3

3. Osnove molekularne biologije

Nasljeivanje, geni i DNA

Ekspresija genetike informacijeRekombinantna DNA

Detekcija nukleinskih kiselina i proteina

Funkcija eukariotskih gena KLJUNI POKUS: Pretpostavka DNA provirusa

MOLEKULARNA MEDICINA: HIV i AIDS

SUVREMENA MOLEKULARNA BIOLOGIJA tei razumjeti mehanizme odgovorne za nasljeivanje i ekspresiju genetike informacije koja odreuje strukturu i funkciju stanice. Kao to je prikazano u prvom poglavlju, sve stanice dijele odreena osnovna svojstva, a to temeljno jedinstvo stanine biologije posebice je vidljivo na molekularnoj razini. Postojanje temeljnoga staninog jedinstva omoguilo je znanstvenicima da izaberu jednostavnije organizme, primjerice bakterije, kao model za provoenje mnogih fundamentalnih eksperimenata u oekivanju da e molekularni mehanizmi i u organizmima razliitim poput ovjeka i E. coli biti slini. Brojni eksperimenti potvrdili su tonost te pretpostavke i danas je jasno da je molekularna biologija stanice jedinstveni put razumijevanja raznolikih vidova staninoga ponaanja.

Poetni napredak u molekularnoj biologiji postignut je koritenjem prednosti brzog rasta i jednostavne genetike bakterija poput E. coli i njezinih virusa. Razvoj rekombinantne DNA tehnologije koji je uslijedio omoguio je da se osnovni principi i eksperimentalni pristupi razvijeni u prokariotima proire i na eukariotske stanice. Posljedice razvoja rekombinantne DNA tehnologije su goleme. U ranim je fazama rekombinantna DNA tehnologija omoguila izolaciju i karakterizaciju pojedinih gena, a od nedavno i odreivanje cjelokupnih redoslijeda nukleotida u genomima sloenih organizma poput biljaka i ivotinja, ukljuivi i ovjeka.

3.1. Nasljeivanje, geni i DNA

Mogunost reprodukcije temeljno je svojstvo svih ivih bia. Svi organizmi genetiku informaciju, koja odreuje njihovu strukturu i funkciju, nasljeuju od svojih roditelja. Isto tako, sve stanice nastaju iz prethodno postojeih stanica, i nuno je da se genetiki materijal umnoi i podijeli pri svakoj podjeli stanice. Nain na koji se genetika informacija udvostruuje i prenosi sa stanice na stanicu, ili s organizma na organizam, sredinje je pitanje biologije. Prepoznavanje molekule DNA kao nositelja genetike informacije i otkrivanje mehanizama njezina prijenosa stvorilo je temelj naem dananjem razumijevanju biologije na molekularnoj razini.

Geni i kromosomi

Temeljne principe genetike postavio je Gregor Mendel 1865. godine na osnovi pokusa krianja graka. Ispitivanjem nasljeivanja nekoliko dobro definiranih svojstava kao to je primjerice boja sjemenke, Mendel je uspio razumjeti osnovne principe njihova prijenosa. Pretpostavio je da je svako svojstvo odreeno parom nasljednih elemenata koje danas zovemo genima, i na taj je nain uspio objasniti sve rezultate dobivene krianjem. Po jedna kopija gena za svako svojstvo (nazivamo je alel) nasljeuje se od svakog roditelja. Primjerice, krianje dviju sorti graka, jedne sa utim, a druge sa zelenim sjemenkama, daje potomstvo prikazano na slici 3.1. Svaka roditeljska sorta ima po dvije identine kopije gena koji odreuje utu (Y engl. yellow) ili zelenu (y) boju sjemenke. Biljke nastale krianjem su hibridi koji su naslijedili po jednu kopiju gena koji odreuje utu (Y) i jednu kopiju gena koji odreuje zelenu (y) boju sjemenke. Sve biljke potomci prikazanoga krianja (prva filijalna ili F1 generacija) imaju ute sjemenke, stoga kaemo da je gen koji odreuje utu boju sjemenki (Y) dominantan, a gen koji odreuje zelenu boju sjemenki (y) recesivan. Genotip (genetiki ustroj) biljaka F1 generacije je stoga Yy, a njihov fenotip (fiziki izgled) je uta boja sjemenki. Kriamo li meusobno dva potomka F1 generacije dobivamo F2 generaciju u kojoj se aleli za utu i zelenu boju sjemenke razdvajaju (segregiraju) tako da je omjer biljaka F2 generacije sa utim i zelenim sjemenkama 3 : 1.

Mendelovo otkrie, koje je oito bilo ispred svog vremena, uglavnom je zapostavljano do 1900. godine kada su Mendelovi zakoni nasljeivanja ponovo otkriveni te je konano spoznana njihova vanost. Ubrzo nakon toga predloeno je da su kromosomi nositelji gena. Uoeno je da je veina stanica viih biljaka i ivotinja diploidna, tj. da sadrava po dvije kopije svakog kromosoma. Iznimka su spolne stanice (spermiji i jajne stanice) koje nastaju posebnim tipom diobe koji nazivamo mejoza, a u kojoj se samo po jedan lan kromosomskog para prenosi na svaku novonastalu stanicu (slika 3.2). Posljedino, spermiji i jajne stanice su haploidne i sadravaju samo po jednu kopiju svakog kromosoma. Sjedinjenje dviju takvih haploidnih stanica pri oplodnji stvara novi diploidni organizam u kojem jedan kromosom svakoga para potjee od mukoga, a drugi od enskoga roditelja. Ponaanje parova kromosoma tijekom mejoze stoga oslikava ponaanje alela tijekom segregacije, to je rezultiralo pretpostavkom da su kromosomi nositelji gena.

Osnove mutacija, povezanosti gena, i odnosa izmeu gena i kromosoma velikim su dijelom razjanjene i pokusima provedenim na vonoj muici, Drosophila melanogaster. Vonu je muicu mogue jednostavno uzgajati u laboratorijskim uvjetima na odgovarajuim podlogama, a razmnoava se priblino svaka dva tjedna to je znaajna prednost za genetika ispitivanja. Zbog tih je svojstava Drosophila i dalje vrlo popularan organizam za genetika ispitivanja na ivotinjama, posebice u podruju genetike razvoja i diferencijacije.

Poetkom 20. stoljea otkriven je velik broj genetikih promjena (mutacija) kod vone muice koje su uglavnom pogaale lako uoljiva svojstva poput boje oiju i oblika krila. Pokusi krianja pokazali su da se neki od gena koji odreuju ta svojstva nasljeuju neovisno jedan o drugom to je upuivalo na to da se nalaze na razliitim kromosomima koji se neovisno razdvajaju tijekom mejoze (slika 3.3). U isto vrijeme, neki su se drugi geni esto nasljeivali zajedno. U tom sluaju govorimo o vezanim genima, a povezuje ih smjetaj na istom kromosomu. Broj skupina vezanih gena jednak je broju kromosoma nekog organizma (etiri kod vrste Drosophila) to je dodatno podralo pretpostavku da su kromosomi nositelji gena. Do 1915. godine gotovo je stotinu gena identificirano i kartirano na etiri kromosoma vone muice to je dovelo do opeg prihvaanja kromosoma kao nositelja nasljeivanja.Geni i enzimi

Rana genetika istraivanja bila su usmjerena na identifikaciju i kartiranje gena koji odreuju lako uoljiva svojstva poput boje oiju vone muice, no nain na koji ti geni odreuju fenotip nije bio poznat. Prve spoznaje o vezi izmeu gena i enzima pojavile su se 1909. godine, kad je uoeno da je nasljedna bolest fenilketonurija (vidi: Molekularna medicina u Poglavlju 2) posljedica genetikoga poremeaja u metabolizmu aminokiseline fenilalanin. Pretpostavljeno je da je taj poremeaj posljedica nedostatka enzima koji katalizira odgovarajue metabolike reakcije, to je potaklo formuliranje generalne hipoteze da geni odreuju sintezu enzima.

Jasniji dokaz povezanosti gena sa sintezom enzima proiziao je iz eksperimenta koji su 1941. godine na gljivici Neurospora crassa proveli George Beadle i Edvard Tatum. U laboratoriju Neurospora moe biti uzgajana na minimalnom ili bogatom mediju slinim onima opisanim u Poglavlju 1 za uzgoj E. coli. Za gljivicu Neurospora crassa minimalni se medij sastoji samo od soli, glukoze i biotina. Bogati medij obogaen je aminokiselinama, vitaminima, purinima i pirimidinima. Beadle i Tatum izolirali su mutante ove gljivice koje normalno rastu na bogatom mediju, no ne mogu rasti na minimalnom mediju. Otkrili su da je svakoj mutanti za rast potreban specifian prehrambeni nadomjestak, primjerice odreena aminokiselina. tovie, potreba za odreenim prehrambenim nadomjestkom bila je u korelaciji s nemogunou sinteze te iste molekule. Na osnovi ovih promatranja Beadle i Tatum su zakljuili da svaka mutacija rezultira nedostatkom odreenoga metabolikoga puta. Kako je bilo poznato da metabolikim putovima upravljaju enzimi, iz eksperimenata na gljivici Neurospora crassa proiziao je zakljuak da svaki gen odreuje strukturu jednog enzima, tj. hipoteza jedan gen jedan enzim. Danas znamo da se mnogi enzimi sastoje od vie polipeptida, pa je trenutno prihvaen oblik ove hipoteze da svaki gen odreuje strukturu jednoga polipeptidnog lanca.

Molekula DNA nositelj je genetike informacije

Razumijevanje kromosomske osnove nasljeivanja i odnosa izmeu gena i enzima nije samo po sebi pruilo molekularno objanjenje gena. Kromosomi sadravaju i proteine i DNA, i prvotno se mislilo da su geni proteini. Prvi dokazi koji su vodili prema suprotnoj ideji da je molekula DNA nositelj genetike informacije doli su iz eksperimenata provedenih na bakterijama. Ti eksperimenti predstavljaju prototip suvremenog pristupa odreivanja uloge gena unoenjem novih molekula DNA u stanicu, to e biti objanjeno kasnije u ovom poglavlju.

Uloga molekule DNA otkrivena je iz rezultata eksperimenata provedenih na bakteriji koja uzrokuje upalu plua (Pneumococcus). Virulentni sojevi ove bakterije okrueni su kapsulom izgraenom od polisaharida koja titi bakterije od napada imunosustava domaina. Budui da kapsula bakterijskim kolonijama daje glatki izgled u kulturi, soj bakterija koji proizvodi kapsulu oznaujemo S (engl. smooth). Mutirani sojevi koji su izgubili sposobnost stvaranja kapsule (oznaeni s R, engl. rough) tvore kolonije s hrapavim rubom te nisu letalni ako njima zarazimo mia. Godine 1928. uoeno je da mi inficiran smjesom hrapavih (R) bakterija i toplinom ubijenih glatkih (S) bakterija razvija upalu plua i ubrzo umire. Bakterije koje su zatim izolirane iz takvog mia bile su S tipa. Kasniji su eksperimenti pokazali da su ekstrakti S bakterijskih kultura u kojima nije bilo itavih bakterijskih stanica takoer u stanju prevesti (transformirati) R bakterije u S oblik. Zakljueno je da je neka tvar u ekstraktu S bakterija (nazvana transformirajui princip) odgovorna za genetiku transformaciju R oblika u S oblik bakterije.

Godine 1944. Oswald Avery, Colim MacLeod i Maclyn McCarty izolirali su DNA iz bakterijskih ekstrakata i pokazali da enzimi koji razgrauju DNA unitavaju sposobnost transformacije, dok enzimi koji razgrauju proteine nemaju takav uinak (slika 3.4). Na taj su nain dokazali da je transformirajui princip zapravo molekula DNA. Ipak, tek e eksperimenti provedeni tijekom sljedeih nekoliko godina na bakterijskim virusima rezultirati prihvaanjem DNA kao genskog materijala. Naime, kad bakterijski virus inficira stanicu, DNA virusa, a ne njegovi proteini, mora ui u stanicu kako bi omoguila umnaanje virusa. tovie, DNA roditeljskog virusa (a ne njegovi proteini) prenosi se na novonastale estice virusa. Usklaenost tih rezultata s nastavkom ispitivanja aktivnosti DNA u transformaciji bakterija dovela je do konanog prihvaanja ideje da je DNA genski materijal.

Struktura DNA

Poznavanje trodimenzionalne strukture DNA koju su 1953. godine otkrili James Watson i Francis Crick temelj je suvremene molekularne biologije. U vrijeme kad su Watson i Crick radili na strukturi DNA bilo je poznato da je DNA polimer koji se sastoji od etiri tipa duikovih baza, dva purina (adenin [A] i gvanin [G]) i dva pirimidina (citozin [C] i timin [T]), vezanih za fosforilirane eere. S obzirom na sredinju ulogu DNA kao genskog materijala, objanjenje njezine trodimenzionalne strukture bilo je kritino za razumijevanje njezine funkcije. Watson i Crickov pogled na taj problem bio je pod znaajnim utjecajem Linus Paulingova objanjenja vodikove veze i -uzvojnice, estog oblika sekundarne strukture proteina (vidi Poglavlje 2). Eksperimentalni podatci o strukturi DNA proizili su iz kristalografskih ispitivanja Mauricea Wilkinsa i Rosalind Franklin. Analiza tih podataka otkrila je da je molekula DNA uzvojnica koja ini zavoje od 3,4 nm. Podatci su pokazali i da je razmak izmeu susjednih baza 0,34 nm, stoga se jedan zavoj uzvojnice sastoji od 10 parova baza. Vano je otkrie bilo da je promjer uzvojnice priblino 2 nm, to je upuivalo na to da se molekula DNA sastoji od dvaju, a ne od jednoga lanca DNA.

Na osnovi ovih podataka Watson i Crick su izgradili svoj model molekule DNA (slika 3.5). Osnovna svojstva modela su da je DNA dvostruka uzvojnica sa eerno-fosfatnom okosnicom na vanjskoj strani molekule. Baze su smjetene u unutranjosti molekule i orijentirane tako da se vodikove veze stvaraju izmeu nasuprotnih purina i pirimidina. Sparivanje baza vrlo je specifino: A se uvijek sparuje s T, a G s C. Ova specifinost objanjava raniji rezultat Erwina Chargaffa koji je analizirao sastav baza u razliitim molekulama DNA i utvrdio da je koliina adenina uvijek jednaka koliini timina, a koliina gvanina jednaka koliini citozina. Zbog specifinog su sparivanja baza dva lanca molekule DNA komplementarna i svaki lanac sadrava cjelokupnu informaciju potrebnu za odreivanje slijeda baza u drugom lancu.

Replikacija DNA

Otkrie komplementarnog sparivanja baza izmeu dva lanca u molekuli DNA dalo je odgovor na pitanje kako genetiki materijal moe upravljati svojom vlastitom replikacijom, procesom koji se mora dogoditi pri svakoj diobi stanica. Predloeno je da se dvije niti DNA mogu razdvojiti i sluiti kao kalup za sintezu novoga komplementarnog lanca iji bi slijed bio odreen specifinim sparivanjem baza (slika 3.6). Ovaj proces nazivamo semikonzervativnom replikacijom jer je u svakoj novonastaloj molekuli DNA sauvan po jedan stari lanac roditeljske DNA.

Izravnu podrku modelu semikonzervativne replikacije DNA pruio je elegantni eksperiment koji su 1958. godine proveli Matthew Meselson i Frank Stahl obiljeivi DNA izotopima koji su promijenili njezinu gustou (slika 3.7). E. coli je prvo uzgajana u mediju koji je sadravao teki izotop duika (15N) umjesto normalnoga duika (14N). DNA tih bakterija umjesto normalnoga duika 14N sadravala je teki izotop 15N, te je stoga bila gua od DNA bakterija uzgajanih u normalnom mediju. Takvu teku DNA (15N) bilo je mogue razdvojiti od normalne DNA (14N) ravnotenim centrifugiranjem u gradijentu CsCl, to je omoguilo prouavanje procesa sinteze DNA. E. coli koja je rasla u 15N mediju prenesena je u normalni medij te joj je omogueno da se podijeli jo jednom. DNA bakterija dobivenih diobom je izolirana i analizirana centrifugiranjem u gradijentu gustoe CsCl. Rezultat ove analize pokazao je da je sva teka DNA zamijenjena novosintetiziranim molekulama DNA ija je gustoa izmeu gustoe tekih (15N) i lakih (14N) molekula DNA. Takav rezultat objanjen je modelom u kojem tijekom replikacije dolazi do razdvajanja dvaju tekih roditeljskih lanaca DNA od kojih svaki slui kao kalup za sintezu po jednoga novog lakoga lanca DNA. Rezultat su molekule DNA od kojih svaka sadrava po jedan laki i jedan teki lanac te je njihova gustoa izmeu gustoe teke i lake molekule DNA. Ovaj eksperiment pruio je izravni dokaz za semikonzervativnu replikaciju DNA i jasno naglasio vanost komplementarnog sparivanja baza izmeu dvaju lanaca DNA u dvostrukoj uzvojnici.

Sposobnost DNA da slui kao kalup za vlastitu sintezu dodatno je potvrena kad je utvreno da enzim izoliran iz E. coli (DNA-polimeraza) moe katalizirati replikaciju DNA in vitro. U prisutnosti lanca DNA koji slui kao kalup, DNA-polimeraza mogla je katalizirati ugradnju nukleotida u komplementarni lanac DNA.

3.2. Ekspresija genetike informacije

Geni djeluju tako da odreuju strukturu proteina koji su odgovorni za funkcioniranje stanice na molekularnoj razini. Identifikacija DNA kao genetikog materijala i razjanjenje njezine strukture otkrilo je da genetika informacija mora biti odreena redoslijedom etiriju baza (A, C, G i T) koje izgrauju molekulu DNA. S druge strane, proteini su polimeri izgraeni od 20 razliitih aminokiselina iji slijed odreuje njihovu strukturu i funkciju. Prva izravna veza izmeu mutacije gena i promjene u slijedu aminokiselina pokazana je 1957. godine, kad je utvreno da je razlika izmeu hemoglobina pacijenata oboljelih od nasljedne bolesti srpaste anemije i normalnoga hemoglobina u svega jednoj aminokiselini, no dublje razumijevanje molekularnog odnosa izmeu DNA i proteina proizilo je iz serije eksperimenata koji su iskoristili prednosti E. coli i njezinih virusa kao genetikih modela.

Kolinearnost gena i proteina

Najjednostavnija pretpostavka koja bi objasnila odnos gena i proteina bila je da redoslijed nukleotida u DNA odreuje redoslijed aminokiselina u proteinima. Mutacije u genu odgovarale bi promjenama u slijedu nukleotida u molekuli DNA koje bi mogle nastati zbog zamjene jednog nukleotida nekim drugim, zbog dodavanja (adicije) ili uklanjanja (delecije) nukleotida. Promjene u slijedu nukleotida u molekuli DNA tada bi rezultirale odgovarajuim promjenama u slijedu aminokiselina u proteinu kojega kodira mutirani gen. Ova je pretpostavka predvidjela da bi razliite mutacije u istom genu mogle promijeniti razliite aminokiseline u proteinu kojega taj gen kodira, a da bi poloaj mutacije unutar gena trebao odgovarati poloaju promijenjene aminokiseline u proteinu.

Brzo umnaanje i jednostavnost genetikoga sustava E. coli bili su od velike pomoi pri traenju odgovora na ova pitanja. Bilo je mogue izolirati razliite mutante bakterije E. coli, ukljuujui i nutritivne mutante koje (poput mutanti gljivice Neurospora crassa prikazanih ranije) rastu samo uz dodatak odreene aminokiseline. Brz rast bakterije E. coli omoguio je izolaciju i kartiranje vie mutacija unutar jednoga gena, to je rezultiralo prvim dokazom linearnog odnosa izmeu gena i proteina. Charles Yanofsky i njegovi kolege kartirali su seriju mutacija u genu koji kodira enzim potreban za sintezu aminokiseline triptofana. Analiza enzima koje kodiraju ti mutirani geni pokazala je da relativni poloaj promjena u aminokiselinama odgovara poloaju mutacija u genu (slika 3.8). Dakle, slijed aminokiselina u proteinu kolinearan je sa slijedom nukleotida u genu, to je u skladu s pretpostavkom da redoslijed nukleotida u molekuli DNA odreuje redoslijed aminokiselina u proteinu.

Uloga glasnike RNA

Iako se inilo da slijed nukleotida u DNA odreuje slijed aminokiselina u proteinu, iz toga nije nuno proizlazilo da sama molekula DNA upravlja sintezom proteina. tovie, u prilog tome nije govorila ni injenica da je DNA smjetena u jezgri eukariotske stanice, dok se sinteza proteina odvija u citoplazmi. inilo se puno vjerojatnije da neka druga molekula prenosi genetiku informaciju s molekule DNA na mjesto sinteze proteina (ribosomi).

RNA je djelovala kao vjerojatni kandidat za takvog posrednika jer je slinost njezine strukture sa strukturom DNA upuivala na to da bi RNA mogla biti sintetizirana na osnovi DNA kalupa (slika 3.9). Molekula se RNA razlikuje od molekule DNA po tome to je jednolanana, a ne dvolanana, to je njezina eerna komponenta riboza, a ne deoksiriboza, i to sadrava pirimidinsku bazu uracil (U) umjesto timina (T) (vidi sliku 2.10). No ni promjena eera, niti zamjena uracila timinom ne utjee na sparivanje baza, stoga je sintezom RNA mogue upravljati koristei DNA kao kalup. tovie, kako je RNA smjetena poglavito u citoplazmi, inilo se da je ona logini posrednik u prijenosu informacije s DNA na ribosome. Ova svojstva RNA sugerirala su tijek genetike informacije koji prepoznajemo kao sredinju dogmu molekularne biologije:

DNA ( RNA ( protein

U skladu s ovim konceptom, molekula RNA sintetizira se na osnovi DNA kalupa (proces koji nazivamo prepisivanje ili transkripcija), a proteini se sintetiziraju na osnovi RNA kalupa (proces koji nazivamo prevoenje ili translacija).

Eksperimentalni dokaz postojanja RNA posrednika koji je predvidjela sredinja dogma pruili su Sidney Brenner, Francois Jacob i Matthew Meselson prouavanjem E. coli inficirane bakteriofagom T4. Sinteza RNA E. coli prestaje nakon infekcije bakteriofagom T4 i jedina nova RNA koja nastaje u inficiranim bakterijama prepisana je s DNA T4 virusa. RNA bakteriofaga T4 dolazi u kontakt s bakterijskim ribosomima, te stoga prenosi informaciju s DNA na mjesto sinteze proteina. Zbog svoje uloge u prijenosu genetike informacije molekula RNA koja slui kao kalup za sintezu proteina nazvana je glasnika RNA (mRNA, od engl. messenger). Sintezu RNA na osnovi DNA kalupa katalizira enzim nazvan RNA-polimeraza.

Osim mRNA, za sintezu proteina vana su i dva druga tipa RNA ribosomska RNA (rRNA) koja je sastavni dio ribosoma i transportna RNA (tRNA) koja djeluje kao adaptor koji donosi aminokiseline na RNA kalup. Osnove strukture i funkcije tih molekula opisane su u nastavku ovoga poglavlja, a detaljnije su prikazane u poglavljima 6 i 7.

Genetiki kod

Na koji se nain slijed nukleotida u RNA prevodi u slijed aminokiselina u proteinu? U ovom koraku ekspresije gena genetika se informacija prenosi s nukleinskih kiselina na proteine, molekule koje su kemijski jako razliite, to otvara dva nova problema za razumijevanje djelovanja gena.

Budui da aminokiseline nisu strukturno srodne duikovim bazama, izravno komplementarno sparivanje mRNA i aminokiselina tijekom ugradnje aminokiselina u proteine nije se inilo vjerojatnim. Kako je onda mogue da se aminokiseline slau na mRNA kalup tijekom sinteze proteina? Ovaj problem rijeen je otkriem tRNA koje slue kao adaptori izmeu aminokiselina i mRNA tijekom prevoenja genetike informacije (slika 3.10). Prije njezine uporabe u sintezi proteina, svaka aminokiselina se pomou specifinog enzima povezuje s odgovarajuom tRNA. U sljedeem koraku sparivanje baza izmeu prepoznavajueg slijeda na molekuli tRNA i komplementarnog slijeda na mRNA usmjerava aminokiselinu vezanu na tRNA na njezin toan poloaj na mRNA kalupu.

Drugi problem u prevoenju slijeda nukleotida u slijed aminokiselina bio je odreivanje genetikoga koda. Na koji je nain mogue informaciju sadranu u slijedu etiri razliita nukleotida prevesti u slijed 20 razliitih aminokiselina u proteinima? Budui da je 20 razliitih aminokiselina potrebno odrediti pomou svega etiri nukleotida, bilo je nuno da najmanje tri nukleotida budu ukljuena u kodiranje svake aminokiseline. Koriteni pojedinano, etiri nukleotida mogli bi kodirati svega etiri aminokiseline, a koriteni u parovima, svega esnaest (42) aminokiselina. Koriteni u obliku tripleta etiri nukleotida mogu kodirati 64 (43) razliite amonokiseline, to je vie nego dovoljno za 20 razliitih aminokiselina koje doista izgrauju proteine.

Da je genetiki kod zaista organiziran u triplete potvreno je eksperimentima provedenim na bakteriofagu T4 koji je nosio mutacije u intenzivno studiranom genu nazvanom rII. Fagi s mutacijama u tom genu tvore jako velike plakove koje je vrlo lako razlikovati od plakova koje tvore virusi divljeg tipa. Identifikacija i kartiranje mutacija u genu rII vrlo je jednostavno pa je napravljena detaljna genetika karta ovog lokusa. Ispitivanje rekombinanata izmeu rII mutanata koji su nastali adicijom ili delecijom nukleotida pokazalo je da adicija ili delecija jednoga ili dva nukleotida uvijek rezultira mutantnim fenotipom. Nasuprot tomu, fagi koji su imali deleciju ili adiciju tri nukleotida esto bi zadrali funkciju divljeg tipa (slika 3.11). Ovo otkrie sugeriralo je da se geni itaju od neke fiksne toke u skupinama od po tri nukleotida. Adicija ili delecija jednoga ili dva nukleotida poremetila bi okvir itanja itavoga gena, to bi dovelo do ugradnje pogrjenih aminokiselina itavom duinom kodiranog proteina. Nasuprot tomu, adicija ili delecija tri nukleotida rezultirala bi samo dodatkom ili gubitkom jedne aminokiseline, dok bi ostatak proteina bio nepromijenjen, a esto bi i zadrao prvobitnu funkciju.

Sljedei korak u otkrivanju genetikoga koda bio je pridruiti odgovarajuu aminokiselinu svakom tripletu nukleotida. Za rjeavanje ovog problema primijenjen je sustav koji je mogao sintetizirati proteine in vitro (in vitro translacija). Tada je ve bilo poznato da ekstrakti stanica, koji sadravaju ribosome, aminokiseline, tRNA i enzime odgovorne za vezanje aminokiselina na pripadajue tRNA (aminoacil-sintetaze), mogu katalizirati ugradnju aminokiselina u proteine. Takav nain sinteze proteina ovisi o prisutnosti mRNA vezane na ribosome, a samu je sintezu mogue znaajno pojaati dodatkom proiene mRNA. Budui da u takvom sustavu dodana strana mRNA upravlja sintezom proteina, ispitivanje prevoenja sintetikih mRNA poznatoga slijeda nukleotida omoguilo je dekodiranje genetikoga koda.

Prvi eksperiment tog tipa proveli su Marshall Nirenberg i Heinrich Matthaei koristei sintetiki RNA polimer koji je sadravao samo uracil kao kalup za in vitro sintezu proteina (slika 3.12). Utvrdili su da poli-U kalup odreuje ugradnju samo jedne aminokiseline, fenilalanina, u polipeptid koji se sastoji od ponavljajuih fenilalaninskih ostataka. Slini eksperimenti s RNA polimerima koji su sadravali samo jednu vrstu nukleotida pokazali su da AAA kodira lizin, a CCC kodira prolin. Ostatak genetikoga koda dekodiran je koristei RNA polimere koji su sadravali smjese nukleotida. Na taj nain deifrirana su sva 64 tripleta (kodona) (tabl. 3.1). Od 64 kodona 61 kodon odreuje aminokiseline, a preostala tri (UAA, UAG i UGA) predstavljaju STOP kodone koji signaliziraju kraj sinteze proteina. Genetiki kod je degeneriran to znai da su mnoge aminokiseline odreene s vie no jednim kodonom. Uz nekoliko iznimaka (prikazanih u Poglavlju 10), svi se organizmi slue istim genetikim kodom to je vrst dokaz da su se sve dananje stanice razvile od istoga zajednikog pretka.

RNA virusi i obrnuto prepisivanjeNakon dekodiranja genetikoga koda inilo se da su temeljni principi molekularne biologije postavljeni. U skladu sa sredinjom dogmom, genetiki materijal sastoji se od DNA koja ima svojstvo samoreplikacije i mogunost prijenosa informacije (prepisivanja) na molekulu mRNA, koja onda slui kao kalup za sintezu proteina. Ipak, kao to je ve navedeno u prvom poglavlju, mnogi virusi kao genetiki materijal sadravaju RNA umjesto DNA to zahtijeva neki drugi oblik prijenosa genetike informacije.

RNA genomi su isprva otkriveni kod biljnih virusa od kojih se mnogi sastoje samo od RNA molekula i proteina. Izravni dokaz da RNA obavlja ulogu genetikog materijala tih virusa pruili su eksperimenti provedeni sredinom 20. stoljea koji su pokazali da proiena RNA izolirana iz virusa mozaika duhana moe inficirati nove stanice domaina u kojima onda nastaju nove infektivne virusne estice. Nain replikacije veine virusnih RNA genoma razjanjen je ispitivanjem RNA bakteriofaga bakterije E. coli. Otkriveno je da ti virusi nose informaciju za specifini enzim koji katalizira sintezu RNA molekule na osnovi RNA kalupa (RNA upravljana RNA sinteza) primjenjujui isti princip komplementarnog sparivanja baza koji se rabi pri replikaciji DNA ili prepisivanju DNA u RNA.

Iako je utvreno da se veina ivotinjskih RNA virusa (primjerice polio virus ili virus influence) umnoava RNA upravljanom sintezom RNA, ovaj mehanizam nije mogao objasniti umnoavanje jedne porodice ivotinjskih virusa (RNA tumorskih virusa) koji su bili posebice interesantni zbog svoje sposobnosti da uzrokuju tumore kod inficiranih ivotinja. Iako ovi virusi sadravaju genomsku RNA, eksperimenti koje je poetkom 1960-ih godina proveo Howard Temin pokazali su da za umnoavanje virusnih estica mora doi do sinteze DNA u inficiranim stanicama, to je dovelo do pretpostavke da se RNA tumorski virusi (danas ih nazivamo retrovirusi) umnoavaju putem sinteze DNA posrednika kojeg nazivamo DNA provirus (slika 3.13). Ova je pretpostavka u poetku nailazila na veliki otpor znanstvenika jer je ukljuivala RNA upravljanu sintezu DNA to se protivilo sredinjoj dogmi. Godine 1970. su Temin i David Baltimore neovisno jedan o drugome otkrili da retrovirusi sadravaju dosad nepoznati enzim koji katalizira sintezu DNA na osnovi RNA kalupa, a dobiveni su i jasni dokazi prisutnosti virusne DNA u inficiranim stanicama. S ovim je otkriima sinteza DNA na osnovi RNA kalupa, koju danas nazivamo obrnuto prepisivanje (reverzna transkripcija) prihvaena kao oblik prijenosa genetike informacije u biolokim sustavima.

Obrnuto prepisivanje nije vano samo kao mehanizam umnoavanja retrovirusa, ve i u jo najmanje dva druga iroka podruja molekularne i stanine biologije. Obrnuto prepisivanje nije ogranieno samo na retroviruse. Odvija se i u stanicama i kao to je prikazano u poglavljima 4 i 5, esto je odgovorno za premjetanje (transpoziciju) slijeda nukleotida s jednoga na neko drugo mjesto u DNA njihovih kromosoma. tovie, sekvenciranje genoma ovjeka pokazalo je da je priblino 40% genomske DNA ovjeka nastalo obrnutim prepisivanjem. S druge strane, enzimi koji kataliziraju RNA upravljanu sintezu DNA (reverzne-transkriptaze) mogu biti uporabljeni za sintezu DNA kopija bilo koje RNA molekule u eksperimentalnim sustavima. Primjena reverzne-transkriptaze omoguila je ispitivanje eukariotske mRNA metodama koje se koriste za manipuliranje molekulama DNA, a koje su opisane u nastavku ovog poglavlja.

3.3. Rekombinantna DNA

Klasini eksperimenti u molekularnoj biologiji znaajno su unaprijedili nae temeljno razumijevanje prirode i ekspresije gena. Budui da su ta istraivanja bila zasnovana poglavito na genetikim analizama, njihov je uspjeh u znaajnoj mjeri ovisio o koritenju jednostavnih organizama koji se brzo razmnoavaju (kao to su primjerice bakterije i virusi). Kako su genomi veine eukariota (primjerice genom ovjeka) i do tisuu puta sloeniji od genoma bakterije E. coli, nije bilo jasno kako bi se ti temeljni principi primijenili i na vie organizme. Poetkom 1970-ih mogunost istraivanja sloenih genoma na molekularnoj razini nije djelovala obeavajue. Posebice se inilo da nema naina na koji bi bilo mogue izolirati i ispitivati pojedinane gene.

Ovu prepreku napretku molekularne biologije savladao je razvoj rekombinantne DNA tehnologije koja je znanstvenicima pruila mogunost da izoliraju, sekvenciraju i manipuliraju genima izoliranim iz bilo kojeg tipa stanica, pa i onih sloenih organizama. Primjena rekombinantne DNA tehnologije omoguila je detaljna molekularna ispitivanja strukture i funkcije eukariotskih gena i genoma te je na taj nain produbila nae razumijevanje stanine biologije.

Restrikcijske endonukleaze

Prvi korak u razvoju rekombinantne DNA tehnologije bila je karakterizacija restrikcijskih endonukleaza, enzima koji kidaju DNA na specifinim redoslijedima. Ovi enzimi otkriveni su u bakterija gdje vjerojatno slue kao obrambeni mehanizam protiv ulaska strane DNA (primjerice virusne) u stanicu. Bakterije imaju velik broj razliitih restrikcijskih endonukleaza koje kidaju DNA na vie od stotinu specifinih mjesta prepoznavanja, a svako od tih mjesta sastoji se od specifinog slijeda od etiri do osam parova baza (primjeri su navedeni u tablici 3.2).

Budui da restrikcijske endonukleaze razgrauju DNA u specifinim redoslijedima, mogue ih je primijeniti za kidanje molekule DNA na jedinstvenim mjestima. Primjerice restrikcijska endonukleaza EcoRI prepoznaje slijed od est parova baza GAATTC. Ovakav slijed nukleotida prisutan je na pet mjesta u DNA bakteriofaga , te stoga EcoRI razgrauje DNA u est fragmenata duljine od 3,6 do 21,2 kilobaze (1 kb = 1.000 parova baza) (slika 3.14). Ti fragmenti mogu biti razdvojeni prema veliini gel-elektroforezom, metodom koja razdvaja molekule na osnovi razlika u brzini kojom putuju u elektrinom polju. Gel, koji je najee sainjen od agaroze ili poliakrilamida, smjeta se izmeu dva rezervoara s puferom u kojima se nalaze elektrode. Zatim se uzorak (primjerice smjesa fragmenata DNA koje treba analizirati) pipetom unosi u prethodno napravljene bunarie u gelu i ukljuuje se elektrino polje. Nukleinske kiseline su negativno nabijene (zbog fosfata u njihovim okosnicama) te stoga putuju prema pozitivnoj elektrodi (anodi). Gel djeluje kao sito koje selektivno usporava vee molekule. Manje molekule se stoga kroz gel kreu bre to omoguuje da se molekule u smjesi razdvoje na osnovi razlika u veliini.

Razliitim metodama mogue je utvrditi redoslijed restrikcijskih fragmenata i dobiti (primjerice) kartu EcoRI restrikcijskih mjesta u DNA faga. Utvreni poloaji restrikcijskih mjesta za brojne razliite restrikcijske endonukleaze mogu se iskoristiti za stvaranje detaljnih restrikcijskih karata molekula DNA kao to su primjerice genomi virusa (slika 3.15). Osim toga, nakon elektroforeze mogue je izolirati pojedine fragmente nastale razgradnjom restrikcijskim endonukleazama to omoguuje njihovo detaljno ispitivanje, primjerice odreivanje slijeda nukleotida u molekuli DNA. Na taj je nain karakterizirana DNA brojnih virusa.

Sama razgradnja restrikcijskim endonukleazama meutim nema dovoljnu rezoluciju za analizu veih molekula DNA, kao to su primjerice stanini genomi. Restrikcijska endonukleaza s mjestom prepoznavanja od est parova baza (kao to je primjerice EcoRI) statistiki e gledano prepoznati jedno mjesto svakih 4.096 parova baza (1/46). Stoga se moe oekivati da e razgradnjom molekule veliine DNA (48,5 kb) nastati oko deset EcoRI fragmenata to je u skladu s rezultatom prikazanim na slici 3.14. Meutim razgradnja veih genoma restrikcijskim endonukleazama daje znaajno drugaije rezultate. Primjerice genom ovjeka sastoji se od priblino 3106 kb i stoga se moe oekivati da emo restrikcijskom razgradnjom dobiti vie od 500.000 EcoRI fragmenata. Tako velik broj fragmenata nije mogue razdvojiti, te agarozna gel-elektroforeza genoma ovjeka razgraenog EcoRI restrikcijskom endonukleazom umjesto razdvojenih fragmenata daje samo kontinuirani razmaz DNA. Kako nije mogue izolirati pojedine restrikcijske fragmente iz takve smjese, sama razgradnja restrikcijskim nukleazama nije odgovarajua metoda za pripravu homogenog uzorka DNA za daljnju analizu. Veliku koliinu proienih fragmenata DNA mogue je pripraviti molekularnim kloniranjem.

Proizvodnja rekombinantnih molekula DNATemeljna je strategija molekularnoga kloniranja unijeti fragment DNA koji nas zanima (primjerice komadi DNA ovjeka) u neku drugu molekulu DNA (zovemo je vektor) koja se moe samostalno umnaati u stanici domainu. Tako nastala hibridna (rekombinantna) molekula ili molekularni klon sastoji se od ugraenoga eljenog fragmenta DNA povezanoga s DNA vektora. Omoguimo li takvom vektoru da se umnoi u odgovarajuem domainu dobit emo velik broj kopija ugraenoga fragmenta DNA. Primjerice fragment DNA ovjeka mogue je ugraditi u vektor (slika 3.16). Takve rekombinantne molekule tada je mogue unijeti u bakteriju E. coli gdje se one uinkovito razmnoavaju, a milijuni novih bakteriofaga sadravat e milijune kopija ugraenoga eljenog fragmenta humane DNA. Dok na eljeni fragment predstavlja moda jednu stotisuinku genoma ovjeka, nakon ugradnje u vektor on ini priblino jednu desetinu DNA vektora. Taj je fragment sada lako razdvojiti od ostatka DNA vektora razgradnjom restrikcijskim endonukleazama i gel-elektroforezom. Rezultat je velik broj kopija homogenoga proienog fragmenta humane DNA koji moemo analizirati i s njime dalje rukovati.

Fragmente DNA kojima se koristimo za stvaranje rekombinantnih molekula obino pripravljamo razgradnjom restrikcijskim endonukleazama. Mnogi od tih enzima kidaju u mjestu prepoznavanja tako da ostavljaju nazubljene (ljepljive) krajeve jednolanane DNA koji se meusobno mogu povezati komplementarnim sparivanjem baza (slika 3.17). Vezu izmeu tih krajeva povezanih komplementarnim sparivanjem baza mogue je uvrstiti tretmanom s DNA ligazom, enzimom koji zatvara prekide u lancima DNA (vidi Poglavlje 5). Na taj je nain mogue u rekombinantnu DNA molekulu povezati dva razliita fragmenta DNA (primjerice fragment DNA ovjeka i DNA vektor) pripravljena razgradnjom pomou iste restrikcijske endonukleaze.

Fragmenti DNA koje moemo klonirati ne moraju nuno zavravati odgovarajuim slijedom nukleotida koji prepoznaju restrikcijske endonukleaze). Naime, na tupe krajeve bilo kojeg fragmenta DNA mogue je dodati sintetike DNA spojnice koje sadravaju mjesta prepoznavanja za velik broj razliitih restrikcijskih endonukleaza. Te su spojnice kratki oligonukleotidi koje je lako pripraviti kemijskom sintezom, a omoguuju da se praktino bilo koji fragment DNA pripremi za ugradnju u vektor.

Osim DNA sekvenci mogue je klonirati i RNA sekvence (slika 3.18). Prvi je korak u tom procesu pripraviti DNA kopiju RNA molekule koristei enzim reverznu-transkriptazu. Tako proizvedenu molekulu DNA (nazivamo je cDNA jer je komplementarna molekuli RNA koju smo koristili kao kalup) mogue je ugraditi u vektor na ve opisani nain. Budui da su eukariotski geni najee isprekidani nekodirajuim redoslijedima (intronima, vidi Poglavlje 4) koje se prekrajanjem (engl. splicing) uklanjaju iz mRNA, mogunost kloniranja i cDNA i genomske DNA bila je kljuna za razumijevanje strukture i funkcije gena

Vektori za rekombinantnu DNA

Ovisno o veliini fragmenta DNA koji elimo ugraditi i svrsi eksperimenta koji planiramo, za pripravu rekombinantnih molekula na raspolaganju nam je vie razliitih tipova vektora za kloniranje. Prema namjeni ih moemo podijeliti na 3 osnovna sustava: vektore za izolaciju i umnaanje klonirane DNA, vektore za ekspresiju klonirane DNA i vektore za unos rekombinantnih DNA molekula u eukariotske stanice.

Vektori izvedeni iz bakteriofaga esto se koriste za poetnu izolaciju genomske DNA ili cDNA iz eukariotskih stanica (slika 3.19). Iz vektora za kloniranje uklonjeni su dijelovi genoma bakteriofaga koji nisu nuni za umnaanje virusa, a zamijenjeni su s jedinstvenim restrikcijskim mjestima za ugradnju klonirane DNA. Veliina fragmenta DNA koji je mogue ugraditi u takve vektore ograniena je na priblino 15 kb zbog nunosti pakiranja takvog rekombinantnoga genoma u estice faga. elimo li primjerice izolirati genomske klonove DNA ovjeka, spojit emo nasumine fragmente prosjene veliine oko 15 kb s krajevima vektora. Takvu rekombinantnu DNA mogue je uinkovito ugraditi u estice faga mijeajui je s proteinima (koje nazivamo ekstrakti za pakiranje) in vitro. S takvim esticama faga zatim inficiramo kulture E. coli. Budui da svaka estica faga stvara odvojeni plak, mogue je izolirati rekombinantne molekule koje sadravaju samo jedan specifini fragment DNA ovjeka. Rekombinantne vektore koji sadravaju specifini gen koji nas zanima mogue je identificirati hibridizacijom nukleinskih kiselina ili nekim drugim metodama pretraivanja (opisano u nastavku ovoga poglavlja).

Plazmidni vektori (slika 3.20) omoguuju lake rukovanje kloniranim DNA molekulama od bakteriofagnih vektora. Plazmidi su male krune molekule DNA koje u bakterijskim stanicama postoje kao slobodne molekule (nisu integrirane u bakterijski "kromosom") te se umnoavaju neovisno od kromosomske DNA. Sve to je potrebno imati u plazmidnoj DNA je ishodite replikacije (slijed nukleotida koji DNA-polimerazu stanice domaina upuuje da replicira stranu molekulu DNA). Osim ishodita replikacije, plazmidni vektori sadravaju gene za rezistenciju na antibiotike (primjerice rezistenciju na ampicilin) koji omoguuju odabir bakterija s rekombinantnim plazmidom. Veliina plazmidnih vektora obino je izmeu 2 i 4 kb DNA, to je znaajno manje od veliine DNA vektora (30 do 45 kb) i stoga olakava analizu ugraenoga fragmenta DNA.

Da bi bio kloniran u plazmidnom vektoru fragment DNA se ugrauje u odgovarajue restrikcijsko mjesto na vektoru i tako nastalom rekombinantnom molekulom transformira se E. coli. Da bi se odreeni fragment DNA klonirao u plazmidni vektor on se najprije mora ugraditi u odgovarajue restrikcijsko mjesto na tom vektoru, a zatim se tako nastalom rekombiniranom molekulom transformira bakterija E. coli. Zatim se odabiru kolonije koje su rezistentne na antibiotik jer one sadravaju plazmidnu DNA. Bakterije u kojima se nalaze plazmidi mogue je sad umnoiti u eljenim koliinama i iz njih izolirati DNA. Male krune molekule plazmidne DNA, kojih esto ima vie stotina u svakoj stanici, mogue je razdvojiti od kromosomske DNA bakterija. Rezultat je proiena plazmidna DNA koja je prikladna za daljnju analizu ugraenoga fragmenta DNA.

Brojne analize genomske DNA zahtijevaju kloniranje fragmenata DNA veih no to ih mogu prihvatiti vektori. Za tu se namjenu koriste pet glavnih tipova vektora (tabl. 3.3). Kozmidni vektori mogu prihvatiti umetke veliine oko 45 kb. Ovi vektori sadravaju DNA bakteriofaga koja omoguuje uinkovitu ugradnju klonirane DNA u estice faga. Kozmidni vektori sadravaju i ishodite replikacije i gene za rezistenciju na antibiotike svojstvene plazmidima, pa se mogu replicirati kao plazmidi u bakterijskim stanicama. Druga dva tipa vektora izvedena su pak iz bakteriofaga P1 i mogu prihvatiti fragmente DNA veliine od 70 do 100 kb. Sadravaju sekvence koje omoguujeju in vitro ugradnju rekombinantne DNA u estice P1 faga, a u bakteriji E. coli se mogu neovisno replicirati poput plazmida. Takozvani P1 umjetni kromosomi (PAC engl. P1 artificial chromosome) takoer sadravaju sekvence bakteriofaga P1, ali se u bakteriju E. coli unose izravno kao plazmidi, a prihvaaju fragmente DNA veliine od 130 do 150 kb. Bakterijski umjetni kromosomi (BAC engl. bacterial artificial chromosome) su vektori izvedeni iz prirodnog plazmida koji nalazimo u E. coli (nazivamo ga F faktor). Ishodite replikacije i ostale redoslijede F faktora omoguuju BAC da se replicira kao stabilni plazmid ak i uz umetke od 120 do 300 kb. Jo vee fragmente DNA (250 400 kb) mogue je klonirati u vektoru koji nazivamo umjetni kromosom kvasca (YAC engl. yeast artificial chromosome). Ti vektori sadravaju ishodite replikacije kvasca i neke druge elemente (centromere i telomere, vidi Poglavlje 4) koji im omoguuju da se repliciraju u stanicama kvasca kao linearne molekule sline kromosomima.

Sekvenciranje DNA

Molekularno kloniranje omoguuje izolaciju pojedinanih fragmenata DNA u koliinama koje su prikladne za detaljnu karakterizaciju i odreivanje slijeda nukleotida. Odreivanje slijeda nukleotida brojnih gena otkrilo je strukture njihovih proteinskih produkata, a razjasnilo je i svojstva DNA sekvenci koje reguliraju njihovu ekspresiju. tovie, slijed nukleotida u kodirajuim regijama novih gena esto je srodan slijedu nukleotida u nekim ve otprije poznatim genima pa je funkciju novo otkrivenih gena esto mogue prepoznati na osnovi slinosti u sekvencama.

Suvremene metode sekvenciranja DNA su brze i tone pa je danas odreivanje slijeda nukleotida DNA od nekoliko kilobaza razmjerno jednostavan zadatak. Stoga je neusporedivo jednostavnije klonirati i sekvencirati DNA nego to je odrediti slijed aminokiselina u proteinu kojeg taj gen kodira. Budui da slijed nukleotida u genu moemo izravno prevesti u slijed aminokiselina u proteinu, najlaki nain odreivanja primarne strukture proteina je sekvenciranje kloniranoga gena ili cDNA.

Najea metoda za sekvenciranje DNA zasniva se na preuranjenom prestanku sinteze DNA zbog ugradnje dideoksinukleotida (koji nemaju 3' OH skupinu na deoksiribozi) koji prekidaju sintezu DNA lanca DNA-polimerazom (slika 3.21). Sinteza DNA zapoinje poetnicom koja je na jednom kraju obiljeena radioizotopom. Provode se etiri neovisne reakcije od kojih svaka osim normalnih nukleotida sadrava i po jedan od dideoksinukleotida (A, C, G ili T). Ugradnja dideoksinukleotida zaustavlja sintezu DNA jer je 3' OH skupina nuna za vezanje sljedeeg nukleotida. Na taj nain nastaje serija obiljeenih molekula DNA koje sve zavravaju bazom koja odgovara dideoksinukleotidu koritenom u toj reakciji. Ti se fragmenti DNA zatim razdvajaju prema veliini gel-elektroforezom i detektiraju izlaganjem gela filmu osjetljivom na X-zrake (autoradiografija). Veliina svakog fragmenta odreena je poloajem na koji se ugradio dideoksinukleotid, stoga slijed nukleotida u DNA odgovara redoslijedu fragmenata koji proitamo s gela.

Sekvenciranje DNA esto se izvodi i pomou automatiziranih sustava koji koriste fluorescentno obiljeene poetnice u reakciji ugradnje dideoksinukleotida (slika 3.22). Novosintetizirani lanci DNA izlaze iz gela za elektroforezu i prolaze kroz lasersku zraku koja pobuuje fluorescentni biljeg. Emitiranu svjetlost oitava fotomultiplikator, a raunalo prikuplja i analizira podatke. Takva automatizacija jako je ubrzala sekvenciranje to je bilo potrebno za odreivanje slijeda nukleotida cjelokupnoga genoma ovjeka, kao i genoma brojnih bakterija, gljivica, vrsta poput Arabidopsis thaliana, Chaernobis elegans, Drosophila melanogaster, te mia.

Ekspresija kloniranih gena

Osim odreivanja slijeda nukleotida pojedinoga gena, te stoga i slijeda aminokiselina u njegovom proteinskom produktu, molekularno kloniranje je omoguilo pripravu velikih koliina proteina za strukturna i funkcionalna ispitivanja. Veina proteina prisutna je u vrlo malim koliinama u eukariotskim stanicama, stoga je konvencionalnim biokemijskim metodama nemogue pripraviti vee koliine tih proteina. Meutim, kad jednom imamo klonirani gen, taj problem moemo rijeiti koristei posebno dizajnirane vektore koji omoguuju snanu ekspresiju kloniranoga gena u bakterijskim ili eukariotskim stanicama.

Da bismo eksprimirali eukariotski gen u E. coli, eljenu cDNA kloniramo u plazmidni ili fagni vektor (nazivamo ga ekspresijski vektor). Vektor sadrava sekvence koje potiu prepisivanje i prevoenje umetnutoga gena u bakterijskim stanicama (slika 3.22). Klonirani gen esto moe biti tako jako eksprimiran da njegov proteinski produkt predstavlja i do 10% ukupnih proteina bakterije. Nakon toga je proiavanje proteina kodiranoga kloniranim genom u koliinama potrebnim za detaljna biokemijska ili strukturna ispitivanja jednostavan zadatak.

esto je potrebno klonirani gen eksprimirati u eukariotskim stanicama umjesto u bakterijama. Taj oblik ekspresije vaan je da bismo, primjerice, osigurali normalno odvijanje posttranslacijskih modifikacija proteina (kao to su dodatak ugljikohidrata ili lipida). Sinteza stranih proteina u eukariotskim stanicama postie se (analogno postupku s E. coli) ugradnjom kloniranoga gena u vektor (obino izveden od virusa) koji omoguuje visoku razinu ekspresije toga gena. Sustav koji se esto koristi za proizvodnju rekombinantnih proteina u eukariotskim stanicama je infekcija insektnih stanica bakulovirusnim vektorima koji omoguuju visoku razinu ekspresije gena umetnutih na mjesto gena za strukturne proteine virusa. Visoku razinu ekspresije kloniranih gena mogue je postii i u stanicama sisavaca uz pomo odgovarajuih vektora. Takoer je praktino klonirani gen eksprimirati u kvascu zbog mogunosti primjene i jednostavnih metoda genetike kvasca za ispitivanje interakcija kloniranog proteina s drugim proteinima ili specifinim slijedovima DNA.

Umnoavanje DNA lananom reakcijom polimeraze

Molekularno kloniranje omoguuje pripravu velikih koliina specifinih DNA fragmenata umnoavanjem i izolacijom iz bakterija. Alternativni pristup za pripravu velike koliine neke DNA molekule je lanana reakcija polimeraze (PCR, engl. polymerase chain reaction), koju je 1988. godine razvio Kary Mullis. Ukoliko je poznat dio slijeda nukleotida u nekoj molekuli DNA, lananom reakcijom polimeraze mogue je u potpunosti in vitro pripraviti goleme koliine te molekule. Osnova metode je opetovano umnaanje odreenog segmenta DNA pomou DNA-polimeraze. Broj molekula DNA dvostruko je vei nakon svakoga kruga umnaanja i poveava se eksponencijalno, te je iz maloga broja kopija molekula kalupa koje su prisutne na poetku reakcije mogue pripraviti veliku koliinu DNA. Primjerice, iz jedne e molekule DNA nakon 30 ciklusa umnaanja teorijski nastati 230 (priblino milijardu) identinih kopija. To znai da je jednu jedinu molekulu DNA mogue umnoiti do koliine koja je potrebna za molekularno kloniranje, analizu razgradnjom restrikcijskim endonukleazama, ili odreivanje slijeda nukleotida.

Osnova metode za umnaanje DNA lananom reakcijom polimeraze prikazana je na slici 3.24. Poetni materijal moe biti klonirani fragment DNA ili pak smjesa razliitih molekula DNA, primjerice ukupni ekstrakt DNA stanica ovjeka. Da bismo mogli umnoiti eljeni segment DNA, moramo poznavati slijed nukleotida koji ga okruuju kako bismo mogli kreirati specifine poetnice koje e zapoeti sintezu DNA na eljenim mjestima. Te poetnice su najee kemijski sintetizirane molekule DNA duljine od 15 do 20 nukleotida. Koriste se dvije poetnice koje e zapoeti sintezu u suprotnim smjerovima na dva komplementarna lanca DNA. Reakcija zapoinje zagrijavanjem kalupa na visoku temperaturu (primjerice 95 C) kako bi se razdvojila dva lanca DNA. Temperatura se tada snizuje kako bi se omoguilo poetnicama da se specifino poveu s komplementarnim sljedovima na lancima kalupa. DNA-polimeraza tada sintetizira lanac DNA komplementaran kalupu poevi od specifino povezanih poetnica. U jednom ciklusu umnoavanja iz svake molekule kalupa nastaju po dvije nove identine molekule DNA. Ovaj je proces mogue ponoviti velik broj puta, a u svakom e se ciklusu broj molekula DNA udvostruiti.

Viestruki uzastopni ciklusi grijanja i hlaenja, koji su sastavni dio lanane reakcije polimeraze, provode se u posebnim termoblokovima koje je mogue programirati, a nazivamo ih termocikleri. Enzimi koje koristimo u lananoj reakciji polimeraze su stabilni i na visokim temperaturama kojima razdvajamo lance DNA molekule. Naime, ovi su termostabilni enzimi izolirani iz bakterija poput Termus aquaticus koje ive u termalnim izvorima na temperaturama od priblino 75 C. Takve su polimeraze stabilne i na visokim temperaturama kojima razdvajamo lance dvolanane DNA, pa je umnaanje DNA lananom reakcijom polimeraze mogue jednostavno provesti. Na ovaj je nain takoer mogue umnoiti RNA molekule ukoliko prije lanane reakcije polimeraze napravimo cDNA kopiju molekule RNA reverznom-transkriptazom.

Ukoliko je slijed nukleotida nekoga gena poznat u dovoljnoj mjeri da moemo pripremiti odgovarajue poetnice, lanana reakcija polimeraze iznimno je mona metoda za pripravu velikih koliina DNA iz poetnog materijala koji moe sadravati svega nekoliko traenih molekula DNA u smjesi velikog broja razliitih drugih molekula DNA. Primjerice, ciljane sekvence duljine i do nekoliko kilobaza mogue je umnoiti iz ukupne genomske DNA, a jednu je cDNA mogue umnoiti iz ukupne stanine RNA. Takve je umnoene dijelove DNA mogue dalje obraivati ili analizirati, primjerice da bismo otkrili mutacije u genu koji nas zanima. Lanana reakcija polimeraze stoga znaajno pridonosi repertoaru metoda rekombinantne DNA. Njezina je snaga posebice izraena u dijagnostici nasljednih bolesti, ispitivanju ekspresije gena tijekom razvoja i u sudskoj medicini.

3.4. Detekcija nukleinskih kiselina i proteina

Razvoj molekularnoga kloniranja omoguio je izolaciju i karakterizaciju pojedinanih gena iz eukariotskih stanica, no za razumijevanje njihove uloge u stanicama bilo je potrebno analizirati i razumjeti brojne procese kao to su primjerice regulacija ekspresije, ili unutarstanina organizacija proteina koje oni kodiraju. U ovom emo poglavlju prikazati temeljne metode koje se danas primjenjuju za detekciju specifinih nukleinskih kiselina i proteina. Te su metode vane za razliita istraivanja kao to su, primjerice, kartiranje gena na kromosomima, analiza ekspresije gena i odreivanje smjetaja proteina u unutarstaninim organelima. Iste temeljne metode koriste se i za izolaciju pojedinih gena kao molekularnih klonova.

Hibridizacija nukleinskih kiselina

Osnova detekcije specifinih redoslijeda nukleinskih kiselina je sparivanje baza izmeu komplementarnih niti RNA ili DNA. Pri visokim se temperaturama (90 100 C) komplementarni lanci DNA razdvajaju i nastaju jednolanane molekule. Kaemo da se DNA denaturirala. Ako takve denaturirane molekule DNA inkubiramo na odgovarajuoj temperaturi (primjerice 65 C), renaturirat e se u dvolanane molekule na osnovi komplementarnog sparivanja baza. Taj proces ponovnog uspostavljanja dvolanane strukture nazivamo hibridizacijom nukleinskih kiselina. Hibridne nukleinske kiseline mogu stvoriti dva lanca DNA, dva lanca RNA ili jedan lanac DNA i jedan lanac RNA.

Hibridizacija nukleinskih kiselina omoguuje detekciju molekula DNA ili RNA koje su komplementarne bilo kojoj izoliranoj nukleinskoj kiselini kao to je primjerice virusni genom ili klonirani gen (slika 3.25). Klonirana DNA je radioaktivno obiljeena, najee time to je sintetizirana u prisutnosti radioaktivno obiljeenih nukleotida. Takva se radioaktivna DNA tada koristi kao sonda za hibridizaciju s komplementarnim DNA ili RNA sekvencama, koje onda detektiramo zahvaljujui radioaktivnosti dvolananih hibrida.

Southern blot (tehnika koju je razvio E. M. Southern) je iroko rasprostranjena metoda za detekciju specifinih gena u staninoj DNA (slika 3.26). DNA koju analiziramo razgraujemo restrikcijskim endonukleazama i nastale fragmente DNA razdvajamo gel-elektroforezom. Na gel se tada stavlja nitrocelulozna ili najlonska membrana na koju se prenose (blotaju) fragmenti DNA. Tako pripravljena replika gela inkubira se s radioaktivnom sondom koja se hibridizira s fragmentima DNA koji sadravaju komplementarne sljedove nukleotida. Poloaj tih fragmenata postaje vidljiv nakon izlaganja blota filmu osjetljivom na X-zrake.

Kad umjesto molekula DNA elimo detektirati molekule RNA koristimo varijaciju Southern blot metode koju nazivamo Northern blot (ime metode izabrano je prema analogiji s engleskim znaenjem rijei south jug; north sjever, o.p.). U ovoj se metodi ukupna stanina RNA izolira i razdvoji prema veliini gel-elektroforezom. Kao i u Southern blotu, RNA se prenosi na membranu i detektira hibridizacijom s radioaktivno obiljeenom sondom. Northern blot se esto koristi za analizu ekspresije gena, primjerice, elimo li utvrditi je li specifina mRNA prisutna u razliitim tipovima stanica.

Umjesto analize jednog po jednog gena to rade Southern i Northern blot metode, hibridizacija s DNA mikroipovima omoguuje istovremenu analizu desetina tisua gena. Kako cjeloviti genomi eukariota postaju poznati, hibridizacija s DNA mikroipovima prua znanstvenicima priliku za globalnu analizu sekvenci prisutnih u uzorcima stanine RNA ili DNA. DNA mikroip sastoji se od predmetnog stakalca ili membrane na koju su fragmenti cDNA robotiziranim sustavima utisnuti u velikom broju malih tokica visoke gustoe (slika 3.27). U svakoj se toki na mikroipu nalazi jedan oligonukleotid ili cDNA. Na klasino predmetno mikroskopsko stakalce mogue je utisnuti vie od 100.000 razliitih oligonukleotida, to omoguuje pripravu DNA mikroipova koji pokrivaju cjelokupne genome. Kao to je prikazano na slici 3.27, DNA mikroipova mogue je primijeniti za analizu ekspresije gena, primjerice za usporeivanje gena koje eksprimiraju dva razliita tipa stanica. U eksperimentima ovog tipa sintetiziraju se cDNA probe od ukupne mRNA koja je eksprimirana u dva tipa stanica (primjerice tumorskim i normalnim stanicama). Te dvije skupine cDNA obiljeavaju se razliitim fluorescentnim bojama (obino crvenom i zelenom), pomijeaju i hibridiziraju s mikroipovima na kojima se nalazi 10.000 ili vie humanih gena predstavljenih kao pojedinane tokice. DNA mikroip tada se analizira laserskim itaem visoke rezolucije, a relativni omjeri transkripcije nekoga gena u tumorskim i normalnim stanicama odgovaraju omjeru crvene i zelene fluorescencije na odgovarajuim tokicama na DNA mikroipu.

Osim u ekstraktima stanica, hibridizacijom nukleinskih kiselina moemo homologne DNA ili RNA molekule detektirati i na kromosomima ili intaktnim stanicama. Metodu nazivamo hibridizacija in situ, a u njoj radioaktivno ili fluorescentno obiljeenu sondu hibridiziranu na specifinim staninim ili substaninim strukturama analiziramo mikroskopom (slika 3.28). Primjerice obiljeene je sonde mogue hibridizirati s intaktnim kromosomima kako bismo odredili podruja kromosoma koja sadravaju gene koji nas interesiraju. Hibridizacijom in situ takoer moemo detektirati specifine mRNA u razliitim tipovima stanica u tkivu.

Detekcija malih koliina DNA ili RNA lananom reakcijom polimeraze

Amplifikacija DNA lananom reakcijom polimeraze daleko je osjetljivija metoda od detekcije staninih DNA ili RNA sekvenci Southern ili Northern blot metodom. Dok je za hibridizaciju na blotu potrebno priblino 100.000 kopija neke DNA ili RNA molekule, lanana reakcija polimeraze moe umnoiti jednu jedinu kopiju DNA (ili RNA nakon obrnutog prepisivanja) do razine koja se moe lako detektirati.

Kao to je ve opisano, specifinost umnoavanja u lananoj reakciji polimeraze postie se primjenom oligonukleotidnih poetnica koje se hibridiziraju s komplementarnim sekvencama na molekulama kalupa. Na taj nain lanana reakcija polimeraze moe selektivno umnoiti specifinu molekulu DNA u sloenim smjesama kao to su primjerice ukupna stanina DNA ili RNA. Zbog toga je lananu reakciju polimeraze mogue primijeniti za detekciju specifine molekule DNA ili RNA u vrlo malim koliinama poetnog materijala, primjerice iz jedne jedine stanice. Ovakva neuobiajena osjetljivost omoguila je primjenu lanane reakcije polimeraze u brojnim podrujima, ukljuujui i analizu ekspresije gena stanicama koje moemo pribaviti samo u ogranienim koliinama.

Protutijela kao sonde za proteine

Ispitivanje ekspresije i funkcije gena zahtijeva detekciju ne samo DNA i RNA, ve i specifinih proteina. U tim ispitivanjima protutijela preuzimaju ulogu sondi kojima moemo selektivno reagirati s pojedinim proteinima. Protutijela su proteini koje proizvode stanice imunosustava (B-limfociti) koje reagiraju protiv molekula (antigena) koje organizam domaina prepoznaje kao strane, primjerice proteinski omota virusa. Imunosustav kraljenjaka sposoban je stvoriti milijune razliitih protutijela od kojih svako prepoznaje jedinstveni antigen (protein, ugljikohidrat ili neku drugu molekulu koja nije prirodnog podrijetla). Jedan limfocit proizvodi samo jedan tip protutijela, no zbog programiranog preureivanja gena tijekom razvoja imunosustava, geni koji kodiraju protutijela razlikuju se od limfocita do limfocita (vidi Poglavlje 5). Ove varijacije rezultiraju velikim brojem razliitih protutijela koja proizvode razliiti limfociti programirani da odgovore na razliite antigene.

Proizvodnju protutijela mogue je potaknuti imunizacijom ivotinje nekim stranim proteinom. Primjerice, protutijela koja prepoznaju proteine ovjeka esto se proizvode u kuniu. U serumima takvih ivotinja nalaze se smjese protutijela (koja proizvode razliiti limfociti) koja reagiraju s razliitim dijelovima molekule antigena kojim je ivotinja imunizirana. Pojedinana protutijela (monoklonska protutijela) mogue je proizvesti uzgajajui u kulturi klonalne linije B-limfocita izoliranih iz imuniziranih ivotinja (najee mia). Kako je svaki limfocit programiran da proizvodi samo jedno protutijelo, klonalne linije limfocita proizvode monoklonska protutijela koja sva prepoznaju istu antigenu determinantu, te su stoga vrlo specifino imunoloko orue.

Iako se najee proizvode protutijela koja prepoznaju proteine proiene iz stanica, mogui su i neki drugi oblici imunizacije. Primjerice, ivotinje je mogue imunizirati intaktnim stanicama kako bi proizvele protutijela na nepoznate proteine koji su eksprimirani u odreenim vrstama stanica (primjerice tumorskim). Takva je protutijela onda mogue iskoristiti za identifikaciju proteina koji su specifini za vrstu stanica koja je koritena za imunizaciju. Protutijela se esto proizvode i na rekombinantne proteine eksprimirane u bakterijama. Na ovaj nain molekularno kloniranje omoguuje proizvodnju protutijela na proteine koje je gotovo nemogue u dostatnim koliinama proistiti iz eukariotskih stanica. Osim na cjelovite proteine, protutijela je mogue razviti i na sintetike peptide od svega 10 do 15 aminokiselina. Ukoliko je poznat slijed nukleotida u nekom genu, mogue je razviti protutijela na sintetike peptide iji je slijed aminokiselina izveden iz dijela sekvence toga gena. Budui da takva protutijela proizvedena na sintetike peptide esto prepoznaju i cjeloviti protein, za uspjenu nam je proizvodnju protutijela na neki protein dovoljno poznavati slijed nukleotida kloniranoga gena.

Protutijela moemo na razne naine primijeniti za detekciju proteina u staninim ekstraktima. Dvije uobiajene metode su imunoblot (poznat i kao Western blot) i imunoprecipitacija. Western blot (slika 3.29) je jo jedna varijacija Southern blot metode. Proteini u ekstraktima stanica isto se prvo razdvajaju prema veliini gel-elektroforezom, no kako su proteini razliiti oblikom i nabojem, ovaj je proces neto drugaiji od elektroforeze nukleinskih kiselina. Proteine razdvajamo metodom koju nazivamo SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza (SDS-PAGE) u kojoj su proteini otopljeni u otopini koja sadrava negativno nabijeni detergent natrij-dodecilsulfat (SDS). Na svaki se protein vee velik broj molekula detergenta koje ga denaturiraju i daju mu ukupni negativni naboj. Pod tim uvjetima svi proteini putuju prema pozitivnoj elektrodi, a brzina putovanja (kao i kod nukleinskih kiselina) odreena je samo njihovom veliinom. Nakon elektroforeze proteini se prenose na membranu i zatim inkubiraju s protutijelima koja prepoznaju eljeni protein. Protutijela vezana na membranu mogue je detektirati razliitim metodama, a to onda otkriva i protein na koji su se ta protutijela vezala.

Imunoprecipitaciju koristimo kako bismo izolirali proteine koje prepoznaju specifina protutijela (slika 3.30). Stanice se najee uzgajaju u prisutnosti radioaktivno obiljeene aminokiseline kako bismo dobili radioaktivno obiljeene proteine. Takvi radioaktivni ekstrakti stanica inkubiraju se s protutijelima koja se veu na ciljne proteine protiv kojih su razvijena (antigene). Nastali kompleksi protutijelo-antigen izoliraju se i analiziraju elektroforezom to omoguuje detekciju radioaktivno obiljeenog antigena autoradiografijom.

Kao to je ve prikazano u Poglavlju 1, protutijelima moemo vizualizirati proteine unutar stanica, a i u lizatima stanica. Primjerice, stanice moemo obojiti protutijelima obiljeenim fluorescentnim bojama, a unutarstaninu lokalizaciju antigenih proteina moemo analizirati fluorescentnim mikroskopom (vidi sliku 1.28). Protutijela je mogue obiljeiti i biljezima koji su vidljivi pod elektronskim mikroskopom, primjerice tekim metalima, to omoguuje ispitivanja i na ultrastrukturnoj razini.

Sonde za pretraivanje knjinica rekombinantne DNA

Iste metode koje koristimo za detekciju nukleinskih kiselina i proteina u ekstraktima stanica primjenjujemo i za otkrivanje molekularnih klonova koji sadravaju umetnute specifine fragmente stanine DNA. Primjerice hibridizaciju nukleinskih kiselina moemo primijeniti da identificiramo genomski ili cDNA klon koji sadrava sekvence DNA za koje postoje odgovarajue sonde. Ukoliko je cDNA klonirana u ekspresijski vektor, mogue ju je identificirati koristei protutijela koja prepoznaju proteine kodirane u toj cDNA.

Prvi korak u izolaciji genomskog ili cDNA klona esto je priprava knjinice rekombinantne DNA, zbirke klonova koji sadravaju sve genomske ili mRNA sekvence odreenog tipa stanica (slika 3.31). Primjerice genomsku knjinicu DNA ovjeka mogue je pripraviti klonirajui nasumine fragmente veliine oko 15 kb u vektor. Kako je veliina genoma ovjeka oko 3106 kb, DNA ekvivalent jednoga genoma bio bi predstavljen s 200.000 takvih klonova. Zbog statistikih fluktuacija u uzorkovanju, u knjinici od 200.000 klonova mnogi geni ne bi bili prisutni, a neki bi bili prisutni u vie klonova. Zbog toga se, kako bismo postigli visoku vjerojatnost da e svaki gen biti predstavljen u knjinici, obino pripravljaju vee knjinice od priblino milijun rekombinantnih bakteriofaga.

Bilo koji gen za koji postoji odgovarajua sonda mogue je lagano izolirati iz takve rekombinantne knjinice. Rekombinantne bakteriofage nasaujemo na E. coli i svaki se fag umnoava i stvara plak na bakterijskoj livadi. Plakovi se tada prenose na membrane u procesu slinom prijenosu DNA s gela na membranu u Southern blot metodi i zatim hibridiziraju s radioaktivno obiljeenom sondom radi otkrivanja plakova faga koji sadravaju eljeni gen. Odgovarajue rekombinantne bakteriofage tada je mogue izolirati s originalne ploice i umnoiti eljeni umetak stanine DNA. Na slian je nain mogue pretraivati i bakterijske kolonije koje nose plazmidne DNA klonove, te je specifine klonove mogue hibridizacijom izolirati i iz fagnih i iz plazmidnih knjinica gena.

Rekombinantne knjinice mogue je pretraivati razliitim sondama. Primjerice cDNA klon mogue je koristiti kao sondu za izolaciju odgovarajuega genomskog klona, a genom kloniranim iz jednog organizma (primjerice mia) mogue je izolirati srodni gen iz neke druge vrste (primjerice ovjeka). Osim izoliranih fragmenata DNA, sonde mogu biti i sintetiki oligonukleotidi to omoguuje izolaciju gena na osnovi djelomino poznatog slijeda aminokiselina u proteinima koje kodiraju. Primjerice, na osnovi djelomino poznatog slijeda aminokiselina u nekom proteinu mogue je sintetizirati oligonukleotide duljine od 15 do 20 baza. Ovim je sondama sad mogue izolirati cDNA klonove koje je (kao to smo ve prikazali) puno lake sekvencirati i karakterizirati nego sam protein. Na ovaj je nain mogue eksperimentalno doi do izoliranoga i kloniranoga gena poevi od svega djelomino poznatog slijeda aminokiselina u proteinu.

Alternativni pristup izolaciji gena poevi od njihova proteinskog produkta je pretraivanje ekspresijskih knjinica pomou specifinih protutijela. U tom se sluaju cDNA knjinica pripravlja u ekspresijskom vektoru koji potie sintezu proteina u E. coli. Bakterijske se kolonije zatim prenose na membranu, a klonovi koji proizvode eljeni protein otkrivaju protutijelima (kao u Western blot metodi).

Prikazane metode za identifikaciju molekularnih klonova i otkrivanje gena i genskih produkata u stanicama oslikavaju fleksibilnost rekombinantne DNA tehnologije. Poevi s nekim kloniranim genom, mogue je ne samo odrediti slijed nukleotida u tom genu i koristiti ga kao sondu za ispitivanje organizacije i prepisivanja gena, ve i eksprimirati protein kojeg taj gen kodira i na njega proizvesti specifina protutijela. S druge strane koristei se oligonukleotidnim sondama ili protutijelima mogue je klonirati gene na osnovi samo djelomino poznate strukture nekoga proteina. Rekombinantnom DNA tehnologijom mogue je eksperimentalnu analizu razvijati ili od DNA prema proteinima, ili od proteina prema DNA to omoguuje veliku fleksibilnost strategija koje se danas primjenjuju za ispitivanje eukariotskih gena i proteina koje oni kodiraju.

3.5. Funkcija gena u eukariotimaTehnologija rekombinantne DNA, prikazana u prethodnim odlomcima, mono je orue za detaljnu karakterizaciju gena eukariotskih genoma. Ipak, za razumijevanje funkcije gena nije dovoljna analiza molekularnih klonova u bakterijama, ve je nuna analiza gena unutar stanica ili cjelovitog organizma. U klasinoj se genetici funkcija gena utvruje na temelju promijenjenog fenotipa mutiranih organizama. Razvoj rekombinantne DNA tehnologije otvorio je novu dimenziju u analizi funkcije gena na taj nain to je omoguio izravnu analizu kloniranoga gena njegovim ponovnim unoenjem u eukariotsku stanicu. Kod jednostavnijih eukariota, kao to su primjerice kvasci, rekombinantna DNA tehnologija omoguila je izolaciju molekularnih klonova koji odgovaraju praktino svakom mutiranom genu. Postoje i tehnike koje omoguujeju unoenje kloniranih gena u ivotinjske i biljne stanice u kulturi, kao i u cjelovite organizme, te njihovu funkcionalnu analizu. Kombinacija ovakvog pristupa sa sposobnou uvoenja mutacija u kloniranu DNA in vitro proiruje mogunosti rekombinantne DNA tehnologije u ispitivanju funkcije eukariotskih gena.

Genetike analize u kvascimaKvasci su posebice pogodni organizmi u istrazivanjima molekularne biologije eukariota (vidi Poglavlje 1). Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae sastoji se od priblino 1,2 107 parova baza i 200 je puta manji od genoma ovjeka. Kvasce je lagano uzgajati u kulturi gdje se udvostruuju priblino svaka 2 sata, te nam stoga kvasci pruaju neke od temeljnih prednosti koje pruaju i bakterije (mali genom i brzo razmnoavanje).

Mutacije je u kvascima jednako lako otkriti kao i u E. coli. Primjerice, lako je izolirati mutante kvasaca koje zahtijevaju odreenu aminokiselinu ili neki drugi hranidbeni nadomjestak u podlozi na kojoj rastu. Osim toga, kvasce s pogrekama u genima potrebnim za temeljne stanine procese (za razliku od metabolikih pogreaka) mogue je izolirati kao mutante osjetljive na temperaturu. Takve mutante kodiraju proteine koji su funkcionalni na jednoj temperaturi (permisivna temperatura), ali ne i na nekoj drugoj temperaturi (nepermisivna temperatura), dok normalni kvasci proizvode normalne proteine koji su funkcionalni i na jednoj i na drugoj temperaturi. Kvasac s mutacijom osjetljivom na temperaturu u nekom kljunom genu mogue je otkriti zahvaljujui selektivnom rastu na odreenoj temperaturi. Sposobnost izolacije mutacija osjetljivih na temperaturu omoguila je otkrivanje kvaevih gena koji kontroliraju brojne temeljne stanine procese, kao to je primjerice sinteza i procesiranje RNA, napredovanje kroz stanini ciklus ili transport proteina izmeu staninih odjeljaka.

Razmjerno jednostavna genetika kvasca omoguuje kloniranje gena koji odgovara bilo kojoj mutaciji na osnovi njezine funkcionalne aktivnosti (slika 3.32). U prvom se koraku pripravlja genomska knjinica normalne DNA kvasca u vektorima koji se umnaaju kao plazmidi i u kvascu i u E. coli. Zbog razmjerno maloga genoma kvasca cjelokupna se knjinica sastoji od svega nekoliko tisua plazmida. Mutante kvasca osjetljive na temperaturu zatim se transformiraju smjesom takvih plazmida i izabiru se transformirani kvasci koji su stekli sposobnost rasta na nepermisivnoj temperaturi. Transformirani kvasci sadravaju normalnu kopiju traenoga gena na plazmidnoj DNA koju je zatim jednostavno izolirati u svrhu daljnje karakterizacije.

Na ovaj su nain izolirani geni koji kodiraju razne kljune proteine kvasaca. U mnogim su sluajevima tako izolirani geni kvasaca omoguili identifikaciju i kloniranje srodnih gena iz stanica sisavaca. Dakle, osim to je pruila vaan modelni sustav za ispitivanje eukariotskih stanica, jednostavna genetika kvasaca omoguila je i kloniranje srodnih gena sloenijih eukariota.

Prijenos gena u biljke i ivotinje

Za razliku od stanica kvasaca, stanicama viih eukariota nije mogue genetiki manipulirati na jednostavan nain, no i u njima je mogue ispitivati funkcije gena unoenjem klonirane DNA. Takvi su se eksperimenti (openito ih nazivamo prijenosom gena) pokazali kljunim za ispitivanje brojnih vanih procesa, kao to su primjerice mehanizmi koji reguliraju ekspresiju gena ili procesiranje proteina. Kao to e biti prikazano kasnije u ovoj knjizi, prijenos gena omoguio je otkrivanje i karakterizaciju gena koji kontroliraju rast i diferencijaciju ivotinjskih stanica, ukljuujui brojne gene odgovorne za nenormalni rast tumorskih stanica.

Metodologija unosa DNA u ivotinjske stanice prvo je razvijena za unos infektivne virusne DNA i stoga se esto naziva transfekcija (rije izvedena iz pojmova transformacija + infekcija) (slika 3.33). DNA je u ivotinjsku stanicu u kulturi mogue unijeti na vie naina. Primjerice, izravnom mikroinjekcijom u jezgru stanice, koprecipitacijom DNA s kalcijevim fosfatom u sitne estice koje spontano ulaze u stanice, ugradnjom DNA u lipidne vezikule (liposome) koji se spajaju sa staninom membranom, ili izlaganjem stanica kratkim elektrinim pulsevima koji privremeno otvaraju pore u staninoj membrani (elektroporacija). Strana DNA se na taj nain moe unijeti u velik broj stanica i prenijeti u jezgru gdje e se prepisivati tijekom sljedeih nekoliko dana fenomen koji nazivamo prolazna ekspresija. U manjem broju stanica (obino 1% ili manje) strana DNA se stabilno ugrauje u stanini genom i pri diobi stanica prenosi se na stanice keri ba kao i bilo koji drugi stanini gen. Stabilno transformirane stanice mogue je odabrati ukoliko transfektirana DNA sadrava biljeg za selekciju, primjerice gen za rezistenciju na inhibitor rasta normalnih stanica. Zajedno s genom za rezistenciju na inhibitor, u stanice je mogue unijeti bilo koji klonirani gen te analizirati njegov uinak na ponaanje stanica, primjerice na rast ili diferencijaciju.

Kao vektore za unos klonirane DNA u stanice mogue je koristiti i ivotinjske viruse. Posebice su pogodni retrovirusi jer njihov normalni ivotni ciklus ukljuuje stabilnu integraciju virusnoga genoma u genom inficiranih stanica (slika 3.34). Retrovirusi se mogu koristiti za uinkovit unos kloniranih gena u razliite tipove stanica, to ih ini znaajnim vektorom sa irokim rasponom primjene.

Klonirane je gene mogue unijeti i u matine linije viestaninih organizama to omoguuje njihovo ispitivanje in vivo, a ne samo u kulturi stanica. Jedna od metoda je izravna mikroinjekcija klonirane DNA u pronukleus oploene jajne stanice, a koristi se za stvaranje mieva koji nose strane gene (transgeninih mieva) (slika 3.35). Injektirana se jajna stanica prenosi u surogat majku gdje se razvija sve do okota. U oko 10% okoenih mieva strana e se DNA ugraditi u genom oploene jajne stanice i stoga e biti prisutna u svim stanicama u organizmu. Budui da je strana DNA prisutna i u spolnim stanicama tih ivotinja, daljnjim razmnoavanjem prenijet e se na potomstvo ba kao i svaki drugi gen.

Karakteristike embrionalnih matinih (EM) stanica omoguuju alternativni pristup unoenja kloniranih gena u mia (slika 3.36). EM stanice mogue je uvesti u kulturu iz ranih mijih embrija, a zatim ih ponovo vratiti u rani miji embrio gdje e normalno sudjelovati u razvoju i diferencirati se u stanice bilo kojeg tkiva mia, ukljuujui i spolne stanice. Ovaj pristup omoguuje da u EM stanice u kulturi unesemo kloniranu DNA, te izaberemo one stanice koje su se stabilno transformirale i unesemo ih u mije embrije. Takvi embriji razvit e se u kimerne ivotinje u kojima e neke stanice potjecati od normalnih embrionalnih stanica, a neke od transfektiranih EM stanica. U nekim od tih mieva transfektirane EM stanice razvit e se u spolne stanice, pa e se njihovim daljnjim razmnoavanjem transfektirani gen izravno prenositi na potomstvo.

Kloniranu DNA mogue je unijeti i u biljne stanice na razliite naine. Jedan pristup je unoenje DNA u protoplaste elektroporacijom na isti nain kako je opisano za ivotinjske stanice. Meutim, pri tome je neophodno prvo ukloniti staninu stijenku kako bismo dobili stanicu obavijenu samo staninom membranom (protoplast). Alternativno, DNA moe biti izravno unesena u intaktne biljne stanice bombardiranjem stanica mikroprojektilima oko kojih je omotana DNA, primjerice malim esticama tungstena. Neke od tih stanica umiru, no ostale preivljavaju i postaju stabilno transformirane.

Biljni virusi iskoriteni su kao vektori za uinkovit unos rekombinantne DNA u razliite biljke i biljne stanice. Najpoznatiji takav vektor izveden je iz plazmida prisutnog u bakteriji Agrobacterium tumefaciens (Ti plazmid) (slika 3.37). U prirodi se Agrobacterium privruje za lie biljaka, a Ti plazmid se prenosi u biljne stanice gdje se ugrauje u kromosomsku DNA, to vektore izvedene iz Ti plazmida ini jako uinkovitim za unoenje rekombinantne DNA u osjetljive biljne stanice. Kako je mnoge biljke mogue regenerirati iz pojedinanih stanica u kulturi (vidi Poglavlje 1), transgenine je biljke mogue izravno razviti iz stanica u koje je rekombinantna DNA unesena u kulturi to je daleko jednostavnije od proizvodnje transgeninih ivotinja.

Mutageneza klonirane DNA

U klasinim je genetikim ispitivanjima, koja koriste bakterije ili kvasce kao modele, promatranje promijenjenog fenotipa mutiranih organizama klju za otkrivanje gena i razumijevanje njihove uloge. Naime, mutirani geni otkrivaju se tako jer za posljedicu imaju vidljivu promjenu fenotipa, primjerice rast osjetljiv na temperaturu ili odreene hranidbene potrebe. Mogunost izolacije gena rekombinantnom DNA tehnologijom otvorila je novi pristup mutagenezi. Danas je mogue unijeti bilo koju promjenu u klonirani gen i ispitati uinke te mutacije na funkciju gena. Takav je postupak nazvan obrnutom genetikom jer se prvo odreena mutacija unosi u gen, a zatim se promatraju promjene fenotipa. Mogunost unoenja specifinih mutacija u kloniranu DNA (in vitro mutageneza) pokazala se znaajnim oruem za ispitivanje ekspresije i funkcije eukariotskih gena.

Klonirane gene mogue je promijeniti razliitim postupcima in vitro mutageneze, a rezultat su delecije, insercije ili zamjene pojedinih nukleotida. Uobiajena metoda mutageneze je koritenje sintetikih oligonukleotida za uvoenje promjena u molekulu DNA (slika 3.38). U ovoj se metodi sintetiki oligonukleotidi koji nose mutiranu bazu koriste kao poetnice za sintezu DNA. Novosintetiziranu DNA koja sadrava mutaciju mogue je zatim izolirati i karakterizirati. Primjerice, mogue je promijeniti pojedine aminokiseline u proteinu kako bi se ispitala njihova uloga u funkciji proteina.

Pomou opisane metode i njezinih varijacija, te zahvaljujui rekombinantnoj DNA tehnologiji mogue je unijeti praktino bilo kakvu promjenu u klonirani gen. Uinke mutacija na ekspresiju i funkciju gena mogue je zatim analizirati unoenjem promijenjenoga gena u odgovarajue stanice. In vitro mutageneza omoguila je detaljno ispitivanje funkcije kodirajuih, ali i regulatornih podruja kloniranih gena.

Unoenje mutacija u stanine gene

Iako je prijenos kloniranih gena u stanice (posebice u kombinaciji s in vitro mutagenezom) mono orue za ispitivanje strukture i funkcije gena, takvim eksperimentalnim pristupom nije mogue odrediti ulogu nepoznatoga gena u stanici ili odreenom organizmu. Stanica s unesenim kloniranim genom najee jo uvijek sadrava i normalnu kopiju toga gena u svojoj kromosomskoj DNA, koja nastavlja obavljati svoju normalnu ulogu u stanici. Zbog toga je potrebno prvo ukloniti aktivnost normalne stanine kopije odreenoga gena da bismo shvatili bioloku ulogu kloniranoga mutiranoga gena. Kao to je prikazano u sljedeem odlomku, ovaj je postupak razmjerno jednostavno provesti u kvascima. Iako znaajno kompliciranije, danas je mogue na nekoliko naina i u ivotinjskim stanicama inaktivirati kromosomske kopije kloniranoga gena, ili onemoguiti njihovo normalno funkcioniranje.

Unoenje mutacija u gene kvasca razmjerno je jednostavno jer se unesena DNA sekvenca esto zamjenjuje s normalnom kromosomskom kopijom mehanizmom homologne rekombinacije (slika 3.39). Na taj se nain klonirani gen, u koji smo in vitro unijeli odreenu mutaciju, ugrauje u kromosom na mjesto normalnog alela te postaje dio normalne kromosomske kopije gena kvasca. U najjednostavnijem sluaju klonirani gen inaktiviramo mutacijom tako da onemoguimo njegovu normalnu funkciju, te ga unosimo na mjesto normalnoga gena u kromosom kvasca kako bismo utvrdili njegovu ulogu u staninim procesima. Na ovaj nain mogue je inaktivirati i ispitivati ak i one gene koji su nuni za rast stanica, jer se kvaev ivotni ciklus sastoji od haploidnog i diploidnog stadija. Naime, neaktivna kopija gena unosi se u diploidne stanice koje onda sadravaju jednu funkcionalnu i jednu neaktivnu kopiju ciljnog gena. Stanice se tad potaknu na mejotiku diobu, a uinci inaktivacije toga gena promatraju se na haploidnom potomstvu.

Rekombinacija izmeu strane DNA i homolognoga kromosomskoga gena vrlo je rijetka u stanicama sisavaca, te je inaktivacija gena ovim pristupom daleko tea nego u kvascima. Veina transfektirane DNA ugradi se u genom stanica primateljica nasuminom rekombinacijom s nesrodnim sekvencama. Ovaj se problem pojavljuje vjerojatno zbog toga to su genomi stanica sisavaca daleko vei od genoma kvasca. Danas su razvijene razliite metode koje poveavaju uestalost homologne rekombinacije u genomima sisavaca, te uspjenost selekcije i izolacije stanica u kojima je dolo do homologne rekombinacije. Vano je da je gene mogue inaktivirati ne samo u somatskim, ve i u linijama embrionalnih matinih stanica u kulturi. Pomou EM stanica mogue je proizvesti transgenine mieve, pa se u tom sluaju uinak inaktivacije gena ispituje u kontekstu organizma, a ne samo pojedinanih stanica. Na taj su nain ispitane funkcije stotina mijih gena, to je bilo posebice znaajno za razumijevanje uloge specifinih gena tijekom razvoja mia.

Alternativni pristup inaktivaciji gena homolognom rekombinacijom je blokiranje ekspresije gena protusmislenim nukleinskim kiselinama (slika 3.40). Ovim pristupom protusmislena RNA ili jednolanana DNA koja je komplementarna molekuli mRNA gena koji nas zanima (protusmislena) unosi se u stanicu. Protusmislena RNA ili DNA hibridizira s mRNA i blokira njezino prevoenje u proteine. tovie, RNA-DNA hibridi koji nastaju zbog unoenja protusmislene DNA molekule najee se brzo razgrauju u stanici. Protusmislene RNA mogu se mikroinjekcijom izravno unijeti u stanicu. Jo jedan od naina je da stanice transfektiramo vektorima koji su dizajnirani da eksprimiraju protusmislenu RNA. Protusmislena DNA obino je u obliku kratkih oligonukleotida (duljine oko 20 baza) koji se mikroinjektiraju u stanice. Budui da stanice i spontano unose sline oligonukleotide iz staninog medija, protusmislene je oligonukleotide mogue jednostavno dodati u kulturu stanica.

RNA interferencija (RNAi) je dodatan vrlo uinkovit nain za ometanje ekspresije gena na razini mRNA (slika 3.41). Tijekom RNA interferencije kratke dvolanane RNA molekule (21 do 23 oligonukleotida) potiu razgradnju komplementarne mRNA. Iako mehanizam na koji dvolanana RNA potie razgradnju ciljne mRNA jo uvijek nije potpuno razjanjen, pretpostavlja se da ukljuuje djelovanje ribonukleaze koja se povezuje s dvolananom RNA te se zatim na osnovi komplementarnog sparivanja baza usmjerava na ciljnu mRNA. RNAi je prvo uvedena za uinkovito poticanje razgradnje mRNA u obliu Caenorhabditis elegans. Kasnije je njezina primjena proirena na vonu muicu (Drosophila melanogaster) i uronjak (Aradopsis thaliana), a nedavno i na stanice sisavaca.

Osim inaktiviranja gena ili poticanja razgradnje mRNA, ponekad je mogue izravno ometati funkciju proteina u stanicama (slika 3.42). Jedan od naina je mikroinjektiranje protutijela koja specifino blokiraju aktivnost odreenog proteina. Alternativno, odreeni mutirani proteini mogu ometati funkciju normalnih kopija ukoliko su eksprimirani u istoj stanici, primjerice kompeticijom s normalnim proteinom za vezanje na ciljnu molekulu. Kloniranu DNA, koja kodira takve mutirane proteine (nazivamo ih dominantni inhibirajui mutanti), mogue je unijeti u stanice prijenosom gena u svrhu ispitivanje uinka blokiranja funkcije normalnoga gena.

KLJUNI POJMOVISAETAK

NASLJEIVANJE, GENI I DNA

gen, alel, dominantnan, recesivan, genotip, fenotip, kromosom, diploidan, mejoza, haploidan, mutacijaGeni i kromosomi: Kromosomi su nositelji gena

hipoteza jedan gen jedan enzimGeni i enzimi: Gen odreuje slijed aminokiselina u polipeptidnom lancu

transformacijaIdentifikacija DNA kao genetikog materijala: DNA je identificirana kao genetiki materijal eksperimentima s transformacijom bakterija

Struktura DNA: DNA je dvostruka uzvojnica u kojoj se stvaraju vodikove veze izmeu purina i pirimidina u nasuprotnim lancima. Zbog specifinog sparivanja baza (A T, G C) dva su lanca molekule DNA komplementarna u slijedu nukleotida

semikonzervativna replikacija, DNA-polimerazaReplikacija DNA: DNA se udvostruuje semikonzervativnom replikacijom u kojoj se dva lanca razdvajaju i svaki slui kao kalup za sintezu novoga lanca

EKSPRESIJA GENETIKE INFORMACIJE

Kolinearnost gena i proteina: Redoslijedom nukleotida u DNA odreen je slijed aminokiselina u proteinu

sredinja dogma, prepisivanje, prevoenje, glasnika RNA (mRNA), RNA-polimeraza, ribosomska RNA (rRNA), transportna RNA (tRNA)Uloga glasnike RNA: Glasnika RNA djeluje kao posrednik koji prenosi informaciju s DNA na ribosome gdje slui kao kalup za sintezu proteina.

genetiki kod, prevoenje in vitro, kodonGenetiki kod: Transportna RNA slui kao adaptor izmeu aminokiselina i mRNA tijekom prevoenja. Svaka je aminokiselina odreena kodonom koji se sastoji od tri nukleotida.

retrovirus, obrnuto prepisivanje, reverzna-transkriptazaRNA virusi i obrnuto prepisivanje: DNA je mogue sintetizirati na osnovi RNA kalupa to je prvo otkriveno kod retrovirusa.

REKOMBINANTNA DNA

restrikcijske endonukleaze, gel-elektroforeza, restrikcijska kartaRestrikcijske endonukleaze: Restrikcijske endonukleaze kidaju DNA na odreenim sekvencama ime nastaju fragmenti DNA definirane veliine.

molekularno kloniranje, vektor, rekombinantna molekula, molekularni klon, DNA ligaza, cDNAProizvodnja rekombinantnih molekula DNA: Rekombinantna molekula DNA sastoji se od eljenoga fragmenta DNA ugraenog u vektor koji se moe neovisno umnaati u odgovarajuoj stanici domainu

plazmid, ishodite replikacije, kozmid, P1 umjetni kromosom (PAC), bakterijski umjetni kromosom (BAC), umjetni kromosom kvasca (YAC)Vektori za rekombinantnu DNA: Za kloniranje fragmenata DNA razliite veliine koriste se razliiti vektori.

dideoksinukleotid, autoradiografijaSekvenciranje DNA: U kloniranom fragmentu DNA mogue je odrediti slijed nukleotida.

ekspresijski vektor, bakulovirusEkspresija kloniranih gena: Proteine koje kodiraju klonirani geni mogue je sintetizirati u velikim koliinama u bakterijama ili eukariotskim stanicama.

lanana reakcija polimeraze (PCR)Umnoavanje DNA lananom reakcijom polimeraze: PCR omoguuje in vitro umnaanje i izolaciju specifinih DNA fragmenata

DETEKCIJA NUKLEINSKIH KISELINA I PROTEINA

hibridizacija nukleinskih kiselina, sonda, Southern blot, Northern blot, DNA mikroip, hibridizacija in situHibridizacija nukleinskih kiselina: Hibridizacija nukleinskih kiselina omoguuje detekciju specifinih molekula DNA ili RNA.

Detekcija malih koliina DNA ili RNA lananom reakcijom polimeraze: PCR je osjetljiva metoda za detekciju malih koliina specifinih molekula DNA ili RNA.

protutijelo, antigen, monoklonsko protutijelo, imunoblot, Western blot, imunoprecipitacija, SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza (SDS-PAGE)Protutijela kao sonde za proteine: Protutijela koristimo za detekciju specifinih proteina u stanicama ili staninim ekstraktima.

knjinica rekombinantne DNA, genomska knjinica, knjinica cDNASonde za pretraivanje knjinica rekombinantne DNA: Specifine rekombinantne molekule DNA pronalazimo u knjinicama rekombinantne DNA uz pomo hibridizacije nukleinskih kiselina ili protutijela.

FUNKCIJA GENA U EUKARIOTIMA

mutanta osjetljiva na temperaturuGenetike analize u kvascima: Jednostavna genetika i brzo razmnoavanje kvasca omoguuju molekularno kloniranje gena koji odgovaraju bilo kojoj mutaciji u kvascu.

prijenos gena, transfekcija, prolazna ekspresija, liposom, elektroporacija, transgenini mi, embrionalne matine (EM) stanice, Ti plazmidPrijenos gena u biljke i ivotinje: Klonirane gene mogue je unijeti u stanice viih eukariota i viestanine organizme radi funkcionalne analize.

obrnuta genetika, in vitro mutagenezaMutageneza klonirane DNA: In vitro mutagenezu klonirane DNA koristimo za ispitivanje uinka odreenih mutacija na funkciju gena.

homologna rekombinacija, protusmislene nukleinske kiseline, RNA interferencija (RNAi), dominantni inhibitorni mutantUnoenje mutacija u stanine gene: Mutacije je mogue unijeti u kromosomske gene homolognom rekombinacijom s kloniranom DNA. Osim toga, ekspresiju ili funkciju specifinih genskih produkata mogue je blokirati protusmislenim nukleinskim kiselinama, RNA interferencijom ili dominantnim inhibitornim mutantama.

Pitanja1. Definirajte pojam prevoenje (translacija) u kontekstu molekularne biologije.

2. to je sve potrebno za provoenje sinteze proteina in vitro?

3. Kako je provedeno prvo povezivanje nekog kodona s aminokiselinom koju taj protein oznauje?

4. Na to mislimo kada kaemo da je genetiki kod degeneriran?

5. Objasnite zato adicija ili delecija jednoga ili dva nukleotida u kodirajuem dijelu gena rezultira nefunkcionalnim proteinom, a adicija ili delecija tri nukleotida esto rezultira proteinom koji zadrava normalnu funkciju.

6. Objasnite koja svojstva mora imati umjetni kromosom kvasca da bismo pomou njega u kvascu mogli klonirati dio humane DNA izrezane pomou EcoR1.

7. Zato je lanana reakcija polimeraze (PCR) vrlo korisna tehnika u molekularnoj biologiji?

8. Kakva je razlika izmeu genomske i cDNA knjinice?

9. Ispitujete enzim u kojem je cistein u aktivnom mjestu kodiran tripletom UGU. Kakav e utjecaj na enzimsku aktivnost imati mutacija tree baze u C, a kakav mutacija iste te baze u A?

10. Razgradnja molekule DNA velike 4 kB s EcoR1 daje dva fragmenta; jedan od 1 kb i jedan od 3 kb. Razgradnja iste molekule s HindIII daje fragmente od 1,5 i 2,5 kb. Razgradnja s kombinacijom enzima EcoR1 i HindIII daje fragmente od 0,5 kb, 1 kb i 2,5 kb. Nacrtajte restrikcijsku kartu toga fragmenta (DNA molekule) i unesite poloaje mjesta prepoznavanja za EcoRI i HindIII.

11. Koliko e kopija nekoga gena nastati nakon 10 i 30 ciklusa umnoavanja lananom reakcijom polimeraze ukoliko reakciju zaponemo s molekulom DNA iz jednog jedinog spermija?

12. Klonirali ste cDNA nepoznate funkcije. Na koji nain moete eksperimentalno utvrditi unutarstanini smjetaj proteina to ga kodira ta cDNA?

13. elite odrediti koje su aminokiseline vane za katalitiku aktivnost nekog enzima. Pretpostavivi da vam je na raspolaganju cDNA klon, predloite eksperimentalnu strategiju koju biste primijenili.

Literaturni navodi i dodatna literatura

Kljuni pokus

Pretpostavka DNA provirusa

"Nature of the Provirus of Rous Sarcoma"

Howard M. Temin

McArdle Laboratory, University of Wisconsin, Madison, WI

National Cancer Institute Monographs, Vol 17, 1964, pages 557-570

Kontekst

Rousov sarkoma virus (RSV) prvi je opisani virus koji moe uzrokovati tumore, te je posluio kao eksperimentalni model za istraivanje molekularne biologije tumora. Howard Temin ukljuio se u istraivanje ovog podruja kada je