2013.02.15.

1

Fluoreszcencia anizotrópia,

Fluoreszcencia Rezonancia Energiatranszfer

és

Fluoreszcencia kioltás

2013. február 12-14. PTE ÁOK Biofizikai Intézet

Biofizika szeminárium

Ujfalusi Zoltán

Lumineszcencia

A molekuláknak azt a fényemisszióját, amelyet a valamilyen módon (például fénnyel való besugárzással) gerjesztett molekula a hőmérsékleti sugárzáson kívül kibocsát, gyűjtőnéven lumineszcenciának nevezzük.

Síkban polarizált fény Síkban polarizált fény

Polarizáció

Malus törvény

2

max cos Párhuzamos állás:

Θ = 0°, I = Imax

Merőleges állás

Θ = 90°, I = 0

Polarizátor

y

x θ

I

Imax

z

(Étienne-Louis Malus)

1. Gerjesztés: dipólusvektor jön létre – abszorpciós momentum

Fluoreszcencia polarizáció

Vertikálisan

sikpolarizált

gerjesztő fény

Fotoszelekció:

random populációból az elektromos

vektorral párhuzamos abszorpciós

vektorú molekulák kiválasztása

Csak a megfelelő orientáltságú abszorpciós momentummal rendelkező fluorofórok gerjesztődnek a mintában!

2013.02.15.

2

2. Fluoreszcencia emisszió: polarizált fény – emissziós momentum

Polarizációfok: abszorpciós és emissziós momentum különbsége

Oka: gerjesztés időtartama (τ) alatti elmozdulás (ns)

Abszorpciós momentum Emissziós momentum

z

y

x

z

y

x

τ A E

Polarizált fény Részben polarizált

fény

Rotációs diffúzió

Az emissziós momentum vektor nem esik egybe a az abszorpciós momentum vektorral a fluorofórok rotációs diffúziós mozgásának következtében!

Fluoreszcencia polarizáció

vv vh

vv vh

I GIp

I GI

fény polarizált fény minta Nicol prizma vertikális detektor

horizontális detektor

Polarizációfok

Iv

Ivh

Ivv

Példa: ha Ivv = Ivh → p = 0

ha Ivh = 0 → p = 1

Intenzitásvektorok különbsége

normálva az eredő intenzitás vektorra

Fluoreszcencia polarizáció

Fluoreszcencia Anizotrópia

Izotróp rendszer: Irányultság szempontjából homogén rendszer.

Anizotróp rendszer: olyan rendszer melyben vannak kitüntetett irányok.

Fluoreszcencia anizotrópia: Polarizált fény segítségével

az izotróp fluorofór populációt anizotrópá alakítjuk át.

2

vv vh

vv vh

I GIr

I GI

Emissziós anizotrópia

v

Intenzitásvektorok különbsége

normálva az teljes intenzitásra

Különböző fluorofórok

anizotrópiája összeadható

z

y

x

E

A vertikális és horizontális síkban mért intenzitások segítségével lehet meghatározni az anizotrópiát!

Fluoreszcencia Anizotrópia

Perrin egyenlet

Stokes-Einstein összefüggés

Rotációs korrelációs idő

Határ anizotrópia

Rotációs korrelációs idő a molekulák rotációs diffúziós képességéről ad információt!

V: objektum térfogata

η: közeg viszkozitása

T: abszolút hőmérséklet

R: egyetemes gázállandó

r0: határérték anizotrópia („mozdulatlan

molekula”, ha r = r0 → φ végtelen)

τ: fluoreszcencia élettartam

φ: rotációs korrelációs idő

(„mozgékonyság”)

Jean Baptiste Perrin,

Nobel díj, 1926 Alkalmazás

Molekulák rotációs diffúziójának meghatározása

Molekulák közti interakciók detektálása

Konformácós változások észlelése

Membránok fluiditásának meghatározása

Előnyök:

alacsony detektálási küszöb (< nM)

real-time mérések

koncentráció független

2013.02.15.

3

Polarizáció,

Anizotrópia

Gerjesztődik,

abszorbeál, fényt

emittál

Monokromatikus,

polarizált fény

Fluoreszcencia

polarizáció

Emittált

fényintenzitás

Gerjesztődik,

abszorbeál, fényt

emittál

Monokromatikus

fény

Fluoreszcencia

spektroszkópia

Intenzitás-

csökkenés

Gerjesztődik,

abszorbeál

Monokromatikus

fény

Abszorpciós

fotometria

Elforgatás Optikailag aktiv Monokromatikus,

polarizált fény Polarimetria

Detektor Minta Fényforrás

Módszerek összehasonlítása Fotonok és molekulák ütközése

Fotonok és molekulák ütközése

Fény (foton) ütközése a molekulákkal

fényszóródás

abszorpció

Fényelnyelés:

-Egy foton energiája -> molekula energiája (E = h/).

-Az elnyelt energia átalakul:

- Hő

- Fluoreszcencia

- Foszforeszcencia

- Fluoreszcencia kioltás és fluoreszcencia rezonancia energia transzfer

Fluoreszcencia Rezonancia Energiatranszfer

(FRET) - Theodor Förster, 1948

• „A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban lévő fluoreszkáló molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre.”

• A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekula emissziója révén valósul meg!

kt~1/R6

E

R

A FRET feltételei

• Fluoreszcens donor és akceptor molekula.

• A donor és akceptor molekula közötti távolság 2-10 nm!

• Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között.

A FRET molekuláris mechanizmusa Spektrális átfedés

26f

4t κRk)nJ(konst.k

J= átfedési integrál

n= közeg törésmutatója

R= donor-akceptor távolság

κ= orientációs faktor

Hullámhossz

2013.02.15.

4

Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer

kt: az energia transzfer sebességi állandója, tD : a

donor molekula fluoreszcencia élettartama az

akceptor hiányában, R: a donor és az akceptor

molekula közötti távolság, R0: Förster távolság a

donor és az akceptor molekula között.

kt = (1/tD) * (R0/R)6

kt~1/R6

E

R

kt= konst. * J(λ) n-4kfR-6κ2

J(λ): átfedési integrál, n: törésmutató (1.33-1.6),

kf: a fluoreszcencia emissziójának sebességi

állandója, R: a donor és az akceptor molekula

közötti távolság, κ: orientációs faktor (2/3)

Kritikus Förster-távolság

Az a távolság melyen a FRET hatásfok a felére csökken (transzferhatásfok 0.5).

RR

RE

66

0

6

0

FRET hatásfok

R0 = 0.211 • [h-4Q0k2J()]1/6

k2 (k-négyzet) = orientációs faktor, a donor emissziós vektorának és az akceptor abszorpciós vektorának relatív orientációjáról tudósít

•várható érték 0 – 4 között •általában a k2 = 2/3 (gyors mozgások miatti átlagolódás következtében)

η = a közeg törésmutatója (1.33-1.6) Q0 = a donor kvantumhatásfoka akceptor hiányában J(l) = átfedési integrál

Kritikus Förster-távolság

Dt

tICicf

t kkkkk

kE t

Az energia transzfer hatásfoka

1: „steady-state” mérések

E = 1 – (FDA / FD)

2: időfüggő mérések (fluoreszcencia élettartam)

E = 1 – (τDA / τD)

RR

RE

66

0

6

0

тDA : élettartam az akceptor jelenlétében

τD : élettartam az akceptor hiányában

FDA : fluoreszcens intenzitás az akceptor jelenlétében

FD : fluoreszcens intenzitás az akceptor hiányában

Távolságmérés FRET segítségével

(Molekuláris mérőszalag)

RR

RE

66

0

6

0

FRET hatásfok

5 10 15 20 25 30 35

1.0

1.5

2.0

2.5

No

rmál

t f

'

[Hőmérséklet] (°C)

Hőmérséklet-függő FRET mérések

2013.02.15.

5

Összefoglalás

• FRET távolságok meghatározására alkalmas megfelelő donor akceptor párok esetén.

• Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása.

• Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása.

Fluoreszcencia kioltás

• A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotban lévő fluorofórral „ütközve” annak gerjesztési energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában disszipálják (például hő).

• Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió.

Kioltás típusai Statikus : A kioltó és a fluorofór még a gerjesztés előtt egy

komplexet (sötét komplex) alkot, mely komplex nem képes fényt emittálni. A gerjesztett állapotban lévő molekulák száma csökken.

- Diffúzió által nem befolyásolt!

- Fluoreszcencia élettartam nem érzékeny rá!

+ : Nincs emisszió

Sötét komplex (a gerjesztés előtt jön

létre) Gerjesztés

Fluorofór Kioltó h*υ

Kioltás típusai Dinamikus : A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok

révén egymás közelébe kerülnek, egy ütközési komplexet hoznak létre, majd a gerjesztett fluorofór átadja az energiáját a kioltónak.

- Diffúzió által befolyásolt!

- Fluoreszcencia élettartamot csökkenti!

+ :

Kioltó Fluorofór

Gerjesztés

Ütközési komplex

+ Fluorofór Kioltó

(a gerjesztés után jön létre)

h*υ

Hogyan dönthető el, hogy milyen típusú kioltásról van szó?

Dinamikus kioltás Statikus kioltás

• Semleges kioltók: Akrilamid,

nitroxidok sztérikus viszonyok

monitorozása.

• Töltéssel rendelkező kioltók:

jodid, cézium, kobalt

elektrosztatikus viszonyok

monitorozása [a fehérje töltése

fontos (Lys, Arg, His, Asp, Glu)].

Kioltók típusai

2013.02.15.

6

A fluorofórok hozzáférhetőségét tükrözi a Stern-Volmer állandó (KSV). A bimolekuláris sebességi állandó (kq) szintén a kioltás eredményességét, azaz a fluorofórok hozzáférhetőségét tükrözi. kq = 1 x 1010 M-1s-1 diffúzió kontrollált kioltás kq < 1 x 1010 M-1s-1 sztérikus elfedettség kq > 1 x 1010 M-1s-1 kötés kialakulása

Eredmények értékelése Stern-Volmer egyenlet

(a kioltás mértékének kvantifikálása)

Otto Stern (1888-1969)

Fizikai Nobel díj (1943)

Max Volmer (1885-1965)

Stern-Volmer egyenlet

][10 QKF

Fsv

F0 : fluoreszcencia intenzitás

a kioltó hiányában

F : fluoreszcencia intenzitás

a kioltó jelenlétében

Ksv : Stern-Volmer állandó

[Q] : kioltó koncentrációja

Módosított Stern-Volmer egyenlet (Lehrer-egyenlet)

A kioltó számára nem egyformán hozzáférhető fluorofórok esetén!

KSV= 5 M-1

meredekség: 1/(αKSV)

metszéspont: 1/α

α : a kioltó által hozzáférhető fluorofór aránya

Triptofán fluoreszcenciájának kioltása akrilamiddal

350 400 450 500 550 600 650

0

50

100

150

Flu

ore

szce

nci

a in

ten

zitá

s

Hullámhossz (nm)