第六章：微生物培养技术与动力学

6.1 6.1 微生物发酵动力学微生物发酵动力学

6.1.1 分批培养

营养物和菌种一次加入进行培养，直到结 束放出，中间除了空气进入和尾气排出，添加消泡剂和调节 pH, 与外部没有物料交换 , 属于非稳态过程。 优点：放大到罐操作比较容易 ，操作简单 缺点：培养初期营养物过多 / 后期代谢产物的积累可能抑制生长，培养的中后期可能又因为营养物浓度过低而降低培养效率 ，总设备生产能力不高

● 延迟期 (lag phase)

是微生物适应新环境的过程 ., 表现为细胞的数量没有增加 , 但一些参与物质的运输 / 与初级代谢相关的酶类会诱导合成 ; 以及一些辅助因子的合成需要一些时间。所以，其时期的长短与细胞的生理状态和细胞的浓度有关。● 对数生长期 (log phase/exponential growth phase)

培养基营养丰富，细胞生长不受限制，细胞浓度随时间指数生长。

△ 分批培养过程中，微生物的生长曲线

dx/dt =μx, μ=(1/x) (dx/dt) x: 细胞的浓度 g/L

t: 培养时间 h,

μ : 比生长速度 h-1

单位菌体浓度引起的菌体增长，反映了指数生长期细胞生长的快慢。

对数期 μ为常数 ,初始条件 : t0=0, t; x0, x, 积分得：

6.87*1010

影响 μ 的因素 细胞的种类，

培养条件（培养温度，限制性基质浓度， pH, 溶氧）

倍增时间 td ：当细胞群体增加一倍时，所需的时间。由公式

描绘营养物的浓度对微生物生长的影响： 1942 年， Monod 总结了经验方程

微生物 td: 0.5-5 h

动物细胞 td:15-100 h

植物细胞 td: 24-74 htd 和 μ 反映在对数生长期微生物的生长特性，

Monod 方程呈双曲线。µm 最大比生长速率， s: 限制性营养物质的浓度， Ks: 饱和常数，为比生长速度等于最大值的一半时的底物浓度。其值大，表示微生物对营养物质的吸收亲和力小，反之，就越大。

＃当底物浓度很低时 , 即 a 段， S«Ks, 从 Monod 式中得

＃ b 段为适合 Monod 方程段，

＃ c 段为 S»Ks ，由于底物浓度过高导致的底物抑制或代谢产物产生抑制，不符合 Monod 方程，对于前者，有下列公式描述：

营养物质的抑制，如 G

代谢产物产生的抑制，如乙醇

＃当底物浓度很高时且无抑制现象发生 , 即 d 段， S » Ks, 从 Monod 式中得

例：在 5 m3 培养液中，按 5% 接种量接种，已知原接种液中含菌 5×106 （个 / 毫升），如果培养后发酵液中的菌体含量需达 4×109 （个 / 毫升），求所需培养时间。假定在整个培养时间，均满足 s »Ks 的条件，已知 μmax=0.8 h-1

解：

因为 s »Ks ，故

①

所以①积分得 ②

依题意

于是

● 稳定期 (stationary phase)

由于营养物的消耗和代谢产物的积累，是微生物的生长速度下降直至停止。从而进入静止期。此时细胞浓度值为最大。若生长速率的下降是由于营养物质的消耗造成的，假设接种细胞后立即进入指数生长期且一直保持到静止期

刚接入菌时，底物浓度为 S, 刚进入稳定期时 S=0

式中 : KS 是常数， X ：细胞浓度， S 为限制性营养物质的浓度

ⅰⅱ

单纯由于营养物质的耗竭造成的生长速率的下降可以通过提高营养物质的初始浓度来推迟稳定期的出现

● 衰亡期 (death phase/decline phase)

由于环境的恶化，培养液中的细胞开始死亡。，在微生物的培养过程中，对衰亡期的研究一般较少。主要由于大多数分批培养的发酵生产，均是在衰亡期开始之前就已经停止操作，它的研究对生产价值不大，。

衰亡期的生物群体遵循指数规律衰减即：

式中 Xm ：最大生物群体浓度； a ：微生物的比生长速率。X: 死亡细胞的浓度。

◆分批培养时微生物细胞的生长与产物形成的动力学

培养基中的营养物质被微生物细胞所利用

生成细胞：细胞得率系数 生成代谢产物：产物得率系数

消耗一克营养物质生成的细胞的克数或生成的产物的克数

工业上，一段时间的平均值，获得为表观得率系数

● 按产物的生成与营养物质的利用之间的关系可将发酵分为三种类型

●按产物的生成与微生物生长关系的动力学模式分为三种类型

(a): 相关联型，产物的形成速度与细胞的比生长速度成正比，因此要提高产物的形成速度就应当努力获得高的细胞的比生长速度

(b) ：复合模式：取决于有关联和无关联的两种形式。

(c) 无关联模式：产物的形成速度与生长速度无关联，而只与细胞的浓度有关。

6.1.2 连续培养

基本操作模型如图所示。物料连续地以体积流量 F 流入反应器，并以同样流量流出。流入物流中基质浓度为 S0 ，菌

浓度为 Xo ， Xo 一般为 0 ，反应器内有很好的混合，即各点浓度一样，

特点：流出物流的浓度与反应器内相同，而且加入的物流一进入反应器立即与反应器内物料均匀混合。

在分批培养过程中，既使提高营养物质的初始浓度，或者采用有些措施中和稀释代谢毒物， 但指数生长期迟早有结束，稳定期也终将出现。就这一问题的彻底解决， Monod首先提出了此培养方式。此培养方式为稳态过程。

Depletion of nutrients

Lack of oxygenChange in pHGrowth

inhibition from metabolic end products

Why do Cells Stop Growing?

◆简单连续培养

● 微生物的物料衡算

( 细胞进入 )-( 细胞流出 )+( 细胞生长 )-( 细胞死亡 )=( 细胞积累速率 )

在稳态操作情况下可以假设：

（ 1 ） x0=0 ，即入口仅加入基质（ S0 ）；

（ 2 ）反应器无积累， dx/dt=0,ds/dt=0 ；

（ 3 ）菌体死亡速率远较生长速率低， α<<μ ，

由上式可以得到D （稀释率）

从上述推导中，连续培养的稳定条件为

假设细胞生长符合 monod方程，于是：

所以，连续培养只要控制 D ，即改变培养基的供给量 F ，就可以控制 μ 在任意可调水平，而 μ 是微生物的特性参数，在分批培养过程中，是一个无法控制的参数，而在连续培养过程中，通过控制操作状态参数 D 来调控 μ ，因而称此类反应器为外控式的微生物反应器

● 限制性营养物的物料衡算

( 细胞进入 )-( 细胞流出 )-( 消耗于菌体合成 )=( 营养物的积累速率 )

● X,S 与 D 之间的关系

○ S 与 D 之间的关系：连续培养过程中，

∵

∴

又因

∴

○ x, S 与 D 之间的关系：

● 冲溃现象 (washout)

在稳态操作条件下，当 D 大到某一值时，使 x=0 的现象。

原因：由于 D 值增大，使培养基在罐内的停留时间太短，导致微生物繁殖的机会减少。

发生冲溃现象的稀释率 Dw

Dw 是生产中稀释率的使用极限，生产中的 Dp 应小于 Dw

S ， x 与细胞产率 P 和 D 之间的关系

①当 D趋向于 0 ，则 S趋向于 0 ， X 最大，为 YS0 。

②当 D«µm, µm-D≈ µm,该阶段随着 D 增大， S 线性增大，而X 线性下降。

③当 D趋向于 µm, S急剧增加， X则以相同的函数急减。

④当 D趋向于 Dw 时，冲溃的发生。

● 细胞的最大产量若生产的目的是细胞本身，如单细胞蛋白，得到最大细胞产量是人们所希望的。

在连续培养系统中，在单位体积的发酵罐内的细胞产量 P

当 dP/dD=0 时 , 细胞产量 P 为最大值

例题：设 µm=1.0 (h-1),Y=0.5,Ks=0.2(g/L),S0=10(g/L), 若D=0.5(h-1), 求 µ,s 和 x, 并计算 Dw, DM 和 PM

)/(9.4)2.010(5.00 LgSSYx )(5.0 1 hD

分批培养与连续培养的产量比较

0

0

2

1

02

0

0

0

1

1

)]([

)(,

1,0

SK

KD

SK

KSKKsKSY

DD

KsSY

SSYxxDP

x

xnt

Ltt

xmx

P

s

smM

s

smss

Mm

M

MMMMCM

m

mBM

Lmm

BM

CM

ss

Lmmss

BM

CM

tx

xn

P

P

S

KSKS

tx

xn

S

KSKS

P

P

0

00

0

0

21

0

21

0

0

0,1

连续培养的细胞产量高于分批培养，同时产品质量和产量稳定，但其对生产管理要求严格，以及菌种的退化和污染问题是限制其广泛应用的因素

◆具有细胞循环的单级连续培养

将流出液中的细胞通过沉降或离心的方法加以浓缩，送回反应器中循环使用。

*对反应器，对细胞物料衡算

dt

dxxx

V

Fcx

V

Fx

V

F 11110

1

在稳态条件下，培养基 x0=0, 及 D=F/V,

则上式可写成 μ=[1-α(c-1)]D

其中， c >1 ，为浓缩因子， α >0 ，为循环比，所以[1-α(c-1)] 小于 1 ， μ 小于 D, 具有细胞循环的连续反应器， μ取决于 D,c 和 α 。

* 对限制性营养物质作衡算

)1(1

)(

1

001

10

cSSY

SSYD

x

dt

dS

Y

xS

VF

SV

FS

V

F

*x, s D 之间的关系

μ=[1-α(c-1)]D

0

0

01

11

1

11

11

11

1111

)1(1

SK

S

cD

cD

cDKS

c

Yx

cDcD

KS

DcSK

S

s

mw

ms

ms

s

m

由此可见，具有细胞循环的简单连续系统比无循环系统提高了生产能力，而且提高了系统的稳定性，反应器可在高于细胞比生长速率的稀释率下操作，广泛用于废水的生化处理。

◆多级连续培养

前一反应器的出料为后一反应器的进料 / 部分进料。此操作方式可以解决不同生产阶段有不同生产要求的矛盾，同时解决快速生长和营养物质充分利用之间的矛盾。

对于代谢产物如青霉素，其菌体生长的最佳温度为 30°C, 而产青霉素的最佳生产温度为 20°C ，在单级反应中无法兼顾，而采用双罐联续培养，可以解决了上述问题。

在单级培养中，从发酵罐中排出的料液所含的营养物的浓度必须足够低， Monod 方程可知， s 低，会导致 μ减小。采用多级罐串联使问题解决。

对第一个罐物料衡算 D1= μ1

2112

101

22

1121

2

122

,

1,1

,

)1(

SSYxx

SSYx

DD

xx

D

对第二个罐物料衡算

二个罐物料停留的总时间

对第一 /二个罐细胞浓度，

单罐时底物浓度与双罐时的第二个罐内浓度相同，因而有 μ=μ2

已知 μ=0.5 （ min-1),Ks=0.3(g/L),S0=50(g/L),S1=5(g/L), S2=0.2(g/L), 求采用单、双级连续反应器的所需的时间τ

对于单罐， μ=D, τ=1/D,采用单罐时 S=S2,

52.0

11

2.02.03.0

2.05.0

D

SKS

s

m

对于双罐， μ1=D1, τ1=1/D1, 应用Monod 方程，解出： μ1

等于 0.47 ， μ2 为 0.2

904.0/

8.49

45

/111

)(13.247.0

111

21

1212

101

2122

2

1

111

xx

YxSSYx

YSSYx

xxD

hD

解得： τ2=0.48 (h)

τ1=2.13, 总时间τ=2.61 （ h)

τs=1/μs=5 (h)

6.1.3 分批补料培养法

又称流加。介于分批与连续培养之间的一种模式。由Yoshide1973提出。

此模式进料连续或按一定的规律，出料则在一定的时间排除部分料液。为不稳定的过程。

◆分批补料的计算

Yx

SK

S

V

FSS

dt

dS

xSK

Sx

VF

dtdx

xVVdt

dxx

dt

dV

dt

Vxd

Fdt

dV

VrFSVSd

VrFxdt

Vxd

s

m

s

m

s

x

0

0

0

消除快速利用碳源后，造成的阻遏效应，维持罐内良好的需氧发酵条件。

避免培养基中某些成分的毒害作用。生产酵母培养基中含有麦芽汁过多，开始导致细胞的过速增长，同时细胞对氧气的需求大于设备提供的能力，是培养系统成为厌氧条件，是酵母产生乙醇，导致抑制细胞的生长，成为阻遏效应。

同理，面包酵母如果添加葡萄糖超过某一值时，也会产生此效应。青霉菌发酵生产青霉素，要求精确的控制葡萄糖的补入速率。生长期是葡萄糖的含量适宜。而在生产期控制补料速率，使青霉素的合成速率达到高值。

另一方面，产物前提物的添加，有利于产量的提高，担当此物质对细胞的生长有毒害作用使，应采用缓慢的加料方式，如苯乙酸钠。

Laboratory process developmentShake Flask Experiments

Optimization of conditions for cell growth and product formation using shake flask experiments:

1. pH2. Temperature3. Dissolved oxygen (DO)4. Substrate choice5. Maximal and optimal substrate concentration6. Others