788.влияние селена и цинка на рост spirvlina platensis и оптимизация внутриклеточного накопления этих элементов

Л~3?3¥-Г

На правах рукописи

ПОПОВА Виктория Викторовна

ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНА И ЦИНКА НА РОСТ

SPIRVLINA PLATENSIS И ОПТИМИЗАЦИЯ

ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО НАКОПЛЕНИЯ ЭТИХ ЭЛЕМЕНТОВ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2004 лУи '

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН в Отделе молекулярных основ внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов, г. Москва

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук Пронина Наталия Александровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Градова Нина Борисовна

Иванов Виктор Борисович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра «Физиология микроорганизмов»

Защита состоится « в /О часов на заседании диссертационного совета ДМ212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д.9) в tyfy3> .

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан «J y>^/w/>>£ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, у/\M>z^e/^ ДМ212.204.13 и- "«^Г— Шакир И.В.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Исследования последних лет показывают, что

обеспеченность жителей многих регионов России микроэлементами значительно снижается (Скальный, 1999; Тутельян и др, 2002). Это обусловлено истощенностью почв, вызванной неправильным ведением сельскохозяйственных работ, глобальным изменением окружающей среды, а также ухудшением качества продуктов питания. В то же время повысившийся уровень стресса в результате загрязнения окружающей среды и особенностей стиля жизни современного человека увеличивает его потребности в некоторых питательных компонентах. Другими словами, для сохранения питательной ценности продуктов человечество встало перед необходимостью их балансировки, в том числе с помощью биологически активных добавок, полученных из натуральных растительных источников.

В последнее время в качестве таких источников используются фотосинтезирующие одноклеточные организмы (Richmond, 1986; Borowitzka and Borowitzka, 1988; Цоглин и Габель, 2000), среди которых наиболее перспективной, следует считать цианобактерию Spirulina platensis. Во-первых, сравнительный анализ биохимического состава микроводорослей показал преимущество S. platensis перед многими фотосинтезирующими организмами (Трубачёв и др., 1976; Richmond, 1986). Во-вторых, пластичность метаболизма микроводорослей позволяет управлять качеством биомассы путем направленного изменения условий культивирования и использовать их для транспорта в организм физиологически важных элементов в биологически активной форме (Клячко-Гурвич, 1966; Семененко, 1985). И, в-третьих, S. platensis является чрезвычайно устойчивой к воздействию стрессовых факторов и способна накапливать микроэлементы в количествах, являющихся летальными для других микроорганизмов (Упитие, 1983).

В настоящее время несомненный интерес представляют эссенциальные микроэлементы селен и цинк, которые требуются для осуществления важнейших физиологических процессов в организме человека. При дефиците этих микроэлементов в организме возникают хронические заболевания желудочно-кишечного тракта, дерматиты, анемия, карликовость, половое недоразвитие, онкологические заболевания, катаракта и другие заболевания.

Цель и задачи исследования. В данной работе для нас представляло интерес исследовать внутриклеточное накопление селена и цинка в клетках Spirulina platensis с целью изучения устойчивости цианобактерии к этим элементам и поиска путей оптимизации их накопления в органических соединениях для получения биомассы, обогащенной данными микроэлементами.

г ~i


В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: 1. Изучение влияния различных концентраций селена и пипка на рост S. platensis; 2. Исследование биохимического состава S. platensis при росте на • модифицированных средах, обогащенных селеном и цинком; 3. Исследование способности клеток S. platensis накапливать селен и цинк; 4. Исследование включения селена и цинка в состав органических соединений

•--• клетки; " 5. Оптимизация условий культивирования, позволяющих получить биомассу с

высоким содержанием микроэлементов. Научная новизна. Определены оптимальные и предельно допустимые

концентрации Se(IV) при культивировании 5. platensis IPPAS В-256. Впервые исследовано влияние Se(IV) на биохимический состав S. platensis. Впервые детально изучена зависимость между внутриклеточным содержанием Se(IV) и его содержанием в среде и показано, что клетки S. platensis не способны лимитировать накопление селена вплоть до гибели культуры. Впервые показано, что высокие концентрации Se(IV) вызывают значительное снижение цитоплазматического рН. Новыми являются данные о зависимости накопления цинка от стадии культивирования, на которой вносился элемент'. Впервые показано, что цинк может включаться в состав лииофильпых соединений циапобактерии. Впервые показано различие в накоплении ципка па свету и в темноте.

Научно-практическое значение. Полученные результаты ммут быть применены в биотехнологии при производстве биологически активных добавок к пище человека и животных, в парфюмерной промышленности для получения различных косметических средств но уходу за кожей, в пищевой промышленности для обогащения продуктов микроэлементами. Также полученные результаты могут быть использованы для дальнейших исследований защитных механизмов цианобактериалыюй клетки на воздействие повышенных концентраций тяжелых металлов и токсических элементов.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены: на конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 2000; 1-ом Международном симпозиуме "Биотехнология - народному хозяйству", Москва, 2000; конференции «Автотрофпые микроорганизмы», Москва, 2000; 1-ой и 2-ой Международных конференциях «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов», Москва, 2001, 2003; Между народной конференции «Достижения биотехнологии на благо будущего человечества», Самарканд, Узбекистан, 2001; Международном симпозиуме «Растения под влиянием стресса окружающей среды», Москва, 2001; Международном симпозиуме «Молекулярная генетика и биотехнология», Москва, 2001;

4


5-ой Европейской конференции «Биотехнология микроводорослей», Потсдам, Германия, 2003; 5-ом Съезде Всероссийского Общества Физиологов Растений, 11еша, 2003.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 работ, включая патент РФ, в которых отражены основные положения диссертации.

Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объекг и методы исследований, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Работа изложена на 91 странице машинописного тсксга, включает 14 рисунков и 4 таблицы, список литературы содержит 201 наименование.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВЛ11ИЙ В качестве объекта исследовании использовалась одноклеточная

термофильная нитчатая цианобактерия Spirulina platensis (Nordst.) Gcitl. IPPAS B-256 из коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им. К.Л. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS).

Культивирование циапобактерии осуществляли на среде Заррука в стерильных условиях при круглосуточном освещений (30 Вт/м2), непрерывном барботировании газо-воздушной смесью, содержащей 1,7-2% СОг, при 33-35°С (Семепенко, 1991). До внесения ипокулята в среду добавляли селенит натрия н количесгес 10 - 170 мгЛ£ Для изучения влияния серы на накопление селена культуру выращивали на модифицированной среде Заррука, содержащей 10% K2SO4 or стандартной среды. Сульфат, нитрат и хлорид цинка вводили в питательные среды либо до внесения посевного инокулята, либо при выходе культуры на линейную фазу в концентрациях 10-40 мг/л.

Биохимические анализы проводили на линейной стадии роста в клеточной массе, предварительно отмытой от культуральной среды. Образцы хранили при -20°С.

Содержание белка определяли по методу Lowry (Lowry ct al, 1951). Содержание хлорофилла измеряли спектрофотомстричсски в мстанольпых

экстрактах (Сергеенко и др., 2000). Содержание липофильных соединений оценивали весовым методом в

пробах, экстрагированных метанолом при 60°С (Клячко-Гурвич, 1966). Содержание углеводов определяли фенол-серным методом (Юшчко-1 уриич, 1964). Анализ аминокислотного состава белка проводили после гидролиза

биомассы в 6 N НО на автоматическом анализаторе аминокислот- AAA 339M («Microtcchna», Чехия) (Коиарев, 1973).

Состав фосфорсодержащих соединении клетки и цитоцлазматический рН определяли с помощью спектроскопии 31Р-ядерного магнитного резонанса (31Р-ЯМР) на MSL-200 («Broker», Германия) как описано (Пронина и ;tp., 2002). Систры снимали при частоте электромагнитного излучения 81 МГц с числом сканирований 3 - 5 тыс. Цитоплазматический рН определяли, используя зависимость химического слыша пика

5


неорганических фосфатов цитоплазмы от рН. Для построения стандартной кривой использовали клеточный экстракт в 6 М НС104 согласно (Kichitsu et al., 1989). Идентификация пиков резонансных сигналов проведена согласно (Roberts, 1984).

Разрушение клеток проводили в гомогенизаторе Retsch-MM2 (Германия) в течение 10 мин при 90000 уд/мин с использованием стеклянных бус при соотношении бусы/суспензия 1:1.

Фракционирование бесклеточного гомогената на фракции растворимых белков и нерастворимых клеточных компонентов осуществляли центрифугированием при 14000 об/мин, 30 мин при 4°С.

Липофильные соединения экстрагировали метанолом при 60°. Хроматографический анализ белков проводили с использованием колоночной

хроматографии высоко давления на колонке 1,6x50 см. В качестве матрицы использовали Syperosa-12 («Pharmacia», Швеция). Белок элюировали с колонки фосфатным буфером, содержащим 0,05М КН2Р04,0,15М NaCl (рН 6,8), со скоростью 2 мл/мин.

Электрофоретическое разделение белков проводили в 15% полиакриламидном геле (Остерман, 1981).

Содержание селена определяли в биомассе или выделенных из нее клеточных фракциях с помощью индуктивно связанной плазмы масс-спектрометрии (ИСП-МС) по изотопу 82Se на автоматическом анализаторе HP 4500 Series ICP-MS («Hewlett Packard», США) (Javis et. al., 1992), а также с помощью флуориметрического метода определения комплексов селена с 2,3-диаминонафталином (Голубкина, 1995).

Содержание цинка в культуральной среде, а также в биомассе 5. platensis или выделенных из нее фракциях, озоленных путем мокрого сжигания в смеси азотной и хлорной кислот, определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре («Hitachi 270», Япония).

Статистическая обработка результатов. Для получения достоверных результатов эксперименты проводили в 2-3-х биологических и не менее, чем в 3-х аналитических повторностях. В результатах работы представлены средние данные и относительные стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование роста S. platensis на средах, содержащих селенит-ионы.

Исследование роста цианобакгерии показало, что в присутствии 10-20 мг/л Na2SeOj ростовые

кривые почти полностью повторяли графическую характеристику контроля (рис. 1 А).

Внесение в среду культивирования 30 и 50 мг/л селенита натрия вызывало падение скорости

роста на линейной фазе и значительное снижение максимальной плотности суспешии при

выходе кривой накопления биомассы на плато.

6


При повышении концентрации Na2SeOj до 100 мг/л (рис. 1 Б) наблюдали те же закономерности роста на линейной фазе, более быстрый выход на стационарную фазу при низком значении максимальной плотности суспензии. Концентрации селенита натрия 150 и 170 мг/л особенно сильно подавляли скорость роста культуры на линейной стадии. При этом максимальная плотность суспензии клеток на стационарной фазе не достигала 1/4 от этого значения в контроле. В присутствии 100 мг/л селенита натрия на 11-ый день культивирования начинался лизис клеток, а при 150 и 170 мг/л на 6-ой день.

4 12 20 28 Время, дни

Рис. 1. Влияние селенита натрия на рост Spirulina platensis. Концентрации Na2SeQi в среде (мг/л): (А) - 0 (1-конгроль), 10 (2), 20 (3), 30 (4), 50 (5). (Б) - 0 (1-контроль), 100 (2), 150 (3), 170 (4).

8 12 Время, дни

Следует отметить, что в присутствии 100-170 мг/л Na2SeOj уже в начале линейной фазы культивирования в среде появлялся красный осадок, а сине-зеленые клетки цианобактерии приобретали красноватый оттенок, что связано с появлением элементарного селена Se(0) в среде и на поверхности клеток в результате восстановления селенита натрия.

Таким образом, 5. platensis обладает чрезвычайно высокой устойчивостью к селену, в отличие от большинства фсгпхшлезирующих микроорганизмов (Richmond, 1986).

Изменение биохимического состава биомассы S. platensis. выращенной в присутствии Se(IY). При анализе состава биомассы S. platensis, полученной при культивировании цианобактерии в присутствии 10 и 20 мг/л селенита натрия в среде не отмечено достоверных изменений в содержании основных групп веществ в расчете на единицу сухого веса (табл. 1). Эти данные говорят о том, что селен в этих

7


концентрациях не оказывал существенного влияния на сдвиг белкового, липидного и углеводного обмена и, вероятно, легко метаболизировался. Последнее подтверждается также тем, что селенит в этих концентрациях не оказывал ингибирующего эффекта на рост (рис. 1 А). В то же время из табл. 1 видна сильная обратная зависимость между концентрацией селенита натрия в среде и содержанием клеточного белка и ее прямая связь с содержанием углеводов и липидов в биомассе, что наблюдается у цианобактерий и микроводорослей и при других стрессовых условиях (Клячко-Гурвич, 1966; Семененко, 1985).

Таблица 1. Влияние селенита натрия на биохимический состав S. platensis

Концентрация Na2Se03,

мг/л 0 10 20 50 100

% от сухой массы Белок

65+7 64±6 62±7 54+3 46+3

Хлорофилл

1,04±0,1 0,77±0,05 0,70±0,05 1,10+0,08 0,90+0,08

Углеводы

17+3 19±2 16±3 22+2 24+3

Лштиды

8±1 9±1 10±1 14+1 16+1

Относительно метаболизма селена у микроводорослей известно немного. Показано, что он включается, главным образом, в свободные аминокислоты и белки. Являясь химическим аналогом серы, селен замещает ее в цистеине и метионине с образованием Se-аминокислот, которые принимают участие в синтезе белка наряду с S-аминокислотами (Bottino et al, 1984; Vandermeulen and Foda, 1988). Исследование аминокислотного состава белка в биомассе, полученной при выращивании культуры в присутствии 20 мг/л Na2SeC>3, показало, что селенит не оказывает существенного влияния на изменение содержания серусодержащих кислот - цистеина и метиоюша, в которые селен может включаться с образованием селеноаминокислот.

Влияние селенита натрия на фосфорный обмен S. platensis и внутриклеточный рН. Для более детального изучения процесса адаптации клеток к различному составу культуральной среды был проведен сравнительный анализ 31Р-ЯМР спектров клеток S. platensis, выращенных в присутствии Se(IV) и без него. Как видно из представленных спектров (рис. 2) наблюдался значительный химический сдвиг неорганического ортофосфата (Pi) от 2,28 р т в контроле (спектр А) до 1,55 ррт в опыте в присутствии 100 мг/л Na2Se03 (спектр В). Этот сдвиг соответствует сильному подкислению цитоплазмы на 1 ед. рН (от 7,17 до 6,18), что, безусловно, связано с подавлением роста культуры (см. рис. 1 Б). Снижение ростовых параметров в присутствии 100 мг/л Na2Se03 коррелирует также с падением сигналов фосфорных эфиров Сахаров (пики 3-5 ррт), что указывает на ингибирование фотосинтеза. При

8


+10 0 -10 -20 Химический сдвиг, ррт

-30

культивировании S. platensis в присутствии 20 мг/л, когда не отмечалось заметных изменений в росте (рис. 1А, кривая 3) и биохимическом составе биомассы (табл. 1), ЯМР. , спектры совпадали с таковыми в контроле (рис. 2 , спектры А и Б).

Рис. 2. 3,Р-ЯМР спектры (in vivo) S. platensis, выращенной без (А), в присутствии 20 (Б) и 100 (В) мг/л Na2Se03. Число сканирований 4500 (А) и 3000 (Б, В).

Исследование динамики накопления селена в клетках 5. platensis. Анализ

внутриклеточного накопления селена при культивировании S. platensis на средах с

различным содержанием Na2SeC>3 (рис. 3)

позволил установить заметное повышение

внутриклеточной концентрации Se уже при

минимальной из исследованных концентраций

селенита натрия в среде. Содержание

внутриклеточного селена находилось в прямой

зависимости от концентрации селенита в среде,

что, в свою очередь, говорит о неспособности

клеток лимитировать его накопление вплоть до

летальных величин.

При снижении в среде культивирования в 10 раз концентрации серы (с 1,0 до 0,1 г/л K2S04) накопление селена у

10 20 30 40 50 Содержание Se в среде, мг/л

S. platensis Рис. 3. Зависимость количества связанного , _ S. platensis атомарного селена от

значительно возрастало (табл. 2) в расчете как к о л и ч е С т в а селена, введенного в среду на сухую массу (вдвое), так и на белок (втрое), культивирования.

9


При этом основная доля селена включалась в белковую фракцию, поскольку его содержание в белке и в суммарной биомассе в расчете на единицу сухой массы практически совпадало.

Таблица 2. Влияние количества серы в среде на накопление селена клетками S. platensis в присутствии 20 мг/л селенита натрия

Концентрация S,

мг/л

300 30

Содержание белка, мг/г

0,60±0,05 0,28±0,03

Содержание Se В биомассе мг/г сухой

массы О,155±О,О08 0,306+0,02

Во фракции белков мг/г сухой

массы 0,147±0,01 0,25б±0,03

мг/г белка

0,280±0,02 0,914+0,07

В то же время из табл. 2 видно, что при дефиците серы содержание суммарного белка в биомассе уменьшается в 2 раза, что, безусловно, снижает суммарное обогащение биомассы селеном и указывает на изменение ее качественного состава. Таким образом, увеличение отношения Se/S, вероятно, глубоко угнетает синтез белка, хотя при этом и усиливает включение селена в серусодержащие аминокислоты, позволяя в 3.3 раза обогатить селеном белок и только в 1.5 раза биомассу.

Влияние цинка на рост S. platensis. Внесение в среду культивирования одновременно с инокулятом 2,2 мг/л цинка в

составе гп(Шз)г не изменяло ход графической кривой роста S. platensis (рис. 4 А, кривая 2). Снижение продуктивности культуры наблюдалось по мере увеличения содержания цинка от 4,4 до 8,8 мг/л. В концентрациях, выровненных по содержанию цинка, ZnS04 оказывал сходный эффект на рост культуры (рис. 4 Б). Однако рост S. platensis ингибировался уже в присутствии 4,8 мг/л цинка в составе ZnCl2 и не наблюдался при его концентрации в среде 9,6 мг/л (рис. 4 В).

Внесение до 4,4 мг/л цинка в составе Zn(N03)2 в начале линейной стадии вызывало некоторое стимулирование роста (рис. 5, кривые 2,3). Однако в присутствии 8,8 мг/л цинка, внесенного в начале линейной фазы, культура погибала (рис. 5), чего не наблюдалось при внесении такого же количества этой соли в период лаг-фазы (рис. 4 А). Сравнение ростовых кривых рис. 4 А и 5 показывает, что при внесении цинка на линейной стадии порог чувствительности S. platensis к этому металлу снижается.

10


Время, сутки

Рис. 4. Влияние цинка на рост S. platensis. Количество внесенного цинка составляло (мг/л): (А) в составе Zn(NOj)2 — 0 (1, контроль), 2,2 (2), 4,4 (3), 6,6 (4), 8,8 (5); (Б) в составе ZnS04 - 0 (1, контроль), 2,3 (2), 4,6 (3), 6,8 (4), 9,1 (5); (В) в составе ZnCb -0(1 , контроль), 4,8 (2), 9,6 (3). Соли вносили вместе с инокулятом.

Рис. 5. Влияние цинка на рост S. platensis при внесении ZnCNChh на линейной стадии роста. Количество внесенного цинка составляло (мг/л): 0 (1, контроль), 2,2 (2), 4,4 (3), 6,6 (4), 8,8 (5).

3 5 7 9 11 Время, сутки

Изучение биохимического состава S. platensis. выращенной в присутствии ионов цинка. Исследование биохимического состава S. platensis показало, что содержание тотального белка в клетках уменьшалось по сравнению с контролем при введении в среду культивирования нитрата цинка (табл. 3).

При увеличении концентрации цинка до 8,8 мг/л содержание общего белка в клетках сокращалось втрое по сравнению с контролем. Такое подавление биосинтеза

И


белка, вероятно, связано со стрессовым воздействием тяжелого металла на клетку. Анализируя кривые роста (рис. 4 А) мы видим также, что эта концентрация цинка вызывает сильное ингибирование роста культуры.

Количественное определение хлорофилла показало, что его содержание в клетках S. platensis практически не изменялось при концентрации цинка в среде от 2,2 до 6,6 мг/л (табл. 4). В присутствии 8,8 мг/л цинка в среде содержание хлорофилла в клетках заметно возрастало.

Табл. 3. Содержание белка и хлорофилла в клетках S. platensis при культивировании на средах, обогащенных цинком

Содержание, % от сух. массы

Белок

Хлорофилл

Содержание цинка в среде, мг/л

0 (контроль)

61,4±5,2

3,73±0,20

2,2

51,5±4,3

3,45±0,15

4,4

45,8±3,8

3,65±0,22

6,6

47,7±3,2

3,94±0,25

8,8

17,8±1,2

4,96+0,31

Динамика накопления цинка клетками S. platensis. Динамика накопления цинка зависела от стадии развития культуры, на которой микроэлемент вносился в питательную среду. При внесении цинка в среду вместе с инокулятом в концентрациях 2,2 - 4,4 мг/л внутриклеточное накопление цинка в расчете на единицу сухой массы происходило постепенно и достигало максимума на 4-6 день культивирования (рис. 6 А), что соответствовало приблизительно середине линейной стадии роста (рис. 4 А). После чего происходил достаточно быстрый вынос металла из клетки и к 8 суткам (начало стационарной стадии роста) концентрация цинка в клетке была практически равна его внутриклеточной концентрации в начале эксперимента. При внесении цинка на линейной стадии роста наблюдалась быстрая аккумуляция (в течение 1 ч) тяжелого металла с последующим быстрым выносом металла обратно в среду культивирования (рис. б Б). Возможно, эта разница в скорости аккумуляции металла клетками связана с различным составом клеточной оболочки на разных стадиях роста. Также, вероятно, что при длительной адаптации цианобактерии к избытку цинка (рис. 6 А) этот тяжелый металл каким-то образом компартментализнруется во внутриклеточных структурах, не оказывая влияния на ростовые процессы, а затем постепенно выводиться из клетки на поздних этапах культивирования. При внесении цинка во время активного роста (рис. б Б) клетка создает барьеры для транспорта элемента внутрь клетки, сорбирует металл клеточными оболочками и далее выносит металл в среду культивирования.

12


2 4 6 8

Время, сутки

10 20 40 60

Время, час

Рис. б. Динамика накопления цинка клетками S.platensis. Культуру выращивали в присутствии Zn(NC>3)2. Соль вносили вместе с инокулятом (А) и на линейной стадии роста (Б) в концентрациях (мг/л): 2,2 (1), 4,4 (2).

5 10 Время, сутки

| 3

I О 1 -

20 40 60 Время, ч

Рис. 7. Изменение содержания цинка в клетках S.platensis (2) и в среде культивирования (1). Культуру выращивали в присутствии Zn(NC>3)2 (2,2 мг/л цинка). Соль вносили одновременно с инокулятом (А) и на линейной стадии роста (Б). Пунктиром отмечена (3) расчетная кривая, вычисленная по формуле: ^ "~ ^ внесенного цинка ~ \S* в клетке ' ^ в среде)-

13


При расчете содержания внутриклеточного цинка на мл суспензии (рис. 7) видна такая же динамика его изменения, как и при расчете на единицу сухой массы (рис. 6). Остается неясным, почему суммарное содержание цинка в среде и клетке ниже концентрации внесенного цинка (рис. 7 А). Эти потери, представленные расчетной кривой 3, можно объяснить тем, что цинк хелатируется какими-то прижизнеными выделениями цианобактерии, которые теряются при отмывке клеток после их отделения от среды.

Изменение содержания цинка в среде культивирования является зеркальным отражением его накопления в клетках, если цинк введен на линейной стадии роста (рис. 7 Б). При этом увеличение содержания внутриклеточного цинка полностью коррелирует со снижением содержания металла в среде, что свидетельствует о прочной связи цинка в клетках цианобактерии.

Влияние света на внутриклеточное накопление цинка S. platensis. Как видно

из рис. 8, клетки S. platensis способны накапливать цинк как на свету, так и в темноте.

Но если на свету клетки накапливали цинк только в течение первого часа экспозиции и

далее постепенно выводили его в среду культивирования, то в темноте наблюдалось

практически постоянное накопление цинка в течение 48 ч. Вероятно, на свету в активно

фотосинтезирующих клетках S. platensis индуцируются металлорегуляторные системы (Patzer and Hantke, 2000; Outten and O'Halloran, 2001), ограничивающие аккумуляцию цинка и активирующие вынос тяжелого металла в среду культивирования.

Рис. 8. Влияние света на накопление цинка клетками S. platensis. Культуру выращивали в присутствии 2,2 мг/л Zn(NOj)2. Соли вносили на линейной стадии роста. После внесения цинка в питательные среды клетки

60 экспонировали на свету (1) и в темноте (2). 20 40 Время, час

Адсорбция цинка сухой биомассой S. platensis. В мертвых клетках максимальное количество цинка накапливалось уже в первые минуты после внесения металла в среду, как результат формирования связей металла с клеточными оболочками. Биосорбция тяжелых металлов «неживыми» клетками установлена также другими авторами (Kuyucak and Volesky, 1990; Sag and Kutsal, 1996).

14


Металлсвязывающие соединения S. platensis. При разделении биомассы S.platensis, обогащенной цинком, на фракции было показано, что около 70% цинка содержится в составе суммарного клеточного белка, и около 30% цинка обнаруживалось в составе липофильных соединений. При этом две трети от тотального белка клетки включалось во фракцию растворимых белков. В 80-е годы из растительных организмов были выделены специфические металлсвязывающие белки металлотионеины и фитохелатины, которые активно синтезируются в организме под влиянием высоких концентраций тяжелых металлов (Алексеева-Попова, 1991). Наиболее хорошо изученными на сегодняшний день являются металлсвязывающие белки, выделенные из ряда цианобактериальных штаммов с молекулярной массой в пределах 3-15 кДа (Turner and Robinson, 1995; Blindauer et al, 2002).

При хроматографическом разделении фракции растворимых белков было показано, что практически весь цинк включается в белки с молекулярными массами от 3 до 15 кДа (рис. 9).

I 2 X о

1

0,5

I

1 Л ' ' 2*103 14,0 1,8 0,2 Молекулярная масса, кДа

а

1*103 15,0 3,0 0,8 Молекулярная масса, кДа

3 8

• 2

Рис. 9. Хроматографическое разделение белков S. platensis. Цианобактерию выращивали на стандартной среде Заррука (А) и на той же среде при добавлении 4,4 мг/л цинка (Б). Пунктирная линия показывает относительное содержание цинка в расчете на единицу беяка.

15


Па элсктрофорсграмме видно несколько полос, соответствующих белкам с молекулярными массами ниже 14 кДа (рис. 10). Можно предположить, что S. platensis также обладает способностью синтезировать белки, связывающие тяжелые металлы, что повышает устойчивость циаиобактериальной клетки к стрессовому воздействию тяжелых металлов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, Spirulina platensis, в отличие от большинства фотосинтезирующих микроорганизмов, проявляет высокую толерантность к селигу и цинку.

Механизмы детоксикапии токсического действия селенит-ионов связаны со способностью клеток восстанавливать Se(IV) до элементарного селена, что ограничивает его поступление в клетку. По-видимому, это один из основных механизмов устойчивости к селену, поскольку его накопление пропорционально содержанию этот элемента в среде. При значительном внутриклеточном накоплении селена обнаруживаются изменения в биохимическом составе клеток, нарушение клеточного гомсостаза, связанного с подкисленном рН цитоплазмы, что приводит к гибели клеток. Снижение концентрации серы в среде увеличивает включение селена в ссрусодсржащие аминокислоты, однако, ипгибирует синтез белка.

Механизмы устойчивости цианобактерии к цинку, вероятно, связаны с сорбцией металла клеточной стенкой, индукцией металлсвязывающих белков и экспортом цинка из клетки в культуральиую среду. При этом динамика накопления цинка зависит от стадии роста S. platensis, на которой металл вводился в среду.

Проведенные комплексные исследования позволяют определить оптимальные концентрации селена и ципка для внесения в среду культивирования, которые не вызывают ишибировалия роста культуры и изменений биохимического состава биомассы для оптимизации внутриклеточного накопления этих элементов и получения биомассы, обогащенной селеном и цинком.

М кДа

25 -

14 -

Рис. 10. Электрофоретическое разделение цинксодержащих белков S.platensis М - маркеры молекулярной массы.

16


выводы

1. Показано, что S. platensis чрезвычайно устойчива к действию высоких концентраций селена и цинка. Культура сохраняет способность к росту, хотя и сильно подавленную, при концентрациях селенита натрия в среде 170 мг/л, нитрата и сульфата цинка 40 мг/л.

2. Показано, что содержание внутриклеточного селена находится в прямой зависимости от концентрации селенита в среде, что, очевидно, говорит о неспособности клеток S. platensis лимитировать накопление Se вплоть до летальных величин.

3. Содержание селена в белке и биомассе может быть увеличено при увеличении соотношении Se/S в культуральной среде.

4. Динамика накопления цинка зависит от стадии роста кулы-уры, на которой элемент вносился в питательную среду и продолжительности культивирования. Максимальное накопление цинка наблюдается через несколько суток при внесении его вместе с шюкулятом и через несколько часов при внесении на линейной стадии роста.

5. Показано, что практически весь селен включается в белковую фракцию. Около 70% цинка обнаруживается в составе суммарного клеточного белка S. platensis. При этом две трети цинка включается в растворимые белки с молекулярной массой 3-15 кДа. 30% цинка обнаруживается в составе липофильных соединений.

6. Сухая биомасса S. platensis способна сорбировать цинк. 7. В темноте клетки накапливают больше цинка, чем на свету. 8. Определение пределов концентраций Se и Zn не вызывающих изменений

биохимического состава и ингибирования роста, а также исследования динамики накопления Zn от стадии развития культуры могут служить основой для разработки технологического процесса получения биомассы S. platensis, обогащенной селеном и цинком.

17


СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ковшова Ю.И., Милехин И.А., Лапин А.Б., Попова ВЛ., Мишина И.М., Пронина НА. Аккумуляция микроэлементов клетками Spirulina platensis II Горизонты физико-химической биологии: Тез. докл. - Пущино, 2000. - С. 319-320. 2. Попова В.В., Ковшова Ю.И., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А. Культивирование Spirulina platensis на средах, обогащенных микроэлементами // Биотехнология — народному хозяйству: Тез. докл. 1-го Межд. симп. - Москва, 2000. 3. Пронина Н.А., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Цоглин Л.Н., Габель Б,В. Способ получения обогащенной селеном биомассы спирулины {Spirulina platensis). Патент РФ № 2199582 от 24 октября 2000г. 4. Попова В.В., Ковшова Ю.И., Пронина Н.А. Накопление селена в клетках Spirulina platensis при культивировании на селенит содержащих средах // Автотрофные микроорганизмы: Тез. докл. - Москва, 2000. - С. 150-151. 5. Пронина Н.А., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Цоглин Л.Н. Получение биомассы Spirulina platensis, обогащенной микроэлементами // Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов: Тез. докл. 1-ой Межд. конф, - Москва, 2001. - С. 236-238. 6. Попова В.В., Тучная О.А., Пронина Н.А. Обогащение клеток Spirulina platensis цинком // Достижения биотехнологии на благо будущего человечества: Тез. докл. Межд. конф. -Самарканд, Узбекистан, 2001. - С.34. 7. Popova V.V., Kovshova U.I., Mazo V.K., Pronina N.A. Accumulation of trace elements by Spirulina platensis II Plant under environmental stress: Abstr. Intern. Symp. - Moscow, 2001. - C. 227-228. 8. Nalimova A.A., Popova V.V., Pronina N.A. Enrichment of Spirulina platensis cells with Cu and Zn // Molecular genetics and biotechnology: Abstr. Intern. Symp. - Moscow, 2001. 9. Пронина Н.А., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Лапин А.Б., Алексеева С.Г., Баум Р.Ф., Мишина И.М., Цоглин Л.Н. Влияние селенит ионов на рост и накопление селена у Spirulina platensis II Физиология растений. - 2002. - Т.49, № 2. - С. 264-271. 10. Попова В.В., Пронина Н.А. Влияние различных солей цинка на рост и биохимический состав Spirulina platensis II Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов: Тез. докл. 2-ой Межд. конф. - Москва, 2003. 11. Popova V.V., Pronina N.A. The influence of anions and light on the growth of Spirulina platensis and intracellular zinc accumulation // Biotechnology of microalgae: Abstr, 5th workshop -Potsdam, Germany, 2003. 12. Попова В.В., Нахимова А.А., Пронина НА. Накопление эссенциальных микроэлементов клетками Spirulina platensis II Тез. докл. 5-го съезда ВОФР - Пенза, 2003. -С. 321.

18


Издательство ЦПИ при механико-математическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова,

Подписано в печать //?. 2005 Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. { О Тираж экз. //О • Заказ $t(

Лицензия на издательскую деятельность ИД В 04059, от 20.02.2001г.

Отпечатано с оригинал-махета на типографском оборудовании механико-математического факультета и Франко-русского центра им. A.M. Ляпунова.


• .1573


Documents

788.влияние селена и цинка на рост spirvlina platensis и оптимизация внутриклеточного накопления этих элементов