441.векторная система на основе генома аденовируса птиц celo для доставки и экспрессии гена тимидинкиназы

nJ-S5o9J/ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

ШАШКОВА Елена Викторовна

ВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА НА ОСНОВЕ ГЕНОМА АДЕНОВИРУСА ПТИЦ

CELO ДЛЯ ДОСТАВКИ И ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ТИМИДИНКИНАЗЫ

ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ЧЕЛОВЕКА ТИПА 1

(специальность 03.00. 03. - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2002

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии эукариот ВНИИ

сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Доронин К.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Карягина-Жулина А.С.

доктор ветеринарных наук,

Белоусова Р.В.

Ведущая организация - Институт канцерогенеза РАМН.

Защита диссертации состоится " " 2002 г. в часов на

заседании Диссертационного Совета Д.006.02701 при ВНИИ

сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: г. Москва, ул.

Тимирязевская, д. 42., тел. 211-38-10, факс 977-09-47.

С диссертацией можно ознакомить^- в библиотеке ВНИИ

сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " " 2СС

Ученый секретарь Диссертационного Совета, / кандидат биологических наук f //itx-tcn Меликова С.А.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Одними из перспективных систем доставки. генетической

информации в клетки млекопитающих являются вирусные векторы, которые

используют для проникновения в клетку природный механизм вирусной

инфекции. Наиболее изученными и эффективными вирусными векторами,

обеспечивающими in vivo транзиентную экспрессию доставляемых генов, в

настоящее время являются векторы на основе генома аденовируса человека

типа 5 (Ад5). Данные векторы способны трансдуцировать различные типы

клеток млекопитающих, включая как делящиеся, так и неделящиеся клетки.

В последние годы интенсивно изучается возможность создания

векторных систем на основе генома аденовируса птиц CELO (Michou A.I. et.

al., 1999, Francois A. et al., 2001, Glotzer J.B. et al., 2000, Шмаров М. и соавт.,

2002). Интерес исследователей к данному вирусу как векторной системе

объясняется наличием свойств, позволяющих предположить возможность

разработки эффективной эукариотической векторной системы на основе

генома CELO. В организме человека и млекопитающих отсутствует

предшествующий применению векторов иммунитет к Ад птиц CELO, что

теоретически способно обеспечить продолжительную персистенцию

экспрессии генов, доставляемых векторами CELO. Особенностью вируса

CELO является способность к репликации в эмбрионах кур (Laver W.G. et.

al., 1971). В отличие от трудоемких и относительно низкоэффективных

методик накопления Ад5 в культуре клеток, наращивание векторов в

эмбрионах кур является высокоэффективным процессом. Данная технология

является привлекательной при получении векторов в препаративных

количествах. Положительными характеристиками Ад CELO являются также

большая пакующая емкость и повышенная J физическая стабильность -


вирионов по сравнению с вирионами Ад5 (Laver W.G. et. al., 1971; Cotten M.

et. al., 1993).

В настоящее время показана возможность конструирования

рекомбинантных Ад CELO. Определен регион геномной ДНК вируса CELO,

удаление которого не оказывает влияния на способность CELO к репликации

в культуре клеток гепатомы петуха леггорна LMH (Michou A.-I. et. al, 1999).

Данные векторы на основе генома CELO представляют собой аналог

недефектных по репликации векторов на основе Ад5 с делецией ЕЗ области и

способны к репродукции в культуре клеток LMH и эмбрионах кур. Описаны

также векторы с делецией раннего гена GAJM-1. Репликация такого вектора

CELO может быть комплементирована in trans экспрессией hsp40. (Glotzer

J.B. et. al., 2000). Векторы с делецией гена длинного фибера CELO (Tan P.K.

et. al, 2001) сохраняют способность к репликации в клетках линии LMH и

эмбрионах кур, что позволяет предположить возможность модификаций

данного гена с целью изменения трансдуцирующих свойств векторов на

основе генома CELO. На настоящий момент в литературе отсутствуют

данные о клеточных линиях, способных комплементировать делении генов

CELO, необходимых для репликации вируса. В экспериментах in vitro

показана функциональная активность рекомбинантных вирусов CELO,

экспрессирующих репортерные гены. В научной литературе отсутствуют

данные по результатам использования векторов CELO для доставки

терапевтических генов и определения их функциональной активности как in

vivo, так и in vitro.

В нашей работе мы исследовали данную новую эукариотическую

векторную систему для доставки и экспрессии терапевтического гена

тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1 (HSV-tk) in vitro, в

культурах клеток опухолей, и in vivo, в модели подкожных трансплантатов

меланомы В16 мышам C57BL/6.


Полученные результаты позволяют сделать заключение о

перспективности развития векторной системы на основе Ад птиц CELO. На

основе векторов данного типа возможно получение рекомбинантных вакцин

против инфекционных заболеваний человека и животных. Векторы CELO

также способны найти широкое применение в генной терапии как

альтернативный или дополнительный к Ад5 вектор.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлось конструирование векторов на основе

Ад птиц CELO и Ад5 для доставки и экспрессии in vitro и in vivo

терапевтического гена HSV-tk, а также репортерного гена EGFP,

исследование экспрессии и функциональной активности продуктов

экспрессии в культурах клеток млекопитающих, сравнение in vitro

эффективности доставки и экспрессии HSV-tk векторами на основе CELO и

Ад5, а также изучение функциональной активности полученных

рекомбинантных Ад CELO in vivo, намодели меланомы мышей В16.

Непосредственными задачами данной работы были:

1. Получение рекомбинантных Ад CELO, несущих гены HSV-tk и

EGFP в сайте делеции 41731-43684 п.о. генома CELO под контролем

промотора HCMV.

2. Исследование функциональной активности рекомбинаитного Ад

CELO, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора

HCMV, в культурах клеток опухолей.

3. Получение рекомбинантных Ад на основе генома Ад5, несущих

гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции Е1 области генома Ад5 под

контролем промотора HCMV.

4. Сравнение in vitro, в культурах клеток опухолей функциональной

активности векторов на основе Ад CELO и Ад5, экспрессирующих

ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.

3


5. Исследование in vivo, на модели подкожных трансплантатов

меланомы мышей В16 функциональной активности

рекомбинантного Ад CELO, экспрессирующего ген HSV-tk под

контролем промотора HCMV.

Научная новизна и практическая значимость.

В результате проведенной работы впервые получены данные о

функциональной активности рекомбинантного Ад птиц CELO,

экспрессирующего терапевтический ген тимидинкиназы вируса простого

герпеса человека типа 1 под контролем промотора HCMV, in vitro, в

культурах клеток опухолей человека и мышей. Исследована эффективность

системы HSV-tk/GCV в экспериментах in vitro с использованием вектора на

основе генома CELO.

Впервые проведено in vitro, в культуре клеток аденокарциномы

легкого человека HI299 сравнение цитотоксического действия векторных

систем на основе геномов Ад птиц CELO и Ад человека типа 5,

экспрессирующих ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.

Впервые показан противоопухолевый эффект рекомбинантного Ад

CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV,

in vivo, на модели подкожных трансплантатов меланомы мышей В16.

Полученные результаты демонстрируют возможность использования

Ад птиц CELO в качестве средства доставки и экспрессии целевых генов в

клетках млекопитающих как in vitro, так и in vivo, что подтверждает

целесообразность дальнейшего изучения и развития векторной системы на

основе генома CELO с целью применения в ветеринарии и сельском

хозяйстве в качестве генно-инженерных вакцин, а также в генной терапии

для создания рекомбинантных вирусов CELO, которые в перспективе могут

быть использованы в терапии 'и профилактике различных заболеваний

человека, в том числе - онкологических.

4


Публикации и апробация работы. По материалам диссертации

опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на I и II

молодежных научных конференциях "Биотехнология в растениеводстве,

животноводстве и ветеринарии", ВНИИСБ (Москва, 2001 г., 2002г.), на 10-й

международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-

Петербург, Россия, 2002), Результаты работы доложены и обсуждены на

расширенном заседании лаборатории генной инженерии эукариот ВНИИ СБ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на

121 странице машинописного текста и состоит из введения, глав "Обзор

литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение

результатов", выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 165

библиографических ссылок. Работа иллюстрирована 22 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Материалы и методы исследования. Плазмидные векторы. Для конструирования челночных плазмидных

векторов были проведены последовательные субклонирования генов HSV-tk

и EGFP. Ndel-Sall фрагмент pGT60hTRAIL (Invivogen, США), содержащий

ген HSV-tk, субклонировали в pBluescript II SK (Fermentas, Литва) используя

сайты Smal и EcoRV полилинкера. BamHI-PstI-фрагмент полученной

плазмиды pBssk/TK, содержащий ген HSV-tk без дополнительных

инициаторных кодонов субклонировали в pBluescript II SK, используя сайты

' EcoRV и PstI полилинкера. Экспрессирующий вектор pRc/TK

конструировали субклонированием Notl-HincII фрагмента полученной на

предыдущем этапе плазмиды pBs/TK в Apal и NotI сайты полилинкера

pRc/CMV (Invitrogen, США). Челночный плазимдный вектор pCBEARV/TK

получили субклонированием PvuII-BglII-фрагмента pRc/TK, содержащим

экспрессирующую кассету, в сайт EcoRV в фрагменте генома CELO в 5


челночном векторе pCBEARV (содержащем фрагмент генома вируса CELO

88,8-100 ед.к. с делецией 1954 пар оснований по сайтам EcoRV (95,2-99,7

ед.к.))- PvuII-BglII-фрагмент pRc/TK субклонировали также в Bglll и EcoRV

сайты полилинкера pAElsplA, содержащий левый концевой фрагмент

генома Ад5 (0-16,1 ед.к.) с делецией Е1 области (1-9,8 ед.к.) с полилинкером

в сайте делеции. Таким образом был получен челночный плазмидный вектор

pRW215.

Ген EGFP получили из pEGFP-1 (Clontech, США), используя сайты

Noti и EcoRV, и субклонировали в pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen, США) в

аналогичные сайты полилинкера. Экспрессируюшую кассету по сайтам Bglll

и PvuII из полученного вектора pcEGFP, содержащую ген EGFP под

контролем промотора HCMV, субклонировали в pCBEARV, используя сайт

EcoRV, а также в pAElsplA - в Bglll и EcoR.V сайты полилинкера. Таким

образом были получены челночные плазмидные векторы pRW325 и pRWll,

соответственно.

Клонирования в плазмидных векторах проводили с использованием

стандартных методик (Маниатис Т. и соавт., 1982; Holmes D.S., Quigley M.A.,

1981; Hanahan D., 1983). В.работе использовали лабораторный штамм Е. coli

DH5a. Плазмида pCBE&RV была любезно предоставлена к.б.н. Шмаровым

ММ. (ВНИИ СБ). Плазмида pAElsplA была любезно предоставлена F.

Graham (McMaster University, Канада).

Клеточные линии и трансфекцин. В работе использовали линии

клеток: 293 (клетки эмбриональной почки человека, трансформированные

El-областью Ад5), А549 и Н1299 (клетки аденокарцином легкого человека),

НерЗВ (клетки гепатоклеточной карциномы человека), LMH (клетки

гепатомы петуха леггорна), любезно предоставленные М. Cotten (Institute for

Molecular Pathology, Австрия) и В16 (клетки меланомы мышей), любезно

предоставленные к.б.н. Казанским Д.Б. (Институт канцерогенеза, РАМН).

б


Трансфекции культур клеток проводили методом кальциево-

фосфатной преципитации (Graham F.L., Van der Eb A. J., 1973; Chen C ,

OkayamaH.,1987).

Аденовирусные векторы. В экспериментальной части работы были

использованы Ад птиц CELO (штамм Phelps) и Ад вектор CELO-GFP,

любезно предоставленный к.б.н. Шмаровым М.М. (ВНИИ СБ). Векторы на

основе генома Ад человека типа 5 наращивали в клетках линии 293 (Green

М, Wold W.S.M., 1980), Ад CELO - в SPF эмбрионах кур (Laver W.G. et. al.,

1971).

Рекомбинантные Ад CELO-TK и CELO-EGFP получили методом

гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH при котрансфекции

геномной ДНК аденовируса CELO, обработанной эндонуклеазой рестрикции

Swal, и плазмидными векторами pCBEARV/TK или pRW325, соответственно.

Полученные векторы несут делецию 1954 п.о. области генома CELO по

сайтам EcoRV (41731-43684 п.о.) и вставку экспрессирующих кассет в сайте

делеции. Данные вирусные векторы способны к репродукции в культуре

клеток LMH, а также - в эмбрионах кур. В культурах клеток млекопитающих

вирусы CELO-TK и CELO-EGFP репликационно-дефектны.

Работа по получению Ад вектора CELO-EGFP проводилась совместно

с Д. Ю. Логуновым (ВНИИ СБ).

Рекомбинантные Ад Ad5-EGFP и Ad5-TK получили по методике,

описанной Graham F.L. и Prevec L. (1991) - котрансфекцией культуры клеток

293 плазмидными векторами pRWll или pRW215, соответственно, и

плазмидой pJM17 (любезно предоставленной F. Graham (McMaster

University, Канада), содержащей полный геном делеционного мутанта Ад5

dl309 с концами вирусной ДНК, замкнутыми 0/10'0% и вставкой плазмидной

ДНК в Е1 области. Полученные вирусные векторы несут делецию Е1 области

генома Ад5 (1,0 — 9,8 ед.к.) и вставку экспрессирующей кассеты в сайте

делеции. Данные вирусные векторы способны к репродукции в культуре


клеток 293, стабильно экспрессирующей Е1 область Ад 5 и

комплементирующей функции Е1 белков in trans.

Структуру геномов рекомбинантных вирусов подтверждали

гидролизом сайтспецифическими эндонуклеазами и методом полимеразной

цепной реакции. Дезоксиолигонуклеотиды были синтезированы и любезно

предоставлены ЗАО «СИНТОЛ», Россия.

Исследование цитотоксичности. Исследование цитотоксичности в

экспериментах in vitro проводили с использованием МТТ-теста (Mossman Т.,

1983). Использовали МТТ фирмы "ДиаэМ" (Россия) и ганцикловир фирмы

"F. Hoffman-La Roche Ltd" (Швейцария).

Лабораторные животные и эксперименты in vivo. В работе были

использованы иммунокомпетентные мыши линии C57BL/6, самки, 6-ти

недельного возраста к началу экспериментов.

Для определения функциональной активности рекомбинантного Ад

CELO-TK in vivo мышам подкожно инъецировали клетки сингенной

меланомы В16 в количестве 1x10* клеток/инъекцию. Через 7 дней опухоли

объемом -100 мм3 были инъецированы внутриопухолево буфером PBS

(Sigma) или рекомбинантными вирусами CELO-TK или CELO-GFP (109

БОЕ/инъекцию). CsCl-содержащие препараты вирусов диализовали 1 час

против 1л буфера PBS, содержащего ионы Са2+ и Mg2+ (Sigma, США) перед

проведением инъекций. Было произведено 10 инъекций по схеме: один раз в

день с интервалом между инъекциями в 2 дня. Начиная со второго дня после

первой инъекции половине мышей вводили внутрибрюшинно GCV в дозе 50

мг/кг/день в течение 30 последующих дней. Размер опухолей измеряли с

интервалом в два дня и рассчитывали объем по формуле: длина (мм) X

ширина2 (мм2) х 0,5 (Dethlefsen L.A. et. al., 1968). При достижении

опухолями объема 2500 мм3 мышей умерщвляли. Все группы состояли из 9

мышей.

8


Данную работу проводили совместно с Л.В. Череновой (ВНИИСБ) и

к.б.н. Д.Б. Казанским (Институт канцерогенеза, РАМН).

Статистический анализ. Для оценки статистической значимости

результатов использовали критерий Стьюдента. Значимыми считали Р<0,05.

2. Результаты исследований и их обсуждение. 2.1. Исследование функциональной активности рекомбинантного

Ад CELO-TK in vitro, в культурах клеток опухолей человека и мышей.

В данной работе для изучения вируса CELO в качестве вектора для

доставки и экспрессии терапевтических генов в клетках млекопитающих мы

использовали ген HSV-tk. Продукты фосфорилирования белком HSV-tk

нуклеозидных аналогов, таких как ганцикловир (GCV), в результате

дальнейшего фосфорилирования клеточными киназами приобретают

способность к встраиванию в ДНК, что приводит к ингабированию ДНК-

полимеразь! и прекращению синтеза ДНК, в результате чего в клетке

активируется механизм программируемой клеточной смерти - апоптоз.

Способность HSV-tk вызывать апоптоз в присутствии GCV используется в

исследованиях и клинических испытаниях терапии злокачественных

опухолей (Anderson L.M. et al., 1999; Minemura К. et al., 2000; Todryk S. et al.,

2001). Поскольку мишенями такой системы могут быть только делящиеся

клетки, специфичность к опухолевым клеткам по сравнению с клетками

нормальных тканей обуславливается их статусом наиболее активно

делящихся популяций клеток в организме.

Нами был сконструирован рекомбинантный Ад CELO-TK,

экспрессирующий ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.

Рекомбинантный Ад CELO-EGFP, экспрессирующий репортерный ген EGFP,

был получен для использования в качестве контроля и детекции

трансдукции. Белок EGFP является мутационным вариантом белка GFP, в

9


Векторы на основе генома аденовируса птиц CELO

Сигнал HCMV-поли-А H S V - t k промотор

CELO-TK о о»*. рвяшят~ -шяшшшшшршяшшшшшъ^ршщ юо CELO-EGFP - м » - ^ „-,7 вд.«.

Векторы на основе генома аденовируса человека типа 5

Сигнал HCMV-лоли<-А H S V - t k п Р ° м о т о р

Ad5-TK од.к. ЩШЯИШЯШЯЛ^ЯЯЫШШШШШШШШШШШ' -ВЦ юо ев.*. 1 вд-к. E G F P в>* • « • * •

Ad5-EGFP I 1

Рис. 1. Схема геномов векторов на основе Ад CELO и Ад5, экспрессирующих гены HSV-tk и EGFP.

отличие от которого обладает улучшенными свойствами, облегчающими

детекцию трансдуцированных вектором клеток. Схема геномов

рекомбинантных Ад CELO представлена на рис. 1.

Для определения степени цитотоксичности, проявляемой рекомбинантным Ад CELO-TK в присутствии GCV, мы использовали культуру клеток аденокарциномы легкого человека А549. Вирус CELO-TK способен трансдуцировать клетки данной линии и не способен в них к репликации. Клетки трансдуцировали вирусом CELO-TK с множественностью инфекции 100 БОЕ/клетку. Через сутки после инфекции в культуральную среду добавляли GCV в различных концентрациях. Результаты эксперимента оценивали на день 7 с использованием МТТ- теста (Рис. 2). Рекомбинантный Ад CELO-TK в присутствии GCV вызывал гибель 87-92% опухолевых клеток в зависимости от концентрации GCV. Данные результаты статистически достоверны с Р<0,05.

10


Рис. 2. Ингнбирование роста клеток линии А549 рекомбинантным

вирусом CELO-TK при различных концентрациях ганцикловира

(множественность инфекции 100 БОЕ/клетку).

Применение гена HSV-tk в исследованиях и клинических испытаниях

в области генной терапии опухолей стало возможным благодаря способности

системы HSV-tk/GCV проявлять так называемый "bystander" эффект

("эффект свидетеля"). "Bystander" эффект позволяет повысить эффективность

противоопухолевой генной терапии, поскольку векторные системы не

способны обеспечивать трансдукцию всех клеток опухолей in vivo. Данный

эффект заключается в гибели не только клеток, экспрессирующих

терапевтический ген, но также соседних с ними иегрансдуцированных

и


клеток. Система HSV-tk/GCV проявляет такой эффект и объясняется он

несколькими процессами: распространением токсичных продуктов

фосфорилирования GCV в опухолевой массе через щелевые межклеточные

контакты, индукцией специфического противоопухолевого иммунитета, а

также фагоцитозом апоптотических везикул, содержащих метаболиты GCV

(Freeman S.M. et. al., 1993; Barba D. et. al., 1994; Melcher A. et. al., 1998;

Rubsam L.Z. et. al., 1999).

Для изучения "bystander" эффекта, проявляемого системой CELO-

TK/GCV, мы использовали культуры клеток аденокарцином легкого человека

А549 и HI299, гепатоклеточной карциномы человека НерЗВ и меланомы

мышей В16. Ад CELO не способен к репликации в данных клеточных

культурах. Клетки трансдуцировали векторами CELO-TK или CELO-GFP с

множественностью инфекции 1000 БОЕ/клетку. Трансдуцированные клетки

смешивали с нетрансдуцированными в соотношении 1:1 и рассевали. Через

сутки в культуральную среду добавляли GCV (50 мкг/мл среды). Анализ

цитотоксичности проводили через 7 дней после инфекции с использованием

МТТ-теста. Результаты эксперимента представлены на рис.3.

Ад CELO-TK в присутствии GCV вызывал гибель 92% клеток А549,

80% клеток HI299, 94% клеток НерЗВ и 64% клеток В16. Контрольные

группы аналогичного эффекта не проявляли.

Полученные данные статистически достоверны с Р<0,05 и

подтверждают функциональную активность in vitro и наличие "bystander"

эффекта системы CELO-TK/GCV в исследованных линиях клеток опухолей.

2.2. Сравнение in vitro цитотоксичности системы HSV-tk/GCV при использовании для доставки гена HSV-tk векторов на основе Ад CELO и Ад5.

Наиболее широко исследуемыми и охарактеризованными Ад

векторными системами в настоящее время являются векторы на основе

генома Ад5 человека. Использование таких векторов, экспрессирующих ген

12


А549 (аденокарцинома легкого человека)

Н1299 (аденокарцинома легкого человека)

«Я г"£ **- г^ * &

</ V oV НерЗВ

(гепатоклеточная карцинома человека)

W.

"а

* Г * nw В16

(меланома мышей)

а? юо

.« JET сГ «© J * сР

Рис. 3. Ад CELO-TK проявляет "bystander" эффект в культурах клеток

опухолей человека и мышей. Множественность инфекции эффекторов

1000 БОЕ/клетку. Соотношение эффектор:мишень =1:1.

13


HSV-tk, показало противоопухолевый эффект в моделях опухолей мозга,

простаты, кишечника, меланомы и других (Vandier D. et. al., 2000; Nasu Y. et.

al., 2000; Wildner O., Morris 1С, 2000; Warren P. et. al., 2002). С целью

сравнения in vitro цитотоксического действия HSV-tk/GCV, проявляемого в

случае доставки гена в клетки опухолей векторной системой на основе Ад

птиц CELO с эффектом, достигаемым при использовании вектора на основе

Ад5 человека мы сконструировали рекомбинантные вирусы Ad5-TK и Ad5-

EGFP, экспрессирующие гены HSV-tk и EGFP, соответственно. Схема

геномов данных векторов представлена на рис. 1. Для сравнения

функциональной активности рекомбинантного Ад CELO-TK с

функциональной активностью вектора Ad5-TK мы использовали культуру

клеток аденокарциномы легкого человека Н1299. В клетках данной линии

как векторы CELO, так и векторы на основе генома Ад5 репликационно-

дефектны. Клетки трансдуцировали векторами CELO-TK и Ad5-TK, а также -

используемыми в качестве контрольных - векторами CELO-EGFP и Ad5-

EGFP. Для векторов на основе Ад5 использовали множественности инфекции

10 и 100 БОЕ/клетку, для векторов на основе CELO - 10, 100 и 1000

БОЕ/клетку. После адсорбции векторов трансдуцированные клетки

отмывали, трипсинизировали, смешивали с нетрансдуцированными клетками

в соотношении 1:1 и рассевали. Через сутки в культуральную среду

добавляли GCV в количестве 50 мкг/мл среды. Анализ цитотоксичности

проводили через 6 дней после инфекции с использованием МТТ-теста

(Рис.4). Увеличение множественности инфекции приводило к увеличению

цитотоксичности как Ad5-TK/GCV, так и CELO-TK/GCV систем. При

множественности инфекции 10 БОЕ в группе Ad5-TK/GCV мы наблюдали

ингибирование роста клеток на 56% и на 38% в группе CELO-TK/GCV, при

множественности инфекции 100 БОЕ - на 77% и на 46%, соответственно.

При множественности инфекции 1000 БОЕ CELO-TK в присутствии GCV

вызывал ингибирование роста клеток на 65%. В контрольных группах как в 14


& <& 4* • •& 4* •л® £ 4? <У 4?

в мои о • МОИ 00 • МОИ 000 •GCV-

•МСЯ-10+GCV • MOI-10OK3CV DMOMOOO+GCV • GCV+

Рис. 4. Сравнение цитотоксичности систем CELO-TK/GCV и Ad5-TK/GCV в культуре клеток аденокарциномы легкого человека Н1299 при различных множественностях инфекции (день 6 после трансдукции). Соотношение эффектор:мишень = 1:1. (А. - отсутствие GCV в среде, Б. - 50 мкг/мл среды).

15


отсутствие, так и в присутствии GCV значительного ингибирования роста

клеток не наблюдалось. Полученные результаты статистически достоверны с

Р<0,05 и подтверждают полученные ранее с использованием репортерных

генов данные, показавшие менее эффективный при равных

множественностях инфекции уровень трансдукции клеток млекопитающих

векторами CELO по сравнению с векторами на основе генома Ад5, что

предположительно объясняется пониженной по сравнению с Ад5

аффинностью длинного фибера CELO к первичному рецептору CAR

(coxsackie adenovirus receptor) клеток млекопитающих (Tan Р.К. et. al., 2001;

Шмаров М. и соавт., 2002).

2.3. Исследование функциональной активности вируса CELO-TK

in vivo, в модели опухоли меланомы мышей В16.

Для изучения функциональной активности рекомбинантного Ад

CELO-TK in vivo мы использовали модель опухоли меланомы В16.

Возможность прививания данных опухолей иммунокомпетентным животным

позволяет проявить иммунные реакции, индуцируемые системой HSV-

tk/GCV, и тем самым наиболее полно оценить функциональную активность

исследуемой векторной системы.

С целью определения способности Ад CELO к трансдукции клеток

опухоли В16 in vivo иммунокомпетентным мышам линии C57BL/6 подкожно

инъецировали 106 клеток данной меланомы. Через 14 дней в сформированные

опухоли в течение трех дней вводили рекомбинантный вирус CELO-EGFP в

дозе 109 БОЕ/инъекцию/день в объеме 100 мкл. В качестве отрицательного

контроля использовали инъекции буфера PBS. На 5 день после первой

инъекции вектора срезы опухолей исследовали флюоресцентным

микроскопированием при длине волны УФ-излучения 490 нм. Вектор CELO-

EGFP эффективно трансдуцирует клетки меланомы мышей В16 in vivo, в

области инъекции (Рис. 5).

16


CELO-EGFP БУФЕР

Рис. 5. CELO-EGFP траисдуцирует клетки подкожных трансплантатов меланомы мышей В16.

Основываясь на полученных результатах по наличию

цитотоксичности системы CELO-TK/GCV in vitro в культуре клеток В16 и

способности вектора CELO . трансдуцировать клетки подкожных

трансплантатов меланомы В16 in vivo, мы исследовали способность

рекомбинантного Ад CELO-TK проявлять функциональную активность in vivo, в данной модели опухоли. Подкожные трансплантаты опухоли В16

размером -100 мм3 были инъецированы буфером PBS или рекомбинантными

вирусами CELO-TK или CELO-GFP (109 БОЕ/инъекцию). Мы наблюдали

замедление роста опухолей в группе CELO-TK+GCV по сравнению с

контрольными группами (Рис. 6). Данные статистически достоверны с

Р<0,05. Полученные результаты показывают, что внутриопухолевые

инъекции рекомбинантного вируса CELO-TK с последующим введением

GCV оказывают супрессивное воздействие на рост меланомы В16 in vivo. Кроме этого, вирус CELO-TK в комбинации с GCV продлевал

выживаемостьмышеи в данном эксперименте, тогда как в контрольных

группах подобного эффекта не наблюдалось (Рис.7). Данные статистически

достоверны с Р<0,05.

17


Рис. 6. Внутриопухолевые инъекции CELO-TK в присутствии гаицикловира замедляют рост подкожных трансплантатов меланомы В16 in vivo (день 9 после начала инъекций).

К настоящему времени в научной литературе отсутствуют данные,

показывающие эффект использования векторов CELO, экспрессирующих

целевые гены, как в экспериментах in vitro, так и in vivo. В данной работе для

определения способности вектора CELO, экспрессирующего ген HSV-tk,

проявлять функциональную активность in vivo мы использовали модель

опухолей меланомы мышей В16. Тезультаты, полученные нами in vitro, в

культуре клеток В16, продемонстрировали наличие прямого токсического

действия системы CELO-TK/GCV, а также "bystander" эффекта. Известно,

что in vivo HSV-tk/GCV - индуцируемый "bystander" эффект обычно

неэффективен в тимэктомированных мышах и оказывает временное

ингибирующее действие, если не более 50% инъецированных опухолевых

18


А. - CELO-GFP не оказывает влияния на выживаемость мышей.

л 100 Щ-80"

О 5 а я ш S 3

СО

60 • 40 • 20.

• • 1 • -"•"-Р' П **"р|

* = ? . -»-ci , l l •' I , , 5 10 15 20 25 30

Дни после начала проведения инъекций

PBS PBS+GCV CELO-GFP CELO-GFP+GCV

Б. - CELO-TK в присутствии ганцнкловира продлевает выживаемость мышей

5 10 15 20 25 Дни после начала проведения инъекций

PBS PBS+GCV CELO-TK CELO-TK+GCV

Рис. 7. Внутриопухолевые инъекции CELO-TK в присутствии GCV

продлевают выживаемость животных в модели сингенных подкожных

трансплантатов меланомы В16 мышам линии C57BL/6.

клеток экспресснруют ген HSV-tk (Freeman S.M. et. al., 1993; Colombo B.M.

et. ah, 1995). В иммунокомпётентных мышах может наблюдаться полная

регрессия опухоли даже в том случае если 10-20% клеток экспресснруют

HSV-tk. При этом была продемонстрирована инфильтрация опухолей

клетками иммунной системы (макрофагами, цитотоксическими

лимфоцитами.Т-хелперами) (Gagandeep S. et. al., 1996). В данной работе мы


использовали иммунокомпетентных животных, что обеспечивает

возможность проявления системой CELO-TK/GCV иммунологического

аспекта "bystander" эффекта. Такие условия позволяют наиболее полно

охарактеризовать функциональную активность, проявляемую

рекомбинантным Ад CELO-TK in vivo.

В наших экспериментах внутриопухолевые инъекции вируса CELO-

TK в присутствии GCV вызывали замедление роста сингенных подкожных

трансплантатов опухоли меланомы В16 в иммунокомпетентных мышах

линии C57BL/6. По сравнению с группой, получавшей инъекции буфера, на

девятый день после начала инъекций средний объем опухолей в данной

группе был снижен в 3,3 раза. В контрольных группах, трансдуцированных

вирусом CELO-GFP, как в присутствии, так и в отсутствие GCV подобных

эффектов мы не наблюдали. Относительно животных, инъецированных

буфером, медиана выживаемости мышей в группе CELO-TK+GCV была

увеличена в два раза. Полученные результаты свидетельствуют о проявлении

рекомбинантным вирусом CELO-TK функциональной активности in vivo.

Для использованной в данной работе модели опухоли характерна

сложность получения положительных результатов при различных стратегиях

терапии. Одним из параметров, оказывающих влияние на успех

противоопухолевой терапии в модельных системах, является количество

опухолевых клеток, вводимых в организм лабораторного животного. Такое

влияние объясняется ограниченными способностями иммунной системы

осуществлять иммунологический надзор в организме и контролировать

пролиферацию клеток опухолей (Kelly J.M. et al., 2002). Другим важным

аспектом при использовании иммунокомпетентных животных является

имуногенность опухолей. Использованная в данной работе меланома В16

проявляет низкую иммуногенность (Srivastava P., 2002). При использовании в

качестве . моделей более иммуногенных опухолей и использовании

уменьшенных доз опухолевых клеток, предположительно, возможно 20


достижение более выраженного терапевтического эффекта. Для усиления

противоопухолевого эффекта системы HSV-tk/GCV в настоящее время

исследуют различные подходы. Было показано, что комбинации

определенных генов проявляют синергизм в ингибировании опухолевого

роста. Одновременное использование гена HSV-tk и генов цитокинов, таких

как IL-2, IL-12, GM-CSF, приводит к индукции усиленного иммунного ответа

на клетки опухоли по сравнению с эффектом использования этих генов

самостоятельно. Совместное использование гена HSV-tk с генами

коннексинов также более эффективно ингибирует рост опухолей, что

объясняется увеличением уровня межклеточных коммуникаций, приводящим

к усилению "bystander" эффекта. Также описана комбинация использования

системы HSV-tk/GCV с обработкой опухолей такими веществами, как

гидроксимочевина и протеазы (Boucher P.D. et. al., 2002; Kuriyama N. et. al.,

2001).

Способность векторов на основе генома CELO проявлять

функциональную активность в клетках млекопитающих in vivo указывает на

перспективность изучения данной векторной системы. При этом актуальным

является вопрос об онкогенности вируса CELO. Известно, что данный вирус

способен вызывать образование опухолей у новорожденных хомяков (Sarma

P.S. et. al., 1965). Показано, что продукт ОРС-22 генома СЕШ связывет белок

ретинобластомы pRb, а также белок рЗОО и по аналогии с подобными

функциями Е1А Ад млекопитающих предполагается, что данный белок

может обладать трансформирующей активностью (Lehrmann H., M. Cotten.

1999). В организме взрослых млекопитающих индукции образования

опухолей в результате инфекции вирусом CELO продемонстрировано не

было. На настоящий момент неизвестно, способны ли векторы CELO с

делецией 95,2-99,7 ед.к. генома вызывать опухоли у новорожденных

хомяков. Исследование вопроса об онкогенности векторов на основе генома

2!


CELO не было целью данной работы, но является необходимым условием их

практического использования.

На основании полученных в данной работе результатов можно

сделать вывод о способности векторной системы на основе Ад птиц CELO в

перспективе стать альтернативой существующим векторам на основе Ад

млекопитающих. Кроме этого, возможно использование векторов CELO

дополнительно к векторам на основе Ад млекопитающих. Последовательное

применение таких векторов предположительно способно повысить уровень и

продолжительность экспрессии доставляемого гена (Morral N. et. al„ 1999).

Наличие двух фиберов различной длины в каждой вершине вириона CELO и

возможность удаления гена длинного фибера, не лишающая вирус CELO

способности к репликации в культуре клеток и эмбрионах кур (Tan P.K. et.

al., 2001), предполагает возможность осуществления замены или

модификации данного фибера с целью улучшения трансдуцирующих свойств

векторов на основе CELO.

Теоретически, на основе вируса CELO возможно получение так

называемых "минимальных" векторов, из геномов которых удалены все

вир'усные гены. "Минимальные" векторы CELO предположительно способны

упаковать до 46000 п.о. генетической информации. Высокотехнологичный и

недорогой способ получения препаратов векторов CELO в эмбрионах кур (до

1012 физических частиц/эмбрион) представляет собой важное практическое

преимущество данной векторной системы по сравнению с вирусными

векторами, для наращивания которых используют культуры клеток.

Предположительно, исследуемая нами векторная система на основе

генома Ад птиц CELO способна в будущем найти широкое применение в

генной терапии заболеваний человека, а также для получения

рекомбинантных вакцин против инфекционных заболеваний человека и

животных.

22


ВЫВОДЫ:

1. Получены рекомбинантные Ад CELO, несущие под контролем

промотора HCMV гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции 41731-43684

п.о. области генома CELO, несущественной для репликации вируса

CELO в культуре клеток LMH и куриных эмбрионах.

2. Впервые исследована функциональная активность рекомбинантного

Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора

HCMV в культурах клеток аденокарцином легкого человека А549 и

HI299, гепатоклеточной карциномы человека НерЗВ и меланомы

мышей В16. Впервые показано наличие "bystander" эффекта системы

CELO-TK/GCV в исследованных линиях клеток опухолей.

3. Получены рекомбинантные Ад на основе генома Ад человека типа 5,

несущие гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции Е1 области генома Ад5

под контролем промотора HCMV.

4. Впервые исследована in vitro функциональная активность

рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под

контролем промотора HCMV, в сравнении с функциональной

активностью векторной системы на основе Ад5. Показано, что при

высоких множественностях инфекции эффективность использования

вектора CELO сравнима с эффективностью вектора на основе Ад5.

5. Исследована in vivo функциональная активность рекомбинантного Ад

птиц CELO, экспрессирующего репортерный ген EGFP под контролем

промотора HCMV, на модели меланомы мышей В16.

6. In vivo, на модели сингенных подкожных трансплантатов меланомы

мышей В16 впервые исследована функциональная активность

рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под

контролем промотора HCMV. Показана противоопухолевая активность

Ад вектора CELO-TK, замедление роста опухолей и увеличение

периода выживаемости мышей. 23


Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Черенова Л.В., М.М. Шмаров, Е.В. Шашкова, Д.Ю. Логунов. Разработка

технологии получения, рекомбинантных аденовирусов на основе

аденовируса птиц CELO, несущих целевые гены.// Материалы I

молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве,

животноводстве и ветеринарии", ВНИИСБ, Москва,27 марта,2001, стр.6-7.

2. Шашкова Е.В. Функциональная активность вектора CELO,

экспрессирующего ген тимидинкиназы вируса простого герпеса человека

типа 1. // Материалы II молодежной научной конференции

"Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии",

ВНИИСБ, Москва, 11 апреля, 2002, стр. 9-10.

3. Черенова Л.В., Шашкова Е.В., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М. Генная

терапия рака векторами на основе генома аденовируса птиц CELO. // 10-я

Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 26-

31 мая, 2002, Санкт-Петербург.

4. Шмаров М.М., Л.В. Черенова, Е.В. Шашкова, Д.Ю. Логунов, Л.В.

Верховская, А.В. Капитонов, Г.Л. Неугодова, К.К. Доронин, Б.С.

Народицкий. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса

птиц CELO, несущие гены GFP и IL-2 человека. // Молекулярная генетика,

микробиология и вирусология, 2002, №2, стр. 30-35.

5. Логунов Д.Ю., Л.В. Черенова, М.М. Шмаров, Е.В. Шашкова, Л.В.

Верховская, К.К. Доронин, Б.С. Народицкий. In vitro и in vivo доставка

гена секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (SEAP) в составе

рекомбинантного аденовируса птиц CELO. // Молекулярная генетика,

микробиология и вирусология, 2002, №4, стр. 34-39.

24


Отпечатано с готового оригинал-макета

Объем 1,5 п. А Зак, HSb Тираж 100

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44


Documents

441.векторная система на основе генома аденовируса птиц celo для доставки и экспрессии гена тимидинкиназы