CRISTIANA FILIP

ENZTME $r COENZIME

't

Editurapf,llrAsr.2007

RE F Enn rytt gTm,rT, r F rc r :PROF.DR.COJOCARU DUMITRU - Uniuersitatea,Al.I.Cuza" IasiPROF. DR. NASTAS IA

-GH EO RG HIIA_ U. M. F. " Gr. T. pop a" ragi' PORF.DR. MAGDA BADESCU - IJ.M.F."Gr.T.popa" Iagi

EDtruRAtrnSoseaua Stefan cel Mare nr. 11 lasi -7OO49gf el. lfax:0232-212740e-mail :editurapim@pimcopy.rowww.pimcopy.ro

EDITURA ACREDITATA CNCSIS BUCURESTI66/01.05.2006

Descrierea CIP a Bibliotecii Na{ionale a RomAnieiFILIP, CRISTIANA .I

Enzime 9i coenzime / Filip Cristiana. - Iagi : pIM, 2007Bibliogr.ISBN 978-973-7 16-798-9

577.15

Tehnoredactare computerizatd: Doina R6.$canu

Prefati

Enzimele sunt componente esenliale ale vietii.Fdr5. ele reacliile chimice s-ar desfasura cu o viteza atAt de mici

incAt, probabil, viala nu ar fi sesizabi15..Mai mult, f5re capacitatea 1or de a discerne atat intre structuri

diferite, cdt qi intre structuri asemdndtoare, in mod sigur hoasul ar firegula.

Surprinzdtor enzimele mai dau dovadd qi de capacitate deadaptare la modificirile ce intervin in mediul 1or, celular.

De aceea putem, fard refinere, sI numim aceste molecule,primele molecule inteligente.

Manualul de fali se doreqte a fi un material util in primul rdndstudentilor facultalii de medicinS. cAt qi celor ce studiazd biologia qibiochimia.

Materialul pune accentul pe elementele de cinetic6 ertzirrraticS',a cSlor utilitate practici in proiectarea medicamentelor, este denecontestat. in p1us, cinetica enzimaticd sti la baza in{elegerii regiiriimetabolismelor gi a coreldrii intermetabolice care fac posibildsuslinerea vielii.

Manualul face qi o prezentare a vitamineior care suntcomponente coenzimatice esenlia1e. Rolul lor in activitatea enzimeloreste evidenliat prin prezentared mecanismelor reacliilor la care acesteaparticipd. Importanla cunoqterii metabolismului vitaminelor estejustificatd de faptul cd deficitul lor duce la insta-larea unor afectiunisevere, caracteristice.

Materialul se adreseaze deopotrivd specialigtilor ce lucreazd inlaboratorul clinic, unde aproape toli parametrii biochimici suntdeterminali prin metode enzimatice.

Fere a avea pretenlia de a fi epuizat toate aspectele legate detema abordati, autorul iqi exprimd speranla cd cei interesali vor gasisuficiente informalii gi rdspunsuri referitoare la acest capitol albiochimiei.

in vederea exprimdrii pdrerilor critice qi a eventualeiorcompletdri qi sugestii cu privire 1a conlinutul gi conceplia acestuimaterial, autorul este disponibil la adresa de email:cfr1ip20OO@yahoo.com.

AutorCristiana Filip

CI'PRINS

I. DNZIME

INTRODUCERE

I.1. DEFINITIE

I.2. NOMENCI"{TURA

I.2. 1. Oxidoreductaze

I.2.2. Transleraze

I.2.3. Hidrolaze

I.2.4. Liaze

l.2.5.Immeraze

1.2.6. Ligaze sau sintetaze

I.3. STRUCTURA ENZIMELOR

1.3.1.lzoenzime

I.4. SPECIFICITATE

I,5. MECANISME DE CATALIZA

I.6. CINETICA ENZIMATICA

I.6. 1. Noliuni de cinetic+ generale

I.6.2. Cineticd enzimaticd

I.6.2.1. Cinetica de tip Michaelis-Menten

I. 6.2.2. Ecualia Uneweaver-Burk

I.6.2.3. Inhibilia activit6lii enzimelor

1.6.2.3. 1. Inhibitia reversibild

1.6.2.3.7.7. Inhibitia competitivd

I.6.2.3.1.2. Inhibifia necompetitivd

1.6 .2 .3 .2 . Inhibitia ireversibil6

I.6.3. Medicamente - inhibitori competitivi

L6.4. Cinetica de tip sinusoidal

I.7. REGLAREA ACTIVITATN ENZIMELOR

I.7. 1. Reglarea alostericd

L7. 1. 1. Structura enzimelor alosterice

I.7. 1.2. Funcfionarea enzimelor alosterice

I.7. 1.3. Factorii care regleazS. activitatea enzimelor alosterice

9

11

13

74

t4

74

15

18

79

2T

26

26

29

40

42

42

44

46

48

52

53

J+

58

I

I.7.2. Reglarea cova.lenta

I.7.3. Transformarea pro-enzimelor in enzime activeI.7.4. Reglarea sintezei de enzime

r.8. IMPORTANTA BTOMEDTCALA A ENZTMELORI . 8 . 1 . Utilizarea enzimelor in stabilirea unui diagnosticI.8.2. Utilizarea enzimelor in scop terapeutic

II. COENZIME VITAMINICE

II. 1. VITAMINELE HIDROSOLUBILE

[.1.1. Vitaminei Br $i coenzima tiaminpirofosfatII. 1.2. Vitamina Bz (riboflavina) 9i coenzimele flaviniceII.1.3. Vitamina Ba (piridoxina) qi coenzimele derivateII.1.4. Biotina (vitamina H) qi rolul ei coenzimaticII.1.5. Vitamina pp (niacina) gi coenzimele nicotinamidiceIL 1.6. Acidul pantotenic (vitamina Bx) gi coenzima AIL 1.7. Acidul folic (acidul pteroifgtutamic) qi coenzimelederivate I

II.1.8 Vitamina Brz (cobalamina) qi rolul ei coenzimaticII. 1.9. Vitamina C (acidul ascorbic, factor antiscorbutic)

II. 2. VITAMINE LIPOSOLUBILE

II.2.1. Vitamina A

II.2.2. Vitamina D

IL2.3. Vitaminele E

IL2.4. Vitaminele K qi rolul lor coenzimaticBibliogralie

60

60

oz

OJ

63

68

69

70

77

72

75

77

79

81

83

85

89

90

97

96

101

105

108

I. ENZIME

INTRODUCERE

Existi doud condilii fundamentai.e pentru via!d.: prima ca

entitdlile vii s5. se poate multiplica qi cea de a doua ca acestea si se

poatd hrdni. Nici unul din cele dou5. fenomene nu este posibil fdr5.

enzime deoarece miile de procese care suslin viala ar avea loc cu viteze

imperceptibile in absenla enzimelor. Enzimele au o extraordinard

putere cataliticd qi o mare specificitate, mai mult capacitatea 1or

catalitici poate fl reglati cu multi precizie.

I.1. DEFIMTIE t

Enzimele sunt biocatalizatori care maresc viteza reactiilor

chimice care au 1oc in organism, fdrd a suferi modilicdri structurale,

regS.sindu-se neschimbate 1a sfArqitul reacliei.

Ele catafizeazS. doar reacliile posibile din punct de vedere

termodinamic, prin micgorarea energiei de activare.

Prin energie de activare se inlelege energia necesarS. unei

molecule de substrat, pentru a ajunge intr-o stare inalt energeticd

numitS. stare de ftanzilie, stare favorabild formdrii produsului. Energia

de activare este egal5 cu diferenla dintre energia libera a reactanli1or qi

energia unui compus instabil, inalt energetic ce apare in cursul

formdrii produsului.

Prin substrat se inlelege o moleculd sau un grup de molecule

asupra cdruia actioneazd errzirna.

in reacliile chimice, pentru ca dou6 molecule sa interactionezeele trebuie sd vind in contact (Iig. l). Nu toate ciocnirile sunt inseeficiente in sensul cd, Iie coliziunea nu are loc dupi un unghi favorabil(figl.a), fre nu este suficient de puternicd. pentru a genera produgi dereactie (fig 1.b), Este nevoie ca moleculele si aibd o anumiteincircdturd energeticd incdt ciocnirea sd. fie suficient de putemice casa genereze produqi (fig 1,c.), cu arte cuvinte, existd o bariereenergetica ce trebuie depiqitd pentru ca reactanlii se se transforme inproduqi de reacfie. Aceasti barierd. energetice poarte numeie deenergie de activare Si este notatd G (fig. 2).

GP@ TAi l ) ( - - - - - - - ) ( .@

(y( ,

l.

\

\-./ \--l

\ ",

a r--..,

!^6 -@.o, . ( A) . \

\_/ \

s# ae tranzltie

Fig.1 - In situati e a qi b ciocnir e sunt ineficiente deoarece nu duc raI:t::: t

produqi de reactie;'in situalia c ciocnirea a"Jr," ln"r"rrta "onducend

larormarea acestora

In absenla enzimelor puline molecule (uneori nici una) ausuficientd energie pentru a depdgi aceasta barierd energetice qi a setra'sforma in produgi. Deoarece viteza de reaclie este datd de numdrulde molecule de produs format in unitatea de timp, inseamna cE vitezade reac{ie in absenla enzimelor este micd.

In faz1, gazoasd sau lichid5 moleculeie pot primi suficientdenergie pentru a depdqi aceaste barierd energetici prin cre$terea

G\

u.8 >b) +@

1

presiunii sau temperaturii astfel ca ciocnirile dintre e1e sd devinS.

productive gi sd ducd 1a formarea de compugi.

in organismele vii, moleculele nu pot primi energie in acest mod,

in schimb bariera energetice poate fi micqorati astfel lncAt un numdr

mai mare de molecule sd o poatd depdgi qi sd se transforme in produqi

de reactie. Acest lucru este realizat prin prezenla unor "catalizatori"

speciali qi anume enzimele. in consecinli, cu cat aceastd barierd

energeticl va fi mai micd cu atat un numdr mai mare de molecule vor

atinge starea de tranzilie, vor forma produqi de reaclie, deci viteza de

reaclie va creqte (fig. 2).

Dire ctia dE darfesnrare a reactiei:]

Fig. 2 - Varialia energiei libere funclie de direclia de desfe$urare a reaclieiS)P. Graficul prezinte pe ordonate modilicdrile suferite de energia de activare intimpul reactiei iar pe abscisd schimbdrile chimice progresive suferite de substrat(rupere, formare de legaturi) in cursul transformSrii in produs. G".."r este diferentade energie in cazul reacliei necatalizate, AG."t este diferenla de energie in cazulreacliei catalizate elfzi'lj,atic l2l.

Graficul din figura 2 prezintl, varialia energiei libere {cantitatea

de energie din totalul energiei interne ce poate fl utilizat de o mo1ecul5.

pentru: a forma noi legdturi chimice etc.) in timpul conversiei

substratului in produs de reaclie, in care pe ordonatd este

reprezentate energia liber5 (G), iar pe abscisd direclia de desfS.qurare a

reacliei.

Energia liberd a produsului de reaclie P (G P/ este mult mai mic5.

decAt cea a substratului S (G I , ca atare diferenla de energie dintre

cele doud stdri este negativd, G P - G S < 0, ceea ce din punct de

8

vedere termodinamic indicd. faptul cd reaclia se poate desfdgura indirecfia formirii produsului S) p. Altfel spus, reaclia este posibili dinpunct de vedere termodinamic, independent de pre?.enla oriciruicatalizator. Cu toate acestea, deqi reaclia este posibild., pentru a seputea transforma in produs, substratul S trebuie mai int6i sd. atingd.starea de tranzlfie. ln aceastd stare atet reaclia directd. S)p cat gi ceainverse P)S sunt Ia fel de posibile. Diferenla de energie AG (intreenergia liberi a substratului qi cea a stdrii de tranzilie), cunoscutd. caenergie de activare, reprezintd energia necesari tuturor aranjArilor girearanjdriior structurale pe care Ie suferd substratul pentru a se puteatransforma in produs. Ea are o valoare mare in cazul reaclieinecata-lizate (AG necat). Valoarea mult mai mic5 a lui AG in cazulreactiei cataJizate de enzima (AG cat), indicd faptul ce aceasta ofera oalternativS. prin care toate aceste transformdri se fac mult mai sauuqor. Astfel prin aceasta ,,alternativd."

ieaclia decurge mai rapid, fdrica enzima s5. modifice energiile libere ale substratului sau produsuiui

adicd fdr5. s5. intervind in echilibrul reactiei.

Nu este obligator ca o reaclie chimicd sd decurgi" intr_o singurdetapd S)P, ci poate avea loc printr-o succesiune de reaclii secventiale(etape de reaclie) in care pot 1ua nagtere intermediari ca de ex. ES, Ep(fig. 2). Un intermediar este orice specie chimicd ce apare intr_o cale d.ereaclie cu o viald foarte scurte mai mare decat vibratia moleculard

-1013 sec. Viteza unei astfel de reaclii este data de viteza etapei carenecesitd cea mai mare energie de activare, cu alte cuvinte, de etapa cedecurge ce1 mai incet. Aceasti reacfie poarta numele d.e reactielimitanti de vitezd.

in concluzie viteza de reaclie este invers proporlionale cuenergia de activare.

Enzimele nu fac al.tceva decAt sd micqoreze aceastd energie prinmecalisme speciale care insd nu influenleazd echilibrul chimic a1reactiei.

- : -

I.2. NOMEI{CI"ATUR.A

Fiecare enzimS. are dou5. denumiri:

- o denumire uzualS. prin care sufixul "a25.' este ataqat denumirii

substratului pe care aclioneazd, enzima (ureazd, glucozidazi) sau

acliunii exercitate de aceasta (\ipazd,, peptidazdl.

- o denumire sistematicd care face referire la tipui de reaclie pe

cate enzrrna o cataJizeazd, qi pe baza ceruia aceasta poate fi exact

identificati. S"*l A elov u& ivQ,'ttlu-{t Cr.' i.t-t-t':i:at.t.l)tt*

ia pentru-Enzi-" i Uni.r.rli Interna ""- 'fllonale de rjloc.rumle " J .: .l

stabilit un sistem de clasificare zecirnal.d. care line seama de reaclia ]catlJizate gi d.e natura substratului. in acest sistem fiecare enzimi este I

I

notate cu un numer de cod format din patru cifre, numdr care permite I

identificarea enzimei, a substratului asupra cdruia ac\ioneazd qi a 1'-/ ',/

reactiei catalizate: ;"1'

- prima cifr6 a numirului de cod indicd clasa qi se referd la tipul i

reacliei catalizate.

- a doua cifrd a nurpdrului de cod definegte subclasa gi se referS.

la tipul grupdrii din molecula substratului asupra cdreia ac\ioneazd.

enzirrra.

- a treia cifr5. defineqte subsubclasa qi indicl gruparea

tralsferatd sau natura acceotorului.

- a patra cifri reprezinti numdrul de ordine a enzimei in

subsubclasa resoectivd.

Eabcd\

t t t \

/ / \ numdr de ordine

// \s1asz subclasa subsubclasa

De exemplu enzima

I

10

cu numdrul de cod E 1.1.1.1. esteAlcool:NAD-oxidoreductaza, care catalizeazii dehidrogenarea a_lcooluluietiiic la aceta.ldehidd. Uzual se acceptd acele denumiri ce sunt in acordcu denumirea gtiinlificd ,,Alcool dehidrogenaza,, (ADH).

Funclie de reacfia cata)izate, enzimele se clasiltcd in qase clasemajore fiecare cu numeroase subgrupe:

/ .-0,-"1'- --\,."t (Td:1.-d":tT:,,, cataJizeazd. reacliite de oxido_

reducere; in func{ie de acceptorul de electroni se pot distinge:). dehldrogenaze/ tedtctaze _ transfer5 electronii de la un

substrat la alt substrat (altul decdt oxigenul);.2. ortgenaze - incorporeazd. direct oigenul in substrat;3. oxtdaze - traasferd electronii de la un substrat direct la

oxlgen;

,,.4. peroxidaze - transferA electronii de la substrat la HzOz ca

t.

catalizeazd tralsferul de grupdri

acceptor.

func!ionale substrat (donor) pe alt substrat (acceptor).

2 ,-q l. Transferaze

,E CrtransJerqze - transferd unitali d.e un atom de carbon intresubstrate (exemplu: metil_transferaze) ;

,Kamino-transferaze _ transferd gruparea amlno de pe unaminoacid pe un cetoacid:

.7 . kinqze - tratsfer5 un radical fosfat din ATp pe un substrat;p/. fosforilaze - transferd radicalul fosfat din fosfat anorganic

(Pa) pe un substrat.--*--_

3 4 iiaroU.. ) catahzeaz|, scindarea legdturilor chimicecu ajutorul apdi: -

"g. fosJataze - indepdrteazd radicalul pOsHz_ de pe un substrat;trU. fosfodiesterq.ze - cliveazd, legdturile fosfatdiesrence, cum

ar fi cele din acizii nucleici;

J"'r. proted.ze _ scindeazd legdturile peptidice din proteine.

/ / ' \ l lD 1\ - ' - . Irl

":tt t aze F catalizeaze, scindarea nehidrolituce a uneigrupari de'!e-6n substrat cu formarea unei duble legAturi saufixeazd. o grupare la o dubld tegdturd.:

,LX' d.ecarboxilaze _ indepltteazd, COzde pe substrat;

{>":o:*.- fo.rmeazd aldehide in reaclii de eliminare;

y;htaze 4e;cd\A molecule fird implicarea ATp_utui.

t .pl' lzom.etue _Jcatalizeazd, reacliile de interconverstune

a zomenlor oplldilleometrici qi de catend:

.,L{ racemaze gi epimeraze _ cataJizeazd. interconversiuneastereoizomerilor L 9i D;

4 ::::.- transferd grupdri intre atomii aceteiaqi molecute;

xt. cts_trans-izorneraze _ interconversiunea izomerilorgeometrici:

y6. izomerq.ze care catalizeazd reacfia de interconversiealdozd

::et9ze: ,\

b .q' ll,igaze Tl_."1151*ge,t cataJizeaza unirea a doicompugi utiri;;a- ene;gi; eriberatd prin hidroliza unei molecure(-'_-- de ATP. r

. 5, ! ; .4|6, l / i )7. i . , , t { ; , , .* / . (_I.2.l. Oxldoreductaze O

Reacliile de oxido_reducere sunt reaclii in care are loc untransfer de H2 sau electroni. Acest transfer este asrgurat de parteacoenzimaticd. a enzimeicoenzime cu rol in oddo.,

(" structura enz. p.r7). principa.lele

NADp*- vezi p. 7e), "..",:;ffi;":- ,ffiT"::il':T:r,T";i:acidul lipoic, citocromii, coenzima e. in multe reaclii transferulelectronilor se face concomitent cu transferul protonilor (cu altecuvlnte are loc transferul de atomi de H), astfel ce acceptarea de H/e-(hidrogenarea) este echiva(dehidrogenarea) este

"":;t;#*I*::o::"o*.oerea

de H/e-

oxidoreductaze re catalizeaz-a "";"-"r*^:oarea -

(tabel nr' 1)'

cHz-cHz_; _cH_NH2; _"n=;: oxidoreducerea gruprrilor: -cHz-oH;

12

Tabei 1: Clasificarea generald a fenomenelor de oxido_reducerefunclie de elementul transferat.

Enzime care ,rlucreaza" cu Hz (e-):

N-)/ Dehidrogenaze

Dehidrogenazele sunt enzime ce ,,scot,, hidrogenul d.e la unsubstrat transferdndu-l unor ,,transportori" care sunt cunoscuti subdenumirea de NAD (nicotin adenin dinucleotid) si FAD (flavin adenindinucleotid). I

OH

FAD FADH2-CH:-CH:- -CH:CH-

,'1,. NADH+H+\/

- CH-a r{t - -fiH-cHr-

oObservafie: FAD preia cei doi atomi de hidrogen de 1a acelagi tip

de atomi in timp de NAD preia cei doi atomi de hidrogen de Ia atomidiq'rili.

/f /{ Reductaze

Reductazele sunt enzime ce ,introduc,, hidrogenul ia un substratacesta fiind preluat de la un ,,transportor" care este cunoscut subdenumirea de NADpH (nicotin adenin dinucleotid fosfatl

I

Element transferat Acceptare de c5.tre un

substrat

Cedare de cetre un-

substrat

oxidare----oxiaare -.

reducere ;

Hz reducere

e- reducere

Oz oxidare

NAD|H+H+ NADP+

-CH:CH- - CH2-CH2-

t3

Enzlme ce ,rlucreazdt' cu Oz:

O, ,/ Oxldaan

Oxidazele catalizeazS. reaclii in care oxigenul devine acceptor

pentru hidrogenul transferat de 1a un substrat:

SubstraFH + o, -!!@--- sub$rat + H2O2

$,,s O*igetaze

Oxigenazele cataTizeazd reaclii in care oxigenul este introdus la

un substrat:

Subsfat-H + c)2 Monooxkenaza > substrat-oH + Hro

subsb:at-H * o, hdF*

t o = subsb:at-oH

1,2.2. Ttarr,sfetaze

CalaJizeaze reaclii1e de transfer a unor grup5ri ,,G" (altele decAt

H) de la un substrat Sr la qlt substrat 52, conform reactiei:

Sr-G* + Sz -----+ Sr + Sz-G

Grupirile transferate por fi grupdri ce contin un singur atorn de

carbon (meti1, metilen etc), resturi de aldehide, cetone, aci1, alchil,

glicozil, amino, fosfat, sulfat.

ducort, + o* hexokinad t ADp + GKp

Glncoz- 6-fosfat

I.2.3, Hidrolaze

Hidrolazele cataTizeazd ruperea unor legdturi organice, cuparticiparea apei, dup5. reaclia:

A-B + HzO -----+ AH + BOH

Legaturile care pot fi desfdcute prin hidrolizd. sunt legdturile

esterice, eterice, peptidice, anhidrice, C-N (altele decdt C-N din

legdtura peptidicd), C-X, P-N.

t4

Caracteristic pentru aceastS. clasd de enzime este lipsa

coenzimelor. Ele necesitd prezeritra unor ioni meta1ici pentru activare.

Din aceastd clasd. fac parte, in general, enzimele digestive: amilaza,

Iipaza, tripsina, chimotripsina.

T'f l_HN -cH-c

Rn+1

1.2.4. Llaze

Liazele sunt enzime care cataJizeazd indepdrtarea unor grupdri

din molecula substratului fdrd" participarea apei, ducAnd 1a formarea

unei duble legS.turi:

n o Tn Q ()ll' jl Pepridaza I u ll

-e -In{-CH-e -HN-CH-C-OH + H2N-CH-C-NHlHzolRn+1 Rn+1

ot"

-c-c-l lXY

Aceastd clasd include enzimele care ac,tioneazd asupra

legdturilor C-C, C-O, C-N, C-S, C-X. 'I

1.2,5. lzom,eraze

Izomerazele sunt enzimele care caLafizeazd. interconversiunea

izomerilor optici, geometrici qi de caten6.

CHO| 'ffpz-iznrrcraza

I.lL -(J|-l

IcH2-o-P

Gliceraldehil- 3-fosfi t

------------> x-Y + )":"(

cHroHI-c:oIcH2-o-P

Dftilroxiaceton-fosfrt

1.2.6. Ligaze sau sintetaze

Ligazele sunt enzime cate cataTizeazS- formarea de legd.turi

chimice cu consum de energie (utiIizeaz6, energia eliberate din ATP

pentru realizarea noii legdturi). In acest mod se real.izeazd legituri C-O;

C-S; C-N; C-C. Ex: glutaminsintetaza catalizeazd sintetiza glutaminei:

Glutanin-

Lchrtarnat + NI{4+ j\_+ chramhE

ATP ADP + Pa

15

I.3. STRUCTURA ENZIMELOR

Din punct de vedere structural enzimele sunt (cu cAteva excepfii)

proteine cu structura terliare (formate dintr-un singur lant

polipeptidic) sau cuaternarS. (formate din mai multe lanluri

polipeptidice sau subunitefl). Activitatea cataiiticd a enzimei depinde

de integritatea sa structurali; astfel dac5. enzima este denaturat5. sau

subunitalile ce o formeazd disociazi, aceasta iqi pierde capacitatea

cata-1itici.

Structura terfiard/ cuaternare determind o anumita aranjare

spaliald care duce.la apantia gnqi ,,buzunar", unde se desfdsoard -a4 . , t :z/ ,J, . . , , , . , " . , , . t . '1, . . . . t^ /u(t / . ,n j i ,J i , , . : ! t rreaclia caLalizatd. Acest 1oc (situs) poarte denumirea de centni activ al

enzimei. Dupd unii autori centrul activ prezinte doud zone distincte $i' , anume un situs de legare al substratului qi un situs cata-litic unde are

loc cataliza propriu-zisd.. Pentru a inle1ege structura spaliald pe care o

adopte centrul activ, se poate imagina mperea unei bare rigide de

metal (fig. 3). .r

O barA metalici se poate rupe tregand de capete in direclii

opuse, acliune in urma cdreia rezultd doud fragmente. Pentru aceasta

este necesar un efort apreciabil, adicd o cantitate mare de energie.

Dacd insd bara rigida este indoitd mperea acesteia se reaJizeazd

cu un consum mult mai mic de energie. Prin indoire bara metalicd este

adus5. intr-o stare intermediard ,,de tranzitje" din care trecerea ln cele

doud fragmente separate, adicd ruperea ei se face mult mai ugor.

Aceasta stare de tranzi\ie este reaLizatd de interacliile magnetice intre

bard qi enzimd, interaclii care sunt de aqa naturd incAt,aduc" bara in

starea de tranzilje foarte favorabild formdLrii produsului/produqilor.

Se poate deduce prin analogie ca structura centrului activ al

enzimei este complementare nu neaperat cu structura substratului ci

mai cur6nd cu structura stdrii de tranzi,tie prin care acesta va trece in

transformarea lui in produs/produqi.

SubsAat@ara ds metat)

Star€ de tanzltisOa$ inddla)

{},}Enziha romplemsntarl cu substntul

m.-ffi-*_ffi

€

.g

(a) Enrima nu €ste plpzenti ^

- ,

'- -*' -r -> {r/tt,t ------* ,*i*t*

Prodnst(bale rupd)

Magneti

tc) Enzima complementar.e cu starea de tranzitib

Dir.cria & d.sE eit.n&lilt

"rv, t t tbn

_^-^ , ^T: j,-, tl""gir ea

^prezinte o enzima imaginari care catalizeazd ruperea uneioare qe metal (a), aclionafld asupra ei prin forle magnetice. O structuri a enzimeicomplementara cu substratul il itabilizeaza p.

""."i" ingreunand indoirea (b); O

;strucjYe.a enzimei complementare cu starea de tranzitiJdestabilizeaza substratulravorzand ruperea acestuia. Interacliile magnetice sunt cele care furnizeazd aportJde energie necesar pentru indoire. In diafarnele alaturate-este ilustratd varialiaenergiei de activare in cazul unei structuri complementare cu substratul gi in cazuiunei structuri complementare cu starea de t. rrri1i", i., ca.ul complementaritdlii cus hstratul complexul ES fiind mai stabil are o energie liberd mar mica decat asubstratului, in consecinle necesite o energie de acdvaie mJ

-mare dec6.t acesta.[21

Acliunea enzimei asupra unui substrat presupune ma1 tntaifixarea acestuia la centrui activ, adicd formarea comptexului ES.

De-a lungul timpului formarea complexului enzim6, substratES a fost explicatd. de doud modele:

- modelul clasic (Fischer) sau modelul cheie_broascd in carecentrul activ al enzimei are o structurd rigida complementari cucea a substratului, cuplarea acestuia fdcAndu_se dupd. modelulcheie-broascd.

Acest model este pulin eficient (deqi a fostcAteva cazuri de catalizl. enzimaticd) deoarece ocomplementare cu substratul il va fixa fermingreunAndu-i transformarea ulterioari..

evidenliat in

enzime total

pe acesta

- modelul "centrului activ indus,, (Koshland) care postuleazdca centrul activ al enzimei are o conformalie relativ diferiti de asubstratului. Centrul activ se comportd ca o matrild flexibild carepoate lega substratui intr-o formi ce reduce la maxim gradele delibertate ale acestuia, in ceea ce prive$te rotalia, translafia, faptcare favorizeazd atingerea rapidd a stdrii de tranzi\ie, Aceastareprezinta interpretarea datd. scdderii energiei de activare,observate in cazul reacliilor catalizate de enzime.

Pe lAngi structura centrului activ al enzimelor, un alt aspectstructural se referi la alcdtuirea 1or. Enzimele in majoritatea 1orsunt heteroproteiene, formate dintr-o parte proteicd. (alcituitd doardin lanluri polipeptidice) numite apoproteind qi o parte neproteicace este cunoscute sub mai multe denumiri:

a. cofactor - dacd partea neproteicd este un ion metalic;b. coenziml. - dacd partea neproteicd este o moteculd

organicd sau o structura ce conline o vitamind, asociate sau nu cuun ion metalic Ai care este slab legati de partea proteica.Precursorii coenzimelor impiicate in cataliza enzimaticd suntvitamine hidrosolubile, prezentate pe larg in capitolul ,,Coenzimevitaminice".

c. parte prosteticd _ dacd partea neproteicd este o structurdorganicd legatd ferm de partea proteice.

indepirtarea cofactorului sau a coenzimei duce la pierdereaactivitS.lii enzimatice.

Apoproteina este responsabilE de specificitatea enzimaticd (deacliune, dar mai ales de substrat), in timp ce partea neprotelca esteimplicatd direct in catalizd.

!

IIE

I.3.1. Izoenzime

Anterior s_a afirmat cd unele enzimeie sunt proteinecuaternare. Aceasta semnificd. faptul ce ele sunt aic5tuite din maimulte lanfuri potipeptidice (numite subunitdfi) asociate intre eleprin legaturi chimice slabe. posibiiitatea asocierii diferite asubunitdlilor duce hfiaritia unor enzime cu forme molecularemultiple numite izoenzime, IzoenzimeLe cata)izeaz,aaceeaqi reacliechimicd. dar cu randament diferit qi au localizare tisulard. diferitd-Izolarea $i evidentierea acestor izoforme se face pe bazaproprietd.filor fizico_chimice diferite.

Doud dintre cele mai intAlnite izoenzime in practica medicald,sunt LDH - lactat dehidrogenaza qi CK (CpK) _ creatrn kinaza(creatin fosfokinaza).

LDH este un tetramer alcdtuit din doud tipuri de lanturipolipeptidice: unul de(mu s cr e) . subunitatea l;*,l "ti

" "l ;"

"::.::,:l ":::"L::

j',r",Iinimii gi in general lesuturilor cu metabolism aerob, iarsubunitatea M (muscle) este caracteristicd muqchiului scheletic Ai_in general organelor gi fesuturilor cu metaboiism anaerob (excepfiefac ficatul gi eritrocitul). Cele doud tipuri de subunitdli se asociazdcate patru pentru a forma un tetramer ducAnd la aparitia a 5izoenzime:

LDHI - HHH H ) cre$te in infarctul de miocardLDHZ .HHHM

LDHS -HHMM

LDH+ -HMMM

LDHs -MMMM ) creqte in afectare hepat icACK este un dimer alcdtuit din doud tipuri de lanluri : unul de

tip B (brain) cel de ai doilea de tip M (muscle). Subunitatea de tip Beste specificd creierului, cea d.e tip M, muqchiului. Cele douisubunitdli se asociazd. diferit pentru a forma un dimer d6nd naqtereIa 3 izoenzime.

CKr - BB

CKz - MB ) creqte in infarct in primele 6-24 ore.

CKs - MM

Se evidentiazd astfel importanfa cunoagterii particularitililor

structurale gi funclionale aJe izoenzimelor in stabilirea cu acuratete aunui diagnostic.

Uneori enzimele sunt asociate in aqa-numite compiexe

multienzimatice in care enzimele individuale sunt fixate prin Iegdturi

slabe pe o proteind. central5, intr-o ordine ce corespunde intrdrii 1or inactiune. Aceaste organizare are ca scop transferul eficient al produqilor

de reaclie ai unei enzime la enzima urmetoare, evit6ldu-se pierderile

qi imprimAnd procesului o anumiti itezl. IJn exemplu de complex

multienzimatic il constituie piruvat dehidrogenaza (pDH), care

cataJizeazd, decarboxilarea oxidativd a acidului piruvic, compus ,cheie"in metabolismul glucidic.

I.4. SPECIFICITATE

slfff citatea enzi\:*ic5'^W# W#g ?9&7tr\vtft.erzirr5:1or de adeosebi intre structuri' diferite. De aceasta ,,capacitate" este

responsabild partea proteica a enzimei $i anume apoenzima.

Specificitatea enzimelor se poate manipsta_..in trei varianteprincipale: specificitate de reaclie, de substrat (i opti"a)

t

'-.-.'/lSfspecificitertea de reactie - denotd fapliiT-cd o enzima este

,,corJceputd " sE catalizeze un singur tip de reaclie. pornind de laaceasta treseturd s-a fhcut clasificarea enzimelor in cele qase grupe

enzimatice.

fuffipecificitatea de substrat - care funclie de aria de actriuneprezinta:

J specificitateabsolute;4

t( specificitate absoluti de grup;

"/ specificitate relativd de grup;

I

20

a) Speclficiteteq absolutd. Unele enzime actioneaze numaiasupra unui singur substrat, catalizdrrd o singurd. reactie, de exempluuteaza:

HrNJ-NH, + H2o-l&33L* 2NH3 + Co2

Aceasta enzimd este total inactivi fa{d. de compuQi foarteasemdndtori structural _ tiourea HzN_CS_NHz. De asemenea, arglnaza- enzima care cateJizea2d hidroliza L_argininei la uree gi ornitind nupoate cataliza hidroliza esterului metilic al argininei sau scindareaagmatinei, amina rezultati prin decarboxilarea argininei.

-CH2-CH2-CH-COO" **0,,- f H:

NH: c:o +INHz

Uree

b) specilrcitatea atsotuti. d.e grup - prezt.te enzimere cecatalizeaz1. acelasi tip de reaclie asupra unui numdr restrens desubstrate apropiate ca structura chimicd.

Din aceaste categorie fac pa_rte gJicozid,azele qi succin_dehidrogenaza (sDH). sDH catarizeazd. reaclia de trecere a aciduruisuccinic 1a fumarat, dar cu aproximativ aceeagi vfteze qidehidrogenarea acizilor L-metil_succinic, L-etil_succinic qi L_clor_succinic.

Hooc -cH2 -cHz-cooH srcch-d"hid.ogenara'' Hooc _cH:cH_cooH

Acil succinb Acid fumarb

cl specificitatea rerqtrod de grap - prezlnte enzimele cecatalizeazd. acelaqi tip de reacfie asupra unui numAr relativ mare d.esubstrate apropiate ca structura chimicd.

Din acest grup fac parte ligazele sau esterazele care fac posibildscindarea mono-, di- trigriceridelor gi chiar arli esten cu structurechimicd mult mai compricata. Enzimeie proteoritice care hidrorizeazi

HN-CH2I

INHz

H2N-CH-CH2-{H2-cHrlCOOH rus^

Arginind

Iegdturile peptidice din proteine qi din alti compuqi neproteici, fac

parte tot din acest grup.

3) Specificitate opticd sau stereochimicd. Este foarte rdspdnditd

dat frind fapful c5. majoritatea substratelor au carboni asimetrici deci

se gdsesc sub forma de stereoizomeri.

Enzimele catalizeazd transformarea numai a unui stereoizomer

(specificitatea opticS. este de obicei absoluti) celAlalt antipod optic

neputAnd fi prelucrat de enzima. De exemplu, L-serin-hidroliaza

catalizeazd, numai dezaminarea L-serinei la piruvat, nu gi a D-serinei:

fH'?-oHfH-NH,cooHLserina Acil piruvi:

Enzimele care recunosc substrate cu izomerie geometrici

prezirrtd. specificitate geometricd.

Ftmaraza, de exemplu, permite hidratarea acidului fumaric

(izomer trans) gi nu a aciduhli maleic {izomer cis) cu formarea acidului

malic ca orodus final:

CH,i l -_I* f _*r,

H2O COOH

9H, Hzo pHs_i: \H \ - l :o

t \ lcooH NH2 cooH

H

HOOc--c:g-cooHI

H

Acid turnrt

Funwaza --Hp:Hooc- cH-cH2-cooH

OHAcil malic

I.s. MEcANIsME DE cATALIZA dl u '' "' ')' ' "' ' t I 6(,

AtAt specificitatea cAt gi cataliza p.esupun stabilirea unor

leg5.turi intre enzimd gi substrat ce duc la formarea temporare a

complexului enzima-substrat ES.

Formarea acestor legaturi tg1rrp_o,lqlg- (mai mult sau mai pulin

slabe) are ca scop lgqq"g"" miqc5rii libere a sub_stratului, extragerea1ui din mediul apos etc. Cumulate toate aceste interacfii imprimdsubstratului o forma corespunzitoare stdrii de tranzitie si oferd

-

energia necesare catafizei p.oprilr-ri"". Odate substatul fixat, asupralui ,,incep" sd acfioneze gruperi funclionale pozitionate adecvat, carepermit ruperea sau formarea unor legdturi, printr_o varietate d.emecanisme: mecanisme acido-bazice gi/sau covalente, mecanisme detensionare a substratului, mecanisme bazate pe efecte entropice etc.S-a observat ci in cursul catalizei o enzimE. utllizeazd, de reguid maimulte mecaaisme simultarr.

Grupdrile funclionale ce participd. la aceste mecanisme sunt:- aminoacizi din lanful polipeptidic;

- compu$i organici (coenzime)/ qi ioni metalici:- ioni metalici.

Dintre toate aceste mecanisme va fi prezentate cataliza ce sedesfdqoard prin mecanism acido-bazic qi catalizd covalentd.

4, - cataliza acido-bazicd

rn acest tip de catalizd sun{ implicate gruped functionale cucaracter de acid sau bazd slaba, care 1a pH fiziologic pot ceda/primi unH+. in acest tip de reaclie iau naqtere intermediari instabili cu sarcinaelectricd.

Cel mai intA_lnit aminoacid, care ia pH frziologic poate funclionasub forma perechii acid.-bazd conjugatd. este histidina, care are pKn = 6$i a carei comportare este prezentata mai jos:

-NH-CH-CO-

CH,t -

HN /.N:

nt_

'44

Ptn=o ts lo a z l

Cataliza covalentd

ln acest tip de catalizd grup5rile funclionale ale centrului activaI enzimei atacd nucleofil (in majoritatea cazurilor) sau electrofil (maira-r) substratul, ducAnd Ia formarea, intr_o secvenld. de reaclii, unui

+H+-_H+

-NH-fH-co-

__J",nrSr-H

intermediar legat covalent de enzimS. Acest intermediar covalent estemult mai labil dec6.t substratul inilial.

Un mecanism de catalizl enzima.ucd, in care sunt utilizate atAtmecanisme acido-bazice cat $i covalente, il reprezinti nrperea legdturiipeptidice sub acliunea chimotripsinei in urma cdreia rezultd.aminoacizii formatori.

ho pr t l

-HN-CH-C-!I\-CH-C -IRn+1

S.P arHN-CH-C-oH + Ii2N-CH-C-NH

IRn+1

H2o

Procesul are loc prin combinarea a doud tipuri de catalizd, incursul reactiei luAnd naqtere at6.t intermediari instabili cu sarcindelectricd cAt qi intermediari fixati covalent de enzimd.

Centrul activ al enzimei prezintA o triade cataliticd a_lcdtuitd dintrei aminoacizi qi anume Asptoz, Hyssz, gsltes.

' t

Ser 10i

*o)

Fig.4 - Centrul catalitic al chimotripsinei evidenfiazd pozitionareaaminoacizilor Asp, Hys si ser astfel incat sd lie posibil transferul de protoni fiiniapunctate) [6].

CAnd un substrat, care conline legetura peptidicd, se leag[ lacentrul activ al chimotripsinei, are loc o uqoard modificareconformalionald care comprimd legatura de hidrogen dintre Hyssz qiArgtoz ducdnd Ia aparilia unei legdturi mai puternice. Aceastainteraclie cre$te pK.-ul Hyssz de 1a valoarea 7 (la histidina liberd) lavaloarea 12, permi!6:nd histidinei sd.-gi accentue ze caracterul bazicincat ea devine capabil5 sE atragd protonul aparlinAnd gupdriihidroxil de Ia Sertes. Deprotonarea imprimd Serles un caracternucleofil puternic; are loc atacul grupdrii carbonil a substratului,atac in urma cS.ruia se formeazd un intermediar cu viatd foartescurte, cu sarcinS. negative.

Instabilitatea compusului incarcat negativ duce iarearanjarea qi formarea unei duble legdturi intre carbon qi oxigen,care dezlocuieqte legd.tura dintre* carbon gi gruparea amino alegiturii peptidice, ducAnd la ruferea acesteia. Gruparea aminoeste protonate de Hyssz, uqurAndu-i_se astfel indepdrtarea.

in aceastd etapa ia naqterea un intermediar legat prinlegaturi estericd de enzima, denumit intermediar acil-enzimd.

in etapa urmitoare o moleculi de apd este deprotonatd prinmecanism acido-bazic ducAnd la generarea unei grupdri hidroxil cucarater puternic nucleofil. Aceasta atac6 legitura estericd a acil_enzimei generd.nd un nou intermediar cu sarcind negativi, cu viatdfoarte scurt6. Instabilitatea acestuia produce rearanjari care duc laindepirtarea produsului de reacfie, ce contine gruparea carboxil sila protonarea g91r9s gu regenerarea enzimei.

25

Rr.6 Ltirtrtr |rotLld I- ' t

o. r*-r'ui^i:YE]) t- s.,'

\ /' * it "

Fig.s . - Mecairismul detaliat aI reacti, ei catalizate de chimotripsin6.Chimotripsina cale.Jj?.earA hidroliza legiturii peptidice la gruparea COOH aaminoaciZilor. cu radicali aromatici (a). Pe parcursd catalizei se fornieazd in urmatransferului unui proton (c), compugi instabili cu sarcina electricd. (d), iar in ufmaruperii legiturii peptidice Si eliberErii po4iunii ce confine gruparea amino, compuQiintermediari legafi covalent (e). Atacul nucleofil af apei (f) genefeaza um nou compuscu sarcine electrice foarte instabil (g), a cErui rupere va elibera o po4iune de la:rtpolipeptidic ce contine gruparea carboxil (h) Qi va regenera enzima (i). [6]

26

I.6. CINETICA ENZIMATICA

I.6.1. Notiuni de cinetlci generali

Cinetica studiazd viteza cu care se desfdqoari diferite fenomene,inclusiv reacliile chimice.

Cinetica enzimaticd studiaza viteza reacliilor chimice ce sedesfdqoard in organism gi factorii care o influenfeazd.

Principiile generale ale cineticii enunld 1egile care permitcalculul vitezei de reaclie in diferite reaclii chimice:

1. presupunAnd o reaclie chimicd ce are loc intr_o singureetape in care este implicat un singur substrat qi care este ireversibild(vezi exemplul barei rigide pC. 16),

S-Pviteza de reaclie este datd de cantitatea de reactant [A]

consumate in unitatea de timp (semnul "_,,

indicd consumulreactivului) sau cantitatea de produs [p] formatd in unitatea de timp.

v=- dtAl = dlPldt dt

. dtAtdar - V-tAl-V-klAl

unde:

K= constanta de vitezi. dependentd de natura reactaltului si decondiliile de reactie.

[A] = concentralia reactantului

[P] = concentralia produsului

Unitatea de mdsurd Jrenrnr. M I

semnifi calia acestei loislan,l-t;*-"9 "t""r'rr"i

rrit"r" unitareindicAnd ,,caltitatea" de timp necesard. transformarii unei ,.unitdti",.Aceastd constantd este strict specilicd fiec5rei motecut. ,ffol"kllA

de natura gi tiria legdturilor ce urmeaz6- a suferi tralsformiri qidependentd de condiliile de reaclie (T, pH, tdrie ionicd., presiune).

Pentru a intelege semnificalia constantei de vitezi. K, linAnd contde expresia ei matematicd (sec-l), vom compara rlrperea unei bare demetal cu ruperea unei bare de material plastic. Ruperea unei bare demeta-l necesitd un timp (exprimat in secunde) mai mare decAt necesitdmperea unei bare de material plastic. Constanta de vitezd, fiind datd.de raportul l/sec, va avea valoare mai micd. in cazul barei de metaldecdt in cazul barei de material plastic. Cu a_lte cuvinte viteza unitaripentru ruperea unei bare metalice este mai micd decAt viteza unitardpentru ruperea barei de material plastic. Se evidentiazd faptul cEstructura dicteazi, merimea specificd a acestei constante, ce reprezintdviteza unitare, pentru fiecare compus in parte.

2. s5. presupunem o reaclie bimoleculard {vezi exemolulciocnirii a doud molecule, p. 6)

A+B---+ P + Qin mod analog viteza de reaclie este datd de cantitatea de

reactivi consumatd in unitatea de timp sau de cantitatea de produsi dereactie formatd in unitatea de timp:

v__ [dAl __ ldBl _ IdPl rdnldt dt - dr

=-- -v- tAl . tBl-+V=ktAl. fBl

in care :

K = constanta de vitez6, dependentd de natura reactantilor si deconditiile de reactie

[n] qi [e] = concentraliile reactangilor

tpl Si tQl = concentraliile produqilor

Unitatea de mdsurS. pentru -,.- _ M . I _.".,

Reaclii cu -",.",,-;;;;";il';r:

ll";J0,i",o"" ciocnireasimultand a trei molecule fenomen relativ rar intalnit qi mult mai greude definit din punct de vedere matematic.

\J! , tuuJ At u.A{tr '61 .L+ttsWc&C c_.Dacd se reprezintd. grafrc veiiiafia cantitd.tii de produs format in

funcfie de timp se obline o curbd ce prezirrtd o porliune rectilinie (cupanta constante) care apoi se inclind qi in frnal se aplatizeazd (frg.6).

Qa-ff

Fig. 6 - Variatia cantiteui de produs format funcfie de timp. Viteza dereaclie, date de dP/dt (care este tangenta la curbd, tgo,), nu este constante pe totparcursuJ procesului, fapt evidenliat de modificarea targentei la curba (oo*or).

Din punct de vedere matematic tangenta in orice punct aI curbeidata de relatia tg c = dP/dt va reprezenta irteza de reacfie, conformrelaliei V = dP/dt.

Portiunea liniarS. a curbei permite calcularea vitezei reale aprocesului (numitd dupd unii autori viteza actuala, dupi ailii vitezainilial5 Vo) atunci cAnd orice cantitate de reactant se transformiintegral in produs, cAnd nu existd. reaclii reversibile, cAnd nu existdimpiedicdri sterice generatg {e 4cumularea de prod.gs etc. pe mesurece cantitatea a" ,"""t""t*To* il,iA^i Hffi*.k"'o.oo,r" rormatd semicqoreazS. qi viteza procesului scade.

Datoritd faptului c6. viteza nu este aceeaqi pe tot parcursulprocesului, este indicatd determinarea ei in primele secunde/minuteale procesului gi anume mdsurarea aqa-numitei viteze iniliale ve .

in reacliile enzimatice activitatea unei enzime este apreciatafunclie de cantitatea de produs formatd in unitatea de timp, prinurmare activitatea enzimatici este similard vitezei de reactie.

Activitatea enzimatica se exprime in:

>::>2)/1J .I (unitdli internalionale) - 1 Unitate Internafionali.reprezintl, cantitatea de enzimd. ce catalizeazl. tra-nsformarea

unui pM de substrat/min in condilii standardizate pentru

fiecare enzimd (temperaturd, pH optim etc.).

-=- )-Katal - 7kat. reprezintd cantitatea de enzimi ce catafizeazd.transformarea unui mo1 de substrat/sec.

2=. 3) Turnover - IG"t reprezintd o mesurd a activitdlii cata_liticemaxime. Kcat este numdrul de molecule de substrattransformat pe moleculd de enzimd qi in unitatea de timpcAnd enzima este saturate cu substrat. T\rrnoverul reprezintd.deci activitatea moleculard a enzimei.

L6.2. Cinetica etrzimatici

Conceptul de bazE al cineticii enzimatice consideri c6 formareaprodusului de reac{ie este condilionatd. de formarea in prealabil acomplexului enzima substrat ES, concept redat de relatia:

l

g .1,_ 5 ___j_ gS _ E + p

Factorii care influenfeaz1. iteza de reaclie sunt, dupd cum seobservS. din relalia de mai sus, concentralia substratului, concentraliaenzimei la care se adaugd parametri ca temperatura qi pH_u1, la carese desfEgoard reaclia.

a) Influenta pH-ului asupra actlvitegl enzimatice

Varialiile de pH pot avea efecte atdt la nivelul enzimei, cat qi lanivelul substratului. Astfel, se poate modifica gradul de ionizare a unorgrupdri funclionale de pe enzimi, a cdror sarcind (pozitivd saunegativS.) este necesard fie formdrii complexului enzimi._substrat, fiemenlinerii conformaliei tridimensionate native a protein_enzimei, fieactivitefli catalitjce propriu-zise (fig. 7). De asemenea, pH_ul mediuluipoate modifica gradul de iorizare al substratului, impiedicAnd sau

30

favorizAnd formarea complexului enzimd-substrat. Valoarea pH_ului 1acare reaclia enzimaticd se desfdqoara. cu vitezd maximd se numeste pHoptim.

- .Itg 1- Influenla pH-ului asupra activitdlii enzimei. Structurile in caregruparile bazice qi cele acide sunt fie ambele protonate, fie ambete neprotonate n,-icorespund ioniziri.i necesare activitSlii enzimatice. Intervalul de actlvitate al enzimeieste cel in care formele bazice sul optim este cuprins intre 6 gi

tgttt Ptotott"te iar cele acide neprotonate' adica pH-

Figura 7 prezinti varialia activitdlii enzimatice a unei enzimelpotetice, funcfie de pH, pentru care ionizarea reziduurilor din centruactiv este esenliale pentru catalizd. Cu alte cuvinte pentru ca enzimasd fie functionald centrul activ trebuie sd prezinte grLlparea bazici {B)in forma protonata (BH+), iar cea acidd (A) in formd neprotonate (A );pK-ul formei bazice este 8; pK-ul formei acide este 6.

La pH 7 in jur de 9Oo/o din ambele grupe (A si B) sunt prezente informd activd., pe mdsurd ce pH-ul scade sau cregte, una sau a-1ta dincele doud. forme trece progresiv in forma inactivd. Cu alte cuvintepentru enzima de fald pH-ul optim este situat in jurul valorii 7. pH_uloptlm pentru cele mai multe enzime are valori cuprinse intre 6_ g.

}cepfie fac enzimele digestive, pepsina (pH = 1,5-2), arginaza (pH =

r.5- i 0) .

b) Influenta temperaturii asupra activitifii enzimatice

Influenla temperaturii asupra activitdfii enzimatice derivi. din::rtul ce odate cu cregterea temperaturii cre$te agitalia termicd gi prin'::=rare gi viteza de reactie. Peste o anumite temperaturd. enzimele

::r-in instabile qi ca urmare a denatur5rii iqi pierd activitatea intr-un

:::erva.1 foarte ingust de temperaturS.. Temperatura optimd a enzimelor

-: organismele superioare nu depS.qeqte 4OoC; eistd insd bacterii

::-nofile a ciror enzime prenntE- activitate optimd 1a 10OoC.

0.8

E

iJ--

0.4

f,nzimidenaturata0.0

0

Temperaturd("()

Fig.S - Influenla temperaturii asupra activitelii enzimei. Structura enzimeieste menlinute intre anumite limite de temperature bana in jur de 4OoC) dupa carecre$terea agitaliei termice favoizeazd denaturarea. Aceasta cauzeazd distrueereaaranjarii spatiale esentiale pentru capacitatea catajitice a enzimei J3l.

cl Influen{a cantitilii de enzimi asupra acti\rititii

enzimatice

influenla concentraliei enzimei asupra activitdlii enzimatice

derivd din faptul cd odate cu mdrirea cantitelii de enzimd se md,reste

cantitatea de complex ES gi deci cantitatea de produs formatd, prinurrnare iteza de reactie cre$te.

Spre exemplu, sub actiunea unei enzime, intr_un preparatbiologic se formeazd X mg de produs p intr_un timp dat. Daca,repetandu-se experimentul, cu acelasi preparat, in acelaqi interval detimp, se formeazd. o cantitate de doud. ori mai mare de produs 2X mg p,inseamna cd in a doua situalie cantitatea de enzimd, care catafizeazd-formarea de produs p, a fost de doud ori mai mare (fig.9).Proporlionalitatea dintre viteza de reaclie si cantitatea de enzimi areimportanld practic5., deoarece permite determinarea concentralieienzimelor din preparate biologice, determinare utili in diagnosticareaunor stari patologice.

Fig.g - Cinetica unei rea4ii enzimatice in prezen a unor concentratiicrescetoare de enzimd. Addusarea, ra o cantitate n*a d" ",ruJi."t,

a unor cantita!crescdtoare de enzima Es r E2 , Er duce 1a f"r*;;" il;iitaii crescetoare deprodus P3 > Pr > Pr, in acelaqi interval de timp,

dl Influenla concentratiei substratului asupra activititiienzimatice

Dacd in organism cantitatea d.e enzimd (cu exceplia enzimelorinductibile) poate fi consideratd relativ constanta, concentraliasubstratelor variaze inse in fimite foarte largi. De aceea se poate afirma

-:-::

cu relative corectitudine ce viteza reactiei enzimatice depinde

principal de concentralia substratului.

Dupd felul in care enzimele iqi modifici activitatea

cregterea/scdderea cantitelii de substrat, acestea pot fr impirfite

doud mari grupe:

z.t/. - enzir.rre ce respectd cinetica Michaeiis -Menten;

4. - enzirne ce prezinte o activitate sinusoidalS., a$a numitele

-. -1enzime alostericel,ff, 't 2,/t

Comportarea diferitd a enzimelor qi diferenfele dintre cele doud

categorii, vor fi prezentate pe laig in cele ce urmeazd.

1.6,2,1. Cinetlca de tip Michaelis-Menten

Michaelis $i Menten au studiat influenla concentratiei

substratului asupra activitefli enzimatice realizAld urmitorul

experiment: la o ca,ntitate constanta de enzimd au addugat cantitali

crescatoare de substrat $i au inregistrat vitezele de reaclie mesurate.

Cu datele oblinute au trasat un grafic in care pe abscisd sunt trecute

concentraliile de substrat iar pe ordonatd vitezele de reaclie

corespunzatoare (fi gura 10).

1n

Ia

in

':li-

[5] {mN)

Fig.10 - Variatia vitezei de reaclie, functie de concentratia substratului

34

AnalizAnd acest grafic se desprind urmdtoarele concluzii:

,!l7a concenttalii mici de substrat viteza este direct proporfionaldcu concentratia acestuia (porfiunea liniard a curbei);

'2f ra concentralii crescute de substrat viteza devine independentade concentralia acestuia, adicd oricAt substrat am ad5uga vitezade reaclie nu mai cregte gi devine egald. cu viteza maximd (Vmax);

)faparilia platoului indicd existenla fenomenului de saturatie adicd

indici o capacitate limitatd. a enzimei de a fixa substraful, irecAtoricdt substrat am adduga nu mai existd. centre active disponibilecare sA-l accepte pentru prelucrare ulterioard. De aici concluziacd formarea produsului este precedata obtgator de formareaunui complex intre enzimi" Si substrat si anume ES.pe grafic se poate determina jumdtate din viteza maximd. adicdYmax/2; acestei viteze ii corespunde o concentratie de substratcunoscute drept constanta |-Iichaelis_Menten (Km). Altfel spusKm reprezintd o concentratie de substrat pentru care viteza

;reactiei este egald" cu Vmax/ 2.

14 nn aa informafii asupra afinitdtii enzimei pentru substrat: astfelvalori mari ale Km-ului indicd o alinitate scdzuti pentru substratin timp ce valori mici ale Km_ului indicd o a-finitate crescutapentru substrat. Acest lucru este vizibil din grafic unde enzima 1are un Krnl (valoare micd), ceea ce indicd. faptul cd are nevoie deo cantitate micd de subshat pentru a atinge Vmax/2, in timp ceenzima 2 are nevoie de o cantitate mai mare de substrat pentru aatinge acelagi randament adicd. Vmax/2. Km are valori cuprinseintre 10-6 M - t0rM.

6fu' #j'u' 1l,U '- i.\ 't n ltt lr2 k JJMichaelis gi Menten au stabilit o .et"iie matematica care

exprimS" varialia vitezei de reaclie funclie de concentratia de substrat.

Kr K,--

ES ----i-----+ F . DK2 ;- '

E+ S+

(1)

I

a

It

e

a

5

rt

ls

a

ce

la

ISe

tre

t.

Conceptul de bazd al cineticii enzimatice (1) postuleazS. cd

:eac{ia de formarea a produsului este una ireversibilS.. Viteza de

ibrmare a acestuia este data de dP/dt (cantitatea de produs formatS. in

'rritatea de timp) care este insi proporlionale cu cantitatea de complex'ESl. Aitfel spus viteza inilialn Vo $ezi p. 28\ este egale cu produsul

dintre K: 9i concentralia complexului ES, produsul formAndu-se atAt

iimp cat se formeazd complexul ES.

V = dP/dt - [ES] adiaa V - [ES] deci Vo = K3[ES1 Q)

Complexul ES reprezintd o stare in care probabilitatea formdrii

produsului este egali cu probabilitatea revenirii la compugii iniliali E

respectiv S. De aceea concentralia reald a complexului [ES] este

dictate de raportul care se stabileqte intre reaclia de formare a

complexului gi reaclii1e in care acesta se consume, atAt prin reaclia

reversibild cAt gi prin trecerea in produs de reaclie:

1) reaclia de formare a complexului este dati de:

Vlo.r*," = K1[E]. [S]

I

2\ reaclia de disfaritie a complexului [ES]

Vde disparitie cauza6 de reacda reversibila = Kz[ES] (4)

Vde disparilie cauza6 de trecerea in p.o6u, = K3IESJ (5)

Din punct de vedere strict matematic cantitatea de enzima E nu

apare in ecuafie deoare ce, prezentl, in ambii termeni ai ecualiei 1, ea

se anuleazd; din punct de vedere biochimic este acelaqi lucru pentru

cd- enzirr,a se regS.seqte neconsumatd la sfdrqitul procesului. Relalia

matematicd in condiliile acestea arati ci compusul S trece integral in

P, cu alte cuvinte viteza de formare a complexului ES este egald" cu cea

de consum.

KrfEl. tsl = KztFSl + K3[BS] sau (6)

KrtEl tsl = [Es] (Kz + K:) (7)

(3)

b1

at

teL1

de

0)

tEt. ts1K2+K3

a\\

KM

Relafia obtinutS. nu este intru totul utild deoarece atAtconcentratia enzirrrei [E] rdmash liberd. c6t $i concentralia substratului

[S] la un moment dat, sunt dificil de determinat. Cantitatea d.e enzimardmasa liberd poate fi insd calculatd ca diferenla intre cantitatea totaldde enzimd. [Er] $i cea care este implicatS. in formarea complexului ES:

.tEl=tsrl_fEslt .

inlocuind [E] in relalia 8 aceasta devine:

de unde:

tESl = KJ t?;;tsl sau [ES] =r\.2 + ^3

rrsr=ftfl rrr

(e)

Km.[ES] = ( tstl - tEsl ).tsl

Km. [ES] + tEsl.tsl = tE"Il. tsl

[ES].( Km+ tsl ) = tE'Il. tsl

tEr'l . l'Sl

Km+ [S]

(10)

(11)

(r2)

(13)

Relalia 13 permite ca1culu1 cantitilii de complex ES (foarte greude determinat experimental) din elemente cunoscute (care suntstabilite experimental) adicd din cantitatea totald. de enzimd sicarutatea totala. de substrat.

Dacd inmullim ambii termeni cu IG (care reprezintd. contanta devitezd pentru formarea produsului) se obfine:

K,'tESl = K3' [E'I]Km+ [S]

(14)

-:::de:

& . [ES] este viteza initiald, Vo, a procesului conform ecua{iei 2.IQ . [Er] reprezintd viteza maxima Vmax. a proc€Sului, atunci c6nd

toate cantitatea de enzima este ocupatd de substrat,

conform aceleaqi ecuafii.

in aceastS. situatie relatia 14 devine:

vo=Vnnx.S (15)Km+ [S]

Relalia 15 este cunoscuta sub numele de ecualia Michaelis_\fenten qi stabile$te influenla concentraliei substratului asupra vitezei'-:nei reaclii cata-lizate de o enzimi.

Ecualia stabilitd de Michaelis-Menten confirmd matematic:bservaliile lEcute prin analiza curbei oblinute experimental gi anume:

1) Ia concentralii mici de substrat, [S] << Kn, concentratia acestuia

[S] poate fi neglijatd in raport cu Km qi viteza inilia1d Vo devine:

I

-. -Vnnx'Suo= t<.-

Relalia aratd c6. vtteza ini{ialn V., depinde, direct proportional,

de concentralia substratului. Aceasta se traduce astfel: in cazul in careconcentratia substratului cregte de doud. ori, viteza de reactie va creste:ot de doue ori.

1) la concentralii mari de substrat, [S] >> Km, valoarea 1ui Kmpoate fi neglijatS. in raport cu valoarea concentraliei substratului

[S] 9i viteza initiald Vo devine:

Vnnx.SVo = Vmax (17)

Relalia aratd cd la concentralii mari de substrat viteza devineindependent6 de concentralia acestuia. Aceasta se traduce astfel:

Vnnxv^=-.s"Km

(16)

votsl

oncat substrat am adel

38

anumitd valoare. )ga vtteza de reacfie nu mai cre$te peste

3) la valori ale vitezei inifiale Vs = v^"./ 2 relalia devine:

Vt l t* = V*.S . , , , I _ ls l

2 Km+S *"

t=K;- N

sau Km+tsl=2 ts l sauKm=[sJ ( t8

Relatia denotA semnificalia fizicd, real6. a lui K,,r qi anume: K6reprezintd o concentra{ie de substrat pentru care vlteza iniliale areacfiei Vo este egald cu Vmax/ 2.

4) Retafia:

r.=_&j5descrie constanta Michaelir

Kl (19)

substrat. s_Menteh gi indicd. afinitatea enzimei fafd de

Din punct de vedere matematic in situalia in care Ie are valori foartemici expresia lui Km devine;

_- K,ls.m=-----=-

r\1 Q0)

Din punct de vedere biochimic atunci cAnd IG are valori mici, reacliade formare a produsuluivitezd cea mai micd,.,",."'::;T;i::i:;i::":" :",*,l:ff: :;::::1::::

reactia inversd" de descompunere inapoi in E qi S. Astfelrlrqg.4 r2lnl reprezintd de fapt constalta de disociere a complexuluiES. Disocierea complexului este strict dependentd de afinitatea ceedstd intre enzimd gi subsuat.Se deosebesc doud sttuatii:

"ft',{ c6rrd Kr>Kz predomind tendinia de formare a compiexuluiES, deci enzima are o afinitate crescutd pentru substrat, K,,' in aceastasltuafie are valori foa_rte mici (raport subunitar). Se obfine confirmarea

8)

=atematice a afirmaliei: ,,valori mici ale Km-ului indici a-finitate mare--e:tru substrat".

,-- -+- cAnd Kr< Kz predomind tendinla de disociere a complexului

-S. deci enzima are o a-finitate micd pentru substrat. in aceastd.

--::::afle K- are valori mari (raport supraunitar). Se obline confirmarea

:-atematicS. a afirmaliei: "valori mari ale Km-ului indicd a-finitate micd

-:tru substrat".

in concluzie ecualiile matematice oblinute confirmi concluziile

:eCuse experimental.

Utilitatea practicd a ecualiei stabilitd de Michaelis-Menten

=:]ste in faptul cA aceasta permite:

a) calculul turnoverului enzimei

Relatia V"'". = K:. [Er] indicS. faptul c5" toate centrele active ale

::zimei sunt ocupate. Ks in aceastd situatie devine IG"t sau turnoverul

::-zimei care aratd numirul de molecule de substrat transformate pe

:cl de enzimi (de toate centrele active a-le acesteia) in unitatea de timp

-.: se exprimd in sec-l. t

b) calcului concentrdtiei serice de enzirr.d- in scopul stabilirii

:1or diagnostice.

in situafia in care concentralia substratului [S] este foarte mare,.:teza inilia15. este independentd de concentralia substratului qi devine

==a15. cu Vmax.

Vo = Vmax sau Vo = K"", [Er]Aceasta inseamna c5. mS.surAnd iteza la saturatie {atunci c6nd

=:zima este saturate cu substrat) mdsurdm de fapt cantitatea totala

ie enzimd [Er] prezentS. intr-o proba biologicd (sAnge de exemplu) la un

:oment dat.

c) studierea influenlei inhibitorilor asupra vitezei de reac{ie.

-{ceasta va fi prezentatd pe larg in capitolul "Inhibifia

activitdtii

-=zirn-lar ' ln 4C\

40

1.6,2.2. Ecualla Lineweaver-Burk

Relalia oblinutd de Michaelis_Menten este ,incomod.d.,, atAt dinpunct de vedere matematic fiind o functie hiperbolicl (a cdreiproportionalitate este limitati), cAt 9i din punct de ved.ere practicIiind necesare un numdr foarte mare de determindri practice pentrutrasarea ei. O formd mai avantajoasd. a hcestei relalii a fost oblinutd.de Lineweaver qi Burk prin liniarizare. Liniarizareaa fost facute prininversarea ecuatiei Michaelis-Menten obfinAndu_se ecuafiaLineweaver-Burk (ecuafia 22), in coordonate 1/Vs $i t/S . Trasareagraficului in coordonate reciproce,l /V6 funclie de 1/S, are avantajulde a permite determinarea cu mai multa precizie a vilezei maxime.care poate fi doar aproximatd in graficul in. coordonate directe Vofunctie de S.

Ecualia Michaelis 9i Menten f15) poate fi scrisi gi sub forma:

Km + [Sl

Vunx [Sl

sau

lKml l

V Vunx tSl Vnrax

Scrisd sub aceastd ultimd formd ecualie 15 devine o ecuatle de

_, Vrnax.Svn =- t - t f , )- Km+ [S]

tipul y=ax + b in care _L $i. l

91 "*" sunt constantele a

sunt variabileie y respectiv x , iar K.

I1sauvo

_l_tsl

$ ib

Vrnax'SKm+S

(22)

ReprezentAnd inversul vitezei j_ in funclie de inversulconcentraliei substratului

* se obfine o dreaptd care taie axa y inpunctul

* i* axa X in punctul - { a$a cum rerese dJn graficul

alAturat (fig.11).

lr

Fig.ll - Reprezentarea gralicd a ecuafiei Lineweaver-Burk. Intersectia cuaxa x este data de - 1 y'K-, intersectia cu axa Y este data de 1/V*

Intersec{ia cu cele doud axe se face la x = 0 (intersectia cu

ordonata) respectiv y = 0 (intersecfia cu abscisa).

Interseclia cu abscisa:

y=g <- -L=6 adici:

Nmllo= t * ' rs *ut*

1I 1 vmax

;z-=-- : : - ' -a;-LSI vmru( I\m

(23) sau

Q4)

(2s)1__ 1[s] - Km

Intersectia cu ordonata:

x=0 <+ I =0 adicE:tsl

l= I e6)Vo Vrmx

Reprezentarea gra-fic6. a ecuafiei Michaelis - Menten qi a ecuafiei

Linewever-Burk sunt prezentate comparativ ir frgura 12.

rFI

- l

Fig.12. Inliuenta loncentrarie; a,rl,-+*^L-,_-. b.oo,ao,,"t. dii"'Jtl v;;l'iJiiii:i- :"bstratului asupra vite. b1 in coordonatJil;:ii";!','i)lde reactie a) in

t.6.2.9. Inhibilia acttvitifii e3zlmelorEcualia Michaelis_Menten sthbileqte o rela{ie intre viteza dereaclre qi concentratia substratului in situafia particulare in care inmediul de reacfie existd r

dereacfie.rncondirii.":::;T;1il:":::H"ilJ:':l;.,H1:pot fi prezenti diverqi corrInfluenla unor astfer o"

",to"ut

care pot influenta activitatea enzimelor'>mpugi va fi prezentatd. in cele ce urmeazE-.Activitatea enzimelor poate fi diminuatd sau anihilatd deprezenta in mediu a unorde naturd endogend ilffi-:il1':1"T:':ff :l,l;:.il,":::exogend (toxice, medicam

poate avea efect reversibii

tente' xenobiotice in general) ' Acliunea lorsau ireversibil asupra activitalii enzimatice.

1.6.2,O.1. Inhibttia reversibiliIn cazul inhibifiei reversibile inhibitorul se leaga prin legdturislabe, reversibil, de enzimr

des intilnite, sunt: inhibilia ' Tipurile de inhibilie reversibild' cel mai

competitivd gi cea necompetrtivd.

43

1.6.2.3.1.1. Inhibifia competitivi

in acest tip de inhibilie inhibitorul are o structure asemdndtoare

:u substratul qi intr5. in competilie cu acesta pentrLl a ocuparea

:entrului activ al enzimei. E;nzirna E poate lega fie substratul S, fie

:rhibitorul I, fiind posibile urmdtoarele echilibre:

S;z ES ..-....._ E + P

-: EI ____jt_ P

Enzir/j,a angajata in complexul EI nu va genera produqi de

:eac!ie, numai complexul ES va permite formarea acestora. Inhibitia

Cepinde de concentralia substrafului qi a inhibitorului; ea poate fi

anulatd prin creqterea cantitdlii de substrat. Mdrirea cantitd{ii de

substrat, face posibild dezlocuirea inhibitorului de la centrul catalitic

al enzimei gi atingerea vitezei maxime . Yiteza maximd va avea aceeagi

saloare ca qi in absenla inhibitorului, dar in acest tip de inhibilie

scade aparent afinitatea enziJnei pentru substrat. Cu a-lte cuvinte

valoarea lui V-," nu se modifica, iar valoarea lui K,,, cre -'- r 4" rl j: t lc t / /7 'J/

InLibilie conpetitivdII

vo tif, irhibitef

Inl, ibil ie cornpelirivi

Fig.13 - Efectul unui inhibitor competitiv asupra vitezei de reactie.eprezentat in coordonate Ve qi 56 (a) $i in coordonate reciproce l/Vo $i f/S F).Viteza maxime atinsa de enzima este aceeaqi indiferent de prezenta inhibitoruluicompetitiv; valoarea lui Km creste modificAnd aparent alinitatea enzimei pentrusubstrat.

I44

Un exemplu de inhibifie competitivd il constltuie activitatezsuccindehidrogenazei careai acidului succinic: "",," ":I:.lTi;l H[:ltr:: :,TH"

I0

COOHICH,l- +cH,I -cooH

AciC succinic

/ * ' .J(uer"_p y, A =.--(acceptor, fonlE oxida6)

cooHCHll + AH,

"f luc.epto., roira r"aug

cooH

Acil tunnrb

Principiul inhibi{iei competitive igi gdseqte aplicatie in practicaterapeutice deoarece un numdr mare de medicamente sunt inhibitoricompetitivi ai unor enzime. CAteva exemple care ilustreazd acfiuneaunor medicamente ce funclioneazd ca inhibitori enzlmatici, suntprezentate in capitolul ,,Medicamente _ inhibitori competitivi, (p. 46).

I.6.2.g.1,2, Inhibif ia ueconlpetitiviIn acest tip de inhibifie, inhibitorul are o structure diferitd de asubstratului, deci nu intrd. in competifie cu acesta pentru ocuparea

centrului activ al enzimei. Ei se fixeazd intr_un situs diferit de centrulactiv, gi se poate lega fie de enzimd,, fie de complexul ES, fiind posibileurmetoareie echilibre:

EIS --)F--+ 91a p

ES

II

E+ PMoleculele de enzir

produs, cere angajate r" ""*,ffi.,;:'"" #:Ti::"J;:j:;angajate in complexul ESImicd, care poate fi ""r,,j",o ;T:"r:;:::H;;:Tff:::"T

It

45

enzime doar una va genera produs, ceea ce va duce la o sc6dere

semnificativl a vitezei maxime a procesului, fSrd insd a se modifica

r-aloarea Ku-u1ui. Deoarece aceqti inhibitori au o structure diferitd de a

substratului, acest tip de inhibitie nu poate fi indepdrtatd prin

cresterea concentra[iei de substrat. Prin urmare va]oarea 1ui Km

rd-mAne constante, in timp ce valoarea lui V-"* scaae.(f 2 /4) .

Fir i inhibitor

a)

I

I

I'

Fig.14 - Efectul unui inhibitor necompetitiv asupra vitezei de reacliereprezentat in coordonate Vo S+ So (a) $i in coordonate reciproce 1/Vo Si 1/S (b).Valoarca lui Km este nemodilicatd, inhibitoml avand structura diferitd de asubstratului. Viteza maxima* atinsi de enzima este mai mice ca urmare amrmdrului mai mic de molecule de enzime active.

1.6,2.3.2. Inhibilia ireversibili

in cazul inhibiliei ireversibile inhibitorul se 1eag5. prin legS.turi

puternice, covalente, de enzimd (la centru de catalizd sau la cel de

legare a substratului), blocdnd definitiv activitatea enzimei; se spune

ce en:zirr,,a a fost otravite.

Exemple de "otrdvuri" sunt unii compugi organici

(iodacetamida, p-clormercur benzoatul, compugii organofosforici), ionii

metalelor grele (Ag*, Hg2*, Cd, Pb), agenli oidanli etc.

Diizo-propil-fluor-fosfatul (un compus organofosforic) inhibd

ireversibil tripsina, blocAnd gmparea -OH provenitd din serind situatd

in centrul catalitic.

Inhihilje neconrpelitivE

r

-46

H:\ fH'r fHf '?cH-cHr-O-P:O

cool l

Hrgl- ^'\g11.

Tripsina Dii- izo-propil- fl uor-fosfr t(DFP)

Acelaqi fenomen se petrece qi in cazur corinesterazei. DFp esteun compus letal deoarece sisteazd degradarea acetilcolinei, compusesenfial pentru propagarea impulsului nervos.

Metalele grele (Hg, pb, Cun- Ag) sunt inhibitori deoarece secombinS. cu grupdrile -SH ale enzimei, formAnd mercaptide qi blocendireversibil activitatea acesteia.

Enzima-SH + Ag* -__+ Enzimd_S_Ag + g*

I.6,3. Medicamente - inhibitori competitieiTerapia medicamentoas E, se bazeaz6, pe inhibilia competitivd,

multe medicamente fiind inhibitori ai activitdlii unor enzime.I) Sulfamidelor sunt analogi structurali ai acidului para_

amino-benzoic:

nN$coou H,N$sor-Nu,

H:\ /rtr3CH

6I

H + F-P:OIo

'CH"H:C' 'cH,

acil para aminobenzob sulfonamid.i Oacteriostatb)

Acidul para-aminobenzoic (pABA) este utilizat de unere bacteriiin sinteza acidului folic, compus indispensabil cregterii lor.Sulfamidele intre in competilie cu acidul p_aminobenzoic ai inhibdproducerea de acid folic necesar diviziunii bacteriene, impiedicdndastfel inmullirea acestora.

f'cH-cH2-OIcoI

47

HrN-/N-.nzN\t i l l*>A*o

OH

Acd folib

r------- - - -1r /--\ |

crrrfrn{ fcoi{NH-cutn-l \ - \ lL--------" \ - -

\PABA

2\ Chimioterapia anticanceroase face apel la numerogi

antimetabolili, a caror administrare produce inhibilia sintezei de acizi

rucleici, fapt ce determini blocarea diviziunii celulelor cu multiplicare

:apidd, cum sunt celulele tumorale' Un exemplu il constituie

medicamentul cunoscut sub numele de metotrexat'fe

us

se

nd

H2N-2N ""'N\\CID FOLIC I l l | // \

' ior-a inactiva) n\,\N/-cH'-T -\jFCo-(GIu)

, Nu, cH:

I 'oto**'i l^f lo

EIYH,Vt-y,,ty*. - dhidroblat n,r'r-ZN-.,,.N-<E

.-A*1i",-i l{_Lco-,cbh +?,\+*1._"oH NADPH P49P tln H -' i i

dibidofolat Erahidrofolar

CO-1Grr)

fA'

ACID FOLINIC(foma activa)

erii

f,)r.

iba

ind

Acidul folic indispensabil diviziunii celulare este adus in

organism prin aport exogen (p'83-84)' Aici suferi o serie de reduceri in

urmacslorarezulteaciduitetrahidrofolic(a$anumitaformS'activda

acidului folic) implicat in diviziunea celulara' Administrarea de

metotrexat inhibd dihidrofolat reductaz a' enzirrrd responsabil5 de

sinteza formei active a acidului folic' stopdnd astfel multiplicarea

celulard, inclusiv a celulelor tumorale'

48

3) Alt exemplu de inhibitor competitiv utilizat ca medicamenteste alopurinol-r.r.l.

NH,t -

Nz\---Nt l t t l\NA*/

H . . \

Adenina

?H .-..'Nz\r-Nt i l t l

HTNAwAN/H

Guanina

?HNz\'n--Nt i l t l

noANAN/

XANTTNA

AI'PI'RINOL

lc tt "V

--.--'-------.->Xantin-oxidaza

(x.o.)

?HNz\_Nl i l t l

soAN NtrnH

ACID T]RIC

Adenina qi guanina, "o-plrg

aparfinAnd materialuiui genetic,sunt degradate printr-o serie de reaclii ce duc la un compus comunnumrt xantinS. Acesta este oxidat in prezenla enzimei xantln oxidazdla acid uric, produs care este eliminat prin urina. Acidur uric este uncompus cu solubiiitate relativ micd. Creqterea cantitdfii de acid uricin sAnge duce la acumularea iui in lesuturile moi sau in articulaliisub formd de tofi gutoqi, care declangea zd, reaclia inflamatorie, inboala numitd guti. Aiopurinol-ul, utilizat in tratamentul gutei,inhibS. acliunea xantin-oxidazei, prevenind incircarea organismuluicu acid uric.

:r.) /1SJ ; a,^ac ,", ,lr,r*rlI.6.4. Cinetica de tip sinusoidal

/

Ecualia Michaelis-Menten descrie funcfionarea unor enzlme,care poate fi exprimatd. de o funclie de tip hiperbolic. Acest tip defuncgionare este ca.racteristic enzirnelor care au o afinitate datd.constanti' pentru substrat. De reguld. centru activ al acestor enzime seocupe u$or cu substrat, se satureazi rapid qi activitatea lor devineindependentd de concentralia substratului, depinzend doar de

initatea intrinsecd a enzirnei pentru substrat. Ne aJldm in cazul in

:ere Km, afinitatea enzimei pentru substrat este ,,constante".

Exista insd enzime care igi moduleazd activitatea funclie de

-:onjuncturE", adicd uneori ptezir:le aflnitate mare pentru substrat,

iteori au afinitate micd pentru acesta. Aceste enzime poarti numele

:e enzime alosterice, sunt enzime ,,reglabi1e" cu afinitate adaptabili

:leconstante) qi prezintd o cineticd de tip sinusoidal.

Pentru a inleiege comportamentul acestor enzime va fi

prezentate functionarea hemoglobinei care nu este o enzim.i, dar care

poate reprezenta un modei pentru funclionarea enzimelor alosterice.

Hemoglobina este o proteind care are rol in transportul Oz de la

pld.mani 1a lesuturi. Ea nu are afinitate ,,constanta" fald de oxigen ci

aceasta variazd funclie de condilii1e fiziologice qi de lesut. Astfel ea are

afinitate mare fald de oxigen la nivel pulmonar, unde are loc

incercarea oxigenului qi alinitate micd la nivel tisular unde se face

descdrcarea acestuia. Mentinerea constante a alinititii pentru oxigen,

adic5. menlinerea aceleaqi afrnit5li (mari, de exemplu) 9i la nivel tisular

ar face imposibild descdrqarea acestuia qi oxigenarea lesuturilor. Cu

a-lte cuvinte hemoglobinzi nu poate avea o aflnitate constantd, ea

trebuie s6-gi ,adapteze" afinitatea fa!5. de oxigen, pentru a-qi indeplini

rolul frziologic.

Deci in studierea enzimelor ce se comportd asemindtor

hemoglobinei, afinitatea constante definite de Km nu mai este

relevaltd. De aceea in cazul acestor enzime, nu mai este utilizatS.

constanta Km ci un parametru S numit grad de saturare aJ enzimei,

care se exprimd in procente [12].

Determinarea vitezei de reac{ie funclie de concentrafia de

substrat (gradul de saturaJe al enzimei) pentru aceste enzime a dus 1a

oblinerea unor curbe de tip sinusoidd (ng 15).

50

_ Fig. t5 - Reprezentarea€rali:1l ":t9Ti g" reaciie Vo funcfie de concentraua

;l|:f,SitJ:Li:T}ffY':- ce prezinte't etici-J-i.,,-,Joiaaralcurba continua).."t" p.",",'tli "o-i;il il'::':dffi1?iu jf, *"n"* "i""t"" r'al"r,*ri"-r'a".'iJi'

Analiza unui asemenea tip de curbd aratd ci:} la concentralii mici de substrat viteza d.e reaclie cre$tefoarte putin (nu direct proporEonal pa in cazul cineticii Michaelis);p la concentralii ,,intermediare" addugarea unei mici cantitdli

de substrat produce o creqtere bruscd, semnificativd, a vitezei dereacfie;

! viteza maximd este atinsd mai curdnd la concentralii foartemari de substrat (fafd de cinetica Michaelis_Menten cdld vitezamaximi se atinge relativ rapid la concentra{ii nu neaparat foarte maride substrat);

! a"finitatea enzimei este dictatd direct de concentralia desubstrat (in cazul cineticii Michaelis alinitatea rdm6le constanteindiferent de concentralia substratului), acesta devenind un modulatoral enzimei. Acest tip de activitate enzimaticd poate fi explicat prinfenomenul de cooperativitate (vezi modelul de funclionare a1hemoglobinei, p.57) ce se manifesta atat la cre$terea cat $i la scd.dereacantitdlii de substrat;

) concentralia substratului pentru care viteza este Vmax/2este notate ca S5o sau So,s $i reprezinta gradul de saturare al enzimei cedetermind atingerea unei viteze qald-vmax/2.

te

liaa).EN

iti

de

te

n

ri

te

DT

in

al

lc

) t

Factori care modlfici viteza de reactie

Pe hngn influenla directi a concentraliei substratului asupra

vitezei de reactie activitatea enzimelor alosterice este influenlatd' 9i de

aqa-numilii modulatori, efectori sau liganzL Ca modulatori pot

functiona substratele, metabolilii sau intermediarii metabolici'

Inlluenta modulatorilor asupra activitdlii unei enzime alosterice este

prezentatS. in frgura 16.

Funclie de efectul pe care il exerciti, modulatorii sunt pozitivi

(activatori) sau negativi (inhibitori) :

1) modulatorii pozitivi (activatori A) mdresc capacitatea de

legare a substratului, in consecin!5 centrul activ se ocupa mai rapid,

viteza creqte semnificativ gi curba tinde spre o alurd hiperbolicd (vezi

funclionarea enzimelor a-losterice p. 54).

2l modulatorii negativi (inhibitori I) micqoreazd capacitatea de

iegare a substratului, viteza scade semnificativ gi se accentueazd

caracterul sinusoidal al curbei'

l

t's {t.]t

1.0tsl

Fig.16 - Prezenla modulatorului pozitiv A m6re$te afnitatea enzimei pentru

substrat li implicit saiurarea rapidd a acesteia, viteza cre$te brusc, alura curbei

devine hiperbolic A. Prezenta modr.rlatorului negativ I micsoreazd afnitatea enzimei

pentru substrat, viteza cre$te 1ent, curba i$i accentueaza aspectul sinusoid [6]'

ia concluzie: cinetica enzimaticd evidenfiezd. doud tipuri decomportdri ale enzimelor:

1) o comportare ce respecti. cinetica Michaelis_Menten, de tiphiperbolic, caracteristicd. enzimelor constitutive cu alinitate

"constante" (mai mare sau mai micd.) fali de substrat indiferent de

concentratia acestuia, ln cazul cineticii Michaelis Menten afinitateaeste o constantS., nu un parametru variabil. Enzimele d.in aceastacategorie au (de reguld.) un K,o mic, centrul activ al enzimei se ocupduqor gi enzima ajunge rapid la saturatie.

2l o comportare ce respecta cinetica sinusoidald,caracteristice enzimelor alosterice cu afrnitate variabild. pentrusubstrat. Aceste enzime i;i adapteazd. activitatea functie deconcentratia substratuiui gi lucreazd diferentiat la concentralii micirespectiv mari de substrat. in cazul enzimelor alosterice afinitatea numai este o ,,constante" ci este un parametru variabil, dependent larAndul lui de concentralia substratului qi de prezenfa/absentamodulatorilor.

r.7. REGLT\REA ACTTVTTaTTI TNZIMELOR

Majoritatea enzimelor ri"spund la o cre$tere (de exemplu) aconcentraliei substratului printr-o cre$tere a vitezei de reacfie. Aceastaare ca efect scdderea rapidd a concentraliei substratului, fapt care facenecesard o nou5. reajustare a itezei de reacfie. Astfel reglarea vitezeide reaclie a enzimelor este esenliald pentru coordonarea proceselormetabolice.

Principa.lele mecanisme prin care este reglati. activitateaenzimelor dintr-o cale metabolicd, sunt reprezentate d.e:

,Xl Reglerc a alo stericd.;

f) Regla:ea covalente (prin fosforilare-defosforilare)

fl /lansformarea pro-enzimeior inactive in enzime active;

l) Reglarea sintezei de enzime.

I.7.1. Reglarea alosterica este mecanismul cel mai complex

- coordondrii metabolice. Enzimele supuse acestui tip de reglare

s:.int enzime alosterice, limitante de vitezS' in cadrul unui proces si

=atalizeazd, de regu15 reaclii ireversibile. Reglarea activitelii 1or este

posibild datoritd structurii 1or particulare. in cele ce urmeazd. vor fi

.:ezentate pe larg structura, funclionarea gi factorii ce influenleazd.

activitatea acestor enzime speciale.

1.7.L.1. Structura enzlmelor alosterice

Enzimele alosterice sunt enzime care prezintd pe lAngd

:entrul activ un situs (uneori mai multe) suplimentar, numit situs

sau centru alosteric (fig. 17). A1o provine din grecescul ,a1o" care

:nseame altul. Compugii care se 1eag5. la acest situs poartd numele

de modulatori sau efectori sau liganzi. Legarea unui modulator

alosteric produce modifrcS.ri conformalionale aie enzimei, care

determini modifi carea afmitelii acesteia pentru substrat'

Din punct de vedefe structural enzimele alosterice :

* sunt proteine cu structure cuaternare alcdtuite din mai multe

lanluri poiipeptidice, numite monomeri sau subunitdfi, care

de reguld sunt in num5.r Par.

* fiecare unitate prezintS- un centru activ gi unul sau mai multe

centre alosterice.

* fiecare subunitate se prezintd sub doui forme: o forma T

(tight sau tense) cu afinitate scdzutS. pentru substrat

(stabilizat5. de modulatorii negativi) 9i o formd. R (relaxed) cu

afinitate crescutS. pentru substrat (stabilizatd de modulatorii

pozitivi).

*"-. *** -flilc*,ru a,.s,€r c

Fig.17 - Structura enzimelor alostedce, alc5tuite din monomen ce i$i potmodifica afinitatea pentru substrat funclie a" f.r"a p. ""*

, adopte h un momentdat: torma T cu afnitate sc5_zuta, forma R cu aliniiate "ies"l,,ta

p"rrt.,] substrat.Modificarea de forme este dictate de prezen!"7.UJ. *"JJ"iorilor I12l .

1.7.1.2. Funclionarea enzlmelor alostericeAu fost elaborate dou6 modele care incearca sd explice

funcfionarea acestor enzime, modelul simetric qi modelul secventiai.Modelul simetric

Acest model trebuie sd respecte condilia de simetne in sensul cimonomerii pot exista fie in forma T, fie in forma R, star e hibride TRnefiind admise (fig. IT). Legarea modulatorului (de exemplu modulatorpozitiv) la starea T determind tranzilia acestuia la forma R fdrd aparifiade specii intermediare. In virtutea simetriei toli monomerii vor suferitral:zilia T-+R ceea ce va accelera semnificativ legarea substratului.

-

Centri cat litici cu afinitatemici pentru substrat

Srrrea TT

- Modulatorul nesativ s€ tcssn fl *"0r,,*', o-,tiv (sau substHrurprcrerenlial d€ forma T qi nenline proteina | | in cooperrrivitlkr homorrop{ pozttiva)alostericl ln conforha a TT I ls€ teagi preferenliat taforma R ii mentrne

| | prorein' atosteric, in conrormalia Rir

IC€ntri crtaliticl cu afinitste mare

Pentru substrat

Starea RR

55

Iapt ce va determina o cre$tere bruscd a activit4ii enzimei, respectiv a

ritezei de reaclie - efect cooperativ. Aceeaqi comportare se va manifesta

9i la fixarea unui modulator negativ, numai c5" efectul va fi contrar, de

scS.dere rapidd a fixirii substratului, respectiv a itezei de reactie.

Modelul secvential

Acest model abandoneazS. principiul simetriei in sensul cE

monomerii pot exista in forma T sau in forma R dar sunt admise qi

formele hibride TR (fig. 18). Legarea unui modulator pozitiv la forma T,

induce tranzilia T)R, dar efectul se limiteazd doar la monomerul

vecin. Numai monomerul vecin va fixa cu mai multd ugurinld

substratui 9i modifrcdndu-gi conformalia, va induce tranzilia T)R

monomerului urmetor, fenomenul propagAndu-se din aproape in

aproape la toli monomerii.

Contd cdalitid ql Ninhlle mlci

Cs{rr alo$edc

Cooperdtvftrta deg{tba Cooperthl{te pad$vl

Fig.18 - Model secvential, in care monomerii pot adopta configuralii inintregime T sau R sau conliguratii hibride TR. Modulatorii pozitivi inducttalfzilia T)R doar monomerului vecin ducand la aparitia formei mixte TR.Aceasta leage la unitatea R (ce are afinitate crescut5) substratul, ceea ceinduce tranzilia T) R urmdtorului monomer. Modificarea se transmiteprogresiv tuturor monomerilor [ 1 2].

I56

Modelul sewenlial poate fi ilustrat pnn comportareahemoglobinei. Hemoglobina este un tetramer alcdtuit din patru lanluripolipeptidice, numite subunitdli sau monomeri, in care fiecaresubunitate transporte o moleculd de odgen. Hemoglobina se prezintd.sub doud forme:

1. o formd tensionatd., cu alinitate micd pentru oxigen,determinati de o structure densd, cauzate de legituri de hidrogen, ceimpiedicd migcarea Iiberd a monomerilor (Iig.2O);

2. o formi relaxate, cu afinitate mare pentru oxigen,determinatd de o structurd. ,afAnatd.", canrzatd- de ruperea unorlegdturilor de hidrogen fapt ce permite miqcarea iiberi a monomer or:

o.,_\__*

(b)

,,,,,,.:,:'?""*; j:,xT:T: ,ltiii*H"efiffl .|i Rii:: :i:iLT"ffix,"'H::T$T:#:HlTrl"&:*?I;Hr*'ceantreneazed"ph";";i;ti;;;i;;fi;';nrjn,"*,*i:*i*il*#":glruf'+i:ikl#,n::ruh":m:

La nivel pulmonar, presiunea crescutd a oxigenului ,for!eaz6,Lg".ea" unei prime molecule de oxigen, in urma legdrii, F6z* din hem

x pozrlioneazd, in centrul nucleului tetrapirolic ceea ce antreneazd

cieplasarea histidinei proximale gi a intregii porliuni de lan! c5reia ii

apaltine (ng. 19).

Apar aqadar modificdri conformalionale ale acestei subunitdli

care duc la ruperea unor legdturi ionice s1abe, prezente in forma T. in

Jrma acestor modific5ri forma T trece in forma R care are alinitatea

crescutd pentru oxigen. Aceste modificdri sunt tralsmise subunitb.lilor

urmetoare astfel ce monomerii 2, 3 Si 4 vor trece consecutiv in forma

R Altfel spus prima moleculd. de oxigen se va lega greu, urmdtoarele

din ce in ce mai ugor. Subunitdlile se inlluenleazd asadar reciproc,

cooperand in fixarea substratului (frg.20). De aici no{iunea de

cooperativitate in activitatea acestor enzime.

l,a nivel tisular, datoritE. gradientului de presiune, oxigenul este

descdrcat. Pierderea primei molecule de oxigen va favoriza conversia

formei R in forma T, conrlersie ce se va transmite progresiv tuturor

subunitdfilor. Astfel detaqarea primei molecule de oxigen va determina

desprinderea din ce in ce mai rapidd a urmdtoarelor.

EE l@[F ]@ @, @ @ @ @r // ' ' U .::-: I li ll =:= i ll jl j :::= ]i /l =:= ii ll

6,@ f lCF t10i &Q @@

Fig.2O - Traazitia de la forma T la forma R. Legd.turile slabe dintre monomeriprezente in forma T ( punlile albastre) se rup progresiv pe masure ce odgenul estefixat. Fixarea fiecarei molecule de oxigen antreneaza tranzifia T) R a monomeruluinvecinat. Progresiv trarzitia T) R este indusa pas cu pas tuturor monomerilor.

58

Observalie: la nivel tisular descdrcarea oxigenului nu este totaldci doar in proporfie de 5O%. Aceasta se explicd prin faptul cd odescdrcare tota-ld ar duce la stabilizarea formei T care s-ar oxigenamult mai greu la nivel pulmonar. pestrarea unui grad d.e saturare inoxigen duce la menfinerea unei forme intermediare (hibride) cefavoizeazd, prin efect homotrop oxigenarea rapidd Ia nivel pulmonar.

1.7,1.3. Factorii care regleaze acHvitatea enzimeloralosterlce

Activitatea enzimelor alosterice este modificatd de a$a_numitiimodulatori sau efectori sau liganzi.

Funclie de natura lor, modulatorii sunt homotropi sauheterotropi.

Modulatori homotropl

in aceasti situatie modulatorul se identifici cu substratul. Celmai adesea substratul acbveaze enzima care il transformh. Se spuneca substratul este modulator pozitiv gi genereazl un efect homotrop.Legarea unei molecule de substrat la unul din centrele active aleenzimei mare$te capacitatea de legare a celorla.lte centre active. Cu altecuvinte monomerii se influen{eazd unii pe alfii, instatAndu_se aqa-numitul efect cooperativ intre centrele active ale enzimei. Urmareacooperdrii monomerilor este cre$terea bruscd a vitezei de reaclieobservatd in cinetica sinusoidald (p.SO). Un exemplu de efect homotropil poate constitui fixarea oxigenului la hemoglobind, acestafavorizAndu- qi propria legare.

Modulatori heterotropi

Modulatorii heterotropi sunt compuqi diferili de substrat, ingeneral produqi de reactie sau metaboli{i qi pot genera doud. tipuri deefecte, reversibile gi anume: (a) feed-forward, de regula activator 9i (b)feed-back, de reguld inhibitor.

(J3Ifi*T.)a) Reglarea feed - forward

Acest tip de reglare a activitdtii enzimatice are scopul de a imprimaun anumit ritrn unei c5i metabolice. Tralsformarea substratului A inprodusul final H are loc printr-o succesiune de reacsi catalizate de diferiteenzime, in care reaclia calalizatA de enzima Ez (de exemplu) este limitant6de vitezd. Aceasta insemnd cd transformarea compusului B in C sereaizeazA cel mai incet, ceea ce poate duce 1a acumularea lrri. Creqtereaconcentratiei compusului B, in mediu de reaqtie face posibild fixarea lui,tn calitate de modulator pozitiv sau activator, la enzjrrra Es. Compusul Beste deci un activator al enzimei, prin urmare fxarea lui la situsulalosteric al enzimei va detepmina o cre$tere a activitd$i enzimei Es, ceea ceva asigura o fluidizare a procesului, prin prelucrarea mai rapidi. aprodusului F (prezent in cantitate din ce in ce mai mare ca urmare ainilierii cSii metabolice).

Altfel spus un intermediar situat in amonte intr-o cale metabolicd

"atenjioneazS.' o enzimd situatd in aval, sd se ,pregeteasce,' pentru a lacefald unui a1h;x sporit de substrat.

b) Reglarea feed - back

Acest tip de reglare a activitdfi enzimatice se nume$te inhibipe prinprodus final, feed-back sau retroinhibilie. produsril final aclioneazd ca unefector alosteric negativ asupra enzimei reglatoare a procesului.Acumu.larea de produs H, ca urmare a neutilizdrii 1ui ir acelaqi ritm cusinteza, face posibild fixarea ]ui, in calitate de modulator negativ, la E2 carecateJiznaz\, efape fimitante de vitezd a procesr.dui. Se eviti asdel atAtepuizarea substratelor cat gi producerea irr exces a compugilor.

60

I.7.2. Reglarea covalenti (prin fosforilare_defosforilare)Un grup important de enzime iqi regleazd activitatea prin atagarea

respectiv i:rdepdrtarea unei grupdri fosfat la un rest de serina, treonin5sau tirozinS.. Ataqarea resfuIui fosfat poartd denumirea de fosforilare qieste catalizatd de o familie de enzime numite kinaze utilizdnd ATp_ul.indepdrtarea grupdrii fosfat poartE denumirea de defosforilare qi estecatalizati de o familie de enzime numite fosfataze, cu qlutorul apei.

Enz-ser-OH Enz-ser-O-PO32-

l g^n

Rdspunsul la fosforilare/defosforilare este diferit funcfie de enzimd:astfel in urma fosforilSrii unele enzime se activeazd, a]tele se dezactiveaz.d,.Un exemplu de reglare a unui proces metabolic in care este utilizatireglarea covalentE il constituie degradarea/sinteza glicogenului. In urmafosforilSrii glicogen-fosforilaza (enzima responsabild de degradareaglicogenr.rlui) se activeazi, in timp ce glicogen-sin tetaza (enztmaresponsabild de sinteza glicogenului) se dezactiveaza. Astfel prinfosforilarea simr.rltand a unor enzime, se asigurd activarea unei cdimetabolice concomitent cu blocarea ciii metabolice opuse.

I.7,3. Transformarea pro_enzlmelor in eazime activeUnele enzime sunt secretate irr organism in formd inactivd de pro_

enzimS. sau zimogen. De reguld. zimogenii sunt sintetiza! lttr_un anumitcompartiment i:r formd. inactivh 9i sunt activafi la locul acSunii subinlluenla unor factori locali sau autocatalitic. Aceste transformbri aucaracter ireversibil 9i implic5 hidroliza unor legdturi peptidice fcovalente)

_., : - -

f,

o

u

F

it

b

u

e)

de la capdtut N terminal 1in cete mai'riLrtte cazuri) urmatS. de indepirtarea

unor oiigopeptide qi expunerea centrului activ al enzimei.

Un exempiu de zimogeni il constituie enzimele pancreatice (tripsina,

chimotripsina secretate de palcreas $i activate in intestin) (frg.21) sau

enzimele implicate ir: coagulare (sintetizate in ficat qi activate in sAnge)

cunoscute sub numele de factorii coasulSrii.

sau Deosinapepsinogen-4 PePstnd

tripsinogen -ipd!4-!gg94slqB.!!@-- tripsins

chimotripsinogen tripsina > chimofipsini

(un zlmogen,inactlv) |- l

lEnt€rokin|'nPcptid de mascare I

Om--'lv

Tripsini(o prot€rz4 activl)

Fig.21 - Tripsinogenrt este secretat in forme inactive in pancreas. in intestinare loc activarea la tripsine sub actiunea enterokinazei. Activarea se rea.lizeazd prinindepartarea unui fragment oligopeptidic care mascheaza centrul activ. Fragmentuloligopeptidic este situat, de reguld, la capatul N termina-I gi indepdrtare lui duce laexpunerea centrului activ al enzimei 115].

Centru activ

L62

I.7.4. Reglarea sintezei de enzimeMecanismele prezentate mai sus modifici activitatea enzimelor

existente deja in orgaaism. Celule i$i pot inse regla gi cantitatea deenzimd prezentd la un moment dat, prin regrarea sintezei acesteia. inacest caz reglarea este exercitate h nivelul genelor gi este realizataprin procese de induclie sau represie.

Induclia se referd la stimularea sintezei de noi molecule deenzimd ca rdspuns la un semnal tralsmis de o moleculd de inductorSubstratul poate funcliona ca inductor, acesta stimulefid de regulasinteza enzimei care il prelucreazd.

Represia reprezintd blocarea sintezei de noi molecule de enzim5ca rAspuns la prezen{a unui represor. De multe on produgii reactieicata)izate de o anumitd enzimd., aclioneazd in ca.litate de represorilimitand sinteza respectivei enzime.

Acest tip de reglare opereazd,_'intermitent funcfie de condiliilefrziologice la un moment dat. Un exemplu de enzima inductibild esteglucokinaza, prezentd. doar in ficat, a carei sinteza este indusd denivelele crescute de glucozi. in acest mod organismul face faldaportului crescut de glucozd,, dupa absorblie.

Modificarea cantiti{ii de enzimd ca rd.spuns la prezenla unuiinductor (sau absenla unui represor) qi care se traduce prin sintezd deproteine, este un fenomen Lent (ore/zite). in contrast modificdrile inactivitatea enzimei, cauzate de mecanismele alosterice, se instaleazdrapid (secunde/minute).

Pe ldngd" enzimele inductibile, in organism exista $i enzime carese gS.sesc in cantitate relativ constaltd., in sensul cd. rata lor deformare egaTeazd rata dispariliei lor, cauzatl.de procesele normale dedegradare. Aceste enzime sunt cunoscute sub denumirea de enzimeconstitutive. Ele nu sunt supuse reglarii prin mecarrism deinductie/represie; sunt aqa_numitele enzime de servici,,housekeeping_enzJmes" cu afinitate mare pentru substrat gi care saturdndu_se rapid

:i

ri

tq

te

de

care

rde

[e de

vtf ie

rde

:plng-

rapid

lul

.de

:1n

zzd

:i]lg eficienla maxima. Un """-ptt-,

de enzimd constitutivS. il'., \'/ A

:cnstituie hexokinaza, enzima importanta'iir metabolizarea ghtcozei.

I.8. IMPORTANTA BIOMEDICALA A ENZIMELOR

Importanla biomedicald a enzimelor este date de utilizarea 1or in

iagnosticarea unor bo1i, precum gi de folosirea lor in scop terapeutic.

I.8.1. Utilizarea enzimelor in stabilirea unui diagnostic

Majoritatea proceselor enzimatice se petrec la nivel celular, in

:rnp ce determinarea enzimelor se face in general in lichide biologice

sange total, plasmS, ser, urin5., lichid cefa,lorahidian etc.). Enzimele

:rezente in plasmd pot fi clasificate in doud grupe:

} enzime care aclioneazl- asupra unor substrate prezente in mod

:onstant in p1asm5. in concentralii semnificative. Astfel de enzime se

lunesc enzime plasmatice funclionale qi au ro1 funclional la acest

rivel deoarece catalizeazd. reaclii chimice in plasmd. Ele sunt secretate

::r diferite organe (de ex. ficat) qi scdderea activitdlii acestor enzime in

plasmd indicd lezarea orgEnului care le produce. Astfel de enzime sunt

enzimele coagulSrii qi fibrinolizei.

D enzime care aclioneaze asupra unor substrate prezente in celule.

-A.stfel de enzime se numesc enzime plasrnatice nefunclionale deoarece

substratele pe care e1e aclioneazd nu sunt prezente in plasmd, ci in

ce1u1e. Aceste enzime sunt totu$i prezente in plasma. (in concentralii

constante, mici), prezenla 1or datordrrdu-se distrucliei celulare,

normale. Enzimele plasmatice nefunclionale pot proveni: a) de 1a

organe secretoare (ex. pancreas) sau b) din compartimente celulare.

a) in cazul enzimelor provenite de la organe secretoare,

concentralia lor plasmaticd poate varia atAt in sensul creqterii cAt si al

scS.derii cantitali de enzim5: cre$terea concentratiei indicS. o

obstruclie a c5ii de secretie sau o modificare a permeabilitdlii

membranelor celulare (ex.creqterea amilazemiei), in timp ce scdderea

concentraliei indicd o atrofiere a organului secretor.

-64

b) In cazul enzimelor exclusiv intracelulare, prezenla lor inplasmi poate varia doar in sensul cre$terii concentra{iei lor, fapt ceindicS. o 1i25. sau o modificare a permeabilitdlii membrarare ca urnarea actiunii unor factori infecfioqi, toxici sau ca o consecinte atraumatismelor tisulare.

Fiecare organ are un profil enzimatic propriu in funclie departicularitdlile metabolice legate de funclia sa. O bund" parte dinenzime se gdsesc in toate organele, doar proporfia dintre ele diferd dela organ la organ. De exemplu, ficatul este bogat in glutamic_piruvictransaminaza (GTp), glutamat dehidrogenaza (GLDH) 9i succinatdehidrogenaza (SDH) fiind sarac in creatjn kinaza (CpK), in timp cemiocardui, musculatura, sunt bogate in cpK. Aceasta face ca reziunilehepatice si fie caracteri zate p:ir- cregteri ate GpT, GLDH qi SDH, iarcele musculare gi miocardice prin cregteri ale CpK.

Determinarea acestui profil engimatic permite confirmarea unuidiagnostic cdt Si urmdrirea evoluliei bolii prin determinareaconcentratiei enzimelor specifice organului respectiv. Un exemplu esteinfarctui de miocard in care prolilul enzimatic este cel prezentat infrgara 22.

3

II;I

. , - - ' - . - tDX

- Cna.

o7aett

aaaj!6tard

_.., Fig 22 - Nivelele CpK2 $i ale LDH in plasma in infarctul de miocard. CpK2atmge concentralii serice maxime iD 24 o.re ( I zil de la instalarea infarctului. LDHtotal creSte mai incet atingand nivele maxime intr_un interval de +8 ore (2 zile).

65

Muqchiul cardiac este singurul tesut ce contine izoenzirna CpKz

(CKMs). Aparitia in sange a acestei enzime Ia trei ore dupd instalarea

durerii in piept, este specificd infarctului de miocard, qi ea prezintd

activitate maximd la aprodmativ 24 ore de la insta-larea acestuia.

Lactat dehidrogenaza (LDH) creqte Si ea in infarct, dar activitatea

maximd. se observd la aproximativ 30-48 ore de instalarea infarctului.

Astfel determinarea LDH este utild. in diagnostic pentru pacientii

investigati dupd 48 de la infarct (timp la care CIG poate prezenta valori

neconcludente) cd:t gi pentru a urm5ri evolulia bolii, scaderea

activitdtii LDH frind un indiciu de depdqire a infarctului.

O altd modalitatea de investigare a unei afecliuni este cea a

determindrii izoenzimelor specifice unui anumit lesut. Un exemplu iI

constituie tot infarctul de miocard in care poate fi determinata o

izoformi, a enzirr.,ei LDH, specificd doar muqchiului cardiac. Izoenzirrra

LDHr este specificd cordului; concentralia ei atinge valoarea maximd in

24-48 ore de la instalarea infarctului (fig. 23).

in cazul enzimelor intracelulare, diferenlierea localizdrii lor

permite aprecierea gradulgi de lezate a celulei/fesutului. Astfel unele

enzime sunt loca-lizate doar intr-un singur compartiment celular

(enzime uniloculare) cum ar fi: glutamat dehidrogenaza (GIDH)

prezentS. doar in mitocondrii, sau LDH gi glutamic piruvic

transaminaza (GPT) prezente numai in citoplasmd.

AIte enzime sunt prezente at6.t in citozol cdt gi in mitocondrii

(enzime biloculare), ca de exemplu glutamic oxalacetic transaminaza

(GOT). Creqterea LDH qi GPT intr-o afectiune hepaticd sugereaze

leziuni limitate la spaliul citoplasmatic. Cre$terea concomitenta gi a

GOT indicd o posibild. leziune mai avansatd care intereseazS. inclusiv

membranele mitocondriale. Confirmarea este data de dozarea GIDH,

enzime strict mitocondriald.

66

And| I [ | | | catod

r234Tlpul l.oeddm$

Fig.23 - Profilul seric alizoertzimeTor lactatdehidrogenazei (LDH) in serulunui pacient sdn5tos $i ininfarct. in serul normal LDHIeste prezentd in concentratii

' mai mici decat LDHz (a). inl. infarct, nivelul total al LDH

cre$te proglesiv (b), cu.resfPree in sneciel a

concentraliilor LDHI caredepdqesc nivelele LDHz intre12- 24 ore (c)- cresterisecundare ale concentrafiilorLDHs pot apare ca urmare acongestiei hepatice (c). Asfelpot fi monitorizate $icomplicaliile secundare aleinfarctuiui [11].

c) O modalitatea de diagnosticare moderne a apdrut prin

asocierea enzimelor cu imunoglobulinele in a$a numitele teste ELISA

(enzime -linked immunoabsorbent assay).

(al

lo,

ln.ohr( rr i.rol rm 6ntln. r.d.nrol,,trllltdl r. l..tl In d&sprl

ry.$l{i{- Utuk.n r !.ri. d* rlr!. r|! {'tliE

G}lNb* er .nihdit rr..m.

h $n r{. nsrt mot.t wi4n,!l!*e *tnhdF*l.i hrtd.. trd

d{.. r.dc {nar, ln al$Or sr.iidrrt-rn tr{r Mrl!.n.

o-w€((dl

LrubuN.r lubitr.t rDr(in( riBaonErdlt tttll .r{a.|. h$..lltu itma.rdlhr'-

+.*4!(Et!. rle.ru$ln ql..rlFertlruan{l$nki a da.dali. DriFsrrnt.

Fig 24 - Principiul tehnicii ELISA. intr-o prime etapa se fixeazd. un anticorpspecific pe suportuJ solid (a). Se aplica apoi serul testat. Antigenul din ser se va fixape anticorpul specifrc (b), dupe care se va add.uga anticorpul specilic marcat cuenzimd (c). in ultima etapd se adauga substratul specifrc enzimei {d), care in urmaacliunii acesteia va genera un compus colorat, a carui intensitate este propo4ionalacu cantitatea de antigen din serul testat I121.

Metoda consta in generarea unor anticorpi specifici, print

inocularea la un animal de experienl5 (qoarece, iepure) a unui antigen

uman, cum ar fi virusul hepatitei. Acest anticorp specific este fixat pe

o supra-fale sotdi intr-o capsule mici de polistiren numitd. godeu.

Pentru a evidenlia prezen.tra virusului hepatitei la un pacient, serul

oblinut din sAngele acestuia, este pus in godeu. Aici are loc o primi

incubare prin care antigenul din sAngele pacientului (in cazul de fafd

virusul hepatititei) se combine cu anticorpul specific fixat pe godeu. Se

indepdrteazS. apoi componentele nereacfionate, se fac o serie de spdldri

cu solutii tampon adecvate, astfel incet pe suprafala solide rdmane

doar complexul antigen-anticorp. Se realizeazd o a doua incubare prin

addugarea unei solulii ce contine acelagi anticorp specific, marcat insd.

cu o enzimd, adic5. un anticorp la care s-a legat covalent o enzimA, de

regule o peroxidaz,e. In aceastd etape anticorpul marcat cu enzima se

va fixa doar acolo unde antedor s-a fixat antigenul. DupE o procedurd

68

de spdlare in care se indepdrteazd, excesul de anticorp marcat se face oultimd incubare prin addugarea substratului specific enzimei. Enzimava actiona asupra substratului gener6ld, de reguld, un compuscolorat. Reaclia enzimaticd este apoi stopate adiugand, de reguld, unacid puternic (ex. HCI). Cu cAt culoarea generate va fi mai intensd. cuatat cantitatea de enzimi. fixatd a fost mai mare, deci qi cantitatea deantigen din ser mai mare. Altfel spus, intensitatea culorii generate estepropo4ionala cu cantitatea de antigen din ser (figura 24).

I.8.2. Utilizarea enzimelor in scop tetapeutic

Cele mai intalnite enzime utilizate ca agenli terapeutici suntstreptokinaza Si aspara gi naza.

Streptokinaza este utilizatd" in infarctul de miocard pentrudizolvarea cheagului. Ea activeazE plasminogenul la plasmini., enzimdfoarte activd in liza cheagului la elemente componente solubile.

Asparaginaza este utilizatd in terapia anticanceroasd. Celuleletumorale au nevoie de cantitdli crescute de asparagind pe care o ,furd,,din sAnge, lipsind astfel celulele normale de acest amrno acid.Administrarea de asparaginaza scade nivelul acestui aminoacid siirnplicit viabilitatea celulelor tumorale.

Utilitatea terapeuticS. a multor enzime este limitatd, deoarece, fiindproteine, ele pot avea rol antigenic.

69

II. COENZIMP VITAMINICE

Vitaminele sunt substanfe organice cu greutate molecularA mic5.,

cu structuri chimice, proprietdli fizice, chimice gi biologice diferite.

Ele nu pot fi sintetizate in organism de aceea trebuie aduse prin

aport a-limentar. Necesarul zilnic de vitamine este mic (cateva

miligrame sau micrograme/zi), insd lipsa din alimentatie a acestora,

duce la declangarea unor stari patologice specifice, numite

auitaminoze.

Vitaminele nu constituie sursa energeticd sau piasticd, pentru

organism, dar sunt indispensabile pentru funclionarea normalS a

organismului, deoarece majoritatea vitaminelor sunt constituentl

coenzimatici, in aceasta ca1itate indeplinind importante roluri

funclionale .

Cercetitorul polonez, Kazirnir Funk a propus ca denumire

pentru aceste substantre, considerate atunci factori nutritivi

suplimentari pe lAngd glucide, lipide, proteine, numele de "vitamine"

(amine vitale). Aceasta qi pentru fapful cd primui preparat izolat d,e

Funk din tdrdlele de orez era din punct de vedere chimic o amind.

Denumirea de vitamind se pastreaza $i astSzi, deqi s-a dovedit c5. din

punct de vedere chimic, e1e nu sunt toate amine.

Existd grupuri de substanle cu structuri chimice inrudite cu

structura diferitelor vitamine, care indeplinesc aceleagi funclii qi a

cdror carenld determind aceea$i avitaminozd qi care se numesc

vitamere.

Existd deasemenea substarle cu structure chimicd

asemenatoare cu a vitaminelor, dar cu acliune antagonicd, care

administrate produc efectele avitamiozelor specifice gi care se numesc

antivitaminele.

I

10

. Clasiflcarea vitaminelot se bazeazd, pe cnterii desolubilitate:

F vitamine liposolubile (solubile in grd.simi) _ A, D, E, K;F vitamine hidrosolubile (solubile in apd) _ Br, Bz Bo, pp,

biotina, acidul pantotenic, acidul folic, Brz, vitamina C.

VITAMINE,/ \

. / \/ \

S

Complexul B

Acidul pantotenic (85)

Fig .25 _ Clasificarea vitarninelor

N. 1. VITAMINELE HIDROSOLUBILE

Vitaminele hidrosolubile aparlin complexului vitaminic B {B1,Bz, Ba, Bo, PP, acid pantotenic, acid folic) $i vitamina C.

Fiind solubile in apd nu se acumuleaz.E in organism inconcentratii toxice qi se elimind in principal pe cale renali.

Vitamina A (retinol, p-carotenul)Vitamina D (colecalciferol)Vitamina K (filochinona, menadi

Solubile ir apn(hidrosolubile)

olubile h grnsimi(liposolubile)

I{Care nu apa4in

complexului BIIt

Vitamina C(acidul ascolbic)

I.

Vitamina E (locoferoli)

Cu tol iheliberarc de energie

IY

Tiarnina @1)Riboflavina @2)Niacina (PP)Biotina

It

Acid folicVitamina Bl2

Alrele

I+Vitanina 86

Vitaminele hidrosolubile indeplinesc in organism rol de

coenzime, de aceea putem face referire la ele ca la coenzime derivate

din vitamine. Altfel spus coenzimele reprezinta forma activa a

vitaminelor.

II.1.1. Vitamina Br $l coenzima tlaminpirofosfat

Vitamina Bl (tiamina, aneurina, vitamina anti beri-beri,

vitamina antinevriticd) este alcEtuith dintr-un nucleu pirimidinic qi un

nucleu tiazolic, substituite qi unite printr-o grupare metiienicd..

,TlY"',\--+.",H,A\n,.rcr l.ts,.{tcu2- cH2-oH

Tiamina

Absorblia tiaminei se reaTizeaz\. la nivelul intestinului subtire,

prin procese active qi pasive; absorbtia activd presupune formarea

tiamin-pirofosfat (TPP ).

in organism tiamina se gd.seqte liberE (plasmd, LCR) 9iesterificatd ca TPP (80%), formd coenzimatica care este activd biolosic.

Tiaminpirofosforilaz- *,2'..t-,, CH, \ .

kinaza 'l ll N--------tr CH r O o,,**- ------------->.._,/1 tt I lt - ^ ]! - X

a.ip \ "r' \'\H, \y'cH;cnr-o-P-o-i-oHAMP I I -

TPP OH OH

o Rol metabollc. Sub formd de TPP participd in calitate de

coenzimS. la unele procese metabolice, decarboxilarea oxidativd. a a-

ceto-acizilor {acid piruvic qi acid o-cetoglutaric). De asemenea, Tpp

constituie coenzima transcetolazelor, enzillr.re din calea pentozo-

fosforicd.

'I

o Tulburiri de aport vitaminic

Simptomele deficienlei pot fi cauzate de malnutriEe, defecte deabsorblie, pierderi vitaminice d.atorate terapiei cu diuretice,hemodializd, diaree.

Deficitul vitaminic poate conduce la boala numrta beri_beri. cese caracterizeaza prin:

- simptome neurologice (somnolenld, dureri de cap, newitiperifericd);

- simptome gastro-intestinale;

- simptome la nivelul aparatului locomotor.

Simptomele moderate ale defrcienlei tiaminice includ: confuziemintald, ataxie (inabilitatea de a realiza un controi fin al func(iilormotorii) qi oftalmoplegie (pierderea coordondrii miqc5rii ochilor).

Aceste simptome se intAlnes-c $i in sindromul Werrricke_Korsakoff. r.

La animale, deficienla tiaminicd conduce la pierdereacoordondrii musculare, ca retractia capului (opistotonus), caracteristicporumbeilor cu hipovitaminozd Br.

Hipervitaminoza tiaminice nu apare in mod obiqnuit. Cu totulexcepfional pot apare fenomene de intoleranli (1e9in, dispnee,tahicardie).

II.1.2. Vitamira Bz (riboflavina) gi coenzimele flaviniceApartine clasei pigmenlilor galbeni sau flavinelor naturale. Este

constituita dintr-un nucleu triciclic, derivat de izoaloxazind. $i o catend.latera-ld de ribitol:

?' ?'?n"

!Hz-CH-6H-CI|CH2-OH

''"JArruYTr^H,cA./\l$ j-NH

o

in organism, riboflavina se gdsegte sub form5. liberd. (p1asm5,

lapte, urinh qi retind), cAt 9i legatd (FMN, FAD, enzime flavinice) in

diferite tesuturi ca rinichi, ficat, inimd, muqchi.

o Rol metabollc

Riboflavina intrd in structura formelor sale coenzimatice,

flavinmononucleotid (FMN) qi flavinadenindinucleotid (FAD).

Transformarea sa in ester monofosforic {FMN} are loc in toate celulele

organismului, sub acliunea unei flavokinaze:

Flavin-adenin-

Ribofl auina -+:gE{Ist-+ FN,[,J/ \

ATP ADP

Prin unirea FMN cu acidul adenozin-SlP (AMP), sub influenta

flavin-adenin-pirofosforilazei, se formeazd FAD-u1. Dup5. nomenclatura

stricta, FMN-ul nu este un mononucleotid, iar FAD-ul nu este un

dinucleotid, deoarece in loc'de perfioze au un alcool polihidroxilic,

ribitolul, iar flavina nu este o'bazd azoIat6. adevirata.

<--FMN

FAD

AMP-+

I

Flavinenzimele particip5 la reacfii de oxidoreducere d.eoarececiclul izoaloxazinic poate suferi reduceri reversibite, prin hxareatemporard la Nr gi Nro, a doi atomi de hidrogen, cu mutarea dubleilegdturi. Hidrogenii sunt preluafi de la diferite substrate reduse (SH2),cu care intrd in reaclie Si care se oxideazd. (So*):

u,c/-6N--/-;a :I' H,c- .^ t ,^ t r -n3L-\,,4\J

.*..NH -2H- HrC'

A -2e-

FMN sau FAD FMNH2 sau FADH2

FMN qi FAD se gisesc in celuld sub formd. de complexe cuproteinele, constituind sisteme enzimatice de mare rmportanta inoxiddrile celulare - flavinenzimele.

Riboflavina intervine qi in gnecanismul vederii (transformdlungimile de undd mici in lungimi de undi mai mari, perceptibile), inftziologia glandelor lacrimale, in mecalismul de producere a HCl inmucoasa gastricd., in activitatea altor vitamine qi hormoni (conservdactivitatea vitaminei Br gi este legatd de activitatea hormonilorcorticosuprarenali qi a insulinei).

o Tulburirl de aport vltaminic

> Hipovltaminoza se manifest5 prin aparilia unor leziuni alemucoasei gastrice, buco-faringiene, leziuni cutanate.

La om, carenfa este cunoscute sub denumirea de ,,pe1agr6 fdrdpelagrf', cu simptomele: stomatite angulard., leziuni umede la collurilegurii gi nasuiui, conjunctivitd, cataractd, blefaritd, cre$terea in voluma limbii.

F Hipervitaminoza. Megadozele administrate timp indelungatdetermini: crampe musculare, poliurie, utilizarea qi metabolizareadefectuoasd a altor vitamine, datoritd competiliei pentru compugi defosforilare-

. -

u'r'3' Viteoiaa Br (piridorina) si coenzimere derivate\,rlrarnina !6 (piridoxina, adermina, factor

include trei compuqi natura.li, derivali de piridini, "-"Ti:TTj::prin natura radicalului din pozilia 4:

cH2oH QHOoFrf)fcr,or ou/-ycw,on

Hrc\,./ H3c\.j

fH2NH,oHf\p-cH,on

Hrc\-./

Piridoxamin6

o Rolul metabolic

Piridoxalul $i piridoxamina intervin in metabolism sub formdcoenzimaticd. de piridoxal_S_fosfat, respectiv piridoxamtn_S-fosfat (p5p),ln care gruparea de alcool primar din pozilia Seste fosforilatd in urmareacfiei cu ATp.

Trans '*Pfidoxalfosfat

- f*J"-c{oos

]f \-- p""arboxilare

OH

H:C

Vitamina Bo intervine in multe reaclii metabolice la careparticipd aminoacizii: transarninare, decarboxilare a c_arrrlno _acizilot(tirozina, arginina, acid eluta'11in I Aa-^^:-^-_ ,transsurfurare (transferul ":,ff,t;. i:'ffi;J1Tll;,^1.""1".1

tzHo-(CH2-NH2)otfy"rz-GporH:

Hrc\..r1

c-H

r

r-

sinteza cisteinei), desulfurar. 1"i"t"ir.a qi homocisteind), in absorbfiadin intestin gi intrarea aminoacizilor in celuld..

. Tulburiri de aport witaninlc

Ca semne ale delicienfei se pot menliona: stirile de nervozitate,insomnie, tulburdri de mers, afecfiuni cutanate in jurul nasului,ochilor, gurii, limfocitopenie.

Carenla vitaminei Ba favorizeazd aparifia cariilor dentare,conduce la modifrcdri in metabolismul triptofanulu i, caracteizatprintr-o excrelie excesivd. de acid xanturenic.

Medicamentul ISONIAZID (hidrazida acidului izonicotinic), uzualutilizat in tratamentul tuberculozei, reactioneazd. cu Bo pentru a formaun derivat hidrazonic, care inhibd enzimele ce con{in piridoxal_5_p.Pacienlii tratali mult timp cu isogriazid denoltl o neutropenieperifericS., care rdspunde foarte bine 1d terapia cu 86.

Q*o-*r-NH2 + Fc

De asemenea, peniciiinamina (beta-dimetii-cisteina) uz:ualutilizatd in tratamentul pacienlilor cu boala Wilson, cistinurie qi artritdreumatoidi, reaclioneaze cu 86, pentru a forma un derivat tiazolidinic

I "'""l

UOH ----,/l

srontan

I ?'r",co--NH-N:crr5N

\__/6"ron

Piriloxalhklrazona

inactiv. Pacienlii tratali cu penicilamind dez'olte. ocazional convulsii,care pot fi prevenite prin tratament cu vitamind Bo.

IL1.4. Blotina (witamlna Hl qi rolul ei coenzimatic

Molecula biotinei este constituitd din doud nuclee condensate,un nucleu tetrahidro-imidazolic (A) qi unul tetrahidro-tiofenic (B) lacare este grefatd. o catend laterald de acid n-valerialic. Se cunosc doiizomeri natura.li, alfa qi beta-biotina, izolali din ficat qi lapte, respectivdin gdlbenugul de ou:

?,,,H_N-;\N_H

, l ^ l rH-t-C"--+{

tBlH2C\^_,.c H-(cHrr-cooH

lD z

Beta-biotina

o

H-N-:-N-Ht^lr-f=1-t f",

H2C\-,.cIFqrrcH-cHrDl

cooHAlh-biotina

in produsele natufale biotina apare combinati cu lizina,compus numit biocitine: -

Biotina-CO-NH-(CHr4-CH-COOH

NHz

Biocitinaza, enzimS. evidenliatd. in plasmd, ficat, pancreas,hidrolizeazl compusui, eliberAnd biotind.

Enzimele care contin biotind au in centrul catalitic, resturi delizind, prin care se fixeazd vitamina. Cu auidina, glicoproteindtermolabild din albuqul de ou crud, forrlreazl- biotin_auidina, compusstabil, rezistent la acliunea enzimelor proteolitice, nedisociabil prindia1iz6. sub aceasta formd., vitamina nu se absoarbe in tractul disestiv.

18

o Rol metabolic

Biotina transporta grupdri COz active, in calitate de grupare

prosteticd a unor sisteme enzimatice de carboxilare (carboxilaze) care

catafizeazE. fixarea COz pe diferite substrate. in reacliile de carboxilare,

COz activat de citre ATP, participd sub form5. de carboxi-biotin-

enzime:

*u,. - oiX" il"'", :-r" ---r*Hcot+ArP-l----+-d i ,i_#"

TfFEnz. J"oon i o:5__-i,_-l t,b--r"-irnc't4-co

Anhidridd-P-carbonica

Biotin-Enzimi

coo-l r

I

coo-J__^ICH,t -cooH^o

e<i-rt-i-Nst^ lrflT" |n-Enz.

H2C\s,,.c tt-{cH2 )4-co

Carboxi-biotin-enzimi

Biotin-enzimiPiruvat-carboxilad

o Tulburiri de aport vitaminic

Carenla alecteaz^, aproape toate compartimentele

metabolismului intermediar, sinteza de novo a enzimelor,

metabolismul glucidic, Iipidic etc.

F llipovitaminoza se manifesti prin tulburdri nervoase,

dermatite, oboseald musculari, anemie, sclderea apetitului.

Dupd un consum mare de albuq de ou crud, 1a qobolani apare

un sindrom deficitar biotinic, numit 'boala albuqului de ou", ce se

manifestd prin dermatitd, alopecie in jurul ochilor gi paralizia

membrelor posterioare.

U.1.5. Vitamina PP (liacinal Si coenzimele nicotinamidlce

Ca vitamine PP (niacina, factorul pelagro-preventiv) sunt

desemnati doi compuqi, derivali de piridind, acidul nicotinic (niacina)

qi amida acidului nicotinic (niacinamida):

f-f-coou6\$..!,

Acid nicotinic

Z\fuo-Nn"t t l

6\,,/2

Nilotinamioa

in sAnge se gS.segte sub formd de coenzimS. (80% in globulele

roqii) 9i sub formd. de amidd liberd., in plasmd.

Vitamina PP se sintetizeazd i:r organism din triptofan; din 60 mg

triptofan rezultd. 1 mg acid nicotinic.

. Rol metabolic

Nicotinamida actjoneazS, in organism sub forma a doud.

coenzime, nicotinamid adenin.flinucleotid (NAD.) 9i nicotinamid adenin

dinucleotid-fosfat (NADPf , in reacfiile de oxido-reducere.

oH (PO3H2)

NAD" (NADp,l

Acestea sunt formele oxidate ce pot fi reduse in NADH+ H* qi

NADPH+ H*, reducere ce are 1oc la nucleul piridinic al nicotinamidei:

(+

-

80

+2H+

+2H+

R

NADH+H+

Aceste doud forme intenrin in procesele de oxidoreducerecelulard., constituind coenzima multor dehidro gerraze.

Spre deosebire de coenzimele flavinice (FMN qi FAD), coenzimelepiridinice (NAD. gi NADP") pot exista liber in celuld; pot fi disociate departea proteice. NAD. participd in special la reactiile de degradareoddative, iar NADPH, in special in reacliile de sinteze reductive (acizigraqi, proteine etc.). I .

Formele reduse ale

acestor doue coenzime prezintd,

absorb{ie specific5. in U.V. la

340 nm, in timp ce formele

oxidate nu prezintd. nici o

absorbtie la aceastd lungime de

undd. Aceasta proprietate

serveSte la dozarea activitdlii

dehidrogenazelor qi a a_ltor

enzime a ciror activitate poate fi

cuplatd cu o reaclie de

dehidrogenare.

4tNH, ffiC" +H+

\N/

8l

. Tulburiri de aport vitanlnlc

La om carenla de vitamind PP se manifestd prin pelagrd (pella-

agra - pieie asprd, brund).

Pelagra se instaleazd cAnd dieta este constituitd in exclusivitate

din porumb, sdrac in triptofan qi vitamind" Ba (regim pelagrogen).

Semne ale peiagrei - oboseal5., sldbiciune, indigestie, anorexie, urmatd

dupd. cAteva luni de o dermatitd. (mai ales pe pielea expusd. la soare),

diaree qi demenli (boala celor trei D).

Deregldrile metabolice din pelagri sunt greu de definit deoarece

carenta de vitamini PP poate Ii indusd de carenta altor vitamine, in

special Bo in lipsa cereia nu se mai sintetizeazd vitamind" PP din

triptofan.

Peiagra poate insoti 9i alte boli specifice unor defecte metaboiice

din metabolismul triptofanului: boa-la Hartnup (defect de absorblie a

triptofanului) sau sindromul carcinoid (proliferarea matigrrS. a celulelor

care sintet)zeazd serotonina al carei precursor este triptofanul).

II.1.5. Acidul pantote+lc (vltamina Bxf ql coenzima A

Acidul pantotenic (vitamina Bx, factor hepatic, factor

antidermatitic al gdinilor) este format din acidul pantoic qi p-alanind".

H'C OHo O' l r i i - l lHG-CH2-C- CH-e-NH-CH2- CH2-c- oH

H:C

Acid pantoic p-alanina

\-----------'Y----------J

Aci'C pantotenb

Poate Ii sintetizat de plante gi microorganisme.

Se absoarbe la nivelul intestinului qi imediat, tot in aceste

celule, este fosforilat la gruparea de alcool primar, formdnd acidul 4,-

fosfopantotenic.

82

Formele active ale acidului pantotenic sunt 4,_fosfopalteteina qicoenzima A (CoASH).

ctrr-i' i - - - -

Ir r lL I

Acidpantoic I P-alanina

l:i- il-E+ * -c',- cH,-8i r.r'- cH2-cH2-sH1"';;;"

CoASH

Riboza

. Rol metabolic

F CoA are ro1 deosebit in metabolismul glucidic, lipidic qiproteic fiind tratsportor de grupdri acil R-CO-. Legdtura dintre CoA girestul acil se realizeazd. prin intermediul grupirii _SH rezuitdnd untioester (R-CO-S-CoA) in care legdtura tioestericd este echivalentd caenergie cu o legeture macroergicd din ATp.

F 4'-fosfopanteteina are rol in sinteza acizilor gragi. 4,_fosfopanteteina este legatd de un rest de serind din proteina aciltransportoare ACP-(Acyl Carrier protein), in complexul multienzimaticnumit acid gras-sintetaza, complex ce catalizeazd sinteza acizilor gragi.

. Tulburifile de aport vitaminic la om sunt cunoscure numalexperimental. dup5. administrarea de antagoniqti. Scddereaconcentratiei acidului pantotenic se caracterize azd, pnn stare deoboseald, ameleli, hipotonie musculard, tulburdri gastrointestinale(gastrite), scdderea rezistentei 1a infeclii. De obicei deficienfa de acidpantotenic este insofitS. qi de defrcienla altor vitamine. Din punct de

Acid pantotenic

, pr, lk'-.J

? "Hi'-O:P-o OH_J;

83

vedere metabolic apar deficienle in capacitatea de acetilare, eliminarea

crescutE de 17-cetosteroizi si alte vitamine hidrosolubile.

II. 1.7. Acldul follc lacidul pterollglutamicf 6l coenzimele

derivate

Acidul pteroilglutamic ( vit.M, factorul U, factorul R, coenzima

C), derivalii inrudili gi formele conjugate constituie grupul aciduiui

folic.

Este constituit dintr-un heterociclu numit pteridinS., acid p-

amino-benzoic qi acid glutamic:

\ iN/-CHr-'fIrN

I COOHi l

-, HN- qH{CHr2-COoHI

* Acid glutamic -

Acid pteroic -"""""""' i

Acid pteroilglutamic

. Rol metabolic

Acidul tetrahidrofolic (FH+), forma activd a acidului folic serveqte

la transferul qi utilizarea fragmentelor de un singur carbon in diferite

stdri de oxidare: -CHs, -CHz-, -CH=, -CHO, -CH=NH, care se pot fixa la

Ns, N10 sau ca o punte metilenicd intre Ns Si N10 lig.26.

Metabolismul folatului este complex. Sursa de un atom de

carbon este serina, care transferd gmparea sa hidroximetil la FH+

formdnd Ns, N1o-metilen-FH+ din care se pot forma gi alte forme active:

Ns_CH3_FH+, Nro_CHg_FH+, N5,N1o-metenil-FHa, Ns-formil-FHa

Coenzimele acidului folic participi la sinteza metioninei din

homoserini (Ns-CHa-FH+), sinteza acidului timidilic din acid uridilic

(Ns, N1o-metilen-FH+), in sinteza nucleului de purind (Ns, Nro-metenil-

FH+ qi Nro-formil-FH+) etc.

Pirimidini -+ i +Pirazi15+i * Acid p-NH2- iPteridini > i benzoic CABA) "-.> i

-

84

-cH3 --NF-->rEtil

Hr$ ir l.l

H,N("Y"Y; ,oNo-\ s-(cttz-Nrrn

I iHoH ,,,

Acid tetmhidrofolic (FHa)

../*-t-"\t t l0N\./r\slcHr-N-

' tcHc

N5-nEri!FHa

N. \

l r0*.,EcHr7-

\ ""r'

cH. ---------->l ' Ns' to

NENlO-cH

nEtenil

N5-N lo-nptenilFHa

./N.rfN=.,-Q:o --:;;;'+ | ll I ro

'! .ii" N\.'\ilcH,-N-

"N5|" l :o

fonnil r!N 10-formilFH+

./N.rr-N\- CH ---:--> | ll I to

ll- Ns N=,,As-}-cHr-N-

r l 'IFC-NH

frrmimino

N5-brmimino-FH+

../*-t-*\t t r0

N\,,\s,,J_cHr-N-t" l

C:NHIH

N l0 formimino- FlI4

Fig 26 - Atomii implicati in transferul fragrnentelor de un atom de carbon.Ns este locul de legare a grupdrilor metil, formimino, Nro locul ae telare afgrupdrilor formil gi formimino, iar gruparile metilen si metenil formeazE prtr"gi i.rt

"atomii Ns $i Nro.

-- -::

. Tulburirl de aPort vitaminic

Deficienla de acid folic apare din cauza unui aport alimentar

scezut, stres (sarcin5.), tulburdri de absorbfie, deficit de enzime

implicate in sistemul de transport sau terapia cu unele

medicamente.

Carenla se manifesti exclusiv prin perturbarea

hematopoezei, simptomul fiind anemia megaloblasticd (cu eritrocite

mari qi rare).

Datoriti relafiei strAnse dintre activitatea metabolismului

acidului folic gi cea a vitaminei 812, este destul de greu de a

diferenlia simptomele clinice dintre cele doud stdri de carentd.

II.1.8 Vltamina Brz {cobalamloaf si rolul el coenzimatic

Vitamina Bn (cobalamina, ciancobalamina, factor

antipernicios, factor extrinsec Castle) este un complex organo-

metalic, cu inel corinic (tetrapirolic), similar nucieului porfirinic, la

care se adaugd ionul de cebalt. Nucleul corinic are substituite

grupe -CHs, acetamidice gi propion-amidice. in centrul acestui

macrociclu se gese$te ionul Co3*, cu num5.rul de coordinalie 6:4

legdturi se realizeazd cu atomii de N pirolici, o legiturS. cu gruparea

-CN, iar a 6-a legdturd- se realizeaz6 cu dimetiibenzimidazol-ul.

intregul complex, fird gruparea -CN, se numeqte cobalamind..

Radicalul R poate fi diferit, rezultdnd forme variate ale vitaminei, de

exemplu: in ciancobalamind R=CN (ciancobalamina se formeazd in

procesul de purificare qi reprezintd forma comerciald a vitaminei);

in hidroxicobalamind R=OH; in 5'-dreoxiadenozilcobalaminS. R=5'-

deoxiadenozil; in metilcobalamine XCHg.

I

86

CHr CH2CH2CONH.,

i I { ?"ocH2cH2coNHCHr-i -o-f- o

i tCH, 3

Absorbfia intestinald a vitaminei Brz este mediatd prinreceptori, in ileon, necesitdnd legarea vitaminei de o glicoproteind.foarte specificd, numitd "factor intrinsec,, secretat de celulereparietale ale mucoasei gastrice. Dupi absorblie, vitamina se leagide o proteine plasmaticd, trapscobalamina II, in vedereatransportului la tesuturi.

in ficat, excesul de vitamind se depoziteazd sub formd de 5,_deoxiadenozil-cobalamind (70%), OH_cobalamind (27o/ol sau netil-cobalamind (3%), fixate pe proteine celulare.

r Rol metabolic

Vitamina Brz pdtrunde in celuld, prin endocitozd, sub formdde OH-cobalamind, metilAndu-se apoi la CHs_cobalamind. Ocantitate importantd intrd in mitocondrii qi se tralsformd in 5,_d eoxiadenozil-cobalamind.

Cele doud. forme coenzimatice, metabolic active, alecobalaminei sunt implicate in func{ionarea a doud sistemeenzimatice: metilmalonil-C oA'izolrrreraza respectiv homocrstein_CHs_transferaza (sau metionin-sintaza), care catalizeaza urmatoarelereactii:

87

Homocisteind Metionina. Reacfie de metilare(citoplasmi)

(CQ-cobalamina)

OH-cobalamina

5'-deoxiadenozil-cobalamina)

L-nemmatorul-LoA .-=-=-.-+ Succinil_CoA Reaclie de rearanramentinnamolecular(mitocondde)

in absenla cobalaminei:

a) reactia de metilare se opre$te, Ns-CHg_FH+ se acumuleaze,blocAnd folatul in a$a numita l.capcarld a folatului, (fig 24). Astfel,homocisteina rdmdne nemetildtd. gi se poate elimina prin urind.(homocistinurie),

b) reaclia de rearanjare intramoleculara se blocheazd, acidul L_metil-malonic se acumuleaza $i se elimina prin urina (acidurie

metilmalonicd).

Cobalamina $i folatul sunt implicate in diferite procese d.emetilare inclusiv metiiarea histonelor, in timpul repficarii ADN_ului

$'g.2al.

Honncistein--transfer

I

88

H,N-HC-COOH-lCH,t -

CH,t-S

cHr(metionina) (homoc isleina)

(metilcobalamind)

1\-Ll l i - rn4,l1.,->NAJ)P

^folar-redLrtaza-/

.- xelpu*H*

trirTtoerim nEtlfrexat

IA IG)

a"r ror J ' a". J

-dftitrofolic

Iv

Timidini

tADN

Idiviziunl oehlara

Fig 27 - Rolul vitaminei Brz $i al acidului folicMetabolismul acidului folic Ai al vitaminePl2 sunt intergsrelate.ln lipsa

acidului folic, formele active a1e acestuia Ns-NrofFH4 qi Ns-CH37mH+, implicate insiteza de purine $i timidina necesare diviziunii delulare, sunt delicitare, prin urmaremultiplicarea celulara este incetinite. Un prim simptom este anemia megaloblastica.in lipsa vitaminei Brz, metil cobalamina CHg-Brz nu se mai formeaze, procesul demetilare aI homocisteinei diminue, formarea metioninei necesara metilSrii gaorcompu$i esenliali este stopat6.. Gruparea metil rSlnerle blocate pe Ns-CH3rtrFH4,folalii rdmenand sechestrati in forma metihte, asa numita capcane a folahtui. Seinstaleaz6 simptomele de anemie megalolasticS, iar dace [psa vitaminei Brz este delunge durate, apar in plus Si simptome neurologice. Din acest motiv anemiamegaloblastice tratate doar prin administrarea de folali poate masca deficitul deBr2, ca-re ulterior poate genera disfunclii neurologice majore. De aceea anemiarnegaloblasticS. trebuie tratate prin administrarea combinate de acid folic $ivitamine 812.

!9

. TulbEriri dc aport vitaminie

Sindromul tipic al carenlei de vitamind Brz il constituie anemia

pernicioasd sau anemia Biermer, caracterizati, prin eritropoezd.

megaloblastica, cu modiflc5ri ale leucopoezei qi formdrii de trombocite.

AlterArile hematologice, caracteristice, pot fi insolite de astenie,

paloare, dispnee, atrofia mucoaseior digestive, tulburiri neryoase

(scdderea rS.spunsurilor reflexe gi a perceperii senzoriale, greutate in

vorbire qi mers), c6.t 9i tulburiri gastro-intestinale.

Anemia rezultd din perturbarea sintezei ADN, care a.Iecteazd

formarea nucleului noilor eritrocite. In aceste cazuri globulele rogii

circulante sunt, in mare parte, forme primitive qi cu viafd scurtd..

In carenta de cobalarnini pe langa modifrcdrile hematopoetice

(modificiri int6lnite qi in carenla de acid folic) apar simptome

neurologice, care devin ireversibile in cazul unui deficit prelungit.

IL1.9. Vitamlna C (acidul ascorbic, factor antiscorbutic)

La inceput, a fost denumit acid heruronic, av6nd o structurd

asemdnetoare monozaharidelor. Forma L este cea mai activd.

' t

?i___lo:f 9

- f lHa I

Ho-f-HcH2oH

3i__-l

HO-C A

'o-+ IH-<] '

Ho-f-ucH2oH

Forma redusd(Acid ascorbic)

Forma oxidaa(Acid dehiclroascorbic)

Este sintetizatd de toate plantele, de unele microorganisme qi de

majoritatea animalelor, cu exceplia omului, primatelor qi cobaiului,

care sunt dependente de aportul exogen.

-90

o Rol metabolic

Nu are ro1 coenzimatic tipic, dar este necesar5 pentru bunafuncfionare a creierului, ficatului, glandeior endocrine, inhematopoezd, hemoglobino-genezd, etc., participAnd 1a numeroasereacfii de oxido-reducere.

Principalele reacfii Ia care participd vitamina C sunt:hidroxilarea prolinei qi lizinei pentru sinteza colagenului, hidroxilareafenilalaninei, sinteza catecolaminelor, hidroxilarea steroizilor,desaturarea acizilor graqi, absorbfia fierului, metabolizareaxenobioticelor etc.

o Tulburirl de aport vitaminic

Carenla vitaminei sau aportul alimentar redus poate conduce latulburdri gastro-intestina.le, boli infeclioase, neoplazi| afecfiuni

metabolice caqectizante Si \a apailia saorbututui.

Apari{ia scorbutului este prebedatd de anemie, inapetente,

scdderea rezistenlei la efort, infecfii, dureri articulare, uscdciuneatForr?nFnfFl^r

intr-un stadiu mai avansat apar hemoragii subcutane,

musculare, gingivale. Apar leziuni a_le lesutului osos qi cartilagiilor, caurnare a perturbdrii biosintezei colagenului. Stocajul normal al

vitaminei C este suficient pentru cel pulin 3-4 luni inaintea aparitiei

semnelor de scorbut.

Nu sunt cunoscute efecte toxice, dar supradozarea poate

conduce la littazd- renald, datoritd formdrii oxalatului de Ca insolubil,

c5.t gi datoritS. efectului nefavorabil asupra absorbliei vitaminei Br.

II. 2. VITAMINE LIPOSOLI'BILE

Din punct de vedere chimic vitaminele liposolubile fac parte din

clasa terpenelor, compuqi polienici, constituili din resturi de izopren,

unite cap la coadi. Dupd numS.rul resturilor izoprenice conlinute, pot

exista in naturd monoterpene (2 resturi), sesquiterpene (3 resturi),

diterpene (4 resturi), triterpene (6 resturi) $i tetraterpene (8 resturi).

Aceqti compuqi pot avea structuri liniare, ciclice sau combinate.

Vitaminele liposolubile cuprind in moleculele 1or ambele tipuri de

structuri.

Vitaminele Liposolubile se gS.sesc in mod obiqnuit asociate cu

lipidele din alimentele naturale.

Absorblia lor se face in aceleagi condilii ca qi a lipidelor, adicd in

prezenta grS.similor, a bilei gi a sucului pancreatic. Dupi absorblie,

vitaminele liposolubile sunt transportate de chilomicroni pe cale

limfatici in sAnge unde sunt transportate de lipoproteine specifice,

nefrind solubile in plasmi. Sunt depozitate in ficat (vitamina A, D, K),

sau in lesutul adipos (vitamina E), pentru diferite perioade de timp.

Supradozarea vitaminelor liposolubile conduce la instalarea unor steri

toxice (hipervitaminozd) mai ales in cazul vitaminelor A gi D.

Nu sunt excretate in urinS; in cea mai ma-re parte sunt

eliminate pe cale biliard in fecale.

Ir.2.l. Vitamina A (Retinol, axeroftol, vitamina

antixeroftalmic[, vitamina {rnosolubil5. de cre$tere)

Sub numele de vitamina A sunt cunoscute doud vitamine,

retinol (Ar) qi 3-dehidroretinol (Az).

r9 mH3

CH,OHt f

cH2oH

Retinol (Vitamina A1) " -uwrruvrvurvr \ r

'.^rr' ^2'

Vitamina ,{1 este un alcool polienic cu 2O atomi de carbon, cu

duble legdturi conjugate, conlindnd Ia un capd.t un ciclu de B-iononi.

Vitamina Az este 3-dehidroretinol, ce conline o legd.turd. dubld

suplimentard intre Cs gi C+.

Gruparea de alcool irrimar din pozilia 15 se poate oxida in

organism reversibil la aldehidS. (retinal) sau ireversibil, la acid retinoic.

,,\jt ot :

Retinol

o ----> ,,\.'€ootr15

.\..cH

Retinal

t6 l7H

'8

;- -CH"- 18 -

3- dehidrcretinol ryitamiB .A2)

Acil retinoic

92

In organism, vitamina A se formeazS. in special la nivelul

mucoasei intestinale, prin transformarea provitaminelor A (cl, I Ci f-carotenii) - prin oxidare 1a Crs. Randamentul cel mai bun este obtinut

din p-caroten, care avAnd 1a ambele capete cicluri de p-ionond. va

conduce la doud molecule de vitamina A.

B iononn B iononap caroten

Ea se depoziteazd in principa.l la nivel hepatic; depozitul de

vitaminS. A din ficat poate asigura necesarul organismului pentru o

perioadS. lung5. de timp (chiar peste 1 an). Aceste depozite scad in

Iipsa vitaminei E.

Ingerarea indelungatd de alimente bogate in caroten duce la

depozitatea acestora in lesuturi, apdrdnd xantodermia - ingilbenirea

pielii, in special a palmelor qi tdlpilor, cu exceplia sclerelor care,

rimAnAnd a1be, permit diferenlierea de icter. Hipercarotenemia nu

atrage Si hipervitaminoza A.

Vitamina A se gdseqte in produsele de origine animald in

cantitate mai mare decet in cele vegetale: ficatul unor pegti de apd

dulce, gdlbenuq de ou, lapte.

Rolurile eitaminei A

F Vitamina A (retinol -CHzOH) este indispensabila vielii qi

cre$terii norma-le (in privinla staturii qi greut6!ii). Retinolul exercitd

acliune protectoare asupra epiteliilor, asupra mucoaselor, impiedicAnd

pd.trunderea microorganismelor (acliune antiinfecfioasd), are rol in

funclionarea aparatului genital gi de reproducere (spermatogenezd).

) Vitamina A, sub formd a" ^cia

.etinoic (-COOH), rezultatS. din

oxidarea retinoluiui, aclioneazh in calitate de hormon prin legarea de

receptori nucleari responsabili de activarea unor gene. Acidul retinoic

poate inlocui retinolul in cre$terea qi diferenlierea epiteliilor, fiind

considerat chiar mai activ, dar nu poate substitui retinolul sau

retinalul in procesul vederii.

F Vitamina A (retinal) sub forma 1 1-cis-retinal (-CHO) este

implicatd in procesul vederii.

Clclul vlzual

Vitamina A constituie gruparea prosteticd a tuturor pigmenlilor

fotosensibili vizuali, din celulele fotoreceptoare (conuri gi bastonaqe),

existente in retind.

Rodopsina, pigment fotosensibil, este alcatuite dintr-o proteinS.

specificS. numitd opsind sau "scotopsind" (scotos = intuneric), la care

este legatd vitamina A forma 1 1-cis-retinal.

in procesul vederii, atunci cAnd, rodopsina este expusi la

lumind, au loc o serie de izometiz.Eti reversibile cis + trans, ce

sunt convertite in impulsuri nervoase transmise de nervul optic la

creier.

A1l-trans-Retinal11-cis-Retinal

Izomerizarea retinalului cis in trans are loc cu intensitate, mare

la lumind qi neglijabild la intuneric. Aceasta izomerizare in care se

reaJizeazS. trecerea de la o stare bogat energetici, cis-retinal, la o stare

saracS. energetic, trans-retina1, este insotita de degajare de energie

convertita in miqcare atomicd care, amplificatI,, genereazS, impulsul

nervos.

Izomerizatea cis-trans altereaz| geometria labili a moleculei derodopsind, producdld desprinderea opsinei. Maximul de absorblie alrodopsinei se deplaseazd de la 500 nm (roqu) spre spectrul retinaluluiliber (380 nm) cu formarea unor intermediari cu maxime de absorbtiegi culori diferite.

La intuneric, au 1oc reacliile de refacere a rodopsinei, carenecesitS" transformarea all-trans-retinalului in 11-cis-retinal qi legarea

lui spontanS. de opsinS. in aceastS. etape sunt implicate reactii dereducere / oxidare 1a care participd ca acceptor respectiv donor de H,sistemul NAD./NADH+H-, in ca-litate de coenzimA a alcool

dehidrogenazei (retinol dehidro genazdl.

(-cHo)

NADH

Alcool-dehidrogenazaNAD+

l (-oH) l(-oH)

,lltl

Sange g lssuhrri

In retind se p[streazd un echilibru intre retina-l qi retinol care

implicd schimburi continue ctt rezerva generald de vitamini A a

organismului (ochi + sAnge + lesuturi).

Instalarea rapidd a tulburirilor vizuale (hemera-1opie) in carenta

de vitaminS. A se explicd prin scdderea refacerii rodopsinei din cauza

aportului insuficient de precursori, ceea ce are drept consecinld.

scdderea rodopsinei din retind.

Existenla hemeralopiei independent6 de carenla de vitamind A

(albinism, la bdtrAli in glaucomul cu cataracte, diabet, graviditate,

, Rodopsina

\Opsina

al CCHo)

boli hepatice, intoxicalii cu alcool, Pb, As etc.) s-ar putea datora

alter5rii echilibrului "retinal + retinoltr 9i faptului cd in procesul

vederii participi gi alte vitamine (Br qi Bz) qi a1!i factori, hormonal.i sau

de altd naturd, factori mai pulin cunoscuti.

. Necesarrrl de vitamind A este in funclie de greutatea

corporald, vArst6, climat, stare fiziologicd.. Necesarul este mai mare in

regim bogat in lipide.

o Tulburirile de aport vitaminic se pot insta.la in diferite

imprejurdri: lipsa din alimente, incapacitatea organismului de a

transforma carotenii in vitamina A, tulburdri in absorbtia lipidelor,

carotenilor gi a vitaminei, depozitarea insuficientS. (boli hepatice),

defrcienlA de Zn (necesar mobilizdrii vitaminei A din ficat), ma-inutrilie

proteicS..

Deficienta de vitamin5. A, la copii 9i animale tinere:

Y afecteaz\, sistemul osos (oprirea creSterii oaselor, erupfii dentare

intdrziate, rdddcini rdu implantate, alterarea emailului dentar) gi apoi

a lesuturilor moi.

) duce la oprirea divizipnii celulare qi atrofia celulelor deja formate,

Ia interzierea severd a creqterii inclusiv a sistemului nervos.

F duce 1a keratinizarea epiteliilor, indiferent de originea 1or, ceea ce

conduce 1a tulburdri a1e glandelor exocrine, lacrimale, pie1e, tractusul

digestiv, respirator, urogenital.

Carenta de vitamind A se manifestd in principal la nivelul ochilor

prin: sciderea capacitelii de adaptare de Ia lumind la intuneric

(nictalopie) qi sciderea acuitdlii vizuale cu ingustarea spectrului vizual

pentru albastru-galben precum $i oboseala la citit (hemeralopie). Dacd

avitaminoza se accentueaze qi este de lunge durate apar leziuni a1e

epiteliului conjunctiv (xeroftalmie), manifestatd prin uscarea epiteliilor

(xerozd), atrofra glandelor lacrimale (cu scS.derea lacrimilor qi umectare

insuficienti) qi lipsa de lizozirn (factor de proteclie antimicrobiand).

Corneea se opacifiazd, continuAnd cu perforarea purulentd a ochiului

96

(keratomalacie), proces care d.uce la orbire (cecitate). Carenta devitamind. A poate fi insofltd de infeclii sponta-ne.

> Hipervitaminoza A

Dozele excesive de vitamini. A produc fenomene de intoxicatieacutd., manifestatS. prin amefeli, cefalee, somnolenta sau intoxicarecronicS. (anorexie, tegumente uscacte, buze uscate, ragade comisurale).

Megadozele de vitamind A produc reabsorbfia oaselor prinstimularea activite$i proteolitice lizozomale, stimuiarea secre(iei deparathormon (PTH) 9i efecte teratogene la femeile gravide.

Consumul exagerat de caroteni produce ,,icterul carotenic,,. CAndse depdQe$te capacitatea de fixare a proteinei de legare a retinolului(retinol binding protien - RBC) are efecte litice asupra membranelorbiologice. Lezarea membranelor eritrocitare de cdtre retinol esteinhibatd de vitamina E (tocoferol). I

IL2.2. Vitamina D (colecalciferol, vitamina arltirahitici)

Grupul vitaminelor D este reprezentat de cinci vitamine custructurd. chimicS. 9i acfiune asemenetoare notate de Ia 2 la 6.

Provitaminele D sunt derivali sterolici cu structura urmatoare:ciclopentaloperhidrofenantren. Ele se diferenfiazd dupd structuraradica-1ului R.

\ , .J

- | , . ' "3K -CIHH<H_gl_cH

t \CH3 'cH3

Fxgosterol, provitamina D2(ergocabiferol)

qH.

R -in-cs,-cn -cs^-61-"'cHr

7-dehilrocobsteroL provitamirn D3.(cobcabiferol)

97

Precursorii nu prezintE aclivitate vitaminice. Activitatea

vitaminicd se dobAndeqte prin activare, proces care cuprinde dou5.

etape: activarea primari 5i activarea secundare.

r'o'utrc offififfi viamlne I -l-aSffisecrinoara>

^- ^-- ^ a2 -a activare secundarazJ_\Jn_u---------------- 1 .15-1oH12_D

o,.{ Activatea primari. Transformarea provitaminei in vitamina

D se reaJizeaz1. prin deschiderea, sub acliunea razelor ultraviolete, a

inelului B intre Cs $i Cro cu apari{ia unei duble legdturi intre Cro gi

Crq. Rezulta o trien5., care constituie structura de bazd, ce conferd

activitate biologicd comund (antira}ritica), catenele laterale fiind

resposabile de intensitatea pctivitelii vitaminice.

Suprairadierea duce la compugi toxici.

. Activarea secundari conste din dou6. procese de hidroxilare

succesive ce au loc in ficat gi rinichi.

Prima hidroxilare a vitaminei Ds are 1oc in ficat, in pozi{ia 25 a

catenei laterale, formdndu-se 25-hidroxi-Dg.

A doua hidroxilare are loc in rinichi, unde forma hidroxilatd in

pozifr.a 25 suferd o noud hidroxilare in pozitia o la carbonul 1. Rezultd

1,25-dihidroxi-colecalciferolul sau 1,25-dihidroxi-Dg care este forma

vitaminicd cu activitate maximi in metabolismul calciului.

Derivatul monohidroxilat (25-OH-D:) este de 4-5 ori mai activ

decdt vitamina D3, in prevenirea rahitismului, iar derivatul dihidroxilat

1,25-(OH)z-Ds este de 2O-30 ori mai eficient decd.t D: in transportul

intestinal de Ca** Si respectiv, in prevenirea rahitismului.

98

7-Dehidrocolesterol

u.v.l(niele)YR

' .-a> r'

"?*a$ *al )r-d'^.."o.,/

. Rolul metabolic d vltamlnel D

Vitamina Da este privitd astdzi mai mult ca un hormon decdt ca

o vitamind.

1,2 S-(OH)z-Ds sau calcitriolul regleazd metabolismul fosfo-ca.lcic

prin acliunile exercitate asupra tesuturilor tint5.: intestin, os, rinichi

(fig 28).

24,25-Dihidroxi-D3(inactiv)

.^-A,^.fl,!r !7,fcllfterorf I T

(viraminaD3)

'../W I

| ficat

Y

oH 25-OH-D3

1,25-Dihidroxi-D3(calcitriol)

Fig-28. Metabolismul Si acliunea vitaminei D. Forma activa a vltamlnei Ds, 1,25_(OH)r-D:, aclioneazd la nivel intestinal ai osos stimuland absorblia respecti"

'n""."^calciului, iar la nivel renal impiedicAnd eliminarea lui I1l.

> La niuelul intestinului calcitriolul este transportat la loculde acliune unde se fixeazd pe proteine receptoare citoplasmatice qiapoi este translocat la nucleu unde printr-un mecanlsm similaracliunii unui hormon steroid induce sinteza unei proteine

I

100

transportoare de calciu (Calcium Binding protein - CBp) carefavoizeazi absorbtia de Ca** contra gradientului de concentrafie.

:> Le nilur.tut htbilor renall I,2S-(OH)z-Ds stimule azE sintezaCaRP renale qi deci reabsorbfia, preintAmpindnd excretia de Ca**.

)> ta nive1atl osului actiunea 1,25-(OH)z-Ds este maicompiicatd qi mai pulin clar6. Vitamina asiguri. fixarea Ca** qi pO+s- inspaliile libere dintre capetele nespiralate ale moleculelor de colagen gistimuleazi" sinteza unei proteine specifice care leagi Ca**,osteocalcina. Calciul se fixeaz1. in faza minerald a osului, sub formE dehidroxiapatita, Caro(pO+)o(OH)2, aleturi de cantitdti mici de citrat, Na*,Mg** qi CO3z-.

u ;y'?Fu :Arutdrl de aport vitamlnic

>r Htpottttaminozq. D

Formarea defectoase in piele a vitaminei Dg, aportul alimentarscdzut gi/sau defecte intestinale de absorblie a vitaminei pot duce lastdri de hipouitaminozd D.

Hipovitaminozele D conduc la stdri de boali" care se manifestdprin:

- defecte in mineralizarea osului.

- perturbari in metabolismul mineral (Ca.. gi pOa:J Si a secretieide parathormon (PTH);

in deficienla de vitamind D absorblia de Ca2* fiind perturbatd

apare hipocalcemia, insolitd secundar gi compensatoriu de cre$terea

secretiei de PIH, care determini mobilizarea Ca2* din oase pentru

normalizarea calcemiei.

Din punct de vedere biochimic hipovitaminoza D estecaracteizatd, prin hipocalcemie moderatd sau normocalcemie,

hipofosfatemie, activitate crescutS. a fosfatazei alcaline. nivele crescutede parathormon gi scdzute de 1,25-(OH)z-Ds.

Din punct de vedere clinic, hipovitaminoza D este caracterizata

de scdderea rezistenlei mecanice a oaselor (inmuierea oaselor).

Hipovitaminoza D la copii se nume$te rahitism iar 1a adult

l0 l

osteomalacie. La adult, rezerva de calciu fiind mai mare,hipovitaminoza se instaleazS. mai greu. Hipocalcemia dezvoltd 1a adultosteoporoza (reducerea masei osoase pe unitate de volum la un nivelsituat sub cel necesar funcliei normale). Osteoporoza apare la femeipostpartum sau dupa instalarea menopauzei, ceea ce dovedegtedependenta hormonalh a acesteia. Tratamentul cu estrogeni previne

instalarea osteoporozei (se pare c5. estrogenii protejeazd osul impotriva

agentilor care determind. resorblia osului, in special pTH).

Sunt descrise boli genetice datorate unui defect i:r sinteza renalda 1,25-(OH)z-Ds, care produc rahitismul dependent de vitamina D (tipI) gi mai rar boli cavzate de deficienle ale receptorului citoplasmaticpentru 1,25-(OH)z-D:, care produc rahitism independent de vitamina D(tip II).

) Htperuita ndnoza D

Dupa ingestia cronicd, oral5., a unor doze mari de vitamind Dpot apare intoxicatii cu vitaminE D caracterizate prin anorexie,v5rshturi, diaree, astenie, mialgie, pierderi in greutate, hipercalcemie,

hipercalciurie. Patologic are 1og calcifierea lesuturilor moi qi in specialla nivel renal (nefroca-lcinoza), cornee, aortd, pldmdni, inimd..

Suprimarea administrdrii de vitamind" D, prin aplicarea unuiregim sdrac in Ca, produce o mobilizare lentd. a Ca din lesuturile moiqi revenirea la normal a calcemiei. Atunci cdnd nu este compromisi.grav, functia renali se normalizeazd,,

IL2.3. Vltaminele E (tocoferolii, vitaminele antisterilitdtii,vitaminele de reproducere)

Numele de tocoferol provine de la funclia biologicd de a favorizafertilitatea (tokos - na$tere; phesein - a purta).

Vitaminele E sunt un grup de vitamine - tocoferoli - formatidintr-un nucleu de croman substituit qi o catend lateral5" ramificati _

rt f l l -

I

r02

cr,- Tocoferol

Sunt patru tocoferoli importanli: d, p, T, 6 - care se diferenliazb.

intre ei prin numdrul de grupiri metil din nucleul cromanic;

proprietSlile vitaminice sunt proporlionale cu numSrul grupelor -CHs,

deci o-tocoferolul va fi ce1 mai activ biologic, avend trei grupdri metil,

5, 7, 8-trimetil tocol.

Absorbtia vitaminelor E din a1imentalie are loc la nivelul

intestinului sublire, in aceleagi condilii ca qi celelalte vitamine

liposoiubile.

De 1a intestin, pe cale limfaticd, ,tocoferolii trec in se,nge unde

sunt vehiculali de p-lipoproteinele plasmatice, apoi sunt repartizafi in

toate organele, depozitele fS.cAndu-se in lesutul adipos.

Intracelular, vitaminele E se acumuleazd- in fosfolipidele

membranare citoplasmatice gi mitocondriale 9i in reticulul

endoplasmatic. Concentralia vitaminelor E in aceste organite este in

funclie de aportul vitaminic, de peroxidanli, antioxidanfi, de seleniu

alimentar gi de aportul de aminoacizi cu sulf.

in procesele metabolice, tocoferolii sunt tralsformafi in compuqi

chinonici, hidrochinonici care se elimind prin bild, 8Oo/o, iar restul prin

urind, sub formd conjugatd cu acidul glicuronic.

O E nol biochimic. Vitamina E nu are o functie biologicd

specificd pentru a explica numeroasele consecinfe care apar in carenla

de vitamind E la animalele de experien{5 (este vitamina in ceutarea

unei boli).

/ Acliunea qntioxidantd. Vitamina E este consideratd ce1 mai

eficace antioxidant liposolubil nafural. Substanlele cele mai sensibile

la peroxidare sunt lipidele celulare gi lipidele din membranele

103

organitelor subcelulare, Si dintre acestea in special, lipidele

nesaturate.

Sub acliunea oxigenului molecular, acizii polinesaturali

formeazS peroxizi lipidici prin peroxidare, proces autocatalitic, care sedesfhgoard dup5. un mecanism radicalic, prin reaclii inldnfuite:

Initierc:

Propagare:

intrerupere:

a-H (QtL J9-qJJr,,. p. * H.

R'+ 02- R-OO

R-H + R-OO.-=+R_OOH + R.

AH + R-OO. -->R-OOH + A

A' este un radical stabil, provenit din tocoferol, capabil sd inhibepropagarea reacfiilor radicalice in lanf din peroxidarea lipidicd..

cl- Tocoferol -->,.CHz

Radical tocoferilputin reaotiv

Tocoferil-chinondstabile

Acliunea antioxidantd a vitaminei E are o importantd marepentru viala celulei, intrucat impreund cu vitamina C $i altiantioxidantri alimentari ar fi implicali in protejarea cdilor respiratorii qi

mai ales a tesutului pulmonar de acliunea nocivd a aerului poluat (Os,

NzO). Efectele nocive ale oxidanlilor pot fi ilustrate prin schemaurmatoare:

I

104

Acizi gragi polinesaturati din fosfolipide membranare

IAntioxldalF Ql @ Oxidanri(v{arruu E) I (Fe2+, Cu2+, 02)

Y

Peroxizi lipidiciI

IvDegradarea acizilor gra;r

din fosfolipidele membranare

Reticul endoplasmatic

IFragilitate_crescutil Pemreabilitate crescuE Dezintegraxea struch.uilor necesare

5i hemolizn acliriii enzimelor prezente

I | la acest nivel

Eliberarea enzimelorhidrolitice I

{ n"ctivarea enzimelor

Modificiri la nivel tisular

e E T:ulb:uteri de aport vltaminlc

2- --' gilooltatnlftoza E

Efectele carenlei de vitamind E sau hipovitaminozei E semanifestd gradat $i progresiv in funclie de perioada de deficitvitaminic.

Semnele deficienfei de vitamind. E la om se manifesti paralel cuperturbarile absorbliei de grdsimi qi constau in: slhbiciune musculare,fragilitate eritrocitarS., fenomene care dispar prin administrareavitaminei E.

Independent de gradul de alterare a lipidelor, la animale, s-auevidenfiat tulburdri a1e capacitdlii de reproducere la ambele sexe.

t \-''/''

f^--.--. --- _ rI

urobule ro$u I

I

105

Nu sunt dovezi care se ateste cd vitamina E, la om, estenecesard pentru fertilitate. Totugi, sunt unele date conform cd.roraconcentraga sanguina de tocoferoli cre$te progresiv in sarcin5 p6ld la50-100% sau chiar mai mult in ultima lund fald de primul trimestrude sarcind. Aceasta constituie o condifie pentru evolu{ia qi dezvoltarealhtului. Revenirea la valori normale se face in primele 2_5 tuni de lana$tere, insd concentratlia ei creqte in lapte. La femeiie cu avorthabitual, concentratia tocoferolului in s6'ge este de 2_4 ori mai sc6zutdecAt la femeile cu sarcind normald.

) Elpteruttannlnoza E

Administrarea indelungati gi abuzivd de vitamind E, Ia om.duce la involulia ovarelor, tulburdri nervoase qi dureri ale membrelorinferioare.

II.2.4. Vitaminele K (Fllochlnona) si rolul lor coenzimaficGrupul vitaminelor K (Filochinona, vitamina coaguldrii,

vitamina antihemoragicd, factor protrombinic) sunt derivafi denafiochinond care la Cs conlin.sau nu un radical variabil de atomi decarbon.

R= "rr"*oxlt"-,"r,-"",-lxlcHr3-H

fin]lcH"t-

R= (CH'{H{_CH,-H

dihmesil

(filochinona) are la Cs un larlt lateral de litit (20

(farnochinona) conline un radical difarnesil {30

Vitamina Kr

atomi de carbon).

Vitamina I{z

atomi de carbon).

I

106

Vitamina IG (menadiona) - in care radicalul R este H, estesinteticd qi este solubild in apd spre deosebire de Kr Si Kz.

Vitamina K este produsd in intestin de bacterii intestinale sauadusd prin aport alimentar.

Absorblia vitaminelor Kr qi Kz (natura-1e) se face impreuna culipidele, apoi pe cale limfaticd trec in se,nge qi de aici in ficat. Cea maimare cantitate a vitaminelor K naturale se depoziteazd temporar inIicat; vitaminele K sintetice frind solubile se absorb in absenlasdrurilor biliare. Ele nu se acumuleazi, excesul find eliminat pringlucurono- sau sulfo-conjugare.

e ,.Y Rohtl metabolic al vitaminei K

Principalul ro1 al vitaminei K este in modificarea posttranscripfionali a unor proteine in principal a factorilor coagulirii,unde in calitate de coenzirrrd, participi,la 1-carboxilarea unor resturiglutamil prezente in aceste proteine. I.

Proteinele coaguldrii: protrornbina (factorul iI), proconvertina(factorul VII), factorul Christmas (factorul IX), factorul Stuart (factorulX), sunt sintetizate in ficat sub formd de precursori inactivi (zimogeni).Pentru ca aceqti factori sd fie transformali in formele biologic activeeste necesard carboxilarea posttranscdplionald a resturilor glutamil,

din precursori, la acid 1.- carboxi glutamic, carboxilare catalizate devita-rnina K.

qoo-ICH,,t -CH,I -

-c-cH-NlFl lo

Glu

Acid glutamic

-OOCI TCOO-

CHco, I_--:________-__> /alr

Vitamina K i r'

_C-CH_NIFtlo

Gla

Acid T-carboxi-glutamic

Resturile carboxil au o mare capacitate de chelatare a ionilor deCa2* care servesc la legarea fosfolipidelor cu protrombina interacliune

107

specifice pentru activarea protrombinei la trombina, factorul activ alcoaguiSrii (fig 28).

Fig 28. Rolul vitaminei K in coagulare. precursorii factorilor coagderii suntsinteti"ali in formi inactivd, caractirizatn de prezenla .*Li- g*pa.i carboxil. Eisufere procesul de activare sub acliunea ,iil;"i K, ;;!"" ""r"

conste inintroducerea_ unei g.upari carboll. !,,ffi-*i".". -pr*i.riu"""to,

doue gruparicarboxil (incdrcate nesativl in pozilie adiacentd, fi*;;;; u5urinta ionii Ca2*,ducr6nd la formarea lomolexului protromUinJcJcif*ii*sange. Acesta leagefosfolipidele de pe suprafal-a plachetilor, "*pa-;;H;

in p"-"""r.,t de coagulare

Antivitaminele K, dicumarolul Si warfarina (derivali cumarinici)inhibd reaclia de carboxilare.a acidului glutamic $t sunt folosili caagenti anticoagulanli atunci cAnd existd primejdia coaguErii sAngeluila nivelul vaselor sanguine (tromboze).

o T\rlburiri de aport wltaminic

Carenla de vitamind K se instaleazd cand existd. tulburdri inabsorbtia de lipide (deficit de bild), afecliuni intestinale, alterarea floreiintestinale, afecliuni hepatice, boli infeclioase.

Careanla de vitamind K duce la scdderea protrombinei.prelungirea timpului de coagulare Si aparilia de fenomene hemoragicespontane.

in perioada imediat postnatale, nou n5sculii sunt predispugi lahemoragii deoarece se nasc f6r1. rezewe de vitamind K, av6ndintestinul sterii.