Transkripciju i procesiranje RNA prati translacija, sinteza proteina koja se odvija prema mRNA kalupu

Poglavlje 7

Sinteza, procesiranje i regulacija proteina

Translacija mRNA

Smatanje i obrada proteina

Razgradnja proteina

Kljuni pokus: Katalitika uloga ribosomske RNA

Molekularna medicina: Antibiotici i sinteza proteina

Nakon transkripcije i procesiranja RNA slijedi translacija, odnosno sinteza proteina koja se odvija prema kalupu mRNA. Proteini aktivno sudjeluju u veini staninih procesa obavljajui mnogobrojne zadae, koje su odreene informacijama pohranjenim u genomskoj DNA. Sintezu proteina, mogue je smatrati krajnjim korakom genske ekspresije, dok je translacija, odnosno prevoenje mRNA, tek prvi korak nastanka funkcionalnog proteina. Nakon sinteze, polipeptidni se lanac treba smotati u odgovarajuu trodimenzionalnu konformaciju, a uz to, esto podlijee razliitim oblicima procesiranja prije zauzimanja aktivnog oblika. Procesiranje proteina, posebice kod eukariota, usko je povezano s razvrstavanjem i transportom proteina do njihovih odgovarajuih odredita unutar stanice.

Premda je ekspresija veine gena primarno regulirana na razini transkripcije (vidi Poglavlje 6), kontrola se moe odvijati i na razini translacije, to je vaan element genske regulacije kako u prokariotskih tako i u eukariotskih stanica. ak su znaajniji mehanizmi koji kontroliraju aktivnosti proteina u stanici. Jednom sintetizirani, mnogi proteini u odgovoru na izvanstanine signale mogu biti regulirani kako kovalentnim modifikacijama tako i povezivanjem s drugim molekulama. Uz to, razine proteina u stanici mogu biti regulirane razliitom brzinom razgradnje proteina. Ove viestruke kontrole koliine i aktivnosti unutarstaninih proteina u konanici reguliraju sve aspekte ponaanja stanice.

Translacija mRNA

Sinteza proteina odvija se prema kalupu mRNA procesom koji je tijekom evolucije ostao visokoouvan (pregled u Poglavlju 3). Sve se mRNA itaju u smjeru 5' prema 3' , a polipeptidni se lanac sintetizira od amino-prema karboksi-kraju. U mRNA svaka je aminokiselina odreena s tri baze (kodon), prema gotovo univerzalnom genetikom kodu. Temeljni mehanizam proteinske sinteze takoer je istovjetan u svim stanicama: translacija se odvija na ribosomima uz tRNA koje slue kao posrednici izmeu kalupa mRNA i aminokiselina koje se ugrauju u protein. Time sinteza proteina obuhvaa interakciju tri tipa RNA molekula (kalup mRNA, tRNA i rRNA) kao i razliite proteine potrebne za translaciju.

Transportne RNA

Tijekom translacije, svaka od 20 aminokiselina mora biti pridruena odgovarajuim kodonima na kalupu mRNA. Sve stanice sadre mnotvo tRNA koje slue kao posrednici ovog procesa. Kao to je za oekivati, zbog istovjetne funkcije u procesu sinteze proteina, razliite tRNA imaju zajednike strukturne osobine. Uz to, posjeduju jedinstvene identificirajue sljedove koji omoguavaju vezanje odgovarajue aminokiseline i njezino pridruivanje svom pripadajuem kodonu u mRNA.

Transportne RNA izgraene su od priblino 70 do 80 nukleotida i imaju karakteristinu strukturu "lista djeteline" koja je posljedica sparivanja komplementarnih baza iz razliitih regija molekule (Slika 7.1). Kristalografske analize X-zrakama dodatno su potvrdile da se sve tRNA smataju u sline kompaktne L-oblike koji su nuni za uklapanje tRNA u ribosome za vrijeme procesa translacije. Posrednika funkcija tRNA temelji se na dvije odvojene regije molekule. Sve tRNA na 3'-kraju sadre slijed CCA, a aminokiseline se kovalentno veu na ribozu krajnjeg adenozina iz tog slijeda. Antikodonska petlja, smjetena na drugom kraju smotane tRNA, putem komplementarnog sparivanja baza prepoznaje i vee odgovarajui kodon u kalupu mRNA.

Pravilna ugradnja kodirane aminokiseline u proteine ovisi o njezinom povezivanju s odgovarajuom tRNA kao i o specifinom kodon-antikodon sparivanju baza. Reakcije u kojima se aminokiseline povezuju sa specifinim tRNA posredovane su enzimima, nazvanim aminoacil-tRNA sintetaze, koje su 1957. godine otkrili Paul Zamecnik i Mahlon Hoagland. Svaki od tih enzima prepoznaje jednu aminokiselinu i odgovarajuu tRNA (ili vie njih) za koju aminokiselina treba biti vezana. Reakcija se odvija u dva koraka (Slika 7.2). Prvo se aminokiselina aktivira reakcijom s ATP-om kako bi nastao aminoacil-AMP-sintetazni meuprodukt. Aktivirana se aminokiselina, zatim povezuje s 3' krajem tRNA. Aminoacil-tRNA sintetaze moraju biti visoko-selektivni enzimi koji prepoznaju i pojedinane aminokiseline i specifine sljedove baza koji su svojstveni odgovarajuoj akceptorskoj tRNA. U nekim sluajevima visoka pouzdanost prepoznavanja aminokiselina potjee dijelom i od procesa provjere itanja (korektivne funkcije), u kojem se neispravni aminoacil-AMP kompleksi hidroliziraju, rae nego da budu pridrueni transportnim RNA tijekom drugog koraka reakcije. Prepoznavanje ispravne tRNA i aminoacil-tRNA sintetaze je takoer visoko-selektivno: sintetaza prepoznaje specifian nukleotidni slijed (koji u veini sluajava obuhvaa i antikodon) koji jedinstveno identificira svaku pojedinu vrstu tRNA.

Nakon to se aminokiselina povezala s tRNA, nastali se kompleks smjeta na kalup mRNA, to je posredovano komplementarnim sparivanjem baza kodona mRNA i antikodona tRNA. Sparivanje baza iz kodona i antikodona neto je manje strogo od standardnog sparivanja baza A-U i G-C o kojem je bilo govora u prethodnim poglavljima. Znaenje ovog neuobiajenog sparivanja baza u prepoznavanju kodon-antikodon povezano je sa redundancijom genetikog koda. Od 64 mogua kodona, tri su stop-kodoni koji signaliziraju zavretak translacije, dok ostalih 61 kodiraju aminokiseline (vidi Tablicu 3.1). Sukladno tome, veina aminokiselina odreena je i vie nego jednim kodonom. Ova redundancija dijelom proizlazi iz injenice da se mnoge aminokiseline mogu vezati s nekoliko vrsta tRNA. E. coli, primjerice, posjeduje oko 40 razliitih tRNA koje slue kao akceptori za 20 razliitih aminokiselina. Uz to, neke tRNA mogu prepoznati vie od jednog kodona u mRNA, to je posljedica nestandardnog sparivanja baza (nazvanog kolebanje ) izmeu antikodona tRNA i baze na treem poloaju nekih komplementarnih kodona (Slika 7.3). Slobodnije sparivanje baza na tom poloaju dijelom potjee od stvaranja parova baza G-U, a dijelom od modifikacije gvanozina u inozin u antikodonima nekolicine tRNA tijekom procesiranja (vidi Sliku 6.40). Inozin moe stvoriti par baza bilo s C, U ili A na treem poloaju, tako da prisutnost ove baze u antikodonu omoguava jednoj tRNA prepoznavanje triju razliitih kodona u kalupu mRNA.

Ribosom

Mjesta na kojima se odvija sinteza proteina, kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama, jesu ribosomi. Prvotno su opisani kao estice detektirane ultracentrifugiranjem staninog lizata, pa ih se stoga, esto imenuje na temelju njihove brzine sedimentacije: oznaka 70S koristi se za bakterijske ribosome, a oznaka 80S za neto vee ribosome eukariotskih stanica. Ribosomi i prokariotskih i eukariotskih stanica izgraeni su od dvije razliite podjedinice, koje obje sadre karakteristine proteine i molekule rRNA. injenica da stanice uobiajeno sadre mnogo ribosoma odraava sredinju vanost sinteze proteina u staninom metabolizmu. E. coli, primjerice, sadri oko 20000 ribosoma, to predstavlja priblino 25% suhe mase stanice, dok brzorastue stanice sisavaca sadre oko 10 milijuna ribosoma.

Premda se u nekim detaljima razlikuju, osnovna je struktura prokariotskih i eukariotskih ribosoma slina (Slika 7.4). Mala se podjedinica (obiljeena kao 30S) ribosoma E. coli, sastoji od 16S rRNA i 21 proteina, a velika je podjedinica (50S) izgraena od 23S i 5S rRNA i 34 proteina. Svaki ribosom sadri jednu kopiju rRNA i jednu kopiju svakog ribosomskog proteina, uz jednu iznimku: jedan je protein 50S podjedinice prisutan u etiri kopije. Podjedinice eukariotskih ribosoma su vee i sadre vie proteina u odnosu na odgovarajue podjedinice prokariotskih ribosoma. Mala je podjedinica (40S) eukariotskih ribosoma izgraena od 18S rRNA i priblino 30 proteina, dok velika podjedinica sadri 28S, 5,8S i 5S rRNA te oko 45 proteina. Zbog svoje veliine i kompleksnosti visoko-rezolucijska strukturna analiza ribosoma X-zrakama nije uspjeno izvedena sve do 2000. godine kada je prvi put objavljena struktura i 50S i 30S podjedinice. Kao to e u daljnjem tekstu biti dodatno potvreno, poznavanje strukture ribosoma na atomskoj razini bilo je kljuno za razumijevanje funkcije ribosoma.

Vano je svojstvo ribosoma da mogu nastati in vitro, samo-udruivanjem pripadajuih RNA i proteina.. Kao to je Masayasu Momura prvotno opisao 1968. godine, proieni e ribosomski proteini i molekule rRNA kada se pomijeaju zajedno, pod odgovarajuim uvjetima, ponovo stvoriti funkcionalne ribosome. Premda je udruivanje ribosoma in vivo (posebice u eukariotskim stanicama) znaajno sloenije, spoznaja da se ribosomi mogu samo-udruivati in vitro, osigurala je vaan eksperimentalni pristup, omoguivi na taj nain ispitivanje uloge svakog pojedinog proteina i molekule rRNA.

Kao i transportne RNA, i ribosomske RNA putem komplementarnog sparivanja baza stvaraju karakteristine sekundarne strukture (Slika 7.5). Povezujui se s ribosomskim proteinima ribosomske se RNA dodatno smataju u posebne trodimenzionalne strukture. Prvotno se smatralo da ribosomske RNA imaju strukturnu ulogu, odnosno da osiguravaju kostur koji sjedinjuje ribosomske proteine. Otkriem katalitikih osobina drugih vrsta RNA, primjerice, RNaze P i samo-prekrajajuih introna o kojima je bilo govora u Poglavlju 6, uvelike se poela razmatrati mogua katalitika uloga rRNA. U skladu s tom pretpostavkom, utvreno je da je rRNA nuna za udruivanje funkcionalnih ribosoma in vitro. S druge strane, izostavljanje mnogih ribosomskih proteina rezultiralo je smanjenjem, ali ne i potpunim gubitkom ribosomske aktivnosti.

Prvi izravni dokaz o katalitikoj aktivnosti rRNA proizaao je iz eksperimenata Harry Nollera i njegovih suradnika 1992. godine. Ovi su znanstvenici pokazali da velika ribosomska podjedinica moe katalizirati nastajanje peptidne veze (reakcija peptidil-transferaze) ak i kad je 90% ribosomskih proteina uklonjeno standardnim postupcima ekstrakcije proteina. Suprotno tome, nakon primjene RNaze stvaranje peptidne veze u potpunosti je dokinuto, ime je snano poduprta hipoteza da ovu reakciju katalizira RNA. No, kako je prisutnost nekih ribosomskih proteina bila nuna za odravanje intaktnosti RNA, jo uvijek nije bilo mogue u potpunosti iskljuiti mogunost da stvaranje peptidne veze kataliziraju proteini.

Nedvojbeni dokaz o tome da rRNA katalizira reakciju stvaranja peptidne veze proiziao je iz prvih strukturnih analiza 50S ribosomske podjedinice pri visokom razluivanju, koje su 2000. godine objavili Peter Moore, Thomas Seitz i njihovi suradnici. Uvid u strukturu ribosoma na atomskoj razini otkrio je da ribosomski proteini nisu prisutni na mjestu u kojem se odvija reakcija peptidil-transferaze, ime je potvreno da rRNA katalizira reakciju stvaranja peptidne veze. Na temelju strukturne analize predloen je i mogui mehanizam ove reakcije: smatra se da rRNA ostaci u aktivnom mjestu kataliziraju stvaranje peptidne veze reakcijom prijenosa protona koja odgovara reakciji suprotnoj od hidrolize peptidne veze koju kataliziraju serinske proteaze (vidi Sliku 2.26). Premda predloeni mehanizam treba dodatno potvrditi novim studijama, za sad je vrsto prihvaeno da temeljnu reakciju sinteze proteina katalizira ribosomska RNA. Iako su smatrani primarnim katalitikim dijelovima ribosoma, danas se smatra da proteini imaju uglavnom strukturnu ulogu.

Izravna ukljuenost rRNA u reakciju peptidil-transferaze ima vane posljedice i za evoluciju. RNA su smatrane prvim samo-replicirajuim makromolekulama (vidi Poglavlje 1). Ovu pretpostavku snano podupire injenica da ribozimi, kao to su RNaza P i samo-prekrajajui introni, mogu katalizirati reakcije s RNA-supstratima. Uloga rRNA u stvaranju peptidne veze proiruje katalitiku aktivnost RNA izvan samo-replikacije, sve do izravne ukljuenosti u sintezu proteina. Dodatne studije, koje su pokazale da ribozimska rRNA iz Tetrahymene moe katalizirati vezanje aminokiselina na RNA, otvorile su mogunost da su izvorne aminoacil-tRNA-sintetaze vjerojatno bile ribonukleinske kiseline, a ne proteini. injenica da molekule RNA mogu katalizirati reakcije potrebne za sintezu proteina kao i reakcije samo-replikacije, moe predstavljati vanu sponu za razumijevanje rane evolucije stanica.

Organizacija mRNA i inicijacija translacije

Premda su mehanizmi sinteze proteina u prokariotskim i eukariotskim stanicama slini, postoje i neke razlike, posebice u signalima koji odreuju mjesto poetka sinteze proteina na kalupu mRNA (Slika 7.7). Translacija ne zapoinje na 5' kraju mRNA, ve na specifinom inicijacijskom mjestu. Stoga su i kod prokariotskih i kod eukariotskih mRNA dijelovi na 5' kraju nekodirajui sljedovi, nazvani 5' podruje koje se ne prevodi. Eukariotska mRNA uglavnom kodira samo jedan polipeptidni lanac, ali mnoge prokariotske mRNA kodiraju vie polipeptida koji se sintetiziraju neovisno, s tim da sinteza zapoinje na zasebnim inicijacijskim mjestima. Primjerice, lac operon iz E. coli sadri tri gena koji se prevode sa iste mRNA (vidi Sliku 6.9). Glasnike RNA koje kodiraju vie polipeptida nazvane su policistronske, dok monocistronske mRNA kodiraju jedan polipeptidni lanac. Konano, i prokariotske i eukariotske mRNA zavravaju 3' podrujem koje se ne prevodi .

I u prokariotskim i u eukariotskim stanicama, translacija uvijek zapoinje aminokiselinom metioninom, koja je najee kodirana kodonom AUG. Alternativni inicijacijski kodoni, kao to je primjerice kodon GUG, se povremeno koriste kod bakterija, ali kad se nau na mjestu poetka polipeptidnog lanca ti kodoni odreuju ugradnju metionina, a ne aminokiseline koju normalno kodiraju (GUG je kodon za valin). Kod veine bakterija, sinteza proteina zapoinje modificiranim metioninskim ostatkom (N-formilmetioninom), dok kod eukariota sinteza zapoinje nemodificiranim metioninom (osim u mitohondrijima i kloroplastima, iji ribosomi slie bakterijskima).

Signali koji odreuju inicijacijske kodone razliiti su kod prokariotskih i eukariotskih stanica, to je u suglasju s razliitim funkcijama policistronskih i monocistronskih mRNA (Slika 7.8). Inicijacijskim kodonima u bakterijskim mRNA prethodi specifian slijed (nazvan slijed Shine-Delgarno, prema njegovim otkrivaima) koji sparujui se s bazama komplementarnog slijeda na 3' kraju 16S rRNA smjeta mRNA na ribosom za translaciju. Ovo sparivanje baza omoguava bakterijskim ribosomima zapoinjanje translacije ne samo na 5' kraju mRNA ve i na unutranjim inicijacijskim mjestima policistronske mRNA. Suprotno tome, kod eukariota ribosomi veinu mRNA prepoznaju vezanjem na 7-metilgvanozinsku kapu smjetenu na 5' kraju mRNA (vidi Sliku 6.41). Ribosomi, zatim, pretrauju mRNA nizvodno od 5' kraja sve dok ne naiu na inicijacijski kodon AUG. Sljedovi oko kodona AUG utjeu na uinkovitost inicijacije, pa se u nekim sluajevima dogaa da prvi AUG kodon u mRNA bude preskoen te da translacija zapone na sljedeem AUG kodonu koji se nalazi nizvodno. Takoer treba spomenuti da nekoliko virusnih i neke stanine mRNA imaju unutranja mjesta ulaza ribosoma, pa na njima translacija moe zapoeti vezanjem ribosoma na unutranji poloaj na mRNA. Ipak, translacija veine eukariotskih mRNA zapoinje na mjestu odreenom pretraivanjem od 5' kraja to je u skladu s njihovom monocistronskom porukom koja kodira samo jedan polipeptid.

Proces translacije

Proces translacije ili prevoenja mogue je openito podijeliti u tri stupnja: inicijaciju, elongaciju i terminaciju (Slika 7.9). I kod prokariota i kod eukariota prvi je korak inicijacijskog stupnja vezanje specifine inicijatorske metionil-tRNA i mRNA za malu ribosomsku podjedinicu. Zatim se ovom kompleksu pridruuje velika ribosomska podjedinice, ime je stvoren funkcionalni ribosom na kojem se dalje nastavlja proces elongacije polipeptidnog lanca. Za odvijanje pojedinih stupnjeva procesa translacije nuna je prisutnost brojnih specifinih neribosomskih proteina (Tablica 7.1).

Kod bakterija prvi translacijski korak predstavlja vezanje tri inicijacijska faktora (IF-1, IF-2 i IF-3) na 30S ribosomsku podjedinicu (Slika 7.10). Kompleksu se zatim pridruuju mRNA i inicijatorska N-formilmetionil-tRNA, koju specifino prepoznaje IF-2 (na koji je vezan GTP). Potom se otputa IF-3, ime je omogueno pridruivanje ribosomske podjedinice 50S. Ovo pridruivanje potie hidrolizu GTP vezanog za IF-2, to zatim dovodi do otputanja i IF-1 i IF-2 (na koji je sad vezan GDP). Time nastaje inicijacijski kompleks 70S (s mRNA i inicijatorskom tRNA koje su vezane na ribosom) koji je spreman zapoeti stvaranje peptidne veze tijekom elongacijskog stupnja translacije.

Inicijacija je kod eukariota mnogo sloenija i zahtjeva barem deset proteina (svaki se sastoji od vie polipeptidnih lanaca), nazvanih eIF (eukariotski inicijacijski faktori; vidi Tablicu 7.1). Faktori eIF-1, eIF-1A, eIF-3 i eIF-5 veu se za 40S ribosomsku podjedinicu, a eIF-2 (koji je prisutan u kompleksu s GTP) se vee na inicijatorsku metionil-tRNA (Slika 7.11). Glasniku RNA prepoznaju i na ribosom donose faktori skupine eIF-4. Elongacijski faktor eIF-4E prepoznaje 5' kapu glasnike mRNA, dok se eIF-4G vee i na eIF-4E i na protein (protein koji vee poli-A ili PABP) povezan s poli-A repom na 3' kraju mRNA. Na taj nain, eukariotski inicijacijski faktori prepoznaju i 5' i 3' kraj mRNA, to objanjava stimulatorni uinak poliadenilacije na translaciju. Inicijacijski faktori eIF-4E i eIF-4G, zajedno s faktorima eIF-4A i eIF-4B zatim donose mRNA na ribosomsku podjedinicu 40S, pri emu faktor eIF-4G stupa u interakciju s faktorom eIF-3. Ribosomska podjedinica 40S zajedno s vezanom metionil-tRNA i elongacijskim faktorima pretrauje mRNA kako bi otkrila inicijacijski AUG kodon. Kada je kodon AUG pronaen, faktor eIF-5 potie hidrolizu GTP vezanog na faktor eIF-2. Inicijacijski se faktori (ukljuujui eIF-2 na koji je sada vezan GDP) zatim otputaju, a podjedinica 60S se vee na podjedinicu 40S te nastaje inicijacijski kompleks 80S eukariotskih stanica.

Nakon nastanka inicijacijskog kompleksa, slijedi elongacija polipeptidnog lanca. Mehanizam elongacije je kod prokariota i eukariota vrlo slian (Slika 7.12). Na ribosomu postoje tri mjesta za vezanje tRNA, nazvana mjesto P (peptidil), mjesto A (aminoacil) i mjesto E (izlazno, engl. exit). Inicijatorska metionil tRNA vezana je na mjesto P. Prvi je korak elongacije vezanje sljedee aminoacil-tRNA na mjesto A to se odvija putem sparivanja baza antikodona s bazama drugog kodona na mRNA. Aminoacil -tRNA do ribosoma prati elongacijski faktor (EF-Tu kod prokariota, eEF-1 kod eukariota) koji se nalazi u kompleksu s GTP. Odabir ispravne aminoacil -tRNA za ugradnju aminokiseline u rastui polipeptidni lanac kljuan je korak koji odreuje tonost proteinske sinteze. Premda se ovaj odabir temelji na sparivanju baza kodona mRNA i baza antikodona na tRNA, samo sparivanje baza nije dovoljno da bi se osigurala tonost proteinske sinteze kojoj je uestalost pogreke manja od 10-3. Ovako veliku tonost osigurava dekodirajui centar u maloj ribosomskoj podjedinici, koji prepoznaje pravilno spojene kodon-antikodon bazne parove, odnosno razlikuje ih od nepravilno spojenih. Smjetanje ispravne aminoacil-tRNA u mjesto A potie konformacijsku promjenu koja inducira hidrolizu GTP vezanog na EF-Tu te otputanje ovog elongacijskog faktora na koji je sada vezan GDP. Nedavne su strukturne studije ribosoma poluile znaajan rezultat prema kojem se prepoznavanje pravilnog kodon-antikodon para u dekodirajuem centru, kao i peptidil-transferazna aktivnost, temelji prvenstveno na aktivnosti ribosomske RNA, a ne proteina.

Jednom kada je EF-Tu (ili eEF-1) napustio ribosom, izmeu inicijatorske metionil-tRNA smjetene u mjestu P i druge aminoacil-tRNA smjetene u mjestu A, moe nastati peptidna veza. U ovoj reakciji, koju katalizira velika ribosomska jedinica, kljunu ulogu ima RNA (kao to je prethodno objanjeno). Rezultat je prijenos metionina na aminoacil-tRNA, smjetenu u mjestu A ribosoma, pri emu na tom mjestu nastaje peptidil-tRNA, a nenabijena inicijatorska tRNA naputa mjesto P. Sljedei korak elongacije je translokacija, za koju je potreban drugi elongacijski faktor (EF-G kod prokariota, a eEF-2 kod eukariota). Ovaj je korak, kao i prethodni, praen hidrolizom GTP. Za vrijeme translokacije, ribosom se pomie za tri nukleotida uzdu mRNA, smjetajui sljedei kodon u prazno mjesto A. Ovim se korakom peptidil-tRNA iz mjesta A premjeta u mjesto P, a nenabijena tRNA iz mjesta P u mjesto E. Time ribosom ostaje s peptidil-tRNA smjetenom u mjestu P i praznim mjestom A. Vezanje nove aminoacil-tRNA u mjesto A potie otputanje nenabijene tRNA iz mjesta E, ime je ribosom spreman za ugradnju nove aminokiseline u rastui polipeptidni lanac.

Kako se elongacija nastavlja, EF-Tu (ili eEF-1) koji je s ribosoma otputen u kompleksu s GDP mora biti vraen u oblik EF-Tu/GTP (Slika 7.13). Za ovu pretvorbu potreban je trei elongacijski faktor, EF-Ts (eEF-1 kod eukariota) koji se vee na EF-Tu/GDP kompleks i potie zamjenu vezanog GDP s GTP. Rezultat ove izmjene je obnavljanje kompleksa EF-Tu/GTP, koji je sada spreman za praenje nove aminoacil -tRNA u mjesto A na ribosomu, ime zapoinje novi ciklus elongacije. Regulacija EF-Tu putem vezanja i hidrolize GTP tipian je primjer regulacije proteinske aktivnosti. Slini mehanizmi kontroliraju aktivnosti mnotva proteina ukljuenih u regulaciju staninog rasta i regulacije, kao i transporta i sekrecije proteina.

Elongacija polipeptidnog lanca nastavlja se sve dok u mjesto A na ribosomu ne doe stop kodon (UAA, UAG ili UGA). Stanice ne sadre transportne RNA s antikodonima koji su komplementarni ovim terminacijskim signalima; umjesto toga postoje faktori za otputanje koji prepoznaju ove signale i zavravaju sintezu proteina (Slika 7.14). Prokariotske stanice sadre dva faktora za otputanje koji prepoznaju terminacijske kodone: faktor RF-1 prepoznaje UAA ili UAG, a faktor RF-2 prepoznaje UAA ili UGA (vidi Tablicu 7.1). U eukariotskim stanicama prisutan je samo jedan i faktor za otputanje (eRF-1) koji prepoznaje sva tri terminacijska kodona. I prokariotske i eukariotske stanice sadre takoer i trei faktor za otputanje (RF-3 kod prokariota, a eRF-3 kod eukariota). On ne prepoznaje specifini terminacijski kodon, ve djeluje zajedno s RF-1 (ili eRF-1) i RF-2. Faktori za otputanje se veu na terminacijski kodon u mjestu A i potiu hidrolizu veze izmeu tRNA i polipeptidnog lanca u mjestu P, to rezultira otputanjem dovrenog polipeptida s ribosoma. Zatim se otputa tRNA, a ribosomske podjedinice i kalup mRNA disociraju. I kod prokariota i kod eukariota sinteza proteina iz glasnike RNA moe se odvijati istovremeno na nekoliko ribosoma. Jednom, kada se ribosom makne s inicijacijskog mjesta, drugi se ribosom moe vezati na mRNA i zapoeti sintezu novog polipeptidnog lanca, tako da se mRNA uglavnom prevode serijom ribosoma koji su meusobno udaljeni 100-200 nukleotida (Slika 7.15). Skupina ribosoma vezana na jednu molekulu RNA naziva se poliribosom ili polisom. Svaki ribosom unutar skupine funkcionira neovisno, to rezultira nastajanjem zasebnih polipeptidnih lanaca.

Regulacija translacije

Premda je transkripcija primarna razina na kojoj se odvija kontrola ekspresije gena, translacija mRNA je takoer regulirana, kako kod prokariotskih, tako i kod eukariotskih stanica. Jedan nain regulacije translacije je vezanje represorskih proteina koji sprjeavaju translaciju na specifine slijedove mRNA. Dobro prouen primjer ovog mehanizma kod eukariotskih stanica jest regulacija sinteze feritina, proteina koji pohranjuje eljezo unutar stanice. Translaciju feritina regulira dostupnost eljeza: vie se feritina sintetizira kada je eljezo prisutno (Slika 7.16). Ova je regulacija posredovana proteinom koji se, kada eljezo nije prisutno, vee za slijed na 5' podruju koje se ne prevodi mRNA za feritin, koji je nazvan element odgovora na eljezo (engl. iron response element ili IRE) te se na taj nain blokira translaciju feritina. U prisutnosti eljeza, represor se ne vee na IRE, pa se translacija moe dalje odvijati.

Zanimljivo je da je regulacija translacije mRNA za feritin putem eljeza slina regulaciji stabilnosti mRNA za transferinski receptor o emu je bilo govora u prethodnom poglavlju (vidi Sliku 6.51). Naime, stabilnost mRNA za transferinski receptor regulirana je vezanjem proteina na IRE koji se nalazi u njezinom 3' podruju koje se ne prevodi . Isti se protein vee i na slijed IRE u mRNA za feritin i u mRNA za transferin. Meutim, posljedice vezanja istog proteina na IRE sljedove su razliite. Vezanje proteina na IRE u mRNA za transferinski receptor titi mRNA od razgradnje, a ne inhibira njezinu translaciju. Ovi razliiti uinci prvenstveno su posljedica razliitog smjetaja IRE sljedova u ovim dvjema mRNA. Da bi djelovala kao mjesto za vezanje represora, IRE mora biti smjetena unutar 70 nukleotida od 5' kraja mRNA za transferin, to upuuje na to da vezanje proteina na IRE blokira translaciju tako to interferira s prepoznavanjem kape (na 5' kraju mRNA) i s vezanjem na 40S ribosomsku podjedinicu. S druge pak strane, vezanje proteina na isti slijed smjeten unutar 3' podruja koje se ne prevodi mRNA za transferinski receptor titi mRNA od razgradnje nukleazama. Na taj nain, vezanje istog regulatornog proteina na razliita mjesta unutar molekule mRNA moe imati razliite uinke na gensku ekspresiju; u jednom sluaju inhibira translaciju, a u drugom stabilizira mRNA pojaavajui sintezu proteina.

Regulacija translacije iznimno je vana tijekom ranog razvoja organizma. Kao to je bilo govora u Poglavlju 6. u oocitama je mnotvo mRNA pohranjeno u netranslatiranom obliku; translacija ovih pohranjenih mRNA aktivira se fertilizacijom ili u kasnijim fazama razvoja. Jedan od mehanizama ovakve regulacije translacije je kontrolirana poliadenilacija oocitnih mRNA. U oocitama je pohranjeno mnotvo netranslatiranih mRNA s kratkim poli-A repovima (priblino 20 nukleotida). U odgovarajuem stadiju razvoja pohranjene se mRNA potiu na translaciju produljenjem njihovih poli-A repova do nekoliko stotina nukleotida. Uz to, ini se da je translacija nekih mRNA tijekom razvoja regulirana represorskim proteinima koji se veu na specifine sljedove u 3' podruja koje se ne prevodi .

Proteini koji se veu na 3' podruja koja se ne prevode mRNA odgovorni su i za smjetaj molekula mRNA u specifina podruja u stanici, ime je omoguena sinteza proteina u specifinim unutarstaninim podrujima. Smjetaj molekula mRNA vaan je dio regulacije translacije u mnogim staninim tipovima, ukljuujui jajaca, embrije, ivane stanice i pokretne fibroblaste. Primjerice, smjetaj molekula mRNA u specifinom podruju jajaca ili embrija igra vanu ulogu u razvoju tako to osigurava odvijanje sinteze proteina u odgovarajuem mjestu razvijajueg embrija (Slika 7.17). Smjetaj molekula mRNA usko je povezan s regulacijom njihove translacije, tako da se proteini koje te mRNA kodiraju sintetiziraju tek kada se, u odgovarajuem razvojnom stadiju, mRNA pravilno smjesti.

Nedavne su studije pokazale da translacija mRNA, osim proteinima, moe biti regulirana i nekodirajuim molekulama RNA koje su homologne dijelu mRNA slijeda. Veina ovih nekodirajuih regulatornih RNA male su dvolanane molekule koje potiu razgradnju svoje ciljne mRNA putem mehanizma RNA-interferencije (vidi sliku 3.41). Uloga ovih nekodirajuih RNA molekula iznimno je dobro prouena kod biljaka: u biljci Arabidopsis thaliana identificirano je priblino pedesetak gena ija je translacija regulirana ovim mehanizmom.

Drugi mehanizam regulacije translacije u eukariotskim stanicama, koji rezultira globalnim uinkom na cjelokupnu translacijsku aktivnost vie nego na translaciju specifinih mRNA, ukljuuje modulaciju aktivnosti inicijacijskih faktora, posebice faktora eIF-2 i eIF-4E. Kao to je ve objanjeno, faktor eIF-2 se (u kompleksu s GTP) vee s inicijatorskom metionil-tRNA i donosi je na ribosom. Zatim slijedi otputanje faktora eIF-2, to je praeno hidrolizom GTP, a ime eIF-2, sada u kompleksu s GDP, postaje neaktivan. Da bi sudjelovao u sljedeem ciklusu inicijacije, kompleks eIF-2/GTP se mora regenerirati putem izmjene vezanog GDP za GTP (vidi sliku 7.18). Ova je izmjena posredovana faktorom eIF-2B. Kontrola aktivnosti eIF-2 putem vezanja/hidrolize GTP slina je stoga kontroli aktivnosti faktora EF-Tu (vidi sliku 7.13). Na taj nain, regulacija aktivnosti faktora eIF-2 osigurava kljunu kontrolnu toku u mnogim eukariotskim stanicama. tovie, faktori eIF-2 i eIF-2B mogu biti fosforilirani regulatornim protein-kinazama. Ove fosforilacije inhibiraju izmjenu vezanog GDP s GTP, te na taj nain inhibiraju inicijaciju translacije. Primjerice, ako stanicama sisavaca nedostaju faktori rasta, protein-kinaze koje fosforiliraju faktor eIF-2B postaju aktivne, inhibirajui nadalje sintezu proteina.

Regulacija aktivnosti faktora eIF-4E, koji se vee na 5' kapu molekula mRNA, druga je kljuna toka kontrole sinteze proteina faktorima rasta. Primjerice, faktori rasta koji potiu sintezu proteina u stanicama sisavaca aktiviraju protein-kinaze koje fosforiliraju regulatorne proteine koji veu faktor eIF-4E (nazvane proteini koji veu eIF-4E ili 4E-BP). U odsutnosti odgovarajuih faktora rasta, nefosforilirani 4E-BP veu faktor eIF-4E te inhibiraju translaciju tako to ometaju interakciju faktora eIF-4E i faktora eIF-4G (vidi Sliku 7.11). Kada su faktori rasta prisutni u dovoljnoj koliini, fosforilacija faktora 4E-BP sprjeava njihovu interakciju s faktorom eIF-4E, to dovodi do pojaane inicijacije translacije.

Smatanje i procesiranje proteina

Translacijom je zavren protok genetike informacije unutar stanice. Slijed nukleotida u DNA sada je preveden u slijed aminokiselina u polipeptidnom lancu. Ipak, sinteza polipeptida ne odgovara u potpunosti stvaranju funkcionalnog proteina. Da bi bio uporabljiv, polipeptid se mora smotati u specifinu trodimenzionalnu konformaciju, a u mnogo sluajeva vie se polipeptidnih lanaca mora udruiti u funkcionalni kompleks. Uz to, mnogi proteini podlijeu daljnjim modifikacijama, izmeu ostalog kidanju te kovalentnom vezanju ugljikohidrata i lipida , to je kljuno za njihovu funkciju i pravilan smjetaj unutar stanice.

aperoni i smatanje proteina

Trodimenzionalna je konformacija proteina posljedica interakcija izmeu bonih ogranaka aminokiselina koje ih izgrauju, kao to je objanjeno u Poglavlju 2. Prema klasinoj postavci o smatanju proteina, sve informacije potrebne da bi protein zauzeo pravilnu trodimenzionalnu konformaciju sadrane su u njegovom aminokiselinskom slijedu. Ta postavka potjee od eksperimenata Christiana Anfinsena koji su pokazali da se u uvjetima in vitro denaturirana RNaza ponovo spontano smata u svoju aktivnu konformaciju (vidi Sliku 2.17). Na temelju tih podataka inilo se da je smatanje proteina samo-udruujui proces za koji nisu potrebni dodatni stanini imbenici. No nedavne su studije pokazale da ovaj opis ne odgovara u potpunosti smatanju proteina unutar stanice. Pravilno smatanje proteina unutar stanice posredovano je aktivacijom drugih proteina.

Proteini koji olakavaju smatanje drugih proteina nazvani su molekularni aperoni. Pojam "aperon" prvi su upotrijebili Ron Laskey i suradnici da bi opisali protein (nukleoplazmin) koji je bio potreban za stvaranje nukleosoma iz histona i DNA. Nukleoplazmin se vee na histone i posreduje njihovo udruivanje u nukleosome, ali se sam nukleoplazmin ne ugrauje u konanu strukturu nukleosoma. aperoni na taj nain djeluju kao katalizatori koji olakavaju udruivanje, a da se pri tome ne ugrauju u kompleks. Studije koje su slijedile proirile su koncept, pa se danas tim imenom nazivaju proteini koji posreduju u mnogim drugim procesima udruivanja, posebice u smatanju proteina.

Vano je uoiti da aperoni ne prenose dodatne informacije potrebne za smatanje polipeptida u njihove pravilne trodimenzionalne konformacije ve da je krajnja konformacija proteina odreena iskljuivo slijedom aminokiselina. Ipak, aperoni kataliziraju smatanje proteina pomaui u procesu samosmatanja. Oni djeluju tako to se veu i stabiliziraju nesmotane ili djelomino smotane polipeptide koji su meuprodukti procesa koji vodi do konanog pravilno smotanog oblika. U odsutnosti aperona, nesmotani ili djelomino smotani polipeptidni lanci bili bi nestabilni unutar stanice, pa bi se smatali nepravilno ili bi se agregirali u netopljive komplekse. Vezanje aperona stabilizira ove nesmotane polipeptide ime se sprjeava nepravilno smatanje i agregacija, te na taj nain omoguava smatanje polipeptidnog lanca u njegovu pravilnu konformaciju.

Dobar su primjer aperoni koji se veu na polipeptidni lanac u nastajanju, koji se jo uvijek prevodi na ribosomu, te na taj nain sprjeavaju nepravilno smatanje ili agregaciju amino-terminalnog dijela polipeptida prije nego to je sinteza cijelog lanca zavrena (Slika 7.19). Proteini se smataju u domene izgraene od 50 do 300 aminokiselinskih ostataka, pa je nuno da se lanac u nastajanju zatiti od nepravilnog smatanja ili agregacije s drugim proteinima sve dok sinteza itave domene nije zavrena i protein moe biti smotan u svoju pravilnu konformaciju. Vezanje aperona stabilizira amino-terminalni dio u nesmotanoj konformaciji sve dok preostali dio polipeptidnog lance ne bude sintetiziran, odnosno dok se dovreni protein ne moe pravilno smotati. aperoni takoer stabiliziraju nesmotane polipeptidne lance za vrijeme njihovog transporta u stanine organele primjerice, za vrijeme transporta proteina iz citosola u mitohondrije (Slika 7.20). Proteini se kroz mitohondrijsku membranu prenose u djelomino smotanoj konformaciji koja je stabilizirana aperonima iz citosola. Zatim aperoni unutar mitohondrija olakavaju prijelaz polipeptidnog lanca kroz membranu te njegovo smatanje unutar organele. Uz to, aperoni sudjeluju i u udruivanju proteina koji su izgraeni od vie polipeptidnih lanaca te njihovom udruivanju u makromolekularne strukture (primjerice, nukleoplazmin).

Mnogi proteini za koje je danas poznato da djeluju kao molekularni aperoni (Tablica 7.2) prvotno su otkriveni kao proteini toplinskog oka, skupina proteina koja se eksprimira u stanicama koje su bile izloene povienim temperaturama ili drugim oblicima stresa iz okoline. Smatra se da proteini toplinskog oka (Hsp, od engl. heat-shock protein) koji su visoko-ouvani kod prokariotskih i eukariotskih stanica, stabiliziraju i olakavaju ponovno smatanje proteina koji su bili djelomino denaturani uslijed izlaganja povienoj temperaturi. Meutim, mnogi su lanovi porodice proteina toplinskog oka eksprimirani i imaju esencijalnu funkciju u stanici i pod normalnim uvjetima rasta. Ovi proteni slue kao molekularni aperoni koji su potrebni za smatanje proteina i njihov transport pod normalnim uvjetima jednako kao u stanicama izloenim stresu iz okoline.

Porodice proteina toplinskog oka Hsp70 i Hsp60 iznimno su vane za cjelokupan proces smatanja proteina u prokariotskim i eukariotskim stanicama. Proteini obje porodice djeluju tako to se veu na nesmotane dijelove polipeptidnih lanaca. lanovi porodice Hsp70 stabiliziraju nesmotane polipetidne lance tijekom translacije (vidi za primjer sliku 7.19) kao i za vrijeme transporta polipeptida u razliite unutarstanine odjeljke, kao to su mitohondriji i endoplazmatski retikul. Ovi se proteini veu za kratke hidrofobne djelove (od priblino sedam aminokiselinskih ostataka) nesmotanog polipeptida, zadravajui polipeptidni lanac u njegovoj nesmotanoj konformaciji i sprijeavajui agregaciju.

lanovi porodice Hsp60 (takoer nazvani aperonini) olakavaju smatanje proteina u njihove nativne konformacije. Svaki se aperonin sastoji od 14 podjedinica, od kojih je svaka veliine priblino 60 kilodaltona (kd). Ureene su u dva nadsloena prstena, ime stvaraju strukturu "dvostrukog prstena" (Slika 7.21). Nesmotani polipeptidni lanci zatieni su od citosola tako to se veu unutar sredinje upljine aperoninskog cilindra. U ovom izoliranom okruenju smatanje proteina moe se nastaviti, dok je agregacija nesmotanih dijelova polipeptidnog lanca sprijeena njihovim vezanjem za aperonin. Vezanje nesmotanih polipeptida reverzibilna je reakcija koja je povezana s hidrolizom ATP, koji slui kao izvor energije. Time hidroliza ATP osigurava viestruko ponavljanje otputanja i ponovnog vezanja nesmotanih regija polipeptida za aperonin, ime se omoguava postupno smatanje polipeptida u pravilnu konformaciju.

U nekim sluajevima, lanovi porodica Hsp70 i Hsp60 djeluju u slijedu jedni iza drugih. Primjerice, lanovi porodice Hsp70 i Hsp60 djeluju u slijedu tijekom transporta proteina u mitohondrij i za vrijeme smatanja novosintetiziranih proteina u E. coli (Slika 7.22). Prvo aperon Hsp70 stabilizira polipeptidni lanac u nastanku sve dok proteinska sinteza nije zavrena. Zatim se nesmotani polipeptidni lanac prenosi na aperonin Hsp60, u kojem se odvija smatanje proteina, pri emu nastaje protein pravilno smotan u svoju funkcionalnu trodimenzionalnu konformaciju. lanovi porodice Hsp70 i Hsp60 naeni su u citosolu i u staninim organelama (primjerice mitohondrijima) eukariotskih stanica kao i u bakterijama (vidi tablicu 7.2), tako da se ini da djelovanje Hsp70 i Hsp60 u slijedu predstavlja opi put smatanja proteina. Alternativni put smatanja nekih proteina u citosolu i endoplazmatskom retikulu ukljuuje djelovanje lanova porodica Hsp70 i Hsp90. Veina supstrata za smatanje uz Hsp90 su proteini koji sudjeluju u prijenosu signala, ukljuujui receptore steroidnih hormona i razliite proteinske kinaze.

Enzimi i smatanje proteina

Osim aperona, koji olakavaju smatanje proteina vezanjem i stabilizacijom djelomino smotanih meuprodukata, stanice sadre najmanje dvije vrste enzima koji kataliziraju smatanje proteina. Stvaranje disulfidnih veza izmeu cisteinskih ostataka vano je za stabilizaciju smotanih struktura mnogih proteina (vidi Sliku 2.16). Protein-disulfid-izomeraze, koje je 1963. godine otkrio Christian Anfinsen, kataliziraju kidanje i ponovno stvaranje ovih veza (Slika 7.23). Za proteine koji sadre vie cisteinskih ostataka, protein-disulfid-izomeraze (PDI) imaju vanu ulogu u poticanju brze izmjene izmeu sparenih disulfida, omoguavajui time proteinu zadravanje obrasca disulfidnih veza koji je kompatibilan s njegovom stabilno smotanom konformacijom. Disulfidne su veze uglavnom prisutne kod sekretornih proteina i nekih membranskih proteina jer citosol sadri reducirajue agense koji odravaju cisteinske ostatke u reduciranom (SH) obliku, sprjeavajui na taj nain stvaranje disulfidne (SS) veze. U eukariotskim stanicama disulfidne veze nastaju u endoplazmatskom retikulu, u kojem se odravaju oksidativni uvjeti. U suglasju s ulogom disulfidnih veza u stabilizaciji sekretornih proteina, aktivnost PDI u endoplazmatskom je retikulu u korelaciji s razinom sekrecije proteina u razliitim staninim tipovima.

Drugi enzim koji sudjeluje u procesu smatanja proteina katalizira izomerizaciju peptidnih veza u kojima sudjeluje prolin. (Slika 7.24). Prolin je neobina aminokiselina po tome to je u ravnotei izmeu cis i trans konfiguracije peptidnih veza koje prethode prolinskom ostatku, trans oblik je tek blago favoriziran. Suprotno tome, peptidne veze izmeu drugih aminokiselina su gotovo uvijek u trans obliku. Izomerizacija izmeu cis i trans konfiguracija peptidnih veza koje prethode prolinskom ostatku, koja moe s druge strane predstavljati ograniavajui korak u proteinskom smatanju, katalizirana je enzimom peptidil-prolil-izomerazom. Ovaj enzim iroko je rasprostranjen i kod prokariotskih i kod eukariotskih stanica i igra vanu ulogu u smatanju nekih proteina.

Kidanje proteina

Kidanje polipeptidnog lanca (proteoliza) vaan je korak u sazrijevanju nekih proteina. Jednostavan je primjer uklanjanje inicijatorskog metionina s amino kraja mnogih polipeptida, koji se odvija neposredno nakon to je amino-kraj rastueg polipeptidnog lanca izronio iz ribosoma. Dodatne kemijske skupine, kao to su acetatna skupina ili lanci masnih kiselina (o emu e se uskoro raspravljati) esto se dodaju na amino-terminalni ostatak.

Proteolitike modifikacije amino-kraja vane su takoer i za prijenos mnogih proteina kroz membrane, ukljuujui sekretorne proteine kod bakterija i eukariota, kao i proteina predodreenih za ugradnju u staninu membranu, lizosome, mitohondrije i kloroplaste eukariotskih stanica. Ovi su proteini usmjereni za prijenos do svojih odredita putem amino-terminalnog slijeda koji se uklanja proteolitikim kidanjem kad protein proe kroz membranu. Primjerice, amino-terminalni signalni slijed, dug najee dvadesetak aminokiselina, usmjerava mnoge sekretorne proteine u staninu membranu bakterija ili u endoplazmatski retikul eukariotskih stanica dok je translacija jo uvijek u tijeku (Slika 7.25). Signalni slijed, koji se uglavnom sastoji od hidrofobnih aminokiselina, uranja u membranski kanal neposredno nakon to izroni iz ribosoma. Kako se translacija odvija, ostatak polipeptidnog lanca prolazi kroz kanal u membrani. Zatim se signalni slijed uklanja kidanjem pomou specifinih membranskih proteaza (signalne peptidaze), a zreli se protein otputa. U eukariotskim stanicama, translokacija rastueg polipeptidnog lanca u endoplazmatski retikul predstavlja prvi korak u usmjeravanju proteina za sekreciju, ugradnju u staninu membranu ili ugradnju u lizosome. O mehanizmima koji usmjeravaju transport proteina na ova odredita, kao i o ulozi drugih usmjeravajuih sljedova u prijenosu proteina u mitohondrije i kloroplaste biti e vie govora u Poglavljima 9 i 10.

Drugi vaan oblik proteolitikog procesiranja je stvaranje aktivnih enzima ili hormona, kidanjem veih pretea prekursora. Dobar je primjer inzulin, koji se sintetizira kao dugi prekursorski polipeptid, a konani oblik nastaje dvostrukim kidanjem. Poetni prekursor (preproinzulin) sadri amino-terminalni slijed koji usmjerava polipeptidni lanac u endoplazmatski retikul (Slika 7.26). Uklanjanjem signalnog slijeda tijekom prijenosa u endoplazmatski retikul nastaje drugi prekursor, nazvan proinzulin. Ovaj se prekursor zatim prevodi u inzulin (koji se sastoji od dva lanca povezana disulfidnim vezama) proteolitikim uklanjanjem unutranjeg dijela peptida. Drugi proteini aktivirani slinim procesima kidanja su probavni proteini i proteini ukljueni u zgruavanje krvi.

Zanimljivo je uoiti da proteini mnogih animalnih virusa nastaju kidanjem veih prekursora. Jedan iznimno vaan primjer uloge proteolize u replikaciji virusa naen je u HIV. Tijekom replikacije virusa HIV, proteaza koja je kodirana u virusu kida polipeptidni prekursor pri emu nastaje virusni strukturni protein. Zbog sredinje uloge u replikaciji virusa, proteaze iz HIV-a (uz reverznu transkriptazu) vana su meta za razvoj lijekova za terapiju AIDS-a. Danas su, uistinu, inhibitori proteaza meu najuinkovitijim agensima dostupnim za borbu protiv ove bolesti.

Glikozilacija

Mnogi proteini, posebice u eukariotskim stanicama, modificirani su dodatkom ugljikohidrata, u procesu nazvanom glikozilacija. Proteini na koje je vezan ugljikohidratni lanac (nazvani glikoproteini) uglavnom se izluuju ili su smjeteni na staninoj povrini, premda su mnogi jezgreni i citosolni proteini takoer glikozilirani. Ugljikohidratni dijelovi glikoproteina imaju vanu ulogu u smatanju proteina u endoplazmatskom retikulu, u usmjeravanju proteina u odgovarajue stanine odjeljke, te kao mjesta prepoznavanja u meustaninim interakcijama.

Ovisno o mjestu vezanja ugljikohidratnog bonog lanca, glikoproteini su podijeljeni na N-vezane ili O-vezane (Slika 7.27). Kod N-vezanih glikoproteina, ugljikohidrat je vezan na duikov atom bonog ogranka asparagina. Kod O-vezanih glikoproteina, mjesto vezanja ugljikohidrata je kisikov atom bonog ogranka serina ili treonina. eeri izravno vezani na te poloaje su N-acetilglukozamin kod N-vezanih eera i N-acetilgalaktozamin kod O-vezanih eera.

Veina glikoproteina u eukariotskim stanicama predodreena je za sekreciju ili ugradnju u staninu membranu. Ovi se proteini najee prenose u endoplazmatski retikul (to obuhvaa kidanje signalnog slijeda) dok njihova translacija jo uvijek traje. Glikozilacija, takoer, zapoinje u endoplazmatskom retikulu prije nego to je translacija u potpunosti zavrena. Prvi je korak prijenos osnovnog oligosaharida izgraenog od 14 eernih ostataka (2 N-acetilglukozamina, 3 glukoze i 9 manoza) na asparagin rastueg polipeptidnog lanca (Slika 7.28). Oligosaharid je s endoplazmatskim retikulom povezan putem lipidnog nosaa (dolikol-fosfat). Oligosaharid se zatim se prenosi na intaktnu jedinicu akceptorskog asparagina (Asn) smjetenog unutar slijeda Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr (gdje je X bilo koja aminokiselina osim prolina).

Tijekom daljnjeg procesiranja osnovni se N-vezani oligosaharid modificira. Dok se glikoprotein nalazi u endoplazmatskom retikulu, uklanjaju se tri glukozna ostatka i jedna manoza. Oligosaharid se dodatno modificira u Golgijevom aparatu u kojeg se glikoproteini prenose iz endoplazmatskog retikula. Ove modifikacije (o kojima e vie rijei biti u Poglavlju 9) obuhvaaju i uklanjanje i dodavanje ugljikohidratnih ostataka kako glikoprotein prolazi kroz odjeljke Golgijevog aparata (Slika 7.29). N-vezani oligosaharidi razliitih glikoproteina procesiraju se u razliitoj mjeri, ovisno o enzimima koji su prisutni u razliitim stanicama kao i o dostupnosti oligosaharida enzimima koji kataliziraju ove modifikacije. Glikoproteini s nedostupnim oligosaharidima ne dobivaju nove eere u Golgiju. Relativno jednostavni oligosaharidi ovih glikoproteina nazivaju se oligomanozni oligosaharidi jer sadre velik udio manoznih ostataka, a slini su osnovnom oligosaharidu prvotno dodanom u endoplazmatskom retikulu. Suprotno tome, glikoproteini s dostupnim oligosaharidima intenzivno se procesiraju to rezultira stvaranjem raznolikih kompleksnih oligosaharida.

O-vezani oligosaharidi se na polipeptide takoer dodaju u Golgijevom aparatu. Suprotno N-vezanim oligosaharidima, O-vezani oligosaharidi nastaju dodavanjem jednog po jednog eera i najee se sastoje od samo nekoliko ostataka (Slika 7.30). Mnogi citoplazmatski i jezgreni proteini, ukljuujui mnoge transkripcijske faktore, modificirani su dodatkom jednog O-vezanog N-acetilglukozaminskog ostatka, to je katalizirano drugim enzimskim sustavom. Meutim, uloga ugljikohidrata u funkciji ovih citoplazmatskih i jezgrenih glikoproteina jo nije razjanjena.

Vezanje lipida

Neki proteini eukariotskih stanica modificirani su vezanjem lipida na polipeptidni lanac. Ove modifikacije najee slue za usmjeravanje i sidrenje proteina u staninu membranu, u koju se hidrofobni lipid moe uklopiti (vidi Sliku 2.48). Uobiajena su tri tipa lipidnih modifikacija N-miristilacija, prenilacija i palmitacija, i to na eukariotskim lipidima koji su povezani s citosolnom stranom stanine membrane. etvrti tip modifikacije, dodatak glikolipida, ima vanu ulogu u sidrenju nekih povrinskih proteina u vanjsku stranu stanine membrane.

Na neke se proteine masna kiselina vee na amino-kraj rastueg polipeptidnog lanca za vrijeme translacije. U tom procesu, nazvanom N-miristilacija, miristinska kiselina (masna kiselina izgraena od 14 ugljikovih atoma) vee se na N-terminalni glicin (Slika 7.31). Glicin je esto druga po redu aminokiselina ugraena u polipeptidni lanac, a inicijatorski se metionin uklanja proteolizom prije dodatka masne kiseline. Mnogi proteini koji su modificirani N-miristilacijom povezani su s unutranjom stranom stanine membrane. Ulogu masne kiseline u tom povezivanju jasno su pokazale analize mutiranih proteina kod kojih je N-terminalni glicin zamijenjen alaninom. Ovom je zamjenom sprijeena miristilacija te je blokirana funkcija mutiranih proteina time to je onemogueno njihovo povezivanje s membranom.

Lipidi na protein mogu biti vezani i preko bonih ogranaka cisteina, serina ili treonina. Vaan primjer ovog tipa modifikacije je prenilacija, u kojoj su specifini tipovi lipida (prenilne skupine) vezani na sumporne atome bonih ogranaka cisteina smjetenih na C-kraju polipeptidnog lanca (Slika 7.32). Mnogi proteini vezani na staninu membranu, koji sudjeluju u kontroli staninog rasta i diferencijacije, modificirani su na ovaj nain, primjerice onkogeni proteini Ras koji su odgovorni za nekontroliran rast mnogih tumora kod ovjeka (vidi Poglavlje 15). Prenilacija se kod ovih proteina odvija u tri koraka. Prvo se prenilna skupina dodaje na cistein koji je od karboksilnog kraja polipeptidnog lanca udaljen tri aminokiseline. Prenilne skupine koje se dodaju u ovoj reakciji su ili farnezil (15 ugljikovih atoma, prikazan na Slici 7.32) ili geranil-geranil (20 ugljikovih atoma). Zatim se aminokiseline iza cisteinskog ostatka uklanjaju, ime cistein ostaje posljednji na karboksilnom kraju. Konano se na karboksilnu skupinu C-terminalnog cisteina dodaje metilna skupina.

Bioloki znaaj prenilacije dokazuje injenica da mutacija kljunog cisteina blokira povezivanje s membranom kao i funkciju onkogenog proteina Ras. S obzirom na to da je farnezilacija relativno rijetka modifikacija staninih proteina, mogunost da bi inhibitori kljunog enzima (farnezil-transferaze) mogli biti korisni lijekovi za terapiju tumora koji ukljuuju proteine Ras potaknula je zanimanje za ovu reakciju. Eksperimenti provedeni na modelnim sustavima pokazali su da inhibitori farnezilacije interferiraju s rastom tumorskih stanica, pa su u tijeku klinike studije kojima se ispituje djelovanje ovih potencijalnih lijekova na inhibiciju rasta tumora kod ljudi.

Trei tip modifikacije proteina masnim kiselinama je palmitacija. Palmitinska se kiselina (masna kiselina sa 16 ugljikovih atoma) dodaje na sumpor bonih ogranaka cisteina smjetenih u unutranjem dijelu polipeptidnog lanca (Slika 7.33). Kao i miristilacija i prenilacija, palmitacija igra vanu ulogu u povezivanju nekih proteina s citosolnom stranom stanine membrane.

Konano, lipidi vezani na oligosaharide (glikolipidi) dodani na C-terminalne karboksilne skupine nekih proteina, slue kao sidra za vezanje proteina na vanjsku stranu stanine membrane. S obzirom na to da glikolipidi vezani na ove proteine sadre fosfatidil-inozitol, esto se nazivaju glikozilfosfatidil-inozitol ili GPI sidra (Slika 7.34). Oligosaharidni dijelovi GPI sidara vezani su na krajnju karboksilnu skupinu polipeptidnih lanaca. Inozitolna je skupina fosfatidilinozitola vezana na oligosaharid tako da ugljikohidrat slui kao poveznica izmeu proteina i masne kiseline fosfolipida. GPI sidra se sintetiziraju te kao ve ustrojene strukture prenose na proteine unutar endoplazmatskog retikula. Njihovo dodavanje praeno je uklanjanjem polipeptida veliine 20 aminokiselina s C-kraja polipeptidnog lanca. Modificirani se protein zatim prenosi na povrinu stanice, pri emu lanci masnih kiselina GPI sidra posreduju u povezivanju proteina sa staninom membranom.

Regulacija funkcije proteina

Kljuna funkcija proteina njihovo je enzimsko djelovanje, potrebno za katalizu gotovo svih biolokih reakcija. Regulacija enzimske aktivnosti time igra kljunu ulogu u upravljanju staninim ponaanjem. To se jednim dijelom postie na razini ekspresije gena, koja odreuje koliinu nekog enzima (proteina) koju stanica sintetizira. Druga razina kontrole postie se regulacijom funkcije proteina, koja omoguava stanici da regulira ne samo koliinu, ve i aktivnost svojih proteinskih komponenti. O regulaciji aktivnosti nekih proteina na razini transkripcije i translacije ve je bilo govora u ovom i prethodnom poglavlju, dok e mnogi dodatni primjeri regulacije proteinske funkcije u kontroli i staninom ponaanju biti objanjeni u ostatku ove knjige. U ovom e odjeljku biti govora o tri osnovna mehanizma kojima se regulira aktivnost staninih proteina.

Regulacija malim molekulama

Djelovanje veine enzima kontrolirano je promjenom njihove konformacije, ime se mijenja i njihova katalitika aktivnost. U mnogim su sluajevima konformacijske promjene posljedica vezanja malih molekula, kao to su aminokiseline ili nukleotidi, ime se regulira i enzimska aktivnost. Ovaj tip regulacije esto je odgovoran za kontrolu metabolikih puteva putem povratne sprege. Primjerice, konani produkti mnogih puteva biosinteze (primjerice aminokiselina) inhibiraju enzime koji kataliziraju prvi korak njihove sinteze, osiguravajui na taj nain odgovarajue snabdijevanje produktom, ali i sprjeavajui sintezu prevelikih koliina istog (Slika 7.35). Inhibicija povratnom spregom primjer je alosterike regulacije, u kojoj se regulatorna molekula vee na mjesto na enzimu koje je razliito od katalitikog mjesta (gr. allo = drugi, steric = mjesto). Vezanje takve regulatorne molekule mijenja konformaciju proteina, a time se mijenja i oblik katalitikog mjesta to djeluje i na katalitiku aktivnost (vidi Sliku 2.29). Mnogi transkripcijski faktori (o kojima je bilo govora u Poglavlju 6) takoer su regulirani vezanjem malih molekula. Primjerice, vezanje laktoze na lac represor u E. coli inducira konformacijsku promjenu koja sprjeava vezanje represora na DNA. U eukariotskim stanicama steroidni hormoni na slian nain kontroliraju gensku ekspresiju veui se na transkripcijske regulatorne proteine.

Regulacija transkripcijskih faktora kao to je regulacija EF-Tu putem vezanja GTP-a (vidi sliku 7.3) ilustrira drugi uobiajeni mehanizam kojim se kontrolira aktivnost unutarstaninih proteina. U ovom sluaju, oblik proteina s vezanim GTP-om aktivna je konformacija, dok je oblik s vezanim GDP-om neaktivan. Mnogi stanini proteini regulirani su na slian nain, putem vezanja GTP-a ili GDP-a. U ovu skupinu ubrajamo onkogene proteine Ras, koji su intenzivno prouavani zbog njihove uloge u kontroli stanine proliferacije i tumora kod ovjeka. Iznimno zanimljivi podaci dobiveni kristalografskom analizom X-zrakama ovih proteina, otkrili su male, ali iznimno znaajne razlike izmeu neaktivnog oblika proteina s vezanim GDP-om i aktivnog oblika s vezanim GTP-om (Slika 7.36). Ove fine razlike u proteinskoj konformaciji odreuju moe li Ras (aktivni oblik s vezanim GTP-om) reagirati sa svojom ciljnom molekulom, to je signal za staninu diobu. Vanost ovih finih razlika u proteinskoj konformaciji ilustrirana je injenicom da mutacije u ras genu pridonose razvoju oko 20% tumora kod ovjeka. Na taj nain mutacije mijenjaju strukturu proteina Ras tako da su oni zarobljeni u svojoj aktivnoj konformaciji s vezanim GTP-om i kontinuirano signaliziraju staninu diobu, to dovodi do nekontroliranog rasta tumorskih stanica. Suprotno tome, normalni proteini Ras balansiraju izmeu GTP- ili GDP- konformacija, tako to postaju aktivni tek nakon stimulacije hormonima ili faktorima rasta koji normalno kontroliraju staninu proliferaciju u viestaninim organizmima.

Fosforilacija proteina

Primjeri o kojima je bilo govora u prethodnom odjeljku odnose se na nekovalentno povezivanje proteina s malim molekulama inhibitorima ili aktivatorima. S obzirom na to da se ne stvaraju kovalentne veze, vezanje ovih regulatornih molekula na protein je reverzibilno, to stanici omoguava brz odgovor na promjene u okolini. Meutim, aktivnost mnogih proteina regulirana je kovalentnim modifikacijama. Jedan od primjera ovog tipa regulacije je aktivacija enzima proteolitikim kidanjem neaktivnih prekursora. Kao to je prethodno spomenuto u ovom poglavlju, probavni enzimi i proteini koji sudjeluju u zgruavanju krvi regulirani su ovim mehanizmom. S obzirom na to da je proteoliza ireverzibilan proces, ona je prvenstveno oblik kontrole aktivacije enzima, a ne "ukljuivanja" i "iskljuivanja" enzima u odgovoru na promjene u okolini. Suprotno tome, druge su kovalentne modifikacije posebice fosforilacija, reverzibilni procesi unutar stanice i djeluju, kao primjerice i alosterika regulacija, tako to reverzibilno aktiviraju ili inhibiraju mnotvo razliitih staninih proteina u odgovoru na signale iz okoline.

Fosforilaciju proteina kataliziraju protein-kinaze, od kojih veina prenosi fosfatnu skupinu s ATP-a na hidroksilne skupine bonih ogranaka serina, treonina ili tirozina (Slika 7.37). Protein-kinaze ine jednu od najveih proteinskih porodica kod eukariota, a pripada im i priblino 2% svih eukariotskih gena. Veina protein-kinaza fosforilira ili serinski i treoninski ostatak ili tirozinski ostatak, pa se sukladno tome nazivaju protein-serin/treonin-kinaze ili protein-tirozin-kinaze. Reakciju reverznu fosforilaciji, hidrolizu fosforiliranog aminokiselinskog ostatka kataliziraju protein-fosfataze. Kao i protein-kinaze, protein-fosfataze su specifine za serinske ili treoninske ostatke, ili tirozinske ostatke, premda neke od njih prepoznaju sve tri fosfoaminokiseline.

Zajedniko djelovanje protein-kinaza i protein-fosfataza posreduje u reverzibilnoj fosforilaciji mnogih staninih proteina. Protein-kinaze esto djeluju kao komponente puteva prijenosa signala u kojima jedna kinaza aktivira sljedeu kinazu, koja zatim moe djelovati na sljedeu kinazu u nizu. Djelovanje serije protein-kinaza moe prenijeti signal primljen na staninoj povrini do ciljnog proteina unutar stanice, to rezultira promjenama staninog ponaanja u odgovoru na poticaje iz okoline.

Prototip djelovanja protein-kinaza proiziao je iz studija metabolizma glikogena, autora Eda Fishera i Eda Krebsa iz 1955. godine. U miinim stanicama hormon adrenalin potie razgradnju glikogena do glukoza-1-fosfata, ime se osigurava izvor energije za pojaanu miinu aktivnost. Razgradnju glikogena katalizira enzim glikogen-fosforilaza, koju regulira protein-kinaza (Slika 7.38). Adrenalin se vee na receptor na povrini stanice i potie pretvorbu ATP u cikliki AMP (cAMP), koji zatim vee i aktivira protein-kinazu, nazvanu protein-kinaza ovisna o cAMP-u. Ova kinaza fosforilira te time aktivira sljedeu protein-kinazu, nazvanu kinaza-fosforilaze. Kinaza-fosforilaze zatim fosforilira i aktivira glikogen-fosforilazu to u konanici dovodi do stvaranja glukoze. Aktivacija fosforilacije i kinaze-fosforilaze i glikogen-fosforilaze moe biti reverzibilna, to kataliziraju specifine fosfataze, tako da uklanjanje poetnog stimulansa (adrenalina ) inhibira daljnju razgradnju glikogena.

Signalni put koji dovodi do aktivacije glikogen-fosforilaze zapoinje vezanjem malih molekula na staninu povrinu vezanjem adrenalina na njegov receptor i vezanjem cAMP-a na protein-kinazu ovisnu o cAMP-u. Signal se zatim prenosi na unutarstanini cilj uzastopnim djelovanjem protein-kinaza. Slini signalni putevi, u kojima protein-kinaze i fosfataze igraju kljunu ulogu, sudjeluju u regulaciji gotovo svih oblika ponaanja eukariotskih stanica (vidi Poglavlje 13 i 14). Odstupanja u ovim putevima, pri emu su esto promijenjene i aktivnosti protein-kinaza, odgovorna su za razvoj mnogih bolesti koje su praene nepravilnom regulacijom staninog rasta i diferencijacije, posebice za razvoj tumora.

Premda je fosforilacija najei i najbolje proueni oblik kovalentnih modifikacija koje reguliraju aktivnost proteina, i neke druge proteinske modifikacije takoer imaju vane uloge. To su metilacija i acetilacija lizinskih ostataka (o emu je bilo govora u Poglavlju 6), kao i dodatak NO skupine na bone ogranke cisteinskih ostataka (nitrozilacija). Uz to, postaje dokazi o tome da O-glikozilacija jezgrenih i staninih proteina takoer ima regulatornu ulogu.

Interakcije protein-protein

Mnogi se proteini sastoje od vie podjedinica, od kojih je svaka neovisan polipeptidni lanac. Kod nekih su proteina podjedinice istovrsne, dok su drugi izgraeni od dvaju ili vie razliitih polipeptida. U oba su sluaja interakcije izmeu polipeptidnih lanaca vane za regulaciju proteinske aktivnosti. Vanost ovih interakcija vidljiva je kod alosterikih enzima, kod kojih vezanje regulatorne molekule mijenja konformaciju proteina promjenom interakcija izmeu podjedinica.

Mnogi drugi enzimi regulirani su na slian nain, putem interakcija protein-protein. Dobar je primjer protein-kinaza ovisna o cAMP-u, koja se sastoji od dvije regulatorne i dvije katalitike podjedinice (Slika 7.39). U ovom stanju, enzim je neaktivan; regulatorne podjedinice inhibiraju enzimsko djelovanje katalitikih podjedinica. Enzim se aktivira putem cAMP-a, koji se vee na regulatorne podjedinice i potie konformacijsku promjenu koja uzrokuje disocijaciju kompleksa uslijed ega se katalitike podjedinice oslobaaju i postaju enzimski aktivne protein-kinaze. Na taj nain cikliki AMP djeluje kao alosteriki regulator djelujui na interakcije protein-protein.

Proteini koji sudjeluju u regulaciji trenskripcije o kojima je bilo govora u Poglavlju 6 pruaju drugi vaan primjer interakcija protein-protein. Mnogi eukariotski transkripcijski faktori djeluju ili kao aktivatori ili kao represori upravo putem interakcija protein-protein s komponentama temeljnog transkripcijskog mehanizma. Kao to e biti govora u sljedeim poglavljima, sline interakcije protein-protein, koje mogu biti regulirane vezanjem malih molekula ili fosforilacijom, igraju kljunu ulogu u kontroli brojnih razliitih oblika staninog ponaanja.

Razgradnja proteina

Razine proteina u stanici odreene su osim intenzitetom sinteze i udjelom njihove razgradnje. Poluvremena ivota proteina u stanici jako su razliita, od nekoliko minuta do nekoliko dana, pa su razliite brzine proteinske razgradnje vaan imbenik stanine regulacije. Mnogi proteini koji se brzo razgrauju djeluju kao regulatorne molekule, primjerice transkripcijski faktori. Brz obrtaj ovih proteina potreban je kako bi njihovoj razini omoguio brzu promjenu u odgovoru na signale iz okoline. Drugi se proteini u odgovoru na specifine signale brzo razgrauju, omoguavajui drugaiji mehanizam za regulaciju unutarstanine enzimske aktivnosti. Uz to, nefunkcionalni ili oteeni proteini bivaju prepoznati i brzo razgraeni unutar stanice, ime se uklanjaju posljedice pogreki koje su nastale tijekom sinteze proteina. U eukariotskim stanicama postoje dva glavna puta razgradnje proteina put ubikvitin-proteasom i lizosomalna proteoliza.

Put ubikvitin-proteasom

Glavni put selektivne razgradnje proteina u eukariotskim stanicama kao biljeg za usmjeravanje citosolnih i jezgrenih proteina na brzu proteolizu koristi ubikvitin (Slika 7.40). Ubikvitin je polipeptid izgraen od 76 aminokiselina, koji je visokoouvan kod svih eukariota (kvasaca, ivotinja i biljaka). Vezanjem ubikvitina na amino-skupinu bonog ogranka lizina proteini postaju obiljeeni za razgradnju. Daljnjim nadodavanjem ubikvitina nastaje multiubikvitinski lanac. Takve poliubikvitinilirane proteine prepoznaje i razgrauje veliki, viepodjedinini proteazni kompleks, nazvan proteasom. Ubikvitin se otputa u tom procesu, pa se moe koristiti i u sljedeem ciklusu. I za vezanje ubikvitina, kao i za razgradnju obiljeenih proteina potrebna je energija koja se dobiva iz ATP-a.

Kako je vezanje ubikvitina biljeg za brzu razgradnju, stabilnost brojnih proteina ovisi o tome hoe li biti ubikvitinilirani. Ubikvitinilacija se odvija u vie koraka. Prvo se ubikvitin aktivira vezanjem za enzim koji aktivira ubikvitin, E1. Ubikvitin se zatim prenosi na drugi enzim, nazvanim enzim koji konjugira ubikvitin (E2). Konani prijenos ubikvitina na ciljni protein posredovan je treim enzimom, nazvan ubikvitin ligaza ili E3, koji je odgovoran za selektivno prepoznavanje odgovarajueg supstratnog proteina. Veina stanica posjeduje samo jednu vrstu E1, ali nekoliko vrsta E2 i velik broj E3 enzima. Razliiti enzimi E3 prepoznaju razliite supstratne proteine, pa se selektivno usmjeravanje staninih proteina na razgradnju putem ubikvitin-proteaznog puta temelji upravo na specifinom djelovanju ovih enzima.

Mnogi proteini koji kontroliraju temeljne procese u stanici, kao to su ekspresija proteina i stanina proliferacija, ciljevi su djelovanja za reguliranu ubikvitinilaciju i proteolizu. Zanimljiv primjer takve kontrolirane razgradnje pruaju ciklini, proteini koji reguliraju stanini rast kontrolirajui diobeni ciklus eukariotskih stanica. Ulazak u mitozu kod eukariotskih stanica kontroliran je dijelom putem ciklina B, koji je regulatorna podjedinica protein-kinaze, nazvane Cdc2 (vidi Poglavlje 14). Povezivanje s ciklinom B nuno je za aktivaciju Cdc2, koja kada je aktivirana, putem fosforilacije razliitih staninih proteina, zapoinje procese mitoze (to obuhvaa kondenzaciju kromatina i razgradnju jezgrine ovojnice). Protein-kinaza Cdc2 aktivira takoer i sustav proteolize posredovane ubikvitinom kojim se razgrauje ciklin B, to vodi prema kraju mitoze. Razgradnja ciklina B inaktivira protein-kinazu Cdc2, omoguavajui stanici izlazak iz mitoze i nastavak prema interfazi sljedeeg staninog ciklusa. Ubikvitinilacija ciklina B je visoko-specifina reakcija, koju odreuje slijed od 9 aminokiselina u ciklinu B, nazvan destrukcijska kutija. Mutacije u ovom slijedu sprjeavaju proteolizu ciklina B to uzrokuje zastoj diobe stanice u mitozi. Ovaj primjer pokazuje vanost regulacije razgradnje proteina u kontroli temeljnih procesa stanine diobe.

Premda ubikvitinilacija uobiajeno usmjerava proteine na razgradnju, vezanje ubikvitina na neke proteine moe imati i druge funkcije. Primjerice, ubikvitinilacija nekih proteina slui kao biljeg za endocitozu, a ubikvitinilacija histona predstavlja element "histonskog koda", o emu je bilo govora u Poglavlju 6. Uz to, proteini mogu biti modificirani vezanjem drugih polipeptida slinih ubikvitinu, kao to je SUMO (mali ubikvitinu slian modifikator), koji slui kao biljeg za usmjeravanje proteina u jezgru i njihovo smjetanje u podjezgrine domene (detaljno u Poglavlju 8).

Lizosomalna proteoliza

Drugi glavni put razgradnje proteina je razgradnja proteina putem lizosoma. Lizosomi su membranom okruene organele koje sadre brojne razgradne enzime, meu kojima i nekoliko proteaza (vidi Poglavlje 9). Imaju nekoliko uloga u staninom metabolizmu, izmeu ostalog u razgradnji izvanstaninih proteina unijetih endocitozom kao i u pretvorbi citoplazmatskih organela i citosolnih proteina.

Zadravanje proteaza i drugih razgradnih enzima unutar lizosoma sprjeava nekontroliranu razgradnju staninog sadraja. Stoga, da bi bili razgraeni lizosomalnom proteolizom, stanini proteini prvo moraju biti unijeti u lizosom. Temeljni princip unosa proteina je autofagija, tijekom koje nastaju vezikule (autofagosomi) kojima su pomou membrana, nastalih od endoplazmatskog retikula, obuhvaena mala podruja citoplazme ili citoplazmatskih orgenale (Slika 7.42). Ove se vezikule zatim stapaju s lizosomima te razgradni lizosomalni enzimi prerauju njihov sadraj. ini se da je unos proteina u autofagosom neselektivan proces, tako da u konanici rezultira sporom razgradnjom dugoivuih citoplazmatskih proteina.

Autofagija je regulirana dostupnou hranjivih tvari, ali i tijekom razvoja viestaninih organizama. Ovaj se proces openito aktivira u uvjetima nedostatka hranjivih tvari, ime je stanici omoguena razgradnja neesencijalnih proteina i organela, te na taj nain ponovo iskoritavanje svojih komponenti. Uz to, autofagija ima vanu ulogu u mnogim razvojnim procesima, kao to je primjerice metamorfoza insekata, koji obuhvaaju intenzivno remodeliranje tkiva i razgradnju staninih komponenti.

KLJUNE RIJEI

tRNA, antikodon, aminoacil-tRNA-sintetaza

ribosom, rRNA

5' regija koja se ne prevodi, policistronska, monocistronska, 3' regija koja se ne prevodi regija, slijed Shine-Delgarno

aperon, proteini toplinskog oka, aperonin

protein disulfid-izomeraze, peptidil-prolil-izomeraze

proteoliza, signalni slijed, signalne peptidaze

Glikozilacija, glikoprotein, dolikol fosfat

N-miristilacija, prenilacija, palmitacija, glikolipid, glikozilfosfatidilinozitolno (GPI) sidro

Alosterika regulacija

Protein-kinaze, protein-serin/treonin-kinaze, protein-tirozin-kinaze, protein-fosfataze

Ubikvitin, proteasom

Lizosom, autofagijaSAETAK

TRANSLACIJA mRNA

Transfer RNA: Transfer RNA slui kao posrednik koji smjeta aminokiseline na kalup mRNA. Aminoacil-tRNA sintetaze veu aminokiseline na odgovarajue tRNA, koje se zatim putem komplementarnog sparivanja baza veu na kodone mRNA.

Ribosom: Ribosomi se sastoje od dvije podjedinice, koje su izgraene od proteina i ribosomskih RNA. Stvaranje peptidne veze primarno je katalizirano ribosomskom 23S RNA.

Ustrojstvo mRNA i inicijacija translacije: Translacija prokariotskih i eukariotskih mRNA zapoinje metioninskim ostatkom. Kod bakterija, inicijacijskom kodonu prethodi slijed koji smjeta mRNA na ribosom putem sparivanja baza sa 16S rRNA. Kod eukariota, inicijacijski kodon se pronalazi pretraivanjem mRNA s 5' kraja, a prepoznaje se na temelju njegove 7-metilgvanozinske kape.

Proces translacije: Translacija zapoinje vezanjem metionil tRNA i mRNA na malu ribosomsku podjedinicu. Zatim se kompleksu pridruuje velika ribosomska podjedinica, te se polipeptidni lanac produuje sve dok ribosom ne stigne do terminacijskog kodona na mRNA. Za odvijanje inicijacije, elongacije i terminacije translacije i kod prokariota i kod eukariota nuna je prisutnost razliitih neribosomskih faktora.

Regulacija translacije: Regulacija specifinih mRNA moe postii vezanjem represorskih proteina te proteinima koji usmjeravaju mRNA u specifino podruje u stanici. Kontrolirana poliadenilacija mRNA takoer je vaan mehanizam regulacije translacije tijekom rane faze razvoja. Uz to, translacija nekih mRNA kontrolirana je nekodirajuim RNA koje putem RNA interferencije dovode do razgradnje homolognih mRNA. Konano, aktivnost translacije u stanici moe openito biti regulirana modifikacijom inicijacijskih faktora.

SMATANJE I PROCESIRANJE PROTEINA

aperoni i smatanje proteina: Molekularni aperoni olakavaju unutarstanino smatanje polipeptidnih lanaca u njihovu pravilnu trodimenzionalnu konformaciju tako to veu i stabiliziraju nesmotane ili djelomino smotane polipeptidne lance.

Enzimi i smatanje proteina: Barem dvije vrste enzima, protein disulfid-izomeraze i peptidil-prolil izomeraze, kataliziraju smatanje proteina.

Kidanje proteina: Proteoliza je vaan korak u procesiranju mnogih proteina: primjerice, sekretorni proteini i proteini ugraeni u veinu eukariotskih organela usmjeravaju se do svojih odredita pomou aminokiselinskog slijeda koji se nakon prolaska proteina kroz membranu uklanja proteolitikim kidanjem.

Glikozilacija: Mnogi su eukariotski proteini, posebice sekretorni i proteini stanine membrane, modificirani dodatkom ugljikohidrata u endoplazmatskom retikulu i Golgijevom aparatu.

Vezanje lipida: Kovalentno vezani lipidi esto usmjeravaju i usidruju proteine u staninu membranu.

REGULACIJA FUNKCIJE PROTEINA

Regulacija malim molekulama: Mnogi su proteini regulirani vezanjem malih molekula, kao to su aminokiseline i nukleotidi, koji potiu promjene konformacije i aktivnosti proteina.

Fosforilacija proteina: Reverzibilna fosforilacija, koja kontrolira aktivnost mnotva razliitih staninih proteina, posljedica je djelovanja protein-kinaza i fosfataza.

Interakcije protein-protein: Interakcije izmeu polipeptidnih lanaca vane su za regulaciju alosterikih enzima i drugih staninih proteina.

RAZGRADNJA PROTEINA

Put ubikvitin-proteasom: Glavni put selektivne razgradnje proteina u eukariotskim stanicama koristi ubikvitin kao biljeg koji usmjerava proteine na brzu proteolizu pomou proteasoma.

Lizosomska proteoliza: Lizosomske proteaze razgrauju izvanstanine proteine unijete endocitozom, a odgovorne su i za razgradnju citoplazmatskih organela i dugoivuih citosolnih proteina. Autofagija se aktivira kao odgovor na gladovanje stanice.

Pitanja

1. E. coli sadri 64 razliita kodona u svojim mRNA, od kojih 61 za aminokiseline. Kako mogu sintetizirati proteine kad ima samo 40 razliitih tRNA?2. U kojem smjeru ribosom prevodi mRNA, a u kojem se smjeru sintetizira polipeptidni lanac?

3. elite eksprimirati kloniranu eukariotsku cDNA u bakteriji. Koji je slijed potrebno dodati da bi se mRNA mogla prevesti na prokariotskim ribosomima?

4. Obrazloite injenicu da je ribosomska RNA najznaajnija komponenta ribosoma.

5. Koji bi uinak inhibitor poliadenilacije imao na sintezu proteina u oploenim jajacima?

6. to su aperoni?

7. Zato je korisno da je sinteza proteina toplinskog oka pojaana u stanicama izloenim povienim temperaturama?

8. Dok ste ispitivali biljni auksin natrij fenilacetat, otkrili ste da inhibira sintezu farnezilnih skupina. Sluajui kolegij Stanine biologije, uoili ste mogunost njegovog koritenja u terapiji tumora koji ukljuuju nenormalno aktivne Ras proteine. to mislite kakav bi uinak fenilacetat imao na funkciju Ras i zato bi imao nekoliko nuspojava?

9. Zanima vas ispitivanje ekspresije proteina na povrini jetrenih stanica. Kako bi vam tretman ovih stanica fosfolipazom pomogao da otkrijete je li va protein transmembranski protein ili je na staninu povrinu vezan pomou GPI sidra?

10. to je dokaz da je za ubikvitinilaciju i razgradnju specifinih proteina pomou proteasoma nuan specifian ciljni slijed na proteinu?

KLJUNI EKSPERIMENT (Tekst na gornjem dijelu 288. stranice)Katalitika uloga ribosomske RNA

Unusual Resistence of Peptidyl Transferase to Protein Extraction Procedures

Harry F. Noller, Vernita Hoffhart, and Ludwika Zimniak

University of California at Santa Cruz

Science, volumen 256, 1992, stranice 1416-1419

Sadraj

Uloga ribosoma u sintezi proteina otkrivena je ezdesetih godina 20. stoljea. U tom su razdoblju ribosomi opisivani kao estice koje se sastoje od proteina i RNA, te je uspjeno obavljen eksperiment uspostavljanja funkcionalnih ribosoma iz proienih gradivnih komponenti. Tada se smatralo da stvaranje peptidne veze (reakciju peptidil-transferaze) kataliziraju ribosomski proteini, a da rRNA uglavnom pridonosi odranju strukture ribosoma. U ranim sedamdesetima, dokazi su ipak poeli sugerirati da bi molekule ribosomske RNA mogle izravnije sudjelovati u proteinskoj sintezi. Primjerice, utvreno je da mnogi ribosomski proteini nisu esencijalni za funkciju ribosoma. Suprotno tomu, pokazano je da su sljedovi nekih dijelova rRNA dobro ouvani tijekom evolucije, to je upuivalo na kljunu funkcionalnu ulogu ovih dijelova molekule rRNA.

U ranim osamdesetima, na temelju studija Toma Cecha provedenih na ribozimu iz Tetrahymene i studija Sidneya Altmana provedenih na RNazi P, utvrena je katalitika aktivnost molekula RNA. Ova su otkria stvorila temelje za pretpostavku da je rRNA izravno ukljuena u katalizu stvaranja peptidne veze. Nepobitni dokaz, koje je potvrdio predloenu ulogu rRNA pruili su u svom lanku Harry Noller i njegovi suradnici, 1992. godine.

Eksperimenti

U studijama katalitike aktivnosti rRNA, Noller i suradnici koristili su pojednostavljenu modelnu reakciju za odreivanje peptidil-transferazne aktivnosti. U reakciji je mjeren prijenos radioaktivno obiljeenog N-formilmetionina s fragmenta tRNA na amino skupinu puromicina, antibiotika koji slii aminoacil-tRNA i moe stvoriti peptidnu vezu s rastuim polipeptidnim lancem. Prednost ove modelne reakcije peptidil transferaze je da se moe provesti s izoliranom ribosomskom podjedinicom 50S; mala ribosomska podjedinica, drugi proteinski faktori, kao ni mRNA nisu potrebni za odvijanje ove reakcije.

Istraivai su zatim ispitali ulogu rRNA mjerenjem peptidil -transferazne aktivnosti podjedinice 50S iz koje su ribosomski proteini uklonjeni standardnim postupcima ekstrakcije proteina. Vaan detalj ovih pokusa bila je uporaba ribosoma iz bakterije Thermus aquaticus. S obzirom na to da ove bakterije ive pri visokim temperaturama, smatralo se da je struktura njihove rRNA stabilnija od strukture rRNA iz E. coli. Kljuan je bio rezultat da je peptidil-transferazna aktivnost ribosoma iz T. aquaticus bila u potpunosti otporna na snane ektrakcijske postupke, primjenu detergenata, proteaza i fenola (vidi sliku). to je jo znaajnije, peptidil transferazna je aktivnost bila u potpunosti ouvana ak i nakon ponovljenih ekstrakcija, kojima je uklonjeno 90% ribosomskih proteina. Suprotno tome, peptidil transferazna je aktivnost, bilo intaktnih, bilo ekstrahiranih ribosoma bila iznimno osjetljiva ak i na kratko izlaganje djelovanju RNaze. Premda na temelju ovih pokusa nije bilo mogue iskljuiti potencijalnu ulogu ribosomskih proteina zaostalih nakon ekstrakcije, dobiveni su rezultati pruili snanu potporu pretpostavci o izravnom sudjelovanju ribosomske RNA 23S u peptidil transferaznoj reakciji.

Odjek

Rezultati Nollerovih pokusa konano su potvreni analizom 50S ribosomske podjedinice pri visokom razluivanju koju su 2000. godine objavili Peter Moore, Thomas Steitz i njihovi suradnici. Pokazano je da mjesto na ribosomu u kojem se odvija peptidil-tranferazna reakcija sadri samo rRNA, a da ribosomski proteini nisu prisutni. Ovi su rezultati uklonili svaku sumnju o katalitikoj ulozi rRNA u ovoj reakciji te su pokazali da temeljnu reakciju sinteze proteina katalizira ribosomska RNA. Ova otkria ne samo da su imala snaan utjecaj na nae razumijevanje funkcije ribosoma, ve su uvelike proirila spoznaje o prethodno opisanim katalitikim aktivnostima molekula RNA te su osigurala nove vrijedne dokaze koji govore u prilog hipotezi prema kojoj je rani period evolucije bio "svijet RNA" napuen samo-replicirajuim molekulama RNA. Ova je hipoteza prethodno temeljena na sposobnosti molekula RNA da kataliziraju reakcije potrebne za njihovu vlastitu replikaciju. Otkrie da RNA moe katalizirati reakcije koje sudjeluju u sintezi proteina, pruilo je dokaz o izravnoj vezi izmeu svijeta RNA i protoka genetike informacije u danas postojeim stanicama, u kojima rRNA sudjeluje u kljunim reakcijama stvaranja peptidne veze.

Tekst ispod slike na 288. stranici

Peptidil-transferazna aktivnost mjerena je praenjem nastalog radioaktivnog N-formilmetionin-puromicina (f-Met-puro), primjenom elektroforeze i autoradiografije. Ribosomi iz T. aquaticus izloeni su ekstrakciji proteina ili djelovanju RNaze, kao to je pokazano na slici.

MOLEKULARNA MEDICINA (Tekst na gornjem dijelu 292. stranice)Antibiotici i sinteza proteina

Bolest

Bakterije su odgovorne za irok spektar potencijalno smrtonosnih zaraznih bolesti, kao to su tuberkuloza, bakterijska upala plua, meningitis djeje dobi, infekcije rana i opeklina, sifilis i gonoreja. Prije etrdesetih godina 20. stoljea, lijenici nisu imali uinkovitu terapiju za ove bakterijske infekcije. Upravo su tih godina prvi antibiotici postali dostupni za kliniku uporabu. Mogunost izljeenja infekcija za koje prethodno nije bilo terapije te znaajno produljenje prosjenog ljudskog ivota bilo je izravna posljedica uvoenja antibiotika u kliniku praksu. Danas je u uporabi vie od stotinu antibiotika koji osiguravaju uinkovitu terapiju bakterijskih infekcija.

Molekularna i stanina osnova

Da bi antibiotik bio kliniki uinkovit, mora ili ubiti bakterije ili inhibirati njihov rast, a pri tome ne smije biti toksian za ovjeka. Stoga je djelovanje veine antibiotika, koji su kliniki primjenjivi, usmjereno na ciljeve koji su prisutni u bakterijskim, ali ne i u ljudskim stanicama. Penicilin, primjerice, inhibira sintezu staninog zida bakterije (vidi Poglavlje 12). Mnogi, uobiajeno koriteni antibiotici inhibiraju pojedine korake proteinske sinteze (vidi tablicu). Neki od ovih antibiotika, primjerice streptomicin, tetraciklin, kloramfenikol i eritromicin, specifino djeluju na prokariotske ribosome te su stoga uinkoviti agensi za lijeenje bakterijskih infekcija. Djelovanje drugih antibiotika, inhibitora proteinske sinteze, usmjereno je i na eukariote i na prokariote (primjerice, puromicin) ili samo na eukariote (primjerice, cikloheksimid). Premda ovi antibiotici oigledno nisu prihvatljivi za kliniku primjenu, upravo su se oni pokazali kao vane eksperimentalne alatke za studije proteinske sinteze i kod prokariotskih i kod eukariotskih stanica.

Prevencija i lijeenje

Uporaba antibiotika imala je snaan utjecaj na modernu medicinu omoguivi lijenicima lijeenje za ivot pogubnih bakterijskih infekcija. Naalost, mutacije ipak mogu dovesti do razvoja bakterijskih sojeva koji su rezistentni na antibiotike. Mnogo je bakterijskih sojeva danas rezistentno na jedan ili vie antibiotika, tako da lijenici ponekad moraju isprobati nekoliko razliitih antibiotika prije no to nau jedan koji je uinkovit. tovie, irenje bakterijske rezistencije stavilo je neke antibiotike izvan uporabe. Mnogo je ozbiljnija injenica da su nastali bakterijski sojevi koji su rezistentni na vie antibiotika, a neki od njih, koji su esto prisutni u bolnicama, otporni su na sve, osim moda na jedan ili tek nekoliko poznatih antibiotika. Nastanak ovakvih sojeva s viestrukom rezistencijom iri spektar neizljeivih infekcija uzrokovanih irenjem bakterija otpornih na antibiotike to je scenarij koji najavljuje povratak u pre-antibiotsko vrijeme infektivnih bolesti. Svladavanje bakterija otpornih na antibiotike, kako optimiranjem uporabe trenutno dostupnih antibiotika, tako i razvojem novih antibiotika, predstavlja vanu brigu u suvremenoj medicinskoj praksi.

Tablica na 292. straniciAntibiotici inhibitori sinteze proteina

AntibiotikCiljna stanicaUinak

StreptomicinProkariotskainhibira inicijaciju i uzrokuje pogreno itanje

TetraciklinProkariotskaInhibira vezanje aminoacil-tRNA

KloramfenikolProkariotskaInhibira peptidil-transferaznu aktivnost

EritromicinProkariotskaInhibira translokaciju

Puromicinprokariotska i eukariotskaUzrokuje prerani zavretak sinteze lanca

CikloheksimidEukariotskaInhibira peptidil-transferaznu aktivnost

281. stranica, tekst uz lijevu marginu

Translacija mRNA 281

Smatanje i procesiranje proteina 298

Regulacija proteinskih funkcija 309

Razgradnja proteina 313

Kljuni eksperiment: Katalitika uloga ribosomske RNA

MOLEKULARNA MEDICINA: Antibiotici i sinteza proteina

Tablica 7.1 Translacijski faktori

UlogaProkariotiEukarioti

InicijacijaIF-1, IF-2, IF-3eIF-1, eIF-1A, eIF-2, eIF-2B, eIF-3, eIF-4A, eIF-4B, eIF-4E, eIF-4G, eIF-5

ElongacijaEF-Tu, EF-Ts, EF-GeEF-1, eEF-1, eEF-2

TerminacijaRF-1, RF-2, RF-3eRF-1, eRF-3

Tablica 7.2 Molekularni aperoni

aperoni

Porodica proteinaProkariotieukarioti

Hsp70DnaK

BiP (endoplazmatski retikul)

SSC1 (mitohondriji)

ctHsp70 (kloroplasti)Hsc73 (citosol)

Hsp60GroEL

Hsp60 (mitohondriji)

Cpn60 (kloroplasti)TriC (citosol)

Hsp90HtpG

Grp94 (endoplazmatski retikul)Hsp90 (citosol)

Slika 7.1 Struktura tRNA

Struktura fenilalanil tRNA prikazana je u otvorenoj formi "lista djeteline" (A) kako bi komplementarno sparivanje baza bilo vidljivo. Modificirane baze obiljeene su kao mG metilgvanozin; mC metilcitozin; DHU dihidrouridin; T ribotimidin; Y modificirani purin (najee adenozin); pseudouridin. Smotana forma molekule prikazana je pod (B), a prostorni model pod (C) (C, susretljivou Dana Richardsona).

amino acid attachment site mjesto vezanja aminokiseline

anticodon antikodon

Slika 7.2 Vezanje aminokiseline na tRNA

U prvom reakcijskom koraku aminokiselini se pridruuje AMP, ime nastaje meuprodukt aminoacil-AMP. U drugom se koraku aminokiselina prenosi na 3' CCA kraj akceptorske tRNA, a AMP se otputa. Oba reakcijska koraka kataliziraju aminoacil -tRNA sintetaze.

ATP ATP

AMP AMP

P P P P

Aminoacyl AMP aminoacil-AMP

tRNA tRNA

Aminoacyl tRNA aminoacil-tRNA

Slika 7.3 Nestandardno sparivanje baza kodon-antikodon

Sparivanje baze na treem poloaju kodona nije strogo, ime je gvaninu (G) omogueno sparivanje s uridinom (U), a inozinu (I) iz antikodona sparivanje s uridinom (U), citozinom (C) i adeninom (A). Prikazana su dva primjera neuobiajenog sparivanja, na temelju kojeg je fenilalanil (Phe) tRNA omogueno prepoznavanje kodona UUC i UUU te alanil (Ala) tRNA prepoznavanje kodona GCU, GCC i GCA.

Phenylalanyl tRNA pairing sparivanje fenilalanil tRNA

Phe Phe

tRNA tRNA

mRNA mRNA

Ribose riboza

Guanosine gvanozin

Cytosine citozin

Codon or anticodon kodon ili antikodon

Uridine uridin

Alanyl tRNA pairing sparivanje alanil tRNA

Ala Ala

Inosine inozin

Anticodon antikodon

Codon kodon

Slika 7.4 Struktura ribosoma

(A) Komponente prokariotskih i eukariotskih ribosoma. Na temelju brzine sedimentacije prilikom ultracentrifugiranja, intaktni se prokariotski ribosomi oznaavaju oznakom 70S, a eukariotski oznakom 80S. Izgraeni su od velike i male podjedinice, koje sadre i ribosomske proteine i rRNA. (B-C) Visokorezolucijska kristalna struktura (dobivena X-zrakama) ribosomske podjedinice 30S (B) i 50S (C). (B, iz B. T. Wimberly, D. E. Brodersen, W. M. Clemons, R. J. Morgan-Warrner, A. P. Carter, C. Vonrhein, T. Hartrsch and V. Ramakrishnan, 2000. Nature 407:327. C, iz N. Ban, P. Nissen, J. Hansen, P. B. Moore and T. A. Steitz, 2000. Science 289:905.)

Prokaryotic 70S ribosome prokariotski 70S ribosom

23S and 5S rRNAs 34 proteins 23S i 5S rRNA 34 proteina

16S rRNA 21 proteins 16S rRNA 21 protein

Eukaryotic 80S ribosome eukariotski 80S ribosom

28S, 5.8S and 5S rRNAs (~45 proteins) 28S, 5,8S i 5S rRNA (~45 proteina)

18S rRNA (~30 proteins) 18S rRNA (~30 proteina)

Slika 7.5 Struktura 16S RNA

Komplementarno sparivanje baza rezultira stvaranjem specifine sekundarne strukture. (iz M. M. Yusupov, G. Z. Yusupova, A. Baucom, K. Lieberman, T. N. H. Earnest, J. H. D. Cate and H. F. Noller. 2001. Science 292:883.)

Slika 7.6 Struktura 50S ribosomske podjedinice

Visokorezolucijski model 50S ribosomske podjedinice s 3 molekule tRNA vezane na mjesta A, P i E na ribosomu. (vidi sliku 7.12). Ribosomski su proteini prikazani rozom, a rRNA plavom bojom. (iz P. Nissen, J. Hansen, N. Ban, P. B. Moore and T. A. Steitz. 2000. Science 289:920.)

Slika 7.7 Prokariotske i eukariotske mRNA

I prokariotske i eukariotske mRNA sadre regije koje se ne prevode (UTR) na svojim 5' i 3' krajevima. Eukariotske mRNA sadre takoer 5' 7-metilgvanozinske (m7G) kape i 3' poli-A repove. Prokariotske su mRNA esto policistronske: kodiraju vie proteina, od kojih se svaki translatira s neovisnog mjesta poetka translacije. Eukariotske mRNA najee su monocistronske, odnosno, kodiraju samo jedan protein.

Procaryotic mRNA prokariotska mRNA

Multiple translation start sites viestruka mjesta poetka translacije

Protein 1 protein 1

Protein 2 protein 2

Protein 3 protein 3

UTR UTR

Eukaryotic mRNA eukariotska mRNA

Single translation start site jedino mjesto poetka translacije

Slika 7.8 Signali za inicijaciju translacije

Inicijacijska mjesta na prokariotskim mRNA obiljeena su slijedom Shine-Delgarno koji prethodi inicijacijskom kodonu AUG. Sparivanje baza iz slijeda Shine-Delgarno i komplementarnog slijeda blizu 3' kraja 16S rRNA smjeta mRNA na ribosom. Suprotno tome, eukariotske su mRNA na 40S ribosomsku podjedinicu vezane preko svojih 5' 7-metilgvanozin kapa. Ribosom zatim pretrauje uzdu mRNA sve dok ne naie na inicijacijski kodon AUG.

Prokaryotic mRNA prokariotska mRNA

Shine-Delgarno sequence slijed Shine-Delgarno

16S RNA 16S RNA

Eukaryotic mRNA eukariotska mRNA

5' cap 5' kapa

40S ribosomal subunit 40S ribosomska podjedinica

ribosome scanning pretraivanje ribosoma

Slika 7.9 Pregled translacije

Initiation inicijacija

Ribosome binds mRNA at start codon ribosom vee mRNA na start kodonu

Elongation elongacija

Polypeptide chain elongates by successively adding aminoacids polipeptid se produljuje stupnjevitim dodavanjem aminokiselina

Direction of ribosome movement smjer kretanja ribosoma

Termination terminacija

When stop codon is encountered, polypeptide is released and ribosome dissociates kad je stop kodon pronaen, polipeptid se otputa, a ribosom disocira

Slika 7.10 Inicijacija translacije kod bakterija

Prvo se tri inicijacijska faktora (IF-1, IF-2, IF-3) veu za 30S ribosomsku podjedinicu. Zatim se ovom kompleksu pridruuju mRNA i inicijatorska N-formilmetionin (fMet) tRNA, koju prepoznaje faktor IF-2, vezan s GTP. IF-3 se zatim otpua, a 50S podjedinica se vee za kompleks potiui hidrolizu GTP-a vezanog na IF-2, nakon ega se faktori IF-1 i IF-2, na koji je sada vezan GDP, otputaju.

30S subunit 30S podjedinica

Initiation factor binding vezanje faktora inicijacije

mRNA mRNA

tRNA tRNA

Slika 7.11 Inicijacija translacije kod eukariotskih stanica

Inicijacijski faktori eIF-3, eIF-1A i eIF-5 veu se na 40S ribosomsku podjedinicu. Inicijatorsku metionil tRNA na ribosom donosi faktor eIF-2 (u kompleksu s GTP), mRNA donose faktori eIF-4E (koji se vee na 5' kapu), eIF-4G (koji se vee i na eIF-4 na 5' kapi i na PABP na 3' poli-A repu), eIF-4A i eIF-4B. Ribosom zatim nizvodno pretrauje mRNA sve dok ne naie na prvi AUG inicijacijski kodon. Za pretraivanje je potrebna energija, pa se ovaj proces stoga odvija uz hidrolizu ATP-a. Kada je inicijacijski kodon AUG otkriven, faktor eIF-5 potie hidrolizu GTP vezanog na faktor eIF-2 to izaziva otputanje eIF-2 (sada u kompleksu s GDP), kao i otputanje ostalih faktora inicijacije. Zatim se 40S kompleksu pridruuje 60S ribosomska podjedinica.

40S subunit 40S podjedinica

Initiation factor binding vezanje faktora inicijacije

mRNA mRNA

Scanning pretraivanje

60S subunit 60S podjedinica

Slika 7.12 Elongacijski stupanj translacije

Na ribosomu postoje tri mjesta vezanja tRNA, oznaena kao mjesto P (peptidil), mjesto A (aminoacil) i E (izlazno, engl. exit). Inicijacijska N-formilmetionin tRNA smjeta se u m