Lumineszcencia spektrometria – összefoglaló

 

Ismétlés: 

fény (elektromágneses sugárzás) elnyelés: abszorpció 

elektron gerjesztés: excitáció 

alap és gerjesztett állapot 

atomi energiaszintek, energiaszintek energia különbsége, foton energia, rezonancia feltétel 

elektromos, vibrációs, rotációs energiaszintek és azok függetlensége → Jablonsky diagram 

(termséma) 

 

szinglet és triplet állapot, multiplicitás 

 

Lumineszcencia jelensége: 

lumineszcencia típusok gerjesztés típusa szerint 

fluorofór = fluoreszcens molekula / jelölő 

jelenségek összekapcsolása: abszorpció‐emisszió, gerjesztés‐visszagerjesztés (excitáció‐deexcitáció), 

foton és elektron kölcsönhatása 

gerjesztés és emisszió jelenségének értelmezése a Jablonsky diagram segítségével, 

spontán emisszió tulajdonságai 

időbeliség, koherencia 

irány, divergencia 

hullámhossz 

polarizáltság 

 

Lumineszcencia típusok triplet és szinglet állapotok szerint: 

fluoreszcencia és foszforeszcencia összehasonlítása 

S1 → S0 és T1 → S0 átmenet, spinátfordulás, tiltott és engedélyezett átmenetek 

időbeliség, átlagos élettartam 

foton energia, emissziós spektrumok az elektromágneses spektrumon 

Lumineszcencia típusok értelmezése a Jablonski diagram segítségével 

Kasha szabály 

sugárzásos és nem sugárzásos átmenetek 

tükör szimmetria, Stokes‐féle eltolódás (vörös eltolódás) 

fluoreszcencia átlagélettartam, kvantumhatásfok 

polarizáció, polarizált fény, abszorpciós és elektromos vektor, fotoszelekció jelensége 

 

Fluorofórok: 

intrinsic és extrinsic fluorofórok 

fluoreszcencia (és fluorofórok) alkalmazási lehetőségei 

 

Lumineszcencia spektroszkópia – fluoriméter: 

egységek és geometria: fényforrás, monokromátor(ok), minta, detektor (PMT), adatgyűjtő és 

kiértékelő egység (PC) 

működési elv: merőleges elrendezés, gerjesztési és emissziós ág 

2012.02.11.

1

Lumineszcencia spektroszkópia

Elektron+vibrációs+rotációs-spektroszkópia alapjai

Fizika-Biofizika II. szemeszter

2012. február

Orbán József

PTE ÁOK Biofizikai Intézet

Kengurupatkány vese epitéliumsejt mitotikus osztódása

DNS Mikrotubulus Mitokondrium

forrás: http://micro.magnet.fsu.edu/cells/fluorescencemitosis/index.html3

2012.02.11.

2

Lumineszcencia

tulajdonságoktulajdonságok• Szinglet/triplet állapot

• Energetika

• Időbeliség, koherencia

• Irány (divergencia)

• Polarizáltság

Szinglet és triplet állapot (molekulák)0

Eredő spin?s = S = ?

Multiplicitás: = 2 S+1

Ene

rgia

Abszorpció

h

S1

s = S = ?

S = 0

T1

S = 1

= 2·S+1

M = 1 M = 3

S0

Pauli elvnek megfelel → engedélyezett átmenet

S0

Pauli elvnek ellentmond → tiltott átmenet

2012.02.11.

3

Molekula orbitál elmélet

Hidrogén → H2

1 p+, 1 e-

H atom H atom

ener

gia

H gáz (H2)

Eredő spin?s = S = ?

e

1s

s: bonding molecular orbitals*: antibonding molecular orbital

Molekula orbitál elmélet

Hélium → He2

2 e-

H l k l (H )He atom He atom

ener

gia

He molekula (He2)

Eredő spin?s = S = ?

e

1s

2012.02.11.

4

Molekula orbitál elméletOxo-/karbonil csoport>C=O

C O kettős kötés

C atom O atom

ener

gia

C, O kettős kötés

n

e

Eredő spin?

s = S = 0Multiplicitás: M = 2S+1

Molekula orbitál elmélet

C atom O atom

ener

gia

nHOMO:Highest occ pied MO

LUMO:Lowest unoccupied MO(legalacsonyabbbetöltetlen MO)Nincs eredő

spin változás!

e

Highest occupied MO(legmagasabb betöltött MO)

→ →n→→n→

2012.02.11.

5

Jablonsky-féle termsémamolekuláris rendszerre

0

S1. Excitáció (gerjesztés)

Ene

rgia

S1

S2

(g j )Abszorpció (elnyelés)

Energiafelvétel közben az e-

egyik szintről a másikra jut.Fotont nyel el a rendszer.

2. De-excitációEmisszió (kibocsátás)Abszorpcióh

S0

Emisszió (kibocsátás)Energialeadás közben az e-

egyik szintről a másikra jut.Fotont bocsát ki a rendszer.

pEmisszió h

A lumineszcencia típusai

A gerjesztés módja szerint:

EM sugárzás elnyelése fotolumineszcencia

kémiai reakció kemi-, biolumineszcencia

termikusan aktivált ion rekombináció termolumineszcencia

töltés által indukált elektrolumineszcencia

nagy energiájú részecske v. sugárzás radiolumineszcencia

mechanikai (súrlódás) tribolumineszcencia

hanghullámok sonolumineszcencia

A gerjesztett állapot szerint:

szinglet állapot fluoreszcencia

triplet állapot foszforeszcencia

A termolumineszcencia nem azonos a (fekete test) hősugárzással!

2012.02.11.

6

Milyen időskálán zajlanak a folyamatok?

gerjesztés

Fluoreszcencia10-9 s

Foszforeszcencia10-3 s

alapállapotgerjesztett állapot

10-15 s

g j p

relaxáció

fluoreszcencia kioltás, FRET

Belső átalakulás (Internal conversion,

hő)

Abszorpció (t ~ 10-15s) S0→Sn

Sugárzásos (radiatív) átmenetekLumineszcenciaFluoreszcencia (F) S1→S0

Foszforeszcencia (P) T →S

AT

VR

IC

IC

VR

VRS2

T2

S1

szinglet triplet

Foszforeszcencia (P) T1→S0

Sugárzás nélküli (nonradiatív) átmenetek:Belső konverzió (IC)Intersystem crossing (ISC)

Vibrációs relaxáció (VR)

VR

IC

ISC

ISC

IC

IC

PF

AS

AX

VR

VR

T1

Kasha-szabály (kivéve foszforeszcencia esete):

minden radiatív lecsengés csakis az első gerjesztett állapot (S1) legalsóvibrációs szintjéről indulhat (földi körülmények között).

S0

2012.02.11.

7

Jabłonsky-féle termsémamolekuláris rendszerre

0

S1. Excitáció (gerjesztés)

Ene

rgia

S1

S2

(g j )Abszorpció (elnyelés)

Energiafelvétel közben az e-

egyik szintről a másikra jut.Fotont nyel el a rendszer.

2. De-excitációEmisszió (kibocsátás)Abszorpcióh

S0

Emisszió (kibocsátás)Energialeadás közben az e-

egyik szintről a másikra jut.Fotont bocsát ki a rendszer.

pEmisszió h

SPONTÁN EMISSZIÓ!

Jabłonsky-féle termsémamolekuláris rendszerre

0

SIC: internal conversionBelső átrendeződés

Ene

rgia

S1

S2

Abszorpcióh

T1

ISC: intersystem crossingRendszerek közti átmenet

VR: vibrációs relaxációTermikus relaxáció

Belső átrendeződés

S0

pEmisszió h

fluoreszcencia foszforeszcencia

2012.02.11.

8

FLUORESZCENCIA

GerjesztésTermikus relaxáció (Kasha-szabály)EmisszióS1-S0 átmenet: szinglet-szinglet

Reakcióséma

S0+ h → S1

S1 → S0 + hflnincs spinátfordulást = 10-9s (ns)

FOSZFORESZCENCIA

GerjesztésTermikus relaxációIntersystem crossing (S T)

S1 → S0 + hfluor

S0+ h → T1Intersystem crossing (S-T)Termikus relaxációEmisszióT1-S0 átmenet: triplet-szinglet

spinátfordulással (!)t = 10-6 – 10 s (µs – s)

0 1

T1 → S0 + hfoszf

Emisszió típusok tulajdonságai

SpontánIndukált(a foton abszorpcióhoz képest)

• Időben késleltetve → nem koherens

• Minden irányban (3D)

A beérkező fotonnal…

• Egy időben (azonnal) → koherens

• Egyező irányban (kis divergencia)

• nem azonos → nem monokrom.

• Kisebb energiájú

• Azonos hullámhossz → monokromatikus

2012.02.11.

9

Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes–féle eltolódás ()

Int. f:10-9 – 10-6 s

p:10-6 – 10 s

bfluor. foszfor.

absz.gerj.

Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes – féle eltolódás

2012.02.11.

10

Tükörszimmetria oka

Source: http://www.olympusfluoview.com/theory/fluoroexciteemit.html

Fluoreszcencia élettartam ()A molekula gerjesztett állapotból fotonemisszióval kerül vissza alapállapotba. A fluoreszcencia-élettartam az az idő, amely alatt a gerjesztett állapotban levő molekulák száma az e-ed részére csökken.

τ= 1 / (kf + kic + kisc) = 1 / (kf + knr ) ≈ ns-os tartomány

ahol knr = kic + kisc

kkf - a fluoreszcencia-átmenet valószínűségeic - internal conversion (belső konverzió)isc - intersystem crossing (rendszerek közti átmenet)nr - nonradiativ (sugárzás nélküli átmenet)

2012.02.11.

11

Fluoreszcencia kvantumhatásfok

Q = Nemit. / N abs. < 1

Q = kf / (kf + kic + kisc) = kf ·

Polarizált fény, abszorpciós vektor, elektromos vektor

Elektromos dipolmomentum

Elektromágneses hullám elektromos térerősség vektora, rezgési sík

2012.02.11.

12

Síkban ill. lineárisan polarizált fény

Az animáció egyfüggőleges síkban polarizált

hullámot mutat be.

A metszősíkot szemből nézveaz alábbi kép tárul elénk:

Ha az elektromos térerősség vektora

http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.html

Ha az elektromos térerősség vektoraa tér valamely, a fénysugárvonalában lévő, rögzített pontjábanegy egyenes mentén rezeg, akkorsíkban vagy lineárisan polarizálthullámról beszélünk.

Az alábbi animáció egy vízszintes síkban polarizált hullámot mutat be.

A metszősíkot szemből nézve

http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.html

2012.02.11.

13

Elektromos és abszorbciós vektorok

Abszorbciós vektor

forgáskúp !!!

meghatározza az abszorbcióvalószínűségét

Elektromos térerősség vektor

Abszorpció maximális, ha az abszorpciós vektor és a fény p yelektromos térerősség vektora párhuzamos.

Abszorpció képessége függ cos2θ-tól (θ az absz. vektor és a fény elektromos térerősség vektora közötti szög).

A kúpon belüli abszorpciós vektor esetén a fluorofor gerjesztésének valőszínűségenagyobb, mint 50%. (függőleges polariáció esetén)

polarizálatlan fény

FotoszelekcióVéletlenszerű, izotróp eloszlás

vertikálisan polarizált fényfluoroforok

random

Anizotróp eloszlás

„fotoszelekció” =rendezett orientációjú

szubpopuláció szelektálódik

randomorientációjú populációja

izotróp: irányfüggetlenMinden irányban azonos.

2012.02.11.

14

Fluorofórok

Ismétlés: Fehérjék abszorpciója - aminosavak

A három fontos aminosav,amelyek UV ban abszorbeálnakamelyek UV-ban abszorbeálnak,azaz gerjeszthetők.

exti

nkc

ió

hullámhossz

2012.02.11.

15

Fluorofórokfluoreszcenciára alkalmas kémiai anyagok

1. Intrinsic, natív (belső) fluorofórok

Fehérjékben: aromás aminosavakElőny: Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszertElőny: Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszert.

Élő sejtek saját fluoreszcenciája

Aequorea victoriaGFP (green fluorescent protein)

szalagdiagrammja

2012.02.11.

16

Kémiai módosításokkal egy alapvegyület abszorpciója és emissziója hangolható!

2. Extrinsic (külső) fluorofórok - fluoreszcens festékekA jelölő kémiai anyagok minősége és elhelyezkedése tervezhető.

A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez köthetjük. (pl.: cisztein, glutamin, lizin)

A fehérje aktivitását tesztelni kell.

IAEDANS PIRÉNIAF

példák:

IAEDANS-IAF: FRET donor-akceptor pár

Pirén: aktin polimerizáció

fluoreszcein, dansyl, rhodamine száramzékok...

Aktin monomer szalagdiagramja

2012.02.11.

17

Kémiai háttér

Könnyű gerjeszteni az elektronokat, ha

R

• Aromás gyűrűben, vagy

• Konjugált kettős kötésű rendszerben

találhatók.

Minél több kettős kötés van a molekulában, annál kisebb energia kell a gerjesztéshez! Hangolható, tervezhető!

Külső (extrinsic) fluorofór alkalmazásakor:fluorofór

A kromofór (fluorofór) lokális

makromolekula

A kromofór (fluorofór) lokális mozgása elkülöníthetőa molekula egészénekmozgásától.

Térszerkezeti változás a makromolekulában hat a kromofór mozgására is. Ez a változás mérhető.

2012.02.11.

18

Fluoreszcencia alkalmazási lehetőségeiJól detektálható jel (alacsony koncentrációjú minták esetén is).

A fluoreszcencia paraméterek érzékenyek a környezeti tényezők

megváltozására.

A molekuláris szintű vizsgálatok fontos eszköze

Szerkezeti és dinamikai információt ad a vizsgált rendszerről.

Biológiai rendszerek vizsgálata (nem károsítjuk a vizsgálandó rendszert).

Molekulák közötti és molekulán belüli kölcsönhatások tanulmányozása.

Molekuláris mozgások vizsgálata (polarizáció, anizotrópia).

Molekuláris szintű távolságmérés (FRET).

Molekulák rugalmasságának jellemzése (FRET).

Molekula szerkezeti részleteinek, és az egyes csoportok elérhetőségének

feltérképezése (quenching).

További alkalmazások:

Szerkezeti tulajdonságok vizsgálataF hé j d á ió kö é• Fehérje denaturáció nyomonkövetése

• Protein-ligand kapcsolat vizsgálata• Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (pH, ionok) változásának függvényében

Dinamikus tulajdonságok vizsgálata• Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája• Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról•Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról

2012.02.11.

19

Mikroszkópia – fluoreszcens jelöléssel

Aktin filamentum

Mikrotubulus

DNS

Hogyan mérjük a fluoreszcenciát?Egy fluoriméter működésének elméleti sémája

gerjesztésimonokromátor

fényforrás Minta

emissziósmonokromátor

Kiértékelés (PC)

Detektor

Fény (gerjesztés)Fény (emisszió)Elektromos jel

2012.02.11.

20

Fluoreszcencia mérése – spektrofluoriméter‘steady – state’

Fényforrás DetektorFényforrás

Lámpa

lézer

G j s tési

Detektor

Polarizátorok / Szűrők

Gerjesztési

monokromátor

(λgerjesztési)

Emissziós

monokromátor

(λemissziós)Minta

küvetta

A fluoreszcencia élettartam

Fluoreszcencia lecsengési görbe

A fluorofórok sajátsága, jele:

2012.02.11.

21

Fázis fluorimetriaIn

tenz

itás

Idő (ns)

Fény-anyag kölcsönhatás: hullámhossz - energiaszintek