Universitatea ``Vasile Alecsandri``Bacau Facultatea de Inginerie Specializarea Inginerie Biochimica

PROIECT LA DISCIPLINA: ,,BIOREACTOARE

Coordonator: Prof.dr.ing. Nistor Ileana-Denisa Prep.drd.ing. Muntianu Gabriela

Student: Pascu Alina Grupa 1141 A

20101

TEMA PROIECTLUI: PROIECTAREA UNUI BIOREACTOR UTILIZAT LA OBINEREA PREPARATELOR ENZIMATICE DESTINATE MATURRII BRNZETURILOR

2

CuprinsTEMA DE PROIECTARE.................................................................pag. 2 INTRODUCERE.................................................................................pag. 4 Capitolul 1. Elemente de inginerie tehnologic.....................................pag. 6 1.1. Caracteristicile materiilor prime i auxiliare..........................................pag. 6 1.1.2. Tipuri de bacterii starter...............................................................................pag. 10 1.1.2. Aspergillus Niger.........................................................................................pag. 12 1.2. Caracteristicile produselor finite.............................................................pag. 14

1.2.1.Generaliti despre produsele finite...............................................................pag. 14 1.2.2.Preparate enzimatice folosite la maturarea brnzeturilor..............................pag. 17 1.2.3. Aciunea principalelor proteinaze n timpul maturrii brnzei......................pag. 18 1.2.4.Alte enzime din lapte......................................................................................pag. 20 1.2.5 Maturarea brnzeturilor..................................................................................pag. 23 1.2.6.Condiii de maturare a brnzeturilor i tratarea acestora n timpul maturrii..pag 25 1.2.7. Accelerarea maturrii brnzeturilor...............................................................pag. 26 1.2.8. Enzime incapsulate........................................................................................pag. 26 1.3. Variante tehnologice de obinere a produsului finit...................................pag. 28 1.4. Descrierea etapelor tehnologice....................................................................pag. 31 Capitolul 2. Bilanul de materiale..........................................................pag. 35 Capitolul 4. Bilanul termic....................................................................pag. 38 Capitolul 4. Alegerea i dimensionarea bioreactorului........................pag. 40 4.1. Utilajul principal-descriere..............................................................................pag. 40 4.2. Dimensionarea bioreactorului.........................................................................pag. 43 Concluzii......................................................................................pag. 45 Bibliografie..................................................................................pag. 46

3

IntroducereEnzimele reprezint catalizatori organici de natur proteic cu structur

macromolecular, elaborate de celula vie. Ele manifest aciune strict specific i au rol primordial n metabolismul celular. Specificitatea enzimelor este determinat de structura centrilor activi formai de anumite grupe funcionale ale aminoacizilor i alte grupe chimice. Cataliza enzimatic ocup un loc important n biotehnologiile moderne. Utilizarea lor n diferite domenii permite perfecionarea proceselor tehnologice, a metodelor de analiz, asigur indici superiori i randamente crescute n industrie, agricultur, facilitnd progresul tehnic. Abilitile catalitice ale enzimelor mult mai sporite fa de catalizatorii chimici, realizarea proceselor n condiii moderate de pH, temperatur i presiune, precum i specificitatea de substrat nalt, fr echivalent n cataliza neenzimatic au influenat considerabil lrgirea sferei de aplicare a preparatelor enzimatice - diverse procese tehnologice, cercetri tiinifice, medicin, etc. Pe larg se utilizeaz astzi enzimele n rile cu biotehnologii avansate - Statele Unite ale Americii, Japonia, Germania, Federaia Rus. Marea majoritate a enzimelor utilizate n diferite ramuri industriale este reprezentat de hidrolaze care sunt n marea majoritate enzime exocelulare, uor solubile n ap. Dintre acestea largi aplicri are grupa enzimelor proteolitice datorit rolului cheie n diversitatea transformrilor substanelor proteice. Se utilizeaz proteaze de origine animal (pepsina, tripsina, renina - cheagul), vegetal (papaina, ficina, bromelaina) i microbian (proteaze produse de bacterii i fungi microscopici). Potenialul genetic bogat al micromicetelor permite obinerea unei diversiti surprinztoare de metabolii cu structur chimic complex i nsuiri biologice specifice. Prin frecvena nalt de biosintez a enzimelor hidrolitice extracelulare se evideniaz reprezentanii

4

genurilor Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus, Mucor, Alternaria, Sclerotinia, Botrytis, Chaetomium, Trichoderma. Performanele fungilor fa de alte microorganisme n calitate de productori de hidrolaze este capacitatea de a metaboliza o gam larg de diverse substraturi ieftine i accesibile i de a secreta metaboliii n mediul de cultur cea ce reduce preul de cost a produsului final, simplific procesul tehnologic. Rolul principal al proteazelor const n hidroliza substanelor polipeptidice cu structura complex pn la fragmente cu masa molecular joas, ceea ce determin gama larg de aplicare n industria alimentar, n procesele de fabricare a prafului de supe, a brnzeturilor, a unor produse de carne, buturilor proteinizate, n panificaie. Preparatele enzimatice cu aciune de coagulare a laptelui sunt denumite uzual cheag microbian. Lipsa tot mai accentuat a cheagului de origin animal a dus la sporirea preocuprilor pentru a gsi modalitatea de rezolvare a situaiei n condiiile n care producia de brnzeturi are tendine de cretere. La scar industrial se produc cheaguri microbiene, prin biosintez cu diferite micete.

5

1. Elemente de inginerie tehnologica

1.1 Caracteristicile materiilor prime i auxiliare Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obin plecnd de la o cultur pur stoc i care prin trecerea prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru producerea unor alimente fermentate. Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe microorganisme. La folosirea culturilor starter n industria alimentar trebuie s se in seama de urmtoarele caracteristici: -sa conin un anumit numr de microorganisme viabile/g sau ml i un numar ct mai redus de germeni nedorii; -produii metabolici s nu prezinte pericol pentru sntatea omului; -s nu conin i s nu produc antibiotice care se utilizeaz n scop terapeutic la om; -s aib anumite activitti specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a azotului etc; -microorganismele existente n cultur s fie declarate cu numele stiinific ntreg; Un mediu de cultur este un amestec de substane care asigur toate componentele necesare pentru metabolismul celulei, i anume: Surse de carbon; Azot; Substante minerale; Factori de cretere; Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea i conservarea microorganismelor sau pentru obinerea prin cultivare a produselor de biosintez microbian. Mediile pot fi procurate de la firme productoare sau pot fi preparate n laborator. Cultura microorganismelor este utilizat pentru a crete numrul de celule care se doresc a fi studiate. Microorganismele sunt adugate n mediul de cultur ce conine nutrieni pentru cretere. Cultura este incubat una sau mai multe zile, la temperatura optim a fiecrui microorganism. n multe cazuri microorganismele sunt crescute pe plci cu agar. Microorganismele se multiplic formnd colonii. O colonie crete n locul n care o singur

6

celul a fost inoculat. O colonie este ca o clon; ea poate fi pur daca nu exista n jurul ei alte tipuri de microorganisme n colonii ce o pot contamina. Mediile de cultur selective sunt medii definite sau complexe, cu o compoziie chimic bine definit, care permit dezvoltarea unui numr restrns de microorganisme sau chiar a unei specii. . Aceste medii conin pe lng substane nutritive i inhibitori ai altor microorganisme insoitoare din microbiota din care se face izolarea culturii care se dorete a fi selecionat. Microorganismele adugate la fabricarea brnzeturilor pot fi mpartite n 2 mari grupe: microorganisme starter i microflor secundar. Pe lng acestea n timpul fabricaiei se mai pot dezvolta n brnz i microorganisme non-starter provenite din lapte sau din contaminri n timpul prelucrrii. Microflora starter este format cu precdere din bacterii ce produc fermentaia lactic, proces anaerob de metabolizare a glucidelor sub aciunea echipamentului enzimatic al microorganismelor, avnd ca produs principal acidul lactic. Microorganismele din cultura secundar nu contribuie la formarea acidului lactic, dar n general joac un rol important n timpul maturrii. Bacteriile lactice ntlnite frecvent n culturile starter sunt: Lactoccocus lactis, Streptoccocus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, utilizate fie individual, fie n combinaii n funcie de sortimentul de brnz. O serie de microorganisme cunoscute sub denumirea de microflor secundar, pot fi adugate alturi de cultura starter. Din aceast categorie fac parte propionobacterii, brevibacterii i specii de mucegaiuri(Penicillium). Aceste microorganisme sunt utilizate mpreun cu bacteriile lactice i sunt specifice unui anumit sortiment de brnzeturi. Producerea de acid lactic de ctre microflora starter n timpul fabricrii brnzeturilor determin o reducere a Ph-ului laptelui care combinat cu un tratament termic i amestecare promoveaz sinereza prin expulzarea zerului din ca, contribuind semnificativ la unul din procesele de baza ale fabricrii brnzeturilor. Maturarea brnzeturilor este un proces complex ce implica un numr de reacii biochimice la care iau parte i concentraii mari de microorganisme prezente n brnza. Att coninutul de acid lactic ct i procentul de transformare a lactozei n acid lactic reprezint doi indicatori foarte importani pentru evaluarea calitii brnzeturilor. n timpul maturrii, culturile de bacterii sufer procesul de autoliz, elibernd enzime intracelulare n reeaua de brnza, iar aceste enzime vor continua s acioneze asupra componenilor caului, dezvoltnd aroma i producnd modificrile dorite de textur n timpul maturrii. Bacteriile lactice Caractere morfologice:bacteriile lactice prezinta heterogenitate morfologic. Principalele forme sunt derivate de la forma coccus i se gsesc sub forma de streptococi(g. Streptococcus si Lactococcus), de diplococi(g. Leuconostoc), de tetrade( g. Pediococcus), iar numeroase bacterii lactice se prezinta sub form de bastonae. Caractere fiziologice:bacteriile lactice folosesc ca surs de carbon i energie pentozele,hexozele i diglucidele. Dintre acizi, acidul malic poate fi transformat n acid lactic,iar acidul citric n acetona i diacetil.

7

Numeroi lactobacili au fost identificai n timpul maturrii brnzeturilor. Lactobacilii ocup o ni specific n maturarea brnzeturilor. Lactobacilii au fost izolai din brnzeturi i supui identificrii, iar cele mai raspndite sunt subspeciile gsite( Lactobacillus casei, Lb. Fermentum, Lb. Brevis).

8

Prezena microorganismelor heterofermentative- Lb. Fermentum, Lb.brevis a determinat defecte de textur la brnza Cheddar. Adugarea lactobacililor heterofermentativi determin mbuntirea calitii brnzeturilor, n special prin accelerarea proceselor de maturare. Cultura secundar Propionibacterium- bacterii G(+), catalazo-pozitive, anaerobe/facultativ aerobe, nesporulate.Patru specii sunt asociate cu brnza Elveiana: Propionibacterium freundenreichii, P. Thoenii, P. Jensenii si P. Acidopropionici. Fermentarea conduce la producerea de acid propionic,acid acetic si dioxid de carbon. Culturi starter Culturile starter contribuie la maturarea brnzeturilor,unde enzimele sunt implicate n proteoliza i n transformarea aminoacizilor n compui de arom. Se utilizeaz: -culturi starter mezofile: pentru brnza Cheddar, Gouda, Edam, Brie i Camembert; - culturi starter termofile(50-55 C)- pentru brnzeturile tratate termic, brnzeturile cu past tare. Microflora non-starter Microflora non-starter reprezint culturi mezofile de lactococi i pediococi, care reprezint o parte important a florei microbiene n majoritatea brnzeturilor n timpul maturrii. Ele nu fac parte din microflora normal starter i de regul cresc n bune condiii n lapte i nu contribuie la producerea acidului n vanele de coagulare. Microorganismele implicate n producerea brnzei i maturarea brnzei pot fi mprite n dou grupe majore: 1) Microorganisme (placa) care se adaug n brnz dup ce au fost selectate cu atenie 2) Bacterii lactice acide non-starter (NSLAB). Primul grup poate fi submprit n dou grupe:culturi starter primare i secundare. Bacteriile acide lactice sunt implicate n producia de acid pe parcursul procesului de fabricaie i contribuie la procesul de maturare. Microorganismele secundare nu contribuie la producia de acid i constau n : (a) bacterii lactice acide non-starter (NSLAB) (b) alte bacterii, drojdii i / sau mucegaiuri. Microorganismele i funcia lor n producia de brnzeturi sunt rezumate n tabelul 1.1.

9

Tabelul 2. Microorganismele din brnz i funcia lor

Genul sau specia Bacterii starterLactococcus Lactis Leuconoctoc spp. Lactobacillus delbrueckii Streptococcus thermophilus Enterococcus spp.

Functie cea mai importantaProductia de acid si de aroma in timpul maturarii Metabolismul citratului Productia de acid; formarea aromei in timpul maturarii Productia de acid; formarea aromei in timpul maturarii Formarea aromei in timpul maturarii Formarea aromei in timpul maturarii Formarea aromei in timpul maturarii

Bacterii lactice non-starterLactobacillus casei Pediococcus spp.

Flora secundaraCorynebacterium spp. Brevibacterium linens Penicillium camemberti Penicillium roqueforti Yeasts proteoliza proteoliza Conversia lactatului in dioxid de C si apa

1.1.1. Tipuri de bacterii starter Dou tipuri de bacterii starter sunt utilizate n procesul de producere a brnzei: termofile cu temperaturi optime de 42 C i mezofile cu temperaturi optime de 30 C. Criteriile de selecie pentru tipul- 0 (un anumit tip starter) de culturi starter mezofile n brnzeturile Cheddar sunt dup cum urmeaz : Productia de acid la 21 i 30-40 C Toleranta la sare Activitatea proteinazei si peptidazei Bacteriile starter sunt bacteriile acidului lactic (LAB) i funcia lor este de a produce acid n timpul procesului de fermentare, acidifierea laptelui pentru brnz la un nivel corespunztor i de asemenea, s contribuie la proteoliza n timpul coacerii. Ele prevd, de asemenea un mediu adecvat cu privire la potenialul redox, pH, umiditate i coninutul de sare pentru a permite activitatea enzimei din chimozina (cheag) i culturi starter s procedeze favorabil n brnz. n afar de plasmina din lapte i cheag, bacteriile acidului lactic(LAB) reprezint principala surs de enzime proteolitice (proteinaze i peptidaze) n brnzeturi. Ele transform cazeina n peptide mici i aminoacizi liberi, care contribuie la arom i pot servi ca precursori de arom. Bacteriile starter cresc rapid n lapte pentru brnz i ca n timpul produciei, ajungnd la 108-109 ufc g-1, dar ulterior scad la aproximativ 1% din numrul maxim n termen de o luna 10

de maturare datorit pH-ului sczut, epuizrii de lactoz i concentraia nalta de sare n ca. Moartea i liza celulelor starter sunt importante deoarece enzimele proteolitice intracelulare sunt eliberate n brnz unde degradeaz oligopeptidele la peptide mici i aminoacizi. Enzimele lor sunt implicate n transformarea proteinelor n aminoacizi i acizi grai de la care compuii de aroma sunt produi . Bacteriile starter sunt membri din genurile Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc i Enterococcus. De asemenea, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii i helveticus Lactobacillus sunt considerate ca bacterii starter . Culturile starter sunt ngheate n volume (200-1000 litri) sau congelate-uscate care pot fi apoi adugate direct la laptele pentru brnz. Inocularea laptelui minimizeaz riscul de contaminare i formatorii de arom ce contribuie la aroma de dezvoltare sunt cunoscui a fi prezeni. Culturile secundare pot fi definite ca acelea adugate la brnz n alte scopuri dect producia de acid i n esen, pot servi ca o surs suplimentar de enzime. Culturile secundare NSLAB necesit dou caracteristici importante. Prima este c tulpinile trebuie s ofere un echilibru de reacii de maturare benefice n brnz. Adjuncii sunt selectai pe baza de lips de defecte specifice. Al doilea este c tulpinile adjuncilor trebuie s fie competitive mpotriva NSLAB accidental n brnz Cheddar i rmne dominant n timpul coacerii pentru a nu afecta aroma. n multe cazuri, aceast caracteristic este obinut prin selectarea NSLAB izolate de bun calitate. Studiile au artat c lactobacilii, folosii ca adjuvani, pot afecta dezvoltarea aromei n brnz Cheddar. Cele mai multe rapoarte ale cercettorilor consolideaza proteoliza i imbuntatirea intensitatii aromei . Astfel, selectarea tulpinii adjuvantului este crucial, pentru c mbuntirea tulpinii de Lactococcus casei produc brnza Cheddar de nalt calitate, n timp ce alte tulpini ale acestor specii a dus la brnz cu gust amar i defecte. De obicei, includerea de tulpini adjuncte de culturi non-starter de lactobacili mbuntesc intensitatea aromei, cresc aroma i accelereaz maturarea. Culturile secundare implicate includ bacterii lactice acide nonstarter (NSLAB), care cresc pe plan intern, n cele mai multe soiuri de brnz, bacterii (Micrococcus, Corynebacterium), bacterii acid propionice (PAB), drojdii (Debaryomyces hansenii), matrie (Penicillum camemberti) i lactobacili heterofermentativi(tabelul 1.1). Cele mai multe dintre culturile secundare cresc n principal pe suprafaa brnzei. Acestea sunt fie: (a) contaminani accidentali (b) n mod deliberat adugate (drojdii). Pentru anumite brnzeturi (Emmental) se utilizeaz i Propionibacterium shermanii, care fermenteaz acidul lactic cu producere de acid propionic, acid acetic i dioxid de carbon, care provoac ``desenul`` brnzei(ochiuri mari). Pentru brnzeturile de tip Lamburger se utilizeaz Brevibacterium linens, care contribuie la maturarea de suprafat a brnzei i formeaz colonii roii-orange. Sporii mucegaiului Penicillium roqueforti se utilizeaz la fabricarea brnzeturilor cu mucegai n past, iar sporii de Penicillium Camemberti se utilizeaz pentru maturarea de suprafat a brnzeturilor de tip Camembert, Brie etc. Microflora variaz numeric n timp. Astfel,dac n brnza iniiala se gsesc ntre 10000000 si 100000000 celule formatoare de colonii/g, pe msura ce maturarea progreseaz , numrul de bacterii lactice se reduce, n funcie de brnz i n principal n dependen de gradul de eliminare al lactozei, de nivelul de NaCl din brnza i/sau gradul de autoliz al bacteriilor lactice. Activitatea bacteriilor lactice este inhibat cnd micelul de NaCl n apa coninut de brnz este mai mare de 5%. Cultura starter de bacterii lactice se folosete dup o prealabil pstrare la frig( 50 C), plasmina joac un rol important deoarece chimozina este inactivat n aceste brnzeturi.

18

Figura 4. Reprezentarea schematic a sistemului enzimatic al plasminei n lapte

Proteoliza este caracteristic la cele mai multe soiuri de brnz i este indispensabil pentru gust bun i dezvoltri texturale. Proteinazele utilizate n prelucrarea brnzei includ: a plasmin, b cheag, c proteinaze (peretele celular i / sau intracelular) de bacterii starter i nonstarter. Aproximativ 6% din cheagul adaugat n lapte pentru brnz rmne n caul dup fabricaie i contribuie n mod semnificativ la proteoliza n timpul coacerii. Combinaii neutre de proteinaze individuale i peptidaze microbiene intensific aroma brnzei i atunci cnd sunt utilizate n combinaii cu cheaguri microbiene reduc intensitatea de amrciune cauzat de acesta din urm. Proteazele acide n izolare provoaca amrciune intensa. Diferite lipaze animale sau microbiene au dat aroma pronunata brnzei, amrciunea i rncezirea a sczut puternic, n timp ce lipazele n combinaie cu proteinaze i / sau peptidaze dau gust bun brnzei, cu un nivel sczut de amrciune. ntr-o abordare mai echilibrat la accelerarea de maturare a brnzei folosind amestecuri de proteinaze i peptidaze, celulele atenuate de pornire sau extracte de celule-free (CFE) sunt favorizate. Sistemul proteolitic de bacterii de acid lactic este esenial pentru creterea lor n lapte i contribuie n mod semnificativ la dezvoltarea aromei n produsele din lapte fermentat. Sistemul este compus din proteinaze proteolitice, care scindeaz iniial proteina din lapte la peptide; peptidazele care despic peptidele la peptide mici i aminoacizi, precum i sistemul de transport responsabil pentru absorbia celulara de peptide mici i aminoacizi. Bacteria acidului lactic are un sistem complex proteolitic capabil de conversia cazeinei din lapte in aminoacizii liberi i peptidele necesare pentru creterea acestora. Aceste proteinaze includ proteinaze extracelulare, endopeptidaze, aminopeptidaze, tripeptidaze i peptidaze specifice, care sunt toate serinproteaze. n afar de proteinaze lactice streptococice, multe alte proteinaze de origine nonlactostreptococica au fost raportate. Folosirea enzimelor pentru accelerarea maturrii brnzeturilor presupune costuri relativ sczute, aciune specific i posibilitatea stabilirii proprietilor senzoriale, dar poate prezenta dificulti de ncorporare uniform a enzimelor i risc de supramaturare. Maturarea brnzeturilor ncepe n vana de prelucrare, faza fermentrii lactice se desfsoar rapid n timpul pregtirii pentru coagulare si coagularea laptelui. Prin introducerea n laptele pasteurizat de culturi selecionate de bacterii lactice se poate dirija procesul de maturare

19

a brnzeturilor; obinndu-se produse cu caracteristici calitative constante i uniforme, prevenind influenta variaiilor zilnice de ordin microbiologic ale laptelui de colectare asupra calitii brnzeturilor. Toate operaiile ulterioare momentului obinerii coagulului, au drept scop aducerea coagulului ntr-o mas compact, asigurndu-se totodat condiii favorabile dezvoltrii bacteriilor lactice specifice, care s aib activitate enzimatic necesar transformrilor dorite a principalelor componente din brnz. n procesul de maturare a brnzeturilor se pot distinge dou faze: prima faz, reprezentat de primele 10 zile de maturare, se caracterizeaz printr-o modificare lent a valorilor parametrilor, iar n a doua faz, dup 10 zile de maturare n condiiile respective, parametrii sufer modificri semnificative. n alt ordine de idei, analiznd compoziia brnzeturilor se poate estima timpul de maturare al acestora. 1.2.4. Alte enzime din lapte Alte enzime utilizate pentru aplicarea de produse lactate sunt: (a) proteaze pentru a reduce proprietile alergice ale produselor din lapte de vac pentru sugari (b) lipazele pentru dezvoltarea de arome lipolitice n brnzeturi de specialitate. Proprietile funcionale ale proteinelor din lapte pot fi mbuntite prin proteoliza limitat prin modificarea enzimatic a proteinelor din lapte. O cazein acid-solubila, fr aroma i potrivit pentru ncorporarea n buturi i alte alimente acide a fost elaborat de ctre proteoliza limitat. Antigenitatea de cazein este distrus de proteoliza i hidrolizatul este potrivit pentru utilizarea n produsele alimentare de lapte pe baz de proteine pentru sugari alergici la lapte de vac. Proteaza alcalina(plasmina sanguina). Aparine serin proteazelor i prezint o activitate enzimatic de tip tripsinic. Aceast enzim este asociat cu micele de cazein. Are activitate maxim la 37 C i la Ph= 7,5- 8,0. Proteaza alcalin are o termorezisten relativ ridicat. Este o enzim de origine sanguin care ajunge din plasma sanguina , via epitelium-ul glandei mamare. Se gsete n lapte att sub form activ ct i sub form inactiv. Proteaza alcalin degradeaz preferenial -cazeina . k-Cazeina este cea mai rezistent la aciunea proteazei alcaline. Datorit faptului c att plasmina ct i plasminogenul sunt legate de cazein i datorit faptului c rezist n mare msur pasteurizrii, enzima va ramne n coagul i va participa la maturarea brnzeturilor, aciunea sa crescnd odat cu creterea Ph-ului brnzei. Acest lucru este vizibil n cazul brnzei Camembert, unde aciunea enzimei se intensific la sfritul maturrii, deoarece mucegaiul P. Camemberti consum acidul lactic i provoac ridicarea Ph-ului la 6,5-7, cnd activitatea plasminei este optim. Activitatea enzimei n brnz va fi influenat i de concentraia n NaCl, temperatura de maturare i umiditatea brnzei. Deoarece plasmina rezist tratamentului UHT, ea va produce un defect important n laptele concentrat sterilizat UHT, gelificarea fiind consecina modificrii suprafeei micelelor de cazein, ceea ce conduce la asocierea lor n agregate cu formare de gel. Lipoproteinlipaza Este o enzim asociat cu membrana globulelor de grsime, ea fiind activat de cofactori termostabili i inhibat de un inhibitor. Lipoproteinlipaza produce rncezirea lipolitic spontan a laptelui, momentul apariiei rncezirii fiind determinat de concentraia laptelui n enzim, raportul activator/inhibitor i de factorii care promoveaz eliberarea enzimei din

20

membrana globulelor de grsime. Poate contribui la maturarea brnzeturilor n condiiile fabricrii acestora din lapte crud sau termizat(63C/30 sec). Esterazele Cele din lapte de vaca au temperatura optim de 37C si ph-ul optim la 8,0. Esterazele din lapte au caracter lipofil i au specificitate mai mare fa de acizii cu lan scurt din structura trigliceridelor. Acioneaz mai bine n emulsie de tipul A/U. Pot participa la maturarea brnzeturilor cu mucegai la suprafa(P. Camemberti), daca acestea sunt obinute din lapte crud sau termizat. Proteaza acida Cea din lapte prezint activitate maxima la ph= 3,5-4,0 si la 50C, i degradeaza preferenial -cazeina,comparabil cu chimozina. Enzima poate contribui la maturarea brnzeturilor, daca se folosete lapte nepasteurizat sau termizat. Peptidaza n lapte s-a pus n eviden o dipeptidaz care hidrolizeaz peptidele L-L la ph alcalin . Peptidele ce conin D-aminoacizi nu sunt hidrolizate.Condiiile de activitate sunt: temperatura 45-50C i ph=7,8-8,3. Enzima poate interveni la maturarea brnzeturilor cu mucegai la suprafa, n condiiile n care s-a folosit lapte crud sau termizat. Fosfataza acida Se gsete n lapte n stare liber i asociat cu membrana globulelor de grsime i este implicat n defosforilarea cazeinei, cauznd creterea punctului izoelectric, cu influen asupra coagulrii cu cheag. Enzima rezist la pasteurizare normal. Poate conduce la desfacerea miceliilor de cazein tocmai datorit defosforilrii.Contribuie n mic masur la maturarea brnzeturilor, dac se folosete lapte crud sau termizat. Lipoliza aduce o contribuie important la aromele brnzei, datorit enzimelor lipolitice din culturile starter. Aroma caracteristic piperata de brnz cu mucegai se datoreaz acizilor grai cu lan scurt i metil cetonelor. Cele mai multe dintre lipolize n brnza cu mucegai sunt catalizate de lipaza Penicillium roqueforti, cu o contribuie mai mic a lipazei din lapte. Procesul NOVO pentru producia de enzime modificate de brnz, folosete brnz de vrst medie, care este emulsionata, omogenizata, pasteurizata i dup care se adaug lipaza din R. miehei, cu sau fr proteinaz i amestecul este maturat la o temperatur nalt pentru 1-4 zile. Amestecul este renclzit, rezult o past care este potrivita pentru a fi inclus n supe, sosuri sau snacks-uri. Tehnologia produciei de enzime modificate ale brnzei a fost dezvoltat pentru a produce o gam larg de arome caracteristice brnzei i intensificri de arom. Susinerile c enzimele exogene sunt eficiente n accelerarea maturrii nu a condus la utilizarea lor la scar larg, probabil din cauza costului ridicat al acestora, dificulti n distribuirea uniforma n ca i posibil pericol de supra-maturare a brnzei. Alte enzime minore avnd aplicaii limitate n prelucrarea laptelui includ glucozooxidaz, catalaza, superoxid dismutaza, oxidaz sulfhidril, lactoperoxidaz i lisosomi. Glucozooxidaza i catalaza sunt adesea folosite mpreun n alimente selectate pentru conservare. Superoxid dismutaza este un antioxidant pentru alimente i genereaz apa oxigenata, dar este mult mai eficace atunci cnd catalaza este prezent. Generaia termica indus de grupuri volatile de sulfhidril este considerat a fi responsabil pentru pregatirea aromei laptelui procesat n temperatur ultranalt (UHT). Utilizarea de oxidaz sulfhidril n condiii aseptice poate elimina acest defect. Mecanismul natural inhibitoar n laptele crud se datoreaz prezenei unor niveluri sczute de lactoperoxidaz (LP), care poate fi activat prin adugarea extern de urme de ap oxigenat i tiocianat. A fost raportat c potenialul sistemului de lactoperoxidaz i activarea acestuia mbuntete calitatea pstrarii laptelui. Laptele de vac poate fi prevzut cu factori de protecie prin adaosul de lizozim, fcndu-l potrivit ca un lapte pentru sugari. Lizozimul acioneaz ca un conservant prin reducerea 21

numrului de bacterii din lapte fr a afecta activitatea L. bifidus. Domeniul de aplicare a enzimelor minore la lapte i produse lactate a fost recent revizuit. Fabricarea brnzei i maturarea presupune aciunea unor enzime (de la cheag i lapte) i a microorganismelor selectate, att direct, n timpul creterii, i indirect, prin intermediul enzimelor dup moarte i liz. Modificrile microbiologice la brnz n timpul coacerii include moartea i liza celulelor starter i o cretere a florei adventive cum ar fi bacteriile non-starter ale acidului lactic. Textura brnzei se nmoaie n timpul maturrii ca o consecin a hidrolizei miceliilor cazeinei n timpul proteolizei si modificri ale pH-ului (care, la rndul lor pot provoca alte modificri, cum ar fi migraia i precipitarea de fosfat de calciu). Modificrile biochimice care au loc n timpul coacerii pot fi grupate n evenimente primare care includ metabolismul lactozei reziduale i de lactat i citrat, lipoliza i proteoliza. n urma acestor evenimente primare, evenimentele biochimice secundare sunt foarte importante pentru dezvoltarea de compui volatili de aroma i includ metabolismul acizilor grai i al aminoacizilor. Un echilibru ntre produsele primare i secundare s-a dovedit a fi responsabil pentru aroma i textura brnzei tipice (Kheadr et al 2003.,). Brnza coagulat cu cheag este maturat pentru o perioad cuprins ntre dou sptmni i doi sau mai muli ani, de exemplu extra-maturea brnzei Cheddar, n timpul creia i textura i aroma caracteristice soiului se dezvolt. Maturarea de obicei implic modificri ale microorganismelor din brnz, inclusiv moartea i liza celulelor starter, dezvoltarea microorganismelor non-starter accidental i n multe brnzeturi, creterea microorganismelor secundare . Maturarea brnzei Cheddar este afectat n principal de rata i gradul de proteoliz. Enzime din mai multe surse contribuie la proteoliza i dezvoltarea de textur i arom n timpul coacerii. Aceste enzime provin din lapte (n principal plasmina), coagulant (cheag), microorganisme din culturi starter i non-starter . n timpul maturrii brnzei, trei mari evenimente biochimice primare au loc- lipoliza, glicoliz i proteoliza, fiecare dintre acestea fiind implicat n formarea aromei. Acesta din urm este cel mai important i de asemenea, cel mai complex . Glicoliza este conversia lactozei n acid lactic i se datoreaz creterii bacteriilor starter i produsul lactat d brnzei gustul proaspt acid general. Acestea pot produce de asemenea, acetat de diacetil i acetaldehid, care sunt compui importani n formarea aromei n brnzeturi proaspete; diacetil este de asemenea, un compus de arom important n brnzeturi dure. Lipoliza rezult din hidroliza grsimei din lapte i producia de acizi grai liberi i glicerin. Acizii grai pot fi n continuare metabolizai la metil cetone i grsimi, de asemenea, i acioneaz ca un solvent pentru multe dintre aromele compuilor produi n brnz . Sursele de proteinaz din brnz este laptele n sine, chimozina (cheag), bacterii lactice acide(placa), bacterii lactice acide non-starter (NSLAB) i microorganismele secundare (micrococci, drojdii si mucegaiuri). Proteinaza laptelui este plasmina i este semnificativ n brnz atunci cnd chimozina este inactivat n timpul gtirii brnzei. Peptidele mici produse din hidroliza de cazein pot fi defalcate n aminoacizi mai mici, peptide, amine, alcooli i compui de sulf, care contribuie la formarea aromei, prin autoliza de placa care elibereaz proteinaze i peptidaze. Combinarea perfect a acestor compusi este responsabil pentru aroma diferit a brnzeturlor. Pentru o prezentare general a cilor biochimice n timpul maturrii brnzei se refer fig. 1.1.

22

Figura 5. Privire de ansamblu privind transformrile biochimice n timpul maturrii brnzeturilor

Preparatele enzimatice cu aciunea de coagulare a laptelui sunt cunoscute sub denumirea de ``cheag microbian``. Lipsa tot mai accentuat a cheagului de origin animal a dus la sporirea preocuprilor pentru a gsi modalitatea de rezolvare a situaiei n condiiile n care producia de brnzeturi are tendine de cretere. La scar industrial se produc cheaguri microbiene, prin biosintez cu diferite micete. 1.2.5. Maturarea brnzeturilor Maturarea brnzeturilor este ansamblul de fenomene chimice, microbiologice i enzimatice care asigur produsului totalitatea caracteristicilor organoleptice specifice sortimentului. Procesul de maturare are loc n anumite condiii de microclimat, ntr-un timp mai mult sau mai puin ndelungat, n raport cu sortimentul fabricat, timp n care principalii componeni: lactoza, substanele proteice i grsimile sufer o serie de transformri. Lactoza este fermentat n acid lactic n totalitate n primele 10 zile de maturare. n continuare acidul lactic sub influena unor microorganisme este transformat n acid propionic, acid acetic i dioxid de carbon, contribuind la formarea aromei i desenului pastei. Grsimea sufer modificari mai importante, n special n cazul brnzeturilor cu mucegai, cu formare n prima etap de acizi grai i glicerin i n faza urmtoare de aldehide i cetone care asigur un gust particular acestor brnzeturi. Substanele proteice n timpul maturrii sufer o hidroliz enzimatic cu formare de compui mai simpli i usor digerabili. Gradul de transformare a substanelor proteice este n relaie direct cu durata maturrii. Procesul de maturare cuprinde trei faze:

23

-prematurarea, cnd are loc acidifierea pastei prin transformarea lactozei n acid lactic, o slab degradare a cazeinei i formarea gurilor specifice la anumite brnzeturi, prin aciunea bacteriilor propionice; - maturarea propriu-zisa, cunoscuta sub denumirea de ``affinage``, n care continu transformrile biochimice, dar cu o viteza mai redus i n care se definitiveaz aroma specific brnzei respective ; Activitatea enzimelor implicate n maturare este influenata de: compoziia brnzei crude, structura micelelor de cazein i a grsimii, umiditatea brnzei, ph-ul brnzei, temperatura de maturare, potenialul redox al brnzei, coninutul de NaCl din brnza. Enzimele implicate n maturare sunt cele proteolitice i lipolitice, cu specificaia c, imediat dup adaugarea de culturi lactice, are loc transformarea lactozei n acid lactic. Consecina acumulrii de acid lactic este scderea ph-ului, care trebuie s fie diferit la 24h, n funcie de felul brnzei: -brnzeturi cu ph=5 i peste 5(brnzeturi cu ncalzirea la temperaturi ridicate); -ph=5 i sub 5( brnzeturi moi , Cheddar i brnzeturile la fermentarea crora particip mucegaiurile). n timpul maturrii brnzeturile sunt supuse unor tratamente i ngrijirii specialentoarcere,splri cu soluii cu 2-3% sare. Cu excepia brnzei proaspete, caul se matureaz la diferite temperaturi i durate de timp pn la atingerea aromei caracteristice, texturii i profilului. Agentii de maturare ai brnzei sunt: - bacteriile li enzimele din lapte; - culturile lactice; - specie; - lipaze; - mucegaiuri sau drojdii adugate; contaminanii din mediul inconjurtor; Astfel, coninutul microbiologic de ca, compoziia biochimic a caului, precum i temperatura i umiditatea influeneaz produsul final. Aceast etap final variaz de la cteva sptmni pn la ani n funcie de soiul de brnz. Enzimele cele mai populare folosite pentru a nchega laptele se numesc proteaze.Acesta funcioneaz prin distrugerea unei proteine din lapte numit cazeina Kappa. O alt enzim importanta este cheagul. Cheagul este un acid lactic, utilizat pentru a ajuta la accelerarea procesului cu proteaze, dar se gsete n membrana de stomac a unui viel! Ea vine n multe forme diferite derivate din animale, vegetale i cele produse genetic! Enzima activ n cadrul cheagului este numit chimozina i o dat adugata n lapte, ncepe coagularea acestuia. - Transformarea de cazein, defalcat din proteaze la paracazein sub influena cheagului. - Precipitarea paracazeinei n prezena ionilor de calciu. Toate acestea au loc din cauza temperaturilor specifice, aciditii i calciului, din cauza naturii sale ionice, n lapte. Cu toate acestea, cea mai bun temperatur pentru reacia normal a cheaguluilui este de 40 C, dar temperaturile mai mici sunt utilizate n mod normal n practic, n principal pentru a evita duritatea excesiv de coagulare. Proteoliza apare n toate soiurile de brnz i este o condiie prealabil pentru dezvoltare aromei caracteristice, care poate fi reglementat prin utilizarea adecvat a agenilor de mai sus. Maturarea brnzei este n esen un proces enzimatic, care poate fi accelerat prin creterea activitii enzimelor cheie. Acest lucru are avantajul de a iniia mai multe aciuni specifice pentru dezvoltarea aromei fa de utilizarea de temperaturi ridicate care pot duce la accelerarea reaciilor adverse nespecifice, i n consecin, n afara dezvoltarea aromei. Enzimele pot fi adugate pentru a dezvolta arome specifice n brnzeturi. Cile care duc la formarea de compui 24

-

de arom sunt n mare parte necunoscute, i, prin urmare, utilizarea de enzime exogene pentru a accelera maturarea este n cea mai mare parte un proces empiric. Diferite enzime microbiene folosite pentru a accelera maturarea brnzei sunt prezentate n tabelul 2.

Enzimele proteolitice ale bacteriilor de acid lactic n produsele din lapte fermentate.

1.2.6. Condiii de maturare a brnzeturilor i tratarea acestora n timpul maturrii. Maturarea brnzeturilor se face n ncperi condiionate, pe stelaje fixe sau mobile, temperatura de maturare fiind de 20-26C pentru brnzeturilor de format mare (maturare cald) i de 15-20 C pentru cele de format mic. Definitivarea maturrii se face n ncaperi cu temperatura de 1014 C. n timpul maturrii se pstreaz o anumit umiditate relativ , care este n funcie de tipul de brnz: -la brnzeturile Camembert, Brie, Roquefort, pentru asigurarea dezvoltrii mucegaiului sunt necesare umiditai relative mai mari(>90%); - la celelalte tipuri de brnzeturi se recomand la nceput o umiditate relativ mai mare, pentru a favoriza difuzia srii n interior, apoi o umiditate relativ mai sczut, pentru a preveni dezvoltarea mucegaiurilor i a mucilagiilor la suprafaa brnzei( nlimea lichidului n reactor va fi : Hl = 0,5 m. d = Dr/3 d = 0,49/3 = 0,16m

42

5. Concluzii

n cadrul acestei lucrri mi-am propus s scot n eviden multe amnunte importante prin proiectarea unui bioreactor utilizat la obinerea preparatelor enzimatice utilizate n maturarea brnzeturilor, dar i calculul bilanului de materiale i cel termic. Preparatele enzimatice pot fi obinute din surse vegetale, surse animale, microbiologice. Studiile privind obinerea proteazelor acide au demarat n anul 1960, cnd au fost obinute proteaze acide, termistabile, cu specii termofile ale genului Mucor ( cu temperatura optim de dezvoltare 55....60C ). ncepand din 1970 au fost iniiate studii privind obinerea de proteaze acide cu mucegaiuri din genul Aspergillus ( A. Niger, A. Oryzae) prin cultivarea n sistem SSF pe orez sau gru. Preparatele enzimatice obinute sunt complexe, conin pe lng proteaze si amilaze, celulaze. Proteazele acide se obin industrial prin cultivarea n sistem SSF. Dei se poate adopta pentru biosintez i procedeul culturilor submerse, n acest caz randamentele de obinere a preparatului enzimatic sunt mai sczute. n general, condiiile optime de biosintez a proteazelor sunt diferite de condiiile optime de cretere, pentru fiecare agent productor impunndu-se optimizarea condiiilor fermentative. Materia prim folosit n obinerea enzimelor este Aspergillus Niger. Acest gen prezint un deosebit interes, pe de o parte datorit aplicaiilor biotehnologice precum i datorit faptului c unii reprezentani sunt cunoscuti ca patogeni. Aspergillus este sursa de acizi organici, enzime i fermentaie. Folosirea microorganismelor ca principala surs de enzime se datoreaz faptului c se pot obine cantiti mari de biomas n timp relativ scurt i n condiii bine controlate, ct i faptului c se pot realiza nivele enzimatice crescute prin intervenii asupra mediului de cultur i a parametrilor de bioproces sau asupra materialului genetic al microorganismului n procesele fermentative fie n sistem submers, fie pe substraturi solide.

43

Bibliografie 1. Viorica Maria Macovi,Calcule de operatii si utilaje pentru procesarea termic si biochimic in biotehnologie,Editura Alma,Galati ,2001 2. Gabriela Bahrim, Biotehnologia Preparatelor Enzimatice, Editura ACADEMICA, Galati, 2002 3. Jurcoane, Tratat de biotehnologie , vol. 1, Editura Tehnica, Bucuresti, 2004 4. G. Zarnea, Bioingineria preparatelor enzimatice microbiene, Editura Tehnica, Bucuresti 5. Dabija A., Rusu L.,Alexa I.C. ,Enzimologie industriala ,Editura Alma Mater ,Bacau,2007.

44