Poglavlje 6

Poglavlje 6

1. Sinteza i obrada RNAGutter, str. 231: Transkripcija u prokariota

231

Eukariotske RNA-polimeraze i transkripcijski faktori

239

Regulacija transkripcije u eukariota

244

Obrada i promet RNA

261

Kljuni pokus: Izolacija eukariotskih

transkripcijskih faktora

251

Kljuni pokus: Otkrie snRNPs

268U 4. i 5. poglavlju razmatrana je organizacija i odravanje genomske DNA, koja bi se mogla promatrati kao skup genetskih instrukcija to upravljaju svim staninim aktivnostima. Instrukcije se prenose na RNA koja potom upravlja procesom sinteze proteina. Vano je napomenuti da ponaanje stanice nije odreeno iskljuivo nasljeenim genima nego kako su ti geni izraeni u neko odreeno vrijeme. Regulacija genske ekspresije omoguava stanicama prilagodbu na promjene njihova okolia, a odgovorna je i za odreene aktivnosti viestruko diferenciranih staninih vrsta koje ine vie biljke i ivotinje. Miine i jetrene stanice, primjerice, sadre iste gene; funkcije tih stanica nisu odreene razlikama u njihovim genomima, nego reguliranim nainom izraaja gena koji upravljaju razvojem i diferencijacijom.

Prvi korak u ekspresiji gena, transkripcija DNA u RNA, primarni je nivo na kojemu se regulira genska ekspresija i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama. RNA molekule u eukariotskim stanicama naknadno se mijenjaju na razliite naine ( primjerice, introni se uklanjaju prekrajanjem ( ime se primarni transkript prevodi u svoj funkcionalni oblik. Razliite vrste RNA imaju razliite uloge u stanicama. Glasnike RNA (mRNAs) slue kao kalupi za sintezu proteina; ribosomalne RNA (rRNAs) i transportne RNA (tRNAs) djelatne su u procesu translacije mRNA. Druge male RNA molekule slue regulaciji gena, prekrajanju mRNA, obraivanju tRNA te razvrstavanju proteina u eukariota. U ovom poglavlju razmatraju se transkripcija i obrada RNA. Krajnji korak u ekspresiji gena, translacija glasnike RNA u protein, razmatra se u poglavlju 7.

1.1. Transkripcija u prokariota

Kao u veini podruja molekularne biologije, studije na E. coli osigurale su model za kasnija istraivanja transkripcije u eukariotskim stanicama. Kako je reeno u poglavlju 3, mRNA je prvotno otkrivena u E. coli. Takoer, E. coli je prvi organizam iz kojega je izolirana i prouavana RNA-polimeraza. Osnovni mehanizmi pomou kojih je transkripcija regulirana rasvijetljeni su na slian nain pionirskim pokusima na E. coli. U tim je pokusima pokazano da regulirana genska ekspresija omoguava stanici da odgovori na promjene u okolini, primjerice na nedostatak hranjivog sastojka. Razumijevanje transkripcije u E. coli omoguilo je prouavanje mnogo sloenijih mehanizama koji reguliraju transkripciju u eukariotskim stanicama.

1.1.1. RNA-polimeraza i transkripcija

Enzim odgovoran za sintezu RNA jest RNA-polimeraza koja katalizira polimerizaciju ribonukleozid 5'-trifosfata (NTPs) usmjerenu kalupom DNA. Sinteza je RNA slina sintezi DNA i slino DNA-polimerazi RNA-polimeraza katalizira rast RNA lanca uvijek u smjeru 5' prema 3'. Meutim, za razliku od DNA-polimeraze, RNA-polimeraza ne treba pripremljenu klicu za zapoinjanje (inicijaciju) sinteze RNA. Umjesto toga, transkripcija zapoinje de novo na specifinim mjestima na poetku gena. Proces zapoinjanja posebice je vaan jer je to znaajan nivo na kojem se regulira transkripcija.

RNA-polimeraza, slino kao i DNA-polimeraza, sloen je enzim koji se sastoji od vie polipeptidnih lanaca. Bakterijski enzim sastavljen je iz pet razliitih podjedinica, nazvanih (, (, (', ( i ( (slika 6.1). ( podjedinica je relativno slabo vezana i moe se razdvojiti od ostalih pet podjedinica, dajui sr enzima nainjenu od dvije (, jedne (, jedne (' i jedne ( podjedinice. Sr polimeraze potpuno je sposobna katalizirati polimerizaciju NTPs u RNA, to ukazuje da ( podjedinica nije potrebna za osnovnu katalitiku aktivnost enzima. Meutim, sr enzima ne moe se specifino vezati na sljedove DNA, to je pokazatelj normalne inicijacije transkripcije, stoga je ( podjedinica potrebna za utvrivanje ispravnih mjesta za zapoinjanje transkripcije. Izbor je tih mjesta kritini dio transkripcije, jer sinteza funkcionalne RNA mora zapoeti na poetku gena.

Slijed DNA na koji se vee RNA-polimeraza kako bi zapoela transkripciju gena naziva se promotor. Sljedovi DNA ukljueni u promotorsku funkciju najprije su utvreni usporedbom nukleotidnih sljedova niza razliitih gena izoliranih iz E. coli. Usporedbe su pokazale da podruja uzvodno od mjesta zapoinjanja transkripcije sadre dvije skupine sljedova koje su sline u mnogim genima. Svaki od tih zajednikih sljedova sastoji se od est nukleotida i smjeten je oko 10 i 35 baznih parova uzvodno od poetnog transkripcijskog mjesta (slika 6.2). Oni se nazivaju -10 i -35 dijelovi, oznaavajui njihovu poziciju u odnosu na poetno transkripcijsko mjesto koje je definirano kao +1. Sljedovi na -10 i -35 poziciji u razliitim promotorima nisu jednaki, ali su svi dovoljno slini da postave usuglaeni slijed( najee naene baze na svakoj poziciji.

Nekoliko vrsta eksperimentalnih dokaza potvruju funkcionalnu vanost -10 i -35 promotorskih dijelova. Prvo, geni s promotorima koji se razlikuju od usuglaenih sljedova transkribiraju se manje uinkovito od gena iji se promotori mnogo bolje podudaraju s usuglaenim sljedovima. Drugo, mutacije uvedene bilo u -10 ili u -35 usuglaene sljedove imaju jake uinke na promotorsku funkciju. Tree, mjesta na kojima se RNA-polimeraza vee na promotore izravno su utvrena pokusima otiska stopala, koji se uobiajeno koriste za utvrivanje mjesta na kojima se proteini veu na DNA (slika 6.3). U pokusima te vrste, ulomak DNA radioaktivno je oznaen na jednom kraju. Oznaena DNA inkubira se s proteinima koji se ispituju (primjerice RNA-polimeraza) i naknadno parcijalno ragrauje s DNazom. Naelo je metode da su podruja DNA na koja se vezao protein zatiena od razgradnje DNazom. Stoga se ta podruja mogu utvrditi usporedbom razgradnih produkata DNA na koju su se vezali proteini s identinim paralelnim uzorkom DNA, koja nije bila inkubirana s proteinima. Varijacije ove osnovne metode, koja koristi kemijske reagense za modifikaciju i razgradnju DNA na odreenim nukleotidima, mogu se koristiti za utvrivanje specifinih baza na DNA koje su u kontaktu s proteinom. Analiza otiska stopala pokazala je da se RNA-polimeraza openito vee na promotore preko podruja od oko 60 baznih parova koji se proteu od -40 do +20 ( od 40 nukleotida uzvodno do 20 nukleotida nizvodno od poetnog transkripcijskog mjesta). Podjedinica ( specifino se vee na sljedove u oba -35 i -10 promotorska podruja, potkrepljujui vanost tih sljedova u promotorskoj funkciji. Dodatno, neki E. coli promotori imaju trei slijed smjeten uzvodno od -35 podruja koji je specifian i vee slijed za (-podjedinicu RNA-polimeraze.

U odsutnosti ( podjedinice, RNA-polimeraza vee se nespecifino na DNA s niskim afinitetom. Uloga ( podjedinice sastoji se u upravljanju polimeraze k promotorima specifinim vezivanjem na oba sljeda, -35 i -10, dovodei do zapoinjanja transkripcije na poetcima gena (slika 6.4). Poetno vezivanje izmeu polimeraze i promotora nazvano je zatvorenim promotorskim kompleksom budui da DNA nije odmotana. Polimeraza potom odmotava 14 baza DNA, od -12 do +2, stvarajui otvoreni promotorski kompleks u kome jednolanana DNA slui kao kalup za transkripciju. Transkripcija zapoinje povezivanjem dva slobodna NTPs. Nakon dodatka prvih deset nukleotida, ( podjedinica oslobaa se s polimeraze koja ostavlja promotor i kree se du kalupa DNA da bi nastavila produljenje (elongaciju) rastueg lanca RNA.

Tijekom produljenja, polimeraza ostaje zdruena s kalupom nastavljajui sintezu mRNA. Kako se ona kree du kalupa DNA, polimeraza odmotava kalup ispred sebe, a smotava ga iza sebe, odravajui odmotano podruje od oko 15 baznih parova u dijelu koji se transkribira. Visoko-rezolutna strukturna analiza bakterijske RNA-polimeraze ukazuje da ( i (' podjedinice tvore strukturu slinu rakovim tipaljkama koja vrsto dri DNA kalup (slika 6.5). Unutarnji lijeb izmeu ( i (' podjedinica moe smjestiti 20 baznih parova DNA i sadri aktivno mjesto polimeraze.

Sinteza RNA nastavlja se sve dok polimeraza ne naie na terminacijski znak, na tom se mjestu zaustavlja transkripcija, RNA se oslobaa s polimeraze, a enzim disocira s DNA kalupa. Najjednostavniji i najei terminacijski signal u E. coli sastoji se od simetrino obrnutog ponavljanja sljeda bogatog GC bazama iza kojega slijedi etiri ili vie A baza (slika 6.6). Transkripcija GC-bogatog obrnuto-simetrinog ponavljanja dovodi do stvaranja segmenta RNA koji moe tvoriti stabilne strukture omine peteljke komplementarnim sparivanjem baza. Nastanak takvih struktura u RNA, koje su same sebi komplementarne, raskida asocijaciju RNA s DNA kalupom i zaustavlja transkripciju. S obzirom da su vodikovi mostovi izmeu A i U slabiji nego izmeu G i C, prisutnost A baza nizvodno od obrnuto-ponavljajueg sljeda promie disocijaciju RNA s DNA kalupa. Druge vrste terminacijskih signala, i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama, prije ovise o vezivanju proteina koji zaustavljaju transkripciju na specifinim sljedovima DNA, nego o nastanku strukture peteljke ome u RNA.

1.1.2. Represori i negativna kontrola transkripcije

Pedesetih godina prolog stoljea Franois Jacob i Jacques Monod izveli su pionirska istraivanja regulacije gena u E. coli. Ovi istraivai zajedno sa svojim suradnicima analizirali su ekspresiju enzima djelatnih u metabolizmu laktoze iji se razgradni produkti, glukoza i galaktoza, mogu koristiti kao izvor ugljika i energije (slika 6.7). Enzim koji katalizira razgradnju laktoze ((-galaktozidaza) kao i ostali enzimi djelatni u metabolizmu laktoze eksprimirani su samo ako je laktoza na raspolaganju bakterijama.Inae, stanica je sposobna racionalno gospodariti ne ulaui energiju u sintezu RNA i proteina koji joj nisu potrebni. Tako laktoza inducira sintezu enzima koji sudjeluju u njenom vlastitom metabolizmu. Osim (-galaktozidaze za metabolizam laktoze potrebni su produkti dva druga gena koji su usko povezani: permeaza koja transportira laktozu u stanicu i transacetilaza ija je zadaa inaktivirati toksine tiogalaktozide koji se skupa s laktozom transportiraju u stanicu pomou permeaze. Na osnovi istih genetikih pokusa, Jacob i Monod deducirali su mehanizam kojim je regulirana ekspresija ovih gena, postavljajui model fundamentalan za razumijevanje regulacije transkripcije.

Poetna toka u analizi bila je izolacija mutanti s defektnom regulacijom gena vanih za metabolizam laktoze. Izolirane su dvije vrste mutanti: konstitutivne mutante koje eksprimiraju sva tri gena i u odsutnosti laktoze i neinducibilne mutante koje ne eksprimiraju ove gene ni u prisutnosti laktoze. Genetikim mapiranjem ovih mutanti lokalizirana su dva odvojena mjesta, nazvana o i i smjetena neposredno uzvodno od strukturnog gena za (-galaktozidazu. Genske promjene (mutacije) koje pogaaju o dovode do konstitutivne ekspresije, a mutacije vezane uz i ili do konstitutivne ili do neinducibilne ekspresije.

Funkcije ovih regulatornih gena ispitane su pokusima s dvije bakterijske loze, koje meusobno isprepletene daju diploidne stanice to sadre gene oba roditelja (slika 6.8). Analiza ekspresije gena u takvim diploidnim bakterijama dala je kritiki uvid i definirala koji je alel regulatornih gena dominantan, a koji recesivan. Primjerice, ako se bakterije s normalnim i genom (i+) isprepletu s bakterijama nositeljima mutacije u i genu, to ima za posljedicu konstitutivnu ekspresiju (i( mutacija), a nastale diploidne bakterije pokazuju normalnu inducibilnost. Stoga je normalni i+ gen bio dominantan nad mutiranim i(. Nasuprot tome, prepletanje normalnih bakterija s bakterijama nositeljima oc mutacije (konstitutivna ekspresija) daje diploide s konstitutivnom ekspresijom, ukazujui da je oc dominantan nad o+. Dodatni pokusi u kojima su mutirani o i i kombinirani s razliitim mutacijama u strukturnim genima pokazali su da o utjee na ekspresiju samo onih gena koji su fiziki povezani, dok i utjee na ekspresiju gena na obje kromosomske kopije u diploidnim bakterijama. Tako, u oc/o+ stanici, samo su strukturni geni povezani s oc konstitutivno eksprimirani. Nasuprot tome, u i+/ i( stanici, strukturni geni na oba kromosoma normalno su regulirani. Ti su rezultati doveli do zakljuka da o predstavlja podruje DNA koje kontrolira transkripciju susjednih gena, a i gen kodira regulatorni faktor (protein) koji moe difundirati kroz cijelu stanicu i kontrolirati gene na oba kromosoma.

Model genske regulacije postavljen na temelju ovih pokusa ilustrira slika 6.9. Geni za (-galaktozidazu, permeazu i transacetilazu eksprimirani su kao jedna jedinica nazvana operon. Transkripcija operona kontrolirana je genom o (operator) smjetenim u susjedstvu poetnog mjesta transkripcije. Gen i kodira protein koji vezivanjem na operator kontrolira transkripciju. S obzirom da su i( mutante (to dovodi do konstitutivne ekspresije) recesivne, zakljueno je da te mutante ne mogu stvarati funkcionalni genski produkt. Taj rezultat ukazuje da je normalni produkt i gena represor koji sprjeava transkripciju vezivanjem na o. Prisutnost laktoze izaziva indukciju operona jer se laktoza vee na represor, sprjeavajui tako njegovo vezivanje na operatorsku DNA. U neinducibilnih i mutanti (koje su dominantne nad i+), represor se ne vee na laktozu, pa se ni operon ne moe inducirati.

Model dostatno odgovara rezultatima genetikih pokusa iz kojih je postavljen. U i( stanicama, represor se ne stvara, tako da je lac operon konstitutivno eksprimiran. Diploidne i+/ i( stanice normalno su inducibilne, s obzirom da je funkcionalni represor kodiran i+alelom. Konano, u oc mutanti ne postoji funkcionalni operator te stoga represor ne moe biti vezan. Sukladno tome, oc mutante su dominantne, ali utjeu na ekspresiju samo onih strukturnih gena koji su fiziki s njima povezani.

Mnogi pokusi potvrdili su ovaj temeljni model, ukljuujui i Walter Gilbertovu izolaciju lac represora i analizu njegovog vezivanja na operatorsku DNA 60. godina prolog stoljea. Molekularnom analizom definirana je operatorska DNA kao 20-tak baznih parova DNA smjetenih nekoliko baza ispred inicijacijskog mjesta transkripcije. Analizom otiska stopala identificirano je to podruje kao mjesto na koje se vee represor sprjeavajui transkripciju tako to interferira s vezivanjem RNA-polimeraze na promotor. Kao to je predvieno, laktoza se vee na represor sprjeavajui njegovo vezivanje na operatorsku DNA; sprjeavanje vezivanja represora ima za posljedicu konstitutivnu ekspresiju gena.

Sredinji je princip regulacije gena, protumaen na primjeru laktoza operona, da je kontrola transkripcije posredovana interakcijom regulatornih proteina sa specifinim sljedovima DNA. Opi nain regulacije iroko je primjenjiv i kod prokariotskih i kod eukariotskih stanica. Regulatorni sljedovi poput operatora nazivaju se cis-djelujui kontrolni elementi, s obzirom da utjeu na ekspresiju samo onih gena koji su vezani na istu molekulu DNA. S druge strane, proteini poput represora nazivaju se trans-djelujui initelji jer mogu utjecati na ekspresiju gena smjetenih na drugim kromosomima u stanici. Lac operon je primjer negativne kontrole, jer vezivanje represora sprjeava transkripciju. Meutim, to nije uvijek sluaj; mnogi trans-djelujui initelji prije su aktivatori nego inhibitori transkripcije.

1.1.3. Pozitivna kontrola transkripcije

Najbolje istraen primjer pozitivne kontrole u E. coli jest utjecaj glukoze na ekspresiju gena koji kodiraju enzime djelatne u razgradnji (katabolizmu) drugih eera (ukljuujui laktozu) to predstavljaju alternativni izvor ugljika i energije. Prioritetno se koristi glukoza, tako dok je glukoza na raspolaganju, enzimi djelatni u katabolizmu alternativnih izvora energije nisu eksprimirani. Primjerice, ako E. coli raste u mediju koji sadri i glukozu i laktozu, lac operon se ne inducira, a bakterije koriste samo glukozu. Tako glukoza gui lac operon ak i u prisutnosti normalnog induktora (laktoza).

Danas je poznato da je represija glukozom (openito nazvano represija katabolitom) posredovana pozitivnim kontrolnim sistemom, koji je povezan s razinom ciklikog AMP-a (cAMP) (slika 6.10). Enzim adenil-ciklaza, koji prevodi ATP u cAMP, u bakterijama je reguliran na nain da pad razine glukoze izaziva porast cAMP. cAMP se potom vee na protein koji regulira transkripciju, nazvan kataboliki protein aktivator (CAP). Vezivanje cAMP stimulira vezivanje CAP na ciljni DNA slijed, u lac operonu smjeten oko 60 baza uzvodno od poetnog mjesta transkripcije. CAP zatim stupa u interakciju s ( podjedinicom RNA-polimeraze, promiui vezivanje polimeraze na promotor i aktivirajui transkripciju.

1.2. Eukariotske RNA-polimeraze i transkripcijski faktori

Iako se transkripcija u svim stanicama odvija po istom temeljnom mehanizmu, u eukariotskim stanicama taj je proces znatno sloeniji nego u bakterijama. To se zrcali u dvije izrazite razlike izmeu prokariotskog i eukariotskog sustava. Prvo, dok se u bakterijama svi geni prepisuju pomou jedne jedine RNA-polimeraze, eukariotske stanice sadre nekoliko razliitih RNA-polimeraza koje prepisuju odreene skupine gena. Drugo, eukariotske RNA-polimeraze ne vezuju se izravno na promotorske sljedove nego trebaju interakciju s nizom dodatnih proteina da bi specifino zapoele transkripciju. To poveava sloenost eukariotske transkripcije, posebice sofisticiranu regulaciju genske ekspresije, potrebnu za usmjeravanje aktivnosti velikog broja razliitih stanica u viestaninom organizmu.

1.2.1. Eukariotske RNA-polimeraze

Eukariotske stanice posjeduju tri razliite RNA-polimeraze smjetene u jezgri koje prepisuju razliite skupine gena (Tablica 6.1). Geni koji kodiraju proteine prepisuju se pomou RNA-polimeraze II dajui mRNA, a ribosomalne (rRNAs) i transportne RNA (tRNAs) se prepisuju pomou RNA-polimeraze I i III. RNA-polimeraza I specifino je odreena za transkripciju tri najvee vrste rRNA oznaene kao 28S, 18S i 5,8S u skladu s brzinom njihove sedimentacije. RNA-polimeraza III prepisuje gene za tRNA i za najmanju ribosomalnu RNA (5S rRNA). Neke od malih RNA djelatnih u prekrajanju RNA i prijenosu proteina (snRNAs i scRNAs) takoer se prepisuju pomou RNA-polimeraze III, dok su ostali transkripti nastali uz polimerazu II. Uz to, posebne RNA-polimeraze (sline bakterijskim RNA-polimerazama) nalaze se u kloroplastima i mitohondrijima gdje specifino prepisuju DNA tih organela.

Sve su tri jezgrine RNA-polimeraze sloeni enzimi koji se sastoje od 12 do 17 razliitih podjedinica. Premda prepoznaju razliite promotore i prepisuju razliite skupine gena po nekim su svojstvima meusobno sline, pa ak i s bakterijskom RNA-polimerazom. Posebice, sve tri RNA-polimeraze sadre devet konzerviranih podjedinica, od kojih su pet slini (, (, (( i ( podjedinicama bakterijske RNA-polimeraze. Nedavno kristalografsko odreivanje strukture kvaeve RNA-polimeraze II ponovno je pokazalo kako je arhitektura ove eukariotske RNA-polimeraze vrlo slina bakterijskom enzimu (slika 6.11), sugerirajui da sve RNA-polimeraze koriste temeljni konzervirani mehanizam za transkripciju DNA.

1.2.2.Transkripcijski faktori i zapoinjanje transkripcije pomou RNA-polimeraze II

U aritu veine studija transkripcije nalazi se RNA-polimeraza II s obzirom da je odgovorna za sintezu mRNA gena koji kodiraju proteine. Rani pokuaji prouavanja tog enzima pokazali su da je njegova aktivnost razliita od prokariotske RNA-polimeraze. Tono prepisivanje bakterijskih gena to se moe savreno izvesti in vitro jednostavnim dodatkom proiene RNA-polimeraze DNA molekuli koja sadri promotor, nije mogue u eukariotskom sustavu. Osnova ove razlike rasvijetljena je 1979. godine kada je Robert Roeder sa suradnicima otkrio da je RNA-polimeraza sposobna zapoeti transkripciju samo ako su u reakciji prisutni dodatni proteini. Tako se ini kako su za transkripciju u eukariotskom sustavu potrebni razliiti inicijacijski imbenici, koji (za razliku od bakterijskih ( faktora) nisu zdrueni s polimerazom.

Biokemijskim frakcioniranjem jezgrinog ekstrakta identificirani su specifini proteini (nazvani transkripcijski faktori) koji su potrebni RNA-polimerazi za zapoinjanje transkripcije. Identifikacija i karakterizacija ovih faktora predstavlja najvei dio nastojanja da se razumije transkripcija u eukariotskim stanicama. Utvrene su dvije osnovne skupine transkripcijskih faktora. Opi transkripcijski faktori djelatni su u transkripciji svih promotora polimeraze II i ine dio bazne transkripcijske mainerije. Transkripcijski faktori specifini za gene (razmatrani kasnije u ovom poglavlju) veu se na DNA sljedove koji kontroliraju ekspresiju individualnih gena pa su tako odgovorni za gensku ekspresiju. Procijenjeno je kako oko 5% gena humanog genoma kodira transkripcijske faktore, naglaavajui znaenje ovih proteina.

Za zapoinjanje transkripcije RNA-polimerazom II u uspostavljenom (rekonstituiranom) in vitro sistemu (slika 6.12) potrebno je pet opih transkripcijskih faktora. Promotori mnogih gena koji se prepisuju RNA-polimerazom II sadre slijed slian TATAA 25 do 30 nukleotida uzvodno od poetnog transkripcijskog mjesta. Taj slijed (nazvan TATA-slog) nalikuje 10 sljedu u bakterijskim promotorima, a rezultati uvoenja mutacija u TATA-slog ukazali su na njegovu ulogu u zapoinjanju transkripcije. Prvi je korak u nastanku transkripcijskog kompleksa vezanje opeg transkripcijskog faktora nazvanog TFIID na TATA-slog (TF oznaava transkripcijski faktor; II oznaava polimerazu II). TFIID je i sam sloen od vie podjedinica, ukljuujui protein koji se vee na TATA-slog (TBP), TBP se specifino vee na TATA usuglaeni slijed i oko 10 polipeptida nazvanih faktori zdrueni s TBP (TAFs). Nakon vezivanja TFIID slijedi pridruivanje drugog opeg transkripcijskog faktora (TFIIB) koji se vee na TBP kao i na DNA sljedove prisutne uzvodno od TATA-sloga u nekim promotorima (slika 6.13) TFIIB slui kao most za RNA-polimerazu II koja se vee na kompleks TBP-TFIIB zdruen s treim faktorom, TFIIF.

Slijedei pridruivanje RNA-polimeraze II na promotor, za inicijaciju transkripcije potrebno je vezivanje dva dodatna faktora (TFIIE i TFIIH). TFIIH se sastoji iz vie podjedinica, a igra dvije vane uloge. Prvo, dvije su podjedinice TFIIH helikaze koje odmotavaju DNA oko inicijacijskog mjesta. (Te podjedinice TFIIH jesu XPB i XPD proteini, potrebni za popravak nukleotidnim izrezivanjem, koji serazmatraju u poglavlju 5.) Druga je podjedinica TFIIH proteinska kinaza koja fosforilira ponavljane sljedove prisutne u podruju C-kraja najvee podjedinice RNA-polimeraze II. C-krajnji dio polimeraze II (ili CTD) sastoji se iz uzastopnih ponavljanja (27 ponavljanja u kvasca, a 52 u ovjeka) od 7 amino-kiselina s usuglaenim sljedom Tyr-Ser-Pro-Thr- Ser- Pro-Ser. Fosforilacija ovih amino-kiselina oslobaa polimerazu iz njenog zdruenja s preinicijacijskim kompleksom i vodi do pridruivanja drugih proteina koji doputaju polimerazi da zapone transkripciju te dalje sintetizira rastui mRNA lanac.

Uz TATA-slog promotori mnogih gena koji se prepisuju RNA-polimerazom II sadre jo jedan vaan element ( inicijator, ili Inr slijed) koji se protee unutar poetnog mjesta za transkripciju. tovie, neki promotori RNA-polimeraze II sastoje se samo od Inr elementa, bez TATA-sloga. Mnogi promotori koji ne sadre TATA-slog, a sadre Inr element, takoer sadre jo jedan nizvodni promotorski element (DPE) smjeten oko 30 baznih parova nizvodno od poetnog mjesta za transkripciju koji kooperativno funkcionira s Inr sljedom. Inicijacija tih promotora zahtjeva TFIID (i TBP), premda TBP oito ne prepoznaje takve promotore izravnim vezivanjem na TATA-slog. Umjesto toga ini se da se podjedinice TFIID (TAFs) veu na Inr i DPE. Vezanje TAF na ove elemente pridruuje TBP, TFIIB i polimerazu II promotoru nakon ega se zdruuju ostali transkripcijski faktori kako je ve opisano. TBP tako igra sredinju ulogu u inicijaciji transkripcije polimerazom II, ak i ako promotori ne posjeduju TATA-slog.

Premda ovdje opisano sekvencijsko pridruivanje pet opih transkripcijskih faktora i RNA-polimeraze II predstavlja minimalni sustav potreban za transkripciju in vitro, u stanici su potrebni dodatni faktori. Oni obuhvaaju posredniki proteinski kompleks (engl. Mediator) koji omoguuje da polimeraza odgovori na transkripcijske faktore specifine za gene koji reguliraju gensku ekspresiju. Najmanje je jedan dio RNA-polimeraze II u kvasca i u stanicama sisavaca prisutan u obliku velikog kompleksa (nazvan RNA-polimeraza II holoenzim) u kojem je polimeraza zdruena s posrednikim proteinima, kao i s skupinom opih transkripcijskih faktora ukljuujui TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH. Posredniki su proteini zdrueni s domenom na C-kraju (CTD) polimeraze II, a oslobaaju se s polimeraze pratei zdruivanje preinicijacijskog kompleksa i fosforiliranje polimerazne domene na C-kraju (slika 6.14). Fosforilirana CTD potom vee ostale proteine koji promiu transkripcijsku elongaciju i djeluju u procesu obrade mRNA, kako se razmatra kasnije u ovom poglavlju.

1.2.3. Transkripcija polimerazom I i III

Kako je ranije razmatrano, razliite RNA-polimeraze odgovorne su za transkripciju gena koji kodiraju ribosomalne i transportne RNA u eukariotskim stanicama. Meutim, sve tri RNA-polimeraze trebaju dodatne transkripcijske faktore zdruene s odgovarajuim promotorskim sljedovima. Nadalje, premda tri razliite polimeraze u eukariotskim stanicama prepoznaju razliite vrste promotora, ini se da je transkripcijski faktor ( protein koji se vee na TATA-slog (TBP) ( potreban za inicijaciju transkripcije bilo kojim od tri enzima.

RNA-polimeraza I odreena je iskljuivo za transkripciju gena za ribosomalne RNA, prisutnih u uzastopnim ponavljanjima. Transkripcijom tih gena nastaje velika 45S pre-rRNA koja obradom daje 28S, 18S i 5,8S rRNA (slika 6.15). Promotor gena za ribosomalne RNA obuhvaa oko 150 baznih parova neposredno uzvodno od inicijacijskog mjesta transkripcije. Te promotorske sljedove prepoznaju dva transkripcijska faktora, UBF (faktor koji se vee uzvodno, engl. upstream binding factor) i SL1 (faktor selekcije 1, engl. selectivity factor 1), koji se kooperativno veu na promotor i potom pridruuju polimerazu I da bi nastao inicijacijski kompleks (slika 6.16). SL1 transkripcijski faktor sastoji se od etiri podjedinice, a jedna od njih je TBP. Uloga TBP izravno je pokazana nalazom da su kvasci nositelji mutacije u TBP defektni ne samo u transkripciji gena uz polimerazu II, nego i u transkripciji gena uz polimeraze I i III. Tako je TBP zajedniki transkripcijski faktor potreban za sve tri vrste eukariotskih RNA-polimeraza. S obzirom da geni koji kodiraju ribosomalne RNA ne sadre TATA-slog, TBP se ne vee na specifini promotorski slijed. Umjesto toga, zdruenje TBP s genima za ribosomalne RNA je posredovano vezivanjem drugih proteina iz SL1 kompleksa na promotor to je slino zdruivanju TBP s Inr sljedovima gena, koje prepisuje polimeraza II, a koji ne posjeduju TATA-slog.

Geni za tRNA, 5S rRNA i neke male RNA molekule djelatne u RNA-prekrajanju i prijenosu proteina prepisuju se uz polimerazu III. Ti se geni prepisuju od tri razliite skupine promotora, od kojih su dva smjetena prije unutar nego uzvodno od sljeda koji se prepisuje (slika 6.17). Najvie prouavani geni od svih koji se prepisuju uz polimerazu III jesu geni za 5S rRNA Xenopusa. TFIIIA (prvi proieni transkripcijski faktor) inicira zdruivanje transkripcijskog kompleksa vezivanjem na specifine sljedove DNA i 5S rRNA promotoru. To je vezivanje praeno sekvencijskim vezivanjem TFIIIC, TFIIIB i polimeraze. Promotori gena za tRNA razlikuju se od 5S rRNA promotora time to ne posjeduju slijed DNA koji prepoznaje TFIIIA. Umjesto toga TFIIIC se izravno vee na promotore gena za tRNA, sluei za pridruivanje TFIIIB i polimeraze da bi nastao transkripcijski kompleks. Promotori tree skupine gena prepisivanih polimerazom III, ukljuujui i gene za male jezgrine RNA djelatne u RNA-prekrajanju, smjeteni su uzvodno od poetnog transkripcijskog mjesta. Ti promotori sadre TATA-slog (slino promotorima za polimerazu II) kao i vezujua mjesta za druge faktore nazvane SNAP. SNAP i TFIIIB veu se kooperativno na promotore, s tim da se TFIIIB izravno vee na TATA-slog. Vezivanje je posredovano proteinom koji se vee na TATA-slog, TBP, podjedinicom TFIIIB. Kao i u sluaju promotora za gene prepisivane polimerazom III, TFIIIB potom pridruuje polimerazu u transkripcijski kompleks.

1.3. Regulacija transkripcije u eukariota

Premda je kontrola ekspresije gena puno sloenija u eukariotima nego u bakterijama, vrijede isti temeljni principi. Ekspresija eukariotskih gena primarno je kontrolirana na razini inicijacije transkripcije, a u mnogim sluajevima i tijekom elongacije. Kao i kod bakterija, transkripcija u eukariotskim stanicama kontrolirana je proteinima koji se specifino veu za regulatorne sljedove i moduliraju aktivnost RNA-polimeraze. Meutim, vana razlika izmeu regulacije transkripcije u prokariotskim i eukariotskim stanicama, rezultat je pakiranja eukariotske DNA u kromatin koji ograniava raspoloivost DNA kao kalupa za transkripciju. Stoga, modifikacija kromatinske strukture igra kljunu ulogu u kontroli transkripcije u eukariotskim stanicama.

1.3.1. Cis-djelujui regulatorni sljedovi: promotori i pojaivai

Kako je upravo obrazloeno, transkripcija je u bakterijama regulairana vezivanjem proteina na cis-djelujue sljedove (primjerice lac operator) koji kontroliraju transkripciju susjednih gena. Slini cis-djelujui sljedovi reguliraju ekspresiju eukariotskih gena. Ti su sljedovi identificirani u stanicama sisavaca primjenom testa prijenosa gena za studij vjerojatnih regulatornih podruja kloniranih gena (slika 6.18). Eukariotski regulatorni sljedovi obino su vezani na reporterski gen koji kodira enzim jednostavan za detekciju. Ekspresija reporterskog gena nakon prijenosa u kultivirane stanice omoguuje osjetljivo ispitivanje sposobnosti kloniranih regulatornih sljedova da upravljaju transkripcijom. Bioloki aktivna regulatorna podruja mogu se tako utvrditi, a in vivo mutageneza se primjenjuje za utvrivanje uloge specifinih sljedova unutar odreenog podruja.

Geni koji se prepisuju RNA-polimerazom II imaju srne promotorske elemente, zajedno s TATA-slogom i Inr sljedom koji slue kao vezna mjesta za ope transkripcijske faktore. Drugi cis-djelujui sljedovi slue kao vezna mjesta za iroku lepezu regulatornih faktora koji kontroliraju ekspresiju individualnih gena. Cis-djelujui regulatorni sljedovi su esto, ali ne uvijek, smjeteni uzvodno od TATA-sloga. Primjerice, dva regulatorna sljeda, naena u mnogim eukariotskim genima, identificirana su istraivanjem promotora gena koji kodira timidin kinazu u virusu herpes simplex (slika 6.19). Oba sljeda smjetena su unutar 100 baznih parova uzvodno od TATA-sloga: usuglaeni su njihovi sljedovi CCAAT i GGGCGG (nazvan GC-slog). Specifini proteini koji se veu na te sljedove i stimuliraju transkripciju takoer su identificirani.

Nasuprot relativno jednostavnoj organizaciji CCAAT i GC-slogova u promotoru gena za timidin kinazu kod herpes virusa, mnoge gene u stanicama sisavaca kontroliraju regulatorni sljedovi smjeteni vrlo daleko (ponekad vie od 10 kilobaza) od poetnog transkripcijskog mjesta. Ti sljedovi, nazvani pojaivai (engl. enhancer), prvotno su identificirani tijekom istraivanja promotora jednog drugog virusa, SV40 (slika 6.20). Za uinkovitu transkripciju kontroliranu tim promotorom, osim TATA-sloga potrebni su i est GC-slogova te dva ponavljanja od 72-bazna para smjetena dalje uzvodno. Utvreno je da ti sljedovi stimuliraju transkripciju od drugih promotora kao i od SV40 te da, izneneujue, njihova aktivnost ne ovisi niti o udaljenosti niti o orijentaciji u odnosu na inicijacijsko transkripcijsko mjesto (slika 6.21). Oni mogu stimulirati transkripciju bez obzira jesu li smjeteni uzvodno ili nizvodno od promotora ili u orijentaciji naprijed ili nazad.

Sposobnost pojaivaa da djeluju i kad su vrlo udaljeni od inicijacijskog mjesta za transkripciju sugerira u prvi mah da oni funkcioniraju po drugom principu od promotora. Meutim, ta je pretpostavka odbaena: pojaivai, slino promotorima, funkcioniraju vezivanjem transkripcijskih faktora koji potom mogu regulirati RNA-polimerazu. To je mogue s obzirom na postojanje DNA omi to omoguuje transkripcijskim faktorima vezanim na udaljene pojaivae da stupaju u interakciju s proteinima zdruenim s RNA-polimerazom na promotoru (slika 6.22). Tako transkripcijski faktori vezani na udaljene pojaivae djeluju na isti nain kao i oni vezani na susjedne promotore, to znai da nema fundamentalne razlike izmeu djelovanja pojaivaa i cis-djelujuih regulatornih sljedova u susjedstvu poetnog mjesta za transkripciju. Zanimljivo je da su pojaivai prvo identificirani u stanicama sisavaca, a potom naeni i u bakterijama ( neobian sluaj da istraivanja eukariota slue kao model za jednostavnije prokariotske sustave.

Vezivanje specifinih transkripcijskih regulatornih proteina na pojaivae odgovorno je za kontrolu ekspresije gena tijekom razvoja i diferencijacije, kao i za odgovor stanica na hormone i faktore rasta. Jedan od najbolje istraenih pojaivaa sisavaca kontrolira transkripciju gena za imunoglobulin u B limfocitima. Pokusima prijenosa gena ustanovljeno je da je imunoglobulinski pojaiva aktivan samo u limfocitima, a ne i u drugim vrstama stanica. Tako je ovaj regulatorni slijed djelomino odgovoran za specifinu tkivnu ekspresiju imunoglobulinskih gena u odgovarajui diferenciranim staninim vrstama.

Vaan je aspekt pojaivaa to to oni sadre vie funkcionalnih elemenata koji veu razliite regulatorne proteine. Kada djeluju zajedno, ti proteini reguliraju ekspresiju gena. Pojaiva tekog lanca imunoglobulina, primjerice, obuhvaa oko 200 baznih parova i sadri najmanje devet razliitih elemenata koji slue kao vezujua mjesta za proteine (slika 6.23). Mutacija bilo kojeg od sljedova smanjuje, ali ne unitava pojaivaku aktivnost, ukazujui da su funkcije individualnih proteina koji se veu na pojaiva, najmanje, dijelom suvine. Mnogi od pojedinanih sljedova imunoglobulinskog pojaivaa sami po sebi stimuliraju transkripciju u nelimfoidnim stanicama. Stoga ograniena aktivnost cijelog pojaivaa u B limfocitima nije rezultat specifine tkivne funkcije svake od njegovih komponenata. Umjesto toga, specifina tkivna ekspresija posljedica je kombinacije individualnih sljednih elemenata koji upotpunjuju cijeli pojaiva. Ti elementi obuhvaaju neke cis-djelujue regulatorne sljedove koji veu transkripcijske aktivatore, specifino eksprimirane u B limfocitima, kao i druge regulatorne sljedove koji veu represore u nelimfoidnim stanicama. Prema tome, imunoglobulinski pojaiva sadri negativne regulatorne elemente koji inhibiraju transkripciju u neodgovarajuoj vrsti stanica, ali i pozitivne regulatorne elemente koji aktiviraju transkripciju u B limfocitima. Ukupna aktivnost pojaivaa vea je od zbroja pojedinanih aktivnosti, odraavajui kombinirano djelovanje proteina zdruenih sa svakim individualnim sljedom.

Premda stvaranje omi u DNA molekuli omoguava pojaivaima da djeluju sa znatne udaljenosti od promotora, aktivnost bilo kojeg pojaivaa specifina je za promotor odreenog ciljanoga gena. Ta se specifinost odrava pomou inzulatora koji dijele kromosome u neovisna podruja i sprjeavaju pojaivae da djeluju na promotore smjetene u oblinjem podruju. Inzulatori takoer sprjeavaju irenje kromatinske strukture jedne domene na susjedstvo, i tako odraavaju neovisno regulirana podruja genoma.

1.3.2. Transkripcijski regulatorni proteini

Izoliranje velikog broja razliitih transkripcijskih regulatornih proteina utemeljeno je na njihovom specifinom vezanju na promotorske ili pojaivake sljedove. Vezivanje proteina na DNA sljedove analizirano je s dva tipa pokusa. Prvi tip, otisak stopala opisan je ranije u svezi s vezivanjem RNA-polimeraze na prokariotske promotore (vidi sliku 6.3). Drugi je pristup test pomaka u elektroforetskoj pokretljivosti, u kojem se radioaktivno oznaeni fragment DNA inkubira s proteinima, a potom podvrgne elektroforetskoj separaciji na nedenaturirajuem gelu (slika 6.24). Vezanje proteina detektira se kao smanjenje elektroforetske pokretljivosti fragmenta DNA, s obzirom da je njegovo kretanje kroz gel usporeno vezanim proteinom. Kombinirana primjena otiska stopala i pomaka u elektroforetskoj pokretljivosti omoguila je usporedbu vezujuih mjesta za proteine s regulatornim elementima pojaivaa i promotora te ukazala da ti sljedovi openito sainjavaju mjesta prepoznavanja specifinih proteina koji se veu na DNA.

Robert Tjian i suradnici prvi su identificirali jedan od prototipova eukariotskog transkripcijskog faktora istraujui transkripciju SV40 DNA. Utvreno je da taj faktor (nazvan Sp1, od engl. specificity protein 1) stimulira transkripciju od SV40 promotora, ali ne od nekoliko drugih promotora u ekstraktima bez stanica (engl. cell-free extracts). Takoer je utvreno da stimulacija transkripcije Sp1 ovisi o prisutnosti GC-slogova u SV40 promotoru: ako su ti sljedovi deletirani sprjeena je stimulacija Sp1. tovie, pokusima otiska stopala utvreno je da se Sp1 specifino vee na GC-slogove. Uzevi sve u obzir, rezultati ukazuju da GC-slog predstavlja specifino vezujue mjesto za aktivator transkripcijske ( Sp1. Slini pokusi pokazali su da mnogi drugi transkripcijski regulatorni sljedovi, zajedno s CCAAT-slogom i razliitim drugim elementima imunoglobulinskog pojaivaa, takoer predstavljaju mjesta prepoznavanja za proteine koji se veu na specifine sljedove DNA.

Specifino vezanje Sp1 na GC-slog ne predstavlja samo djelovanje Sp1 kao transkripcijskog faktora, nego i opi pristup proiavanju transkripcijskih faktora. Izolacija tih proteina prvotno je predstavljala golem izazov s obzirom da su prisutni u vrlo malim koliinama (npr. samo 0,001% ukupnih staninih proteina) koje je teko proistiti konvencionalnim biokemijskim tehnikama. Problem je otklonjen proiavanjem Sp1 DNA-afinitetnom kromatografijom (slika 6.25). Mnogobrojne kopije oligonukleotida, koji odgovaraju sljedu GC-sloga, vezane su na vrsti nosa, a stanini ekstrakt prolazi kroz oligonukleotidnu kolonu. Poto je Sp1 vezan na GC-slog (KLJUNI POKUS 1: Izolacija eukariotskog transkripcijskog faktora, str. 251) jakim afinitetom, specifino je zadran na koloni, dok ostali proteini nisu. Proieni Sp1 mogao se tako ponovno dobiti i koristiti za studij, ukljuujui i odreivanje njegovog aminokiselinskog sljeda, nakon ega se moe klonirati Sp1 gen.

Metoda DNA-afinitetne kromatografije, prvotno optimirana za proiavanje Sp1, uspjeno je koritena za izolaciju velikog broja proteina koji se veu na specifine sljedove DNA iz eukariotskih stanica. Geni koji kodiraju druge transkripcijske faktore izolirani su pretraivanjem cDNA ekspresijskih knjinica na rekombinantni protein koji se vee na specifine sljedove. Kloniranje i sekvenciranje cDNA za transkripcijske faktore omoguilo je brojne informacije o strukturi i funkciji ovih vanih regulatornih proteina.

1.3.3. Struktura i funkcija transkripcijskih aktivatora

S obzirom da transkripcijski faktori imaju sredinju ulogu u regulaciji ekspresije gena, razumijevanje mehanizama njihova djelovanja najvee je podruje znanstvenog interesa u staninoj i molekularnoj biologiji. Najvie su istraeni transkripcijski aktivatori, koji se, slino Sph1, veu na rgulativne DNA sljedove i stimuliraju transkripciju. Openito, ti se faktori sastoje od dvije domene: jedna se domena specifino vee na DNA, a druga stimulira transkripciju stupanjem u interakciju s drugim proteinima, ukljuujui komponente transkripcijske mainerije (slika 6.26). Transkripcijski su faktori modularni proteini, u smislu da se DNA vezujua i aktivirajua domena razliitih faktora moe meusobno zamjenjivati pomou tehnika rekombinantne DNA. Takvim manipulacijama nastaju hibridni transkripcijski faktori koji aktiviraju transkripciju vezivanjem na promotorske ili pojaivake sljedove kako je odreeno njihovom vezujuom domenom. Iz tog proizlazi da je osnovna funkcija domene za vezivanje na DNA sidrenje transkripcijskog faktora na prikladno mjesto na DNA; aktivacijska domena potom neovisno stimulira transkripciju interakcijom protein-protein.

Mnogi razliiti transkripcijski faktori identificirani su u eukariotskim stanicama i, kako se oekivalo, pokazali su svu kompleksnost tkivno-specifine i inducibilne genske ekspresije u sloenim viestaninim organizmima. Molekularna je karakterizacija pak rasvijetlila slinost domena za vezivanje na DNA u mnogim tim proteinima (slika 6.27). Domene cinkova prsta sadre ponavljanja cisteinskih i histidinskih ostataka koji veu cinkove ione i smotani su u ome ("prsti") to se veu na DNA. Prvotno su te domene identificirane u transkripcijskom faktoru polimeraze III, TFIIIA, ali su prisutne i u transkripcijskim faktorima koji reguliraju promotore polimeraze II, ukljuujui i Sph1.

Drugi primjeri transkripcijskih fakotra to sadre domenu cinkovog prsta jesu receptori za steroidne hormone, regulatori transkripcije gena u odgovoru na steroidne hormone, kao to su estrogen i testosteron.

Uzvojnica-okret-uzvojnica (helix-turn-helix) motiv prvi je put prepoznat kod prokariotskih proteina koji se veu na DNA, ukljuujui E. coli protein aktivator katabolizma (CAP). U tih proteina jedna uzvojnica ostvaruje veinu kontakata s DNA, dok druga uzvojnica premouje kompleks da bi stabilizirala interakciju. U eukariotskim stanicama proteini uzvojnica-okret-uzvojnica ukljuuju homeodomenske proteine koji su vani u regulaciji genske ekspresije tijekom embrionalnog razvoja. Geni koji kodiraju te proteine najprije su otkriveni u razvojnim mutantama Drosophilae. Neke od najranije prepoznatih mutanti Drosophilae (nazvane homeotske mutante 1984. godine) dovode do razvoja muica kod kojih je jedan dio tijela transformiran u drugi. Primjerice, u homeotskoj mutanti nazvanoj Antennapedia, noge, a ne antene, rastu iz glave muice (slika 6.28). Pionirskim radom Ed Lewisa u 40. godinama prolog stoljea, napravljena je genetika analiza te muice i pokazalo se da Drosophila sadri devet homeotskih gena, a svaki od njih odgovoran je za identitet odreenog dijela tijela. Molekularno kloniranje i analiza tih gena ukazala je da oni sadre konzervirane sljedove od 180 baznih parova (nazvane homeo-slogovima) koji kodiraju domene transkripcijskih fakotra to se vezuju na DNA (homeodomene). Mnogo homeodomenskih proteina naeno je u gljivama, biljkama i ivotinjama, kao i kod ovjeka. Geni s homeo-slogovima u kraljenjaka vrlo su slini, strukturno i funkcionalno, takvim genima u Drosophili, to govori o evolucijski vrlo ouvanim ulogama tih transkripcijskih faktora u ivotinjskom razvoju.

Druge dvije porodice proteina koji se veu na DNA, proteini s leucinskim zatvaraem i uzvojnica-oma-uzvojnica proteini, sadre vezujue domene nastale dimerizacijom dvaju polipeptidnih lanaca. Leucinski zatvara sadri etiri ili pet leucinskih ostataka razmaknutih u intervalima od po sedam aminokiselina, ime su njihovi hidrofobni postranini lanci izloeni na jednoj strani uzvojnice. Taj dio uzvojnice slui kao dimerizacijska domena za dvije proteinske podjedinice koje se dre zajedno hidrofobnim interakcijama postraninih lanaca leucina. Odmah nakon domene s leucinskim ziperom nalazi se domena bogata pozitivno nabijenim aminokiselinama (lizin i arginin) koja se vee na DNA. Proteini uzvojnica-oma-uzvojnica sline su strukture, osim to je svaka njihova dimerizacijska domena izgraena od dvije uzvojnice razdvojene omom. Vano je svojstvo transkripcijskih faktora tipa leucinskih zatvaraa ili uzvojnica-oma-uzvojnica to razliiti lanovi ovih porodica mogu dimerizirati meusobno. Tako kombinacija razliitih proteinskih podjedinica moe stvarati veliki broj faktora koji se razlikuju, kako u prepoznavanju sljeda DNA na koji se veu, tako i u stimulaciji transkripcije. Proteini s leucinskim zatvaraem i uzvojnica-oma-uzvojnica proteini vani su u regulaciji specifine tkivne i inducibilne genske ekspresije, a nastanak dimera izmeu razliitih lanova tih porodica vaan je aspekt kontrole njihove funkcije.

Aktivirajua domena nije tako dobro karakterizirana kao vezujua domena. Neke, nazvane kisele aktivirajue domene, bogate su negativno nabijenim ostatcima (aspartat i glutamat), druge su pak bogate prolinima i glutaminima. Aktivirajue domene eukariotskih transkripcijskih faktora stimuliraju transkripciju na dva razliita naina (slika 6.29). Prema prvom mehanizmu, one reagiraju s posrednikim proteinima i opim transkripcijskim faktorima kao to su TFIIB ili TFIID da bi pridruili RNA polimerazu i olakali zdruivanje transkripcijskog kompleksa na promotoru, slino transkripcijskim aktivatorima u bakterijama (vidi sliku 6.10). Nadalje, eukariotski transkripcijski faktori stupaju u interakciju s mnogim koaktivatorima koji stimuliraju transkripciju modificiranjem strukture kromatina, kako e se i razmatrati kasnije u ovom poglavlju.

1.3.4. Eukariotski represori

Ekspresija gena u eukariotskim stanicama regulirana je kako represorima tako i transkripcijskim aktivatorima. Slino prokariotskim represorima, eukariotski se represori veu na specifian slijed DNA i inhibiraju transkripciju. U nekim sluajevima eukariotski represori jednostavno interferiraju s vezivanjem drugih transkripcijskih faktora na DNA (slika 6.30). Primjerice, vezivanje represora u blizini poetnog mjesta za transkripciju moe sprijeiti interakciju RNA polimeraze ili opih transkripcijskih faktora s promotorom, to je slino djelovanju represora u bakterijama. Drugi se represori natjeu s aktivatorima za vezanje na specifian regulatorni slijed. Tako neki represori sadre istu domenu za vezivanje na DNA kao i aktivatori, ali nemaju njihovu aktivacijsku domenu. Posljedica je toga da njihovo vezanje na promotor ili pojaiva sprjeava vezanje aktivatora na to mjesto ime je inhibirana transkripcija.

U opreci spram receptora koji jednostavno interferiraju s vezanjem aktivatora, drugi represori (nazvani aktivni represori) sadre specifine funkcionalne domene koje inhibiraju transkripciju protein-protein interakcijama (slika 6.30B). Prvi takav aktivni represor opisan je 1990. godine pri istraivanju gena nazvanog Krppel, djelatnog u embrionalnom razvoju Drosophilae. Molekularna analiza Krppel proteina pokazala je da on sadri diskretnu represijsku domenu povezanu s domenom cinkovog prsta koja se vee na DNA. Krppelova represijska domena moe se izmjenjivati s odreenim domenama transkripcijskih faktora koje se veu na DNA. Takve hibridne molekule, takoer, djeluju represijski na transkripciju, to ukazuje da Krppelova represijska domena inhibira transkripciju preko protein-protein interakcija, neovisno o mjestu njegova vezivanja na DNA.

Utvreno je da mnogi aktivni represori imaju kljunu ulogu u regulaciji transkripcije u ivotinjskim stanicama, u mnogim sluajevima oni su kritini regulatori staninog rasta i diferencijacije. Kao i kod transkripcijskih aktivatora, identificirano je nekoliko razliitih vrsta represijskih domena. Primjerice, represijska domena Krppelova proteina bogata je alaninskim ostatcima, dok su druge represijske domene bogate prolinom ili kiselim ostatcima. Funkcionalni su ciljevi represora takoer razliiti; represori mogu inhibirati transkripciju interakcijom sa specifinim aktivatorskim ili posrednikim proteinima ili s opim transkripcijskim faktorima ili pak, s korepresorima koji modificiraju kromatinsku strukturu.

Regulacija transkripcije represorima, kao i aktivatorima, znaajno iri niz mehanizama koji kontroliraju ekspresiju eukariotskih gena. Znaajna uloga represora mogla bi biti inhibicija ekspresije gena u odreenim tkivima. Primjerice, kako je napomenuto ranije, mjesto za vezanje represora u imunoglobulinskom pojaivau pridonosi specifinoj tkivnoj ekspresiji, sprjeavajui transkripciju u ne-limfoidnim stanicama. Drugi represori igraju kljune uloge u kontroli proliferacije i diferencijacije stanica izloenih djelovanju hormona i faktora rasta (vidi poglavlja 13 i 14).

1.3.5. Povezanost kromatinske strukture i transkripcije

Kako je napomenuto u prethodnoj diskusiji, aktivatori i represori reguliraju transkripciju u eukariotima, ne samo interakcijom s drugim imbenicima transkripcijske mainerije, nego i izazivanjem promjena u kromatinskoj strukturi. DNA svih eukariotskih stanica vezana je na histone. Osnovna strukturna jedinica kromatina jest nukleosom koji se sastoji od 146 baznih parova DNA omotane oko dvije molekule svakog histonskog proteina, H2A, H2B, H3 i H4, te jedne molekule histona H1 vezanog na DNA pri ulasku u sr nukleosomske estice (vidi sliku 4.12). Kromatin je potom kondenziran smotavanjem u obliku spirale u strukturu vieg reda organiziranu u velike ome DNA. Ovakvo pakiranje eukariotske DNA u kromatin sigurno ima vane posljedice po raspoloivost DNA kao kalupa za transkripciju. Tako kromatinska struktura predstavlja kritian apekt genske ekspresije u eukariotskim stanicama.

Geni koji se aktivno transkribiraju smjeteni su u relativno dekondenziranom kromatinu, koji se vjerojatno podudara s 30-nm kromatinskim vlaknom razmatranim u 4. poglavlju (vidi sliku 4.13). Primjerice, mikroskopska vizualizacija politenskog kromosoma Drosophilae ukazuje da se podruja genoma, aktivno upletena u sintezu RNA, podudaraju s dekondenziranim kromosomskim dijelom (slika 6.31). Usprkos tomu, aktivno prepisivani geni ostaju vezani na histone i pakirani u nukleosome, transkripcijski faktori i RNA-polimeraza stalno se susreu s problemom interakcije prije s kromatinom nego s golom DNA. Gusto namotana DNA oko sri nukleosomske estice najvea je prepreka transkripciji, to utjee kako na sposobnost transkripcijskih faktora da se veu na DNA, tako i na sposobnost RNA-polimeraze da transkribira kroz kromatinski kalup.

Nekoliko modifikacija, obuhvaajui i modifikacije histona, karakteristine su za transkripcijski aktivan kromatin, ukljuujui modifikacije histona, rearanman nukleosoma te zdruivanje dva nehistonska kromosomalna proteina, nazvana HMGN proteini, s nukleosomima aktivno transkribiranih gena. Vezna mjesta za HMGN na nukleosomima preklapaju se s veznim mjestima za histon H1 i ini se da HMGN proteini stimuliraju transkripciju, mijenjajui interakciju histona H1 s nukleosomima da bi odrali dekondenziranu kromatinsku strukturu.

Acetiliranje histona povezivalo se s transkripcijski aktivnim kromatinom u vrlo velikom broju staninih vrsta (slika 6.32). Srni histoni (H2A, H2B, H3 i H4) imaju dvije domene: domena histonskog namatanja, ukljuena u interakcije s drugim histonima i smotavanje DNA oko sri nukleosomske estice, te domena repa na amino-kraju koja se prua izvan nukleosoma. Repna domena na amino-kraju bogata je lizinom i moe se modificirati acetiliranjem na specifinim lizinskim ostatcima. Acetiliranje smanjuje ukupni pozitivni naboj histona, a moe i oslabiti njihovo vezanje na DNA kao i promijeniti njihove interakcije s drugim proteinima. tovie, pokazano je da acetiliranje histona olakava vezanje transkripcijskih faktora na nukleosomalnu DNA, to ukazuje da acetiliranje histona poveava pristupanost kromatina proteinima koji se veu na DNA.

Istraivanja dvije skupine znanstvenika 1996. godine pruila su dokaze o izravnoj svezi izmeu acetiliranja histona i reguliranja transkripcije te pokazala da su transkripcijski aktivatori i represori zdrueni s acetil-transferazom i deacetilazom. Ta je asocijacija prvi put otkrivena pri kloniranju gena koji kodira histonsku acetil-transferazu u Tetrahymeni. Neoekivano, sekvenca histonske acetil-transferaze u bliskoj je svezi s prethodno poznatim transkripcijskim koaktivatorom u kvascima, nazvanim Gcn5p, koji stimulira transkripciju u povezanosti s nekoliko razliitih specifinih transkripcijskih aktivatora. Daljnji su pokusi otkrili da sam Gcn5p djeluje kao acetil-transferaza, sugerirajui da je aktiviranje transkripcije izravna posljedica acetiliranja histona. Rezultati su proireni spoznajama o tome da je acetil-transferaza zdruena s brojnim transkripcijskim koaktivatorima sisavaca, kao i s opim transkripcijskim faktorom TFIID. Naprotiv, mnogi transkripcijski korepresori kako u stanicama kvasca tako i u stanicama sisavaca djeluju kao histonske deacetilaze, uklanjajui acetilnu skupinu s histonskog repa. Acetiliranje histona tako je izravna meta i transkripcijskih aktivatora i represora, ukazujui da acetiliranje ima kljunu ulogu u regulaciji genske ekspresije u eukariotima.

Histoni se ne modificiraju samo acetiliranjem, nego i fosforiliranjem serinskih ostataka, metiliranjem lizinskih i argininskih ostataka te dodatkom ubikvitina (mali peptid razmatran u 7. poglavlju) na lizinske ostatke. Slino acetiliranju, ove se modifikacije dogaaju na specifinim aminokiselinskim ostatcima u histonskom repu, a povezane su s promjenama transkripcijske aktivnosti (slika 6.33). Pored toga to utjeu na kromatinsku strukturu pretpostavljeno je da histonske modifikacije utjeu i na gensku ekspresiju priskrbom veznih mjesta za druge proteine koji reguliraju transkripciju. U skladu s tom hipotezom, kombinacija specifinih histonskih modifikacija tvori "histonski kod" koji regulira gensku ekspresiju pridruivanjem drugih regulatornih proteina na kromatinski kalup. Primjerice, transkripcijski aktivan kromatin u svezi je s nekoliko specifinih modifikacija histona H3, ukljuujui metiliranje lizina-4, fosforiliranje serina-10 te acetiliranje lizina-9 i lizina-14. Nasuprot tome, metiliranje lizina-9 povezano je s represijom, a enzim koji katalizira metiliranje H3 lizina-9 pridruuje se ciljnim genima pomou korepresora. Metilirani lizinski ostatak na poziciji 9 u H3 histonu slui, kako je naknadno pokazano, kao vezno mjesto za proteine koji induciraju kondenzaciju kromatina, izravno povezujui ovu histonsku modifikaciju s represijom transkripcije.

Treba imati na umu da te modifikacije histonskog repa reguliraju svaku sljedeu, dovodei do potvrde da razliiti uzorci histonskih modifikacija koreliraju s transkripcijskom aktivnou. Primjerice, fosforiliranje H3 serina-10 promovira acetiliranje lizina-14, ali inhibira metiliranje lizina-9, dovodei do postavke uzorka H3 modifikacije koji je karakteristian za transkripcijski aktivan kromatin. Metiliranje lizina-4 takoer inhibira metiliranje lizina-9 i obrnuto, to je u skladu s obrnutim djelovanjem metiliranja ovih dvaju lizinskih ostataka na transkripcijsku aktivaciju odnosno represiju. Meusobni utjecaji modifikacija razliitih ostataka daju tako uzorke histonske modifikacije koji osiguravaju stabilni regulatorni kod za transkripcijsku aktivnost kromatina.

Nasuprot enzimima koji reguliraju kromatinsku strukturu modificiranjem histona, nukleosomalni remodelirajui faktori jesu proteinski kompleksi koji mijenjaju aranman ili strukturu nukleosoma bez uklanjanja ili kovalentne modifikacije histona (slika 6.34). Jedan mehanizam kojim djeluju nukleosomalni remodelirajui faktori jest taj da kataliziraju pomicanje histonskih oktamera du DNA. Tako se repozicioniraju nukleosomi da bi se promijenila izloenost specifinog sljeda DNA prema transkripcijskim faktorima. Osim toga, nukleosomalni remodelirajui faktori mogu djelovati tako da izazivaju promjene u konformaciji nukleosoma, utjeu na sposobnost specifinih sljedova DNA da stupaju u interakciju s regulatornim transkripcijskim proteinima. Slino enzimima koji modificiraju histone, nukleosomalni remodelirajui faktori mogu se pridruiti DNA u asocijaciji s drugim tranksripcijskim aktivatorima ili represorima te promijeniti aranman nukleosoma da bi stimulirali ili inhibirali transkripciju.

Pridruivanje enzima koji modificiraju histone i nukleosomalnih remodelirajuih faktora djelovanjem transkripcijskih aktivatora stimulira zapoinjanje transkripcije mijenjanjem kromatinske strukture u podrujima pojaivaa ili promotora. Meutim, nakon zapoinjanja transkripcije, RNA-polimeraza i dalje je suoena s problemom elongacije kromatinskog kalupa. Moda je iznenaujue, ali pakiranje DNA u nukleosome ne predstavlja nepremostivu zapreku RNA-polimerazi, ona je sposobna transkribirati kroz sr nukleosoma kidajui kontakte histona i DNA. Sposobnost RNA-polimeraze da transkribira kromatinski kalup olakana je zdruivanjem HMGN proteina s nukleosomima aktivno transkribiranih gena, kao i s elongacijskim faktorima koji su zdrueni s fosforiliranom domenom na C-kraju RNA-polimeraze II nakon zapoinjanja transkripcije (vidi sliku 6.14). Elongacijski faktori pridruuju histonsku acetil-transferazu, a djeluju i izravno na kidanju nukleosomske strukture tijekom transkripcije.

1.3.5. Reguliranje transkripcije nekodirajuim RNA

Najnovije spoznaje ukazuju na to da se ekspresija gena moe regulirati, osim transkripcijskim regulatornim proteinima, kako je ve razmatrano, i nekodirajuim regulatornim RNA molekulama. Jedan je nain djelovanja nekodirajuih regulatornih RNA inhibicija translacije RNA interferencijom; pojava kad kratke dvolanane RNA izazivaju degradaciju homologne mRNA (vidi sliku 3.41). Osim toga, nekodirajue RNA ini se da imaju vanu ulogu u represiji transkripcije na nekim mjestima na kromosomima, inducirajui modifikacije histona koje dovode do kondenzacije kromatina i nastanka heterokromatina. Premda ostaje mnogo toga za nauiti u svezi s mehanizmom njihova djelovanja, nekodirajue RNA nesumnjivo igraju vane uloge u reguliranju kromatinske strukture i funkcije u eukariotskim stanicama.

Pojava inaktiviranja X kromosoma priskrbila je primjer uloge nekodirajuih RNA u regulaciji genske ekspresije u sisavaca. U mnogih ivotinja kao i u ovjeka enke imaju dva X kromosoma, a mujaci jedan X i jedan Y kromosom. X kromosom sadri stotine gena koji nisu prisutni na mnogo manjem Y kromosomu (vidi sliku 4.29). Tako enke imaju dva puta vie kopija veine gena smjetenih na X kromosomu u odnosu na mujake. Usprkos toj razlici i mujaci i enke sadre istu koliinu proteina kodiranih veinom gena na X kromosomu. Rezultat je to kompenzacijskog mehanizma za doziranje kojima se veina gena s jednog od dva X kromosoma u stanicama enke rano u razvoju inaktivira konverzijom u heterokromatin. Slijedom tog, samo jedna kopija veine gena smjetenih na X kromosomu na raspolaganju je za transkripciju u stanicama kako enki tako i mujaka.

Premda mehanizam inaktivacije X kromosoma nije potpuno razjanjen, ini se da je kljuni element nekodirajua RNA nastala transkripcijom regulatornog gena, nazvanog Xist, koji se nalazi na inaktivnom X kromosomu. Xist RNA ostaje na inaktivnom X kromosomu, vee se na njega i prekriva ga (slika 6.35). Nadalje, Xist RNA pridruuje regulatorne proteine koji utiavaju transkripciju veine gena na inaktivnom X kromosomu. Premda ti proteini nisu jo identificirani, naelno je djelovanje Xist RNA indukcija metiliranja lizinskog ostatka-9 na histonu H3, to izaziva kondenziranje kromatina i prevoenje inaktivnog X u heterokromatin.

Nekodirajue RNA, kako je nedavno pokazano, igraju vanu ulogu u gaenju transkripcije i nastanku heterokromatina u podruju centromera kod fisijskih kvasca Schizosaccharomyces pombe. U tom sluaju RNA molekule homologne ponavljajuim centromerskim DNA sljedovima djeluju na nain da stiavaju transkripciju i izazivaju nastanak heterokromatina na centromeri. Kao i inaktivacija X kromosoma, metiliranje lizina-9 na histonu H3 rani je dogaaj u nastanku heterokromatina na centromeri kvasca. Zanimljivo je da djelovanje regulatornih centromerskih RNA u S. pombe zahtijevaju prevoenje u male dvolanane RNA molekule staninom mainerijom, odgovornom za stvaranje interferirajuih RNA koje zaprjeavaju ekspresiju gena upuivanjem mRNA za razgradnju.

1.3.6. Metiliranje DNA

Metiliranje DNA sljedei je opi mehanizam kojim je kontrola transkripcije u kraljenjaka povezana s strukturom kromatina. Citozinski ostatci u DNA kraljenjaka mogu se modificirati dodatkom metilne skupine na ugljikov atom na poloaju 5 (slika 6.36). DNA se metilira specifino na citozinskim ostatcima kojima prethode gvanini u lancu DNA (CpG dinukleotidi). Metiliranje je povezano sa smanjenom transkripcijskom aktivnosti gena koji sadre velik broj CpG dinukleotida u blizini promotora. Metiliranje inhibira transkripciju tih gena tako da interferira s vezanjem nekih transkripcijskih aktivatora, kao i da pridruuje represore koji se specifino veu na metiliranu DNA. Represori koji se veu na metiliranu DNA djeluju kao kompleksi s histonskom deacetilazom, povezujui metiliranje DNA s mijenjanjem acetiliranja histona i nukleosomske strukture.

Premda metiliranje DNA moe inhibirati transkripciju, openito se ini da su metilirani samo oni geni koji su ve suprimirani. Metiliranje DNA naelno prije slui stabiliziranju i odravanju inaktivacije tijekom razvoja, nego to je zapravo primarni uzrok inaktiviranja transkripcije. Primjerice, geni na inaktivnom X kromosomu metiliraju se nakon represije transkripcije pomou Xist RNA i metiliranja lizina-9 na histonu H3, to moe sluiti za usmjeravanje enzima odgovornih za indukciju metiliranja DNA na inaktivne gene. U biljkama je takoer sugerirano da nekodirajue RNA usmjeravaju metiliranje DNA suprimiranih gena.

Vana regulatorna uloga metiliranja DNA predstavljena je pojavom znanom kao genomski otisak (engl. ***), koja kontrolira ekspresiju nekih gena djelatnih u embrionalnom razvoju sisavaca. U veini sluajeva, oba alela, majin i oev, bivaju eksprimirani u diploidnim stanicama. Meutim, postoji mali broj otisnutih gena (preko dvadeset opisanih u mia i ovjeka) ija ekspresija ovisi o tome jesu li naslijeeni od majke ili od oca. U nekim je sluajevima eksprimiran samo oev alel otisnutog gena, a majin je alel transkripcijski inaktivan. Za druge otisnute gene majin je alel aktivan, a oev inaktivan.

ini se da metiliranje DNA igra kljunu ulogu u razlikovanju izmeu majinih i oevih alela otisnutih gena. Dobar je primjer gen H19, koji se transkribira samo s majine kopije (slika 6.37). H19 gen je specifino metiliran tijekom razvoja mukih, ali ne i enskih spolnih stanica. Spajanje spermatozoida s jajnom stanicom u trenutku oplodnje daje embrij koji sadri metilirane oeve i nemetilirane majine alele tog gena. Ta se razlika u metilaciji zadrava i nakon replikacije DNA te specifinog metiliranja oevog lanca (slika 6.38). Oev H19 alel stoga ostaje metiliran i transkripcijski inaktivan u embrionalnim stanicama i somatskim tkivima. Meutim, oev H19 alel demetilira se u germinativnoj liniji, omoguujui uspostavu novog uzorka metilacije u sljedeoj generaciji.

1.4. Obrada i promet RNA

Premda je transkripcija prvi i vrlo ureeni korak u genskoj ekspresiji, obino predstavlja poetak niza dogaanja potrebnih za nastanak funkcionalne RNA. Veina novosintetiziranih RNA mora se modificirati na razliite naine da bi bila prevedena u funkcionalni oblik. Bakterijske su mRNA iznimke; one se odmah koriste kao kalupi za sintezu proteina, dok se jo transkribiraju. Meutim, primarni transkripti rRNA i tRNA moraju proi niz koraka obrade, kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. Slino, primarni transkripti eukariotskih mRNA prolaze intenzivne modifikacije, kao uklanjanje introna prekrajanjem, prije nego se transportiraju iz jezgre u citoplazmu, gdje slue kao kalup za sintezu proteina. Regulacija koraka obrade osigurava dodatni stupanj kontrole genske ekspresije, kao i regulacija brzine kojom razliite mRNA bivaju razgraene u stanici.

1.4.1. Obrada ribosomalnih i transportnih RNA

Osnovna obrada ribosomalnih i transportnih RNA slina je u prokariotskim i u eukaritskim stanicama, kako se moe i oekivati s obzirom na fundamentalnu ulogu tih RNA u sintezi proteina. Kako je ve razmatrano eukarioti imaju etiri vrste ribosomalne RNA (vidi Tablica 6.1), tri su od njih (28S, 18S i 5,8 rRNA) derivati cijepanja jednog dugog prekursorskog transkripta, nazvanog pre-rRNA (slika 6.39). Prokarioti imaju tri ribosomalne RNA (23S, 16S i 5S), ekvivalentne 28S, 18S i 5S rRNA eukariotskih stanica i takoer su nastale obradom jednog pre-rRNA transkripta. Jedina rRNA koja se ne obrauje sveobuhvatno jest 5S rRNA u eukariotima, koja se transkribira s odvojenog gena.

Prokariotske i eukariotske pre-rRNA obrauju se u nekoliko koraka. Inicijalno cijepanje bakterijske pre-rRNA daje odvojene prekursore za tri individualne rRNA; one se dalje obrauju sekundarnim cijepanjem u konane produkte. U eukariotskim stanicama, pre-rRNA prvo se cijepa na mjestu koje je u blizini 5,8S rRNA na njenoj 5' strani, dajui dva odvojena prekursora koji sadre 18S i 28S + 5,8S rRNA. Daljnje cijepanje prevodi ih u konane produkte, s 5,8S rRNA vezanom vodikovim vezama na 28S molekulu. Osim ovih cijepanja, obrada rRNA ukljuuje dodatak metilne skupine na bazu i eerni dio specifinih nukleotida. Obrada rRNA dogaa se u nukleolusu eukariotskih stanica, o emu e biti govora u 8. poglavlju.

Slino rRNA, tRNA u bakterijama i eukariotima sintetiziraju se kao duge prekursorske molekule (pre-tRNA), od kojih neke sadre nekoliko individualnih tRNA sljedova (slika 6.40). U bakterijama neke tRNA nalaze se u pre-rRNA transkriptima. Obrada 5' kraja pre-tRNA ukljuuje cijepanje enzimom nazvanim RNaza P, koje je posebno zanimljivo s obzirom da predstavlja prototipni model reakcije katalizirane RNA enzimom. RNaza P sastoji se od RNA i proteinske molekule, a obje su potrebne za maksimalnu aktivnost. Godine 1983. Sidney Altman i suradnici pokazali su da je izolirana RNA komponenta RNaze P sposobna katalizirati pre-tRNA cijepanje. Prema tim je pokusima RNaza P ribozim enzim u kojem je prije RNA nego protein odgovorna za katalitiku aktivnost.

3' kraj tRNA nastaje djelovanjem konvencionalnog proteina RNaze, ali obrada tog kraja tRNA molekule takoer ukljuuje neobinu aktivnost: dodatak CCA kraja. Sve tRNA imaju CCA slijed na 3' krajevima. Taj je slijed mjesto privezivanja aminokiseline, potrebno za tRNA funkciju tijekom sinteze proteina. CCA kraj nekih tRNA kodiran je DNA slijedom, ali kod drugih nije, stoga se dodaje kao korak obrade RNA enzimom koji prepoznaje i nadodaje CCA na 3' kraj svih tRNA koje nemaju taj slijed.

Drugi je neobian aspekt obrade tRNA sveobuhvatna modifikacija baza u tRNA molekuli. Oko 10% svih baza u tRNA molekuli promijenjeno je i daje tako razliite modificirane nukleotide na specifinim poloajima u tRNA molekulama (vidi sliku 6.40). Funkcije su veine tih modificiranih baza nepoznate, ali neke su vane u sintezi proteina tako to mijenjaju svojstva tRNA, s obzirom na sparivanje komplementarnih baza (vidi 7. poglavlje).

Neke pre-tRNA, kao i pre-rRNA u malom broju organizama, sadre introne koji se uklanjanju prekrajanjem. U opreci spram drugih reakcija prekrajanja, koje (kako e biti razmatrano u sljedeem odjeljku) obuhvaaju djelovanje katalitikih RNA, prekrajanje tRNA posredovano je konvencionalnim proteinskim enzimima. Endonukleaza cijepa pre-tRNA na mjestu prekrajanja da bi izrezala intron, nakon ega slijedi spajanje eksona i nastanak zrele molekule tRNA.

1.4.2. Obrada mRNA u eukariotima

Nasuprot obradi ribosomalnih i transportnih RNA, obrada glasnikih RNA predstavlja najveu razliku izmeu prokariotskih i eukariotskih stanica. U bakterijama, ribosomi imaju izravan pristup mRNA molekuli u nastajanju i translacija zapravo zapoinje na nastajuem mRNA lancu jo dok traje transkripcija. U eukariotima, mRNA sintetizirana u jezgri mora se prvo transportirati u citoplazmu, prije nego to se moe upotrijebiti kao kalup za sintezu proteina. tovie, poetni produkti transkripcije u eukariotskim stanicama (pre-mRNA) sveobuhvatno se modificiraju prije izlaska iz jezgre. Obrada mRNA obuhvaa modifikaciju oba kraja primarnoga transkripta, kao i uklanjanje introna (slika 6.41). Reakcije obrade prije su povezane s transkripcijom, nego to su neovisni dogaaji koji slijede nakon sinteze pre-mRNA. Tako su sinteza mRNA i njena obrada tijesno koordinirani koraci u ekspresiji gena. Domena na C-kraju (CTD) RNA-polimeraze II igra kljunu ulogu u koordiniranju tih procesa, sluei kao vezno mjesto za enzimske komplekse ukljuene u obradu mRNA. Zdruivanje tih enzima za obradu RNA s CTD polimeraze II pridonose njihovoj specifinosti u procesu obrade mRNA; polimeraze I i III nemaju CTD, tako se njihovi transkripti ne obrauju istim enzimskim kompleksima.

Prvi je korak u procesu obrade mRNA modificiranje 5' kraja transkripta dodavanjem strukture nazvane 7-metilgvanozinska kapa. Enzimi odgovorni za dodavanje kape pridruuju se fosforiliranoj CTD, slijedei zapoinjanje transkripcije, a kapa se dodaje nakon transkripcije prvih 20-30 nukleotida RNA. Dodavanje kape inicirano je dodatkom GTP u obrnutoj orijentaciji na 5' krajnji nukleotid RNA. Nakon toga dodaje se metilna skupina na G bazu i na ribozni dio jednog ili dva nukleotida na 5' kraju RNA lanca. 5' kapa stabilizira RNA i svrstava eukariotske mRNA na ribosomima tijekom translacije (vidi 7. poglavlje).

3' kraj veine eukariotskih mRNA nije definiran zaustavljanjem transkripcije, nego cijepanjem primarnog transkripta i dodavanjem poli-A-repa reakcija procesa obrade nazvana poliadenilacija (slika 6.42). Signali za poliadenilaciju obuhvaaju visoko konzervirane heksanukleotide (AAUAAA u stanicama sisavaca), smjetene 10 do 30 nukleotida uzvodno od mjesta poliadenilacije, i G-U bogati nizvodni sljedni element. Osim toga, neki geni imaju U-bogate sljedne elemente uzvodno od AAUAAA. Te sljedove prepoznaje proteinski kompleks koji obuhvaa endonukleaze to cijepaju RNA lanac i odvojenu poli-A polimerazu koja dodaje poli-A rep od oko 200 nukleotida na transkript. Enzimi djelatni u procesu obrade povezani su s fosforiliranom CTD RNA-polimeraze II i mogu putovati s polimerazom od mjesta zapoinjanja transkripcije do kraja. Cijepanje i poliadenilacijski signal zaustavljanja transkripcije obino se pojavljuju nekoliko stotina nukleotida nizvodno od mjesta dodavanja poli-A.

Gotovo su sve mRNA u eukariotima poliadenilirane, a poli-A rep, pokazano je, regulira i translaciju i stabilnost mRNA. Osim toga, poliadenilacija igra vanu regulatornu ulogu u ranom razvoju, gdje promjene duljine poli-A repova kontroliraju translaciju mRNA. Primjerice, mnoge mRNA uskladitene su u neoploenim jajima u obliku neprimjerenom za translaciju s kratkim poli-A repovima (obino 30 do 50 nukleotida dugom). Oplodnja stimulira produljivanje poli-A repova usladitenih mRNA, to potom aktivira njihovu translaciju i sintezu proteina potrebnih za rani embrionalni razvoj.

Najdojmljivija je modifikacija pre-mRNA uklanjanje introna prekrajanjem. Kao to je razmatrano u 4. poglavlju, kodirajui sljedovi veine eukariotskih gena isprekidani su nekodirajuim sljedovima (intronima) koji se precizno izrezuju iz zrele mRNA. U sisavaca, veina gena sadri viestruke introne, koji pridonose veliini pre-mRNA od oko deset puta veoj nego kad bi sadravala samo eksone. Neoekivano otkrie introna 1977. godine usmjerilo je istraivake napore u smjeru razumijevanja mehanizma prekrajanja, vrlo specifinog za stvaranje funkcionalne mRNA. Daljnja istraivanja prekrajanja nisu samo rasvijetlila nove mehanizme regulacije gena, nego su razotkrila neobine katalitike aktivnosti RNA molekula.

1.4.3. Mehanizam prekrajanja

Klju je razumijevanja prekrajanja pre-mRNA razvoj in vitro sustava koji efikasno izvodi reakciju prekrajanja (slika 6.43). Pre-mRNA sintetiziraju se in vitro kloniranjem strukturnih gena (s njihovim intronima) u blizinu promotora za bakteriofagne RNA-polimeraze koje se mogu izolirati u velikim koliinama. Transkripcija tih plazmida moe se potom koristiti za pripravu velikih koliina mRNA, koje, kad se dodaju nuklearnom ekstraktu stanica sisavaca, bivaju korektno prekrojene. Kao kod transkripcije, primjena ovakvih in vitro sustava omoguuje detaljnije istraivanje prekrajanja nego bi to bilo mogue u cjelovitim stanicama.

Analiza reakcijskih produkata i poluproizvoda nastalih in vitro razotkrila je da se prekrajanje mRNA odvija u dva koraka (slika 6.44). Prvo, mRNA se cijepa na 5' mjestu za prekrajanje i 5' kraj introna spaja se s adeninskim nukleotidom unutar introna (blizu 3' kraja). U ovom koraku nastaje neobina veza izmeu 5' kraja introna i 2' hidroksilne skupine adeninskog nukleotida. Nastali intermedijer slian je lasu u kojem intron pravi omu. Drugi korak u prekrajanju odvija se istodobnim cijepanjem na 3' mjestu za prekrajanje i sljepljivanjem (ligacijom) dva eksona. Intron je tako isjeen u obliku lasa, biva potom lineariziran i razgraen u jezgri cjelovite stanice.

Ove reakcije definiraju tri kritina sljedna elementa u mRNA: slijed na 5' mjestu za prekrajanje, slijed na 3' mjestu za prekrajanje i slijed unutar introna na toki grananja (mjesto gdje se 5' kraj introna povezuje da bi nastala struktura slina lasu) (vidi sliku 6.44). Pre-mRNA sadri sline dogovorene sljedove na svakoj od navedenih pozicija, omoguavajui maineriji za prekrajanje da prepozna pre-mRNA i izvede reakcije cijepanja i sljepljivanja obuhvaene procesom prekrajanja.

Biokemijska analiza nuklearnih ekstrakata otkrila je da se prekrajanje odvija u velikim kompleksima nazvanim tjelecima za prekrajanje (engl.spliceosom) koji se sastoje od proteina i RNA. RNA komponente tjeleaca za prekrajanje svrstane su u pet skupina malih nuklearnih RNA (snRNA) nazvanim U1, U2, U4, U5 i U6. Te snRNA, veliine od oko 50 do 200 nukleotida (KLJUNI POKUS 2: Otkrie snRNP, str. 268), nalaze se u kompleksu sa est do deset proteinskih molekula tvorei male nuklearne ribonukleoproteinske estice (snRNP) koje igraju sredinju ulogu u procesu prekrajanja. U1, U2 i U5 snRNP svaka sadri jednu snRNA molekulu, dok su U4 i U6 snRNA meusobno kompleksirane u jednu snRNP.

Prvi je korak u zdruivanju tjeleca za prekrajanje vezivanje U1snRNP na 5' mjesto za prekrajanje pre-mRNA (slika 6.45). Prepoznavanje 5' mjesta za prekrajanje obuhvaa sparivanje baza izmeu 5' dogovorenog sljeda za prekrajanje i komplementarnog sljeda na 5' kraju U1 snRNA (slika 6.46). Potom se U2 snRNP vee na toku grananja slinim komplementarnim sparivanjem izmeu U2 snRNA i sljeda toke grananja. Ve nastali kompleks sastavljen od U4/U6 i U5 snRNP ugrauje se u tjelece za prekrajanje, s vezivanjem U5 na slijed uzvodno od 5' mjesta za prekrajanje. Reakcija prekrajanja povezana je s rearanmanom snRNA. Disocijacija U6 od U4 i premjetanje U1 na 5' mjesto za prekrajanje prethode prvom koraku u procesu prekrajanja (nastanak poluproizvoda strukturno slinog lasu). U5 se nakon toga vee na sljedove na 3' mjestu za prekrajanje, iza ega slijedi isjecanje introna i sljepljivanje eksona.

SnRNA ne samo da prepoznaju dogovorene sljedove na toki grananja i mjestima prekrajanja, one takoer izravno kataliziraju reakciju prekrajanja. Katalitika uloga RNA u procesu prekrajanja pokazana je otkriem nekih RNA sposobnih za samo-prekrajanje; one mogu katalizirati uklanjanje vlastitih introna u odsutnosti drugih proteina ili RNA imbenika. Samo-prekrajanje prvi put je opisao Tom Cech i suradnici prouavajui 28S rRNA u protozoi Tetrahymena. Ta RNA sadri intron veliine od oko 400 baza koji se precizno uklanja nakon inkubacije pre-rRNA u odsutnosti dodanih proteina. Daljnji su studiji objelodanili da je prekrajanje katalizirano intronom, koji djeluje kao ribozim upravljajui isjecanjem samoga sebe iz pre-rRNA. Otkrie samo-prekrajajuih rRNA Tetrahymene zajedno s ipitivanjem RNaze P, o emu je bilo rijei, prvi je put ukazalo na katalitiku aktivnost RNA.

Daljnja ispitivanja razotkrila su samo-prekrajajue RNA u mitohondrijima, kloroplastima i bakterijama. Samo-prekrajajue RNA svrstane su u dvije skupine na osnovi reakcijskog mehanizma samo-prekrajanja (slika 6.47). Prvi je korak u prekrajanju skupine 1 introna (primjerice, Tetrahymena pre-rRNA) cijepanje na 5' mjestu za prekrajanje posredovano gvanozinskim kofaktorom. 3' kraj slobodnog eksona potom reagira s 3' mjestom za prekrajanje da bi se isjekao intron kao linerana RNA. Nasuprot tome, samo-prekrajajue reakcije skupine II introna (primjerice, neke mitohondrijske pre-mRNA) jako nalikuju nuklearnom prekrajanju mRNA kod kojeg do cijepanja 5' mjesta za prekrajanje dolazi zbog napada adenozinskog nukleotida u intronu. Kao i kod pre-mRNA prekrajanja nastaje poluproizvod slian lasu koji se izrezuje.

Slinost izmeu prekrajanja pre-mRNA posredovanog tjelecima za prekrajanje i samo-prekrajanja skupine II introna sugerira da su aktivne katalitike komponente tjeleca za prekrajanje prije RNA nego proteini. Precizno, slinosti ukazuju da je prekrajanje pre-mRNA katalizirano snRNA u tjelecu za prekrajanje. Nastavak istraivanja pre-mRNA prekrajanja potkrijepilo je taj stav time to je pokazano da U2 i U6 snRNA u odsutnosti proteina mogu katalizirati prvi korak u prekrajanju pre-mRNA. Smatra se da proces prekrajanja pre-mRNA jest reakcija utemeljena na RNA, snRNA u tjelecu za prekrajanje djeluje analogno skupini II samo-prekrajajuih introna. Unutar stanice, proteinske komponente snRNP takoer su potrebne i participiraju kako u zdruivanju tjeleca za prekrajanje tako i u samoj reakciji prekrajanja.

Brojni proteinski imbenici prekrajanja, koji nisu snRNP, takoer igraju vanu ulogu u zdruivanju tjeleaca za prekrajanje, posebice u identifikaciji korektnog mjesta za prekrajanje u pre-mRNA (slika 6.48). Pre-mRNA sisavaca uobiajeno sadri kratke eksone (prosjeno oko 150 nukleotida u ljudi) razdvojene mnogo veim intronima (prosjeno 3500 nukleotida). Introni esto sadre vie sljedova koji odgovaraju mjestu prekrajanja, tako mainerija za prekrajanje mora biti sposobna identificirati odgovarajua 5' i 3' prekrajajua mjesta u graninom podruju introna/eksona da bi nastale funkcionalne mRNA. Prekrajajui faktori slue za upravljanje tjeleca za prekrajanje na korektno mjesto prekrajanja vezivanjem na specifine RNA sljedove unutar eksona, pridruujui potom U1 i U2 snRNP na odgovarajua mjesta na pre-mRNA interakcijama protein-protein. Osim toga, prekrajajui faktori povezuju prekrajanje s transkripcijom, zdruujui se s fosforiliranom CTD RNA-polimeraze II. To sidri maineriju za prekrajanje na RNA-polimerazu to je vano za jamenje da e se eksoni slijepiti korektnim redosljedom kako je pre-mRNA sintetizirana.

1.4.4. Alternativno prekrajanje

Sredinja uloga prekrajanja u procesu obrade pre-mRNA otvara mogunosti regulacije genske ekspresije kontrolom prekrajajue mainerije. Budui da veina pre-mRNA sadri brojne introne, razliite mRNA mogu nastati iz istoga gena razliitim kombinacijama 5' i 3' mjesta za prekrajanje. Mogunost da se eksoni spoje meusobno u raznim kombinacijama baca novo svjetlo na kontrolu genske ekspresije, jer se brojne mRNA (i stoga brojnih proteina) mogu generirati iz iste pre-mRNA. Taj proces, nazvan alternativno prekrajanje, dogaa se esto u genima sloenih eukariota. Primjerice, procijenjeno je da alternativnim prekrajanjem mogu nastati tri ili vie mRNA od prosjenog gena sisavaca, znaajno poveavajui raznolikost proteina koji su kodirani s 30 do 40 tisua gena u genomu sisavaca. S obzirom da alternativno prekrajanje moe biti razliito u razliitim tkivima, ono osigurava vaan mehanizam za specifinu tkivnu i razvojno reguliranu ekspresiju gena.

Dobro istraen primjer alternativnog prekrajanja specifinog za odreeno tkivo predstavlja odreivanje spola u Drosophilae, gdje alternativno prekrajanje iste pre-mRNA odreuje da li je muica enka ili mujak (slika 6.49). Alternativno prekrajanje pre-mRNA gena nazvanog transformirajui (engl.transformer) kontrolirano je proteinom (SXL) koji je eksprimiran samo u enkama. Transformirajua pre-mRNA ima tri eksona, ali razliiti drugi ekson ugraen je u pre-mRNA kao rezultat upotrebe alternativnog 3' mjesta za prekrajanje u dva razliita spola. U mujaka ekson 1 spaja se uzvodno od 3' mjesta, odabranog vezanjem U2AF faktora prekrajanja na slijed u eksonu 2. U enkama SXL protein vee se na to mjesto u eksonu 2, sprjeavajui vezanje U2AF. Dosljedno tome, uzvodno 3' mjesto prekrajanja preskoeno je u enkama, a ekson 1 se umjesto toga spaja na alternativno mjesto prekrajanja dalje silazno. Sljedovi u eksonu 2 u mujaka sadre kodon za terminaciju translacije, tako da ne nastaje protein. Terminacijski kodon ne nalazi se u mRNA enki, tako da enke eksprimiraju funkcionalni transformirajui protein, koji djeluje kao kljuni regulator spolnog odreivanja.

Alternativno prekrajanje transformirajueg gena ilustrira djelovanje represora (SXL protein) koji djeluje, sprjeavajui vezanje faktora prekrajanja (U2AF). U drugim sluajevima, alternativno prekrajanje kontrolira se aktivatorima. Aktivatori pridruuju faktore prekrajanja, mjestu prekrajanja koje na drugi nain ne bi bilo prepoznato. Brojni mehanizmi mogu tako regulirati alternativno prekrajanje, a varijacije u alternativnom prekrajanju najvie pridonose raznolikosti proteina eksprimiranih tijekom razvoja i diferencijacije.

1.4.5. Ureivanje RNA

Ureivanje RNA odnosi se na dogaanja u procesu obrade RNA (koji nisu prekrajanje) to mijenjaju kodirajue sljedove proteina nekih mRNA. Taj neoekivani oblik procesa obrade RNA otkriven je u mitohondrijskim mRNA Trypanosoma, gdje se U ostatci dodaju i briu na vie mjesta u molekuli. Mnogo kasnije opisano je ureivanje mitohondrijskih mRNA drugih organizama, mRNA iz kloroplasta viih biljaka te nuklearnih mRNA nekih gena sisavaca.

Ureivanje nuklearnih mRNA sisavaca, kao i mitohondrijskih i kloroplastnih RNA viih biljaka, obuhvaa promjene jedne baze kao posljedice modifikacijskih reakcija, slino onima djelatnim u procesu obrade tRNA. U stanicama sisavaca reakcije ureivanja RNA obuhvaaju deaminiranje citozina u uridin i adenozina u inozin. Jedan od najbolje istraenih primjera jest ureivanje mRNA za apolipoprotein B, lipoprotein koji sudjeluje u transportu lipida u krvi. U tom sluaju, ureivanje RNA specifino za odreeno tkivo ima za posljedicu dva oblika apolipoproteina B (slika 6.50). Kod ljudi, Apo-B100 (4536 aminokiselina) sintetizira se u jetri translacijom neureene mRNA. Meutim, krai protein (Apo-B48, 2152 aminokiseline) nastaje sintezom u crijevima kao rezultat translacije ureene mRNA u kojoj je C promijenjen u U deaminiranjem. Te alternativne promjene kodona za glutamin (CAA) u neureenoj mRNA u kodon za terminaciju translacije (UAA) u ureenoj mRNA imaju za posljedicu sintezu kraeg Apo-B proteina. Ekspresija strukturno i funkcionalno razliitih proteina u jetri i crijevima proizlazi iz ureivanja Apo-B mRNA specifinog za tkivo. Protein pune duljine, Apo-B100 nastao u jetri, transportira lipide u cirkulaciji; Apo-B48 djelatan je u apsorpciji lipida iz hrane u crijevu.

Ureivanje RNA deaminiranjem adenozina u inozin najuobiajeniji je oblik ureivanja nuklearne RNA u sisavaca. Taj oblik ureivanja igra vanu ulogu u nervnom sustavu, gdje A-u-I ureivanje ima za posljedicu izmjene jedne aminokiseline u receptorima za neke signalne molekule na povrini neurona. Vanost reakcije ureivanja jasno je pokazano upotrebom homologne rekombinacije za inaktiviranje gena koji kodira enzim odgovoran za A-u I ureivanje u mia (vidi 3. poglavlje). Mievi koji nemaju taj enzim umiru u mladoj dobi nakon ponavljanih epileptikih napada kao posljedice disfunkcije neprikladno ureenih receptora.

1.4.6. Razgradnja RNA

Iz koraka u procesu obrade, razmatranih u prethodnom dijelu, proizlaze zrele mRNA koje se prenose u citoplazmu da bi upravljale sintezom proteina. Meutim umjesto toga, veina se sljedova transkribiranih u mRNA razgrauje u jezgri. Preko 90% pre-mRNA predstavljaju intronski sljedovi koji se razgrauju u jezgri nakon izrezivanja u procesu prekrajanja. Razgradnju izvodi enzim koji prepoznaje jedinstveni 2'-5' vez nastao u toki grananja, kao i enzim koji prepoznaje ili 5' ili 3' krajeve RNA molekula i katalizira degradaciju RNA u oba smjera. 5' i 3' krajevi mRNA zatieni su od djelovanja degradacijske mainerije dodavanjem kape i poliadenilacijom, dok nezatieni krajevi introna bivaju prepoznati i razgraeni.

Osim za razgradnju introna, stanice posjeduju sustav za kontrolu kvalitete (nazvan nesmisleno-posredovana razgradnja mRNA) koji vodi u razgradnju mRNA bez cjelovitog okvira itanja. To eliminira defektne mRNA molekule i sprjeava sintezu nenormalno skraenih proteina. Nesmisleno-posredovana razgradnja mRNA u kvasaca dogaa se u citoplazmi, a izazvana je onda kada se ribosom sretne s preranim terminacijskim kodonom tijekom sinteze proteina. U sisavaca, meutim, dogaa se najmanje nekoliko nesmisleno-posredovanih razgradnji mRNA u jezgri. Mehanizam kojim se prepoznaju terminacijski kodoni unutar jezgre stanica sisavaca nije rasvijetljen, premda istraivanja u posljednje vrijeme ukazuju da bi ribosomi unutar jezgre mogli biti djelatni u prepoznavanju i tovie translaciji nuklearnih mRNA.

Krajnji aspekt procesa obrade RNA molekule jest njezina eventualna degradacija u citoplazmi. S obzirom da je unutarstanina razina bilo koje RNA odreena ravnoteom izmeu sinteze i razgradnje, brzina kojom se individualne RNA razgrauju jest druga razina na kojoj se moe kontrolirati ekspresija gena. Obje, ribosomalna i transportna RNA, stabilne su, a ta stabilnost uvelike doprinosi visokoj razini tih RNA (vie od 90% svih RNA) i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama. Suprotno tome, bakterijske se RNA brzo razgrauju, obino imaju poluivot od 2 do 3 minute. Taj brzi promet bakterijskih mRNA omoguava stanici da odgovori brzo na promjene u okoliu, kao to su promjene u nutrientima potrebnim za rast. U eukariotskim stanicama, meutim, razliite mRNA razgrauju se razliitim brzinama, to predstavlja dodatni imbenik u regulaciji genske ekspresije u eukariotima.

Citoplazmatska razgradnja veine eukariotskih mRNA inicirana je skraivanjem njihovih poli-A repova. Nakon toga slijedi uklanjanje 5' kape i razgradnja RNA nukleazama djelatnim na oba kraja. Poluivot mRNA u stanicama sisavaca kree se od 30 minuta do oko 20 sati. Nestabilne mRNA esto kodiraju regulatorne proteine, ukljuujui neke transkripcijske faktore ija se stanina razina brzo mijenja u skladu s poticajima iz okolia. Te mRNA esto sadre specifine AU-bogate sljedove blizu svojih 3' krajeva koje, kako se ini, signaliziraju brzu degradaciju promiui deadeniliranje.

Stabilnost nekih mRNA moe se regulirati u skladu s vanstaninim signalima. Dobar je primjer mRNA koja kodira transferinski receptor protein smjeten na povrini stanice djelatan u procesu unoenja eljeza u stanicu sisavaca. Koliina transferinskih receptora regulirana je dostupnou eljeza, najvie kao rezultat moduliranja stabilnosti njihovih mRNA (slika 6.51). U prisutnosti odgovarajue koliine eljeza mRNA za transferinske receptore brzo se razgrauje kao posljedica nukleaznog cijepanja na sljedovima u blizini 3' kraja. Ako je snabdjevenost eljezom neodgovarajua, onda je mRNA stabilizirana, iz ega proizlazi poveana sinteza transferinskih receptora i vee unoenje eljeza u stanicu. Ova je regulacija posredovana proteinom koji se vee na specifine sljedove (nazvane elementi odgovorni za eljezo, engl. iron response element, IRE) u blizini 3' kraja mRNA za transferinski receptor i tako titi mRNA od cijepanja. Vezanje regulatornog proteina na IRE je pak kontrolirano razinom eljeza unutar stanice: ako stanica oskudijeva u eljezu, protein se vee na IRE ime zatiuje mRNA za transferinski receptor od razgradnje. Sline promjene stabilnosti drugih mRNA ukljuene su u reguliranje genske ekspresije nekim hormonima. Premda transkripcija ostaje primarna razina na kojoj se regulira ekspresija gena, varijacije u brzini razgradnje mRNA takoer imaju vanu ulogu u kontroli ustaljenog stanja mRNA u stanici.

KLJUNI POJMOVISAETAK

TRANSKRIPCIJA U PROKARIOTIMA

RNA-polimeraza, promotor, otisak stopalaRNA-polimeraza i transkripcija: E. coli RNA-polimeraza sastoji se od (,(,((,( i ( podjedinica. Transkripcija zapoinje vezanjem ( na promotorski slijed. Nakon sinteze oko prvih 10 nukleotida RNA, sr enzima disocira od ( i putuje du kalupa DNA kako produljuje novosintetizirani RNA lanac. Transkripcija se nastavlja dok ne naie na terminacijski signal.

operon, operator, represor, cis-djelujui kontrolni elementi, trans-djelujui faktoriRepresori i negativna kontrola transkripcije: prototipni je model za gensku regulaciju u bakterijama lac operon, reguliran vezanjem represora na specifini slijed u DNA unutar promotora.

Pozitivna kontrola transkripcije: neki bakterijski geni regulirani su prije transkripcijskim aktivatorima nego represorima.

TRANSKRIPCIJA U EUKARIOTIMA

Eukariotske RNA-polimeraze: eukariotske stanice sadre tri razliite nuklearne RNA-polimeraze to transkribiraju gene koji kodiraju mRNA (polimeraza II), rRNA (polimeraza I i III) te tRNA (polimeraza III).

transkripcijski faktori, opi transkripcijski faktori, TATA-slog, TATA-vezujui protein (TBP), TBP-zdrueni faktor (TAF), posrednik Opi transkripcijski faktori i zapoinjanje transkripcije RNA-polimerazom II: eukariotske RNA-polimeraze ne veu se izravno za promotorske sljedove; one trebaju dodatne proteine (ope transkripcijske faktore) za zapoinjanje transkripcije. Promotorske sljedove mnogih gena koje transkribira polimeraza II prepoznaju proteini koji se vezuju na TATA-slog, oni pridruuju dodatne transkripcijske faktore i RNA polimerazu do promotora.

Transkripcija RNA-polimerazom I i III: RNA-polimeraze I i III takoer trebaju dodatne transkripcijske faktore da bi se vezale na promotore gena koji kodiraju rRNA, tRNA i neke snRNA.

REGULACIJA TRANSKRIPCIJE U EUKARIOTIMA

pojaivai, inzulatoriCis-djelujui regulatorni sljedovi: promotori i pojaivai: Transkripcija eukariotskih gena kontrolirana je proteinima koji se veu na regulatorne sljedove udaljene do nekoliko kilobaza od mjesta zapoinjanja transkripcije. Pojaivai tipino sadre vezna mjesta za vie proteina koji zajednikim djelovanjem reguliraju gensku ekspresiju.

test pomaka elektroforetske pokretljivosti, DNA-afinitetna kromatografijaProteini koji reguliraju transkripciju: mnogi eukariotski transkripcijski faktori izolirani su na t