกษาจากโรงเรยนถาวรานกล อ าเภอเมองฯ จงหวดสมทรสงคราม

พ.ศ. 2552 ส าเรจการศกษาปรญญาวทยาศาสตรบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร

พ.ศ. 2553 ศกษาตอในระดบปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร

งานวจยทส าเรจแลว

ระดบปรญญาตร การโคลนยน mpdB ทเกยวของกบการยอยยาฆาแมลงเมทธลพาราไธออน โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน

ระดบปรญญาโท การโคลนและการแสดงออกของยน mpdB ทเกยวของกบการยอยยาฆา-แมลงเมทธลพาราไธออน โดยใชพาหะทออกแบบเพอการหลงโปรตน

การเสนอผลงานวจย Poster presentation and Proceeding

พ.ศ. 2553 Wisoot Kaewmaha, Methus Suanchan and Jesdawan Wichitwechkarn. Cloning and expression of mpdB gene responsible for methyl parathion degradation using a vector designed for periplasmic secretion. The 22th Annual Meeting of the Thai Society for Biotechnology (TSB2010), 20-22 October 2010, Prince of Songkla University, Trang Campus, Thailand.

125

พ.ศ. 2555 Methus Suanchan and Jesdawan Wichitwechkarn. Periplasmic secretion of recombinant mpdB gene responsible for methyl parathion degradation. The 24th Annual Meeting of the Thai Society for Biotechnology (TSB2012), 29-30 November 2012, Ubonratchathani, Thailand.

Oral presentation and Proceeding พ.ศ. 2556 เมธส สวนจนทร และเจษฎาวรรณ วจตรเวชการ. การหลงเอนไซมออก

นอกเซลล และการท าบรสทธของเอนไซมเมทธลพาราไธออนไฮโดรเลสใน Escherichia coli. การประชมวชาการระดบชาตทางดานวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลย, 2-3 ธนวาคม 2556, คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม, มหาวทยาลยศลปากร, วทยาเขตพระราชวงสนามจนทร, ประเทศไทย.