食品中致病菌的检测技术

食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术

第八章

食品中致病菌的检测技术

第一节食品中肠道致病菌的检测

第二节食品中致病性球菌的检测

第三节其他致病菌检验


第一节食品中肠道致病菌的检测一、沙门氏菌的检验（一）概述沙门氏菌（ Salmonella ）广泛分布于自然界，是对人类和动物的重要致病菌。因为多种动物肠道带菌率很高，可由不同方式污染食品，引起食物中毒暴发。在各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌食物中毒屡占首位。沙门氏菌为需氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，有动力，在周生鞭毛（但有无动力的变种），能在普通培养基上生长良好，最适生长温度为 37℃ ，最适 pH 值为 7.2 ～ 7.6 ，在固体培养基上 37℃,24h 菌落可呈中等大小，光滑，圆形，湿润，隆起，在液体培养基内生长均匀混浊。


在检品中，沙门氏菌含量较少或食品加工过程中使其受到损伤而处于濒死的状态时，为了能够分离出沙门氏菌，需要选用增菌培养的办法，如冻冷食品和加工食品必须经过前增菌，使检品中的沙门氏菌恢复其活力，对未经加工的新鲜食品，不必进行前增菌，可用选择性增菌培养，使沙门氏菌得以增殖，而使大多数的其他细菌受到抑制，再进行分离，可以提高沙门氏菌的检出率。沙门氏菌的型别种类繁多，现已达 2000 余种，根据该菌的特征，其检验及鉴定方法需经较为繁杂的手段才能确切的识别，一般分为前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定、血清学分型五个步骤。


（二）检测方法 1 ．前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取检样 25g（mL），加在装有 225mL 缓冲蛋白胨水的 500mL 广口瓶内。固体食品可先应用均质器以 8000r/min ～ l0000r/min 打碎 lmin ，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于 36℃±l℃培养 4h （干蛋品培养 l8～ 24h），移取 l0mL ，转种于100mL 氯化镁孔雀绿增菌液（ MM ）或四硫磺酸钠煌绿（ TTB ）增菌液内，于 42℃ 培养 l8～ 24h 。同时，另取l0mL ，转种于 l00mL亚硒酸盐胱氨酸（ SC ）增菌液内，于 36℃±l℃ 培养 l8h～ 24h 。

食品中致病菌的检测技术　鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取 25 g（ 25mL ）加入灭菌生理盐水 25mL ，按前法做成检样匀液；取 25mL ，接种于 100mL氯化镁孔雀绿（ MM ）增菌液或四硫磺酸钠煌绿（ TTB ）增菌液内，于 42℃ 培养 24h ；另取 25mL接种于 100mL亚硒酸盐胱氨酸（ SC ）增菌液内，于 36℃±l℃ 培养 18 ～ 24h。 2 ．分离　　取增菌液 1 环，划线接种于一个亚硫酸铋（ BS ）琼脂平板和一个 DHL琼脂平板（或 HE琼脂平板、 WS或 SS琼脂平板）。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于 36℃±l℃ 分别培养 18 ～ 24h（ DHL、 HE、WS、 SS ）或40 ～ 48h（ BS），观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表 8-l 。


食品中致病菌的检测技术 3 ．生化试验（ 1）自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。一般应多挑几个菌落，以防遗漏。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表 8-2 。

表 8-2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢（ H ２ S ）阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。因此都需要做几项最低限度的生化试验。必要时做图片染色镜检应为革兰氏阴性短杆菌，做氧化酶试验应为阴性。

食品中致病菌的检测技术（ 2 ）在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胰水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（ pH7.2）、氰化钾（ KCN ）培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于 36℃±l℃ 培养 l8～ 24h ，必要时可延长至 48h ，按表 8-3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于 Al、 A2和 B1 ，其他 5 种反应结果均可以排除。


① 反应序号 A1 典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸三项中有一项异常，按表 8-4 可判定为沙门氏菌。如有两项异常，则按 A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。

② 反应序号 A2 补做甘露醇和山梨醇试验，按表 8-5判定结果。


③ 反应序号 Bl 补做 ONPG 。若 ONPG（＋），为大肠埃希氏菌，若 ONPG（－），为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸（＋），但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸（－）。 ④ 必要时可按表 8-6 进行沙门氏菌生化群的鉴别。


4 ．血清学分型鉴定一般采用 1.5%琼脂斜面培养物做玻片凝集试验。 O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如 2.5%～ 3%）培养基上再检查；如果是由于 Vi抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 lmL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。 H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.7%～ 0.8%半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有 03%～ 0.4%半固体琼脂的小玻管 l 次～ 2次，自远端取菌培养后再检查。


（ 1） O 抗原的鉴定首先用 A～ F多价Ｏ血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照，在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。凡 A～ F多价Ｏ血清呈现凝集者，可依次用Ｏ因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定Ｏ群。如不被 A～ F多价Ｏ血清凝集者，可用 57 种或 163 种沙门氏菌因子血清中的 7 种多价血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。如果是由于 Vi抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可将菌苔用生理盐水作成浓菌液煮沸后再检查。


（ 2） H 抗原的鉴定根据所确定的 O 群，依次用 H因子血清检查 1相和 2相的 H 抗原，对不常见的菌型，可先用多价 H血清检查，如其中某种多价血清凝集时，则再用此血清所包括的 H因子血清逐一检查，以确定第 1 相和第2相的 H 抗原，如无单因子血清时，要用两个 H复合因子血清核对其检查地结果。如仅检出第 1 相或第 2相时，可在琼脂斜面上移种 1～ 2代后再检查，若仍为一相，要用位相变异的方法检查其另一相H抗原。


常用的位相变异试验方法如下：小玻管法：将半固体管（每管 1～ 2mL ）在酒精灯上溶化并冷却至 50℃ ，取已知相的 H 因子血清 0.05 ～ 0.1 mL ，加入已溶化的半固体内，混匀后，用毛细管吸取分装于供位相变异试验的小玻璃管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按血清 1:200 ～ 1:800 的量加入。于 37℃ 培养后再做凝集试验。


小倒管法：将两端开口的小玻璃管（下端开口要留一个缺口。不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时将琼脂在酒精灯上加热溶化，冷至 50℃ ，挑取已知 H因子血清 l 环，加人小套管中的半固体内，略加搅拌，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后 , 可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种l%软琼脂斜面，于 37℃ 培养后再做凝集试验。


简易平板法：将 0.7%～ 0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清 1 环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。（ 3） Vi抗原的鉴定用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi

抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。 5 ．菌型的判定和结果报告综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。


二、志贺氏菌的检验（一）概述志贺氏菌（ Shigella ）是人类重要的肠道致病菌之一，食物源性的痢疾爆发（即志贺氏菌食物中毒），主要是食用了被污染该菌的食品和水所致。志贺氏菌为需氧性革兰氏阴性无芽胞杆菌，在普通培养基上易于生长，最适 pH 为 6.4 ～ 7.8 ，最适温度为 37℃ ，于 10 ～ 40℃ 均能繁殖，在选择性或鉴别培养基上为无色，半透明，微凸起，光滑，湿润，边缘整齐，直径约 2mm 大小的菌落，但宋内氏志贺氏菌常出现 R 形菌落。在液体培养基中呈均匀混浊，无鞭毛，无动力。


志贺氏菌因在食品中的存活期较短，当样品采集后应尽快进行检验，如不能立即检查时，可将标本放入冰箱保存。对该菌的检验至今还没有很好的增菌方法，一般采用 GN 增菌液，缩短增菌时间， 6 ～ 8h 增菌液内细菌轻微生长，即可接种鉴别平板，以免时间较长，其他肠道非致病细菌生长过多而影响志贺氏菌的分离。用于分离鉴别的培养基，一般不少于两个，采用中等选择性的 HE或 SS琼脂平板和弱选择性的麦康凯或 EMB琼脂平板，以利于志贺氏菌的阳性检出率。


志贺氏菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸、不产气（福氏志贺菌 6 型可微产气），斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内沿穿刺线生长。不发酵水杨苷和侧金盏花醇，不分解尿素，在西蒙氏柠檬酸盐培养基上不生长， V-P 为阴性，不发酵乳糖（宋内氏志贺氏菌可迟缓发酵），不能使赖氨酸脱羧，宋内氏菌和鲍氏 B型可使鸟氨酸脱梭，其他均为阴性。检验方法一般分为增菌、分离、生化试验及血清学鉴定。


（二）检测方法 1 ．增菌以无菌操作取检样 25g（mL），加入装有 225mLGN增菌液的 500 mL 广口瓶内，固体食品用均质器以 8000r/min ～l0000r/min 打碎 lmin ，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。于 36℃ 培养 6 ～8h 。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 2 ．分离和初步生化试验（ 1）取增菌液 1 环，划线接种于 HE琼脂平板或 SS琼脂平板一个；另取 l 环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板一个，于 36℃ 培养 18 ～ 24h ，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。


（ 2 ）挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各一管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经 36℃培养 18 ～ 24h ，分别观察结果。（ 3 ）下述培养物可以弃去： ① 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； ② 在 18h～ 24h 内发酵乳糖、蔗糖的培养物； ③ 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物； ④ 产气的培养物； ⑤ 有动力的培养物； ⑥ 产生硫化氢的培养物。

食品中致病菌的检测技术（ 4 ）凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌 6 型可产生少量气体），无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。 3 ．血清学分型和进一步的生化试验（ 1）血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果由于 K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用Al、 A2、 B群多价和 D 群血清分别试验。如系 B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表 8-7 。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。


4 种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价 1、 2 、 3 分别检查，并进一步用 1～ 15 各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌 3 ～ 12 型多价血清及各型因子血清检查。


（ 2 ）进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶， pH7.2尿素，氰化钾（ KCN ）生长，以及水杨苷和七叶甘的分解。除宋内氏菌和鲍氏 13 型为鸟氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。


已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做 5%乳糖发酵，甘露醇、棉籽糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏 6 型的生化特性与 A 群或 C 群相似，见表 8-8 。

（三）结果报告

综合以上生化和血清学的试验结果，判定菌型并作出报告。

食品中致病菌的检测技术三、致泻大肠埃希氏菌的检验（一）概述大肠埃希氏菌作为正常菌群而存在于人和动物肠道中，并广泛存在于自然界。大肠埃希氏菌的某些菌株对人有致病性。人和动物的带菌是传播本菌引起食物中毒的重要原因。致泻大肠埃希氏菌（ Escherichia coli），简称致病性大肠菌。根据其致病机制可分为 4 个类型。肠道致病性大肠菌（ Enteropathogenic E.coli， EPEC），肠道侵袭性大肠菌（ Ente roinvasive E·coli， EIEC），产肠毒素大肠菌（ Enterotoxigenic E·coli， ETEC），肠道出血性大肠菌（ Enterohemorrhagic E.coli， EHEC）。 EPEC主要引起新生儿的腹泻。 EPEC、 ETEC 引起腹泻腹痛型胃肠炎。 EIEC 引起的胃肠炎酷似痢疾。 EHEC 引起出血性大肠炎。


（二）检测方法 1 ．增菌样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前预冷藏外，一般不冷藏。以无菌操作取检样 25g（mL），加在 225mL营养肉汤中，以均质器打碎 lmin 或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群 MPN 值，其余的移人 500mL 广口瓶内，于 36℃±l

℃ 培养 6h 。挑取 1 环，接种于 1 管 30mL 肠道菌增菌肉汤内，于 42℃ 培养 l8h。


2 ．分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于 36℃±l℃ 培养 18 ～ 24h ，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。 3 ．生化试验（ 1）自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（ TSI ）或克氏双糖铁琼脂（ KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体琼脂、 pH7.2尿素琼脂、 KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在 36℃ 培养过夜。

食品中致病菌的检测技术（ 2 ） TSI 斜面产酸或不产酸，底层产酸， H2S 阴性， KCN 阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。 TSI底层不产酸，或 H2S、 KCN 、尿素等试验中有任一项为阳性培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。 4 ．血清学试验（ 1）假定试验挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价 O 血清和出血性大肠埃希氏菌O157 血清做玻片凝集试验。当与某一种多价 O 血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价 O 血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的 O 抗原群见表 8-9。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。


（ 2 ）证实试验制备 O 抗原悬液，稀释至与 Mac Farland3号比浊管相当的浓度。原效价为 1:160 ～ 1:320的 O 血清，用 0.5%盐水稀释至 1:40 。稀释血清与抗原悬液在 l0mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于 50℃ 水浴锅内，经 l6h后观察结果。如出现凝集，可证实为该 O 抗原。


5 ．肠毒素试验产毒培养：将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于 0.6mLCAYE 培养基内， 37C 振荡培养过夜。加入 20000IU/mL 的多粘菌素 B0.05mL ，于 37℃l h ，以 4000r/min 离心 l5min ，分离上清液，加入 0.1 硫柳汞 0.05mL ，于 4℃保存待用。（ 1）酶联免疫吸附试验检测不耐热肠毒素 LT （双抗体夹心法）： ① 包被先在产肠毒素大肠埃希氏菌 LT和 ST酶标诊断试剂盒中取出包被用 LT抗体管，加入包被液 0.5mL ，混匀后全部吸出于 3.6mL包被液中混匀，以每孔 100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于 4℃冰箱湿盒中过夜。


② 洗板将板中溶液甩去，用洗涤液 I 洗三次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。 ③ 封闭每孔加 100μL 封闭液，于 37℃ 水浴中 l h。 ④ 洗板用洗涤液 II洗三次，操作同上。 ⑤ 加样本每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100μL， 37℃ 水浴中 l h。 ⑥ 洗板用洗涤液 II洗三次，操作同上。 ⑦ 加酶标抗体先在酶标 LT抗体管中加 0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于 3.6mL 稀释液中混匀，每孔加100μL， 37℃ 水浴中 1 h。

食品中致病菌的检测技术 ⑧ 洗板用洗涤液 II洗三次，操作同上。 ⑨ 酶底物反应每孔（包括第一孔）各加基质液 100μL ，室温下避光作用 5～ l0min ，加入终止液 50μL。 ⑩ 结果判定以酶标仪在波长 492nm下测定吸光度 OD值，待测标本 OD 值大于阴性对照 3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。（ 2 ）酶联免疫吸附试验检测耐热肠毒素 ST （抗原竞争法）： ① 包被先在包被用 ST抗原管中加 0.5mL包被液，混匀后全部吸出于 1.6mL包被液中混匀，以每孔 50μL加入于 40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，便液体布满孔底。第一孔留空作对照，置 4℃冰箱湿盒中过夜。


② 洗板用洗涤液 I 洗三次，操作同上。 ③ 封闭每孔加封闭液 l00μL， 37℃ 水浴 l h。 ④ 洗板用洗涤液 II洗三次，操作同上。 ⑤ 加样本及 ST单克隆抗体每孔分别加各试验菌株产毒培养液 50μL ，稀释的 ST单克隆抗体 50μL （先在 ST单克隆抗体管中加 0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于 1.6mL稀释液中，混匀备用）， 37℃ 水浴 l h。 ⑥ 洗板用洗涤液 II洗三次，操作同上。 ⑦ 加酶标记兔抗鼠 Ig 复合物先在酶标记兔抗鼠 Ig 复合物管中加 0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于 3.6mL稀释液中混匀，每孔加 100μL， 37℃ 水浴 l h。


⑧ 洗板用洗涤液 II洗三次，操作同上。 ⑨ 酶底物反应每孔（包括第一孔）各加基质液 100μL ，室温下避光 5～ l0min ，再加入终止液 50μL。

⑩ 结果判定以酶标仪在波长 492nm 下测定吸光度（ OD ）值，计算见下式：（阴性对照 OD 值－待测样本 OD 值） / 阴性对照 OD

值×100％≥ 50%为阳性目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。


（ 3 ）双向琼脂扩散试验检测 LT

将被检菌株按五点环形接种于 Elek 氏培养基上。以同样操作共做两份，于 36℃ 培养 48h 。在每株菌的菌苔上放多粘菌素 B 纸片，于 36℃ 经 5 ～ 6h ，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各 5mm 处的中央，挖一个直径 4mm

的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加 LT抗毒素 30μL 。用已知产 LT 和不产毒菌株作对照，于 36℃经l5～ 20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。


（ 4 ）乳鼠灌胃试验检测 ST

将被检菌株接种于 Honda 氏产毒肉汤内，于 36℃ 培养24h ，以 3000r/min 离心 30min ，取上清液经薄膜滤器过滤，加热 60℃30min ，每 lmL滤液内加入 2%伊文思蓝溶液 0.02mL 。将此滤液用塑料小管注人 l日～ 4日龄的乳鼠胃内 0.lmL ，同时接种 3 ～ 4只，禁食 3 ～ 4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部肠管，称量肠管（包括积液）重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于 0.09为阳性， 0.07 ～ 0.09为可疑。 6 ．结果报告综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。


第二节食品中致病性球菌的检测一、金黄色葡萄球菌的检验（一）概述葡萄球菌（ StapHylococcus ）是微球菌科的一个属，葡萄球菌属中根据近几年来的报导共有 20 多个种，其中金黄色葡萄球菌污染食物后，产生肠毒素可引起食物中毒，据报导金黄色葡萄球菌产生肠毒素的菌株约占 50%～ 70%。因此食品中检出金黄色葡萄球菌是食品卫生上的一种潜在危险。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，在血平板和 Baird-Parker 氏平板上生长典型菌落，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为 0.5 ～1μm 。血浆凝固酶试验阳性。


（二）检测方法 1 ．增菌培养法（ 1）检样处理按无菌操作取检样 25g（mL），加入225mL 灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。（ 2 ）增菌及分离培养吸取 5mL 上述混悬液，接种于 7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤 50mL 培养基内， 36℃± l℃ 培养 24h ，转种血平板和 Baird-Parker 氏平板， 36± l℃ 培养 24h ，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。


（ 3 ）培养特性在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在 Haird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为 2 ～ 3mm ，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。


（ 4 ）血浆凝固酶试验吸取 1:4 新鲜兔血浆 0.5mL ，放人小试管中，再加入培养 24h 的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物 0.5 mL ，振荡摇匀，置 36℃±l℃ 温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察 6h ，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及肉汤作为对照。兔血浆制备：以无菌手续从兔心脏采取兔血约 4 mL ，注入加有灭菌 1mL3.8%柠檬酸钠试管内，混匀。 4000r/mi

n离心 5min ，吸取上清液，即为兔血浆。

食品中致病菌的检测技术 2 ．直接计数方法（ 1）吸取上述 1:10 混悬液，进行 10倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液各 lmL ，分别加入三块 Baird-Parker 平板，每个平板接种量分别为0.3mL、 0.3mL、 0.4mL ，然后用灭菌 L棒涂布整个平板。如水分多不易吸收，可将平板放在 36℃±1℃1 h ，等水分蒸发后反转平皿置 36℃±l℃ 培养 24 h。（ 2 ）在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板， 36℃±l℃24h 培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。（ 3 ）菌落计数将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以 5 ，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。


二、溶血性链球菌检验（一）概述链球菌（ Streptococcus ）在自然界中分布较广，可存在于水、空气、尘埃、牛奶、粪便及人的鼻咽腔和肠道，常可引起皮肤和皮下组织的化脓性炎症及咽峡炎、扁桃体炎、肺炎等，也可引起猩红热、产褥热等急性感染，还可通过食品引起食物中毒。根据其抗原结构，族的特异性“ C”抗原的不同，可进行血清学分族。按其在血平板上的溶血情况可分为甲类溶血链球菌、乙类溶血链球菌、丙类溶血链球菌。与人类疾病有关的大多属于乙类溶血链球菌，其血清学分族为 A、 C、 G 族，其中 A 族占 90%。


溶血性链球菌为革兰氏阳性球菌，呈球形或卵圆形，直径 0.5～ lμm ，链状排列，链长短不一，短者 4 ～ 8 个细胞组成，长者 20 ～ 30 个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链。不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。在血平板上生长有细小菌落，有溶血作用，出现溶血环。乙类溶血链球菌呈完全溶血，甲类溶血链球菌在菌落周围的溶血环中残存红细胞。链激酶试验阳性。


（二）检测方法 1 ．检样处理按无菌操作称取食品检样 25g（mL），加入 225mL 灭菌生理盐水，研成匀浆，制成混悬液；液体检样可直接吸取。 2 ．一般培养将上述混悬液或液体检样 5mL ，接种于 50mL葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种于血平板。如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经 36℃±l℃ 培养 24h ，接种血平板，置 36℃±l℃ 培养 24h ，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。


3 ．培养特性该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。乙类溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约 0.5 ～0.75mm ，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有 2 ～ 4mm 界限分明、无色透明的溶血圈。 4 ．链激酶试验致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶（即溶纤维蛋白酶），此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。


吸取草酸钾血浆 0.2mL （草酸钾 0.01g ，加入 5 mL 人血混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾血浆），加 0.8mL 灭菌生理盐水，混匀，再加入 l8～ 24h、 36℃±℃培养的链球菌培养物 0.5mL 及 0.25% 氯化钙 0.25mL ，（如氯化钙已潮解，可适当加大至 0.3%～ 0.35%），振荡摇匀，置于 36℃±1℃ 水浴中每隔数分钟观察一次，一般约 l0min 血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动），血浆凝固后，再注意观察及记录溶化时间。溶化时间愈短，表示该菌产生链激酶愈多，含量多时， 20min 内凝固的血浆即完全溶解。


不溶解者仍放入水浴 24h后再观察，如凝块全部溶解为阳性，如 24h后仍不溶解即为阴性。 5 ．杆菌肽敏感试验挑取乙类溶血性链球菌浓菌液，涂布于血平板（肉浸液琼脂加入 5%脱纤维羊血）上，用灭菌镊子夹取每片含有 0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于 36℃±l℃ 培养 l8～ 24h ，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。


第三节其他致病菌检验一、副溶血性弧菌的检验（一）概述（二）检测方法 1．采样时应注意首先准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快迭检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。


2．分离培养以无菌操作取检样 25g（mL），加 225 mL3.5% 灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐菌选择性琼脂平板各一个，同时取10mL ，加入 l00mL 增菌液中，置 37℃,8～ l6h 培养后，涂上述平板进行分离。于 37℃ 培养 18 ～ 24h后取出观察。挑取上述可疑菌落，转种 3.5%氯化钠三糖铁斜面， 37℃ 、24h观察结果。 3．涂片镜检将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。


4．嗜盐性试验将上述可疑培养物分别接种于不同浓度的盐胨水（ 0% 、 3% 、 7% 、 10% ）中，于37℃ 、 24h 培养后观察生长情况，在无盐和 10%盐的胨水中不生长，在 3%和 7%盐的胨水中生长良好者进行下列有关试验。 5．生化试验分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、 V-P ，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放 37℃ 培养，除V-P 、靛基质、甲基红试验培养 48h后加试剂观察外，其他均可在 24h观察结果。具体内容见表 8-10 。


在 6．动物试验将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种 3.5%氯化钠胨水，经 37℃l6～ l8h 培养后，注射小鼠腹腔 0.3mL ，观察 2 ～3d ，有毒力者可在 5~10h 发病死亡，长者有 24h左右发病死亡。发病时有竖毛、运动不活泼，腹部紧贴罐底，呼吸困难，四肢抽搐、尾部痉挛震颤等症状。将死亡小鼠解剖后，取心血等内脏进行分离，可检时试验菌的纯培养。对照动物观察 2 ～ 3d无异常现象。但应注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时不易区别，需要上述系列的检验后，进行毒力证实，综合判定结果。

食品中致病菌的检测技术二、小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验（一）概述（二）检测方法 1 ．样品的采集和处理采取的样品以无菌操作放灭菌容器内，应立即送检，并注意冷藏，根据样品的种类分别进行处理，固体食品如肉类及其制品等，均需用均质器打碎或用乳钵研磨后再进行增菌培养。 2 ．增菌培养将食物样品与改良的磷酸盐缓冲液增菌液以 1:10 的比例混合，置 4℃冰箱进行冷增菌。经冷增菌培养后，分别在7d、 l4d、 2ld 时进行分离，可获得较好的检出效果。


3 ．碱处理将肉及其制品的冷增菌液 0.5mL ，与碱处理液 4.5mL 混合 15s。 4 ．分离培养将冷增菌液和碱处理的冷增菌液分别接种 CIN-I 和改良 Y培养基，于 26℃48h 培养后，在 CIN-I 上挑取红色牛眼状菌落，在改良 Y 培养基上挑取无色透明、不粘稠的菌落，进行进一步的鉴定（小肠结肠炎耶尔森氏菌在 CIN-l平板上生长菌落较大，扁平，有明显的边缘，中心为深红色，周围有半透明圆环的特征，成牛眼状菌落。在改良 y 琼脂平板上生长为无色透明、光滑、扁平、不粘稠的菌落）。


5 ．改良克氏双糖试验将上述可疑菌落接种到改良克氏双糖管中，于26℃ 、 24h 培养，将斜面和底部皆变黄者做进一步的生化鉴定。 6 ．尿素酶试验和动力观察将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上，注意接种量要大，挑取一接种环，振摇几秒钟，放置于 26℃ 培养 2 ～ 4h ，然后将阳性者接种两管半固体，分别放置26℃ 和 37℃恒温培养箱中，培养 24h 检查，如在 26℃ 有动力者，可进行镜检和进一步的生化试验。


7 ．染色镜检将上述可疑菌落做涂片染色，进行显微镜观察，呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为 0.8 ～3.0μm×0.8μm者做以下生化试验。 8 ．生化特性将上述可疑的菌落做下列主要生化试验与其他相似细菌进行鉴别： V-P试验、鸟氨酸脱羧酶试验，山梨醇、甘露醇、蔗糖、棉子糖、鼠李糖等发酵试验。所有以上生化反应皆在 26℃ 培养。


本菌主要生化特性以及与其他菌种的区别见表 8-11。

9 ．血清型鉴定

除进行生化鉴定外，亦可做血清型别鉴定。目前国内可生产 27种 O 型血清因子，供各地使用。具体操作方法与沙门氏菌 O 因子血清分型相同。


三、空肠弯曲菌的检验（一）概述空肠弯曲菌（ Campylobacter jejuni ）引起的食物中毒是一种以腹泻为主要症状的疾病。近十多年来研究证明，这种致病菌分布较广，可存在于牛、羊、猪、鸡、狗，猫等动物的肠道。污染肉、禽、蛋等食品，引起食物中毒。目前有些国家由空肠弯曲菌引起的食源性疾病已成为细菌性食物中毒主要病因之一。我国空肠弯曲菌的检验研究工作作的还不多，只从各种动物、禽类粪便及宰后的胴体、鸡等能分离出本菌，证明是被污染，但尚无本菌引起食物中毒的报导。应对本菌引起食物中毒给以密切注意，提高检验水平。


空肠弯曲菌为微需氧菌，条件是氧气为 5%，二氧化碳为 10% ，氮气为 85% 。革兰氏阴性菌，大小为 0.3 ～0.4μm×1.5～ 3μm ，呈 S 形或螺旋状，培养时间过久或在不适条件下常呈球形。分离培养用选择性培养基，需要营养丰富（加血液）且能抑制其他细菌（加多种抗菌素）生长，如改良的 Cam-BAP或 Skinnow 氏培养基，需用万古霉素、多粘菌素 B 、头孢霉素以及 TMP （甲氧苄氨嘧啶），配量必需准确，如果配成水溶液 1～ 2 周即失效（ 4℃冰箱）；如放置在－ 20℃冰箱，可保存 3 个月。

食品中致病菌的检测技术（二）检测方法 1 ．样品的采集及处理食物样品采集后应尽快进行检验。如果样品必须运送和保存，应使用 Cary-Blair半固体培养基。弯曲菌的存活时间取决于温度，在 25℃情况下，其存活时间不到 24h 或更短，因此样品在原始分离前需放冰箱或冷处保存。 2 ．微需氧条件的制备最佳微需氧条件是氧气为 5%、二氧化碳为 10%、氮气为 85%。有以下几种方法：（ 1）带有双相压力计（可表示正负压的）的厌氧罐在装皿密封后，先抽去罐内空气至负压7.3×104Pa（ 550mmHg ）处，输入上述三种混合气体使罐内压力恢复于零；再将罐内气体抽至负压7.3×l04Pa（ 550mmHg），同样输入上述气体至零，即可放置温箱培养。


（ 2 ）气袋法操作时只使用气体发生剂而不加催化剂。（ 3 ）双平板法取两块平板，一块平板接种已知的兼性厌氧菌（如变形杆菌），另一块平板接种样品，去掉皿盖，将含琼脂的两只皿相对合齐并用胶布粘封，放入密封不漏气的罐内（或袋内）进行培养。由于兼性厌氧菌生长的代谢作用，可使小环境中的氧气浓度下降和二氧化碳浓度上升。（ 4 ）蜡烛缸法将己接种细菌的平板置于容量 2000mL的磨口标本缸或干燥器内。缸盖及缸口涂以凡士林，放人小段点燃蜡烛于缸内（勿靠近缸壁，以免烤热缸壁而炸裂），盖密缸盖。缸内燃烛约 0.5min～ 1min, 因氧减少自行熄灭，此时容器内约含二氧化碳 5%～ 10%。最后连同容器一并置于 42℃±l℃ 温箱中培养。


3 ．分离培养（ 1）拭子或液体可直接在选择性培养基如改良 Camp-

BAP 布氏杆菌培养基或使用 Skirrow 氏培养基平板上划线接种。于 42℃ 培养 48h后，观察可疑菌落。（ 2 ）第一型菌落不溶血，灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去象水滴，有从接种线向外扩散的倾向；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径为 1 ～2mm），边缘完整、发亮。


4 ．初步鉴定将可疑菌落做氧化酶和过氧化氢酶试验，如为阳性，则涂片做革兰氏染色。本菌为革兰氏阴性菌，大小为 0.3 ～ 0.4μm×1.5～ 3μm ，呈 S 型、螺旋状或纺锤形。在固体培养基上培养时间过久或在不适条件下则常呈现球形菌。在暗视野或相差显微镜下观察，动力明显。根据菌落生长特性、菌体染色、动力、氧化酶和过氧化酶试验阳性者，可初步确定为弯曲菌。


5 ．确定试验经初步鉴定后，仍需做下述试验（以下各项试验均需在 5%氧气的微需氧环境中培养）。（ 1）甘氨酸耐受性试验接种于甘氨酸培养基中，培养 48h ，如为阳性，在培养基近表面有云雾状生长，则为弯曲菌空肠亚种。（ 2 ）硫化氢生长试验接种于三糖铁斜面上，并吊一根乙酸铅滤纸条于管口，培养物经 48 ～ 72h 培养，空肠弯曲菌一般在斜面上少量生长，其反应为碱性 / 碱性，滤纸条变黑，但培养基底部不因硫化氢而变黑。


（ 3 ）对 3.5%氯化钠的耐受性试验接种于 3.5%含盐肉汤培养基，经 48h 培养，空肠弯曲菌不生长。（ 4 ） 42℃ 和 25℃ 生长试验将培养物接种于两管布氏肉汤中，一管放于 42℃ ，一管放于 25℃ 培养 48h， 42℃生长而 25℃ 不生长者，则为空肠弯曲菌。（ 5 ）马尿酸钠水解试验将培养物接种于马尿酸钠培养基，于 42℃ 培养 48h ，离心沉淀取出部分上清液。加入三氯化铁试剂，如出现恒久沉淀物则为阳性，空肠弯曲菌呈阳性反应。（ 6 ）萘啶酸试验将可疑空肠弯曲菌涂布接种于血平板上，然后贴上含 30μg 萘啶酸的滤纸于平板上，空肠弯曲菌敏感而肠道弯曲菌不敏感。


（ 7） TTC（ 2,3,5-氯化三苯四氮唑）试验空肠弯曲菌在 TTC 培养基上呈阳性，而胎儿弯曲菌为阴性，阳性者有紫色菌苔并有光泽。（ 8 ）硝酸盐还原试验取培养物的浓菌悬液，在 37℃放置 2h ，加入试剂，观察颜色反应，空肠弯曲菌呈红色的阳性反应。（ 9）鉴别试验弯曲菌的生化鉴别见表 8-12 。


6 ．生物分型（ 1）快速马尿酸钠水解试验将细菌接种在 1%马尿酸钠 0.4mL， 37℃ 水浴 2h ，再加丙酮与丁醇溶解的 3.5%茚三酮 0.2mL ，徐徐加入避免相混，放置 l0min后观察结果。深紫色为阳性，淡紫色或无色为阴性。（ 2 ）快速硫化氢（ H2S ）试验取一大环细菌悬浮于快速硫化氢半固体琼脂上三分之一段， 37℃ 水浴 2h ，观察结果，细菌团块周围变黑为阳性。（ 3） DNA酶水解试验细菌点种于 DNA酶甲基绿琼脂平板上，微需氧环境培养 3 ～ 5 d ，菌苔周围出现无色透明环为阳性。


生物分型结果见表 8-13 。

7 ．血清分型空肠弯曲菌 O 因子分型应采用间接血凝法， H或 K因子分型可用玻片凝集法。 8 ．菌种保存空肠弯曲菌菌种的保存，应接种在改良 Camp-BAP斜面培养基上（棉塞不宜过紧），于 42 ～ 43℃微需氧中培养 48h 后，置 4℃冰箱微需氧内可保存 10～ l4d ，需要时仍可转种一次，长期保存用冻干法。 9 ．注意事项对空肠弯曲菌检验时，应严格执行无菌操作，防止自身感染。


四、变形杆菌的检验（一）概述变形杆菌的主要生化学性状见表 8-14 。

食品中致病菌的检测技术为证实从不同样品中分离的变形杆菌是否为同一菌型时，最好是用血清学的方法进行分型，但在没有因子血清的情况下，也可采用以下几种方法进行试验。 1．凝集试验用两株菌的免疫血清与两株细菌作交叉凝集试验，测定交叉凝集效价，观察两菌是否相同。 2．吸收试验用两株菌的免疫血清与两株细菌做相互交叉吸收试验，观察是否能将血清中的凝集素完全吸除，确定两株细菌的抗原是否相同。 3．拮抗试验将两株不同来源分离的菌株点种在普通琼脂平板或血琼脂平板上，经 37℃ 、 24h后观察结果，在两株细菌菌落交界处出现明显的分界线时，为菌株不同出现拮抗现象（即称为 Dienes 现象）。如果菌株相同时，菌株之间无拮抗现象产生，两株细菌的菌落可以融合在一起。但应注意也有少数例外。


（二）检测方法 1．取被检样品 25g ，加 225mL 灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种在 SS琼脂平板和 EMB琼脂平板上，经 37C 、培养 18 ～ 24h ，普通变形杆菌和奇异变形杆菌在弱选择性的固体培养基上可出现菌落蔓延生长的特点， SS琼脂能抑制其蔓延生长，呈单个菌落。其他变形杆菌呈半透明圆形菌落。 2．挑取上述可疑菌落，接种三糖铁斜面培养基，经 37℃ 、24h 培养后，斜面产碱不变，底层产酸变黄，多数产少量气体，有的产硫化氢或不产硫化氢者均为可疑反应。 3．将三糖铁斜面上可疑反应的培养物做尿素酶试验和涂片革兰氏染色镜检。 4．对尿素酶阳性的革兰氏阴性杆菌，根据生化特性进行分型鉴定。必要时做血清分型。


五、肉毒梭菌的检验（一）概述肉毒梭菌（ Clostridium botulinum ）广泛分布于自然界特别是土壤中，易于污染食品，于适宜条件下可在食品中产生很强的向神经性毒素（称肉毒毒素），能引起以神经麻痹为主要症状且病死率甚高的食物中毒（称肉毒中毒）。婴儿肉毒中毒虽属感染型中毒，但中毒病因有时也与食物或餐具受肉毒梭菌污染有关。故检验食品特别是不经加热处理而直接食用的食品中有无肉毒毒素或肉毒梭菌（例如罐头等密封保存的食品），至为重要。


肉毒梭菌为专性厌氧的革兰氏阳性粗大杆菌，形成近端位的卵圆形芽胞，在疱肉培养基中生长时，混浊、产气、发散奇臭，有的能消化肉渣。肉毒梭菌按其所产毒素的抗原特异性分为A、 B、 C、 D、 E、 F、 G 等七个型，故肉毒梭菌的检验目标主要是其毒素。不论食品中的肉毒毒素检验或者肉毒梭菌的检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。


（二）检测方法 1 ．肉毒毒素检测液状检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例如等量、倍量或 5倍量、 10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测。另取一部分上清液，调 pH6.2 ，每 9 份加 10% 胰酶（活力 1:250 ）水溶液 1份，混匀，不断轻轻搅动， 37℃作用 60min ，进行检测。肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法。


（ 1）检出试验取上述离心上清液及其胰酶激活处理液，分别注射小白鼠 2只，每只 0.5mL 。观察 4d 。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后 24h 内发病、死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠碎死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试验。


（ 2 ）确证试验不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成 3份进行试验。 1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀， 37℃ 作用 30min； 1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸 l0min； 1 份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。 3份混合液分别注射小白鼠各 2只，每只 0.5mL ，观察 4d ，若注射加诊断血清与煮沸加热的 2份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有的症状死亡，则可判定检样中有肉毒毒素存在，必要时要进行毒力测定及定型试验。


（ 3 ）毒力测定取已判定含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成 50倍、 500倍及 5000倍的稀释液，分别注射小白鼠各 2只，每只 0.5 mL ，观察4 d 。根据动物死亡情况，计算检样所含肉毒毒素的大体毒力（ LD/mL或 LD/g）。例如： 5倍、 50倍及 500倍释致动物全部死亡，而注射 5000倍稀释液物的动物全部存活，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为 1000 ～ 10000LD/mL。


（ 4 ）定型试验按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在 10 ～1000LD/mL 的范围，分别与各单型肉毒抗毒诊断血清等量混匀， 37℃ 作用 30min ，各注射小鼠 2 只，每只0.5mL ，观察 4d 。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。


2 ．肉毒梭菌检出（增菌产毒培养试验）取庖肉培养基三支，煮沸 10 ～ 15min ，做如下处理：第一支：急速冷却，接种检样均质液 1～ 2 mL 。

第二支：冷却至 60℃ ，接种检样，继续于 60℃ 保温10min ，急速冷却。第三支：接种检样，继续煮沸加热 10min ，急速冷却。以上接种物于 30℃ 培养 5d ，若无生长，可再培养10d 。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同肉毒毒素检测，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。


3 ．分离培养选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板， 35℃厌氧培养 48h 。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样（或珍珠层样）薄层，但 G 型菌无此现象。根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于 30℃ 培养 5d ，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。（ 1）毒素检测（同肉毒毒素检测方法）。（ 2 ）培养特性检查接种卵黄琼脂平板，分成 2份，分别在 35℃ 的需氧和厌氧条件下培养 48h ，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特征的菌落，而在需氧条件下则不生长。

食品中致病菌的检测技术六、产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验（一）概述（二）检测方法 1 ．活菌计数培养（ 1）按无菌操作称取检样（食品 25g ，粪便 5 g），放人均质器中，加 0.1% 蛋白胨水（食品 225 mL ，粪便 45 mL ），低速搅拌 1 ～2min ，使之均质化，作为 1:10稀释液。（ 2 ）以上述 1:10稀释的均质液按 lmL 加 0.1%蛋白胨水 9mL做成10-2 ～ 10-6 的系列稀释液。（ 3 ）吸取各稀释液 lmL ，分别放于灭菌平皿内。每个平皿浇注约 50℃的 SPS琼脂 15 ～ 20 mL ，仔细转动平皿，使稀释液和琼脂充分湿匀。每个稀释度做两个平皿。（ 4 ）上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内，于 36℃±l℃厌氧培养 24h。（ 5 ）选取长有 30 ～ 300 个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。


2 ．确证试验（ 1）由平板上任取 10 个黑色菌落，分别按种 FT 培养基，于 36℃±l℃ 培养 18h～ 24h。（ 2 ）用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。（ 3 ）用接种环（针）穿刺接种动力 -硝酸盐培养基，于36℃±l℃ 培养 24h ，观察接种线的生长情况，判断有无动力。然后，滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各 0.5mL，，观察硝酸盐是否被还原。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。


（ 4 ）取生长旺盛的 FT 培养液 1mL ，接种于含铁牛乳培养基，厌氧培养 37℃ 过夜或 46℃,2 ～ 5h ，观察有无“暴烈发酵”现象， 5h 内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖、凝酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。（ 5 ）用接种环取 FT 培养液点种于卵黄琼脂平板（每个平板至少可点种 10点），于 36℃±l℃厌氧培养 24h ，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，使接种点的底部及周围形成乳白色的混浊带。四项生化试验全部符合者，即确定为产气荚膜梭菌。


3 ．菌数计算根据黑色菌落的计数和确证试验的结果，计算每克（毫升）食品检样的含菌数。例如： 10-4稀释液的平板长有黑色菌落 100 个，而供做确证试验的 10 个菌落中有 7 个被确证为产气荚膜梭菌，则每克（毫升）食品检样所含产气荚膜梭菌数为： 100×0.7×104=7×105 个 / g（mL）


七、蜡状芽孢杆菌的检验（一）概述（二）检测方法 1 ．菌数测定以无菌操作将检样 25g（mL），用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成 10-1 ～ 10-5 的稀释液按 GB/T4789.2 测定。取各稀释液 0.1mL ，接种在两个选择性培养基――甘露醇卵黄多粘菌素（ MYP ）琼脂培养基上，用 L形涂棒涂布于整个表面，置 36±l℃ 培养 12h～ 20h ，选取菌落数在 30 个左右的平板进行计数，蜡样芽孢杆菌在此培养基上的菌落为粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑取 5 个此种菌落做证实试验，根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽孢杆菌数。例如将 0.1 mL10-4 样品稀释液涂布于 MYP平板上，其可疑菌落为 25 个，取 5 个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌，则 1g （mL ）检样中所含蜡样芽胞杆菌数为： 25×4/5×104×10=2×106 。

食品中致病菌的检测技术 2 ．分离培养将检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基（ MYP ）上，置 37℃ 培养 l2～ 20h ，挑取可疑为蜡样芽胞杆菌的菌落，接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养，然后做证实试验。 3 ．证实试验（ 1）形态观察本菌为革兰氏阳性大杆菌，宽度在 lμm或 lμm 以上，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。（ 2 ）培养特性本菌在肉汤中生长混浊，常微有菌膜或壁环，振摇易乳化；在普通琼脂平板上其菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐。（ 3 ）生化性状本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。


4 ．生化分型根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、 V-P反应、明胶液化性状的试验，分成不同型别，见表 8-15 。


5 ．与类似菌鉴别本菌与其他类似菌的鉴别见表 8-16


本菌在生化性状上与苏云金芽胞杆菌极为相似，但后者可籍细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其检查方法如下：取营养琼脂上纯培养物少许，加少量蒸馏水涂于玻片上，待自然干燥后用弱火焰固定，加甲醇于玻片上，半分钟后倾去甲醇，置火焰上干燥，然后滴加 0.5%碱性复红液，并用酒精灯加热至微见蒸气维持 1.5min ，移去酒精灯，将玻片放置半分钟，倾去染液，置洁净自来水充分漂洗、晾干、镜检。在油浸镜下检查有无游离芽胞和深染的似菱形的红色结晶小体（如末形成游离芽胞，培养物应放室温再保存 ld～ 2d后检查），如有即为苏云金芽胞杆菌，蜡样芽胞杆菌检查为阴性。


八、单核细胞增生李斯特氏菌的检验（一）概述（二）检测方法 1 ．样品的收集及处理无菌取样品 25g （ mL ），放灭菌均质器中加225mLEB和 LB 增菌液，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存 4℃冰箱。 2 ．增菌培养 EB 增菌液放 30℃±1℃ 培养 48h， LB1 增菌液 225mL

放 30℃±1℃ 培养 24 h ，吸取 0.1mL ，加入 10 mL LB2

菌液中二次增菌。


3 ．分离培养将 EB 增菌液和 LB2 二次增菌液分离于选择培养基 MMA

琼脂平板上，培养 30℃±1℃ ， 48h ，挑选可疑菌落，用白炽灯 45° 角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形菌落。选 5 个以上的上述可疑菌落接种三糖铁（ TSI ）琼脂和 SIM 动力培养基，培养于 25℃±1℃ ，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察 2 ～7d ，阳性者可做下一步鉴定。


4 ．纯培养将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基（ TSA-YE ）上纯培养，做以下鉴定。 5 ．染色镜检将上述可疑纯培养物做革兰氏染色，并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为 0.4 ～ 0.5μm×0.5

～ 2.0μm ；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。


6 ．生化特性将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及其种间的区别见表 8-17 。

食品中致病菌的检测技术 7 ．对小鼠的致病力试验将符合上述特性的纯培养物接种于 TSB-YE 中， 30℃ 培养 24h ，离心，弃上清液，用 0.85%灭菌生理盐水制备成浓度为 1010 个 /mL 的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射 3 ～ 5只，每只 0.5mL 。观察小鼠死亡情况。致病株于2 ～ 5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。 8 ．协同溶血试验（ cAMP）在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌（ R． equi），在它们中两者之间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们， 30℃ 培养 24 ～ 48h ，检查平板中李斯特氏菌的溶血环。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，而绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强。

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食品中致病菌的检测技术