A TRPV1 ÉS TRPA1 IONCSATORNÁK, VALAMINT …aok.pte.hu/docs/phd/file/dolgozatok/2015/Kun_Jozsef_PhD_dolgozat.pdf · 7 I. Általános bevezetés 1. A TRPV1 receptor Az 1950-60-as

KUN JÓZSEF

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar

Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Neurofarmakológia Program

Doktori Iskola és Programvezető: Prof. Dr. Pintér Erika

Témavezető: Prof. Dr. Helyes Zsuzsanna

2014

A TRPV1 ÉS TRPA1 IONCSATORNÁK, VALAMINT

SZENZOROS NEUROPEPTIDEK EXPRESSZIÓJA ÉS SZEREPE BŐR ÉS BÉL GYULLADÁSOS FOLYAMATAIBAN

DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

1

Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke ..................................................................................................................... 4

Az állatkísérletek és a klinikai mintagyűjtés etikai vonatkozásai .................................................. 6

I. Általános bevezetés .............................................................................................................. 7

1. A TRPV1 receptor .............................................................................................................. 7

2. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció .................................................................................... 12

3. A TRPA1 receptor ............................................................................................................ 14

4. Nem-neuronális TRP receptorok ..................................................................................... 16

5. A PACAP........................................................................................................................... 17

II. Általános célkitűzések ......................................................................................................... 19

1. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció károsítja-e az extraneuronális TRPV1 csatornákat? .. 19

2. A kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban milyen szerepe van a TRPV1 és a PACAP

közötti kapcsolatnak?.............................................................................................................. 19

3. Milyen szerepet játszik a TRPA1 gyulladásos bélbetegségben? ..................................... 19

III. A kémiai és sebészi denerváció hatása a nem-neuronális TRPV1 kifejeződésére patkány

szájnyálkahártyában és bőrben .................................................................................................. 20

1. Irodalmi háttér, előzmények ........................................................................................... 20

2. Célkitűzések..................................................................................................................... 22

3. Anyagok és módszerek .................................................................................................... 23

Kísérleti állatok, RTX deszenzitizáció, sebészi denerválás .................................................. 23

Szövetminták előkészítése .................................................................................................. 24

mRNS expresszió vizsgálata ................................................................................................ 24

Immunhisztokémia .............................................................................................................. 24

Statisztika ............................................................................................................................ 25

4. Eredmények .................................................................................................................... 26

TRPV1 mRNS expresszió patkány lábbőrben és szájnyálkahártyában ................................ 26

TRPV1 immunpozitivitás a patkány láb bőrszövetében ...................................................... 28

5. Megbeszélés, következtetések ....................................................................................... 34

IV. A TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolat hatása a kapszaicin által kiváltott

bőrgyulladásban .......................................................................................................................... 40


2. Célkitűzések..................................................................................................................... 41

2


Reagensek, vegyszerek ....................................................................................................... 41

Kísérleti állatok .................................................................................................................... 41

Akut gyulladás kiváltása ...................................................................................................... 42

Radioimmunassay ............................................................................................................... 43

A PACAP-38 és PAC1 receptor mRNS detektálása a bőrben ............................................... 44

Szövettani, immunhisztokémiai vizsgálatok ....................................................................... 44

Statisztika ............................................................................................................................ 45

4. Eredmények .................................................................................................................... 46

A PACAP és a PAC1 kimutatható az egér bőrben ................................................................ 46

A PACAP és PAC1 expressziója eltérően változik kapszaicin és CFA hatására .................... 48

PACAP és TRPV1 hiányos egerek kisebb gyulladásos válasza kapszaicin hatására ............. 51


V. A TRPA1 expressziója és szerepe colitisben ........................................................................ 56


2. Célkitűzések..................................................................................................................... 58


Kísérleti állatok .................................................................................................................... 58

Klinikai minták ..................................................................................................................... 59

Egér DSS colitis modell ........................................................................................................ 59

Betegségaktivitási Index meghatározása ............................................................................ 60

Szövettani elemzés .............................................................................................................. 61

Immunhisztokémia .............................................................................................................. 62

Kvantitatív PCR .................................................................................................................... 63

Luminex RNS assay .............................................................................................................. 64

Luminex Multiplex Immunassay ......................................................................................... 64

Statisztika ............................................................................................................................ 65

4. Eredmények .................................................................................................................... 66

TRPA1 és TRPV1 génexpresszió ........................................................................................... 66

TRPV1 és TRPA1 immunhisztokémiai lokalizáció ................................................................ 68

Betegségaktivitási Index az egér DSS modellben ................................................................ 72

Szövettani pontozás az egér DSS modellben ...................................................................... 73

Citokin mRNS expresszió egér DSS modellben ................................................................... 74

3

Citokin fehérjeexpresszió egér DSS modellben................................................................... 75

Receptor és neuropeptid génexpresszió a gyulladt vastagbélben ..................................... 77


VI. Új eredmények összefoglalása, következtetések ............................................................ 89

Függelék ...................................................................................................................................... 91

Irodalomjegyzék .......................................................................................................................... 94

Köszönetnyilvánítás .................................................................................................................. 113

Publikációs lista ......................................................................................................................... 114

4

Rövidítések jegyzéke

AC: adenilát-cikláz AITC: allil-izotiocianát ANOVA: analysis of variance/ variancia-analízis BCP: bromo-chloro-propane/ bróm-klór- propán BSA: bovine serum albumine/ borjú szérum albumin CAPS: capsaicin/ kapszaicin CCL5: chemokine (C-C motif) ligand 5/ kemokin (C-C motívum) ligand 5 (RANTES) CFA: complete Freund’s adjuvant/ teljes Freund adjuváns CGRP: calcitonin gene-related peptide/ kalcitonin gén-rokon peptid CLC2: chemokine (C-C motif) ligand 2/ kemokin (C-C motívum) ligand 2 (MCP-1) COX-2: ciklooxigenáz-2 Cq: quantification cycle/ kvantifikációs ciklus CXCL9: chemokine (C-X-C motif) ligand 9/ kemokin (C-X-C motívum) ligand 9 (MIG) DAB: diamino-benzidin DAG: diacil-glicerol DAI: disease activity index/ betegségaktivitási index DSS: dextran sulphate sodium/ dextrán-szulfát nátrium sója EC: extracelluláris tér EM: endomorfin GAPDH: glicerin-aldehid-3- dehidrogenáz GUSB: béta-glükuronidáz HPETE: hidroperoxi-eikoza-tetraénsav Hprt1: hipoxantin foszforibozil transzferáz 1 HT: hipotalamusz H2O2: hidrogén-peroxid IBD: inflammatory bowel diseases/ gyulladásos bélbetegségek IC: intracelluláris tér IFNɤ: gamma-interferon IL: interleukin IL-1β: interleukin-1 béta IL-1rn: interleukin-1 receptor antagonista gén (fehérje: IL-1RA) iNOS: inducable nitrogen-monoxide sytnhase/ indukálható nitrogén-monoxid szintáz IP3: inozitol-triszfoszfát i.p.: intraperitoneális i.pl.: intraplantáris i.v.: intravénás KO: knock-out/ génhiányos LPA: lizofoszfatidsav MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1/ monocita kemoattraktáns protein-1 (CLC2) MIG: monokine induced by gamma interferon/ gamma-interferon által indukált monokin (CXCL9) MO: mustard oil/ mustárolaj

5

NADA: N-arachidonoil-dopamin NF-κB: nukleáris faktor-κB Nrf-2: nukleáris faktor eritroid 2 [NF-E2]-kapcsolt faktor 2 NKA: neurokinin A NKB: neurokinin B NK sejtek: natural killer sejtek/ természetes ölősejtek OLP: oralis lichen planus PA: foszfatidsav PACAP: pituitary adenylate cyclase activating polypeptide/ hipofízis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid PAC1R: PACAP specifikus receptora PACAP WT: PACAP génhiányos egerek vad típusú megfelelője (CD1 törzs) PACAP (Adcyap1) KO: PACAP génhiányos/ PACAP knockout PACAP-IR: PACAP immunreaktivitás PC: foszfatidil-kolin PCR: polymerase chain reaction/ polimeráz láncreakció PE2: prosztaglandin E2 PG: pituitary gland/ agyalapi mirigy PIP2: foszfatidil-inozitol-biszfoszfát PPE: plazma protein extravazáció PKC: protein kináz C PLC: foszfolipáz C qPCR: quantitative polymerase chain reaction/ kvantitatív polimeráz láncreakció PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride/ fenil-metil-szulfonil-fluorid RANTES: regulated on activation, normal T cell expressed and secreted/ aktiváció hatására szabályozott, normál T-sejt-expresszált és szekretált (CCL5) ROS: reactive oxygen species/ reaktív oxigéngyökök RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction / reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció SAPE: streptavidin phycoerythrin/ sztreptavidin- fikoeritrin s.c.: subcutan SEM: standard error of the mean/ középérték közepes hibája SP: substance P/ P-anyag SST: szomatosztatin SSTR1/4: szomatosztatin 1/4 receptor TNBS: trinitro-benzol-szulfonsav TNF-α: tumor nekrózis faktor alfa TRP: Tranziens Receptor Potenciál TRPA1: Tranziens Receptor Potenciál Ankirin 1 TRPV1: Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 ttkg: testtömeg kg UC: ulcerative colitis/ colitis ulcerosa UV-sugárzás: ultraibolya sugárzás VIP: vazoaktív intesztinális polipeptid VPAC1/VPAC2: a VIP és a PACAP közös receptorai WT: wild-type/ vad típus

6

Az állatkísérletek és a klinikai mintagyűjtés etikai vonatkozásai

Minden kísérleti eljárást az állatok védelmére és kíméletére vonatkozó, 1998. évi

XXVIII. törvénynek, valamint az állatkísérletek végzésére vonatkozó 243/1988. (XII.31.)

Kormányrendeletnek megfelelően hajtottunk végre. Kísérleteink összhangban voltak az

International Association for the Study of Pain és a Helsinki Nyilatkozat elveivel.

Vizsgálatainkat jóváhagyta a Pécsi Tudományegyetem Munkahelyi Állatkísérleti

Bizottsága a PTE állatkísérleti etikai kódexe alapján.

Engedélyszámok: BA 02/2000-16-2006 és BA 02/2000-2/2012 az állatkísérletek

számára; BA 02/2000-1/2012 a klinikai minták gyűjtésére.

Minden beteg beleegyező nyilatkozatot írt alá.

7

I. Általános bevezetés

1. A TRPV1 receptor

Az 1950-60-as években Magyarországon végzett kutatások alapján fedezték fel, hogy

az erős paprika csípős anyaga, a kapszaicin szelektíven aktiválja, illetve nagy dózisok

ismételt adása után károsítja a fájdalomérző idegvégződések egy hőérzékeny

csoportját [1,2]. A következő évtizedben szintén hazánkban született meg az a

koncepció, mely szerint a kapszaicin egy specifikus receptoron hat a

plazmamembránban [3], amely Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) néven

ismert 1997-es klónozása óta [4]. A patkány Trpv1 cDNS egy 95 kDa nagyságú, nem

szelektív kation csatorna alegységet kódol (1. ábra), amely a hátsó gyöki ganglionok

(DRG), a trigeminus és a vagus ganglionok kis átmérőjű szenzoros neuronjai jelentős

mértékben kifejeznek.

1. ábra

A TRPV1 receptor alegység funkcionális szerkezete a kulcs aminosavak megjelölésével.

Szolcsányi és Sándor, 2012 [5]. S1-6: transzmembrán domének; A: ankirin ismétlődés

domén; TRP: tranziens receptor potenciál domén, amely a TRP csatornákban konzervált

szerkezetű, és a foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát (PIP2) által történő aktiváláshoz

szükséges; fekete kör: foszforilációs helyek, amelyek a protein kináz C (PKC) és a

protein kináz A (PKA) általi szenzitizáció hatóhelyei; LPA: lizofoszfatidsav.

8

A TRPV1 alegység hat transzmembrán doménnel és kiterjedt N-, C-terminális régiókkal

rendelkezik. Az alegységek tetramer és/vagy heteromer csatorna komplexeket

képeznek (2. ábra).

2. ábra

(A) A TRPV1 receptor alegység szerkezete. Kalia és Swartz, 2013 [6]. Négy alegység

alakítja ki a funkcionális receptor-ioncsatorna komplexet. (B) A patkány TRPV1

tetramer szerkezetének modellje, az extracelluláris oldal felőli nézetben. A négy

alegység (A, B, C, D) TM5 és TM6 transzmembrán hurokszerkezetű szakasza egy

központi pórust alakít ki. Lee és mtsai, 2011 [7]. (C) A TRPV1 háromdimenziós

szerkezetének elhelyezkedése a plazmamembránban. Moiseenkova-Bell és mtsai,

2008 [8].

9

Az N- és C- terminális, valamint egy intracelluláris régió a protein kináz A (PKA) és a

protein kináz C (PKC) feltételezett hatóhelyeit, az N-és C-terminális a

kalcium/kalmodulin komplex kötőhelyét, a C-terminális a foszfatidilinozitol-4,5-

biszfoszfát (PIP2) hatóhelyét tartalmazza. Ezek a foszforilációs és kötőhelyek

feltehetően szerepet játszanak a TRPV1 ioncsatorna deszenzitizációjában [9–11] (1.

ábra, 7. old.).

A TRPV1-et a kapszaicinen kívül fájdalmas hőinger (>43 °C) és protonok (pH <6,0),

valamint többféle gyulladás- és fájdalomkeltő endogén molekula aktivál (pl. N-

arachidonoil-dopamin: NADA, lipoxigenáz termékek, anandamid), vagy a perifériás

idegvégződésen szenzitizál (pl. bradikinin, adenozin-trifoszfát: ATP, idegi növekedési

faktor: NGF), illetve exogén vanilloidok aktiválnak [12,13]. Az utóbbi agonistacsoportba

tartozó kapszaicin és ultrapotens analógja, a reziniferatoxin (RTX) a receptor

intracelluláris és transzmembrán régióján hat (1. ábra, 7. old.) dózisfüggő módon [14].

Az RTX kémiai szerkezete magyarázza ultrapotens tulajdonságát [15] (3. ábra).

3. ábra

A kapszaicin (8-metil-N-vanillil-6-

nonénamid) és a reziniferatoxin

(RTX) molekulaszerkezete. Lee és

mtsai, 2011 [7]. A: 4-hidroxi-3-

metoxifenil; B: összekötő amid-

(kapszaicin) vagy észtercsoport

(RTX); C: lipofil oldallánc

(kapszaicin: nonenil; RTX: diterpén).

Az RTX legfontosabb farmakofórjai

az „A” régión kívül a C20 észter-, a

C3 ketocsoport és az ortofenil

csoport [7,15,16].

10

A TRPV1 izgatásával generált akciós potenciál következménye az érzőműködés és a

nocicepció kialakulása. Így egyfelől különböző szenzoros modalitások (fájdalom,

viszketés, hőérzékelés, stb.) jelátvitelét közvetítik (afferens funkció) (4. ábra). Másrészt

a kapszaicin-érzékeny szenzoros rostok aktiválása többféle, főleg gyulladáskeltő

szenzoros neuropeptid felszabadulásához vezet (lokális efferens funkció) [17,18].

Az aktivált perifériás végződésekből olyan neuropeptidek szabadulnak fel (P anyag,

neurokinin A: NKA, neurokinin B: NKB, kalcitonin gén-rokon peptid: CGRP), amelyek az

arteriolák erőteljes tágulatát, a venulákból lokális plazmafehérje-kiáramlást, valamint

gyulladásos sejtek aktivációját okozzák a beidegzési területen [19]. Az így létrejövő

neurogén gyulladás számos betegség kialakulásában szerepet játszik, úgy mint asthma

bronchiale, allergiás rhinitis, conjunctivitis és dermatitis, ekcéma, rheumatoid arthritis,

migrén, gyulladásos bélbetegségek [20–22].

4. ábra

A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója. Helyes, 2009 [23]. EM:

endomorfin. TRPA1: a TRPV1-rokon Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1.

11

Munkacsoportunk korábban bizonyította, hogy ezzel párhuzamosan az aktivált,

szenzoros idegvégződésből gyulladáscsökkentő hatású szomatosztatin is felszabadul,

amely a szisztémás keringésbe is bekerül (szenzokrin hatás). A szomatosztatin mellett

további szisztémás gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító hatású peptidek (pl.

endomorfinok) is felszabadulnak ezen rostokból aktiválásuk hatására [18,24] (4. ábra,

10. old.).

12

2. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció

A kapszaicin nem csak szelektíven aktiválja, hanem hosszabb vagy ismétlődő kezelés

után deszenzitizálja a „kapszaicin receptor” TRPV1-et expresszáló C-polimodális

nociceptorokat [1,18] (5. ábra). Az így létrejövő kemoanalgézia jelenségét használják ki

kísérleti eszközként, amikor a szenzoros TRPV1 funkció hiányát kívánják vizsgálni [18].

5. ábra

A kapszaicin/RTX deszenzitizáció hatása a TRPV1-et kifejező érzőideg-végződésre.

Anand és mtsai, 2011 [25].

Szisztémás TRPV1 deszenzitizációs kísérletekben az RTX-et részesítik előnyben a

kapszaicin helyett, mivel előbbit az állatok jobban tolerálják [15]. Az RTX a

kapszaicinhez képest 1000-szeres hatékonysággal képes deszenzitizációt kiváltani: a

szisztémás RTX dózis a 150-200 μg/kg, míg a kapszaicin dózisa a 150-200 mg/kg

tartományba esik [1,15,26–28]. A kapszaicin és az RTX nagyobbrészt más kötőhelyen,

eltérő mechanizmussal aktiválja a TRPV1 receptort (1. ábra, 7. old), ugyanakkor a Ca2+-

toxicitás következménye hasonló [29]. Aktiváláskor a TRPV1 elsősorban kalciumionokat

enged át a pórusán, amely az intracelluláris Ca2+-koncentráció és vele a membrán

depolarizáció növekedéséhez vezet. Trpv1 knock-out (KO) egerekkel végzett

vizsgálatok kimutatták, hogy az ioncsatorna kulcsfontosságú gyulladásos- és

13

fájdalomingerek integrálásában, amelynek köszönhetően célmolekulává vált a

gyógyszerfejlesztésben [15,18,30].

Lokálisan vagy szisztémásan alkalmazott nagydózisú kapszaicin kezelés reverzíbilis, de

hosszantartó analgéziát vált ki [1,18,31]. A kapszaicinnel ily módon deszenzitizált

állatok káros kémiai anyagok hatására nem mutatnak védőreflexet vagy gyulladást:

szisztémás kapszaicin előkezelés után a szenzoros idegvégződések stimulálása nem vált

ki akut neurogén gyulladást [32], amely arra utal, hogy a gyulladásos mediátorok (P-

anyag, NKA, CGRP) kiürülnek a fájdalomérző idegvégződésekből. Ezen szenzoros

neuropeptidek a neurogén gyulladás mellett simaizom kontrakciót váltanak ki, továbbá

szabályozzák az értónust, a nyálkaszekréciót és az immunfunkciókat [33].

14

3. A TRPA1 receptor

A Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1 (TRPA1) a TRPV1-hez hasonló receptor-

ioncsatorna komplex a molekulaszerkezete, funkciója és lokalizációja szempontjából

[34] (6. ábra).

6. ábra

A TRPA1 és

TRPV1

receptor

felépítése.

Bessac és

mtsai, 2008

[35].

Jól ismert, hogy a TRPA1 és a TRPV1 nagymértékben koexpresszálódik a peptiderg,

afferens Aδ- és C-rostok egy alpopulációjában, amelyek sejttestje a dorzális,

trigeminális ganglionokban és bolygóideg érződúcaiban (ggl. jugulare, ggl. nodosum)

találhatóak [36–39]. A TRPV1-et kifejező neuronok 30-50%-a tartalmaz TRPA1-et is,

míg utóbbi ritkán található meg a TRPV1 nélküli neuronokban [40,41]. Az agy több

régiójában kimutatták a TRPV1-et [42–45] és a TRPA1 jelenlétére utaló adatok is

ismertek [44,46,47]. A TRPA1, TRPV1 általában nem-neuronális sejtekben is együtt

fordul elő (pl. epithelium, keratinociták) [13].

A TRPA1 nem szelektív Ca2+-csatornaként számos sejtszintű folyamatban tölt be

szerepet a szenzoros funkcióktól a homeosztázis fenntartásáig. A receptort a hideg

hőmérséklet (<17 °C), mechanikai ingerek, számtalan elektrofil, irritáns, csípős vegyület

aktiválja, közülük több a táplálékban is megtalálható (pl. fahéjaldehid, mentol, allil-

izotiocianát, allicin, stb.) [48] (7. ábra, 15. old.). Az előbbi exogén vegyületek mellett a

receptort a gyulladás, oxidatív stressz és szövetkárosodás során felszabaduló endogén

15

agonisták is képesek szenzitizálni/aktiválni [49–52]. A TRPA1 receptor lokalizációja és

funkcionális tulajdonságai alapján kulcsszerepet játszik akut és krónikus fájdalomban,

gyulladásban. Patofiziológiai jelentősége, potenciális gyógyszercélpont szerepe

felmerült többek között a légutak, a kardiovaszkuláris rendszer és a bél gyulladásos

betegségeiben [48].

7. ábra

A TRPA1 receptor néhány, a táplálékban megtalálható természetes exogén liganduma.

SuperPain Database, Charité Orvostudományi Egyetem, Berlin [53]. Az allicin a TRPV1

receptort is aktiválja [54].

16

4. Nem-neuronális TRP receptorok

A TRPV1 előfordulását eredetileg kizárólag neuronális struktúrákon feltételezték, az

elmúlt években azonban egyre több nem-neuronális sejttípuson is kimutatták: többek

között keratinocitákon, epidermiszben, hízósejteken, dendritikus sejteken, T-

limfocitákon, epithelsejteken, vaszkuláris endothelsejteken, ér simaizomsejteken, az

orrnyálkahártya szubmukózus mirigyeiben, az urotheliumban,

gyomornyálkahártyában, stb. [13,55–62]. In vitro kimutatták, hogy egyes sejeteken a

nem-neuronális TRPV1 receptorokat aktiválja a kapszaicin/RTX, gyulladásos

mediátorok, ultraibolya (UV) sugárzás és magas hőmérséklet, amely az extraneuronális

ioncsatorna funkcionális jelenlétére utal [63–68]. Ugyanakkor a nem-neuronális

receptorok szerepe a gyulladásos válaszok esetleges mediátoraként in vivo nem ismert.

A TRPA1 receptor extraneuronálisan megtalálható többek között enterokromaffin

sejtekben, a hasnyálmirigy béta-sejtjeiben, epidermális keratinocitákban,

melanocytákban, fibroblastokban, synoviocytákban, a vékony- és vastagbél

szöveteiben, arteriolák simaizomsejtjeiben, gyulladásos sejteken [13,62,69].

Mivel a nem-neuronális TRPV1/TRPA1 receptorok funkciója, élettani, illetve kórélettani

jelentősége tisztázatlan, az utóbbi években ez a kutatási irány az érdeklődés

középpontjába került. A neuronális TRPV1/A1 receptorokat célzó hatóanyagok

extraneuronális mellékhatásait nem ismerjük, emellett a nem-neuronális TRP

csatornák maguk is potenciális gyógyszercélpontok lehetnek. Az ér simaizomsejteken

lokalizálódó TRPV1 csatornák aktiválása vazokonstrikciót okoz, amely a

mikrocirkuláció, vérnyomás szabályozásában játszhat szerepet [69,70]. A

keratinocitákon expresszálódó TRPV1 izgatása, hasonlóan humán T-limfocitákhoz és

egér hízósejtekhez, gyulladáskeltő mediátorok felszabadulásához vezethet in vitro

[62,63,71,72], közülük számos szenzitizálhatja a szenzoros TRPV1-et [15,73]. Így a

keratinocitákon, gyulladásos sejteken kimutatott [13,62] TRPV1 és a szenzoros

idegrostok közötti interakciók modulálhatják a neurogén gyulladás folyamatait [74,75].

Az utóbbi években a nem-neuronális TRP csatornák, mint a farmakológiai kutatások

„forró” területe felé fordult érdeklődésünk. Munkacsoportunk kimutatta a TRPV1

expresszió növekedését a szájnyálkahártya keratinocitáin oralis lichen planusban (OLP)

[76], valamint hízósejteken asztmás orrpolipózisban [77].

17

5. A PACAP

A kapszaicin-érzékeny idegvégződésekben a gyulladáskeltő neuropeptidek mellett (pl.

CGRP, P-anyag, egyéb tachykininek, stb.) gyulladáscsökkentő peptidek is

expresszálódnak, például a PACAP. Utóbbi két különböző molekulaformában létezik:

PACAP-27 és PACAP-38 (8. ábra), túlnyomóan az utóbbi van jelen az emlős

szövetekben [78]. A PACAP a vazoaktív intesztinális peptid (VIP)/szekretin/glukagon

peptid szupercsalád leginkább konzervált szerkezetű tagja [78–81].

8. ábra

A PACAP-38 molekula

térszerkezete. Toyama

Egyetem, Japán [82].

A PACAP specifikus receptora a PAC1, amely mind Gs, mind Gq proteinekhez

kapcsolódhat, előbbi révén az adenilát-cikláz (AC) jelátviteli útvonalat, utóbbin

keresztül a foszfolipáz C (PLC) utat aktiválja. A VPAC1 és VPAC2 receptorok hasonló

mértékben kötik a PACAP-ot és VIP-et, és az adenilát ciklázt aktiválják, amely

megnövekedett cAMP termelődéshez vezet [78,83] (9. ábra, 18. old).

A PACAP és receptorai széles körben előfordulnak a szervezetben a központi és

perifériás idegrendszerben, valamint nem-neuronális sejtekben a perifériás

szervekben, pl. a bőrben és a bélrendszerben is [78,84,85]. Ezáltal a PACAP számtalan

fiziológiai és patofiziológiai folyamatban játszik szerepet, beleértve az immunfunkciók

modulálását, az erek integritását, a neuronális fejlődést és regenerációt, a circadian

ritmust, szaporodást, stb. [86–92]. A peptid alapvetően gyulladáscsökkentő,

neuroprotektív funkcióiról ismert, de a gyulladás, fájdalomkeletkezés irányába is

mediálhatja a patofiziológiai folyamatokat a különböző sejteken,

receptorvariánsokon/típusokon azonosított, ill. eddig nem ismert splice variánsokon

feltételezett “kombinatorikusan” pleiotróp hatásától függően [78,81,83,88,92–99] (9.

ábra, 18. old.).

18

9. ábra

A specifikus PACAP receptor PAC1R (legelterjedtebb ún. null variánsa), valamint a

PACAP/VIP receptor VPAC1/2 aktivációja által stimulált főbb intracelluláris jelátviteli

útvonalak. Dickson és mtsai, 2009 [83]. Aktiváció hatására mindhárom receptor képes

Gαs fehérjéhez kapcsolódni és cAMP szintézist indukálni. Ezen felül a három receptor a

foszfolipáz C enzimet (PLC) is képes aktiválni, amely a [Ca2+]i növekedéséhez vezet Gαq

(mindhárom receptor esetében) és Gαi fehérjéhez (VPAC1 és VPAC2 esetén) kapcsoltan.

A foszfolipáz D (PLD) aktivitás is stimulálható a három receptortípuson keresztül, ADP-

ribolizációs faktor (ARF) közvetítésével a VPAC1/2 receptorokon, és protein kináz C

(PKC) közvetítésével a PAC1R receptoron át. EC: extracelluláris tér; IC: intracelluláris tér;

PA: foszfatidsav; PIP2: foszfatidil-inozitol-biszfoszfát; IP3: inozitol-triszfoszfát; DAG:

diacil-glicerol; PC: foszfatidil-kolin.

19

II. Általános célkitűzések

Doktori (PhD) munkámat 2009 szeptemberében kezdtem meg a Pécsi

Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai

Intézetében. Célom volt az alábbi kérdések megválaszolása:

1. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció károsítja-e az extraneuronális

TRPV1 csatornákat?

Fájdalom- és gyulladás állatkísérletes modelljeiben a szenzoros neuronok szerepét

kapszaicin vagy RTX kezeléssel történő deszenzitizálással vizsgálják. Arra voltunk

kíváncsiak, hogy a kísérleti módszer valóban szelektív-e a TRPV1-pozitív szenzoros

neuronokra és nem károsítja az extraneuronális TRPV1 receptorokat? RTX-

deszenzitizált és összehasonlításként sebészileg denervált patkányok bőr és

szájnyálkahártya mintáiban terveztünk TRPV1 fehérje- és génexpressziós vizsgálatokat.

2. A kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban milyen szerepe van

a TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolatnak?

Ismert, hogy a) a specifikus TRPV1 agonista kapszaicin neurogén gyulladást vált ki a

bőrben, és hogy b) a PACAP szerepet játszik akut vazodilatációban gyulladásos

folyamatok során. Nem ismert azonban e kettő közti kapcsolat, és hogy a PACAP-nak

és specifikus PAC1R receptorának milyen szerepe van ebben a folyamatban. A PACAP

és a PAC1R fehérje és mRNS szintű expresszióját vizsgáltuk ezért a talpi, lábháti és háti

bőrben, valamint a TRPV1 és PACAP génhiányos egerekben kapszaicinnel kiváltott

neurogén, ill. összehasonlításként Komplett Freund adjuváns (CFA) segítségével

indukált sejtes immunválaszon alapuló gyulladásban.

3. Milyen szerepet játszik a TRPA1 gyulladásos bélbetegségben?

Elsőként a TRPA1 és a TRPV1 receptor lokalizációjára voltunk kíváncsiak az intakt és

gyulladt egér vastagbélben és humán klinikai mintákban, különös tekintettel azok

extraneuronális előfordulására. Majd Trpa1 KO egerekben dextrán-szulfát nátrium

sójával (DSS) kiváltott colitisben kívántuk vizsgálni a receptor szerepét, ill. a mögöttes

mechanizmusok felderítésére a lokális neuropeptid útvonalakat, valamint

citokinek/kemokinek szintézisét a disztális vastagbélben.

20

III. A kémiai és sebészi denerváció hatása a nem-neuronális

TRPV1 kifejeződésére patkány szájnyálkahártyában és

bőrben

Kun József, Helyes Zsuzsanna, Perkecz Anikó, Bán Ágnes, Polgár Beáta, Szolcsányi János, Pintér Erika Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(3) pp. 795-803. (2012)

1. Irodalmi háttér, előzmények

A szenzoros rostok gyulladásban betöltött szerepét (neurogén komponens) vizsgáló

állatkísérletekben a szisztémás RTX előkezelést szelektív farmakológiai eszközként

alkalmazzák a TRPV1-pozitív érzőideg-végződések deszenzitizációjára [18]. A nem-

neuronális TRPV1 csatornák felfedezésével adódik a kérdés: az évtizedek óta

alkalmazott RTX deszenzitizáció vajon továbbra is szelektív kísérleti eszköznek

tekinthető-e, amely kizárólag a szenzoros neuronokat érinti, de a nem-neuronális

sejtekre nincs hatással? Keratinocitákon végzett in vitro vizsgálatok [100] alapján

feltételezhetjük, hogy a nem-neuronális TRPV1 receptorok és gazdasejtjeik intakt

állapotban maradnak szisztémás RTX kezelés után.

A kapszaicin és az RTX fontos farmakológiai eszközzé vált a perifériás szenzoros

neuronok szelektív aktiválásában, ill. ismételten, nagy dózisban történő alkalmazásuk

esetén ezen neuronok szelektív károsításában [15] (10. ábra, 21. old.).

A szenzoros idegvégződések RTX/kapszaicin nagydózisú vagy ismételt adása által

kiváltott deszenzitizációjához három mechanizmus vezet. (1) Receptor szintű

deszenzitizáció: az aktivált TRPV1 csatornán át beáramló Ca2+ ionáram a receptor

defoszforilációját okozza, amely csökkenti annak érzékenységét. (2) Ingerület

kialakulásának gátlása: a TRPV1 ismételt aktiválása és az ezzel járó kation beáramlás

közvetetten blokkolja a feszültségfüggő Na+-csatornákat, amely az akciós potenciál

kialakulása ellen hat. (3) Idegvégződés funkcionális károsodása: a mitokondriális

membrán depolarizációja az organellum duzzadásához és Ca2+ kiáramlásához vezet a

citoplazmába. Nagy dózisokban adott RTX tehát az idegvégződés funkcionális

károsodását okozza, ez a folyamat a deszenzitizáció, amelyet az idegvégződés fizikai

21

károsodása követhet, utóbbi a kémiai denerváció [10,25]. A deszenzitizáció

szinonimájaként használják az irodalomban a deszenzibilizáció kifejezést is, amely az

idegi-ingerületvezetési funkciók hiányát hangsúlyozza ki.

10. ábra

A kapszaicin/RTX deszenzitizáció hatásmechanizmusa a TRPV1-et kifejező érzőideg-

végződésekben. Anand és mtsai, 2011 [25].

Mivel a krónikus, súlyos fájdalommal járó állapotok kezelésében az eddigi TRPV1

antagonisták nem jutottak túl a II-es fázisú klinikai vizsgálatokon a mellékhatásaik

(elsősorban a fájdalmas hőküszöb emelkedése) miatt, előtérbe került a kapszaicin-

érzékeny idegvégződések deszenzitizációja mint terápiás eszköz. Ennek legfrissebb

irodalmát Nilius és Szállási (2014, [44]) tekintette át: a nagy dózisú (8%) kapszaicint

tartalmazó Qutenza bőrtapaszt jelenleg posztherpetikus neuralgia (PHN, övsömör

utáni idegzsába) és nem diabéteszes perifériás neuropátiás fájdalom kezelésére

alkalmazzák. A transzdermális kapszaicin terápia a TRPV1-pozitív szenzoros afferensek

reverzíbilis eliminációját okozza a bőrben, amely fájdalomcsillapító hatású [25]. Szintén

PNH-ban analgetikus hatású a nagykoncentrációjú (20%) kapszaicin folyadék

formuláció (NGX-1998), továbbá klinikai vizsgálatok alatt áll a zu-kapszaicin (kapszaicin

22

cisz-izomer; Civamid: ízületi fájdalom, migrén, cluster-fejfájás; Civanex krém: ízületi

fájdalom csillapítása COX-2 gátlóval kombinációban) [44]. Az RTX deszenzitizáció is újra

az érdeklődés középpontjába került, más módon nem kezelhető daganatos fájdalom

csillapításában, a bíztató állatkísérletek után I-es fázisú klinikai vizsgálat indult [44].

Vizsgálataink előtt nem volt ismert, hogy a szenzoros TRPV1 károsodását okozó

kapszaicin/RTX terápiák [44] károsítják-e a nem-neuronális TRPV1 receptorokat.

2. Célkitűzések

A fenti előzmények alapján vizsgálataink céljául tűztük ki patkány lábbőr és

szájnyálkahártya mintákban a nem-neuronális TRPV1 (1) jelenlétének, valamint (2)

expresszióváltozásának vizsgálatát RTX deszenzitizáció és sebészi denerváció után,

mRNS és fehérjeszinten. Azt szerettük volna kimutatni, hogy a szenzoros denerváció

valóban szelektíven a neuronálisTRPV1 receptorra hat-e.

23

3. Anyagok és módszerek

Kísérleti állatok, RTX deszenzitizáció, sebészi denerválás

A kísérleteket felnőtt hím Wistar patkányokon (tömeg: kb. 300 g) végeztük. (11. ábra)

Az állatok egy csoportjában (n=6) a hátsó lábakon denerválást végeztünk, amellyel az

idegrostok degenerálódását idéztük elő. Nátrium-pentobarbitál (Euthasol; 40 mg/ttkg

i.p.; Produlab Pharma b. v., Hollandia) altatás alatt a patkányok jobb hátsó lábán a

comb magasságában elvágtuk a n. ischiadicust és a n. saphenust, ezzel denerváltuk a

végtagot. Az ellentétes hátsó végtagok szolgáltak kontrollként. A denerválás után öt

nappal a nátrium-pentobarbitállal túlaltatott állatokat feláldoztuk. A denervált és

kontroll hátsó lábak dorzális (szőrrel borított) és plantáris (szőrtelen) bőrét

kimetszettük, két darabra vágtuk kvantitatív qPCR és immunhisztokémiai vizsgálatok

céljára. Öt másik patkányt deszenzitizáltunk RTX (Sigma, St. Louis, MO, USA) kezeléssel:

30, 70, és 100 μg/ttkg RTX s.c., három egymást követő napon [101]. Öt állat fiziológiás

sóoldatot kapott kontrollként. Az állatokat két héttel később feláldoztuk, a hátsó lábak

dorzális és plantáris bőr-, és szájnyálkahártya mintáit kimetszettük qPCR és

immunhisztokémiai jelölés céljából. (11. ábra)

11. ábra

Kísérleti elrendezés.

24

Szövetminták előkészítése

Minden egyes kimetszett szövetmintát két darabra vágtunk, a szövetminta felét RNA

Later (Sigma-Aldrich Magyarország Kft, Budapest) folyadékba helyeztük, és −80°C-on

tároltuk, másik felét 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk

immunhisztokémiai jelölés céljára.

mRNS expresszió vizsgálata

Az RNA Later folyadékban tárolt mintákat 1 ml TRI reagensben (Molecular Research

Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk és a gyártó utasításainak

megfelelően teljes RNS-t izoláltunk belőlük. Az izolált RNS mennyiségét és tisztaságát

Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer V3.5 (NanoDrop Technologies, Inc.,

Wilmington, DE, USA) segítségével határoztuk meg. Mintánként 1 µg totál RNS-t írtunk

át reverz transzkripcióval cDNS-re a RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

(Fermentas/Thermo Fisher Scientific, USA) segítségével, 5 µM oligo(dT)18 primerrel 20

μl térfogatban, a gyártó utasításainak megfelelően. Ezt követően kvantitatív PCR

(qPCR) detektálást hajtottunk végre Roche LightCycler készüléken TaqMan Universal

Master Mix (Applied Biosystems/LifeTechnologies, USA), TaqMan primerek és próbák

(patkány TRPV1-re specifikus, Rn00583117_m1 azonosítójú assay, LifeTechnologies,

USA) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően (900 nM primer, 250nM

próba, 20 µl reakciótérfogatban; kétlépéses PCR program: 95°C 10 perc; 95°C 15s, 60°C

1 perc, 40 ciklus). A mintákat triplikátumban mértük le, a génexpressziót a hipoxantin

foszforibozil-transzferáz-1 (Hprt1) gén transzkriptumaira normalizáltuk (patkány Hprt1-

re specifikus, Rn01527840_m1 azonosítójú assay, LifeTechnologies, USA). A relatív

génexpressziót a referenciagénhez képest számítottuk ki a szövettípusok közötti

összehasonlításra a 2-ΔCt képlettel.

Immunhisztokémia

A deparaffinizált és rehidrált szöveti mintákat pH 6-on citrát pufferben inkubáltuk

mikrohullámú sütőben, 3x5 percig, 750 W-on, antigén feltárás céljából. A szövetek

endogén peroxidáz aktivitását 20 perces 3%-os hidrogén-peroxidban (H2O2) való

inkubációval gátoltuk. A másodlagos antitest nem specifikus kötődését

25

megakadályozandó a mintákat normál kecske szérumban inkubáltuk 20 percig. Ezután

a metszeteket előbb 1:1000-es hígításban nyúl poliklonális anti-TRPV1 antitesttel (Kat.

szám: 2233; Tocris Bioscience, USA) inkubáltuk 1 órán keresztül, majd másodlagos

torma-peroxidázzal konjugált EnVision system anti-nyúl szekunder antitesttel (Dako-

Cytomation, Dako North America, USA) 30 percig. Végül a TRPV1 receptorok

immunlokalizációját diamino-benzidinnel (DAB) hívtuk elő 10 percig, magfestést

hematoxilinnal végeztünk. Az elsődleges antitest szelektivitását Western blot

segítségével bizonyították [102]. Negatív kontrollként elsődleges antitest nélküli,

másodlagos antitest és kecskeszérum hozzáadásával inkubált metszetek szolgáltak,

mindhárom szövettípuson. A szájnyálkahártyában a TRPV1 receptorok

immunpozitivitását szemikvantitatív pontozással határoztuk meg egy, a kísérletekben

részt nem vevő patológus segítségével. Image Pro Plus 4.5 szoftverrel analizáltuk a

metszetekről készült képeket, és az immunspecifikus festődés alapján azonosítottuk az

pozitív pixeleket. Az adatokat a vizsgált régióban (epithelium, kötőszövet) százalékos

arányban adtuk meg. A dorzális mintákban az epidermális réteg nem bizonyult kellő

vastagságúnak a keratinocita szám pontos meghatározásához, ezért ezt csak a talpi

bőrmintákban végeztük el, az ImageJ 1.44p szoftverrel (National Institutes of Health,

USA).Az előhívás után kialakult specifikus immunfestési színre manuálisan beállítottunk

egy detektálási küszöbértéket az immunpozitív keratinociták azonosítására. Kijelöltük

az epidermális régiót és lemértük a területét, amelyet a pixelek számában ad meg a

szoftver, majd megszámoltuk a TRPV1-re specifikusan festődő keratinociták számát.

Minden egyes kontroll és kezelt állatból öt metszetet elemeztünk, metszetenként öt

fotó készült. Az adatokat egységnyi epidermisz területre (100 000 pixel) vonatkoztatott

TRPV1-pozitív keratinociták számaként adtuk meg.

Statisztika

Az eredményeket átlag±átlag szórása (SEM) formában fejeztük ki. A statisztikai analízis

során Mann-Whitney-próbát, a szövettípusok qPCR eredményeinek

összehasonlításakor Kruskal-Wallis és Dunn-féle többszörös összehasonlító próbát

alkalmaztunk, a p<0,05 értékeket tekintettük szignifikánsnak.

26

4. Eredmények

TRPV1 mRNS expresszió patkány lábbőrben és szájnyálkahártyában

RTX kezelés

A Trpv1 receptor mRNS az előzetes várakozásaink szerint kimutatható volt qPCR-ral a

lábháti (12. ábra) és talpi bőrben (13. ábra), valamint a szájnyálkahártyában (14. ábra,

27. old.) mind az RTX-előkezelt, mind a kezeletlen kontroll állatokban. A relatív Trpv1

mRNS expresszió nem különbözött szignifikánsan a deszenzitizált és kontroll állatok

azonos típusú mintái között. A szövettípusok közül a szájnyálkahártya mutatja a

legmagasabb mértékű génexpressziót, amelyet a dorzális és plantáris bőr követ (15.

ábra). A Trpv1 szignifikánsan magasabb szinten expresszálódik a dorzális bőrben és két

nagyságrenddel magasabban a szájnyálkahártyában, a talpi bőrhöz képest.

12. ábra

A relatív Trpv1 génexpresszió a lábháti

bőrben a kontroll és RTX-kezelt állatok

között. Nincs szignifikáns különbség a

kontroll és RTX-kezelt csoport között.

Mann-Whitney-próba.

13. ábra

Relatív Trpv1 génexpresszió a talpi

bőrben a kontroll és RTX-kezelt állatok

között. Nincs szignifikáns különbség a

kontroll és RTX-kezelt csoport között.


27

14. ábra

Relatív TRPV1 génexpresszió a

szájnyálkahártyában a kontrol és RTX-

kezelt állatok között. Nincs szignifikáns

különbség a kontroll és RTX-kezelt

csoport között. Mann-Whitney-próba.

15. ábra

Relatív Trpv1 génexpresszió

összehasonlítása a szövettípusok között

a kezeletlen kontrollmintákban.

Kruskal-Wallis próba és Dunn-féle

többszörös összehasonlító próba: talpi

bőr vs. szájnyálkahártya **p<0,01.

Mann-Whitney próba lábháti vs. talpi

bőr #p<0,05.

Sebészi denerváció

A qPCR-ral mért Trpv1 mRNS expresszió mértéke hasonló volt a sebészileg denervált és

ellenoldali ép kontroll lábháti (16. ábra) és talpi (17. ábra, 28. old.) bőrminták között.

Nem volt különbség a vizsgált bőrterületek között.

16. ábra

Relatív Trpv1 génexpresszió a lábháti

bőrben a kontroll és sebészileg denervált

láb között. Nincs szignifikáns különbség a

kontroll és denervált csoport között. Mann-

Whitney-próba.

28

17. ábra

Relatív Trpv1 génexpresszió a talpi

bőrben a kontroll és sebészileg denervált

láb között. Nincs szignifikáns különbség a

kontroll és denervált csoport között.


TRPV1 immunpozitivitás a patkány láb bőrszövetében

RTX kezelés

A negatív kontrollként szolgáló szövetmetszetek, amelyeket csak a másodlagos

antitesttel és kecskeszérummal inkubáltunk, nem mutattak immunpozitivitást (18.

ábra, 29. old.; 19. ábra, 30. old.; 20. ábra, 31. old). Erős pozitív TRPV1 protein

immunfestést a lábi bőr keratinocitákon, a talpbőr kapilláris endothel sejteken, a

dorzális bőrben sebocitákon is (18. ábra, 29. old; 19. ábra, 30. old) kimutattunk.

Szájnyálkahártyában egyértelmű TRPV1 immunopozitivitást találtunk keratinocitákon,

valamint a kötőszövetben fibroblastokon, limfocitákon és érendothel sejteken (20.

ábra, 31. old). A TRPV1 immunfestődés intenzitása nem mutatott különbséget a három

szöveti régióban és nem változott RTX deszenzitizáció hatására. A TRPV1

immunpozitivitás szemikvantitatív értékelése a talpi bőr (21. ábra, 32. old.), valamint

szájnyálkahártya metszeteken (22. ábra, 32. old.) nem mutatott ki szignifikáns

különbséget az RTX-előkezelt és kontroll minták között.

29

18. ábra

Reprezentatív TRPV1-

specifikus

immunhisztokémiai

felvételek a (A) negatív

kontroll (elsődleges antitest

nélküli) lábháti bőr

szövetmetszetekről,

valamint a (B) kontroll és (C)

RTX-kezelt állatok lábháti

bőr mintáiról. Lépték: 500

µm.

A kezeletlen kontroll (B)

lábháti (szőrrel borított)

bőrminták TRPV1

immunpozitivitást mutatnak

keratinocitákon (felső nyíl)

és sebocitákon (alsó nyíl).

A 3 egymást követő napon

30, 70 és 100 μg/ttkg s.c.

RTX dózissal deszenzitizált

állatok (C) lábháti bőrmintái

szintén TRPV1



és sebocitákon (alsó nyíl).

C

B

A

30

19. ábra


specifikus immunhisztokémiai



nélküli) talpi bőr

szövetmetszetekről, valamint

a (B) kontroll és (C) RTX-

kezelt állatok talpi bőr

mintáiról. Lépték: 500 µm.

A kezeletlen kontroll (B) talpi

(szőrtelen) bőrminták TRPV1



és kapilláris

endothelsejteken (alsó nyíl).


30, 70 és 100 μg/ttkg s.c.


állatok (C) talpi bőrmintái

szintén TRPV1



és kapilláris

endothelsejteken (alsó nyíl).

B

A

C

31

20. ábra


specifikus immunhisztokémiai



nélküli) szájnyálkahártya

szövetmetszetekről, valamint

a (B) kontroll és (C) RTX-

kezelt állatok

szájnyálkahártya mintáiról.

Lépték: 500 µm.

A kezeletlen kontroll (B)

állatok szájnyálkahártya

mintái TRPV1


keratinocitákon (nyíl) és a

kötőszövetben.


30, 70 és 100 μg/ttkg s.c.


állatok (C) szájnyálkahártya

mintái szintén TRPV1


keratinocitákon (nyíl) és a

kötőszöveti régióban.

B

C

A

32

21. ábra

RTX-kezelt állatok talpbőréből

készült metszetek TRPV1

szemikvantitatív

immunpontozása. 100 000

pixel epidermisz területre eső

TRPV1-pozitív keratinociták

száma. Átlag ± SEM. Nincs

szignifikáns különbség a

kontroll és RTX kezelt csoportok között. Mann-Whitney próba.

22. ábra

RTX-kezelt állatok

szájnyálkahártya metszetei

TRPV1 szemikvantitatív

immunpontozása. A TRPV1-

pozitivitás pontozása az epithel

rétegben és a kötőszövetben,

összetett pontszámként

összegezve. Átlag ± SEM. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és RTX kezelt

csoportok között. Mann-Whitney próba.

Sebészi denerváció

A keratinociták és kapilláris endothel sejtek specifikus immunfestődése a talpi bőrben

és a sebociták jelölődése a lábháti bőrben változatlan maradt sebészi denerváció után

(23. ábra, 33. old.). Nem találtunk különbséget a denervált és ép kontroll talpi

metszetek között szemikvantitatív TRPV1 immunpontozással (24. ábra, 34. old).

33

D

C

A 23. ábra

Reprezentatív TRPV1-specifikus

immunhisztokémiai felvételek a

sebészi denerváción átesett láb, ill. az

intakt ellenoldali hátsó végtag

bőrmintáiból. Lépték: 100 μm.

A (A) nem denervált hátsó lábháti

bőrminták TRPV1 festődése

keratinocitákon (felső nyíl) és

sebocitákon (alsó nyíl). A sebészileg

denervált állatok az idegátvágás után 5

nappal kerültek leölésre.

Az ép hátsó végtag (B) lábháti

bőrmintái szintén TRPV1


keratinocitákon (felső nyíl) és

sebocitákon (alsó nyíl).

A (C) kontroll talpi bőrminták TRPV1

specifikus immunpozitivitást mutatnak

keratinocitákon (felső nyilak) és

kapilláris endothelsejteken (alsó

nyilak).

A (D) kontroll talpi bőrminták szintén

TRPV1 specifikus immunpozitivitást

mutatnak keratinocitákon (felső nyilak)

és kapilláris endothelsejteken (alsó

nyilak).

B

34

24. ábra

Sebészileg denervált és intakt

ellenoldali láb talpi bőréből

készült metszetek TRPV1

szemikvantitatív

immunpontozása. 100 000

pixel epidermisz területre

számított TRPV1-pozitív

keratinociták száma. Átlag ± SEM. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és denervált

csoport között. Mann-Whitney próba.

5. Megbeszélés, következtetések

Elsőként mutattuk ki patkány talpi és lábháti bőrben, továbbá szájnyálkahártyában a

TRPV1 receptor mRNS és fehérjeszintű jelenlétét. Keratinocitákon végzett in vitro

vizsgálatok [100] alapján előzetesen feltételeztük, hogy a nem-neuronális TRPV1

receptorok és az azokat tartalmazó sejtek épek maradnak szisztémás RTX előkezelés

után. Bizonyítottuk, hogy a szisztémás RTX kezelés kizárólag a neuronális TRPV1

receptorokra szelektív, mivel a szisztémás RTX deszenzitizáció, amely kémiai

denervációt eredményezett, nem változtatja meg a TRPV1 kifejeződését nem-

neuronális sejteken a patkány lábbőrben és a szájnyálkahártyában.

A n. ischiadicus és a n. saphenus átvágása patkány lábon comb magasságban, amely a

TRPV1-pozitív érzőideg-végződések degenerálódásával jár, nem befolyásolja a nem-

neuronális TRPV1 expresszióját a lábbőrben. Idegi ligációs vizsgálatok alapján a TRPV1

receptorproteinek a primér szenzoros neuronok sejttesteiben szintetizálódnak,

ahonnan ligandkötésre képes receptormolekulák formájában intraaxonális

transzporttal jutnak el a perifériára [73]. Ezért a TRPV1 mRNS jelenlétét a periférián

lokális, nem-neuronális eredetűnek tekintjük. A TRPV1 mRNS detektálása RTX-

előkezelt állatokból származó lábbőr és szájnyálkahártya mintákban bizonyítékot

szolgáltat a TRPV1 kizárólagosan nem-neuronális sejteken való jelenlétére. Specifikus

TRPV1 immunfestődés figyelhető meg keratinocitákon és kapilláris endothelsejteken a

35

talpi bőrben, míg a lábháti bőrminták TRPV1-pozitív sebocitákat is tartalmaznak. A

szájnyálkahártya TRPV1 immunpozitivitást tartalmaz mind keratinocitákon, mind

kötőszöveti elemeken (fibroblastok, limfociták, érendothel sejtek). Az

immunhisztokémiai eredményeinket a TRPV1 receptorok lokalizációjáról alátámasztják

in vitro funkcionális irodalmi adatok: az általunk kimutatott TRPV1-pozitív sejttípusok

szelektív TRPV1 agonista vagy antagonista kezelés hatására megfelelő választ adtak

sejtkultúrában [63,68,102–105].

Szájnyálkahártyában a Hprt1 referenciagénhez viszonyított Trpv1 génexpresszió két

nagyságrenddel magasabb, mint a talpi bőrben. A detektált mRNS szintjét arányosnak

tekintjük a TRPV1-et kifejező sejtek számával, míg az egyes sejteken belüli kifejeződés

szintjével csak kismértékben [67]. A nagyobb számú keratinocita és a kötőszövet

további TRPV1-pozitív sejtjeinek (T-limfociták, fibroblastok) jelenléte magyarázhatja a

szájnyálkahártya legmagasabb génkifejeződését az általunk vizsgált szövettípusok

között. Az RTX által kiváltott deszenzitizáció a neurogén gyulladás hiányához vezet [15],

amely bizonyítja a neuronális TRPV1 receptorok funkcióvesztését. RTX kezelés után a

TRPV1 mRNS szint nem mutatott változást sem a bőr, sem a szájnyálkahártya

mintákban a megfelelő kontrollokhoz viszonyítva. Ismert, hogy magas vagy ismételt

szisztémás RTX dózisok hosszútávon károsítják a TRPV1-pozitív szenzoros neuronokat

[15]. A TRPV1 receptor mRNS-t detektáltuk nem-neuronális sejtekben az RTX-

előkezelés után, a változatlan mRNS szint ép sejtfunkcióra utal. Így bizonyítottnak

tekintjük, hogy a TRPV1-et kifejező nem-neuronális sejtek nem érzékenyek a

szisztémás RTX citotoxikus hatásaira. A lábbőr és szájnyálkahártya minták specifikus

immunfestése is bizonyította a TRPV1 receptorfehérje változatlan jelenlétét RTX

deszenzitizáció után. A talpi bőr és szájnyálkahártya metszetek szemikvantitatív TRPV1

immunpontozása nem mutatott különbséget az RTX-előkezelt és kontroll állatok

között.

Összességében a qPCR és immunhisztokémiai eredményeink alapján kimondhatjuk, az

általunk alkalmazott szisztémás RTX előkezelés elegendőnek bizonyult az idegkárosító

hatáshoz, a TRPV1-pozitív nem-neuronális sejtek károsítása nélkül. Ez az eredmény jól

korrelál az irodalmi adatokkal, amelyek szerint a nagy dózisú (>0,8 M kapszaicin [106]),

de nem az alacsony dózisú (<1 μM RTX; <10 μM kapszaicin [100]) vanilloidok

36

citotoxikus hatásúak humán keratinocitákra in vitro. A nagy dózisú vanilloidok

citotoxikus hatását nem-neuronális sejttenyészetekre nem TRPV1 receptor által

mediált folyamatnak tekintik [100,102].

A TRPV1 receptorok RTX által kiváltott hosszan tartó aktiválása az intracelluláris szabad

Ca2+ szint nagymértékű növekedéséhez vezet, amely a neuronális sejtekre citotoxikus,

míg a nem-neuronális sejtek tolerálják, vagy a kation beáramlás eleve kisebb

mértékű/rövidebb ideig tart. Ismert, hogy a nem-neuronális sejttípusok kisebb

sűrűségben fejezik ki a sejtmembránon a TRPV1 receptort a neuronális sejtekhez

képest [15,100], hiszen ebben az esetben nem szerepük akciós potenciál generálása. Ez

magyarázhatja az agonistára való kisebb érzékenységet. Keratinocitákon végzett in

vitro vizsgálat alapján [100] az RTX citotoxikus hatása a TRPV1 receptorexpresszió

szintjétől függ. Hozzájárulhatnak az RTX differenciális hatásához a neuronális és nem-

neuronális sejttípusok közötti strukturális különbségek, ill. a receptorok eltérő

érzékenysége. A mikrotubulus rendszer és kapcsolódó intracelluláris jelátviteli

komplexek szabályozzák a TRPV1 deszenzitizáció mértékét [74]. Elképzelhető, hogy

fejlődéstanilag különböző eredetű sejtekben ez a reguláció eltérően játszódik le.

Ismert, hogy a heterológ módon kifejeztetett TRP csatornák farmakológiai

tulajdonságai eltérőek, amelyet a szignalizációs komponensek másfajta összetétele

okozhat [107]. Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján a TRPV1 ioncsatornát a

külső plazmamembránban körülvevő lipid raft különböző összetétele részben felelős

lehet a kapszaicin/RTX differenciális hatásaiért szenzoros ganglionsejtekben és

transzfektált sejtvonalakban [108]. Korábban leírták, hogy a kapszaicin/RTX előkezelés

dózisfüggő módon deszenzitizálja az egér hízósejteket további vanilloid stimulustól, de

nem citotoxikus [72]. Kimutatták, hogy a patkány arteriola simaizomsejteken található

TRPV1 receptorok gyorsan (perceken belül) deszenzitizálódnak kapszaicin hatására in

vitro [109], amely behatárolja a Ca2+-toxicitás mértékét.

A fentieken túl eredményeink jól összeegyeztethetőek azon korábbi adatokkal is,

amelyek szerint a TRPV1 receptor által mediált vazodilatációs hatás megszüntethető

szisztémás kapszaicin kezeléssel, ugyanakkor a kapszaicin érösszehúzó hatása ezután is

megmarad vagy fokozódik [110]. Azóta tudjuk, hogy az érfal simaizomsejtjei

funkcionális TRPV1 receptorokat expresszálnak [55,69], így a nem-neuronális

37

ioncsatornák közvetíthetik az érösszehúzó hatásokat. Időközben igazolták, hogy

újszülött patkányokban a neuronális TRPV1 receptorokat anatómiailag és

funkcionálisan elimináló szisztémás kapszaicin kezelés (5 napon át összesen 300

mg/ttkg) nem befolyásolja a vázizom arteriolák TRPV1-et kifejező sejtjeit, azok

életképességét [109], amely összhangban van munkacsoportunk eredményeivel.

Kísérleteink másik szakaszában sebészi denervációval károsítottuk a TRPV1

receptorokat. A n. ischiadicus és n. saphenus idegek átvágása a lábon comb

magasságban a TRPV1-pozitív szenzoros idegvégződések degenerációját idézi elő [1].

Ez az eljárás csak a neuronális TRPV1 receptorokat károsítja fizikailag. Ez

magyarázhatja, hogy kísérletünkben miért maradtak épen a nem-neuronális eredetű

receptorok: hasonlóan a kémiai denerváláshoz, a sebészi denerválás sem volt hatással

a nem-neuronális Trpv1 mRNS expresszióra. Továbbá, a lábbőr minták specifikus

immunfestése szintén a TRPV1 receptorproteinek változatlan jelenlétét demonstrálja

sebészi denerválást követően keratinocitákon és kapilláris endothelsejteken (talpi bőr),

és sebocitákon (lábháti bőr). A keratinocitákon található TRPV1 receptorok, hasonlóan

az idegvégződéseken jelenlévőkhöz, szöveti sérüléskor felszabaduló protonok és hő

által aktiválhatóak [64,65,111,112]. Ez azt sugallja, hogy elsődleges sejtes kémiai és

hőszenzor szerepet játszik a receptor [63]. Keratinocitákon és egyéb nem-neuronális

sejteken található TRPV1 receptorok lehetséges szerepe a gyulladásos folyamatokban

tisztázásra vár. TRPV1 stimulációja keratinocitákon prosztaglandin E2 és interleukin-8

felszabaduláshoz, megnövekedett COX-2 és mátrix metalloproteináz-1 expresszióhoz

vezet in vitro [63,65]. Az epidermális TRPV1 szerepet játszik abban a gyulladásos

válaszban, amelyet a bőrfelszín savas hámlasztása okoz [68]. Pro-inflammatorikus

mediátorok, amelyeket az epithelsejtek TRPV1 receptoraira ható káros környezeti

hatások szabadítanak fel, neurogén gyulladásos válaszhoz vezethetnek, részben a

szenzoros idegek TRPV1 csatornáinak aktiválásával/szenzitizálásával [30].

Munkacsoportunk korábban kimutatta [76] a keratinocita-TRPV1 expresszió

fokozódását egy szájüregi gyulladásos betegségben, oralis lichen planusban, amely a

fenti in vitro előzmények alapján okozati szerepet sugall ebben a kórképben. A T-

limfocitákból, amelyek TRPV1 specifikus festődését kimutattuk a szájnyálkahártyában,

38

a kapszaicin képes P-anyagot felszabadítani [71]. Nemrégiben igazolták a funkcionális

TRPV1 jelenlétét limfocitákon [62].

Következtetésként elmondhatjuk, hogy az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicin-

szenzitív neuronokra citotoxikus, így továbbra is a neuronális TRPV1 receptorokra

szelektív farmakológiai eszköznek tekinthetjük. Az ultrapotens kapszaicin analóg RTX

alkalmazásával kapott eredményeink alapján a primér szenzoros neuronokra szelektív

neurotoxinként alkalmazott kapszaicin nem károsítja az extraneuronális sejteket [18].

A vanilloid deszenzitizáció eliminálja a neuronális TRPV1 receptorokat. Ha megfordítjuk

a gondolatmenetet, mindez egyúttal megnyitja a lehetőséget a (kémiai denerválás

után is intakt) nem-neuronális TRPV1 receptorfunkció szelektív in vivo

tanulmányozására.

Az RTX/kapszaicin „nem specifikus”, azaz nem TRPV1 által mediált hatásait a

szervezetben több helyen leírták, a TRPV1 nem-neuronális sejteken történt

felfedezésével ezeket a vanilloid hatásokat újraértékelhetjük [15]. Jól ismert például,

hogy a TRPV1 aktiváció neurogén mechanizmusokon keresztül vazodilatációt [21], míg

bizonyos körülmények között vazokonstrikciót (mesentericus, coronaria és vázizom,

dura mater) okoz [69,103,113–115]. Ezen korábbi irodalmi adatok az érfalban

lokalizálódó TRPV1 összehúzó funkcióját sugallták, amely azóta igazolást nyert az

arteriola simaizomban [69,114] (míg az érendothelben a TRPV1 dilatációt okozó CGRP

felszabadítását mediálja [13]). Eredményeink alapján feltételezzük továbbá, hogy a

kapszaicin/RTX deszenzitizáción alapuló terápiák nem károsítják az extraneuronális

TRPV1 receptorokat, ill. az azokat kifejező sejteket (25. ábra, 39. old.).

39

25. ábra

Eredményeink összefoglalása.

40

IV. A TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolat hatása a

kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban

Helyes Zsuzsanna, Kun József, Dobrosi Nóra, Sándor Katalin, Németh József, Perkecz Anikó, Pintér Erika, Szabadfi Krisztina, Gaszner Balázs, Tékus Valéria, Szolcsányi János, Martin Steinhoff, Baba Akemichi, Reglődi Dóra, Bíró Tamás Capsaicin induces skin inflammation via Transient Receptor Potential Vanilloid-1-mediated up-regulation of Pituitary Adenylate-Cyclase Activating Polypeptide Közlésre benyújtva a Journal of Investigative Dermatology folyóirathoz, a bírálók kérdéseire a válaszadás folyamatban.


A PACAP és más neuropeptidek kolokalizációját RT-PCR-ral és immunhisztokémiával

kimutatták kapszaicin-szenzitív neuronok sejttestében és végződéseiben [116–120].

Munkacsoportunk a közelmúltban bizonyította, hogy a PACAP-38 felszabadul in vitro a

kapszaicin-érzékeny afferensek stimulált perifériás végződéseiből [121] és in vivo a

szisztémás keringésbe [93]. A PACAP emberi bőrben való lokalizációját leírták a

dermális-epidermális határhoz közeli dermális idegrostokban, szőrtüszőkben,

véredényekben, és izzadságmirigyekben [78]. Továbbá, a nagy affinitással bíró PAC1

receptort (9. ábra, 18. old) is kimutatták. Kifejezett PACAP és PAC1 upregulációt

figyeltek meg psoriasisos betegekben, amely a PACAP szerepére utal a bőr gyulladásos

folyamataiban [122].

A számos vizsgálat ellenére, amely a PACAP gátló hatását mutatta ki sejtes gyulladásos

és immunválaszokra [123–128], viszonylag keveset tudunk a gyulladás neurogén

komponensére kifejtett hatásairól. Munkacsoportunk kimutatta korábban, hogy

exogén PACAP bejuttatása gátolja a szenzoros neuropeptidek felszabadulását és az ezt

követő akut neurogén gyulladást [93,121]. A PACAP-hiányos egerekkel végzett

vizsgálatok segítségével feltárhatóak az endogén PACAP funkciói gyulladásos

reakciókban in vivo. Néhány vizsgálat megnövekedett gyulladásos választ mutatott

PACAP génhiányos egerekben kiváltott colitis, autoimmun encephalomyelitis, légúti és

idegi gyulladás [88,129–134], továbbá allergiás kontakt dermatitisz modelljeiben [94].

41

2. Célkitűzések

Mivel korábban nem volt irodalomi adat a PACAP expresszióra, annak gyulladásban

bekövetkező változására és szerepére egér bőrben, a jelenlegi vizsgálat célja volt

ezekre választ keresni radioimmunassay és molekuláris biológiai módszerekkel. A

TRPV1 és a PACAP közötti lehetséges közvetlen kapcsolat vizsgálatára funkcionális

teszteket végeztünk génhiányos egereken két akut in vivo bőrgyulladás modellben,

amelyek mechanizmusa elkülöníthetően neurogén, ill. nem neurogén.


Reagensek, vegyszerek

PACAP-38, kapszaicin (8-metil-N-vanillil-6-nonenamid), CFA és etidium bromid a Sigma

(USA), az etanol és a Tween 80 a Reanal (Budapest) gyártmánya. A molekuláris

biológiai vizsgálatokhoz a TRIzol és a primerek az Invitrogentől kerültek beszerzésre

(Invitrogen, Egyesült Királyság), az AMV reverz transzkriptáz a Promegától (USA), a

Thermal Cycler az Applied Biosystemstől (USA). A kapszaicint 10% etanol, 10% Tween

80 és 80% sóoldatban (0,9% NaCl) oldottuk fel 10 mg/ml törzsoldatba, amit tovább

higítottunk sóoldattal. A PACAP-38 antiszérum Prof. A. Arimura (Tulane University,

New Orleans, USA) nagylelkű ajándéka volt.

Kísérleti állatok

Kísérleteinket hím CD1 egereken (25-35g) végeztük, amelyeket a PTE ÁOK

Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet Állatházában 24-25°C-on tartottunk, normál

élelemmel és vízzel ad libitum ellátva. A kísérletek egy része során a CD1 törzsből

létrehozott PACAP génhiányos egereket [135] használtuk fel a kapszaicin és CFA-

kiváltotta lábduzzadás vizsgálatára, az endogén PACAP szerepének feltárására. A

TRPV1 receptor génhiányos egereket (Trpv1 KO) és C57Bl/6 vad típusú megfelelőiket a

Jackson Laboratories-tól szereztük be, a Charles-River Hungary Kft.-én keresztül. Az

altatást ketamin-xilazinnal (100 mg/kg ketamin i.p., Richter Gedeon NyRt., Budapest; 5

mg/kg xilazin i.p., Eurovet Animal Health BV, Hollandia) végeztük, majd a gerincvelő

megszakításával leöltük az állatokat és kimetszettük a bőrmintákat. A szövetmintákat

42

három darabra vágtuk, az egyik RNAlater (Sigma-Aldrich Kft., Budapest) folyadékba

került molekuláris biológiai vizsgálatokra, egy másikat lefagyasztottunk -20˚C-on

radioimmunassay mérésekhez, a fennmaradó részt formaldehidben fixáltuk.

Akut gyulladás kiváltása

Neurogén, ill. vegyes típusú gyulladásos reakciót váltottunk ki 50 μl kapszaicin (100

μg/ml, Sigma, USA) intraplantáris injekciójával, ill. teljes Freund-adjuvánssal (complete

Freund’s adjuvant: CFA; elölt Mycobacterium tuberculosis szuszpenziója

paraffinolajban; 50 μl, 1 mg/ml) a bal hátsó lábba. A megfelelő oldószer azonos

térfogata került befecskendezésre az ellenoldali lábba. Az egereket mélyaltatásban

kivéreztettük 24 órával a kapszaicin vagy CFA adása után. A hátsó lábból származó talpi

és lábháti, valamint háti bőrdarabokat, ill. kontrollként fül, agyalapi mirigy és

hipotalamusz szövetmintákat kettévágtuk a PCR és RIA mérésekhez (lásd lentebb) (26.

ábra). A kapszaicin és CFA által kiváltott lábduzzadás mértékének meghatározására a

láb térfogatát pletizmométer segítségével mértük meg (Ugo Basile Type 7140,

Comerio, Olaszország), a gyulladás kiváltása előtt és utána többször. Az ödémát a

kezdeti kontroll %-ában fejeztük ki (n=6-8 csoportonként) [136].

26. ábra

Kísérleti elrendezés.

43

Radioimmunassay

A PACAP-38-szerű immunreaktivitás (PACAP-38-LI) meghatározása egy specifikus és

érzékeny RIA technikával történt laboratóriumunkban [137]. A PACAP-24-38

peptidszármazékot a Szegedi Tudományegyetem Orvosi Vegytani Intézetében

szintetizálták. A „88111-3” PACAP-38 antiszérumot nyúlban termeltették, amelyhez

szintetikus peptideket konjugáltak szarvasmarha szérum albuminhoz vagy

tiroglobulinhoz, glutáraldehiddel vagy carbodiimiddel. Az így nyert antitest

nagymértékű specificitását és a C-terminálisára való érzékenységét keresztreakciós

vizsgálatokkal igazolták. Az antitest sem a PACAP-27-tel, sem más neuropeptiddel (VIP,

glukagon, szekretin) nem adott keresztreakciót [137].

A kimetszett bőrminták tömegét lemértük, és steril foszfát-pufferelt fiziológiás

sóoldatban (PBS) homogenizáltuk. 2 centrifugálást követően (4000 rpm, 10 perc, 4C,

majd 10000 rpm, 10 perc, 4C) történt a RIA meghatározás.

A PACAP 24-38 peptidszármazék 125I jódizotóppal való jelölését saját

laboratóriumunkban végeztük. A kalibrációs görbe elkészítéséhez szintetikus peptidet

használtunk, melyet 0-10000 fmol/ml koncentrációban mértünk az inkubációs

oldatokba. Az assay-t 1 ml 0,05 mol/l (pH 7,4) foszfátpufferben mértük össze, amely

0,1 mol/l nátrium-kloridot, 0,25 % (w/v) szarvasmarha szérum albumint (BSA) és 0,05

% (w/v) nátrium azidot tartalmazott. Az antiszérumot (100 μl, 1:10000 hígitás), a RIA

jelölőt (tracer) (100 μl 3000 cpm/cső) és a standardet (100 μl) vagy az ismeretlen

mintát, valamint az assay puffert polipropilén csövekbe mértük.

4°C-on 48-72 óráig történt inkubáció után az antitesthez kötött jelölt peptidet

tartalmazó frakciót elválasztottuk a szabad jelölt peptidektől olyan módon, hogy

csövenként 100 μl szeparálószuszpenziót (10 g mosott szén, 1 g dextrán, és 0,2 g

zsírmentes tejpor 100 ml desztillált vízben) mértünk hozzá. A mintákat 4°C-on 20

percig 3000 rpm-en centrifugáltuk, majd a felülúszót óvatosan leöntöttük. A szénhez

kötött szabad peptidfrakció radioaktivitását NZ310 típusú gamma számlálóval mértük.

Ebből következtettünk az ellenanyaghoz kötött radioaktivitás értékére, majd a

kalibrációs görbéről leolvastuk az ismeretlen minta neuropeptid koncentrációját.

44

A PACAP-38 és PAC1 receptor mRNS detektálása a bőrben

A PACAP (Adcyap1) és a PAC1 receptor (Adcyap1r1) mRNS-t szemikvantitatív reverz

transzkripciós (RT) PCR-ral határoztuk meg kapszaicin és CFA-kezelt egerekből

származó szövetmintában [104,138]. Az RNA Later folyadékban tárolt mintákat 1 ml

TRI reagensben (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk

és a gyártó utasításainak megfeleően totál RNS-t izoláltunk belőlük. Az izolált RNS

mennyiségét és tisztaságát Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer V3.5 (NanoDrop

Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA) segítségével határoztuk meg. Mintánként 1

mikrogramm total RNS-t írtunk át reverz transzkripcióval cDNS-re a 15 U oAMV reverz

transzkriptáz enzimmel és 0,025 μg/μl random hexamer primerekkel. Ezt követte a PCR

amplifikáció (95 °C 2 perc, 35 ciklus: 94 °C 1 perc; 61,5 °C PACAP (Adcyap1) 1 perc /

62,5 °C PAC1 (Adcyap1r1) 90 s / 55,5 °C Gapdh 60 s, 72 °C 1 perc; 72°C 2 perc)

GeneAmp PCR System 2400 DNA Thermal Cycler készüléken. Primerek: PACAP

(Adcyap1) F 5’-GGGGCAAGTCTAGCTCCTCT-3’, R 5’-GGGTCTCCAGAAAATCCACA-3’;

PAC1 receptor (Adcyap1r1) F 5’-AGGCAATGAGTCGAGCATCT-3’, R 5’-

GTCTTTCCCTCTTGCTGACG-3’; Gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (Gapdh), F: 5’-

ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3’; R: 5’-GCTGACAATCTTGAGGGAGT-3’. A PCR

termékeket 1,5 %-os agaróz gélen detektáltuk etidium bromid nukleinsav festékkel (0,5

mg/ml), UV-fény alatt.

Szövettani, immunhisztokémiai vizsgálatok

A talpi bőrszövet mintákat 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, majd 0,1 M PBS-be

helyztük szobahőmérsékleten 1 órára, majd sorozatmetszeteket készítettünk.

Hematoxilin-eozin festést alkalmaztunk a rutin morfológiai vizsgálathoz. Az

immunhisztokémiai analízishez a mintákat PBS-ben öblítettük, permeabilizáltuk PBS-

ben oldott 0,1% Triton X-100-ban 5 percig, majd 0,1% BSA, 1% normal goat serum és

0,1% Na-azid PBS oldatában inkubáltuk, hogy a nem specifikus jelölést minimalizáljuk.

A metszeteket szobahőmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán át nyúlban termeltetett

anti-PAC1 antitesttel (1:100, Prof. Seiji Shioda nagylelkű ajándéka). PBS-ben történő

többszöri mosás után a metszeteket két órán keresztül sötétben inkubáltuk a

megfelelő Alexa Fluor ‘‘568’’ másodlagos antitesttel, amelyet szintén nyúlban

45

terneltettek (1:1000, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). A metszeteket PBS-ben

mostuk, Fluoromount-G-vel (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) rögzítettük őket.

Kontrollként az elsődleges antitest elhagyása szolgált, ebben az esetben nem

tapasztaltunk specifikus festődést a metszeteken. Digitális fényképeket készítettünk

egy CCD kamerával felszerelt Nikon Eclipse 80i mikroszkóp és a Spot software package

segítségével.

A szemikvantitatív immunfluoreszcencia meghatározásához a PAC1 intenzitást ImageJ

1.440 szofverrel mértük, az expresszió szintjét korrigáltuk a szöveti háttérrel. A

különböző csoportok közötti intenzitás összehasonlítására standardizáltuk a

paraméreket: minden egyes metszetet azonos körülmények között analizáltunk (a

felvétel időtartama, azonos beállítások, unit range: 250x250 pixel, metszetenként 10

mérés átlaga).

Statisztika

A PACAP-IR és mRNS adatok statisztikai elemzése Mann-Whitney U próbával történt. A

gyulladásos kísérletekből (ödémakeletkezés, PAC1 immunreaktivitás) származó adatok

elemzése ANOVA-val és Bonferroni post hoc teszttel történt. p<0,05-t fogadtunk el

szignifikánsnak minden esetben.

46

Háti bőr Talpi bőr Lábháti bőr Fül

4. Eredmények

A PACAP és a PAC1 kimutatható az egér bőrben

Nem volt korábban irodalmi adat a PACAP és specifikus receptora, a PAC1

expressziójára egér bőrben. Ezért kísérleteinket ezek kimutatásával kezdtük. A PACAP-

38 immunreaktivitás (IR) radioimmunassay által megbízhatóan mérhető mennyiségben

van jelen a különböző egér bőrminták homogenizátumában (27. ábra). A

koncentrációja hasonló volt (20 és 25 fmol/mg nedves szövet) a talpi és lábháti bőrben

és a fülben. Ezzel ellentétben a PACAP-IR kifejezetten kisebb mintegy 7-8 fmol/mg volt

a háti bőrben.

27. ábra

PACAP-38 immunreaktivitás (PACAP-38-IR) radioimmunassay módszerrel történt

meghatározása különböző egér bőrterületekből származó homogenizátumokban.

47

28. ábra

(A) PACAP (Adcyap1) és (B)

PAC1 receptor (Adcyap1r1)

génexpresszió Gapdh

referenciagén arányában

különböző bőrrégiókban,

gél alapú PCR

denzitometriás értékelése

alapján. OD: optikai

denzitás. A hipofízis (PG) és

a hipotalamusz (HT)

szolgáltak pozitív

kontrollként. n=4-5 egér

csoportonként. Átlag ±

SEM.

A PACAP-IR jelenléte mellett a peptid a bőrben mRNS szinten is kimutatható volt (28.

ábra A). A Gapdh referenciagénhez képest számított relatív expressziója hasonló volt a

vizsgált bőrrégiókban. Ugyanakkor a háti bőrben mért PACAP mRNS expresszió nem

szignifikáns mértékben, de kisebb volt, mint más bőrterületeken, ellentétben a

peptidszinten mért eredménnyel. A PACAP mRNS szintje mintegy 4-5 ször nagyobb volt

a pozitív kontrollként használt hipotalamuszban és az agyalapi mirigyben.

A PACAP specifikus receptora, a PAC1 szintén kimutatható volt az egér bőrben (28.

ábra B). A PACAP-hoz hasonlóan, a PAC1 (Adcyap1r1) specifikus mRNS viszonylag

állandó expressziót mutatott a különböző bőrterületeken. Ezen felül a specifikus PAC1-

IR kimutatható volt a talpbőr papilláris rétegében (27. ábra, 50. old.), ahol a

felszínközeli erek és a hő-, fájdalom- és tapintási ingert felfogó szenzoros

idegvégződések találhatóak [139].

48

Kapszaicin CFA

Nem gyulladt Gyulladt Nem gyulladt Gyulladt

A PACAP és PAC1 expressziója eltérően változik kapszaicin és CFA hatására

A következő lépésben meghatároztuk, hogy a neurogén (talpbőrbe adott kapszaicin

injekcióval kiváltott) vagy a túlnyomórészt nem neurogén (CFA-val kiváltott) gyulladás

befolyásolja-e a PACAP és a PAC1 receptor expresszióját. A kapszaicin szignifikáns,

több, mint kétszeres PACAP-38-IR növekedést idézett elő a talpi bőrben 24 órával a

beadása után, míg a kontralaterális, nem gyulladt oldalon nem volt változás. Ezzel

ellentétben a láb talpi felszínbe adott CFA injekció nem befolyásolta a PACAP-IR-t (29.

ábra).

29. ábra

PACAP-immunreaktivitás (PACAP-IR) radioimmunassay módszerrel történt

meghatározása gyulladt és nem gyulladt egér talpi bőrmintákban 24 órával a gyulladás

kiváltása után. A neurogén gyulladást intraplantáris kapszaicin injekcióval váltottuk ki,

míg a túlnyomórészt nem-neurogén gyulladást CFA adásával. A kontralaterális oldali

lábakat a megfelelő oldószerrel kezeltük. Átlag ± SEM, n=5-6 egér. *p<0,05 Mann-

Whitney U próba vs. megfelelő nem gyulladt minta.

49

30. ábra

(A) PACAP (Adycap1) és (B)

PAC1 (Adycap1r1) specifikus

mRNS transzkriptumok

gyulladt és nem gyulladt

egér talpi bőrben 24 órával

az intraplantáris kapszaicin

(Kap) vagy CFA injekció után.

A kontralaterális talp bőrét a

megfelelő oldószerrel

kezeltük, továbbá

kontrollként szolgált a nem

kezelt dorzális lábbőr. n=5

egér/csoport. Átlag ± SEM

relatív expresszió értékeket a

Gapdh arányában fejeztük ki.

*p<0,05 Mann-Whitney U

próba.

Az előbbi adatokkal összhangban a PACAP mRNS expresszió a gyulladt talpi bőrben

szintén szignifikánsan magasabb volt 24 órával a kapszaicinkezelés után, míg a CFA

injekciót követően nem mutatott változást (30. ábra A). Ehhez hasonlóan a PAC1

receptor mRNS szintén upregulálódott a kapszaicinre, de nem a CFA-ra adott

válaszként (30. ábra). Öszehasonlításként, a lábháti bőrben a PACAP és PAC1 receptor

mRNS változatlan maradt talpi bőr gyulladása esetén (30. ábra A, B).

50

31. ábra

A PAC1 receptorfehérje immunlokalizációja a talpi bőrben. A bal oldali panelek DAB

festéssel előhívott (A) kis nagyítású (lépték: 20 μm) és (B) nagy nagyítású. Az A panel

belső fotója a negatív kontrollt mutatja a PAC1 antitest blokkoló peptiddel való

inkubálás után végzett immunjelöléssel. A (C) panel PAC1 expresszió kvantitatív

értékelését mutatja az immunfluoreszcens metszeteken. A bőrgyulladást kapszaicinnel

(Kap.) vagy CFA adásával váltottuk ki vad típusú vagy PACAP (Adycap1) génhiányos

egerekben, kontrollként a megfelelő oldószer szolgált. n=6 egér/csoport, több

metszet/egér, átlag ± SEM (unit range: 250x250 pixel, 10 mérés/metszet átlaga).

Kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc próba.

A PCR eredményekkel összhangban az immunhisztokémiai eredmények is azt mutatják,

hogy vad típusú egerekben a kapszaicin kiváltotta talpi bőrduzzadás hatására

jelentősen megnövekedett a PAC1 receptorfehérje jelenléte (31. ábra). Érdekes

módon, a RT-PCR eredményekkel ellentétben, a CFA kezelés szintén megnövelte a

PAC1 receptorfehérje expresszióját a nem gyulladt szövetekhez képest (31. ábra C).

51

PACAP és TRPV1 hiányos egerek kisebb gyulladásos válasza kapszaicin hatására

Ezek után a kapszaicin feltételezett hatásmechanimusát vizsgáltuk PACAP és Trpv1

génhiányos egerek segítségével. Mind CD1, amelyen a PACAP hiányos egerek

alapulnak, mind C57Bl/6 vad típusú egerekben a potens és szelektív TRPV1 receptor

agonista kapszaicin jelentős mértékű lábduzzadást váltott ki (32. ábra A, B).

32. ábra

Intraplantáris kapszaicin (A, B) vagy CFA (C, D) adásával PACAP (Adycap) és TRPV1

génhiányos egerekben, és a megfelelő vad genotípusú (CD1, C57Bl/6)

alomtestvéreikben kiváltott gyulladás során a lábduzzadás dinamikája. A hátsó láb

pletizmométerrel mért térfogatnövekedése a gyulladás kiváltása előtti kiindulási érték

%-ában. Átlag ± SEM, n=5-6 egér/csoport; **p<0.01 ***p<0.001 vs. WT; egyutas

ANOVA és Bonferroni post hoc próba.

52

A gyulladásos válasz a maximumát (25-30%) 2 órával az intraplantáris injekció után

érte el. Az ödéma fokozatosan 5-10%-ára csökkent az intraplantáris injekciót követő 24

órában (32. ábra A, B). PACAP-hiányos állatokban ez a kapszaicin által kiváltott akut

(túlnyomórészt neurogén) ödémakeletkezés szignifikánsan kisebb volt a kísérlet teljes

ideje alatt (32. ábra A). A várakozásoknak megfelelően a kapszaicin nem váltott ki

jelenős lábduzzadást Trpv1 KO egerekben (32. ábra B).

Intraplantáris CFA adása szintén a láb duzzadását eredményezte. A kinetikát tekintve a

lábduzzadás szignifikáns szintet (a kiindulási értékhez képest 25-35 %-os emelkedést)

ért el két órával az injekció beadása után, stabil maradt 6 órán keresztül, majd újra

emelkedett 45-55%-ra a 24 órás mérési pontnál, mindkét vad típusú törzsben (32. ábra

A, B). Fontos kiemelni, hogy a kapszaicinnel kiváltott válasszal ellentétben, nem volt

különbség a CFA-kiváltotta ödéma között sem a PACAP (Adcyap1), sem a Trpv1

génhiányos egerekben a megfelelő vad típusú csoportokhoz képest (32. ábra C, D).


Eredményeink szolgáltatják az első bizonyítékot, hogy a PACAP-IR kimutatható az egér

bőr különböző területein. A koncentrációja viszonylag hasonló a lábháti és talpi

bőrben, valamint a fülben, míg a háti bőrben gyengébb PACAP-IR van jelen. A PACAP a

peptid jelenléte mellett mRNS szinten is kimutatható volt ezekben a bőrterületeken. A

Gapdh referenciagénhez képest közel azonos az expressziója a dorzális és plantáris

lábbőrben, és a fülben. A PACAP (Adcyap1) mRNS kismértékben, de nem szignifikánsan

kisebb a háti bőrben. A PACAP jelenlétét kimutatták korábban szenzoros idegekben

[140,141], szőrtüszőkben, vérerekben, verejtékmirigyekben [122], továbbá gyulladásos

sejtekben is [78]. A peptid jelentős mRNS szintű expressziója a bőrben arra utal, hogy

szintézise nem-neuronális sejtekben is végbemegy. A háti bőrben mérhető kisebb,

fmol/mg nedves szövettömegre számított PACAP-IR expresszió azzal magyarázható,

hogy a terület kevésbé beidegzett szenzoros idegekkel, ezáltal kevesebb neuronális

eredetű PACAP-ot tartalmaz, de a bőrszövet nagyobb vastagsága és az eltérő

szerkezete is szerepet játszhat.

53

A PACAP szignifikáns upregulációja megfigyelhető volt a talpi bőrben mind peptid,

mind mRNS szinten a kapszaicin adása után 24 órával. A kapszaicin szelektíven aktiválja

a TRPV1 ioncsatornát, amelyet nem csak szenzoros idegvégződéseken, hanem pl.

dendritikus sejteken és sebocitákon is leírtak a bőrben [142,143]. A TRPV1 aktiváció

hatására megnövekedett PACAP expresszió magyarázható a kapszaicin közvetlen

hatásával az extraneuronális TRPV1 receptorokra vagy a szenzoros idegekből

felszabaduló gyulladásos mediátorok közvetett hatásával. A P-anyagról és a CGRP-ről

kimutatták, hogy képesek stimulálni ezeket az epitheliális és gyulladásos sejteket, így

ezek potenciálisan megnövelhetik a PACAP szintézist bennük. Munkacsoportunk

korábban igazolta, hogy in vivo körülmények között a PACAP-38 a bőrben kapszaicin-

érzékeny rostokból felszabadul szisztémás TRPV1 aktiváció hatására [93]. Hasonlóan

kimutatta csoportunk a PACAP felszabadulását ezekből az afferensekből elektromos és

kémiai stimuláció hatására in vitro is [121]. Noha a szenzoros eredetű PACAP

hozzájárulhat a gyulladt bőrszövet-homogenizátumokban mért emelkedett

immunreaktivitáshoz, az mRNS szint esetében ezt nem tekintjük számbavehető

mértékű tényezőnek.

A kapszaicin-kiváltotta PACAP növekedéssel ellentétben, a CFA injekció nem

változtatta meg sem a peptid-IR, sem az mRNS koncentrációt. A CFA kezelés

megnövelte a PAC1 receptorfehérje expresszióját a nem gyulladt szövetekhez képest

az mRNS eredményekkel ellentétben. E mögött állhatnak poszttranszkripciós

mechanizmusok: elképzelhető a receptor mRNS megnövekedett féléletideje.

A kapszaicin akut, tisztán neurogén gyulladást vált ki nociceptív szenzoros idegrostok

egy alpopulációja aktiválásával a TRPV1 receptoron keresztül, amely során vazoaktív

neuropeptidek szabadulnak fel [19,20,144,145], köztük PACAP is. Ugyanakkor a CFA

krónikus, túlnyomórészt nem neurogén típusú gyulladásos választ idéz elő a

veleszületett immunrendszer, makrofágok, T-sejtek aktiválásával, amely sejtes

beszűrődéshez vezet. Mindebben a szenzoros elemek csak későbbi fázisban jutnak

szerephez [146,147].

A specifikus PACAP receptor PAC1 expressziója párhuzamosan változott a PACAP-pal,

amely azt jelezheti, hogy a receptor a peptid gyulladásos hatásait közvetíti.

54

A PACAP génhiányos egerekkel kapott eredményeink a lokálisan megemelkedett

PACAP in vivo funkcionális jelentőségét is feltárták akut vaszkuláris gyulladásos

válaszokban. A lokális, endogén PACAP potens gyulladáskeltő mediátornak bizonyult,

amely növeli az ödémaképződést neurogén, és nem nem-neurogén

mechanizmusoknak köszönhetően. A hátsó lábba intradermálisan beadott PACAP

extravazációt kiváltó hatását szintén leírták [95].

Ezzel ellentétben munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy i.p. injektált, alacsony

dózisú PACAP-38 peptid gátolja a TRPV1 vagy TRPA1 agonisták által kiváltott akut

neurogén plazma extravazációt vagy a carragenin által kiváltott “vegyes típusú”

gyulladást a patkány hátsó láb talpi bőrében [93,121]. Ez a gátló hatás a P-anyag és

CGRP szenzoros rostokból, valamint további gyulladásos mediátoroknak a szimpatikus

rostokból vagy sejtes forrásokból való felszabadulásának gátlásával indokolható.

Továbbá a PACAP közvetlen gátló hatása a vaszkuláris endotéliumra szintén

feltételezhető. Ezt a lehetőséget erősíti meg a PAC1 receptorok jelenléte

endothelsejteken [148], de számos adat arra utal, hogy a PACAP az érsimaizmot képest

ellazítani [120,149], függetlenül az endotheliumtól.

Ezen adatok alapján az endogén PACAP az akut neurogén ödéma előidézésével a

bőrben a gyulladás irányába hat, pro-inflammatorikus szerepű, míg az exogén peptid

gátló hatású a szenzoros neuronokból felszabaduló neuropeptidek szintjére [93,121].

Az utóbbi hatás nem az ismert PACAP receptorokon keresztül mediálódhat, mivel azok

az idegvégződésekre stimuláló hatású jelátviteli folyamatokat közvetítenek.

Magyarázatként ettől eltérő gátló hatású mechanizmusok és célpontok szolgálhatnak,

a szenzoros rostokon eddig nem azonosított receptor- vagy splice variánson keresztül.

Összegezve, bizonyítékot szolgáltattunk a PACAP expressziójára és kapszaicin

közvetítette upregulációjára egér bőrben, mRNS és peptid szinten egyaránt. PACAP-

hiányos egerekkel kimutattuk továbbá a peptid funkcionális jelentőségét: a peptid a

TRPV1 aktiváció által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos mediátora (33.

ábra, 55. old.).

55

[107–109,

138–140]

33. ábra


56

V. A TRPA1 expressziója és szerepe colitisben

Kun József, Szitter István, Kemény Ágnes, Perkecz Anikó, Kereskai László, Pohóczky Krisztina, Vincze Áron, Gódi Szilárd, Szabó Imre, Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna Upregulation of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 ion channel in the inflamed human and mouse colon and its protective roles PLoS ONE, megjelenés: 2014. szeptember 29.; DOI: 10.1371/journal.pone.0108164


A gyulladásos bélbetegségek (inflammatory bowel diseases, IBD) a bélrendszer

leggyakrabban előforduló krónikus gyulladásos rendellenességeit foglalja magába.

Közéjük tartozik a colitis ulcerosa (UC) és a Crohn-betegség. A UC csak a vastagbelet

érinti, míg a Crohn-betegségben az egész gasztrointesztinális traktust érintheti a

krónikusan fennálló gyulladt állapot, de leggyakrabban a vékonybél disztális szakasza, a

csípőbél és a vastagbél érintett. Az IBD fő klinikai tünetei a hasi fájdalom, hasmenés,

gasztrointesztinális vérzés és testúlycsökkenés [150]. A dextrán nátrium-szulfát sója

(DSS) által kiváltott egér colitis az egyik leggyakrabban alkalmazott, nem genetikai IBD

modell. A DSS kémiai úton károsítja a bélnyálkahártyát (epitheliális barriert),

vastagbélgyulladást és fekélyesedést idéz elő, amely a nyálkahártyában a Lieberkühn-

féle kripták progresszív elvesztéséhez, a béllumen baktériumösszetételének

megváltozásához, valamint a gyulladásos sejtek aktiválásához vezetnek [151,152].

Az IBD az emésztőrendszer fájdalmas és az életminőséget jelentősen rontó, akár

életveszélyes betegségévé válhat. Az elérhető immunszupresszív terápiák komoly

mellékhatásokkal járhatnak, és a betegek egy csoportja visszaeső vagy kiújuló

betegségtől szenvednek. Mindezek hajtóerőt jelentenek, hogy megértsük az összetett

kórélettani mechanizmusokat, kulcsmediátorokat azonosítsunk, és új terápiás

célpontokat találjunk [153].

A kapszaicin-érzékeny idegrostok [18,154] az emésztőcsatornát is sűrűn beidegzik

[155,156]. Itt is peptid transzmitterek, pl. P-anyag, NKA, CGRP szabadul fel ezekből a

rostokból a TRPV1 aktiválás hatására [157]. A TRPV1-et kifejező, extrinsic (külső úton

beidegző) szenzoros neuronok szerepet játszanak a bélgyulladásban, azonban ennek

iránya ellentmondásos az IBD patogenezisében [158–165]. Az emésztőtraktusban a

57

TRPA1 különböző rendszerekben fordul elő: extrinsic elsődleges afferens neuronok,

intrinsic enterikus neuronok, ill. a nyálkahártya endokrin és epithelsejtjei [34,155,156].

A TRPA1 a béllumeben környezeti kemoszenzorként működik, és gasztrointesztinális

funkciókat modulál: fájdalomérzékelés, gyomortónus, a fűszeres ételek által kiváltott

telítettségérzés, motilitás és szekréció [34].

A TRPA1-aktiváció gyulladásos neuropeptidek felszabadulásához vezet (tachykininek:

P-anyag, NKA; CGRP) a szenzoros idegvégződésekből [166] és neurogén gyulladást

váltanak ki, amelyet vazodilatációt és plazma extravazációt követő ödéma, leukocita

aktiváció és migráció jellemez [17,18,167]. A trinitro-benzol-szulfonsav (TNBS) vagy

dextrán-nátrium-szulfát (DSS) vastagbélbe juttatása súlyos colitist vált ki, neurogén

komponenssel: CGRP és P-anyag szabadul fel az extrinsic szenzoros neuronokból [168–

170]. A CGRP szerepe protektívnek bizonyult vastagbélgyulladásban [168,169].

Irodalmi adatok szerint a P-anyag colitist kiváltó és fenntartó szerepű a DSS modellben,

valamint colitis ulcerosában szenvedő betegekben [168,171,172]. A P-anyag NK1

receptora upregulálódott a vastagbélben rágcsálókban kiváltott colitisben és IBD-ben

szenvedő emberekben [170,173,174]. Kutatócsoportunk kimutatta korábban, hogy az

NK1 receptor farmakológiai gátlása és a receptorgén hiánya egyaránt enyhítette az

egérben kiváltott vastagbélgyulladást [173].

A TRPA1 aktiváció P-anyag felszabadulást idéz elő, ugyanakkor a receptor IBD-ben

betöltött szerepe össszetett [175]. A TRPA1 irodalma colitis egérmodellben

ellentmondásos, egyaránt leírták gyulladáskeltő, gyulladáscsökkentő vagy hatás nélküli

szerepét is [168,176–178]. Munkacsoportunk kimutatta a 90-es években, hogy a

szenzoros TRPA1 aktivációja gyulladáscsökkentő peptidek, pl. szomatosztatin

felszabadulásához vezet, amely egy ellenregulációs „szenzokrin” hatást vált ki

[179,180]. A téma összetettségéhez hozzájárul, hogy a nem-neuronális TRPA1

csatornák élettani szerepét még nem ismerjük [13].

58

2. Célkitűzések

A jelen vizsgálat céljai a következők voltak:

1. A lokális neuronális és nem-neuronális TRPA1 mRNS és fehérjeexpresszió vizsgálata

a TRPV1-gyel összehasonlításban az ép és gyulladt egér disztális vastagbélben, továbbá

IBD-s betegek biopsziás mintáiban.

2. A TRPA1 szerepének vizsgálata receptor génhiányos egerekben DSS-sel kiváltott

vastagbélgyulladásban és a receptor által mediált citokin, neuropeptid és neuropeptid

receptor változások elemzése. A DSS által kiváltott egér colitis összevetése a humán

adatokkal , eredményeink transzlációs relevanciájának kiderítése érdekében.


Kísérleti állatok

A 10 napos DSS kezelést hím, Trpa1 génhiányos (knock-out, KO) egereken [181]

hajtottuk végre, amelyek 8-10 generációra visszakeresztezésre kerültek C57BL/6

egerekkel, valamint azok vad típusú (wildtype, WT) megfelelőin. Az eredeti

heterozigóta (Trpa1+/-) tenyészpárokat Pierangelo Geppetti (Firenzei Egyetem)

bocsájtotta rendelkezésünkre. A Trpa1 WT és Trpa1 KO vonalakat külön tenyésztettük

tovább a PTE ÁOK Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetének Állatházában, 24–25

˚C-on, standard egértáppal és víz ad libitum fogyasztásával, 12 órás sötét ciklus alatt. A

kísérleti egerek 8-10 hetesek és 22-25 g közötti tömegűek voltak. Az eredeti Trpa1+/-

egerek utódjainak tenyészete, továbbá a kísérletek során használt egerek

genotipizálása PCR módszerrel történt [182].

59

Klinikai minták

A vastagbél biopsziás mintavétel a PTE Klinikai Központ I.sz. Belgyógyászati Klinikán

három betegcsoportból történt: 1. nem gyulladásos bélbetegség vagy szűrővizsgálatra

érkezett egyén (n=5); 2. vastagbél tumor (polypus coli, adenocarcinoma, n=8); 3. colitis

ulcerosa vagy Crohn betegség (n=10). A mintákat RNALater (Sigma-Aldrich Ltd,

Budapest) folyadékban tároltuk -80˚C-on a qPCR vizsgálatokhoz. Az immunhisztokémiai

mintákat formaldehidben tároltuk.

Egér DSS colitis modell

Krónikus vastagbélgyulladást (colitis) váltottunk ki WT és Trpa1 KO hím egerek

ivóvízébe 10 napon keresztül adagolt 2% dextrán-szulfáttal (DSS, MP Biochemical) (34.

ábra, 60. old.). A vad és KO állatokat véletlenszerűen osztottuk be egy csapvizet ivó

kontrollcsoportra (1-1 kontrollcsoport/genotípus, n=5/csoport) és DSS-t kapó

csoportokra (n=9 WT és n=9 KO). 3-3 vad és génhiányos egeret választottunk ki

véletlenszerűen a DSS-kezelés 3., 7. és 10. napján, amelyet előző éjjeli ételmegvonás

után, ketamin-xilazin mélyaltatásban (100 mg/kg ketamin i.p.; Richter Gedeon NyRt, 5

mg/kg xilazin i.p.; Eurovet Animal Health BV, Hollandia) leöltünk. A vastagbél disztális

harmadát kimetszettük a további vizsgálatok céljára [158,173].

60

34. ábra

Kísérleti elrendezés. PFA: paraformaldehid.

Betegségaktivitási Index meghatározása

A colitis klinikai tünetei (testtömeg-változás, székletkonzisztencia, széklet vértartalma)

a kezelés 1-10. napján pontozásra került. A széklet vértartalmát Hemocare teszttel

(Care Diagnostica, Ausztria) határoztuk meg. A 3 paraméter pontszámait átlagoltuk az

egyes egerek esetében, amellyel megkaptuk a Betegségaktivitási Indexet (Disease

Activity Index, DAI) [173] (1. táblázat, 61. old.).

61

Pont 0 1 2 3 4

Testtömeg-

csökkenés

0-0.9% 1-5% 5.1-10% 10.1-20% >20.1%

Széklet

vértartalma

(Hemocare test)

negatív világoskék

festődés

kék festődés véres

foltok/kék

festődés

teljesen

véres

Széklet

konzisztencia

normális normális/puha puha puha/vizes vizes

1. táblázat

Betegségaktivitási index számítási módja.

Szövettani elemzés

A disztális vastagbél-mintákat 40 mg/ml pufferelt formaldehidben fixáltuk,

metszeteket készítettünk (5 µm), majd hematoxilin-eozin festést végeztünk. Digitális

mikrofotókat készítettünk Olympus BX51 mikroszkóp és Olympus DP50 fényképezőgép

segítségével. A gyulladásos elváltozásokat patológus szakértő értékelte és pontozta

[173], aki nem vett részt a kísérletben (2. táblázat, 62. old.).

62

Pont 0 1 2 3 4

Gyulladás

súlyossága normális enyhe közepes súlyos -

Bélkripták

károsodása ép

egyharmad

arány

kétharmad

arány

kripták

eltűntek

mucosa

eltűnt

Gyulladás

kiterjedése

nem

gyulladt csak mucosa submucosa teljes bélfal -

Károsodott

terület aránya 0% 1-25% 26-50% 51-75% 76-100%

2. táblázat

A szövettani pontozás szempontjai.

Immunhisztokémia

Az immunhisztokémiai jelölést paraffinba ágyazott metszeteken végeztük. A

deparaffinizált és rehidrált szöveti mintákat pH 6-on citrát pufferben inkubáltuk

mikrohullámú sütőben, 3x5 percig, 750 W-on, antigénfeltárás céljából. A szövetek

endogén peroxidáz aktivitását 20 perces 3%-os hidrogén-peroxidban (H2O2) való

inkubációval gátoltuk. A másodlagos antitest nem specifikus kötődését

megakadályozandó a mintákat normál kecske szérumban inkubáltuk 20 percig. Ezután

a metszeteket poliklonális elsődleges antitesttel inkubáltuk 1 órán át: egér anti-CD68

(KP1) antitest: ab125212 (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) 1:300 hígításban;

egér és humán TRPA1 antitest: ab68847 1:300 hígításban, a specificitását teszteltük az

immunizáló peptiddel történő preadszorpcióval (ab150297, 1:100 hígításban, Abcam,

Cambridge, Egyesült Királyság); egér TRPV1 antitest ab74813 1:300 hígításban, a

specificitását teszteltük az immunizáló peptiddel történő preadszorpcióval (ab190844

1:100 hígításban, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság; humán TRPV1 antitest:

GP14100 1:100 hígításban, a specificitását teszteltük az immunizáló peptiddel történő

preadszorpcióval (P14100 1:10 hígításban, Neuromics, Edina, USA).

63

Ezek után másodlagos torma-peroxidázzal konjugált EnVision system megfelelő anti-

nyúl vagy anti-tengerimalac másodlagos antitesttel (Dako-Cytomation) 30 percig. Végül

a TRPV1 receptorok immunlokalizációját diamino-benzidinnel (DAB) hívtuk elő 10

percig, magfestést hematoxilinnal végeztünk.

Kvantitatív PCR

Az RNA Later folyadékban (Sigma-Aldrich Kft.) -80°C-on tárolt mintákat 1 ml TRI

reagensben (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk.

Totál RNS-t izoláltunk a gyártó utasításainak megfeleően, a vizes fázis kinyeréséig. A

szövetmintákat 1 ml TRI Reagensben homogenizáltuk, majd 200 µl bróm-klór-propánt

(BCP, Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) adtunk hozzá. A következő

lépésben kapott vizes fázisból RNS-t izoláltunk a Direct-zol RNA MiniPrep kit (Zymo

Research, Irvine, CA, USA) segítségével, a gyártó leírásának megfelelően. 400 µl vizes

fázishoz 400 µl abszolút etanolt adtunk, az elegyet az oszlopra mértük, majd mosási

lépések után 50 µl RNáz mentes vízben eluáltuk. A kinyert RNS mennyiségét és

tisztaságát Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer V3.5 (NanoDrop Technologies, Inc.,

Wilmington, DE, USA) segítségével állapítottuk meg. 1 µg total RNS reverz

transzkripcióját végeztük Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher

Scientific, Waltham, MA, USA) segítségével, oligo dT-vel, 20 μl térfogatban, a gyártó

utasításainak megfelelően. Az így kapott cDNS mintákat MX3000P qPCR system

(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) és Maxima Master Mix (SYBR Green vagy

próba detektáláshoz, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). A PCR ciklusok

paramétereit a master mix gyártójának utasításai alapján állítottuk be (kétlépéses PCR

program: 95°C 10 perc; 95°C 15s, 60°C 1 perc, 40 ciklus). Az alkalmazott assay-ket a 2.

függelék tartalmazza. Referenciagénként a béta-glükuronidáz (GUSB) és a GAPDH

szolgáltak, az Cq értékeik mértani közepét vettük. A primerek hatékonyságát

meghatároztuk, értékeik a 95-105% tartományba estek. A cDNS mintákat

duplikátumban mértük le, a minták Cq értékei átlagát vettük figyelembe a technikai

variabilitás csökkentése érdekében, a grafikonok a biológiai variabilitást ábrázolják. A

relatív génexpressziót a 2-ΔΔCt módszerrel számítottuk ki.

64

Luminex RNS assay

QuantiGene 2.0 Plex Assay (Plex Set 21491 MOUSE 8 plex Magnetic Beads; kat. szám:

321491; Affymetrix Inc./Panomics, USA) segítségével kvantifikáltuk 1 referenciagén

(beta-aktin) és 7 célgén mRNS szintjét (3. függelék) az egér disztális vastagbél

mintákból izolált totál RNS-ből (az RNS izolálás leírását lásd a Kvantitatív PCR-nál), a

gyártó instrukcióinak megfelelően. A befogó próbákat tartalmazó Luminex gyöngyöket

inkubáltuk overnight 20 μl RNS mintával (0,5 µg/µl) és a génspecifikus próbákkal.

Minden mintát duplikátumban mértünk le. A 2. napon hajtottuk végre a

jelamplifikálást: a mintákat inkubáltuk a pre-amplifikáló, amplifikáló, majd a jelölő

próbákkal. A detektálást streptavidin phycoerythrin (SAPE) hozzáadásával, majd a jel

leolvasásával végeztük el Magpix készülék (Luminex Corp., USA) segítségével. Az mRNS

expresszióváltozást a béta-aktin referenciagénhez normalizáltuk és a gyártó

utasításainak megfelelően számoltuk ki.

Luminex Multiplex Immunassay

A kimetszett és -80°C-on tárolt egér disztális vastagbél szövetmintákat a mérés

megkezdése előtt kiolvasztottuk, lemértük a tömegüket, és azonnal proteáz inhibitort

(10 mg/ml fenil-metil-szulfonil-fluorid: PMSF) tartalmazó PBS oldatba helyeztük, majd

homogenizáltuk. Ezután Triton X-100-at adtunk a mintákhoz (10 mg/ml

végkoncentráció) és centrifugáltuk (10000g, 5 perc) a sejttörmelék eltávolításához. A

Luminex Multiplex Immunoassay végrehajtása a korábban leírtaknak megfelelően

történt [183]. Az alábbi citokineket/kemokineket határoztuk meg (Milliplex Map Kit,

egyedi rendelésre összeállított, Millipore), amelyeket munkacsoportunk korábbi

mérései alapján [44] választottunk ki: 1. interleukin-1β (IL-1β); 2. monocita

chemotaktikus protein-1 (MCP-1, más néven chemokine /C-C motif/ ligand 2: CLC2); 3.

monokine induced by gamma interferon (MIG, más néven chemokine, C-X-C motif

ligand 9: CXCL9); 4. regulated on activation, normal T cell expressed and secreted

(RANTES, más néven chemokine /C-C motif/ ligand 5: CCL5). A mérést a gyártó

utasításainak megfelelően végeztük el. Előzetes optimalizálást követően a mintákat

hígítás nélkül, vakon mértük le. Luminex100 készüléket használtunk és Luminex 100 IS

65

szoftverrel analizáltuk a gyöngyök medián fluoreszcens intenzitásértékeit. A mintákat

RPMI-1640 (GIBCO) oldatban (1% protease inhibitor keveréket tartalmazott)

homogenizáltuk, a mintákat 20 mg/ml koncentrációban mértük le, duplikátumban.

Minden minta, kontroll vagy standard 25 µl-ét 96 lyukú lemezre (a kit része) mértük,

25 µl antitesttel borított, fluoreszcens gyönggyel együtt. Biotinilált másodlagos

antitestet és streptavidin-PE-t adtunk a lemezre, a megfelelő inkubációs és mosási

lépések után. Az utolsó mosási lépés után 100 µl puffert adtunk minden egyes well-be.;

a lemezt a Luminex100 array reader készülékben inkubáltuk és olvastuk le, majd öt-PL

regressziós görbe segítségével ábrázoltuk a standard görbét. Az adatokat MasterPlex

szoftver segítségével elemeztük. A végeredményt pg/g nedves szövet formában adtuk

meg.

Statisztika

Az eredményeket átlag ± SEM formában fejeztük ki. Az állatok egy csoportban

egyszerre elemzett számának (n=3-5 állat/csoport) megfelelően nem paraméteres

statisztikai próbákat alkalmaztunk (Kruskal-Wallis és Mann-Whitney próba). A

Betegségaktivitási Index esetében, a két genotípus összehasonlításakor az egyszerre

elemzett nagyobb elemszám (n=14/genotípus) miatt, a normáleloszlás tesztelése után

(Kolmogorov-Smirnov próba) kétutas ANOVA-t és Bonferroni post hoc próbát

használtunk. A statisztikai számításokat GraphPad Prism 5.02 for Windows (GraphPad

Software, USA) szoftverrel végeztük. p<0,05 valószínűségi értékeket tekintettük

szignifikánsnak.

66

A B

A B

4. Eredmények

TRPA1 és TRPV1 génexpresszió

Egér DSS colitis

35. ábra

Trpa1 mRNS

expresszió 10

napos DSS

kezelés során

(A) qPCR és (B)

RNS assay

módszerrel.

Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; n=3-5/csoport.

A qPCR eredmények alapján a Trpa1 mRNS upregulálódott egerekben a DSS kezelés 7.

napján, a vizet ívó kontrollokhoz képest (35. ábra A). Az RNS assay adatai megerősítik

ezt az expressziós mintázatot (35. ábra B).

36. ábra

Trpv1 mRNS

expresszió 10 napos

DSS kezelés során

(A) qPCR és (B) RNS

assay módszerrel.

Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba; n=3-5/csoport.

A Trpv1 mRNS szintek WT egerekben qPCR (36. ábra A) és RNS assay (36. ábra B)

módszerrel sem mutattak statisztikailag szignifikáns változást a DSS kezelés hatására.

67

B A

Az RNS assay közvetlenül az mRNS-t detektálja, ellentétben a qPCR-ral. Utóbbi egy

további lépést (reverz transzkripció) is magában foglal, amely növeli a technikai

variabilitást. A két módszer egyező értékei validálják eredményeinket.

Klinikai minták

37. ábra

(A) TRPA1 és (B)

TRPV1 mRNS

expresszió aktív (+)

és inaktív (-) fázisú

IBD-ből származó

vastagbél

szövetmintákban, a gyulladás nélküli kontroll, illetve tumormintákhoz viszonyítva.

Átlag ± SEM. Kruskal-Wallis és Dunn post hoc próba: *p<0,05; n=5-8/csoport.

A TRPA1 mRNS szintje szignifikánsan megnőtt az aktív státuszú IBD-betegekben, míg az

inaktív állapotúakban nem (37. ábra A). A TRPV1 mRNS szignifikánsan csökkent az aktív

IBD betegekben a gyulladás nélküli csoporthoz képest (37. ábra B). Az

összehasonlításként használt tumoros vastagbél biopsziás mintákban kimutatható a

lokális TRPV1 és TRPA1 génexpresszió, de egyik sem mutat szignifikáns különbséget a

nem gyulladt kontrollokhoz képest (37. ábra).

68

TRPV1 és TRPA1 immunhisztokémiai lokalizáció

Egér DSS colitis

69

38. ábra

Reprezentatív szövettani felvételek (A) TRPA1 és (B) TRPV1 antitest jelöléssel. Intakt,

nem gyulladt disztális vastagbél, és 7 napig DSS-t ivó egerek gyulladt bélszövete. Belső

kép: KP1 (anti-CD68) antitesttel jelölt makrofágok. Csillag: vastagbél lumen. Nyílak: a:

gyenge immunpozitivitás a nyálkahártya epithelsejtjein; b: jelentős immunpozitivitás a

nyálkahártya idegrostjai és vérerei régiójában; c: plexus myentericus idegrostok; d:

plexus myentericus ganglionok; e: submucous plexus. g: infiltrálódó leukociták; h:

kifejezett immunpozitivitás a gyulladásos leukocitákon; i: intersticiális plazmasejtek a

submucosában.

Immunhisztokémiai bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy a TRPA1 receptor

immunpozitivitás megtalálható a nyálkahártya epithelsejtjein, a bélnyálkahártya

idegrostjai és vérerei környezetében, a myenterikus idegrostokon és ganglionokon a

vizet ivó, kontroll C57Bl/6 egerek disztális vastagbél metszetein (38. ábra A, 68. old.). A

DSS-kezelt egerek disztális vastagbél metszetei ezen felül TRPA1 immunfestődést

mutattak intersticiális makrofágokon és a plexius submucosus struktúráin. Az

infiltrálódó makrofágok jelenlétét megerősítettük a mucosában anti-CD68

immunjelöléssel. A TRPV1 receptort detektáltuk az enterikus ganglionokon, és gyenge

immunpozitivitás volt jelen az intakt, kontroll egerek disztális vastagbél metszeteiben

az epithelrétegben (38. ábra B, 68. old.). A DSS-kezelt állatok ezen felül TRPV1

immunjelölést mutatnak a plexus submucosában, a mucosa makrofágaiban, a

submucosa plazmasejtjeiben és jelentős immunfestődés volt jelen az epithelréteg

közeli fehérvérsejteken.

Humán disztális vastagbél

A kontrollként szolgáló, nem gyulladt vastagbél klinikai mintákban gyenge TRPA1 (39.

ábra, 70. old.) és TRPV1 (40. ábra, 71. old.) immunpozitivitást találtunk a bélkripták

epitheliumában. IBD betegekben TRPA1-pozitív immunjelölés volt kimutatható a

bélkripták neuroendokrin sejtjein, Paneth sejteken, makrofágokon és intersticiális

plazmasejteken. A TRPV1 immunfestést szintén kimutattuk intersticiális

plazmasejteken és makrofágokon. A neuroendokrin sejtek egy részén gyenge,

sporadikus TRPV1 immunjelölést detektáltunk.

70

39. ábra

Reprezentatív

mikrofotók TRPA1 -

specifikus antitesttel

jelölt klinikai

szövetmintákról. (A)

nem gyulladt

szövetminta. Nyílhegy:

kripta epithelsejtek.

(B) Colitis ulcerosa. a:

neuroendokrin

sejteknek megfelelő

granulált mirigysejtek;

b: Paneth sejtek; c:

intersticiális

makrofágok.

(C) Crohn betegség. a:

neuroendokrin

sejteknek megfelelő

granulált mirigysejtek;

d: infiltrálódó

plazmasejtek és

makrofágok.

B

A

C

71

40. ábra

Reprezentatív

mikrofotók TRPV1-

specifikus antitesttel

jelölt klinikai

szövetmintákról. (A)

Nem gyulladt

kontrollminta.

Nyílhegy: kripta

epithelsejtek;

(B) Colitis ulcerosa c:

intersticiális

makrofágok.

(C) Crohn betegség. d:

infiltrálódó

plazmasejtek és

makrofágok.

A

B

C

72

A

B

Betegségaktivitási Index az egér DSS modellben

41. ábra

A. A betegségaktivitási index ábrázolása a DSS kezelés 10 napja folyamán Trpa1 WT és

KO genotípusú egerekben. Kétutas ANOVA genotípus faktor: ***p<0,0001; Bonferroni

post hoc próba: 8. nap **p<0,01; 9. nap *p<0,05. B. Az „A” grafikon görbe alatti

területeinek összehasonlítása a 10 napig DSS-t ivó állatok csoportjában. Mann-Whitney

próba *p<0,05.

73

A Betegségaktivitási Index (Disease Activity Index, DAI) szignifikánsan nagyobb volt a

TRPA1 receptor hiányában a 10 napos kísérlet során (kétutas ANOVA genotípus faktor,

görbe alatti terület), ill. a KO állatokban a WT genotípusúakhoz képest a 8. és 9. napon

(41. ábra, 72. old.).

Szövettani pontozás az egér DSS modellben

42. ábra

Hematoxilin-eozin festés intakt és 10 napig DSS-t ivó, vad genotípusú és Trpa1 K.O.

egerek disztális vastagbél mintáiból készült szövetmetszeteken. a: intakt bélkripta; b:

károsodott bélkripta; c: neutrofil infiltráció a mucosában; neutrofil infiltráció a

submucosában. Nagyítás: 100x; belső képek: 400x.

74

2% DSS kezelés gyulladást és szöveti károsodást okozott a szövettani (hematoxilin-

eozinnal festett) metszetek alapján, az intakt állatok ép kriptákat és nyálkahártya

epithelréteget tartalmazó szövettani felvételeihez képest (42. ábra, 73. old.). A

mucosában és a submucosában fokozott neutrofil infiltráció, a bélkripták elvesztése,

továbbá a nyálkahártya szerkezetének dezintegrációja volt megfigyelhető mindkét

genotípusban. A súlyossága és kiterjedtsége ezen patológiai elváltozásoknak

szignifikánsan nagyobb volt a TRPA1 receptor hiányában a 10. napon a WT egerekhez

képest (43. ábra).

43. ábra

A szövettani pontozás eredménye intakt és DSS-kezelt, WT és Trpa1 KO egerek disztális

vastagbél szövetmintáiból készült, hematoxilin-eozinnal festett metszetein. Kétutas

ANOVA és Bonferroni post hoc próba **p<0,01 WT vs. KO a 10. napon.

Citokin mRNS expresszió egér DSS modellben

A TNF-α, BLC, M-CSF és IL-1 receptor antagonista citokinek/kemokinek

transzkriptumait kimutattuk az ép és gyulladt vastagbélmintákban (44. ábra, 75. old.).

A TNF-α (Tnf) génexpresszió upregulálódott a 3. napon mindkét genotípusban a nem

gyulladt kontrollhoz képest. A KO állatokban magasabb volt a TNF-α expresszió a vad

75

típusúakhoz képest. A BLC (Cxcl13) mRNS szintje szignifikánsan megnőtt a DSS kezelés

10. napján a KO egerekben, mind az azonos napon leölt vad állatokhoz, mind a

kezeletlen kontroll egerekhez képest. Az M-csf génexpresszió mindkét genotípusban

csökkent a 10. napon, a vad és génhiányos egerek között nem volt különbség. Az IL-1rn

génexpresszió nem változott szignifikánsan a vizet ivó kontrollcsoporthoz képest.

44. ábra

Intakt és DSS-kezelt, Trpa1 WT és KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiban (A)

TNF-α, (B) BLC, (C) M-CSF, (D) IL-1rn citokin mRNS expresszió változása. Átlag ± SEM.

Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; #p<0,05 WT vs. KO. n=3-5/csoport.

Citokin fehérjeexpresszió egér DSS modellben

A Luminex multiplex mikrogyöngy array módszer segítségével (45. ábra, 76. old.) az

egér disztális vastagbélmintákban detektált 4 citokin/kemokin közül az IL-1β protein

szignifikánsan kisebb mennyiségben volt jelen a vizet ivó kontroll KO állatokban, a

megfelelő vad típusú csoporthoz képest (45. ábra A).

A

C

B

D

76

45. ábra

Luminex multiplex mikrogyöngy array módszerrel detektált gyulladásos

citokin/kemokin (A: IL-1β, B: MCP-1, C: RANTES, D: MIG) fehérjexpressziós mintázat

intakt és DSS-kezelt, vad és Trpa1 KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiban. Átlag

±SEM. Mann-Whitney próba *p<0,05, **p<0,01 vs. intakt kontroll; #p<0,05, ##p<0,01

WT vs. KO, n=3-5/csoport.

B

D

A

C

77

A DSS kezelés szignifikánsan megemelte a citokin szintjét mindkét genotípusban. A

kísérlet 3. és 7. napján szignifikánsan megnőtt az IL-1β szintje a KO állatokban, a

megfelelő intakt kontrollcsoporthoz képest. A 10. napon csökken a citokin expressziója

a KO egerekben a 7. naphoz képest, de még szignifikánsan magasabb marad a

megfelelő intakt kontrollhoz képest. A vad genotípusú állatokban az expressziója

csökken a 10. napra a vad intakt csoporthoz képest.

Az MCP-1 szintje szignifikánsan megnőtt a DSS-kezelt KO csoportban a 7. és 10. napon

mind a vizet ivó KO kontrollokhoz, mind a 10. napon a vad típusúakhoz képest (45.

ábra B). A RANTES koncentrációja szignifikánsan csökkent a DSS fogyasztás hatására a

10. napra mindkét genotípusban a megfelelő intakt kontrollokhoz képest (45. ábra C).

A vad és KO egerek mintáiban nem különbözött a RANTES szintje. A MIG expresszió

szignifikánsan megemelkedett a KO egerekben a 7. napon mind a vizet fogyasztó,

intakt KO, mind az azonos napi WT állatokhoz képest (45. ábra D).

Receptor és neuropeptid génexpresszió a gyulladt vastagbélben

46. ábra

qPCR módszerrel detektált Trpv1

génexpressziós profil intakt és DSS

kezelt, vad és Trpa1 KO egerek

disztális vastagbél szövetmintáiban.

Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba,

*p<0,05 vs. intakt kontroll; n=3-

5/csoport.

A Trpv1 mRNS expresszióját nem változtatta meg szignifikánsan a DSS kezelés a vad

genotípusú egerekben (46. ábra). A KO állatokban ugyanakkor szignifikánsan

csökkentette a DSS fogyasztás a Trpv1 génexpressziót a 10. napon.

78

47. ábra

qPCR és Luminex multiplex mikrogyöngy array módszerekkel detektált neuropeptid és

neuropeptid receptor génexpressziós profil intakt és DSS-kezelt, vad és Trpa1 KO egerek

disztális vastagbél szövetmintáiban. (A) Vip, (B) PACAP (Adcyap), (C) PAC1R

(Adcyap1r1), (D) VPAC1 (Vipr1), (E) VPAC2 (Vipr2), (F) Szomatosztatin, (G) Sstr1, (H)

Sstr4. Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; #p<0,05, WT vs.

KO, n=3-5/csoport.

C

A B

D E

H G F

79

A szomatosztatin, PACAP és VIP neuropeptidek, valamint receptoraik (SSTR1, SSTR4,

PAC1, VPAC1, VPAC2) mRNS szinten kimutathatóak mind a nem gyulladt, mind a

gyulladt disztális vastagbélben (47. ábra, 79. old.). A vizet ivó intakt állatokban nincs

különbség a neuropeptid és receptor génexpressziós profilban a vad és Trpa1 KO

állatok között. A Vip génexpresszió szignifikánsan megnőtt mindkét genotípusban a

DSS kezelés hatására a saját intakt kontrollcsoportjaikhoz képest, de a 10. napon

jelentősen megnőtt a KO egerekben a WT egerekhez képest is (47. ábra A, 79. old.).

DSS kezelés hatására a PACAP (Adcyap1) mRNS szignifikánsan megnőtt a KO, de nem a

vad egerekben, a megfelelő intakt kontrollcsoportokhoz viszonyítva (47. ábra B, 79.

old.). A 10. napon a PACAP (Adcyap1) mRNS szintje szignifikánsan nagyobb volt a Trpa1

KO egerekben a vad típusúakhoz viszonyítva.

A PAC1 (Adcyap1r1), a VPAC1 (Vipr1) és a VPAC2 (Vipr2) transzkriptumai

kimutathatóak a vizet ivó és DSS-kezelt vad és KO állatokban (47. ábra C, D, E, 79. old.).

A VPAC1 (Vipr1) receptor expressziója szignifikánsan csökkent a KO csoportban a 10.

napon az intakt kontrollokhoz képest (47. ábra D, 79. old.). A PAC1 és VPAC2 szintjét

nem befolyásolta szignifikánsan a genotípus vagy a DSS kezelés (47. ábra C, E, 79. old.).

A lokális, leukocita eredetű szomatosztatin génexpresszió nem változott szignifikánsan

egyik genotípusban sem a DSS fogyasztás hatására, és a genotípusok között sem volt

különbség (47. ábra F, 79. old). Hasonlóan, a SSTR1 és a SSTR4 receptorok mRNS

expresszióját sem befolyásolta a DSS adása vagy a TRPA1 hiánya (47. ábra G, H, 79.

old.).

A P-anyagot és a NKA-t kódoló Tac1 gén, a NKB-t kódoló Tac3 gén és az NK1 receptort

kódoló Tacr1 gén expressziója kimutatható a nem gyulladt és a DSS-kezelt disztális

vastagbélben egyaránt (48. ábra, 81. old). A Tac1 és Tacr1, de nem a Tac3 mRNS

szignifikánsan kisebb a vizet kapó, intakt KO állatokban, a WT egerekhez képest. DSS

adás hatására, a Tac1 mRNS megemelkedett mindkét genotípusban. A 10. napon a

Tac1 génexpresszió szignifikánsan nagyobb volt a KO állatokban a vad típusúakhoz

képest. A Tac3 mRNS upregulálódott a KO egerekben a 10. napon mind az intakt KO,

mind a megfelelő WT egerekhez képest. A Tacr1 mRNS szignifikánsan megnőtt a DSS

kezelés hatására a 3., 7. és 10. napokon a KO állatokban.

80

A

B

48. ábra

Tachykinin és tachykinin receptor

génexpressziós profil intakt és DSS kezelt,

vad és Trpa1 KO egerek disztális

vastagbél szövetmintáiban. Átlag ± SEM.

Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt

kontroll; #p<0,05, ##p<0,01 WT vs. KO,

n=3-5/csoport. (A) Tac1 mRNS; (B) Tac3

mRNS; (C) NK1 (Tacr1) mRNS.

C

81


TRPA1 és TRPV1 immunfestődést és génkifejeződést mutattunk ki egér és humán

vastagbélben. Gyulladás hatására a TRPA1, de nem a TRPV1 mRNS szignifikánsan

megemelkedett. A TRPA1 receptor protektív szerepét egyértelműen demonstráltuk

DSS colitis modellben a betegség aktivitási index és a szövettani pontozás alapján,

amelyeket a TRPA1 által mediált gyulladásos citokin és neuropeptid csökkenés is

alátámaszt.

A TRPA1 szerepe a viscerális fájdalom közvetítésében bizonyított [155,156,178,184–

187]. TRPA1 antagonisták klinikai vizsgálatok alatt állnak gyulladásos, neuropáthiás és

viszcerális fájdalom kezelésére [188]. Az IBD patogenezisében betöltött szerepére

ugyanakkor ellentmondó adatok állnak rendelkezésre: leírták a TRPA1 gyulladáskeltő

és gyulladásgátló hatást közvetítő szerepeit, valamint ezek hiányát is [168,177,178]. Az

általunk vizsgált, vizet ivó kontroll, vad genotípusú egerek vastagbélmintáiban

gyulladáskeltő mediátorok (P-anyag, NKA és NKB mRNS, IL-1β fehérje) szignifikánsan

nagyobb alapszintjét mértük a TRPA1 receptorgén-hiányos egerekhez képest. Ezt azzal

magyarázhatjuk, hogy a Trpa1 gén hiánya csökkenti a bél mikroflórájának és

metabolitjainak aktiváló/szenzitizáló hatását. Ez a TRPA1 folytonos, „tónikus”

aktiválására utal, amelynek a homeosztázis fenntartásában lehet szerepe. Mindez

megfelel az irodalomban leírt, P-anyag felszabadítással mediált gyulladáskeltő

szerepének [168,169]. Ezzel ellentétben adataink alapján azt gondoljuk, hogy

gyulladásos körülmények között a vastagbélben a TRPA1 szerepe eltolódik a

gyulladásgátlás irányába. Ismert, hogy a TRPA1 gyulladáscsökkentő szomatosztatin

felszabadulását mediálja [180], amely anti-inflammatorikus lehet gyulladásos

bélbetegségben is. A TRPA1-et expresszáló szenzoros rostok stimulációjakor

felszabaduló CGRP hiányában kiváltott kísérletes colitis súlyosabb [168,169].

Munkacsoportunk kimutatta, hogy a szenzoros TRPA1 specifikus aktiválása H2S-dal

CGRP felszabadulással jár, amely vazodilatációt okoz [189], valamint a H2S, részben a

TRPA1 aktiválásán keresztül, protektív lehet DSS colitisben [190].

A TRPA1 által közvetített gyulladásgátló szerep mechanizmusát illetően a DSS által

kiváltott egér colitisben, az NK1 receptor csökkent expresszióját mutattuk ki vad

genotípusú egerekben, a TRPA1 hiányos egerekhez képest. Az NK1 receptor (Tac1r)

82

mRNS szintjének növekedését írták le a TRPA1 agonista mustárolajjal (MO) kiváltott

colitisben [170], azonban TRPA1 hiányos egerekben nem vizsgálták a mustárolaj

hatását.

A TRPA1 védőhatást fejtjhet ki a gyulladáskeltő, IBD-ben is szerepet játszó P-anyag,

NKA és NKB [168,171,172,191–195] expressziójának csökkentésével. A TRPA1 jelenléte

csökkenti a PACAP és a VIP szintézisét a gyulladt vastagbélben, míg a PACAP/VIP

receptorok szintje nem változik szignifikánsan. Közelmúltbeli adatok a VIP

gyulladáskeltő szerepére utalnak DSS-colitisben, ugyanakkor más források heterogén

képet mutatnak a VIP kísérletesen kiváltott colitisben és humán IBD-ben való

expressziójáról és szerepéről [97,196–201]. A vastagbélben detektált VIP (Vip) és

PACAP (Adcyap1) mRNS-nek számos forrása van (enterikus neuronok, leukociták),

továbbá ezen peptidek többféle PACAP/VIP receptortípuson és variánson hatnak,

amelyek sejttípustól függően eltérő jelátviteli útvonalakhoz kapcsolódhatnak (10. ábra,

18. old.) [78,196]. Ezért további vizsgálatok tárgya lehet, hogy az általunk mért

szignifikáns PACAP és VIP szintézis emelkedés milyen szerepet játszik a vastagbél

gyulladásos folyamataiban.

Munkacsoportunk korábban nagyszámú citokin/kemokin (panel alapú) vizsgálatát

végezte el [173], amely alapján 8 mediátort választottunk ki a vastagbélgyulladás

jellemzésére kísérletünkben. Közülük három kifejeződésében nem találtunk

különbséget a WT és Trpa1 KO egerek között, így nem feltételezzük, hogy a TRPA1

mediálja a keletkezésüket:

RANTES és M-CSF: szintézisük szignifikánsan csökkent a DSS-kezelés 10. napjára,

mindkét genotípusban. A RANTES (CCL5) elsősorban T-limfociták által termelt, míg az

M-CSF-et leukociták széleskörűen expresszálhatják, utóbbi szerepe a monociták

aktiválása [202].

IL-RN: az anti-inflammatorikus, leukociták és epithelsejtek által is termelt interleukin-1

receptor antagonista citokin a DSS kezelés hatására emelkedő majd csökkenő

tendenciát mutatott mindkét egértörzsben [202].

További öt citokin genotípus szerint differenciáltan expresszálódott, a TRPA1 jelenléte

csökkentette szintézisüket:

83

TNF-α: korai gyulladásos citokin, amelyet leukociták termelnek. Diszregulációja

szerepet játszik IBD-ben; az anti-TNF-α terápia alkalmazása elterjedt [203,204].

Kimutatták, hogy DSS colitis modellben a korai immunválaszban játszik szerepet.

[152,205,206] A Th1/Th17 sejtek által mediált, magas TNF-α szinttel járó akut

gyulladást egy túlnyomórészt Th2 sejtek által dominált krónikus gyulladásos válasz

váltja fel, amely alacsonyabb TNF-α szinttel jár. Érdemes megemlíteni, hogy a TNF-α

fehérje mennyisége késéssel követheti a kísérlet 10. napján mért kisebb mRNS szintet,

azaz a géntermék még jelen lehet nagyobb mennyiségben. Eredményeink alapján a

TRPA1 receptor aktiválása csökkentheti a TNF-α szintézisét, amely hozzájárulhat a

receptor gyulladásgátló funkcióhoz.

MIG és MCP-1: a két leukocita attraktáns kemokin szintjét is szignifikánsan

csökkentette a TRPA1 aktiváció a gyulladásgátló hatásainak részeként.

IL-1β: gyulladáskeltő citokin, amelyet a veleszületett immunrendszer setjei (pl.

gyulladáskeltő M1 típusú makrofágok) mellett az enterikus neuronok is termelnek

[207]. Az IBD lefolyását súlyosbító szerepe jól ismert [208]. TRPA1 jelenlétében

szignifikánsan csökkent a szintje.

BLC (CXCL13): a szerepét kimutatták az IBD-ben keletkező aberráns limfoid szövet

kialakulásában [209], szintje csak a TRPA1 receptor hiányában emelkedett meg a DSS

kísérlet 10. napján.

Citokineket/kemokineket immunrendszer és más eredetű sejtek (epithelsejtek,

enterikus neuronok) is termelhetnek, így kifejeződésüket nem tudjuk minden kétséget

kizáróan sejttípushoz rendelni adataink alapján. Érdemes kiemelni, hogy a TRPA1

receptor jelenléte csökkentette a klasszikus úton aktivált, gyulladáskeltő M1 irányba

polarizált makrofágok által karakterisztikusan szekretált [202] IL-1β, MCP-1 (CCL2) és

TNF-α szintjét. Ugyanakkor a túlnyomórészt T-limfocita eredetű [202] RANTES

szintézisét nem mediálta a TRPA1 receptor.

Poole és mtsai [210] 2011-ben leírták a TRPA1 ioncsatorna jelenlétét és bizonyos

protektív hatásait az egér vastagbélben. Azt találták, hogy a neuronális TRPA1

aktiválása gátolja a spontán neurogén kontrakciókat és így a béltranzitot. A TRPA1

84

ilyen módon véd a gyulladásos mediátorok szenzitizáló/aktiváló hatásától. Az általunk

kimutatott és mások eredményeivel [170,211,212] korreláló TRPA1 génexpresszió

emelkedés egér és emberi vastagbél-mintákban az enterikus neuronok

receptorszintézisére utalhat. A TRPA1, TRPV1 receptorfehérjét kimutattuk a plexus

myentericusban és a plexus submucosusban. A Trpa1 mRNS upregulációja a DSS

kezelés 7. napján, de még nem a 3. napon a génexpresszió szintjén késleltetett választ

jelezhet. Kimutatták, hogy stimuláció hatására a TRPA1 receptorfehérje az

intracelluláris raktárakból a neuronok plazmamembránjába szállítódik [213]. Mivel a

citoplazmában már jelenlévő TRPA1 fehérjemolekulák kerülnek a membránba, az aktív

ioncsatorrnák száma a transzkripció azonnali növekedése nélkül is emelkedhet. A 10.

napon tapasztalt emelkedés hiánya a Trpa1 mRNS-t szintetizáló struktúrák

károsodásával magyarázható. Érdemes figyelembe venni, hogy az mRNS szint

csökkenését késéssel követheti a fehérjeszint változása. A makrofágokon található

TRPA1 receptornak gyulladáscsökkentő szerepet is tulajdonítanak [176], lásd lentebb,

ezen sejtek infiltrációja is hozzájárulhat a megnőtt Trpa1 génexpresszióhoz. A

mintáinkban detektált lokális Trpa1 mRNS kevésbé valószínű, hogy az extrinsic

szenzoros neuronokból ered, ezért nem informatív a vastagbelet beidegző dorzális

ganglionokban szintetizált TRPA1 csatornák szerepét illetően.

A Trpv1 esetében nem tapasztaltunk szignifikáns mRNS upregulációt a DSS kezelt vad

típusú állatokban, hasonlóan a mustárolajjal kiváltott colitishez [170]. Érdekes módon a

Trpa1 KO állatokban a DSS által okozott nagyobb gyulladással párhuzamosan a lokális

Trpv1 mRNS szignifikánsan csökkent a 10. napra. Az IBD betegek esetében szintén

csökkent TRPV1 mRNS expressziót detektáltunk, míg mások colitis ulcerosa

betegekben nem mértek változást [214]. További vizsgálatok szükségesek annak

tisztázására, hogy az általunk mért TRP mRNS szintekért az egyes sejttípusok milyen

arányban felelősek, hiszen a szövetmintáinkban a különböző sejtek mRNS expresszió

változásai eredőjét mértük.

Az extrinsic szenzoros TRPV1 receptorok gyulladáskeltő és gyulladáscsökkentő

funkciókat egyaránt mediálnak, upregulációjukat detektálták IBD-ben [158–

165,184,215–217]. A receptorfehérje intraaxonálisan transzlokálódik a perifériára [73],

ugyanakkor van adat arra vonatkozóan, hogy a TRPV1 mRNS kimutatható perifériás

85

axonokban [218]. Korábbi eredményeink szerint a bőrben és szájnyálkahártyában az

extraneuronális TRPV1 expressziót nem befolyásolja a primér szenzoros afferensek

kémiai vagy sebészi denervációja [219]. Továbbá, a nem neuronális TRP mRNS szintek

jóval alacsonyabbak a neuronális sejtekénél [15,100]. E mögött azt feltételezhetjük,

hogy az akciós potenciál kiváltásához nagyobb receptorsűrűségre van szükség, mint a

nem neuronális sejtekben ellátott szerepekhez. Mindezek alapján úgy gondoljuk,

enterikus neuronok járulnak hozzá túlnyomórészt a mintáinkban mért TRP mRNS

expresszióhoz. Az intrinsic enterikus TRPV1 jelenlétére egyre több bizonyíték van, de a

bélben betöltött excitatórikus/szekréciós szerepeit még nem tárták fel

[160,168,191,220–226].

A gyulladás TRPA1 és TRPV1 pozitív fehérvérsejtek akkumulációját okozta, amelyek

közül nagyszámú sejtet makrofágként azonosítottunk anti-CD68 immunfestéssel a

nyálkahártyarétegben. Az infiltrálódó makrofágok szerepet játszanak az IBD

kiváltásában és fenntartásában [227]. Eredményeink alapján nagyobbrészt M1 típusú

gyulladásos makrofágok által jellemzően szekretált citokinek/kemokinek szintjét

csökkentette a TRPA1 receptor jelenléte. Ez lehet a szenzoros TRPA1 közvetítésével

felszabaduló, gyulladáscsökkentő szomatosztatin „szenzokrin” hatása közvetve vagy

közvetlenül a makrofágok szomatosztatin receptorain [228].

Ugyanakkor ismert in vitro irodalmi adat a makrofágok saját TRPA1 csatornái részleges

anti-inflammatorikus szerepére is, ennek funkcionális jelentőségét in vivo gyulladásos

folyamatokban még nem tárták fel [176]. A gyulladáscsökkentő szerep lehetőségét

alátámasztja továbbá, hogy leírták TRPA1 agonisták (kurkumin, szulforafán,

fahéjaldehid, hidroxi-fahéjaldehid, tiocianátok) és a TRPV1-aktiváló kapszaicin, ill. a

mindkét receptort izgató gingerol gyulladáscsökkentő hatását egér/patkány

makrofágokban, humán monocitákban/makrofágokban in vitro [229–236]. A TRPA1

agonisták anti-inflammatorikus hatása makrofágokban a gyulladáskeltő útvonalak

gátlásában (NF-κB, PKCα, indukálható nitrogén-monoxid szintáz: iNOS, reaktív oxigén

gyökök: ROS, leukotriének, prosztaglandinok, hidrolítikus enzimek, IL-1, IL-1β, IL-6,

miRNS-155) valamint az antioxidáns útvonalak aktiválásában (Nrf2 transzkripciós

faktor-hemoxigenáz-1; peroxinitrit elleni védelem) nyilvánult meg; a TNF-α szintézisére

ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre. Ezen közlemények egy része a TRPA1

86

ioncsatorna felfedezése, exogén ligandumainak feltérképezése előtt született vagy

pusztán nem vizsgálták a TRPA1 szerepét. Ezért tisztázásra vár, vajon a protektív

hatásokat valóban a TRPA1 receptor mediálja-e? Munkacsoportunk a közelmúltban

mustárolajjal (ill. kapszaicinnel) vad típusú és génhiányos egerek peritoneális

makrofágjain szelektíven kiváltott Ca2+-beáramlás detektálásával bizonyította a

funkcionális TRPA1 (ill. TRPV1) jelenlétét [237].

A nem gyulladt, kontrollként szolgált biopsziás mintákban gyenge TRPA1 és TRPV1

immunpozitivitást találtunk a bélkripták epitheliális sejtjeiben, hasonlóan az egér

vastagbélhez. Az IBD-betegek szövetmintáiban az intesztinális kripták neuroendokrin

sejtjei festődtek TRPA1 antitesttel. Az egérhez hasonlóan a humán disztális

vastagbélben található fehérvérsejtek TRPV1 és TRPA1 immunfestődést mutattak. IBD-

betegek vastagbél metszetein a Lieberkühn-féle kriptákban Paneth sejtek és granulált

neuroendokrin sejtek TRPA1 immunfestődést produkáltak. A sejteken lokalizálódó

TRPA1 receptorok szerepet játszhatnak a colitis modulálásában a szerotonin és

melatonin felszabadulás szabályozásával [238–240].

Mivel a TRPA1 receptort izgatják a táplálékban, különösen a fűszernövényekben

előforduló egyes elektrofil, irritáló, csípős vegyületek, feltehetjük a kérdést: megfelelő

étrenddel javítható-e a betegek állapota? Nilius és Appendino irodalmi

összefoglalójában (2013) részletesen áttekintette a TRP csatornák, a fűszerek és az

egészségi állapot kölcsönhatásait [241]. Ezek alapján elmondható: a fűszernövények

hatóanyagait komplex polifarmakológia jellemzi, azaz hatásukat egyszerre több

molekuláris célponton fejtik ki, ill. a bioaktív anyagok sajátságainak megfelelően

hatásuk egyszerre lehet előnyös és kedvezőtlen. A piperin (feketebors) és az allicin

(fokhagyma) például a TRPA1 mellett az IBD-ben pro-inflammatorikus szerepűnek

bizonyuló TRPV1-et is aktiválja [54,242]. A TRPA1-et izgató kurkuminnak (kurkuma)

100-nál több molekuláris célpontja létezik az emberi szervezetben [241,243]. A TRPA1

agonista allil-izotiocianát (mustár, retek, torma, wasabi) fogyasztása 10-25 mg/ttkg

koncentrációban enyhíti az egér DSS-colitis tüneteit [244], bár ebben a TRPA1 receptor

szerepe tisztázásra vár. Ugyanakkor a vastagbélbe adott 0,5% mustárolaj akut colitist

vált ki egérben [170]. Evolúciós perspektívából szemlélve nem tekinthető véletlennek,

hogy ezek az elektrofil, irritáns vegyületek fájdalmas ingert váltanak ki.

87

Epidemiológiai tanulmányok alapján negatívan korrelál az IBD előfordulásával, így

kismértékű védőhatást sugall a zöldségek fogyasztása [245,246]. A számos konyhakerti

növényt magába foglaló káposztafélék családja például gazdag TRPA1-izgató szerves

kénvegyületekben. Közülük a szulforafánnal történő előkezelés (25 mg/ttkg per os)

enyhíti a DSS-colitis tüneteit egérben [247], de itt a TRPA1 szerepét nem ismerjük. Az

epidemiológiai vizsgálatokban szintén előnyösnek mutatkozó olivaolajban a TRPA1

ligandum oleocanthal van jelen [248,249]. Adódik a kérdés, vajon a jótékony exogén

agonistákat „terápiás dózisban” tartalmazó táplálékmennyiség elfogyasztható-e

reálisan, főképpen hosszútávon és különös tekintettel a gyakran erős aromára?

Óvatosságra int az is, hogy célzott étrenddel eddig nem tudtak átütő javulást elérni

IBD-betegek állapotában a klinikai tapasztalatok alapján [250]. Tisztázásra vár, hogy az

exogén aktivátorok a szenzoros vagy a lokális (autonóm idegrendszer, epithel-,

neuroendokrin sejtek, leukociták) TRPA1 receptorokra hatnak. Figyelembe kell venni

továbbá a táplálékban található TRPA1 agonisták szisztémás hatását, a májban, ill. a

mikroflóra által a bélben keletkező metabolitjaikat, valamint az örökítőanyag egyéni

eltéréseit (nutrigenomika).

A TRPA1 csatorna lokalizációja a vastagbél különböző sejttípusain (extrinsic szenzoros

neuronok, enterikus /intrinsic/ neuronok, neuroendokrin sejtek, leukociták,

plazmasejtek), gyulladás hatására egérben és emberben hasonló upregulációja,

továbbá egy krónikus colitismodellben tapasztalt egyértelmű gyulladáscsökkentő

szerepe fontos protektív szerepre utal IBD-ben.

A TRPA1 anti-inflammatorikus szerepe mögött a lokális P-anyag, NKA, NKB és NK1

receptor, továbbá a feltehetően makrofág eredetű citokin/kemokinszintézis

csökkenése állhat adataink alapján. Továbbá mindezek hátterében feltételezhetjük a

szenzoros TRPA1 szomatosztatin és CGRP felszabadításával kifejtett

gyulladáscsökkentő szerepét.

Az egérből származó és a klinikai vastagbél minták egybevágó TRPA1 expressziós

mintázata állatkísérletes eredményeink transzlációs relevanciájára utal. A TRPA1

általunk bizonyított protektív szerepe a gyulladásos betegségek kutatásában

perspektívával kecsegtet (49. ábra, 88. old.).

88

49. ábra


89

VI. Új eredmények összefoglalása, következtetések

1. Az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicin-szenzitív neuronokra citotoxikus, nem

károsítja az extraneuronális TRPV1 receptorokat a patkány talpi, lábháti bőrben és

szájnyálkahártyában. A Ca2+-toxicitás hiánya nem-neuronális sejteken a kisebb TRPV1

receptorsűrűségre, eltérő sejtstruktúrára, az ioncsatorna eltérő érzékenységre utalhat.

Továbbra is szelektív farmakológiai eszközként tekinthetünk az RTX/kapszaicin-

deszenzitizációra, amellyel a szenzoros TRPV1 funkciók vizsgálhatók kísérletesen.

Eredményeink az sugallják, hogy az RTX/kapszaicin deszenzitizáción alapuló terápiák

nem károsítják extraneuronálisan a TRPV1-et, ill. az ioncsatornát kifejező sejteket.

2. a. Bizonyítékot szolgáltattunk a PACAP expressziójára és kapszaicin közvetítette

upregulációjára egér bőrben, mRNS és peptid szinten egyaránt. b. PACAP-hiányos

egerekkel kimutattuk továbbá a peptid funkcionális jelentőségét: a TRPV1 aktiváció

által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos mediátora. Ennek hátterében a

PACAP arteriola dilatációt és plazmafehérje extravazációt növelő hatása állhat.

3. a. Egér colitis és humán gyulladásos bélbetegségben számos neuronális és nem-

neuronális sejt expresszálja a TRPA1 receptort; b. a TRPA1 protektív DSS-colitis

egérmodellben; c. a receptor aktivációja csökkenti a lokális, gyulladáskeltő

tachykininek és számos citokin/kemokin szintjét. Mindebben fontos szerepet játszhat a

makrofágfunkciók gátlása, amelyben a sejteken lokalizálódó TRPA1 közvetlen funkciója

is lehetséges. A TRPA1-aktiváció hatására a szenzoros neuronokból felszabaduló

szomatosztatin és CGRP szerepe elképzelhető a protektív hatás közvetítésében

bélgyulladásban. A TRPA1 ígéretes célpont lehet a gyulladásos bélbetegségek

kutatásában.

Dolgozatom legfontosabb eredményeinek összefoglalásaként (50. ábra, 90. old.)

elmondható, hogy az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicin-szenzitív neuronokra

citotoxikus, a TRPV1 aktiváció által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos

mediátora a PACAP, valamint a TRPA1 protektív egér DSS-colitis modellben.

90

50. ábra

A dologozat legfontosabb új eredményeinek összefoglalása.

91

Függelék

1. függelék

A TRPA1 és TRPV1 specifikus antitestek szelektivitásának tesztelése. Részletesen lásd

Anyagok és módszerek, V. Fejezet.

92

Gén Accession Assay

Hu

má

n

GAPDH NM_001256799

NM_002046

(2) Hs02758991

GUSB NM_000181 (2) Hs00939627_m1

TRPV1 NM_018727

NM_080704

NM_080705

NM_080706

(2) Hs00218912_m1

TRPA1 NM_007332 (2) Hs00175798_m1

Eg

ér

Gapdh NM_008084 (1) Mm.PT.39a.1

Gusb NM_010368 (1) Mm.PT.39a.22214848

Trpv1 NM_001001445 (1) Mm.PT.56a.13426135

Trpa1 NM_177781 (2) Mm00625268_m1

Vip NM_011702 (1) Mm.PT.56a.32346790

Adcyap1

(PACAP)

NM_009625 (1) Mm.PT.56a.31241204

Sst NM_009215 (2) Mm00436671_m1

Cxcl13 (BLC) NM_018866 (1) Mm.PT.56.31389616

Il1rn (IL-1RA) NM_001039701 (1) Mm.PT.56.43781580

Tac1 NM_009311 (3) F 5′- AAATGTGCGCTATGAGGAATGA -3′

R 5′- GGAAACATGCTGCTAGGAATACAAA -3′

Tac3 NM_001199971 (3) F 5′-TCTGGAAGGATTGCTGAAAGTG-3′

R 5′-GTAGGGAAGGGAGCCAACAG-3′

Tacr1 (NK1) NM_009313 (3) F 5′-TGGACTCTGATCTCTTCCCCAACA-3′

R 5′-GGACCCAGATGACAAAGATGACCA-3′

Tnf NM_013693 (3) F 5′-CCCAGACCCTCACACTCAGAT-3′

R 5′-TTGTCCCTTGAAGAGAACCTG-3′

Csf1 NM_007778

NM_001113529

NM_001113530

(3) F 5′-GGCTTGGCTTGGGATGATT-3′

R 5′-AGGCGTGGAGGGGGAAAAC-3′

2. függelék

Az egér és humán vastagbél minták qPCR analíziséhez használt primerek és hidrolízis

próbák listája. (1): Integrated DNA Technologies, Inc. (Iowa, USA); (2): Life

Technologies (Kalifornia, USA); (3): [251,252]. GAPDH (gliceraldehid 3-foszfát

dehidrogenáz); GUSB (béta-glükuronidáz); TRPV1 (tranziens receptor potenciáll

vanilloid 1); TRPA1 (tranziens receptor potenciáll ankirin 1); Vip (vazoaktív intesztinális

polipeptid); Adycap1 (hipofízos adenilát cikláz aktiváló polipeptid, PACAP); Sst

(szomatosztatin); Cxcl13 (kemokin (C-X-C motívum) ligand 13 azaz B-limfocita

kemoattraktáns, BLC); Il1rn (interleukin-1 receptor antagonista, IL-1RA); Tac1

(tachykinin 1); Tac3 (tachykinin 3); Tacr1 (tachykinin 1 azaz neurokinin receptor 1); Tnf

(tumor nekrózis faktor α); Csf1 (macrophage colony stimulating factor 1, M-CSF).

93

Gén Teljes név Accession

Trpv1

transient receptor potential

cation channel, subfamily V,

member 1

NM_001001445

Trpa1

transient receptor potential

cation channel, subfamily A,

member 1

NM_177781

Actb actin-beta NM_007393

Adcyap1r1

adenylate cyclase activating

polypeptide 1 receptor 1

(PAC1)

NM_007407

Vipr1 vasoactive intestinal peptide

receptor 1 (VPAC1) NM_011703

Vipr2 vasoactive intestinal peptide

receptor 2 (VPAC2) NM_009511

Sstr1 somatostatin receptor 1 NM_009216

Sstr4 somatostatin receptor 4 NM_009219

3. függelék

A Quantigene 2.0 Plex RNA Assay módszer segítségével detektált egér gének.

94

Irodalomjegyzék

1. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J (1967) Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br J Pharmacol Chemother 31: 138–151.

2. Jancsó N (1960) Role of the nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions. Bull Millard Fill Hosp: 53–77.

3. Szolcsanyi J, Jancso-Gabor A (1975) Sensory effects of capsaicin congeners. Part II: Importance of chemical structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin-type compounds. Arzneimittelforschung 26: 33–37.

4. Caterina MJ, Schumacher M a, Tominaga M, Rosen T a, Levine JD, et al. (1997) The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389: 816–824.

5. Szolcsányi J, Sándor Z (2012) Multisteric TRPV1 nocisensor: a target for analgesics. Trends Pharmacol Sci 33: 646–655.

6. Kalia J, Swartz KJ (2013) Exploring structure-function relationships between TRP and Kv channels. Sci Rep 3: 1–9.

7. Lee JH, Lee Y, Ryu H, Kang DW, Lee J, et al. (2011) Structural insights into transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1) from homology modeling, flexible docking, and mutational studies. J Comput Aided Mol Des 25: 317–327.

8. Moiseenkova-Bell VY, Stanciu L a, Serysheva II, Tobe BJ, Wensel TG (2008) Structure of TRPV1 channel revealed by electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 7451–7455.

9. Alawi K, Keeble J (2010) The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation. Pharmacol Ther 125: 181–195.

10. Vyklický L, Nováková-Tousová K, Benedikt J, Samad A, Touska F, et al. (2008) Calcium-dependent desensitization of vanilloid receptor TRPV1: a mechanism possibly involved in analgesia induced by topical application of capsaicin. Physiol Res 57 Suppl 3: S59–S68.

11. Szallasi A, Cortright DN, Blum C a, Eid SR (2007) The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept. Nat Rev Drug Discov 6: 357–372.

12. Starowicz K, Nigam S, Di Marzo V (2007) Biochemistry and pharmacology of endovanilloids. Pharmacol Ther 114: 13–33.

13. Fernandes ES, Fernandes M a, Keeble JE (2012) The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from sensory nerves. Br J Pharmacol 166: 510–521.

95

14. Calixto JB, Kassuya C a L, André E, Ferreira J (2005) Contribution of natural products to the discovery of the transient receptor potential (TRP) channels family and their functions. Pharmacol Ther 106: 179–208.

15. Szallasi A, Blumberg PM (1999) Vanilloid (Capsaicin) Receptors and Mechanisms. Pharmacol Rev 51: 159–211.

16. Appendino G, Ech-Chahad A, Minassi A, Bacchiega S, De Petrocellis L, et al. (2007) Structure-activity relationships of the ultrapotent vanilloid resiniferatoxin (RTX): the homovanillyl moiety. Bioorg Med Chem Lett 17: 132–135.

17. Szolcsányi J (1996) Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions : facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanisms. Prog Brain Res 113: 343–359.

18. Szolcsányi J (2004) Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology and physiology. Neuropeptides 38: 377–384.

19. Holzer P (1998) Implications of Tachykinins and Calcitonin Gene-Related Peptide in. Digestion 43: 269–283.

20. Maggi CA (1995) Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog Neurobiol 45: 1–98.

21. Geppetti P, Nassini R, Materazzi S, Benemei S (2008) The concept of neurogenic inflammation. BJU Int 101 Suppl : 2–6.

22. Geppetti P, Holzer P (1996) Neurogenic inflammation. CRC Press.

23. Helyes Z (2009) Szenzoros neuropeptidek szerepének vizsgálata légúti és ízületi gyulladás, valamint fájdalom állatkísérletes modelljeiben - MTA doktori értekezés.

24. Helyes Z, Pinter E, Szolcsanyi J (2009) Regulatory role of sensory neuropeptides in inflammation. In: Kovacs M, Merchentahler I, editors. Neuropeptides and Peptide Analogs. Kerala, India: Research Signpost, Vol. 661. pp. 111–141.

25. Anand P, Bley K (2011) Topical capsaicin for pain management: therapeutic potential and mechanisms of action of the new high-concentration capsaicin 8% patch. Br J Anaesth 107: 490–502.

26. Sugimoto T, Xiao C, Ichikawa H (1998) Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res 807: 147–154.

27. Ohtori S, Chiba T, Takahashi K, Ino H, Yamagata M, et al. (2000) Neonatal capsaicin treatment decreased substance P receptor immunoreactivity in lamina III neurons of the dorsal horn. Neurosci Res 38: 147–154.

96

28. Maggi C, Patacchini R, Tramontana M, Amann R, Giuliani S, et al. (1990) Similarities and differences in the action of resiniferatoxin and capsaicin on central and peripheral endings of primary sensory neurons. Neuroscience 37: 531–539.

29. Szolcsányi J, Pintér E (2013) Transient receptor potential vanilloid 1 as a therapeutic target in analgesia. Expert Opin Ther targets 17: 641–657.

30. Gunthorpe MJ, Szallasi A (2008) Peripheral TRPV1 receptors as targets for drug development: new molecules and mechanisms. Curr Pharm Des 14: 32–41.

31. Jancsó G, Kiraly E, Jancsó-Gábor A (1977) Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature 270: 741–743.

32. Pinter E, Szolcsanyi J (1995) PLASMA EXTRAVASATION IN THE SKIN AND PELVIC ORGANS EVOKED BY ANTIDROMIC STIMULATION OF THE LUMBOSACRAL DORSAL ROOTS OF THE RAT. Neuroscience 68: 603–614.

33. Helyes Z, Elekes K, Sándor K, Szitter I, Kereskai L, et al. (2010) Involvement of preprotachykinin A gene-encoded peptides and the neurokinin 1 receptor in endotoxin-induced murine airway inflammation. Neuropeptides 44: 399–406.

34. Nilius B, Appendino G, Owsianik G (2012) The transient receptor potential channel TRPA1: from gene to pathophysiology. Pflugers Arch 464: 425–458.

35. Bessac BF, Jordt S-E (2008) Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway chemosensation and reflex control. Physiology (Bethesda) 23: 360–370.

36. Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, et al. (2003) ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell 112: 819–829.

37. Jordt S, Bautista DM, Chuang H, Meng ID, Julius D (2004) Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 427: 260–264.

38. Nagata K, Duggan A, Kumar G, García-Añoveros J (2005) Nociceptor and hair cell transducer properties of TRPA1, a channel for pain and hearing. J Neurosci 25: 4052–4061.

39. Spahn V, Stein C, Zöllner C (2014) Modulation of transient receptor vanilloid 1 activity by transient receptor potential ankyrin 1. Mol Pharmacol 85: 335–344.

40. Kobayashi K, Fukuoka T, Obata K, Yamanaka H, Dai Y, et al. (2005) Distinct expression of TRPM8, TRPA1, and TRPV1 mRNAs in rat primary afferent neurons with adelta/c-fibers and colocalization with trk receptors. J Comp Neurol 493: 596–606.

41. Storti B, Bizzarri R, Cardarelli F, Beltram F (2012) Intact microtubules preserve transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) functionality through receptor binding. J Biol Chem 287: 7803–7811.

97

42. Steenland HW, Ko SW, Wu L-J, Zhuo M (2006) Hot receptors in the brain. Mol Pain 2: 34.

43. Han P, Korepanova A V, Vos MH, Moreland RB, Chiu ML, et al. (2013) Quantification of TRPV1 protein levels in rat tissues to understand its physiological roles. J Mol Neurosci 50: 23–32.

44. Nilius B, Szallasi A (2014) Transient receptor potential channels as drug targets: from the science of basic research to the art of medicine. Pharmacol Rev 66: 676–814.

45. Tóth A, Boczán J, Kedei N, Lizanecz E, Bagi Z, et al. (2005) Expression and distribution of vanilloid receptor 1 (TRPV1) in the adult rat brain. Brain Res Mol Brain Res 135: 162–168.

46. Doihara H, Nozawa K, Kawabata-Shoda E, Kojima R, Yokoyama T, et al. (2009) Molecular cloning and characterization of dog TRPA1 and AITC stimulate the gastrointestinal motility through TRPA1 in conscious dogs. Eur J Pharmacol 617: 124–129.

47. De Moura JC, Noroes MM, Rachetti VDPS, Lobão-Soares B, Preti D, et al. (2014) The blockade of transient receptor potential ankirin 1 (TRPA1) signaling mediates antidepressant- and anxiolytic-like actions in mice. Br J Pharmacol 1: 1–26.

48. Bautista DM, Pellegrino M, Tsunozaki M (2013) TRPA1: A gatekeeper for inflammation. Annu Rev Physiol 75: 181–200.

49. Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, et al. (2004) Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron 41: 849–857.

50. Taylor-Clark TE, McAlexander M a, Nassenstein C, Sheardown S a, Wilson S, et al. (2008) Relative contributions of TRPA1 and TRPV1 channels in the activation of vagal bronchopulmonary C-fibres by the endogenous autacoid 4-oxononenal. J Physiol 586: 3447–3459.

51. Takahashi N, Mizuno Y, Kozai D (2008) Molecular characterization of TRPA1 channel activation by cysteine-reactive inflammatory mediators. Channels 2: 1–12.

52. Takahashi N, Mori Y (2011) TRP Channels as Sensors and Signal Integrators of Redox Status Changes. Front Pharmacol 2: 58.

53. SuperPain Database (n.d.). http://bioinformatics.charite.de.

54. Salazar H, Llorente I, Jara-Oseguera A, García-Villegas R, Munari M, et al. (2008) A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci 11: 255–261.

55. Birder LA, Kanai AJ, Groat WC De, Kiss S, Nealen ML, et al. (2001) Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. PNAS 98: 13396–13401.

98

56. Denda M, Fuziwara S, Inoue K, Denda S, Akamatsu H, et al. (2001) Immunoreactivity of VR1 on epidermal keratinocyte of human skin. Biochem Biophys Res Commun 285: 1250–1252.

57. Lazzeri M, Vannucchi MG, Zardo C, Spinelli M, Beneforti P, et al. (2004) Immunohistochemical evidence of vanilloid receptor 1 in normal human urinary bladder. Eur Urol 46: 792–798.

58. Seki N, Shirasaki H, Kikuchi M, Himi T (2007) Capsaicin induces the production of IL-6 in human upper respiratory epithelial cells. Life Sci 80: 1592–1597.

59. Saunders CI, Kunde D a, Crawford A, Geraghty DP (2007) Expression of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) and 2 (TRPV2) in human peripheral blood. Mol Immunol 44: 1429–1435.

60. Charrua A, Reguenga C, Cordeiro JM, Correiade-Sá P, Paule C, et al. (2009) Functional transient receptor potential vanilloid 1 is expressed in human urothelial cells. J Urol 182: 2944–2950.

61. Stander S, Moormann C, Schumacher M, Buddenkotte J, Artuc M, et al. (2004) Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous sensory nerve fibers, mast cells, and epithelial cells of appendage structures. Exp Dermatol 13: 129–139.

62. Bertin S, Aoki-Nonaka Y, de Jong PR, Nohara LL, Xu H, et al. (2014) The ion channel TRPV1 regulates the activation and proinflammatory properties of CD4(+) T cells. Nat Immunol.

63. Southall MD, Li TAO, Gharibova LS, Pei Y, Nicol GD, et al. (2003) Activation of Epidermal Vanilloid Receptor-1 Induces Release of Proinflammatory Mediators in Human Keratinocytes. 304: 217–222.

64. Lee H, Caterina MJ (2005) TRPV channels as thermosensory receptors in epithelial cells. Pflugers Arch 451: 160–167.

65. Li WH, Lee YM, Kim JY, Kang S, Kim S, et al. (2007) Transient receptor potential vanilloid-1 mediates heat-shock-induced matrix metalloproteinase-1 expression in human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol 127: 2328–2335.

66. Lee YM, Li WH, Kim YK, Kim KH, Chung JH (2008) Heat-induced MMP-1 expression is mediated by TRPV1 through PKCalpha signaling in HaCaT cells. Exp Dermatol 17: 864–870.

67. Saunders CI, Fassett RG, Geraghty DP (2009) Up-regulation of TRPV1 in mononuclear cells of end-stage kidney disease patients increases susceptibility to N-arachidonoyl-dopamine (NADA)-induced cell death. Biochim Biophys Acta 1792: 1019–1026.

68. Denda S, Denda M, Inoue K, Hibino T (2010) Glycolic acid induces keratinocyte proliferation in a skin equivalent model via TRPV1 activation. J Dermatol Sci 57: 108–113.

99

69. Kark T, Bagi Z, Lizanecz E, Pásztor TE, Erdei N, et al. (2008) Tissue-Specific Regulation of Microvascular Diameter : Opposite Functional Roles of Neuronal and Smooth Muscle Located Vanilloid Receptor-1. Mol Pharmacol 73: 1405–1412.

70. Czikora Á, Lizanecz E, Bakó P, Rutkai I, Ruzsnavszky F, et al. (2012) Structure-activity relationships of vanilloid receptor agonists for arteriolar TRPV1. Br J Pharmacol 165: 1801–1812.

71. Lai J, Douglas SD, Ho W (1998) Human lymphocytes express substance P and its receptor. J Neuroimmunol 86: 80–86.

72. Bíró T, Maurer M, Modarres S, Lewin NE, Brodie C, et al. (1998) Characterization of Functional Vanilloid Receptors Expressed by Mast Cells. Blood 91: 1332–1340.

73. Szallasi A, Nilsson S, Farkas-Szallasi T, Blumberg PM, Hökfelt T, et al. (1995) Vanilloid (capsaicin) receptors in the rat: distribution in the brain, regional differences in the spinal cord, axonal transport to the periphery, and depletion by systemic vanilloid treatment. Brain Res 703: 175–183.

74. Ferrandiz-Huertas C, Mathivanan S, Wolf C, Devesa I, Ferrer-Montiel A (2014) Trafficking of ThermoTRP Channels. Membranes (Basel) 4: 525–564.

75. Flockerzi V, Nilius B (2014) TRPs: truly remarkable proteins.

76. Bán Á, Marincsák R, Bíró T, Perkecz A, Gömöri É, et al. (2010) Upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid Type-1 Receptor Expression in Oral Lichen Planus. Neuroimmunomodulation 17: 103–108.

77. Tóth E, Kun J, Perkecz A, Tornoczky T, Gerlinger I, et al. (2014) Expression of transient receptor potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Ankyrin 1 (TRPA1) receptors in chronic rhinosinusitis. Rhinology 52: 625.

78. Vaudry D, Falluel-Morel A, Bourgault S, Basille M, Burel D, et al. (2009) Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide and Its Receptors: 20 Years after the Discovery. Pharmacol Rev 61: 283–357.

79. Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minaminot N, Ueharas A, et al. (1989) ISOLATION OF A NOVEL 38 RESIDUE-HYPOTHALAMIC POLYPEPTIDE WHICH STIMULATES ADENYLATE CYCLASE IN PITUITARY CELLS. Biochem Biophys Res Commun 164: 567–574.

80. Arimura A (1998) Perspectives on pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the neuroendocrine, endocrine, and nervous systems. Jpn J Physiol 48: 301–331.

81. Arimura A (2007) PACAP: the road to discovery. Peptides 28: 1617–1619.

82. Faculty of Science, University of Toyama http://www.sci.u-toyama.ac.jp/ (n.d.).

83. Dickson L, Finlayson K (2009) VPAC and PAC receptors: From ligands to function. Pharmacol Ther 121: 294–316.

100

84. Somogyvari-Vigh A, Reglodi D (2004) Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide : A Potential Neuroprotective Peptide. Curr Pharm Des 10: 2861–2889.

85. Tan Y-V, Waschek J a (2011) Targeting VIP and PACAP receptor signalling: new therapeutic strategies in multiple sclerosis. ASN Neuro 3.

86. Ohtaki H, Nakamachi T, Dohi K, Shioda S (2008) Role of PACAP in ischemic neural death. J Mol Neurosci 36: 16–25.

87. Rácz B, Gasz B, Borsiczky B, Gallyas F, Tamás A, et al. (2007) Protective effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in endothelial cells against oxidative stress-induced apoptosis. Gen Comp Endocrinol 153: 115–123.

88. Reglodi D, Kiss P, Szabadfi K, Atlasz T, Gabriel R, et al. (2012) PACAP is an endogenous protective factor-insights from PACAP-deficient mice. J Mol Neurosci 48: 482–492.

89. Reichenstein M, Rehavi M, Pinhasov A (2008) Involvement of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the mechanism of antidepressant action. J Mol Neurosci 36: 330–338.

90. Shimakura S-I, Kojima K, Nakamachi T, Kageyama H, Uchiyama M, et al. (2008) Neuronal interaction between melanin-concentrating hormone- and alpha-melanocyte-stimulating hormone-containing neurons in the goldfish hypothalamus. Peptides 29: 1432–1440.

91. Lenti L, Domok F, Kis D, Zimmermann A (2008) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide ( PACAP ) preserves pial arteriolar dilation to hypercapnia and N-methyl-D-aspartate ( NMDA ) after global cerebral ischemia in piglets. FASEB J 22: 1151.

92. Tamas A, Reglodi D, Farkas O, Kovesdi E, Pal J, et al. (2012) Effect of PACAP in Central and Peripheral Nerve Injuries. Int J Mol Sci 13: 8430–8448.

93. Helyes Z, Pozsgai G, Börzsei R, Németh J, Bagoly T, et al. (2007) Inhibitory effect of PACAP-38 on acute neurogenic and non-neurogenic inflammatory processes in the rat. Peptides 28: 1847–1855.

94. Kemény A, Reglodi D, Cseharovszky R, Hashimoto H, Baba A, et al. (2010) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide deficiency enhances oxazolone-induced allergic contact dermatitis in mice. J Mol Neurosci 42: 443–449.

95. Cardell LO, Stjärne P, Wagstaff SJ, Agustí C, Nadel J a (1997) PACAP-induced plasma extravasation in rat skin. Regul Pept 71: 67–71.

96. Markovics A, Kormos V, Gaszner B, Lashgarara A, Szoke E, et al. (2012) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerol-induced trigeminovascular activation in mice. Neurobiol Dis 45: 633–644.

97. Yadav M, Huang M-C, Goetzl EJ (2011) VPAC1 (vasoactive intestinal peptide (VIP) receptor type 1) G protein-coupled receptor mediation of VIP enhancement of murine experimental colitis. Cell Immunol 267: 124–132.

101

98. Chen Y, Zhou Z, Wang Z, Gao H, Zheng X (2004) On PACAP-aggravated experimental acute pancreatitis. J Biomed Eng 21: 964–969.

99. El Zein N, Badran B, Sariban E (2008) The neuropeptide pituitary adenylate cyclase activating polypeptide modulates Ca2+ and pro-inflammatory functions in human monocytes through the G protein-coupled receptors VPAC-1 and formyl peptide receptor-like 1. Cell Calcium 43: 270–284.

100. Pecze L, Szabó K, Széll M, Jósvay K, Kaszás K, et al. (2008) Human Keratinocytes Are Vanilloid Resistant. PLoS One 3: 1–10.

101. Bánvölgyi A, Pálinkás L, Berki T, Clark N, Grant AD, et al. (2005) Evidence for a novel protective role of the vanilloid TRPV1 receptor in a cutaneous contact allergic dermatitis model. J Neuroimmunol 169: 86–96.

102. Athanasiou A, Smith P a, Vakilpour S, Kumaran NM, Turner AE, et al. (2007) Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun 354: 50–55.

103. Porszasz R, Porkolab A, Ferencz A, Pataki T, Szilvassy Z, et al. (2002) Capsaicin-induced nonneural vasoconstriction in canine mesenteric arteries. Eur J Pharm 441: 173–175.

104. Bodó E, Kovács I, Telek A, Varga A, Paus R, et al. (2004) Vanilloid receptor-1 (VR1) is widely expressed on various epithelial and mesenchymal cell types of human skin. J Invest Dermatol 123: 410–413.

105. Engler A, Aeschlimann A, Simmen BR, Michel B a, Gay RE, et al. (2007) Expression of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) in synovial fibroblasts from patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Biochem Biophys Res Commun 359: 884–888.

106. Ko F, Diaz M, Smith P, Emerson E, Yj K, et al. (1998) Toxic effects of capsaicin on keratinocytes and fibroblasts . PubMed Commons. J Burn Care Rehabil 19: 409–413.

107. Liedtke WB, Heller S (2007) TRP Ion Channel Function in Sensory Transduction and Cellular Signaling Cascades. Liedtke WB, Heller S, editors CRC.

108. Szoke E, Börzsei R, Tóth DM, Lengl O, Helyes Z, et al. (2010) Effect of lipid raft disruption on TRPV1 receptor activation of trigeminal sensory neurons and transfected cell line. Eur J Pharmacol 628: 67–74.

109. Czikora Á, Rutkai I, Pásztor ET, Szalai A, Pórszász R, et al. (2013) Different desensitization patterns for sensory and vascular TRPV1 populations in the rat: expression, localization and functional consequences. PLoS One 8: e78184.

110. Donnerer J, Lembeck F (1982) Analysis of the effects of intravenously injected capsaicin in the rat. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 320: 54–57.

102

111. Inoue K, Koizumi S, Fuziwara S, Denda S, Inoue K, et al. (2002) Functional vanilloid receptors in cultured normal human epidermal keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun 291: 124–129.

112. Radtke C, Sinis N, Sauter M, Jahn S, Kraushaar U, et al. (2011) TRPV channel expression in human skin and possible role in thermally induced cell death. J Burn Care Res2 32: 150–159.

113. Dux M, Sántha P, Jancsó G (2003) Capsaicin-sensitive neurogenic sensory vasodilatation in the dura mater of the rat. J Physiol 552: 859–867.

114. Lizanecz E, Bagi Z, Pásztor ET, Papp Z, Edes I, et al. (2006) Phosphorylation-dependent desensitization by anandamide of vanilloid receptor-1 (TRPV1) function in rat skeletal muscle arterioles and in Chinese hamster ovary cells expressing TRPV1. Mol Pharmacol 69: 1015–1023.

115. Szolcsanyi J, Oroszi G, Nemeth J, Szilvassy Z, Blasig IE, et al. (2001) Functional and biochemical evidence for capsaicin-induced neural endothelin release in isolated working rat heart. Eur J Pharmacol 419: 215–221.

116. Dun EC, Huang RL, Dun SL, Dun NJ (1996) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-immunoreactivity in human spinal cord and dorsal root ganglia. Brain Res 721: 233–237.

117. Zhang Y, Malmberg a B, Yaksh TL, Sjölund B, Sundler F, et al. (1997) Capsaicin-evoked release of pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) and calcitonin gene-related peptide (CGRP) from rat spinal cord in vivo. Regul Pept 69: 83–87.

118. Fahrenkrug J, Hannibal J (1998) PITUITARY ADENYLATE CYCLASE ACTIVATING POLYPEPTIDE IMMUNOREACTIVITY IN CAPSAICIN-SENSITIVE NERVE FIBRES SUPPLYING THE RAT URINARY TRACT. Neuroscience 83: 1261–1272.

119. Møller M, Fahrenkrug J, Hannibal J (1999) Innervation of the rat pineal gland by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)-immunoreactive nerve fibres. Cell Tissue Res 296: 247–257.

120. Hannibal J, Fahrenkrug J (2000) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in intrinsic and extrinsic nerves of the rat pancreas. Cell Tissue Res 299: 59–70.

121. Németh J, Reglödi D, Pozsgai G, Szabó A, Elekes K, et al. (2006) Effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. Neuroscience 143: 223–230.

122. Steinhoff M, McGregor GP, Radleff-Schlimme A, Steinhoff A, Jarry H, et al. (1999) Identification of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and PACAP type 1 receptor in human skin: expression of PACAP-38 is increased in patients with psoriasis. Regul Pept 80: 49–55.

103

123. Kodali S, Friedman I, Ding W, Seiffert K, Wagner J a, et al. (2003) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide inhibits cutaneous immune function. Eur J Immunol 33: 3070–3079.

124. Peters EMJ, Ericson ME, Hosoi J, Seiffert K, Hordinsky MK, et al. (2006) Neuropeptide control mechanisms in cutaneous biology: physiological and clinical significance. J Invest Dermatol 126: 1937–1947.

125. Gomariz RP, Juarranz Y, Abad C, Arranz A, Leceta J, et al. (2006) VIP-PACAP system in immunity: new insights for multitarget therapy. Ann N Y Acad Sci 1070: 51–74.

126. Ding W, Wagner J a, Granstein RD (2007) CGRP, PACAP, and VIP modulate Langerhans cell function by inhibiting NF-kappaB activation. J Invest Dermatol 127: 2357–2367.

127. Ding W, Manni M, Stohl LL, Zhou XK, Wagner J a, et al. (2012) Pituitary adenylate cyclase-activating peptide and vasoactive intestinal polypeptide bias Langerhans cell Ag presentation toward Th17 cells. Eur J Immunol 42: 901–911.

128. Tan Y-V, Abad C, Wang Y, Lopez R, Waschek J a (2013) Pituitary adenylate cyclase activating peptide deficient mice exhibit impaired thymic and extrathymic regulatory T cell proliferation during EAE. PLoS One 8: e61200.

129. Armstrong BD, Abad C, Chhith S, Cheung-Lau G, Hajji OE, et al. (2008) Impaired nerve regeneration and enhanced neuroinflammatory response in mice lacking pituitary adenylyl cyclase activating peptide. Neuroscience 151: 63–73.

130. Azuma Y-T, Hagi K, Shintani N, Kuwamura M, Nakajima H, et al. (2008) PACAP provides colonic protection against dextran sodium sulfate induced colitis. J Cell Physiol 216: 111–119.

131. Nemetz N, Abad C, Lawson G, Nobuta H, Chhith S, et al. (2008) Induction of colitis and rapid development of colorectal tumors in mice deficient in the neuropeptide PACAP. Int J Cancer 122: 1803–1809.

132. Tan Y-V, Abad C, Lopez R, Dong H, Liu S, et al. (2009) Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide is an intrinsic regulator of Treg abundance and protects against experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci 106: 2012–2017.

133. Abad C, Waschek J a (2011) Immunomodulatory roles of VIP and PACAP in models of multiple sclerosis. Curr Pharm Des 17: 1025–1035.

134. Elekes K, Sandor K, Moricz A, Kereskai L, Kemeny A, et al. (2011) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays an anti-inflammatory role in endotoxin-induced airway inflammation: in vivo study with gene-deleted mice. Peptides 32: 1439–1446.

135. Hashimoto H, Shintani N, Baba A (2006) New insights into the central PACAPergic system from the phenotypes in PACAP- and PACAP receptor-knockout mice. Ann N Y Acad Sci 1070: 75–89.

104

136. Boros M, Kemény Á, Sebők B, Bagoly T, Perkecz A, et al. (2013) Sulphurous medicinal waters increase somatostatin release: It is a possible mechanism of anti-inflammatory effect of balneotherapy in psoriasis. Eur J Integr Med 5: 109–118.

137. Jakab B, Reglodi D, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, et al. (2004) Distribution of PACAP-38 in the central nervous system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem Biophys Methods 61: 189–198.

138. Dobrosi N, Tóth BI, Nagy G, Dózsa A, Géczy T, et al. (2008) Endocannabinoids enhance lipid synthesis and apoptosis of human sebocytes via cannabinoid receptor-2-mediated signaling. FASEB J 22: 3685–3695.

139. De Falco M, Pisano MM, Luca A De (2014) Embryology and Anatomy of the Skin. Skin Cancer - Current Clinical Pathilogy. Springer Netherlands. pp. 1–15.

140. Moller K, Zhangj Y, Lurs AA, Lund RSJ, Uddman RJ (1993) PITUITARY ADENY LATE CYCLASE ACTIVATING PEPTIDE IS A SENSORY NEUROPEPTIDE: IMMUNOCYTOCHEMICAL AND IMMUNOCHEMICAL EVIDENCE. Neuroscience 57: 725–732.

141. Mulder H, Jongsma H, Zhang Y, Gebre-medhin S, Sundler F, et al. (1999) Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide and Islet Amyloid Polypeptide in Primary Sensory Neurons. Mol Neurobiol 19: 229–253.

142. Tóth BI, Géczy T, Griger Z, Dózsa A, Seltmann H, et al. (2009) Transient receptor potential vanilloid-1 signaling as a regulator of human sebocyte biology. J Invest Dermatol 129: 329–339.

143. Tóth BI, Benko S, Szöllosi AG, Kovács L, Rajnavölgyi E, et al. (2009) Transient receptor potential vanilloid-1 signaling inhibits differentiation and activation of human dendritic cells. FEBS Lett 583: 1619–1624.

144. Holzer P (1988) LOCAL EFFECTOR FUNCTIONS OF CAPSAKIN-SENSITIVE SENSORY NERVE ENDINGS: INVOLVEMENT OF TACHYKININS, CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE AND OTHER NEUROPEPTIDES. Neuroscience 24: 739–768.

145. Szolcsányi J (1996) Neurogenic inflammation, reevaluation of axon reflex theory. In: Geppetti P, Holzer P, editors. Neurogenic inflammation. Boca Raton: CRC Press. pp. 33–42.

146. Qin HY, Sadelain MW, Hitchon C, Lauzon J, Singh B (1993) Complete Freund’s adjuvant-induced T cells prevent the development and adoptive transfer of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol 150: 2072–2080.

147. Allison AC (2008) Effects of Adjuvants on Different Cell Types and Their Interactions in Immune Responses. In: Wolstenholme GEW, Knight J, editors. Ciba Foundation Symposium 18 - Immunopotentiation.

148. Abu-Hamdan MD, Drescher MJ, Ramakrishnan N a, Khan KM, Toma VS, et al. (2006) Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptor (PAC1-R) in

105

the cochlea: evidence for specific transcript expression of PAC1-R splice variants in rat microdissected cochlear subfractions. Neuroscience 140: 147–161.

149. Dalsgaard T, Hannibal J, Fahrenkrug J, Larsen CR, Ottesen B (2003) VIP and PACAP display different vasodilatory effects in rabbit coronary and cerebral arteries. Regul Pept 110: 179–188.

150. Rubin DC, Shaker A, Levin MS (2012) Chronic intestinal inflammation: inflammatory bowel disease and colitis-associated colon cancer. Front Immunol 3: 107.

151. Solomon L, Mansor S, Mallon P, Donnelly E, Hoper M, et al. (2010) The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comp Clin Path 19: 235–239.

152. Perše M, Cerar A (2012) Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol 2012: 718617.

153. McLean MH, Neurath MF, Durum SK (2014) Targeting Interleukins for the Treatment of Inflammatory Bowel Disease-What Lies Beyond Anti-TNF Therapy? Inflamm Bowel Dis 20: 389–397.

154. Szolcsányi J (1982) Capsaicin type pungent agents producing pyrexia. Pyretics and Antipyretics. pp. 437–478.

155. Holzer P (2011) TRP channels in the digestive system. Curr Pharm Biotechnol 12: 24–34.

156. Holzer P (2011) Transient receptor potential (TRP) channels as drug targets for diseases of the digestive system. Pharmacol Ther 131: 142–170.

157. Holzer P (1992) Peptidergic sensory neurons in the control of vascular functions: mechanisms and significance in the cutaneous and splanchnic vascular beds. Rev Physiol Biochem Pharmacol 121: 49–146.

158. Szitter I, Pozsgai G, Sandor K, Elekes K, Kemeny A, et al. (2010) The role of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptors in dextran sulfate-induced colitis in mice. J Mol Neurosci 42: 80–88.

159. Lee J, Yamamoto T, Kuramoto H, Kadowaki M (2012) TRPV1 expressing extrinsic primary sensory neurons play a protective role in mouse oxazolone-induced colitis. Auton Neurosci 166: 72–76.

160. Holzer P (2004) Vanilloid receptor TRPV1: hot on the tongue and inflaming the colon. Neurogastroenterol Motil 16: 697–699.

161. Fujino K, Takami Y, de la Fuente SG, Ludwig K a, Mantyh CR (2004) Inhibition of the vanilloid receptor subtype-1 attenuates TNBS-colitis. J Gastrointest Surg 8: 842–847; discussion 847–848.

162. Kimball ES, Wallace NH, Schneider CR, D’Andrea MR, Hornby PJ (2004) Vanilloid receptor 1 antagonists attenuate disease severity in dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Neurogastroenterol Motil 16: 811–818.

106

163. Massa F, Sibaev A, Marsicano G, Blaudzun H, Storr M, et al. (2006) Vanilloid receptor (TRPV1)-deficient mice show increased susceptibility to dinitrobenzene sulfonic acid induced colitis. J Mol Med (Berl) 84: 142–146.

164. Goso C, Evangelista S, Tramontana M, Manzini S, Blumberg PM, et al. (1993) Topical capsaicin administration protects against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in the rat. Eur J Pharmacol 249: 185–190.

165. Vinuesa AG, Sancho R, García-Limones C, Behrens A, ten Dijke P, et al. (2012) Vanilloid receptor-1 regulates neurogenic inflammation in colon and protects mice from colon cancer. Cancer Res 72: 1705–1716.

166. Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, et al. (2007) 4-Hydroxynonenal, an endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation of the irritant receptor TRPA1. PNAS 104: 13519–13524.

167. Brain SD, Williams TJ, Tippins JR, Morris HR, MacIntyre I (1985) Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature 313: 54–56.

168. Engel M a, Leffler A, Niedermirtl F, Babes A, Zimmermann K, et al. (2011) TRPA1 and substance P mediate colitis in mice. Gastroenterology 141: 1346–1358.

169. Engel M a, Khalil M, Siklosi N, Mueller-Tribbensee SM, Neuhuber WL, et al. (2012) Opposite effects of substance P and calcitonin gene-related peptide in oxazolone colitis. Dig Liver Dis 44: 24–29.

170. Kimball ES, Prouty SP, Pavlick KP, Wallace NH, Schneider CR, et al. (2007) Stimulation of neuronal receptors, neuropeptides and cytokines during experimental oil of mustard colitis. Neurogastroenterol Motil 19: 390–400.

171. Engel MA, Becker C, Reeh PW, Neurath MF (2011) Role of sensory neurons in colitis: increasing evidence for a neuroimmune link in the gut. Inflamm Bowel Dis 17: 1030–1033.

172. Bernstein C, Robert M, Eysselein E (1993) Rectal Substance P Concentrations Are Increased in Ulcerative Colitis But Not in Crohn ’s Disease . Am J Gastroenterol 88: 908–913.

173. Szitter I, Pintér E, Perkecz A, Kemény A, Kun J, et al. (2014) Role of neurokinin 1 receptors in dextran sulfate-induced colitis: studies with gene-deleted mice and the selective receptor antagonist netupitant. Inflamm Res DOI 10.100.

174. Goode T (2000) Neurokinin-1 receptor expression in inflammatory bowel disease: molecular quantitation and localisation. Gut 47: 387–396.

175. Kaneko Y, Szallasi A (2013) Transient Receptor Potential (TRP) channels: a clinical perspective. Br J Pharmacol.

107

176. Romano B, Borrelli F, Fasolino I, Capasso R, Piscitelli F, et al. (2013) The cannabinoid TRPA1 agonist cannabichromene inhibits nitric oxide production in macrophages and ameliorates murine colitis. Br J Pharmacol 169: 213–229.

177. Pozsgai G, Helyes Z, Pinter E (2013) P42 Intricate regulatory role of hydrogen sufide in dextran sulfate sodium-induced colitis. Nitric Oxide 31: S53–S54.

178. Cattaruzza F, Spreadbury I, Miranda-Morales M, Grady EF, Vanner S, et al. (2010) Transient receptor potential ankyrin-1 has a major role in mediating visceral pain in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 298: G81–G91.

179. Szolcsányi J, Helyes Z, Oroszi G, Németh J, Pinter E (1998) Release of somatostatin and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. Br J Pharmacol 123: 936–942.

180. Szolcsanyi J, Pinter E, Helyes Z, Petho G (2011) Inhibition of the Function of TRPV1-Expressing Nociceptive Sensory Neurons by Somatostatin 4 Receptor Agonism: Mechanism and Therapeutical Implications. Curr Top Med Chem 11: 2253–2263.

181. Bautista DM, Jordt S-E, Nikai T, Tsuruda PR, Read AJ, et al. (2006) TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell 124: 1269–1282.

182. Knowlton WM, Bifolck-Fisher A, Bautista DM, McKemy DD (2010) TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain 150: 340–350.

183. Nedvig K, Weber G, Nemeth J, Kovacs K, Reglodi D, et al. (2012) Changes of PACAP immunoreactivities and cytokine levels after PACAP-38 containing intestinal preservation and autotransplantation. J Mol Neurosci 48: 788–794.

184. Akbar a, Yiangou Y, Facer P, Walters JRF, Anand P, et al. (2008) Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut 57: 923–929.

185. Kondo T, Oshima T, Obata K, Sakurai J, Knowles CH, et al. (2010) Role of transient receptor potential A1 in gastric nociception. Digestion 82: 150–155.

186. Yu Y-B, Yang J, Zuo X-L, Gao L-J, Wang P, et al. (2010) Transient receptor potential vanilloid-1 (TRPV1) and ankyrin-1 (TRPA1) participate in visceral hyperalgesia in chronic water avoidance stress rat model. Neurochem Res 35: 797–803.

187. Feng B, La JH, Schwartz ES, Gebhart GF (2012) Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 302: G1085–G1098.

188. Brederson J-D, Kym PR, Szallasi A (2013) Targeting TRP channels for pain relief. Eur J Pharmacol 716: 61–76.

108

189. Pozsgai G, Hajna Z, Bagoly T, Boros M, Kemény Á, et al. (2012) The role of transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptor activation in hydrogen-sulphide-induced CGRP-release and vasodilation. Eur J Pharmacol 689: 56–64.

190. Pozsgai G, Helyes Z, Pintér E (1998) Intricate regulatory role of hydrogen sufide in dextran sulfate sodium-induced colitis: 100.

191. Holzer P, Holzer-Petsche U (2001) Tachykinin receptors in the gut: physiological and pathological implications. Curr Opin Pharmacol 1: 583–590.

192. Menzies JR, McKee R, Corbett a D (2001) Differential alterations in tachykinin NK2 receptors in isolated colonic circular smooth muscle in inflammatory bowel disease and idiopathic chronic constipation. Regul Pept 99: 151–156.

193. Renzi D, Pellegrini B, Tonelli F, Surrenti C, Calabrò A (2000) Substance P (neurokinin-1) and neurokinin A (neurokinin-2) receptor gene and protein expression in the healthy and inflamed human intestine. Am J Pathol 157: 1511–1522.

194. Evangelista S, Tramontana M, Maggi C a (2008) Spatial and temporal expression of tachykinins and NK1- and NK2-receptor gene during TNB induced colitis in rats. Neuropeptides 42: 663–670.

195. Sanger GJ (2004) Neurokinin NK1 and NK3 receptors as targets for drugs to treat gastrointestinal motility disorders and pain. Br J Pharmacol 141: 1303–1312.

196. Vu JP, Million M, Larauche M, Luong L, Norris J, et al. (2014) Inhibition of Vasoactive Intestinal Polypeptide (VIP) Induces Resistance to Dextran Sodium Sulfate (DSS)-Induced Colitis in Mice. J Mol Neurosci 52: 37–47.

197. Todorovic V, Janic B, Koko V, Micev M, Ja N, et al. (1996) Colonic vasoactive intestinal polypeptide (VIP) in ulcerative colitis--a radioimmunoassay and immunohistochemical study. Hepatogastroenterology 43: 483–488.

198. Abad C, Juarranz Y, Martinez C, Arranz A, Rosignoli F, et al. (2005) cDNA array analysis of cytokines, chemokines, and receptors involved in the development of TNBS-induced colitis: homeostatic role of VIP. Inflamm Bowel Dis 11: 674–684.

199. Sigalet DL, Wallace LE, Holst JJ, Martin GR, Kaji T, et al. (2007) Enteric neural pathways mediate the anti-inflammatory actions of glucagon-like peptide 2. J Mol Neurosci 293: 211–221.

200. Lakhan SE, Kirchgessner A (2010) Neuroinflammation in inflammatory bowel disease. J Neuroinflammation 7: 37.

201. Newman R, Cuan N, Hampartzoumian T, Connor SJ, Lloyd a R, et al. (2005) Vasoactive intestinal peptide impairs leucocyte migration but fails to modify experimental murine colitis. Clin Exp Immunol 139: 411–420.

202. Thomson AW, Lotze MT, editors (2003) The Cytokine Handbook, Two-Volume Set. Gulf Professional Publishing.

109

203. Brynskov J, Foegh P, Pedersen G, Ellervik C, Kirkegaard T, et al. (2002) Tumour necrosis factor alpha converting enzyme (TACE) activity in the colonic mucosa of patients with inflammatory bowel disease. Gut 51: 37–43.

204. Deleporte A, Viennot S, Dupont B, Giletta C, Allaire M, et al. (2013) Efficacy of anti-TNF-alpha monoclonal antibodies in inflammatory bowel disease treatment. Int J Interf Cytokine Mediat Res 5: 11–31.

205. Bauer C, Loher F, Dauer M, Mayer C, Lehr HA, et al. (2007) The ICE inhibitor pralnacasan prevents DSS-induced colitis in C57BL/6 mice and suppresses IP-10 mRNA but not TNF-alpha mRNA expression. Dig Dis Sci 52: 1642–1652.

206. Alex P, Zachos NC, Nguyen T, Gonzales L, Chen T-E, et al. (2009) Distinct cytokine patterns identified from multiplex profiles of murine DSS and TNBS-induced colitis. Inflamm Bowel Dis 15: 341–352.

207. Tixier E, Galmiche J-P, Neunlist M (2006) Intestinal neuro-epithelial interactions modulate neuronal chemokines production. Biochem Biophys Res Commun 344: 554–561.

208. Li L, Liu Z, Yang X, Yan H, Bao S, et al. (2013) Bioluminescence imaging for IL-1β expression in experimental colitis. J Inflamm (Lond) 10: 16.

209. Carlsen HS, Baekkevold ES, Johansen F-E, Haraldsen G, Brandtzaeg P (2002) B cell attracting chemokine 1 (CXCL13) and its receptor CXCR5 are expressed in normal and aberrant gut associated lymphoid tissue. Gut 51: 364–371.

210. Poole DP, Pelayo JC, Cattaruzza F, Kuo Y-M, Gai G, et al. (2011) Transient receptor potential ankyrin 1 is expressed by inhibitory motoneurons of the mouse intestine. Gastroenterology 141: 565–575, 575.e1–e4.

211. Izzo A, Capasso R, Aviello G, Borrelli F, Romano B, et al. (2012) Inhibitory effect of cannabichromene, a major non-psychotropic cannabinoid extracted from Cannabis sativa, on inflammation-induced hypermotility in mice. Br J Pharmacol 166: 1444–1460.

212. Yang J, Li Y, Zuo X, Zhen Y, Yu Y, et al. (2008) Transient receptor potential ankyrin-1 participates in visceral hyperalgesia following experimental colitis. Neurosci Lett 440: 237–241.

213. Schmidt M, Dubin AE, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A (2009) Nociceptive signals induce trafficking of TRPA1 to the plasma membrane. Neuron 64: 498–509.

214. Keszthelyi D, Troost FJ, Jonkers DM, Helyes Z, Hamer HM, et al. (2013) Alterations in mucosal neuropeptides in patients with irritable bowel syndrome and ulcerative colitis in remission: a role in pain symptom generation? Eur J Pain 17: 1299–1306.

215. Engel M a, Khalil M, Mueller-Tribbensee SM, Becker C, Neuhuber WL, et al. (2012) The proximodistal aggravation of colitis depends on substance P released from TRPV1-expressing sensory neurons. J Gastroenterol 47: 256–265.

110

216. Yiangou Y, Facer P, Dyer NHC, Chan CLH, Knowles C, et al. (2001) Vanilloid receptor 1 immunoreactivity in inflamed human bowel Variant Creutzfeldt-Jakob disease in an elderly patient. Lancet 357: 1338–1339.

217. Matsumoto K, Lo MW, Hosoya T, Tashima K, Takayama H, et al. (2012) Experimental colitis alters expression of 5-HT receptors and transient receptor potential vanilloid 1 leading to visceral hypersensitivity in mice. Lab Invest 92: 769–782.

218. Tohda C, Sasaki M, Konemura T, Sasamura T, Itoh M, et al. (2001) Axonal transport of VR1 capsaicin receptor mRNA in primary afferents and its participation in inflammation-induced increase in capsaicin sensitivity. J Neurochem 76: 1628–1635.

219. Kun J, Helyes Z, Perkecz A, Bán Á, Polgár B, et al. (2012) Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. J Mol Neurosci 48: 795–803.

220. Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethö G, Holzer-Petsche U, et al. (2004) Effects of capsaicin on visceral smooth muscle: a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur J Pharmacol 500: 143–157.

221. Matsumoto K, Kurosawa E, Terui H, Hosoya T, Tashima K, et al. (2009) Localization of TRPV1 and contractile effect of capsaicin in mouse large intestine: high abundance and sensitivity in rectum and distal colon. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 297: G348–G360.

222. Patapoutian A, Tate S, Woolf CJ (2009) Transient receptor potential channels : targeting pain at the source. Nat Rev Drug Discov 8: 55–68.

223. Chan CLH, Facer P, Davis JB, Smith GD, Egerton J, et al. (2003) Sensory fibres expressing capsaicin receptor TRPV1 in patients with rectal hypersensitivity and faecal urgency. Lancet 361: 385–391.

224. Holzer P (2003) Acid-sensitive ion channels in gastrointestinal function. Curr Opin Pharmacol 3: 618–625.

225. Anavi-goffer S, Mckay NG, Ashford MLJ, Coutts AA (2002) Vanilloid receptor type 1-immunoreactivity is expressed by intrinsic afferent neurones in the guinea-pig myenteric plexus. Neurosci Lett 319: 53–57.

226. Holzer P (2004) TRPV1 and the gut : from a tasty receptor for a painful vanilloid to a key player in hyperalgesia. Eur J Pharmacol 500: 231–241.

227. Steinbach EC, Plevy SE (2014) The role of macrophages and dendritic cells in the initiation of inflammation in IBD. Inflamm Bowel Dis 20: 166–175.

228. Patel YC (1999) Somatostatin and its receptor family. Front Neuroendocrinol 20: 157–198.

111

229. Joe B, Lokesh BR (1997) Effect of curcumin and capsaicin on arachidonic acid metabolism and lysosomal enzyme secretion by rat peritoneal macrophages. Lipids 32: 1173–1180.

230. Ippoushi K, Azuma K, Ito H, Horie H, Higashio H (2003) [6]-Gingerol inhibits nitric oxide synthesis in activated J774.1 mouse macrophages and prevents peroxynitrite-induced oxidation and nitration reactions. Life Sci 73: 3427–3437.

231. Ippoushi K, Itou H, Azuma K, Higashio H (2002) Effect of naturally occurring organosulfur compounds on nitric oxide production in lipopolysaccharide-activated macrophages. Life Sci 71: 411–419.

232. Wagner AE, Boesch-Saadatmandi C, Dose J, Schultheiss G, Rimbach G (2012) Anti-inflammatory potential of allyl-isothiocyanate--role of Nrf2, NF-(κ) B and microRNA-155. J Cell Mol Med 16: 836–843.

233. Lee T-Y, Lee K-C, Chen S-Y, Chang H-H (2009) 6-Gingerol inhibits ROS and iNOS through the suppression of PKC-alpha and NF-kappaB pathways in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages. Biochem Biophys Res Commun 382: 134–139.

234. Lee SH, Lee SY, Son DJ, Lee H, Yoo HS, et al. (2005) Inhibitory effect of 2’-hydroxycinnamaldehyde on nitric oxide production through inhibition of NF-kappa B activation in RAW 264.7 cells. Biochem Pharmacol 69: 791–799.

235. Lee H-S, Kim B-S, Kim M-K (2002) Suppression effect of Cinnamomum cassia bark-derived component on nitric oxide synthase. J Agric Food Chem 50: 7700–7703.

236. Chao LK, Hua K-F, Hsu H-Y, Cheng S-S, Lin I-F, et al. (2008) Cinnamaldehyde inhibits pro-inflammatory cytokines secretion from monocytes/macrophages through suppression of intracellular signaling. Food Chem Toxicol 46: 220–231.

237. Kun J, Helyes Z, Szitter I, Kemény Á, Ernszt D, et al. (2013) TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS. Period Biol 115: 38.

238. Nozawa K, Kawabata-Shoda E, Doihara H, Kojima R, Okada H, et al. (2009) TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 3408–3413.

239. Ahern GP (2011) 5-HT and the immune system. Curr Opin Pharmacol 11: 29–33.

240. Chojnacki C, Wiśniewska-Jarosińska M, Kulig G, Majsterek I, Reiter RJ, et al. (2013) Evaluation of enterochromaffin cells and melatonin secretion exponents in ulcerative colitis. World J Gastroenterol 19: 3602–3607.

241. Nilius B, Appendino G (2013) Spices : the savory and beneficial science of pungency . Rev Physiol Biochem Pharmacol 164: 1–76.

242. Vriens J, Appendino G, Nilius B (2009) Pharmacology of vanilloid transient receptor potential cation channels. Mol Pharmacol 75: 1262–1279.

112

243. Leamy AW, Shukla P, McAlexander M a, Carr MJ, Ghatta S (2011) Curcumin ((E,E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) activates and desensitizes the nociceptor ion channel TRPA1. Neurosci Lett 503: 157–162.

244. Davaatseren M, Hwang J-T, Park JH, Kim M-S, Wang S, et al. (2014) Allyl isothiocyanate ameliorates angiogenesis and inflammation in dextran sulfate sodium-induced acute colitis. PLoS One 9: e102975.

245. Sakamoto N, Kono S, Wakai K, Fukuda Y, Satomi M, et al. (2005) Dietary Risk Factors for Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Bowel Dis 11: 154–163.

246. Chapman-Kiddell C, Davies PSW, Gillen L, Radford-Smith GL (2010) Role of diet in the development of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 16: 137–151.

247. Wagner AE, Will O, Sturm C, Lipinski S, Rosenstiel P, et al. (2013) DSS-induced acute colitis in C57BL/6 mice is mitigated by sulforaphane pre-treatment. J Nutr Biochem 24: 2085–2091.

248. Peyrot des Gachons C, Uchida K, Bryant B, Shima A, Sperry JB, et al. (2011) Unusual pungency from extra-virgin olive oil is attributable to restricted spatial expression of the receptor of oleocanthal. J Neurosci 31: 999–1009.

249. Bennett SM, Hayes JE (2012) Differences in the chemesthetic subqualities of capsaicin, ibuprofen, and olive oil. Chem Senses 37: 471–478.

250. Yamamoto T (2013) Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol 29: 216–221.

251. Berger A, Paige CJ (2005) Hemokinin-1 has Substance P-like function in U-251 MG astrocytoma cells: a pharmacological and functional study. J Neuroimmunol 164: 48–56.

252. Berger A, Tran AH, Paige CJ (2007) Co-regulated decrease of Neurokinin-1 receptor and Hemokinin-1 gene expression in monocytes and macrophages after activation with pro-inflammatory cytokines. J Neuroimmunol 187: 83–93.

113

Köszönetnyilvánítás

Mindenekelőtt szeretném hálámat kifejezni témavezetőmnek, Helyes Zsuzsanna

professzornak, hogy bevezetett a kutatás világába és szakmai, személyes

példamutatásával, pozitív szemléletével korábban nem remélt távlatok elérésére

sarkallt. Hálás köszönetem Pintér Erika professzornak, intézetvezetőnek, Doktori Iskola

és Programvezetőnek, aki gyakorlatilag szintén témavezetőmként, kutatói és emberi

értékek átadásával ösztönzött. Köszönöm Szolcsányi János Professzor Úrnak, hogy

mindvégig figyelemmel kísérte munkámat és iránymutatásokkal látott el.

Köszönöm Dr. Kemény Ágnes és Dr. Szőke Éva lelkes segítségét. Külön köszönöm Hírné

Perkecz Anikónak és Bagoly Teréznek a nélkülözhetetlen munkát, és nem utolsósorban

odaadó asszisztensemnek, Buzási Ádámné Annának az együtt töltött vidám perceket.

Köszönöm Dr. Szitter István, Dr. Sándor Katalin, Dr. Tékus Valéria és Olaszné Zádor

Csilla állatkísérletekben való közreműködését. Köszönet illeti továbbá a Farmakológiai

és Farmakoterápiai Intézet valamennyi munkatársát, az összes kutatót, PhD hallgatót,

az asszisztenseket és állatgondozókat, hogy munkámat kivételesen segítőkész,

támogató légkörben végezhettem.

Eredményeim nem jöhettek volna létre külső együttműködők nélkül. Köszönöm Dr.

Bíró Tamásnak (Debreceni Egyetem) az értékes kooperációt, Dr. Szabadfi Krisztinának

(TTK Kísérletes Állattani és Neurobiológiai Tanszék), Dr. Kereskai Lászlónak (Pathologiai

Intézet) és Dr. Gaszner Balázsnak (Anatómiai Intézet) a szövettani munkában nyújtott

segítséget. Köszönettel tartozom a klinikai mintákért Dr. Szabó Imrének, Dr. Vincze

Áronnak és Dr. Gódi Szilárdnak (I. sz. Belgyógyászati Klinika), továbbá a metodikai

segítségért az Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet munkatársainak: Dr.

Polgár Beátának, Dr. Palkovics Tamásnak és Kiss Áginak. Külön köszönöm Nagy Ágnes

és Kovács Sándor (PTE SzKK Növénybiológiai Csoport) szakmai és baráti támogatását.

Végül, nem lehetek eléggé hálás családomnak, akik mindvégig támogattak és

megfelelő hátteret biztosítottak a munkámhoz.

Köszönöm a Nemzeti Kiválóság Program Apáczai Csere János Doktoranduszi Ösztöndíj

(TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001) támogatását.

114

Publikációs lista

Az értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények

Kun József, Helyes Zsuzsanna, Perkecz Anikó, Bán Ágnes, Polgár Beáta, Szolcsányi János, Pintér Erika Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(3) pp. 795-803. (2012) IF: 2,504

Helyes Zsuzsanna, Kun József, Dobrosi Nóra, Sándor Katalin, Németh József, Perkecz Anikó, Pintér Erika, Szabadfi Krisztina, Gaszner Balázs, Tékus Valéria, Szolcsányi János, Capsaicin induces skin inflammation via Transient Receptor Potential Vanilloid-1-mediated up-regulation of Pituitary Adenylate-Cyclase Activating Polypeptide Közlésre benyújtva a Journal of Investigative Dermatology folyóirathoz, a bírálók kérdéseire a válaszadás folyamatban. IF: 6,372

Kun József, Szitter István, Kemény Ágnes, Perkecz Anikó, Kereskai László, Pohóczky Krisztina, Vincze Áron, Gódi Szilárd, Szabó Imre, Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna Upregulation of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 ion channel in the inflamed human and mouse colon and its protective roles PLoS ONE, megjelenés: 2014. szeptember 29., DOI: 10.1371/journal.pone.0108164 IF: 3,534

Az értekezés alapját képező közlemények kumulatív impakt faktora: 6,038.

Független idézők száma: 4.

Egyéb teljes közlemények

Szitter István, Pintér Erika, Perkecz Anikó, Kemény Ágnes, Kun József, Kereskai László, Claudio Pietra, John P. Quinn, Andreas Zimmer, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Helyes Zsuzsanna Role of neurokinin 1 receptors in dextran sulfate-induced colitis: studies with gene-deleted mice and the selective receptor antagonist netupitant Inflamm. Res. (2014) 63:399–409 IF: 2,143

115

Markovics Adrienn, Kormos Viktória, Gaszner Balázs, Arvin Lashgarara, Szőke Éva, Sandor Katalin, Szabadfi Krisztina, Tuka Bernadett, Tajti János, Szolcsányi János, Pintér Erika, Hitoshi Hashimoto, Kun József, Reglődi Dóra, Helyes Zsuzsanna Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerol-induced trigeminovascular activation in mice. NEUROBIOLOGY OF DISEASE 45: pp. 633-644. (2012) IF: 5,403, független idézők: 15.

Az értekezés alapját képező konferencia prezentációk

J. Kun, I. Szitter, Á. Kemény, A. Perkecz, L. Kereskai, Krisztina Pohóczky, Áron Vincze, Szilárd

Gódi, Imre Szabó, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes

UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 RECEPTOR IN THE

INFLAMED HUMAN AND MOUSE COLON

The 8th International Symposium on Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/ Organoprotection

and IUPHAR Meeting of the 17th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology,

Budapest, 2014. szeptember 24-26. (poszter)

J. Kun, I. Szitter, Á. Kemény, A. Perkecz, L. Kereskai, Krisztina Pohóczky, Áron Vincze, Szilárd

Gódi, Imre Szabó, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes

UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE

INFLAMED HUMAN AND MOUSE COLON AND ITS PROTECTIVE ROLES

The 8th International Symposium on Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/ Organoprotection

and IUPHAR Meeting of the 17th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology,

Budapest, 2014. szeptember 24-26. (előadás)

J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, É. Szőke, É. Sághy, D. Ernszt, T. Bagoly, A. Perkecz, K.

Pohóczky, A. Markovics, V. Tékus, E. Pintér

TRPA1 RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS

BY DECREASING TACHYKININ AND INFLAMMATORY CYTOKINE EXPRESSIONS

Semmelweis Symposium 2013: Molecular mechanisms and therapeutic targets in

inflammatory diseases, Budapest, 2013. november 7-9. (poszter)

J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K.

Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér

TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN

DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS

Magyar Immunológiai Társaság 42. Vándorgyűlése, Pécs, 2013. október 16-18. (poszter)

116



TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE

SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS

Horvát Élettani Társaság Konferenciája – Élettani Társaságok 1. Regionális Konferenciája, 2013.

szeptember 13-15., Fiume, Horvátország (poszter)

Zs. Helyes, J. Kun, N. Dobrosi, K. Sandor, J. Nemeth, A. Perkecz A, E. Pinter, K. Szabadfi, V.

Tekus, J. Szolcsanyi, A. Baba, D. Reglodi, T. Biro

CAPSAICIN INDUCES SKIN INFLAMMATION VIA TRPV1- MEDIATED UP-REGULATION OF PACAP

The 11th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides. Konferencia helye,

ideje: Pécs, Magyarország, 2013.08.27-2013.08.31. Pécs. (előadás)

J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Sz. Gódi, I. Szabó, Á. Kemény, K. Pohóczky, A. Perkecz, E. Pintér

A tranziens receptor potenciál ankyrin 1 (TRPA1) és vanilloid 1 (TRPV1) receptor mRNS

expresszió gyulladásos bélbetegségben (IBD) és dextrán-szulfát (DSS) által indukált egér colitis

modellben

A Magyar Élettani, Farmakológiai és Mikrocirkulációs Társaságok 2013. évi közös Tudományos

Kongresszusa, 2013.június 5-8., Budapest, Semmelweis Egyetem Testnevelési és

Sporttudományi Kar (poszter)


TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) AND VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR

mRNA EXPRESSION IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATE-

INDUCED COLITIS IN MICE

Joint Meeting of The European Neuropeptide Club (ENC) Meeting and Summer Neuropeptide

Conference, 2013. május 29 – június 1., Gdynia, Lengyelország (poszter)

J. Kun, E. Pintér, I. Szitter, I. Szabó, Sz. Gódi, A. Perkecz, Zs. Helyes

A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR EXPRESSZIÓVÁLTOZÁSA

GYULLADÁSOS BÉLBETEGSÉGBEN (IBD) ÉS DEXTRÁN-SZULFÁT ÁLTAL INDUKÁLT EGÉR COLITIS

MODELLBEN

Magyar Anatómus Társaság, a Magyar Biofizikai Társaság, a Magyar Élettani Társaság, és a

Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Vándorgyűlése, Debrecen, 2012.

június 10-13. (poszter)

J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Sz. Gódi, I. Szabó, E. Pinter

A tranziens receptor potenciál ankyrin 1 (TRPA1) receptor expresszióváltozása gyulladásos

bélbetegségben (IBD) és dextrán-szulfát kiváltotta egér colitisben

Kisfaludy Lajos Alapítvány előadóülés, Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Rt., Budapest, 2013.

április 15. (előadás)

117

J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Sz. Gódi, I. Szabó, E. Pinter

EXPRESSION CHANGE OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR

IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS IN MICE

6th European Congress of Pharmacology (EPHAR), Granada, Spanyolország, 2012. július 17-20.

(poszter)

J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Á. Bán, B. Polgár, J. Szolcsányi, E. Pintér

EFFECT OF SURGICAL AND CHEMICAL SENSORY DENERVATION ON NON-NEURAL EXPRESSION

OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTORS IN THE RAT

International Brain Research Organization IBRO 2012 Workshop, 2012. január 19-21, Szeged

(poszter)

J. Kun, E. Pintér, A. Perkecz, J. Szolcsányi: "EFFECT OF SURGICAL AND CHEMICAL SENSORY

DENERVATION ON NON-NEURAL EXPRESSION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL

VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTORS IN THE RAT"

The 8th International Medical Postgraduate Conference, Károly Egyetem Orvostudományi Kar,

Hradec Kralove, Cseh Köztársaság, 2011. november 10-12. (előadás)

Egyéb konferencia prezentációk

E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, Z. Piski, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pintér

Nem-neurális tranziens receptor potenciál VANILLOID 1 (TRPV1) - azaz kapszaicin receptor - és

ANKYRIN 1 (TRPA1) receptorok jelenléte orrpolipózisban, asztmás betegcsoporton

A MAGYAR FÜL-, ORR-, GÉGE ÉS FEJ-, NYAKSEBÉSZ ORVOSOK EGYESÜLETE 43.

KONGRESSZUSA, TAPOLCA, 2014. OKTÓBER 15-18. (előadás)

A. Kemeny, Zs. Hajna, I. Szitter, J. Kun, E. Pinter, Zs. Helyes

Role of TRPV1 and TRPA1 ion channels in cigarette smoke-induced chronic airway

inflammation model of the mouse

20th International Symposium on Regulatory Peptides (REGPEP2014), Kiotó, Japán, 2014.

szeptember 7-10. (poszter)

K. Pohóczky, J. Kun, B. Szalontai, K. Kovács, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes

Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) and Vanilloid 1 (TRPV1) ion channels are

expressed and upregulated in response to estrogen in the rat endometrium



118

J. Kun, D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J.

E. Pongrácz, Zs. Helyes

CIGARETTE SMOKE-INDUCED UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL

ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3-

DIMENSIONAL MODEL



J. Kun , D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J.

Pongrácz, Zs. Helyes

CIGARETTE SMOKE-INDUCED UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL

ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3-

DIMENSIONAL MODEL

Joint Meeting of the Federation of European Physiological Societies (FEPS) and the Hungarian

Physiological Society, Budapest, 2014. August 27-30. (poszter)

E. Toth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter

EXPRESSION OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) AND ANKYRIN 1

(TRPA1) RECEPTORS IN CHRONIC RHINOSINUSITIS

25th Congress of the European Rhinologic Society in conjunction with 32ndInternational

Symposium of Infection & Allergy of the Nose; Amszterdam, Hollandia, 2014. június 22-26.

(előadás)

K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes

Expression and hormone-mediated upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid 1

(TRPV1) and Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in the rat endometrium

Horvát Élettani Társaság Konferenciája – Élettani Társaságok 1. Regionális Konferenciája, 2013.

szeptember 13-15., Fiume, Horvátország (poszter)

A. Markovics, V. Kormos, B. Gaszner, A. Lashgarara, E. Szoke, K. Sandor, K. Szabadfi, B. Tuka, J.

Tajti, J. Szolcsanyi, E. Pinter, H. Hashimoto, J. Kun, D. Reglodi, Zs. Helyes

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerol-induced

trigeminovascular activation in mice

NEUROINFLAMMATION: A satellite symposium to the regional FENS meeting. Konferencia

helye, ideje: Prága, Csehország, 2013.09.08-2013.09.11. (poszter)



PITUITARY ADENYLATE CYCLASE-ACTIVATING POLYPEPTIDE PLAYS A KEY ROLE IN

NITROGLYCEROL-INDUCED TRIGEMINOVASCULAR ACTIVATION IN MICE

The 11th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides. Konferencia helye,

ideje: Pécs, Magyarország, 2013.08.27-2013.08.31. (poszter)

119


A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR ÉS A MAKROFÁG

MIGRÁCIÓT GÁTLÓ FAKTOR (MIF) HORMONFÜGGŐ EXPRESSZIÓ-VÁLTOZÁSAI PATKÁNY

ENDOMETRIUMBAN

A Magyar Élettani, Farmakológiai és Mikrocirkulációs Társaságok 2013. évi közös Tudományos

Kongresszusa, 2013.június 5-8., Budapest, Semmelweis Egyetem Testnevelési és

Sporttudományi Kar (poszter)

I. Szitter, E. Pintér, A. Perkecz, Á. Kemény, J. Kun, C. Pietra, J. Quinn, A. Zimmer, A. Berger, Zs.

Helyes.

ROLE OF NEUROKININ 1 (NK1) RECEPTORS IN DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS: STUDIES

WITH GENE-DELETED MICE AND A SELECTIVE RECEPTOR ANTAGONIST

Joint Meeting of The European Neuropeptide Club (ENC) Meeting and Summer Neuropeptide

Conference

2013. május 29 – június 1., Gdynia, Lengyelország (poszter)

D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, D. Ernszt, T. Kovács, E. J. Pongracz

Changes in expression levels of Wnt signalling molecules in cigarette smoke- induced

experimental model systems.

9thJános Szentagothai Inredisciplinary Conference and Student Competition, Pécs, Hungary, 3-4

May 2013 (poszter)

D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, E. J. Pongrácz

Expression levels of Wnt5a and Wnt11 molecules in cigarette smoke-exposed in vitro and in

vivo inflammation models.

The Student Scientific Conference on Biotechnology and Biomedicine. Brno, Czech Republic,

10-12 April 2013 (előadás)

J. Kun, K. Pohóczky, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes

The presence and estrogen-mediated upregulation of the TRPV1 receptor in rat endometrium

Magyar Biokémiai Egyesület (MBKE), a Magyar Genetikusok Egyesülete (MAGE) és a Sejt- és

Fejlődésbiológiai Szakosztály közös konferenciája: Molekuláris Élettudományi Konferencia,

2013. április 5-7, Siófok (poszter)

D. Feller, J. Rapp, J. Kun

Changes in expression levels of Wnt signalling molecules in cigarette smoke-exposed

experimental model systems.

9th International Biomedical Croatian Student Summit, University of Zagreb, Croatia, 20-23

March 2013 (előadás)

D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Pongrácz

A Wnt szignálmolekulák expressziójának vizsgálata dohányfüst indukálta in vivo és in

vitro kísérleti modellrendszererekben.

XVIII. Bolyai Konferencia, Budapest, 2013. március 23-24. (poszter)

120

Zs. Hajna, É. Borbély, V. Tékus, I. Tóth, A. Berger, C. J. Paige, E. Pintér, J. Kun, J. Szolcsányi, Zs.

Helyes

Hemokinin-1 induces hyperalgesia in inflammatory and neuropathic pain models of the mouse

A Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. január 17-19., Budapest (poszter)


A TRPV1 receptor jelenléte és ösztrogén kezelés hatására történő expresszió-növekedése

patkány endometriumban

A Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. január 17-19., Budapest (poszter)

E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornóczky, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pintér

NEM-NEURÁLIS TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1)-AZAZ KAPSZAICIN

RECEPTOR- ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOROK JELENLÉTE KRÓNIKUS RHINOSINUSITISBEN

Magyar Fül-, Orr-, Gége és Fej-, Nyaksebész Orvosok Egyesülete 42. Kongresszusa, Pécs, 2012.

okt. 17-20. (előadás)

D. Feller, Zs. Helyes, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Rapp, M. Avdičević, E. Kiss, E. J. Pongrácz

The expression of the wnt11 and wnt5a signal molecules in cigarette smoke-exposed airway

inflammation models.

Janos Szentagothai Memorial Conference and Student Competition, Pécs, Hungary, 29-30

October 2012 (poszter)

V. Tékus, Zs. Helyes, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, E. Pintér, J. Szolcsányi

Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1), but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels

mediate mustard oil-induced hyperalgesia in mice

1st International Doctoral Workshop on Natural Sciences, Pécsi Tudományegyetem, 2012.

október 3. (előadás)

Á. Bán, J. Kun, A. Perkecz, E. Pintér

A tranziens receptor potenciál vanilloid 1 (TRPV1) és a tranziens receptor potenciál ankyrin 1

(TRPA1) receptorok expressziójának összehasonlítása orális lichen planusban

Magyar Fogorvosok Egyesülete, Árkövy Vándorgyűlés, Pécs, 2012. szeptember 20-22. (előadás)

D. Feller, Zs. Helyes, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Rapp, M. Avdičević, E. Kiss, E. J. Pongrácz

THE EXPRESSION OF THE WNT11 AND WNT5A SIGNAL MOLECULES IN CIGARETTE SMOKE-

INDUCED AIRWAY INFLAMMATION MODELS

The 22nd Annual BioCity Symposium - PERSONAL GENOMICS FROM TECHNOLOGIES TO

APPLICATIONS, Turku, Finnország, 2012. augusztus 23-24. (poszter)

121

V. Tékus, Zs. Helyes, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, E. Pintér, J. Szolcsányi

A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1)

IONCSATORNÁK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA MUSTÁROLAJJAL KIVÁLTOTT NOCIFENZÍV

VISELKEDÉSBEN ÉS AKUT GYULLADÁSOS HIPERALGÉZIÁBAN




Zs. Hajna, É. Borbély, V. Tékus, I. Tóth, A. Berger, J. Kun, E. Pintér, J. Szolcsányi, Zs. Helyes

A HEMOKININ-1 FONTOS SZEREPET JÁTSZIK A HIPERALGÉZIA KIALAKULÁSÁBAN KÜLÖNBÖZŐ

GYULLADÁSOS ÉS DEGENERATÍV KÓRKÉPEK EGÉRMODELLJEIBEN




Á. Ban, J. Kun, A. Perkecz, E. Pinter

COMPARISON OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) AND TRANSIENT

RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR EXPRESSION IN ORAL LICHEN PLANUS

Europerio 7 – Coference of the European Federation of Periodontology, Bécs, Ausztria, 2012.


V. Tékus, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, J. Szolcsányi, Zs. Helyes

ROLE OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 AND ANKYRIN 1 (TRPV1 AND

TRPA1) ION CHANNELS IN THERMONOCICEPTION IN MICE


(poszter)

P. Kiss, J. Farkas, A. Matkovits, G. Horváth, Zs. Helyes, J. Kun, H. Hitoshi, B. Akemichi, L. Welke,

A. Tamás, D. Reglődi

NEUROBEHAVIOURAL DEVELOPMENT IN PACAP KNOCKOUT NEWBORN MICE


(poszter)

J. Kun, E. Tóth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter

NEM-NEURÁLIS TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1)

RECEPTOROK JELENLÉTE RHINOSINUSITISBEN

Magyar Farmakológiai, Anatómus, Mikrocirkulációs, Élettani Társaságok közös tudományos

konferenciája (FAMÉ), PTE ÁOK, Pécs, 2011. június 8-11 (poszter)

J. Kun, E. Toth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter

EXPRESSION OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL RECEPTORS VANILLOID 1 (TRPV1) AND

ANKYRIN 1 (TRPA1) IN NASAL POLYPOSIS

The 8th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the American Summer

Neuropeptide Conference, Boston, 2011. május 22-25. (poszter)

122

J. Kun, T. Palkovics, A. Perkecz, T. Laszlo, E. Pinter, J. Szolcsanyi, P. Nagy, B. Polgar, L. Jakab, T.

F. Molnar, Zs. Helyes

EXPRESSION OF SOMATOSTATIN RECEPTOR SUBTYPE 1 (SST1) IN DIFFERENT TYPES OF LUNG

CANCER

The 7th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the American Summer

Neuropeptide Conference, Pécs, 2010. június 21 - 24. (poszter)

Idézhető kivonatok (absztraktok)

E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pinter

Expression of transient receptor potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Ankyrin 1 (TRPA1) receptors

in chronic rhinosinusitis

Rhinology (2014) 52:S25:625; IF: 2,8

J. Kun, D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J.

E. Pongrácz, Zs. Helyes

CIGARETTE SMOKE EXPOSURE UPREGULATES TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1

ION CHANNELS IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3-DIMENSIONAL

MODEL

J Mol Neurosci (2014) 53:S175; IF: 2,757

A. Kemeny, Zs. Hajna, I. Szitter, J. Kun, E. Pinter, Zs. Helyes

ROLE OF TRPV1 AND TRPA1 ION CHANNELS IN CIGARETTE SMOKE-INDUCED CHRONIC AIRWAY

INFLAMMATION MODEL OF THE MOUSE


K. Pohóczky, J. Kun, B. Szalontai, K. Kovács, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes

Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) and Vanilloid 1 (TRPV1) ion channels are

expressed and upregulated in response to estrogen in the rat endometrium




PITUITARY ADENYLATE CYCLASE-ACTIVATING POLYPEPTIDE PLAYS A KEY ROLE IN

NITROGLYCEROL-INDUCED TRIGEMINOVASCULAR ACTIVATION IN MICE


Zs. Helyes, J. Kun, N. Dobrosi, K. Sandor, J. Nemeth, A. Perkecz A, E. Pinter, K. Szabadfi, V.

Tekus, J. Szolcsanyi, A. Baba, D. Reglodi, T. Biro

CAPSAICIN INDUCES SKIN INFLAMMATION VIA TRPV1-MEDIATED UP-REGULATION OF PACAP


123


TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) AND VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR

mRNA EXPRESSION IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATE-

INDUCED COLITIS IN MICE


I. Szitter, E. Pintér, A. Perkecz, Á. Kemény, J. Kun, C. Pietra, J. Quinn, A. Zimmer, A. Berger, Zs.

Helyes

ROLE OF NEUROKININ 1 (NK1) RECEPTORS IN DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS: STUDIES

WITH GENE-DELETED MICE AND A SELECTIVE RECEPTOR ANTAGONIST




TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE

SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS

PERIODICUM BIOLOGORUM 115:(2) p. 38. (2013); IF: 0,2


Expression and hormone-mediated upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid 1

(TRPV1) and Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in the rat endometrium

PERIODICUM BIOLOGORUM 115:(2) p. 46. (2013); IF: 0,2



TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN

DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS

IMMUNOLÓGIAI SZEMLE V:(3) p. 32. (2013); IF: 0

P. Kiss, J. Farkas, A. Matkovits, G. Horváth, Zs. Helyes, J. Kun, H. Hitoshi, B. Akemichi, L. Welke,

A. Tamás, D. Reglődi

Neurobehavioral development in PACAP knockout newborn mice

JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) p. S164. 1 p. (2012); IF: 2,504

J. Kun, E. Toth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter

Expression of transient receptor potential receptors vanilloid 1 (TRPV1) and ankyrin 1 (TRPA1)

in nasal polyposis

JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) pp. S197-S198. (2012); IF: 2,504

B. Sandor, D. Hobor, P. Kiss, K. Szabadfi, D. Makovics, A. Matkovics, J. Farkas, M. Wlaschits, A.

Jungling, B. Kaszas, J. Kun, A. Nagy, R. Gabriel, D. Reglodi, A. Tamas

Comparative examination of tooth development in wild type and PACAP deficient mice

JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) p. S164. 1 p. (2012); IF: 2,504

124

V. Tékus, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, J. Szolcsányi, Zs. Helyes

Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion

channels in thermonociception in mice.

CLINICAL NEUROSCIENCE 65:(1) p. 68. (2012); IF: 1,247

J. Kun, E. Tóth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter

THE PRESENCE OF NON-NEURAL TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL RECEPTORS VANILLOID 1

(TRPV1) AND ANKYRIN 1 (TRPA1) IN RHINOSINUSITIS

ACTA PHYSIOLOGICA 202:(S683) pp. 64-65. (2011); IF: 0,453

J. Kun, T. Palkovics, A. Perkecz, T. Laszlo, E. Pinter, J. Szolcsanyi, P. Nagy, B. Polgar, L. Jakab, T.

F. Molnar, Zs. Helyes

EXPRESSION OF SOMATOSTATIN RECEPTOR SUBTYPE 1 (SST1) IN DIFFERENT TYPES OF LUNG

CANCER

NEUROPEPTIDES 44:(6) p. 542. (2010); IF: 2,036

Az összes publikáció (teljes közlemények és kivonatok) kumulatív impakt faktora IF: 47,331 Független idézők: 19

Documents

A TRPV1 ÉS TRPA1 IONCSATORNÁK, VALAMINT …aok.pte.hu/docs/phd/file/dolgozatok/2015/Kun_Jozsef_PhD_dolgozat.pdf · 7 I. Általános bevezetés 1. A TRPV1 receptor Az 1950-60-as