Upload
priscilla-fox
View
19
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Клонирование ДНК. Плазмиды. Плазмида – внехромосомный генетический элемент встречающийся во множестве видов бактерий. П. – это двухцепочечные замкнутые кольцевые молекулы ДНК размером от 1 до 200 тысяч пар оснований. ген 1. Плазмиды содержат гены : 1. Устойчивости к антибиотикам ; - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Плазмида – внехромосомный генетический элемент встречающийся во множестве видов бактерий. П. – это двухцепочечные замкнутые кольцевые молекулы ДНК размером от 1 до 200 тысяч пар оснований.
Плазмиды
Клонирование ДНК
Плазмиды содержат гены:
1. Устойчивости к антибиотикам;2. Синтеза антибиотиков;3. Расщепления сложных органических соединений;4. Образования колицинов (летальные изменения мембран);5. Образования энтеротоксинов;6. Образования ферментов рестрикции и модификации (рестриктазы+метилазы).
ген 1
ген n
Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции)
Р. – ферменты вносящие в ДНК двуцепочечный разрыв с образованием выступающих ‘липких’ концов. Разрыв вносится по определенным последовательностям-палиндромам.
HindIII 5’-AAGCTT-3’ Haemophilus influenzae Rd 3’-TTCGAA-5’ геном закончен в 1995 г.
EcoRI GAATTC Escherichia coli
BamHI GGATCC Bacillus amyloliquefaciens H
PstI CTGCAG Providencia stuartii
М. – присоединяют метильную группу к ДНК, т.е. модифицируют ее, причем по определенным последовательностям. Модифицированная ДНК не гидролизуется рестриктазами. Таким образом бактерия защищает свою ДНК от собственных рестриктаз, но не от чужих, т.к. чужие рестриктазы могут узнавать неметилированные последовательности.
Метилазы
ген устойчивости к антибиотику A
Origin репликации
Последовательнсти, распознаваемые какой-то эндонуклеазой рестрикции (сайты), например EcoRI
Клонирование ДНК
Фрагмент ДНК, содержащий ген, который мы собираемся клонировать
Ген Х
Сайты для EcoRI
EcoRI
Ген Х
Ori
Ar
Ori
Ar
лигазаГен Х
Гидролиз и лигирование (сшивка) ДНК
Клонирование ДНК
Трансформация E. coli, селекция клонов
Плазмиды с геном Х
E.coli
Электрический разряд ~2000 V, 5 ms
Чашка Петри с селективной средой: агар+антибиотик А
Размножаются только те бактерии, которые содержат плазмиду с геном устойчивости к антибиотику