实验一 微藻的培养基配制

一、实验目：

掌握微藻的培养基配制方法。

以海水单胞藻培养液通用配方“ f/2” 为例

二、实验原理

藻类的培养液必须具备藻类的生长繁殖所需要的各种营养元

素，并且营养盐的比例应该符合藻类生长繁殖的需要。不同种

类的微藻对营养盐的质和量的需求不同，各有其特殊性，因此，

制定某种微藻的一个培养液配方时，首先必须进行一系列的试

验，了解这该种藻类对营养的要求，并在使用中验证配方的效

果，加以改进，使配方达到更理想的水平。藻类对营养盐的需

求也有很多共同点，因而一些培养液配方（如 F/2 ）可应用于多

种藻类的培养。

进行微藻培养时，可根据培养藻类对营养的要求，选用合适

的配方，在消毒水中按配方加入各种营养物质配成。所加肥料

应保持清洁，某些不清洁肥料必须消毒，预防敌害生物通过肥

料污染。

绿藻培养液配方：

① 海洋三号扁藻培养液（海洋研究所， 1960 ）：

NaNO3 0.1g 2Na3C6H5O7 11H2O 0.02g﹒

K2HPO4 0.01g

Fe(SO4)3(1% 溶液 ) 10 滴 海水 1000ml

② 亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）：

NaNO3 0.05g 维生素 B12 200mμg

KH2PO4(1% 溶液 ) 0.005g 人尿 2ml

FeC6H5O7 0.2ml

维生素 B1 200μg 海水 1000ml

培养亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能

加入海泥抽出液 20ml ，效果更好。

硅藻培养液配方：

① 艾伦 - 内尔森（ Allen-Nelson ）培养液 {Allen ， E.J.et al （ 1910 ） } ：

A. KNO3 20.2g 纯水 100ml

B. Na2HPO4.12H2O 4.0g CaCl.6H2O 4.0g

HCl （浓） 2.0ml 纯水 80ml

FeCl3 （溶液） 2.0ml

B 液的配制法：先把氧化钙 4g 溶解于 40ml 纯水中。另外把磷酸氢二钙 4g

溶解于 40ml 纯水中，再把三氯化铁溶融液 2ml ，缓慢滴入，摇动，产生白

色沉淀，加热，缓慢滴入浓盐酸 2ml ，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以

上两溶液混合。

使用时，取 A 液 2ml 和 B 液 1ml ，加入 1000ml 海水中，充分混合后加热

消毒，消毒后静置 24h ，然后将上层清夜倒出使用。

培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻

烦，固体的营养元素一般都配成母液（如浓缩 1000 倍的母

液），在使用时，只要吸取一定的量加入培养液中即成。主

要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，

每组 2 种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长

有机物质也多种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一

般生物因不能忍受而死亡。

三、实验材料及用具

1 、器材

电炉；灭菌锅； pH计

500ml 试剂瓶（每组 5 个）；

玻棒、 500ml烧杯、 50ml容量瓶（每组一个） /牛皮纸、细绵绳

2 、试剂：

蒸馏水、海水

各种试剂

NaNO3; NaH2PO4 ； FeCl3 EDTA ； Na2SiO3.9H2O ；盐酸硫铵素

(VB1) ； Biotin VH

三、实验步骤

（一） F/2 (+ Si) 培养基母液的配制（用去离子水配制）

1.A 液 500 ml 1000 倍

NaNO3 37.5 g; NaH2PO4 2.5 g

2.B 液 500 ml 1000 倍

Fe-EDTA 2.5 g (FeCl3 1.6 g + EDTA 0.9 g)

3.C 液 500 ml 1000 倍

Na2SiO3.9H2O 10 g

4.D 液 500 ml 1000 倍

盐酸硫铵素 (VB1) 5 mg ( 试剂 50 mg/ml 取 100 μl)

Biotin VH 0.025 mg ( 试剂 0.1 mg/ml 取 250 μl)

VB12 0.025 mg ( 试剂 0.25 mg/ml 取 100 μl)

先用维生素分别用纯水溶解混合，稀 HCl 将 pH调到 4.5~5.0 ，最后用纯

水稀释至 1升。膜过滤后冰冻保存。

5.E 液 500 ml 1000 倍

CuSO4.5H2O 0.0098 mg ； ZnSO4.7H2O 0.022 mg

CaCl2.6H2O 0.01 mg ； MgCl2.4H2O 0.180 mg

Na2MoO4.2H2O 0.0063 mg

A 、 B 、 D 、 E高压灭菌备用

（三） F/2 培养基配制

1000 ml (1升 ) F/2 (+ Si) 培养基 = 1000 ml (1升 ) 过滤灭菌海水 + 1m

l A 液 + 1ml B 液 + 1ml D 液 + 1ml E 液 (+ 1ml C 液 )

注意：煮沸的海水放置凉后（ 50度以下）再加母液，否则会出现沉淀。

（二）海水处理

沉淀 —— 砂池过滤 ——（抽滤）——灭菌（海水放于三角瓶

中，置于电炉上煮沸，可杀来一般细菌）

实验二 单细胞藻类的培养

一、实验目的掌握单细胞微藻的实验室培养 ( 藻种培养 ) 方法，细胞生长曲线观察。

二、实验材料及用具1 、实验材料：小球藻（ 500ml ）、等鞭金藻、扁藻2 、实验仪器：可见分光光度计、显微镜（ 1部 / 组）、血球计数板（一

个 / 组）、电炉、灭菌锅、 pH计、 500ml烧杯（ 1 个 / 组）、胶头滴管（ 3支 / 组）、 250ml锥形瓶（每组 3 个）、牛皮纸、细绵绳

3 、试剂：蒸馏水、海水、碘化钾

三、实验步骤

1 、培养基配制：见实验一

2 、接种：一般培养的接种量为 1/3～ 1/5.

3 、计数：分光光度计测定 500nm （ OD500 ）和 750nm

（ OD750 ）吸光值；细胞计数板计数。

4 、每天测定一次，分别绘制以 OD值和细胞绝对数目为纵坐

标、时间为横坐标的生长曲线，分析细胞数目与 OD500 和

OD750 的相关性。

5 、观察并描述微藻不同生长时期的特点

小球藻

扁藻 球等鞭金藻

1 、血球计数板计数方法：

（ 1 ） 搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行

搅拌，搅拌后立即取样。

（ 2 ）固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计

数困难，需把水样稀释到适宜的程度。（附：鲁哥氏液（ Lugol‘s Solution ）又

称碘液，常用的配方是：将 6克的碘化钾溶于 20毫升水中，待完全溶解后加入 4克碘，

摇荡，待碘完全溶解后，加入 80毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。）

（ 3 ） 计数板与盖玻片洗净擦干——盖好盖玻片——摇荡藻液——吸取藻液

（干的微吸管）——迅速加样—— 1 分钟后低倍镜下计数－计数任何对角两

大格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为 0.1立方毫米的空间），然后取

其平均值。每个样品须重复计数两次。

1毫升水体藻细胞＝计算平均值 ×10,000× 藻稀释倍数

2 、分光光度计定量法

比色皿用 75％酒精消毒后，将藻液摇匀，倒入 2/3 体积，在两个波长下测定吸光度值。注意分光光度计测定前要调零和调满度。

作业 :

1 、分别绘制以 OD值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生

长曲线 ( 三张图 ) ，分析细胞数目与 OD500 和 OD750 的相关性

（两次相关性），比较哪个波长下的密度值更能代表藻细胞数目。

5 、观察并描述微藻不同生长时期的特点。

实验三

藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察

一、实验目的

掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿素

的吸收光谱。

叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素含

量，可用来初步估量浮游植物的光合作用能力，并进行估量水域初级生

产力。也适用于评价实验室单种生长状况。

二、实验材料及用具

1、实验材料：海带、 裙带菜、紫菜、小球藻、球等鞭金藻等 ,选 4种

藻

2、实验仪器：紫外分光光度计 (208实验室 )

3、实验器材：研钵（每组一套）、 15ml 离心管（每组 4支 - 依藻种类

定）、 15ml 刻度试管（每组 4支）、 0.45m的滤膜（每组 3个），

抽滤装置，离心机（或用 20ml 针管和滤膜器）

4、试剂：丙酮（分析纯）、MgCO3

三、实验步骤

1 、抽滤：

减压过滤 5ml 的藻类培养液到玻璃纤维滤片上，约加 0.1g MgCO3

细粉，使均匀覆盖于薄膜上，倒入水样抽滤，注意避免高温、强光及压力

过高，水滤完后，应继续抽气数分钟，以尽量吸尽滤膜上水分。

2 、储存：将折膜放入样品储存装置中，置黑暗、干燥、低温处保存。

3 、研磨和提取：

把滤膜放到一个组织研磨管内的底部，加入 2－ 3ml 的

90％丙酮，把杵插入管内，研磨，在弱光下将滤得的试样研磨 1 到 2min ，

再用 5ml 的 90％丙酮把杵上和研磨管内的东西洗入 15ml 的有螺旋盖

的离心管内，静置于暗处 10min ，使色素充分被提取。（观察叶绿素

荧光）

4 、离心：（ 2000g ） 5min ，离心，

5 、测定：

将上清液用 90％丙酮定容 25ml ，在分光光度计上，用 1cm 的比色皿

分别读取 750nm 、 663nm 、 645nm 、 630nm波长的吸光度，并

以 90％的丙酮作校正吸光度测定。

6 、计算：分别从 663 、 645 、 630nm 时的光密度值，减去 750nm

时的光密度值，再除以液槽光程（厘米），即为 D663 、 D645 、 D

630 的值。下式计算叶绿素在 90％丙酮中的含量。

联合国教科文组织国际工作组推荐公式

Chla （ mg/ml ） =11.64*D663-2.16*D645+0.1D630

Chlb （ mg/ml ） =3.94*D663+20.97*D645-3.66D630

Chla （ mg/ml ） =5.53*D663-14.81*D645+54.22D630

7、叶绿素吸收光谱的测定：将提取的叶绿素放于 (石英 )比色皿中，

用紫外分光光度计测定 400nm-750nm波段的吸收光谱。

三、作业：

1、计算几种藻类的叶绿素含量

2、比较并说明不同藻类的叶绿素吸收光谱有何异同，并分析原因

实验四 微藻的分离方法

---微吸管分离法

一、实验目的

1 、单胞藻类的培养，首先需要有藻种。原始的藻种是从天然水域混杂

的生物群中，运用一定的方法，把所需要的个体，分离出来，而获得单

种培养。

2 、若藻种受敌害生物及其他杂藻的污染也要通过分离进行纯化。

本实验的目的是使学生了解单胞藻的分离方法，掌握单细胞藻类的微吸

管法分离技术。

二、实验材料及用具

1、实验材料：扁藻，球等鞭金藻或小球藻

2、实验仪器：显微镜

3、实验器材：细玻璃管或毛细管；载玻片；小试管；脱脂棉；纱布；酒

精灯

4、试剂：灭菌海水； F/2培海水养基

三、实验步骤

1 、采样 ：水样可取自天然水域、养殖池、湖泊、溪流及特殊水域环境等。

此外，培养水生生物的或储水的各种容器、水池，均可能生长大量浮游

或附着藻类，也是采样的理想场所。

2 、拉制微吸管：选直径 5毫米的细玻璃管，或者其它任何适合拉成毛细管

的巴氏滴管，用镊子夹住滴管的前端，放在酒精喷灯的外焰上，直到玻

璃变软，迅速移离火焰，同时快速拉成毛细管。

4 、将装有藻细胞的试管置于适宜的条件下培养。

三、实验步骤

3 、分离：镜检待分离的藻液，调藻液浓度为 5-6 个藻细胞为宜，在已灭菌

的载玻片上滴加 6 滴消毒培养液，另取一载玻片滴一滴稀释的待分离藻

液，在显微镜下用微吸管吸取所需的藻细胞，放在第一滴消毒水中，清

洗，再用微吸管吸取所需的藻细胞放在备有培养液的试管中。

实验五 微藻的分离方法

---平板分离法

一、目的：

学生掌握平板分离单藻种的方法。

适用于能在固体培养基上生长的种类。

二、 实验材料：

F/2 海水培养基；琼脂糖； 玻璃棒；培养皿（每个同

学一副）；干燥箱、高压灭菌锅、电炉；封口膜

三、 实验步骤：

1 、平板培养基的制备：该培养基的制备包括调配、融化、分装、灭菌四

个步骤。

调配：按分离种类的需要选用合适的营养盐配方配成培养液，加 1%琼

胶（又称冻粉），琼胶剪成细片，加入培养液中浸泡 12 小时。

融化：把培养液加热，不断搅拌，使琼胶完全融化。在加热过程中，水

分要蒸发不少，在加热完毕应以淡水补充蒸发掉的水分。

分装：稍冷后即分装于培养皿中，装的厚度依培养皿大小而定，在 0.3-0.

5厘米之间。

三、 实验步骤：

2 、平板分离方法：经灭菌的固体培养基冷却后，培养基凝固成固体状态，

即可进行分离。（显微观察待分离的藻液并调节藻液浓度为 1000-5000 个 /毫

升）

划线法：把一个金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，蘸取需要分离的藻液

轻轻地在平板上划折线。

喷雾法：将需要分离的藻液稀释，装入经消毒过的小型喷雾器中，打开培

养皿盖，把藻液喷射在培养皿表面形成分布均匀的一薄层水珠。

涂布法：滴 1-2 滴自然采集物于琼脂的边缘。用一弯玻璃棒（将棒浸入 70

%酒精溶液，放在火焰上点燃并移离火焰；重复几次。）在无菌条件下将

滴在琼脂上的自然采集物滴平涂在琼脂表面上。

3 、将待分离的藻液喷在固体培养基上，然后盖好，放在光亮处培养。

实验六 褐藻胶的提取