3^ SESSIONE

Aspetti di tossicologia forense

Le analisi chimiche e tossicologiche

Prof. Letizia Antonilli

Laboratorio Sezione di Farmaco-Tossicologia

UOC Patologia Clinica

Umberto I Policlinico di Roma - «Sapienza» Università di Roma

Summary

• Analisi chimico-tossicologiche e loro ruolo nel

percorso diagnostico clinico e medico legale

• Procedure di accertamento implicazioni ed

applicazioni

• Parametri di laboratorio

L’analisi chimico-tossicologica

• L’analisi tossicologica è una parte essenziale nel processo diagnostico clinico e medico

legale essendo mirata a ricercare l’evidenza della presenza di sostanze psicoattive nei

fluidi biologici

• Metodi analitici con elevato potere identificativo sono necessari al fine di poter

ottenere più informazioni possibili da una singola analisi

• Le conseguenze penali che possono derivare dai risultati provenienti dal laboratorio si

traducono nella necessità di ottenere un dato analitico altamente attendibile

• Il laboratorio analitico deve seguire linee guida nazionali e/o internazionali nonché

avere misure di verifica e accreditamento esterno

• Le linee guida internazionali specificano che nel caso di analisi finalizzate a scopi

medico-legali, le fasi analitiche previste siano fondamentalmente due, basate ciascuna

su principi chimico-fisici differenti cioè “ortogonali” tra loro

Obiettivo dell’indagine analitica

Ottenere da un dato scientifico tutte le informazioni utili per

supportare correttamente il processo diagnostico clinico e medico

legale.

Particolare attenzione deve essere posta:

alla validità e al controllo delle procedure operative

ai criteri di scelta dei metodi di analisi

alla valenza diagnostica e agli eventuali aspetti di natura

medico-legale correlati alla gestione del risultato

analitico

4

5

• Quali sostanze / gruppo di sostanze si

vogliono ricercare

• In quali concentrazioni sono presenti

nella matrice biologica

A quale periodo di tempo si può

riferire l’esposizione

Tipo di matrice

Tipo di procedura

analitica

Quali informazioni dovrebbe fornire l’analisi

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Scelta della matrice biologica

SOSTANZA TEMPO

MDMA (ecstasy) 30 -48 ore

Metamfetamina 48 ore

Cocaina 6-8 ore

Benzoilecgonina 48-72 ore

Cocaetilene > 20 ore

Morfina 24 ore

Codeina 24 ore

6 monoacetil morfina (6-MAM) 2-4 ore

Morfina glucuronidi 48 ore

Buprenorfina 48-46 ore

∆ -9-tetraidrocannabinolo

Uso saltuario - moderato 3 – 4 giorni

Uso giornaliero 10 giorni

Uso cronico fino a 36 giorni

Fenciclidina 8 giorni

Ketamina 72 ore

Intervallo di rilevabilità nelle urine

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Fasi dell’indagine analitica analitica

Richiesta di analisi

Campione biologico

Sangue

Urina

Capelli

Saliva

Metodi analitici

Interpretazione del risultato

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La richiesta di analisi

Dati del richiedente

Dati dell’utente

Data, ora e firma di chi effettua il prelievo

Elementi circostanziali (terapia in atto, esposizione attuale

o pregressa a farmaci o a sostanze d’abuso, segni

sintomatologici ….)

Finalità dell’analisi

Documentazione allegata : consenso informato

catena di custodia

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Metodi Immunochimici

Metodi sensibili

Individuano le classi di sostanze : specificità non assoluta

L’anticorpo può cross-reagire con molecole strutturalmente

correlate con l’analita di interesse

Altre sostanze esogene o componenti della matrice possono

interferire con il segnale analitico

Non richiedono un pretrattamento del campione: semplicità

operativa e rapidità di esecuzione

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Principio della reazione antigene-anticorpo

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Y

EROINA

MORFINA

CODEINA

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SOSTANZA AGENTE

INTERFERENTE

RISULTATO CAUSA

Oppiacei Fluorochinolonici Falso positivo Interferenza

Rifampicina Falso positivo Interferenza

Metadone Verapamil Falso positivo Non identificata

FANS Falso positivo Interferenza

Cannabinoidi Ibuprofene,Naproxene Falso positivo Interferenza

Cocaina Salicilati Falso negativo Interferenza

Amfetamine Efedrina Falso positivo Cross-reattività

Norpseudoefedrina Falso positivo Cross-reattività

Clorpromazina Falso positivo Interferenza

Statine Falso positivo Interferenza

Interferenze e Reattività crociata

• nessuna tecnica di screening è in grado di rilevare tutte le

sostanze xenobiotiche di interesse medico-legale, quindi a

seconda delle singole esigenze è necessario utilizzare più

metodi analitici.

• «NON PUO’ AVERE VALIDITA’ FORENSE UN

RISULTATO POSITIVO OTTENUTO ATTRAVERSO

UN’ANALISI DI SCREENING. E’ PERTANTO

INDISPENSABILE CHE TALE RISULTATO SIA

VERIFICATO MEDIANTE UN’ANALISI DI

CONFERMA» *

*

Analisi di conferma: Metodi cromatografici

• Sensibilità: elevata

• Specificità: elevata – molto elevata

• Richiedono l’isolamento degli analiti dalla matrice

• Determinazione quantitativa : precisa ed accurata

• Tempi di esecuzione maggiori rispetto ai metodi

immunochimici

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Cromatografia Liquida ad Elevata Prestazione (HPLC)

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COLONNA

SOLVENTE

POMPA

INIETTORE

DETECTOR

RECORDER

CR

OM

ATO

GR

AM

MA

Tempo di ritenzione (min)

Are

a

A,B,C

A

BC

A

BC

nm

C

B

AU

campioni standards

solvente

CBA

Fronte del

solvente

standard

sample

AU

Rf

Cromatografia su strato sottile ad alta prestazione (HPTLC)

A

Spettrometria di massa tandem

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Cocaina

304 (m/z)

82 (m/z)

182 (m/z)

+

Cosa ci dice la spettrometria di massa?

le sostanze sono identificate in base al loro pesomolecolare e ai frammenti chimici che si originanoper impatto con elettroni prodotti ad alta velocità

Si può misurare accuratamente il peso molecolare, fino alla quarta cifra decimale

Si possono ottenere per ciascun composto dei profili di frammentazione specifici e che costituiscono la loro inequivocabile impronta digitale

LA SPETTROMETRIA DI MASSA,

ACCOPPIATA AD UNA METODICA

CROMATOGRAFICA, E’ UNIVERSALMENTE

RICONOSCIUTA DALLE ASSOCIAZIONI

SCIENTIFICHE FORENSI COME TECNICA

IDENTIFICATIVA DI ELEZIONE PER LE

ANALISI DI CONFERMA

Parametri di laboratorio

Tutti i metodi analitici sono principalmente

definiti da due variabili :

Sensibilità : capacità del metodo rilevare la minima

concentrazione di analita significativamente diversa dal bianco

Specificità : capacità del metodo di rilevare la presenza

dell’analita, in una miscela complessa, senza subire interferenze

da parte di altri componenti presenti

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Concetto di cut-off

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Limite di concentrazione definito in maniera

convenzionale per:

stabilire la negatività o la positività in un

campione

garantire la confermabilità dei risultati

positivi con tecniche alternative dotate di

maggiore sensibilità e specificità

Quali sostanze

Classe Sostanza

Oppiacei Morfina

Morfina glucuronide

6-Monoacetilmorfina

Codeina

Diidrocodeina

Cocaina metaboliti Cocaina

Benzoilecgonina

Ecgonina metilestere

Cocaetilene

Cannabinoidi Delta-9-THC

Cannabidiolo

Amfetamine ed analoghi Amfetamina

Metamfetamina

MDMA (ecstasy)

MDA

Alcool e metaboliti Etanolo

Etilglucuronide

Ketamina

New drugs : Cannabinoidi sintetici,

Catinoni, preparati erboristici

ecc..

Determinazione dell’alcolemia

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CH3-COHCH3COOH

+

NADH

Alcol deidrogenasi

NAD NAD

CH3-CH2-OH

O

H

H O

H

H O

H

H

O HHO

COOH

C H2

C H3

Aldeide deidrogenasi

Etil-glucuronide

(0.06%)

Metabolismo dell’etanolo

Gas cromatografia dello spazio di testa: determinazione dell’alcolemia

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Analisi di composti volatili anchein tracce

Si inietta in colonna il vapore chesi trova in equilibriotermodinamico con il campioneda analizzare

lavora su una frazione arricchitadelle specie chimiche

Si realizzano così analisi moltoprecise e riproducibili

CONCLUSIONI

Le indagini analitiche per identificare e determinare sostanze stupefacenti in matrici biologiche riguardano diversi settori in

ambito clinico e con implicazioni medico legali

Integrazione tra metodologie analitiche diverse

IMMUNOCHIMICHE CROMATOGRAFICHE

AFFIDABILTA’ DEL DATO DI LABORATORIO

SUPPORTO DEL PERCORSO DIAGNOSTICO CLINICO E MEDICO LEGALE