Upload
andrej-mihajlovic
View
76
Download
10
Embed Size (px)
Citation preview
1
MetodeMetode
Laboratorijska mjerenja
Kvalitativna Semi-kvantitativna Kvantitativna
Ima - NemaManje – isto- više od
Funkcionalna specifičnostBrojčani izraz
Strukturalna specifičnost
Imunokemijske metodeImunokemijske metode
JezeroJezero Duž: 2,5 kmDuž: 2,5 km
Šir: 0,5 kmŠir: 0,5 km
Dubina; 20 mDubina; 20 m
Volumen: 2,5 Volumen: 2,5
2 g šećera u 0,1 mL vode
(0,23 pmol/L)
šećera
Imunokemijske tehnikeImunokemijske tehnike
• U većini IK tehnika radni reagens
– sadrži poliklonalna (monoklonalna) At
– služi za kvalitativnu i kvantitativnu analizu Ag u uzorku
2
MetodeMetode
• [Ag] + [At] [Ag – At]
Vezanje At na Ag izravno je razmjerno:
• Afinitetu
• Avidnosti
• Koncentraciji At
• Gustoći epitopa
• Jačina veze obrnuto je razmjerna
udaljenosti aktivnih mjesta
udesno [Ag] i [At] > [Ag-At]
MetodeMetode
• afinitet i avidnost – mogućnost križne
reaktivnosti
• Avidnost je fenomen u kojem jakost veze
svih parova "paratop – epitop" nadmašuje zbroj pojedinačnih veza paratop – epitop
• [Hp - At ]n > { [Hp - At ] + .....[Hp - At ]n}
Imunokemijske tehnikeImunokemijske tehnike
1. Neobilježene – izravne
– Reagens sadrži poliklonalna At (pAt)
2. Obilježene – posredne
– Reagnes sadrži monoklonalna At (mAt)
3
ČČemu služe osjetljive IK metode?emu služe osjetljive IK metode?
1. Određivanje niskih koncentracija Ag (hormoni, specifični proteini)
2. Istodobno određivanje više Ag (hormoni hipotalamusa, faktori rasta)
3. Rana dijagnostika tumora (tumorski biljezi)
4. Otkrivanje virusnih Ag i At (HIV, HBV, HCV...)
5. Otkrivanje novih Ag (nepoznati biljezi)
Pregled IK metodaPregled IK metoda
I - Taložne reakcije
II – Kvalitativne metode u gelu
III – Kvantitativne metode u gelu
IV – Izravne metode u otopini
V – Metode s obilježenim reagensima
Taložne reakcijeTaložne reakcije -- ((serološkeserološkemetodemetode))
• Taloženje nastaje zbog reakcije između
velikoga broja hidrofobnih skupina.
• Kada broj hidrofobnih skupina dosegne
određenu kritičnu razinu kompleks postajesposoban izbaciti vodu, i istaložiti se.
• Tako topljivi reaktanti stvaraju netopljivi
produkt.
4
Taložne reakcije Taložne reakcije -- PovezanostPovezanost omjeraomjera
Ag/At i Ag/At i sastavasastava kompleksakompleksa
Omjer Ag/At Vrsta kompleksa2,25 AgnAtn>1, topljiv, slobodni Ag
2,27 AgnAtn=1, AgnAtn, slobodni Ag i At
0,71 svi tipovi kompleksa, topljivi, netopljivi, slobodni Ag i At
0,40 Ag1Atn,Ag2Atn , slobodni Ag i At
0,23 malo kompleksa Ag1Atn, malo
slobodnog Ag, puno slobodno At
0,13 Ag1At8, nema slobodnog Agnetopljiv
topljiv
Taložne reakcijeTaložne reakcije ––((serološkeserološke metodemetode))
1. precipitacija
a. kvalitativna precipitacija
b. kvantitativna precipitacija
2. aglutinacija
a. izravna aglutinacija
b. posredna aglutinacija
* aglutinacija stanica ili inertnih čestica obloženihantigenom
** obrnuta aglutinacija stanica ili inertnih česticaobloženih antitijelom
*** spontana aglutinacija (virusna aglutinacija)
Kvalitativne tehnike u geluKvalitativne tehnike u gelu
1. Imunodifuzija
A. jednostruka imunodifuzija
a. jednostruka jednodimenzionalna imunodifuzija
b. jednostruka dvodimenzionalna imunodifuzija
B. dvostruka imunodifuzija
a. dvostruka jednodimenzionalna imunodifuzija
b. dvostruka dvodimenzionalna imunodifuzija
2. Imunoelektroforetske tehnike
a. imunoelektroforeza
b. protusmjerna imunoelektroforeza
c. Imunoblot (Western Blot) tehnika
5
Kvantitativne tehnike u geluKvantitativne tehnike u gelu
1. Radijalna imunodifuzija
2. Elektroimunoprecipitacija
- elektroforeza antigena u gelu;
- raketna elektroforeza
Izravne tehnike u otopiniIzravne tehnike u otopini
a. turbidimetrija
b. nefelometrija
c. laserska nefelometrija
Metode s obilježenim reagensimaMetode s obilježenim reagensima
1. Radioimunokemijske metode(RIA)
2. Imunoradiometrijska metoda (IRMA)
3. Enzimimunokemijska metoda (EIA)
4. Fluoroimunokemijska metoda (FIA)
5. Luminoimunokemijska metoda (LIA)
a. kemiluminiscencija
b. bioluminiscencija
6
PrecipitaPrecipitacijacija
Antigen Antigen
AntiAntitijelotijelo
PrecipitaPrecipitacijacija1. faza – specifično vezanje pojedinačnih molekula u Ag-At
- ovisi o koncentraciji reaktanata (10-6) – djelić sekunde; (10-9) – nekoliko minuta
2. faza – stvaranje vidljivih agregata - ravnoteža- nekoliko sati ili dana- važni fizik.čimbenici: konc. soli, pH, temp, vrijeme
Količina At u precipitatu jednaka ukupnoj količini specif. At dodanom volumenu antiseruma
3. faza - ovisno o relativnim koncentracijama antigena i protutijela kompleksi se mogu križno povezivati pri čemunastanu veliki trodimenzionalni kompleksi. Kad se uravnoteže svi nastali kompleksi prestaje njihova daljnjirast.
PrecipitaPrecipitacijacija
Kvalitativna precipitacija
• Za dokazivanje pripadnosti vrsti (mišji, goveđi, kunićji proteini)
• Za dokazivanje tipa proteina (primjese
serumskih proteina u pročišćenim preparatima)
7
PrecipitaPrecipitacijacija
• Kvanitativna precipitacija
* konst (At) + ili (Ag) - mjeri se konc. Ag
Epruveta u kojoj se pojavi talog = ZE (titar ili g/L)
** konst. (Ag) + ili (At) – mjeri se konc. At
ZE
pre-zona post-zona
višak At višak Ag
optimalan Ag : Atprecipitat
[At] 1
[At] 1/128
PrecipitaPrecipitacijacija
• Mjerenje ZE (točke ekvivalencije) –
fotometrijski, spektrofotometrijski
• Standard Ag – ne trebaju razrjeđenja
• - baždarna krivulja – 2 točke
(uzlazni i silazni krak)
• Prednost: jednostavnost, brzina, pouzdanost
• Nedostatak; nedovoljna osjetljivost
8
AglutinacijaAglutinacija
• Ag = korpuskula (bakterija, Erc) – aglutinat (ugrušak)
• Izravna aglutinacija :
Erc, bakterije, gljivice + At aglutinacija
• Posredna (pasivna) aglutinacija
* aglutinacija stanica ili inertnih čestica koje su obložene s Ag i koje su pasivni nosači inače topljivih Ag (aglutinacija čestica lateksa)
** obrnuta aglutinacija: čestice lateksa ili Erc se oblažu s At
*** spontana aglutinacija Erc koju izazivaju neki virusi (virusna hemaglutinacija)
AglutinacijaAglutinacija
Eritrociti
• Lako dostupni
• Osjetljivi (kao indikator)
• Mogućnost čuvanja (+4oC)
• Potrebno je ukloniti heterofilna At s površine Erc (mogu aglutinirati)
• Erc se tretiraju s formalinom, glutaraldehidom
oblažu se s proteinskim Ag (prethodno s
taninskom kis.)
Krvne grupe
9
Ligandi
Hh antigenski sustav (antigen prisutan u osoba s krvnom grupom O- molekularna struktura ABO(H) antigenskog sustava
Osobe s rijetkim fenotipom Bombay (hh) nemaju H antigen("substance H") (antigen prisutan
u krvnoj grupi O).
Kompatibilnost
A-B-O Davatelj & Primatelj
PrimateljPrimatelj
Davatelj
AB
B
A
O
AB
Nema
B
anti-A
A
anti-B
Oanti-Aanti-B
Aleli &Antitijela
NR - Nema reakcijeAG - Aglutinacija
Kompatibilnost
A-B-O Davatelj & Primatelj
PrimateljPrimatelj
Davatelj
NRAglutinacija
AglutinacijaAglutinacijaAB
NRNRAglutinacijaAglutinacijaB
NRAglutinacija
NRAglutinacijaA
NRNRNRNRO
AB
Nema
B
anti-A
A
anti-B
Oanti-Aanti-B
Aleli &Antitijela
NR - nema reakcije
10
Određivanje krvnih grupaDodati kap anti-A antitijela kapi krvne grupe ADodati kap anti-B antitijela kapi krvne grupe B
anti-A antitijela anti-B antitijela
Rh
Rh senzibilizacija
Prva trudnoća
Druga trudnoća
11
Rh - antigeni
Rh Rh --dddd
OtacOtacDdDd
Rh +Rh +DDDD
DDDddd
Rh + Rh-
MajkaMajka
Rh - antigeni
Rh Rh --dddd
OtacOtacDdDd
Rh +Rh +DDDD
DDDddd
Rh + Rh-
MajkaMajka
Rh - antigeni
Rh Rh --ddddRh +Rh +Rh +Rh + (Rh(Rh--))RhRh--
OtacOtacDdDd
Rh +Rh +RhRh ++ (Rh(Rh--))Rh +Rh + (Rh(Rh--))
Rh +Rh +DDDDRh +Rh +Rh +Rh +Rh +Rh +
DDDddd
Rh + Rh-
MajkaMajka
12
AglutinaAglutinacijacija
ERC
ERC
ERC
ERC
IgMIgM
IgG IgG
ERC
ERCERC
ERC ERC
ERCERC
LateksLatekspolimerizacija
stirenski monomer polistirenski lateks
– Stiren + surfaktant (Na dodecil sulfat) - emulzija s bilijun čestica jednakog promjera
– Dodatak K-persulfata (počelo polimerizacije) ------------- polimerizacija
– Polistirenski lanci tvore micele (u središtu hidrokarbon, a na periferiji sulfatni ioni)
– Veličina čestica (0,5 – 2 µm) ovisi omjerima hidrokarbona, surfaktanta, počela i uvjeta polimerizacije
– Površinski naboj = negativan
Sulfatne skupine surfaktanta
Polistiren
Sulfatni slobodni radikali
Hidrokarbonski krajevi sufaktanta
Lateks
• Najrašireniji korpuskularni nosač (0,1-2,0µm)
• Može vezati Ag ili At
• Velika kontaktna površina (omogućuje detekciju već kod pojave prvih količina Ag/At
• osjetljivost, brzina reakcije (nakon 1. min) dovoljno za kvalitativnu analizu
• Gruba kvantitativna procjena– pozitivan / negativan standard
• Kvantitativna analiza –razrijeđeni uzorci—turbidimetrijski (CRP, RF, ASO)
13
AglutinacijaAglutinacija
• Mononukleoza (kvalitativna , semikvantitativna
– Princip: Određuju se IgM heterofilna antitijela (koristi se antigen bubrega zamorca, eritrociti konja koji povećavaju specifičnost, osjetljivost i budući da su obojeni vidljivost reakcije)
• Reumatski faktori
– lateks aglutinacija
– Pročišćeni humani IgG kovalentno vezan na modro obojene latex čestice. U prisustvu RF čestice aglutiniraju, vidljivi agregati.
• Virus Rubela
– Određuju se IgG i IgM prema virusu rubele u serumu
– polistirenske lateks čestice obložene denaturiranim virusom (soj HPV77)
Aglutinacija
At
Ag
Metode vezanja proteina na lateks
Pasivna adsorbcija
-Lateks + protein + pufer
- postizanje ravnoteže
- višekratno ispiranje
Kovalentno vezanje
- preko funkcionalnih skupina
karboksilati, amino-, aldehidne- ,
amidi-,
Lateks
• Preduvjeti za kvalitetan lateks
– Dobro pročišćeni ligandi. Nečistoća smanjuje osjetljivost i specifičnost testa
– Količina vezanog liganda na površini čestice mora biti idealna. Aglutinacija se može
smanjiti ako čestice ne sadrže dovoljan (ili prevelik) broj liganada
– Nevezani ligandi moraju se ukloniti nakon vezanja
14
Lateks Lateks -- odre određđivanje RFivanje RF
• Negativan rezultat
+
Lateks prekriven Serum s niskoms humanim IgG konc RF (IgM)
• Pozitivan rezultat
Niska konc RF u serumu
+Serum s visokom konc. RF
Visoka konc RF u serumuTURBIDIMETRIJA
LateksLateks
???CV (%)
1,140,660,53SD (IU/L)
50,6120,0811,07X (IU/L)
202020broj uzoraka
321serum br.
Preciznost unutar određivanja (RF)
LateksLateks
2,253,294,78CV (%)
1,140,660,53SD (IU/L)
50,6120,0811,07X (IU/L)
202020broj uzoraka
321serum br.
Preciznost unutar određivanja (RF)
15
Kvalitativne tehnike u geluKvalitativne tehnike u gelu
• Reakcija Ag : At se izvodi u polučvrstom
mediju:
»Agarozni – gel»Agaroza»Poliakrilamidni gel
Agarozni gelAgarozni gel
• Pročišćen polisaharid – dobiven od agara
• Dostupan u različitim
koncentracijama
temperature taljenja
jačine gela,
razine elektroendoosmoze
čistoće
AgarozaAgaroza
• Otapanjem praha u kipućoj vodi :
• Hidroklorid povezan H- i hidrofobnim
vezama
• Hlađenjem na 40 oC ---- gel
• Stabilan na temp. < 100 oC
• konc. - pore; radna konc. 0,4 – 4,0 %
• Lomljiv – oprezno rukovanje
16
Poliakrilamidni gelPoliakrilamidni gel
• Akrilamid – križno povezani monomeri
• Polimerizacija: dugi lanci kovalentno povezani
• Najmanja križno povezana jedinica:
N,N'-metilen-bis-akrilamid
• Polimerizaciju kataliziraju
- slobodni radikali (peroksid)
- fotokemijski (UV-svjetlo)
- hlađenje 20 – 60 min
Pasivna difuzija u geluPasivna difuzija u gelu
• Pasivna difuzija Ag i At opisana Fickovom
jednadžbom:
• dQ dC
• Dt dx• dQ = količina molekula koje difundiraju
• Dt = vrijeme difuzije
• A = površina
• dC/dx koncentracijski gradijent (C = konc, x = difuzijski put
• D = koeficijent difuzije
= - D x A x
O čemu ovisi brzina difuzije?O čemu ovisi brzina difuzije?
• Koncentracija Ag i At
• Mr Ag i At
• Građa, površinski naboj Ag i At
• Gustoća ili koncentracija gela
• Temperatura, pH, koncentracija elektrolita
17
ImunodifuzijaImunodifuzija
Jednostruka imunodifuzija Dvostruka imunodifuzija
ImunodifuzijaImunodifuzija
1. reakcija identičnosti 2. reakcija djelomične identičnosti 3. reakcija neidentičnosti
ImunelektroforezaImunelektroforeza
1. Zonska elektroforeza antigena
2. Reakcija Ag - At
Ag
At
18
Imunoelektroforeza - elektroforeza proteina – naboj, Mr; pI
- difuzija- precipitacijski lukovi
Antigeni
Antitijela
Protusmjerna imunoelektroforezaProtusmjerna imunoelektroforeza
Ag
At+
+
Dvostruka imunodifuzijaDvostruka imunodifuzija
19
Kvantitativne tehnike u geluKvantitativne tehnike u gelu
• Radijalna imunodifuzija (Mancini i Carbonara)
pasivna difuzija Ag u agarozni gel koji sadrži
jednolično raspoređena At
• Elektroimunoprecipitacija (Laurell) Raketna IEF
• Elektroforeza Ag u gelu koji sadrži specifična
At
Kvantitativne tehnike u geluKvantitativne tehnike u gelu
• Agarozni gel je puferiran, pH = 8,6
• Ukupan naboj At = 0 (At ne putuju)
RadiRadijjalalna imunodifuzija (RID)na imunodifuzija (RID)
Gel s Gel s AAtt
Ag/8Ag/8 Ag/4Ag/4 Ag/2Ag/2 Ag/1Ag/1
PrecipitPrecipitacijski acijski prstenprsten
Koncentracija aKoncentracija antigenntigenaa
20
Radijalna imunodifuzijaRadijalna imunodifuzija
ZEZE
Reakcija precipitacije u gelu vidljiva je tvorbom precipitacijske linije u ZE;
u području viška Ag ili At nema vidljivih precipitata
Radijalna imunodifuzijaRadijalna imunodifuzija
Reakcija precipitacije u gelu vidljiva je tvorbom precipitacijske linije u ZE; u području viška Ag ili At nema vidljivih precipitata
Zona ekvivalencije
At
Difuzija Ag
Precipitacija
razmjerna konc. antigena
Antitijelo
Dvostruka imunodifuzijaDvostruka imunodifuzija
At u polukrutoj podlozi
Ručno očitavanje Automatizacija
matematički algoritam
21
ElektroimunoprecipitacijaElektroimunoprecipitacija
+
At At
konc. Ag (g/L)
Duljina putovanja
(mm)
Dvosmjerna imunoelektroforezaDvosmjerna imunoelektroforeza
Križna imunoelektroforeza
1. Zonska elektroforeza 2. elektoimunoprecipitacija
+
+
22
Tehnike u otopiniTehnike u otopini
Tehnike se razlikuju prema načinu mjerenja reakcije Ag + At
• Mjerenje u ZE, metoda završne točke – End point (neobilježene, izravne): turbidimetrija, nefelometrija. Uzorak antigena pomiješa se sa stalnom koncentracijom At
• Mjerenje primarne reakcije Ag + At u točno određenom vremenu - Fixed time method. Mjeri se brzina stvaranja kompleksa Ag-At ( u prvih nekoliko minuta)
Izravne tehnike u otopiniIzravne tehnike u otopini
• Mjerenje završne točke u ZE (u trenutku
najveće konc. Ag-At
• Polietilen-glikol
• Pojačava reakciju vezanja
• Pomiče točku ekvivalencije prema višim
koncentracijama Ag
• Održava homogenost (Ag-At) koji lebdi u otopini
Turbidimetrija Turbidimetrija –– Nefelometrija Nefelometrija
70o
Pad intenziteta
svjetla
TURBIDIMETRIJA
Zamućenost (Ag)
Rasipanje
svjetlaNEFELOMETRIJA
-(Ag) mjeri se na uzlaznom dijelu krivulje
- ne postoji razmjerna zavisnost (Ag) i optičke gustoće—visoke
konc. razrijediti
start
E1
E
Aps.
t (min)
23
Nefelometrija
Osjetljivost imunokemijskih metodaOsjetljivost imunokemijskih metoda
Metoda Osjetljivostmg/L
Radijalna imunodifuzijaRadijalna imunodifuzija
Reakcija precipitacije u gelu vidljiva je tvorbom precipitacijske linije u ZE; u području viška Ag ili At nema vidljivih precipitata
Zona ekvivalencije
At
Difuzija Ag
Precipitacija
razmjerna konc. antigena
Antitijelo
Dvostruka imunodifuzijaDvostruka imunodifuzija
At u polukrutoj podlozi