A virA szekvenciák azonosítása Agrobacterium vitis törzsekből

DIPLOMADOLGOZAT

Készítette: RADVÁNYI ATTILA

Biológus MSc szakos hallgató

Témavezető: DR. PUTNOKY PÉTER

PTE TTK Biológiai Intézet

Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék

Pécs, 2017.

2

TARTALOMJEGYZÉK:

1. Irodalmi áttekintés ........................................................................................................... 3

1.1. Bevezetés ................................................................................................................. 3

1.2. Agrobaktérium fertőzés folyamata .......................................................................... 4

1.3. Virulenciagén-expresszió......................................................................................... 5

1.4. Aktiváló szignálok ................................................................................................... 6

1.5. VirA fehérje és szignál érzékelés............................................................................. 7

2. Célkitűzések .................................................................................................................... 11

3. Alkalmazott anyagok és módszerek .............................................................................. 12

3.1. Baktériumok, plazmidok, fágok............................................................................. 12

3.2. Táptalajok és baktériumok növesztése .................................................................. 13

3.3. Primer tervezés ...................................................................................................... 13

3.4. Összes DNS izolálása ............................................................................................ 14

3.5. Polimeráz láncreakció ............................................................................................ 15

3.6. GenJet DNS tisztítás oszlopon ............................................................................... 15

3.7. Agaróz gélelektroforézis ........................................................................................ 16

3.8. DNS ligálás ............................................................................................................ 16

3.9. Transzformálás....................................................................................................... 16

3.10. Plazmid DNS izolálás és szekvenáló miniprep...................................................... 16

3.11. Emésztés restrikciós endonukleázokkal................................................................. 17

3.12. Fragment izolálás ................................................................................................... 17

3.13. DNS-szekvencia meghatározás .............................................................................. 18

3.14. Háromszülős keresztezés ....................................................................................... 18

4. Eredmények és megvitatásuk ........................................................................................ 19

4.1. A virA szekvenciák meghatározása ....................................................................... 19

4.2. Egyedi hasítóhely kialakítása a virA fragmenten ................................................... 20

4.3. A kanamicin rezisztenciagén előkészítése a munkára ........................................... 23

4.4. Kanamicin rezisztenciagén beépítése a virA fragmentbe ...................................... 24

4.5. Háromszülős keresztezések eredményei ................................................................ 27

5. Összefoglalás ................................................................................................................... 30

6. Irodalomjegyzék ............................................................................................................. 31

7. Köszönetnyilvánítás........................................................................................................ 36

8. Melléklet .......................................................................................................................... 37

9. Hallgatói nyilatkozat ...................................................................................................... 38

3

1. Irodalmi áttekintés

1.1. Bevezetés

Az Agrobacterium a Rhizobiaceae családba tartozó nemzetség [FARRAND et al 2003], és

kétszikű növényeket fertőznek meg, több mint 90 különböző növénycsaládból [MURUGESAN

et al 2010]. Négy Agrobacterium fajt írtak le a Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology-

ban: az Agrobacterium radiobacter-t, Agrobacterium rhizogenes-t, Agrobacterium

tumefaciens-t, és az Agrobacterium rubi-t, [KERSTERS and DE LEY 1984]. Az A. radiobacter-t

nem patogén agrobaktériumnak tekintették. Azokat, melyek gyökér proliferációt indukálnak

A. rhizogenes-ként definiálták. A koronagubacsot okozó agrobaktériumokat A. tumefaciens-

nek nevezték, három változattal; és azokat, melyek a Rubus fajokon okoznak tumort, A. rubi-

nak. Felismerték, hogy ez a besorolás nem megfelelő, mert az A. tumefaciens és A.

radiobacter csak abban különbözik, hogy tartalmaz-e Ti-plazmidot, vagy sem [HOLMES and

ROBERTS 1981], amely egyébként átvihető a törzsek között [WATSON et al 1975].

Az A. vitis-t az A. tumefaciens 3-as változatának tudományos neveként javasolták [OPHEL

and KERR 1990], és világszerte predomináns patogénként tekintettek rá a

szőlőültetvényekben. Természetes gazdatartományáról kimutatták, hogy csak a szőlőkre

korlátozódik [BURR et al 1998]. Az Agrobacterium vitis tumort okoz a szőlő törzsén és

vesszőin, redukálja a növekedést, és potenciálisan a tőkék halálát eredményezi. A betegség

limitáló faktor a szőlőtermelő régiókban szerte a világon és különösen jelentős olyan

éghajlaton, ahol a hideg téli hőmérséklet sérüléseket okoz, melyek nélkülözhetetlenek a

fertőzés megkezdéséhez [BURR and OTTEN 1999; PRATT and POOL 1981]. Az A. vitis fertőzési

folyamatáról úgy gondolják, hogy hasonló az A. tumefaciens-éhez [BINNS and THOMASHOW

1988; BURR and OTTEN 1999; ZUPAN et al 2000], mert az A. vitis-nek is sérülésre van

szüksége a fertőzéshez és hasonló Ti-plazmidokat hordoz, melyek által a törzsek

kategorizálhatók [OTTEN et al 1996].

Jelenleg kevés stratégiánk van a betegség kezelésére. Miután egy területen megjelent, a

baktérium évekig fennmaradhat a talajban, az élő és halott szőlőszövetben is; fertőzési

forrásként funkcionálva [BURR et al 1995]. Ezért, a tiszta palántázó anyag használata olyan

területeken, ahol korábban nem volt betegség, a legjobb lehetőség ennek a betegségnek a

kontrollálására.

4

1.2. Agrobaktérium fertőzés folyamata

Az Agrobacterium törzsek széles körben elterjedtek a természetben. Teljesen

szaporodóképesek a talajban függetlenül a gazdától. A legtöbb izolátum nem tartalmaz Ti-

plazmidot [KRIMI et al. 2002]. Mindazonáltal, a törzsnek a tumorindukáló képesség

egyértelmű szelekciós előnyt jelent azáltal, hogy a tumor táplálékforrást termel (az opinokat)

a kiváltó baktérium számára. Azonban egyértelmű, hogy a növénytranszformációhoz

szükséges bakteriális folyamatok összetettek és energetikailag megterhelők. Emiatt, a

virulencia-indukáló folyamatoknak gondosan szabályozottnak kell lennie és csak akkor

szabad megindulniuk, amikor a kompetens gazda felismert és elérhető.

Az alábbi modell bemutatja a folyamata főbb lépéseit:

1. ábra: A fertőzési folyamat alapmodellje [MCCULLEN and BINNS 2006 módosított ábrája]

A fertőzési folyamat a következő lépésekre tagolható: (1) a gazda kémiai felismerése és a

virulencia gének bekapcsolása; (2) fizikai felismerés és kölcsönhatás a baktérium és a gazda

között; (3) a transzferrendszer termelése; (4) fehérjék és DNA átjuttatása a gazdasejtbe; (5)

majd a sejtmagba; (6) T-DNS beépülés a gazda genomjába; és (7) a T-DNS expressziója.

5

1.3. Virulenciagén-expresszió

A szabályzás megértéséhez azok a munkák voltak az első lépések, melyek azonosítottak

néhány Ti-plazmid hordozta operont a T-DNS-en kívül, amik a virulenciához szükségesek, a

vir géneket (1. ábra) [KLEE et al. 1983, STACHEL and NESTER 1986]. Expressziójuk elemzése

felfedte, hogy, a virA és virG kivételével, a vir gének lényegében némák [STACHEL and

NESTER 1986]. A virA és virG kétkomponensű szabályzórendszereket kódoló génekkel

szignifikánsan homológ, melyekben egy szenzor kináz reagál a bejövő jelre és kiváltja egy

válasz regulátor aktivációját, utóbbi foszforilációs állapotának megváltoztatásával [WOLANIN

et al. 2002]. Számos alapvető, kétkomponensű rendszerek által végrehajtott biokémiai lépés

látható a VirA/VirG rendszerben (2. ábra). A membránba ágyazott szenzor kináz, a VirA,

autofoszforilál egy konzervált hisztidin aminosavat; és átadja ezt a foszfátot a citoplazmikus

válasz regulátor, a VirG konzervált aszparaginsavának. A VirG-P a vir promóterek specifikus,

12 bp-os DNS szekvenciáihoz (vir boxok) köt és aktiválja a transzkripciót [BRENCIC and

WINANS 2005]. A legtöbb kétkomponensű, patogének virulencia rendszereit irányító

rendszerrel szemben, itt azonosították a gazdától származó szignálokat, melyek a VirA/VirG

rendszer aktivációjáért felelősek. Ezek fenolok, aldóz monoszacharidok, alacsony pH, és

alacsony PO4-szint [BRENCIC and WINANS 2005, PALMER et al. 2004]. A fenolok feltétlenül

szükségesek a vir gén expresszió indukálásához, míg a többi szignál érzékenyíti a baktériumot

a fenolokra.

2. ábra: A ChvE/VirA/VirG jelátalakító rendszer

[MCCULLEN and BINNS 2006 módosított ábrája]

6

1.4. Aktiváló szignálok

A sebek gyakori helyei az A. tumefaciens általi transzformációnak [BRAUN 1952]. Bár a

seb egyszerűen lehet belépési portál, előfordulhatnak más specifikus folyamatok a sérülés

helyén, amik megkönnyíthetik a transzformációt. A vir-indukáló szignálok azonosítása

szolgáltatta az egyik legvalószínűbb magyarázatot a sérülés helyének fontosságára: a

fenilpropanoid útvonal magas aktivitása, alacsony pH, és sejtfalszintézishez kapcsolódó

cukrok rutinszerűen kötődnek a sebgyógyuláshoz [BARON and ZAMBRYSKI 1995]. Braun

[1952] felvetette, hogy a sejtosztódás a sérülés helyén a transzformációhoz szükséges

sebválasz esszenciális komponense, és számos ezt követő vizsgálat mutatja, hogy az osztódó

növényi sejtek sokkal hatékonyabban transzformálhatók, mint a nyugvó sejtek [pl., SANGWAN

et al. 1992].

Az indukáló szignálok közül, az alacsony pH és PO4-szint képes aktiválni a virG

expressziót – a VirA-tól függetlenül – a komplex virG promóter működésén keresztül

[WINANS 1990]. A legújabb bizonyítékok arra utalnak, hogy ennek a promóternek a pH

regulációja egy külön pH-érzékelő kétkomponensű rendszeren, a ChvG/ChvI-n keresztül

közvetítődhet. Ez a rendszer kromoszomálisan kódolt és szükséges mind a vir gén

expresszióhoz, mind a virulenciához [LI et al. 2002], bár ezt a mechanizmust még nem

dolgozták ki.

Először a fenolokat azonosították a vir gén expresszió indukálóiként, a gyökerekből és

levél protoplasztokból származó váladékok vizsgálata által [STACHEL et al. 1985]. A 3,5-

dimetoxi-acetofenon, vagyis az acetosziringon (AS), nagy mennyiségben volt jelen ezekben a

váladékokban, és a szintetikus AS-nak magas indukáló aktivitása volt megfigyelhető a

növényi sejtek hiányában is. Szintetikus és természetben előforduló fenolok széles köre mutat

aktivitást, ezek mind a fenilpropanoid-útvonalból származnak növényekben [review PALMER

et al. 2004].

A cukrok szerepét a vir gén indukció folyamatában fiziológiai és genetikai munkákon

keresztül ismerték fel. Az indukáló cukrokra adott válasz kettős: először is, a VirA/VirG

rendszer szignifikánsan alacsonyabb fenoldózisnál indukálódik (pl., 0.5 μM AS szemben a

10–20 μM AS-nal), és másodszor, a vir indukció maximális szintje a fenol telítési

koncentrációjánál öt- tízszeresére növekszik [CANGELOSI et al. 1990, SHIMODA et al. 1990].

Mutációk a kromoszómális virulencia lókuszon – chvE – és a virA–ban drasztikusan

befolyásolhatják ezt a választ [BANTA et al. 1994, CANGELOSI et al. 1990, LEE et al. 1992,

SHIMODA et al. 1993].

7

Számos fenol- és cukorkomponens együttese játszik szerepet a felismerésben,

valószínűleg ez alakítja ki az Agrobacterium széles gazdakörét. A fenolok, melyek feltétlenül

szükségesek a vir gén aktivációhoz, különösen fontosak lehetnek ebben a tekintetben. Bár

mindenütt jelen vannak a magasabb rendű növényekben, a fenolok különböző szubsztitúciós

mintázatokkal specifikusak lehetnek adott nemzetségekre vagy fajokra [DIXON et al. 2002].

Így, a vir indukáló rendszer képessége, hogy felismerje a különböző fenolokat lehetővé teszi a

virulencia gének expresszióját a gazdanövények széles skáláján.

1.5. VirA fehérje és szignál érzékelés

A VirA egy dimer, membránba ágyazott fehérje, ami szignálok hiányában is megtalálható

ebben az állapotban [PAN et al. 1993]. A fehérje számos doménjét azonosították (3. ábra)

szerkezeti és genetikai munkákban [összefoglalva: BRENCIC and WINANS 2005]. Minden

monomer tartalmaz egy kicsi N-terminális citoplazmikus domént, két transzmembrán (TM)

domén által körülvett, 180-aminosavas periplazmikus (P) domént, és egy nagy citoplazmikus

domént. Ez utóbbi három további doménből áll – egy linker (L) doménből, ami részt vesz a

fenol érzékelésben; egy kináz (K) doménből, ami magában foglalja a konzervált hisztidint

(ami foszforilálódik), valamint egy ATP-kötő helyet; és egy vevő (receiver, R) doménből,

melynek szekvenciája homológ – a konzervált aszparaginsavat is beleértve – a VirG N-

terminális régiójával.

Az indukáló szignálok észlelésének eszközeit változó sikerrel határozták meg. Az cukrok

esetében, a kromoszomálisan kódolt, periplazmikus protein, a ChvE szerepe egyértelműnek

tűnik. Ez a fehérje szignifikánsan homológ a periplazmikus cukorkötő fehérjék széles körével,

és az ezt nélkülöző törzsek már nem tudnak válaszolni a cukrok vir-indukáló hatására

[CANGELOSI et al. 1990]. Számos tanulmány szerint a ChvE összhangban dolgozik a VirA

periplazmikus doménjével, hogy érzékenyítse a VirA-t a fenolos indukálókra, amikor cukor

van jelen [BANTA et al. 1994, CHANG and WINANS 1996, SHIMODA et al. 1993]. A VirA/ChvE

kölcsönhatás fizikai bizonyítékáról még nem számoltak be, és a ChvE fehérje cukorkötő

aktivitására sincs biokémiai bizonyíték.

A fenol észlelés fizikai alapja kevésbé világos. Genetikai analízis azt sugallja, hogy a

linker domén kritikus ebben a folyamatban [CHANG and WINANS 1992, TURK et al. 1994].

Erre a legjobb bizonyíték, hogy a VirA egy verziója, mely csak az L és K doméneket

(VirALK) tartalmazza, a VirA fenolra reagáló formája, míg a VirAK nem az [CHANG and

WINANS 1992]. Bár a linker domén szerepet játszik a fenol észlelésben, nincs fizikai

bizonyíték, hogy a fenol köt hozzá, vagy a VirA bármely más doménjéhez, amiről

8

beszámoltak. Nem került elő bizonyíték fenolkötő fehérjék bevonásáról sem a vir gén

aktivációba. Genetikai bizonyíték a modellre, miszerint a fenol közvetlenül kölcsönhatásba

lép a VirA-val, két irányból jön. Először is az Agrobacterium néhány törzse érzékeli a fenolok

különböző változatait, és ez függ az aktuális virA gén jelenlététől [LEE et al. 1995, 1996].

Másodszor, egy fenol-reagáló VirA/VirG rendszert újraalkottak Escherichia coli-ban

[LOHRKE et al. 2001]. Hacsak nincsenek fenolkötő fehérjék, amik E. coli-ban is léteznek, és

produktívan kötődni tudnak a VirA-hoz és aktiválni azt, akkor a VirA-nak közvetlenül

érzékelnie kell a fenolt. Ennek a kérdésnek a végső eldöntése várat magára a fenol:VirA

kölcsönhatás bemutatásáig és jellemzéséig.

A harmadik bemeneti jel, amit a VirA érzékel, az alacsony pH (pH 5.5). Melchers és

munkatársai megmutatták, hogy a nagy periplazmikus deléció a VirA molekulában

indukálhatja a vir gén expressziót (fenolok jelenlétében) 7-es pH-n, ami normális esetben nem

indukáló állapot [MELCHERS et al. 1989]. Újabb vizsgálatok azt mutatják, hogy mind az intakt

periplazmikus doménnek [CHANG and WINANS 1996] és a ChvE-nek (és cukroknak) [GAO

and LYNN 2005] jelen kell lennie a VirA-közvetítette, pH általi indukcióhoz. Bár a

ChvE/cukor kölcsönhatás szükségesnek látszik a pH általi indukcióhoz, a cukor és a pH jel

szétkapcsolható egy kis delécióval a VirA periplazmikus doménjében [BANTA et al. 1994,

GAO and LYNN 2005]. A pH érzékelés fizikai mechanizmusa nem ismert. Mivel a ChvE

megköti az arabinózt semleges pH-n [A. WISE, G. NAIR, és A. BINNS, publikálatlan adat], a

cukorkötés nem lehet pH-függő. A pH hatással lehet a ChvE kölcsönhatására a VirA-val vagy

a VirA válaszára erre a kölcsönhatásra.

A VirA moduláris jellege nagyban segítette a szignálok integrációját és az átalakításukat

vizsgáló munkákat. Kiterjedt genetikai analízis a kináz aktivitásra gyakorolt domén hatásokról

egy modellt eredményezett (3. ábra). A részlegesen tisztított kináz domén képes foszforilálni

a VirG-t in vitro, és ennek a doménnek (VirAK) az expressziója Agrobacterium-ban aktiválja

a vir gén expressziót, bár alacsony szinten és irányító szignál nélkül [CHANG and WINANS

1992, JIN et al. 1990]. A linker domén hozzáadása VirALK formát eredményez, mely

konstitutív indukáló aktivitást eredményez in vivo, de stimulálható fenolokkal is, jelezve

ezeknek a szignáloknak a pozitív hatását [CHANG and WINANS 1992]. Azonban, mivel a vad

típusú VirA szignálok hiányában inaktív (azaz nincs vir gén expresszió), más doméneknek

represszív hatással kell lenniük az aktivitásra. Ennek egyik példája a periplazmikus domén.

Bár a VirA nagy periplazmikus delécióval (VirA P) érzéketlen a cukrokra, megnő a

képessége, hogy indukáljon semleges pH-n és magas szintű vir gén expressziót vált ki

válaszul a fenolokra, cukrok hiányában [BANTA et al. 1994, LEE et al. 1992, MELCHERS et al.

9

1989]. Ez azt sugallja, hogy a periplazmikus domén gátló hatást gyakorol a VirA citoplazmás

részére. A cukor- és pH-modulált ChvE kölcsönhatása a VirA-val enyhíti ezt a gátlást,

maximális érzékenységet és fogékonyságot eredményezve a fenolokra. A vevő doménnek is

van gátló hatása a VirA kináz aktivitásával kapcsolatban. A VirA R nem igényel fenolokat az

aktivációhoz, bár ez még függ a pH-tól és a cukorszignáltól [CHANG and WINANS 1992,

1996].

3. ábra: A ChvE/VirA általi szignál integráció és aktivitás modellje

[MCCULLEN and BINNS 2006 módosított ábrája]

A VirA fehérje dimer állapota jellemző a legtöbb membránba ágyazott szenzor hisztidin-

kinázra és fontos a funkció szempontjából. Genetikai bizonyíték erősen azt sugallja, hogy

ATP kötése az egyik VirA monomerhez, foszforilálja a másikat [BRENCIC et al. 2004]. A

dimer állapot jelentőségét is igazolták a szignáltranszdukcióban. Egy, a linker doménben lévő

pontmutáció miatt inaktív; és egy, a konzervált hisztidinnél mutációt (H474Q) hordozó

inaktív VirA expressziója egy aktív, fenolra reagáló dimert eredményezett [TOYODA-

YAMAMOTO et al. 2000]. Hasonlóképpen, a cukorra nem reagáló VirAE255L koexpressziója a

10

VirAH474Q-val egy cukorra reagáló fenotípusú törzset eredményezett [WISE et al. 2005]. A

VirA verzióinak, melyekből hiányoznak a transzmembrán és periplazmikus domének,

alacsony aktivitásuk van, még magas AS szint mellett is. Ez lehet az ilyen konstrukciók

relatíve gyenge dimerizációjának eredménye [WANG et al. 2002].

11

2. Célkitűzések

Hosszú távú célunk az Agrobacterium vitis baktériumtörzsekben található virA gének

összehasonlító vizsgálata. Ennek érdekében terveztük:

1) a fellelhető virA szekvenciák elemzésével a belső konzerválódott részekre primereket

tervezünk és kipróbáljuk, hogy alkalmasak-e ismeretlen virA szekvenciák

felsokszorozására;

2) az izolált virA részszekvenciákat klónozzuk és meghatározzuk pontos

nukleotidsorrendjüket;

3) az új szekvenciákat összehasonlítjuk az adatbázisokban található gének szekvenciáival,

hogy megtudjuk, mennyire hasonlóak vagy eltérőek.

Ezen eredmények ismeretében további célul tűztük ki a virA gén teljes szekvenciájának

izolálását és meghatározását az A. vitis AT1 törzsből.

4) Ennek érdekében egy kanamicin-rezisztencia gént terveztünk elhelyezni a megismert

szekvenciában, és ezt a mutációt visszajuttatva az A. vitis AT1 törzsbe, homológ

rekombinánst terveztünk előállítani.

5) A mutáns baktériumból a kanamicin rezisztencia segítségével kívántuk klónozni a teljes

gént, a nem kódoló 5' és 3' részeit is ide értve.

12

3. Anyag és módszer

3.1. Baktériumok, plazmidok, fágok

Munkánk során használt baktériumtörzsek, plazmidok, valamint fágok jellemzőit az 1.

táblázat tartalmazza.

1. táblázat: a munka során alkalmazott baktériumtörzsek és plazmidok

ELNEVEZÉS JELLEMZŐK REFERENCIA

Escherichia coli törzsek:

XL1-blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE4 relA1

lacZ_M15 TcR

[BULLOCK et al.]

PP4304 E. coli DH5α (pCU101) CmR – helper törzs Papp Péter

PP211 E.coli JF1754 (pRK2013) KmR helper törzs Putnoky Péter

Fágok:

PP2654 -fág::Tn5 transzpozon Putnoky Péter

Agrobacterium törzsek:

PP4664 A. vitis AT1 nopalin pTi RifR Putnoky Péter

PP4374 A. vitis Tm4 oktopin pTi vad típus Szegedi Ernő

PP4398 A. tumefaciens C58 noplain pTi RifR Putnoky Péter

Plazmidok:

pBS pBluescript SK II(+/-), klónozó vektor, AmpR STRATAGENE

pPAG160 szűk gazdaspecifitású konjugatív vektor, SpcR/Str

R Papp Péter

pPP2815 pAT330 rkpK::Tn5(207), RK2 plazmid származék,

incP TcR, Km

R

Putnoky Péter

pPP4749 pBSEcoRV::virA(AT1)::EcoRV mutáció ez a munka

pPP4750 pBSEcoRV::virA(AT1)::EcoRV mutáció ez a munka

pPP4751 pBSEcoRV::KmR fragment, ori I. ez a munka

pPP4752 pBSEcoRV::KmR fragment, ori II. ez a munka

pPP4759 pBS virA (AT1)::KmR ez a munka

pPP4760 pBS virA (AT1)::KmR ez a munka

pPP4761 pPAG160::virA(AT1)::KmR ez a munka

13

3.2. Táptalajok és baktériumok növesztése

Az Agrobacterium törzseket 28°C-on TA [OROSZ et al. 1973] táptalajon, az E. coli

törzseket pedig 37°C-on LB [SAMBROOK et al. 1989] tápközegben növesztettük. A táptalajok

a megfelelő antibiotikumot a 2. táblázatban leírtak szerint tartalmaztak. Táptalaj készítésekor

a tápoldatokat 1,5% agarózzal egészítettük ki. A baktérium törzseket 15 %-os glicerines TA-

ban -20°C-on lefagyasztva tároljuk.

2. táblázat: Az alkalmazott antibiotikumok és koncentrációjuk ( g/ml)

Antibiotikumok Rövidítés E. coli Agrobacterium törzsek

Ampicillin Amp 100 -

Kanamicin Km 30 200

Spectinomicin Spc 100 -

Chloramfenikol Cm 15 -

Tetraciklin Tc 15 15

Rifampicin Rif - 30

3.3. Primer tervezés

A tervezett primereket a 3. táblázat tartalmazza. Olyan szekvenciákat kívántunk

felsokszorozni, melyek még nem ismertek, ezért a primertervezéshez rokon fajok homológ

szekvenciáit vettük alapul. A munkát kulcsszavas kereséssel kezdtük az NCBI honlapjának

nukleotid adatbázisában. A megtalálható szekvenciák közül az A. tumefaciens C58

(NC_003065), SAKURA (NC_002147), Bo542 (DQ058764), A6 (AF242881) és az A. vitis

S4 (NC_011982) törzsek szekvenciáit használtuk fel. A talált szekvenciák összeillesztéséhez

az EMBL honlapján található Clustal Omega programot használtuk

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). A szekvenciákat FASTA formátumban egymás

alá írtuk az adatbeviteli ablakba. Nem változtattunk a program alapbeállításain. A primer

tervezést a Sequence Manipulation Suite oldalán található PCR Primer Stats nevű programot

használtuk (http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html). A virA gén

körülbelül 2500 bp hosszú, de mi két belső, konzerválódott részt keresve, rövidebb szakaszok

felsokszorozásához terveztük a primereket. Így készült el a VirA11 – VirA11R és a VirA-12 –

VirA-122R primerpár (3. táblázat).

14

Miután már megismertük az A. vitis AT1-es virA szekvenciájának egy részletét, annak

felhasználásával terveztük meg a VirAm-VirAmR primerpárt, ami egy EcoRV hasítóhelyet

tartalmaz. (3. táblázat és 4.2. fejezet 5. ábra).

A kanamicin-rezisztencia gén felsokszorozásához a R5Km-Forward és Reverse

primereket használtuk, amik a Tn5 transzpozonhoz lettek tervezve úgy, hogy egy-egy EcoRV

restrikciós hasítóhelyet tartalmazzanak (3. táblázat).

3. táblázat: A munkában felhasznált oligonukleotidok

Oligonukleotidok neve Bázissorrend Tm

(°C)

Termék

hossza

VirA-11 TGTGAAATGCAGCTTATGGAACT 63,40 1003 bp

VirA-11R ATCCAGAAAAGACGGTTGGTC 63,42

VirA-12 GGCTTGAAGCAGTTGGTAC 61,26 650 bp

VirA-122R GAGGGAGATAAATGTCAAAGCGCG 66,56

M13-UNI GTAAAACGACGGCCAGT 59,97 változó

M13-REV CAGGAAACAGCTATGAC 54,37

VirAm TGAGCAGATATCGATGAACCTG 62,52 301 bp*

VirAmR CAGGTTCATCGATATCTGCTCA 62,52 327 bp*

R5Km-Forward AGATATCAAGGGCTGCTAAAGGAA 64,07 1255 bp

R5Km-Reverse TGATATCTGGGCGAAGAACTCCA 66,00

* A termék hossza a VirAm primer esetén a VirA-122R primerrel, a VirAmR primer

esetén a VirA-12 primerrel értendő.

3.4. Összes DNS izolálása

Meade és társai [MEADE et al 1982] módosított eljárását alkalmaztuk. 1,5 ml éjszakán át

TA tápoldatban növesztett baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük, és 300

μl TE oldatban (50 mM TrisHCL, 20 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáltuk. 100 μl 5% SDS-t

tartalmazó TE oldatot és 100 μl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá.

1-3 órás 37°C-os inkubálás után 500 μl TE-vel telített fenollal ráztuk össze, majd

centrifugálás után a felülúszót új Eppendorf csőbe pipettáztuk át. 500 μl fenol : kloroform

oldattal (25 térfogat fenol : 24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze.

15

Centrifugálás után a felülúszóhoz 500 μl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform : 1 térfogat

izoamil-alkohol) adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázisból a DNS-t 1000 μl

abszolút etanollal kicsaptuk. A kocsonyás csapadékot új, 500μl 70%-os etanol tartalmú,

Eppendorf csőbe tettük át pipettahegy segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve,

szárítást követően, a DNS csapadékot 100 μl desztillált vízben oldottuk fel.

3.5. Polimeráz láncreakció

Az Agrobacterium törzsek virA szekvenciáit a VirA12, VirA-122R, VirAm és VirAmR

primerek, valamint a VIRA52 és 58c40s program segítségével sokszoroztuk fel. (4.1. fejezet

és 4. táblázat). A kísérletekben a THERMO SCIENTIFIC cég Dream Taq DNS polimeráz enzimét

használtuk.

4. táblázat: Az alkalmazott PCR programok

VIRA52 58c40s UNI

1. 95°C 2:00 94°C 2:00 94°C 2:00

2. 95°C 0:30 94°C 0:10 94°C 0:30

3. 52°C 1:00 58°C 0:20 53°C 0:30

4. 72°C 2:00 72°C 0:40 72°C 1:30

5. go to 2.×34 go to 2.×33 go to 2.×33

6. 20°C 2:00 25°C 2:00 end

7. end end

3.6. PCR fragmentek tisztítása klónozás előtt

A polimeráz láncreakcióval felsokszorozott kanamicin-rezisztencia gént a GenJet kit

(THERMO SCIENTIFIC) protokollja alapján izoláltuk, az alábbi lépéseket követve. A PCR-cső

tartalmához 1 térfogat binding puffert adtunk, majd az elegyet egy oszlopra pipettáztuk és 30

másodpercig centrifugáltuk. 600 l mosó puffer (Wash Buffer) oszlopra pipettázása után

újabb 30 mp centrifugálás következett. Ezután 1 percig centrifugáltunk az alkohol eltávolítása

érdekében. Majd 30 l elúciós puffert pipettáztunk az oszlopra és egy percig szobahőn

tartottuk, majd 1 perc centrifugálás következett.

16

A DNS-fragment végeit a Fast DNA End Repair Kit (THERMO SCIENTIFIC) protokoll

segítségével alakítottuk tompa véggé. 13 l DNS-hez 1,5 l 10x puffert és 0,5 l enzim mixet

adtunk. 5 percig szobahőn tartottuk az elegyet, majd megismételtük a GenJet fragment tisztító

lépést. A DNS ezután lett alkalmas a ligálási reakcióra.

3.7. Agaróz gélelektroforézis

A DNS-minták elválasztására 1-1,5%-os agaróz gélt és 0,5×TBE puffert használtunk,

követve az általános módszertani leírásokat [SAMBROOK et al. 1989]. A futtatások során 5 l

mintát vittünk fel a gélre 5 l 2xSTOP oldattal. Kontrollként 100 bp Plus DNS ladder-t

alkalmaztunk (THERMO SCIENTIFIC).

3.8. DNS ligálás

A ligálási reakciókat 20 μl térfogatban, 5 l fragment DNS, és 4 l 5xT4 DNS ligáz puffer

(40 mM TrisHCL, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, pH 7,8) segítségével végeztük

el. A reakciókhoz 0,5 U T4 DNS ligáz enzimet (THERMO SCIENTIFIC) használtunk. Az elegyet

egy éjszakán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk a transzformáció előtt.

3.9. Transzformálás

A kompetens sejtek az XL1-blue törzsből készültek, Inoue és társai módszere alapján

[INOUE et al. 1990]. Egy transzformáláshoz 100 μl kompetens sejtet használtunk fel. A

sejteket -80°C-ról jégre tettük. 15 perc eltelte után hozzáadtuk a transzformációhoz használt

DNS-t. 20 percig jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37°C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk

után 400 μl LB tápoldatot adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket

szelektív táptalajra tettük.

A telepek β-galaktozidáz enzimaktivitását 40 mg/ml X-gal (5-bromo-4- chloro-3-indolyl-

β-D-galactopyranoside) és 40 mg/ml IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)

jelenlétében teszteltük. Bizonyos kísérleteknél a szelekciót antibiotikum rezisztencia

biztosította.

3.10. Plazmid DNS izolálás és szekvenáló miniprep

A plazmid DNS-t 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében egy

éjszakán át növesztett E. coli sejtekből Ish-Horowicz és Burke [ISH-HOROWICZ and BURKE

1981] módszerének módosított változata szerint preparáltuk.

17

1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe tettünk es a sejteket centrifugálással leülepítettük. A

tisztítás során minden centrifugálás 5 percig tartott, 12.000-res fordulatszámmal,

szobahőmérsékleten. A sejteket 100 μl TEG oldatban (25 mM TrisHCl, 10 mM EDTA, 50

mM glükóz pH 8,0) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 μl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS)

hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd 160 μl jéghideg Na-

acetát oldatot (3M, pH 4,8) adtunk hozzájuk es az oldatot erősen összeráztuk. 5 perc 0°C

inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, es a felülúszóból 320 μl izopropanollal

kicsaptuk a plazmid DNS-t. 20 perc -20°C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk,

szárítottuk, és 100 μl Tris-acetát pufferben (50 mM Tris, 100 mM Na-acetát, pH 8,0)

feloldottuk. Ezután 200 μl etanollal a DNS-t ismét kicsaptuk, centrifugáltuk, szárítottuk az

előzőekhez hasonló módon, majd 50 μl RN-áz tartalmú desztillált vízben (100 μg/ml forralt

RN-áz) oldottuk fel.

A DNS-szekvencia meghatározáshoz a preparátumokat további lépésekben tisztítottuk. Az

előzőek szerint készített 50 μl plazmid preparátumhoz 0,1 térfogat 10% SDS oldatot es 1

térfogat 0°C-os 7,5 M NH4-acetát oldatot adtunk es 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután a

csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával

kicsaptuk a plazmid DNS-t (-20°C, 20 perc inkubálás). Centrifugálás, etanolos mosás, szárítás

után a tisztított DNS-molekulát 40 μl desztillált vízben vettük fel.

3.11. Emésztés restrikciós endonukleázokkal

A DNS-minták emésztését a (THERMO SCIENTIFIC) cég termékeit használva a megadott

protokollok szerint végeztük. Kettős emésztés esetén, amennyiben az enzimek különböző

puffert igényeltek, az első emésztés után a DNS-t 0,1 térfogat 3M Na-acetát (pH:7,0) és 2

térfogat abszolút etanol hozzáadásával kicsaptuk. 20 percig inkubáltuk -20°C-on, majd 5 perc

centrifugálás és 70%-os etanolos mosás, szárítás után 30 μl steril desztillált vízbe vettük fel.

Ez után végeztük el a második enzimreakciót. Az emésztés sikerességét agaróz

gélelektroforézissel ellenőriztük.

3.12. Fragment izolálás

A PCR terméket agaróz gélelektroforézis segítségével választottuk el. Az izolálni kívánt

fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk, és 15 perces 60 V feszültség melletti

elektroforézis után a fragment a papírra került. A papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t

kétszer egymás után 50 μl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS kicsapása 10 μl 3M Na-

acetát oldattal (pH:7,0) és 220μl abszolút etanollal történt. A csapadékot 20 perc, -20°C

18

inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 20μl steril desztillált vízben oldottuk fel. Ebből

5 l-t használtunk fel gélelektroforézishez, amivel az izolálás sikerességét ellenőriztük.

3.13. DNS-szekvencia meghatározás

A munkánk során a tisztított plazmid DNS minták nukleotid szekvenciáját a megfelelő

oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló

Laboratóriumában határozták meg. A részszekvenciákat a Chromas Pro

(www.technelysium.com.au/ChromasPro.html) program segítségével ellenőriztük, javítottuk

és a CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) program alkalmazásaival illesztettük össze. A

szekvenciákat BlastN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) program segítségével

hasonlítottuk össze a GenBank nukleotidszekvencia adatbázisban található szekvenciákkal.

3.14. Háromszülős keresztezés

A donor, a recipiens és a helper baktérium törzseket TA táptalajon növesztettük, a

megfelelő antibiotikumok jelenlétében, 1-2 napon keresztül. A felnőtt baktériumokból 0,5 ml

TA tápoldatban szuszpenziót készítettünk, TA lemezen azonos arányban összecseppentve

28°C-on egy napig inkubáltuk őket. Az így felnőtt baktériumokból ismételten szuszpenziót

készítettünk, majd az antibiotikumokat tartalmazó lemezekre szélesztettük őket, különböző

hígításban. Két-három napon keresztül növesztettük őket.

19

4. Eredmények

4.1. A virA szekvenciák meghatározása

Az adatbázisokban fellelhető virA szekvenciák alapján primereket terveztünk (3.3.

fejezet), hogy több A. vitis törzsből is izoláljuk a még ismeretlen szekvenciájú virA gént. A

polimeráz láncreakcióhoz a VirA-12 – VirA-122R és a VirA-11 – VirA-11R primerpárokat, a

VirA52-es programot és templátként DNS-izolátumot használtunk. Előbbi primerpár az A.

vitis AT1-es, utóbbi a Tm4-es törzs esetében működött. A fragmenteket gélből izoláltuk, majd

a pBluescript plazmid EcoRV helyére klónoztuk be. A plazmidot XL1-blue sejtekbe

transzformáltuk. A transzformálás eredményeként kapott fehér telepek valószínűleg

tartalmazzák az izolálni kívánt DNS-szakaszt. Ennek ellenőrzéséhez az M13 UNI-REV

primerpárt és az UNI PCR-programot használtunk. Ez a primerpár a Bluescript plazmid

klónozóhelyének (MCS) két végére lett tervezve. Azokkal a telepekkel folytattuk a munkát,

amelyek a reakció során megfelelő méretű fragmentet adtak. Az AT1-es törzs esetében

nagyjából 700, a Tm4-es törzsnél pedig úgy 1100 bázispár hosszú fragmentet kaptunk.

Ezeknek meghatároztattuk a pontos szekvenciáit (lásd 8. Melléklet 15. és 16. ábra).

Az ellenőrzött és összeszerelt szekvenciákat először a BlastN program segítségével

vizsgáltuk és megállapítottuk, hogy azok erősen homológok a már ismert Agrobacterium virA

szekvenciákkal. Ezek után az újonnan meghatározott szekvenciákat bevonva sokszoros

illesztésben vizsgáltuk a szekvenciák hasonlóságát (ClustalW program). Az

összehasonlításhoz csak a mindkét esetben meglévő szekvenciarészletet használtuk fel, így a

Tm4 szekvenciából kb. 350 bp-nyit nem vettünk figyelembe.

5. táblázat: Találatok BlastN programmal

Törzs neve Accession Number Koordináták

A. vitis S4 CP000637.1 184754..185404

A. rhizogenes pRi2659 EU186381.1 156045..156695

A. rhizogenes pRi1724 AP002086.1 190969..191619

A. tumefaciens KU12 AF001781.1 1581..2231

A. tumefaciens AB2/73 AF329849.1 3735..4385

A. tumefaciens C58 AE007871.2 182244..182869

20

4. ábra: A különböző virA szekvenciák rokonsági viszonyai (cladogram)

A Tm4-es törzs szekvenciája igen nagyfokú hasonlóságot mutat az S4 törzsével. Ennek

oka lehet, hogy a két törzs szekvenciája azonos helyről származik. Az AT1 törzs virA

szekvenciája kevésbé rokon az ismert törzsekkel. Az A. tumefaciens AB2/73 törzsben

található szekvenciával 76% azonosságot mutatott. Mivel ekkora az eltérés, úgy ítéltük meg,

hogy ezen törzs virA génjét célszerűbb megismerni szekvencia szinten, ezért ezzel a törzzsel

folytattuk a munkát és próbáltunk egy kanamicin-rezisztencia gént elhelyezni a virA

szekvenciában, majd ennek segítségével izolálni a teljes gént, az előtte és utána elhelyezkedő

nem kódoló szekvenciákkal együtt.

4.2. Egyedi klónozóhely kialakítása a virA fragmenten

Munkánk célja az Agrobacterium vitis AT1-es törzs virA szekvenciájának mutagenizálása

egy kanamicin-rezisztencia gén beépítésével. A gén egy Tn5-ös transzpozonon található, amit

egy -fágtörzs is tartalmaz. A gént polimeráz láncreakcióval, az 58c40s programmal

sokszoroztuk fel. A felhasznált R5Km-Forward és R5Km-Reverse primerek egy-egy EcoRV

hasítóhelyet (gat’atc) tartalmaznak, amik megkönnyítik a gén klónozását. Logikus tehát, hogy

a kanamicin kazettát egy ilyen hasítóhelyre építsük be. Ehhez azonban szükség volt egy

EcoRV restrikciós hasítóhelyre körülbelül a meghatározott virA szekvencia közepén.

Mivel ilyet nem találtunk, úgy döntöttünk, készítünk egyet polimeráz láncreakció

segítségével. Ehhez új primerpárt terveztünk, mely tartalmazza az enzim hasítóhelyének

szekvenciáját. Szerencsére majdnem a fragment felénél találtunk négy bázist egymás mellett,

ami része az enzim felismerési helyének. Tehát csak két bázist kellett módosítanunk. A

primertervezéshez az AT1-es törzs virA fragmentjének korábban megismert szekvenciáját

használtuk (5. ábra).

21

5. ábra: A VirAm-VirAmR primerek a restrikciós hasítóhellyel

6. ábra: A tervezett primerek helye a virA génen belül. A számértékek a gén bázispárjainak

számát jelölik.

7. ábra: Primerek ellenőrzése PCR-reakcióval, a virA szekvenciarészletet használva

templátként. L: 100 bp Plus DNS ladder kontroll; 1-2: VirA12-VirAmR primerpár; 3-4:

VirAm-VirA-122R primerpár

A VirAm-VirA-122R primerpár jól működött a reakció többszöri megismétlése esetén is;

viszont a VirA12-VirAmR primerpár vagy nem adta a reakciót vagy csak gyengén,

22

amennyiben baktérium szuszpenziót használtunk templátként. Ennek oka például lehet, hogy

a VirA12 primert homológ szekvenciák alapján terveztük, így valószínűleg nem teljesen

komplementer az AT1-es szekvenciájával. Emiatt úgy döntöttünk, hogy még egy PCR-

reakciót végrehajtunk, melyben először a klónozott virA szekvenciarészletet sokszoroztuk fel,

mely tartalmazza az említett primer szekvenciákat, és ezt használtuk templátként a további

reakcióban. Ehhez a reakcióhoz a VirA12 – VirA-122R primerpárt és a VIR52 programot

használtuk, ahogyan korábbi munkánk során is (8. ábra, I. reakció).

A terméket ezerszeresére hígítottuk és ezt adtuk templátként a következő reakcióhoz.

Primerként a VirA12–VirAmR, illetve a VirAm–VirA-122R kombinációkat használtuk a

58c40s programmal. Ezeknek a reakcióknak a terméke a virA szekvencia két fele, melyek a

módosított bázissorrendet tartalmazzák a VirAm és VirAmR primerekkel szemben (8. ábra,

II. reakció).

Az utolsó PCR-reakciót két lépésben hajtottuk végre: (1) a virA fragment százszoros

hígítása szolgált templátként, a II. reakció terméke pedig tízszeres hígításban primerként 5

cikluson keresztül, az 58c40s program használatával. A polimeráz kiegészíti a szálat, így

olyan duplaszálú DNS-ünk lesz, aminek az egyik szála módosított (8. ábra, III/1-es reakció).

(2) Az 1-es reakció termékét templátként alkalmaztuk a VirA12–VirA-122R primerpárral és

ugyanazzal a programmal, de ezúttal 33 cikluson keresztül. A reakció végterméke a virA

fragment, ami tartalmazza a kívánt EcoRV hasítóhelyet (8. ábra, III/2. reakció). Erről

restrikciós emésztéssel és a plazmid DNS izolálása után szekvenálással bizonyosodtunk meg

(9. ábra). Az elegy tartalmazhatja a vad típusú szekvenciát is, de ennek mennyisége csekély.

8. ábra: Az EcoRV hasítóhelyet tartalmazó szekvencia létrehozása. A csillagok a

megváltoztatott bázisokat jelölik.

23

9. ábra: A szekvenálás eredménye: a megváltoztatott virA szekvencia, benne az EcoRV

hasítóhellyel (sárgával jelölve) és a VirA12–VirA-122R primerekkel (pirossal jelölve)

4.3. A kanamicin rezisztenciagén előkészítése a munkára

A kanamicin rezisztenciagént PCR-technika segítségével sokszoroztuk fel az 58c40s

program és az R5Km primerek használatával. A felsokszorozott fragmentet GeneJet kit

használatával tisztítottuk és XL1-blue törzsbe transzformáltuk. A sejteket kanamicin tartalmú

szelektív táptalajra kentük, majd a felnövő telepekből véletlenszerűen kiválasztottunk hatot.

Ezekből plazmid DNS-t izoláltunk a fragment orientációjának meghatározására – bár ez itt

még lényegtelen. A fragment kétféleképpen épülhet be a vektorba (10. ábra). A DNS-mintákat

PstI enzimmel emésztettük, majd 1%-os agaróz gélen megfuttattuk. Az emésztés során

keletkező, eltérő hosszúságú DNS-darabok jelzik az orientációt.

10. ábra: A kanamicin rezisztenciagén lehetséges beépülési módjai a PstI restrikciós

hasítóhelyekkel; P: lacZ promóter

Az emésztés eredményét a következő gélfotó mutatja be.

24

11. ábra: A PstI restrikciós emésztés eredménye a kalkulált fragmentméretekkel: 1-3: I-es

orientáció, 4-6: II-es orientáció, L: 100 bp Plus DNS ladder kontroll (3000, 2000, 1500, 1200,

1000, 900, 800, 700, 600, 500 bp)

A fotó alapján a vizsgált mintáink fele-fele arányban tartalmazzák a két orientációt. A

további munkához az 1-es és 6-os mintákat választottuk ki és tisztítottuk tovább. A 6-os minta

esetében szekvenálással is megbizonyosodjunk meg az inszert jelenlétéről.

4.4. Kanamicin rezisztenciagén beépítése a virA fragmentbe

Már rendelkezésünkre állt külön-külön a virA szekvencia - melybe bevittük a hasítóhelyet

- és a beépítésre szánt rezisztenciagén, Bluescript plazmidokba építve. Most egyesíteni kellett

a munka két szálát. Ehhez először EcoRV enzimmel megemésztettük mindkét plazmidot.

A virA fragment közepén lévő hasítóhely felnyitásával a plazmid linearizálódik, mivel

csak ez az egy ilyen hely található rajta. Innentől kezdve ez szolgál vektorként.

A kanamicin-rezisztencia gént tartalmazó plazmid esete más. A gén két végén egy-egy

hasítóhely van, így az emésztés után egy kisebb (KmR-gén) és egy nagyobb DNS-darab

(plazmid) keletkezik. A két fragmentet agarózgélen elválasztottuk, majd a rezisztenciagént

izoláltuk a gélből. Ezt követően a vektorba ligáltuk, majd XL1-blue törzsbe transzformáltuk

(12. ábra). A sejteket ampicillin és kanamicin tartalmú szelektív táptalajra szélesztettük.

Mivel antibiotikummal szelektáltunk, csak azok a baktériumok nőttek fel, amelyek felvették a

rezisztenciagént tartalmazó plazmidot.

25

12. ábra: A pBS::virA::KmR konstrukció létrehozása

A konstrukció ellenőrzéséhez és a kanamicin rezisztenciagén orientációjának

meghatározásához 1-1 mintából plazmid DNS-t izoláltunk és megemésztettük PvuII

enzimmel. A gén irányától függően kétféle emésztési mintát kaphatunk (13. ábra).

13. ábra: A PvuII-es emésztés eredménye. 1-3: minták; L: 100 bp Plus DNS ladder kontroll

(3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 bp)

26

A gélképen látható legnagyobb bend a plazmidot jelöli 2700 bázispár körül; míg a

legkisebb, 360 bp-os fragment a rezisztenciagénen belül található, így minden alkalommal

ugyanakkora méretben jelenik meg. Ha a gén a virA fragmentnek megfelelően épül be, az

egyik bend több, mint 800; a másik több, mint 1200 bp méretű lesz (2-3-as minta). Fordított

beépülés esetén a kisebb fragment körülbelül 700 bp, a nagyobb pedig több, mint 1300

bázispár (1-es minta).

A konstrukció ellenőrzése után a következő feladat a DNS bejuttatása Agrobacterium-ba.

A Bluescript plazmid erre nem alkalmas, ezért szükség volt egy másik vektorra. Ez a szűk

gazdaspecifitású pPAG plazmid volt, ami spektinomicin rezisztenciát hordoz és helper

plazmid segítségével képes bejutni Gram-negatív sejtekbe (pl.: Agrobacterium sejtek), de

replikálódni ezekben nem tud. A konstrukciót EcoRI-KpnI emésztéssel kivágtuk a Bluescript-

ből és ugyanígy megemésztve linearizáltuk a pPAG vektort is, mivel a két hasítóhely nagyon

közel helyezkedik el egymáshoz a plazmidon. Az konstukciót a pPAG-ba ligáltuk, majd E.

coli-ba transzformáltuk (14. ábra).

A transzformánsokból véletlenszerűen kiválasztottunk három telepet és plazmid DNS-t

izoláltunk belőlük. EcoRV restrikciós emésztéssel ellenőriztük az inszert jelenlétét. A

konstrukciót hordozó sejtek alkalmasak az úgynevezett háromszülős keresztezésre.

14. ábra: A konstrukció klónozása pPAG vektorba, ami már átvihető Agrobacterium-ba

27

4.5. Háromszülős keresztezések eredményei

Ezen keresztezéshez az elkészített konstrukciót tartalmazó sejteket (donor), az A. vitis

AT1-et (recipiens) és a PP4304 jelű törzset (helper) használtuk. Kanamicin és rifampicin

tartalmú lemezeken vártuk a mutáns törzsek megjelenését. A csak rifampicint tartalmazó

lemezekre a recipiens sejtszám meghatározásához volt szükség. Azonban a kísérletek nem

jártak sikerrel. Nem kaptunk kanamicin-rezisztens telepeket a kísérlet többszöri megismétlése,

illetve a transzformáció során hosszabb ideig tartó inkubáció alkalmazása esetén sem.

Úgy tűnt, hogy ez a konjugációs rendszer nem működik az AT1-es törzsben, holott az A.

tumefaciens C58-ban (amiben régóta alkalmaztuk ezt a rendszert) nagy számban keletkeznek

mutáns baktériumok. A kudarcnak több oka lehetett. Az AT1-es elég rosszul nő; a C58

törzzsel összehasonlítva legalább egy nagyságrenddel alacsonyabb sejtszámot produkál. A

lassú növekedés miatt az E. coli törzsek túlnövik. Lehetséges, hogy nem zajlik le a

konjugáció, degradálódik a bejutott DNS, vagy nem történik meg a homológ rekombináció.

Ezért próbát tettünk egy másik konjugációs rendszerrel is, melyben olyan plazmidot

használtunk, ami tetraciklin rezisztenciát hordoz és képes replikálódni agrobaktériumban.

Kíváncsiak voltunk, hogy ezzel a rendszerrel lehet-e transzkonjugánsokat kapni, és ha igen,

milyen hatásfokkal. Ehhez a PP211-es helper törzset és a PP2815-ös donort használtuk, ami

egy P1 inkompatibilitási csoportba tartozó konjugatív plazmid. Ugyanúgy növesztettük fel és

készítettünk belőlük szuszpenziót, mint az eredeti keresztezésnél. Hogy növeljük a siker

esélyét, az AT1-ből töményebb szuszpenziót készítettünk és háromszor nagyobb mennyiséget

vittünk fel belőle a konjugatív lemezre a keresztezéshez. Ezt is 28°C-on inkubáltuk egy napig.

Ennél a kísérletnél a szelektív TA mellett GTS (minimál) lemezeket is használtunk. A

lemezeket 3 napig inkubáltuk 28°C-on. Az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza:

6. táblázat: A kontroll keresztezések eredményei

A. tumefaciens C58 A. vitis AT1

Recipiens sejtszám

(sejt/ml)

GTS 4,7*109 5,6*10

7

TA Rif 4,2*109 1,8*10

7

Transzkonjugánsok

száma (sejt/ml)

GTS Km 1,862*108 1,62*10

5

TA Rif Tc 2,012*108 20

28

A keresztezés érdekes eredményt hozott. Keletkeztek transzkonjugáns telepek az AT1 és a

C58 esetében is, ami bizonyítja, hogy lezajlott a konjugáció és a bejutott plazmid nem

degradálódott az AT1 törzsben sem. A C58-as törzsbe a plazmid jó hatásfokkal bejut. Az

adatokból kiszámolható, hogy minden 20-25-ik sejt transzkonjugáns lesz. Táptalaj

szempontjából nincs jelentős különbség a GTS és a TA között.

Az AT1-es törzsnél – feltehetően a gyengébb növekedés miatt – megfigyelhető a jóval

(két nagyságrenddel) alacsonyabb recipiens sejtszám, a C58-hoz viszonyítva, mindkét

táptalajon. Transzkonjugánsok legfeljebb elenyésző számban számolhatók TA táptalajon, míg

GTS-en számottevő számú telepet kaptunk, bár ez a mennyiség két nagyságrenddel kevesebb

a recipiens sejtszámnál. Azt nem értjük, hogy miért van ez; elméletileg egyforma

nagyságrendben kellene telepeket kapnunk a TA és GTS lemezeken is. Talán a rifampicin és a

tetraciklin együttes hatása okozza az eltérést. Sajnos idő hiányában nem tudtunk alaposabban

utánajárni. Számításaink szerint a GTS táptalajon körülbelül minden 345-ik sejt lesz

transzkonjugáns. Egy esetleges restrikciós rendszer jelenléte nem bizonyított, hiszen akkor

sok nagyságrendes csökkenést kellene tapasztalnunk. Ez az eredmény arra ösztönzött minket,

hogy újra megpróbáljuk az eredeti keresztezést és a mutáns AT1-es előállítását, ezúttal GTS

táptalajon. Ennek eredményeit a 7. táblázat tartalmazza.

7. táblázat: A keresztezések adatai

A. vitis AT1

Recipiens sejtszám (sejt/ml): GTS 4,96*108

TA Rif 3,44*108

Transzkonjugánsok (sejt/ml): GTS Km 0

TA Rif Km 0

Ez a keresztezés sem sikerült, nem kaptunk egyetlen transzkonjugáns telepet, még a

valamivel magasabb recipiens sejtszám dacára sem. Ebben a keresztezésben a konjugáció

után még egy homológ rekombinációnak kell történnie, aminek kis valószínűsége újabb

nagyságrendekkel redukálja a baktériumok számát.

Az AT1-es relatíve alacsony sejtszáma, a transzfer rosszabb hatásfoka és a homológ

rekombináció lezajlásának kis valószínűsége együtt olyan alacsonyra csökkenti a

transzformáns sejtszámot, amit az alkalmazott módszerekkel nem tudtunk kimutatni.

29

Feltételezhetően ahhoz, hogy rekombinánst kapjunk, legalább két nagyságrenddel növelni

kellene a recipiens sejtszámot. Ehhez több dolgot is meg lehet próbálni:

- megváltoztathatjuk a donor/recipiens arányát,

- megnyújthatjuk az inkubációt a konjugatív, nem szelektív táptalajon,

- átvizsgálhatunk több baktériumot, több tucat petricsészét alkalmazva.

30

5. Összefoglalás

Az Agrobacterium vitis egy növénypatogén talajbaktérium, mely sebzési helyen fertőzi a

szőlőt. A szőlő genetikai módosításon esik át, melynek során a baktérium Ti-plazmidjából a

T-DNS beépül a növényi genomba. Ehhez kromoszómális és a Ti-plazmidon kódolt

virulencia gének is szükségesek. A folyamatot a sebzett növényi sejtből felszabaduló

fenolvegyületek, monoszacharidok és az alacsony extracelluláris pH érzékelése indítja el. Az

érzékelési folyamat központi eleme a VirA nevű integráns membránfehérje, mely

autofoszforilációs aktivitással rendelkezik. A T-DNS növényi genomba juttatásának teljes

folyamatát ez a fehérje indítja el, így kulcsfontosságú avirulens törzsek létrehozásában.

Munkánk során először a rokon Agrobacterium törzsekből származó virA

génszekvenciákban konzerválódott részeket kerestünk és primert terveztünk rájuk. Két

törzsből (A. vitis AT1 és Tm4) sikerült virA szekvenciarészletet felsokszoroznunk. Ezeket

klónoztuk, majd meghatároztuk a bázissorrendjüket és összehasonlítottuk közeli rokon

fajokkal. Kiderült, hogy a Tm4 jelű törzs szekvenciája nagyon nagymértékben azonos az A.

vitis S4 törzsével (melynek teljes genomszekvenciája ismert és az interneten szabadon

hozzáférhető). A másik törzs, az A. vitis AT1 esetében láthattuk, hogy az izolált virA

szekvencia kevésbé azonos az ismert törzsek virA szekvenciájával. Az A. tumefaciens AB2/73

törzsben található szekvenciával 76% azonosságot találtunk. A kisebb hasonlatosság miatt ezt

a törzset választottuk további munkára.

Annak érdekében, hogy vizsgálhassuk a virA gén funkcióját és megismerhessük a gén

teljes szekvenciáját, célul tűztük ki a gén elrontását egy kanamicin-rezisztencia gén

beépítésével.

Munkánkhoz először primereket terveztünk, melyekkel bevihettünk egy új restrikciós

hasítóhelyet a korábbi munkánk során izolált génszekvencia-részletbe. A kanamicin-

rezisztencia gén beépítése után a konstrukciót homológ rekombinációval terveztük

visszajuttatni az AT1 törzsbe. Azonban ez nem sikerült többszöri próbálkozásra sem.

Ekkor egy másik konjugációs rendszert próbáltunk ki, hogy ellenőrizzük, le tud-e

egyáltalán zajlani a konjugáció. Ez a másik plazmid bejutott a baktériumba és fenn is maradt,

vagyis a konjugáció le tud zajlani, bár kisebb valószínűséggel és a bejutott DNS-t nem

degradálta semmilyen restrikciós enzim.

A mutáns baktérium előállítása talán lehetséges a kísérlet egyes paramétereinek

megváltoztatásával.

31

6. Irodalomjegyzék

BANTA LM, JOERGER RD, HOWITZ VR, CAMPBELL AM, BINNS AN. 1994. Glu-255 outside

the predicted ChvE binding site in VirA is crucial for sugar enhancement of

acetosyringone perception by Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol. 176:3242–49

BARON C, and ZAMBRYSKI PC. 1995. The plant response in pathogenesis, symbiosis and

wounding: variations on a common theme? Annu. Rev. Genet. 29:107–29

BINNS, A., and THOMASHOW, M. 1988. Cell Biology of Agrobacterium infection and

transformation of plants. Annu. Rev. Microbiol. 42:575-606.

BRAUN AC. 1952. Conditioning of the host cell as a factor in the transformation process in

crown gall. Growth 16:65–74

BRENCIC A, XIA Q, WINANS SC. 2004. VirA of Agrobacterium tumefaciens is an intradimer

transphosphorylase and can actively block vir gene expression in the absence of phenolic

signals. Mol. Microbiol. 52:1349–62

BRENCIC A. and WINANS S. 2005. Detection and response to signals involved in host-microbe

interactions by plant-associated bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69:155–94

BULLOCK WO, FERNENDEZ JM, SHORT JM. 1987. Xl1-blue: A high efficiency plasmid

transforming RecA Es. Biotechniques 5: 376-9

BURR, T. J., REID, C. L., YOSHIMURA, M., MOMOL, E. A., and BAZZI, C. 1995. Survival and

tumorigenicity of Agrobacterium vitis in living and decaying grape roots and canes in soil.

Plant Dis. 79:677-682.

BURR, T. J., BAZZI, C., SULE, S., and OTTEN, L. 1998. Crown gall of grape: biology of

Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies. Plant Dis. 82:1288-

1297.

BURR, T. J., and OTTEN, L. 1999. Crown gall of grape: biology and disease management.

Annu. Rev. Phytopathol. 37:53-80.

CANGELOSI GA, ANKENBAUER RG, NESTER EW. 1990. Sugars induce the Agrobacterium

virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6708–12

CHANG CH. and WINANS SC. 1992. Functional roles assigned to the periplasmic, linker, and

receiver domains of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein. J. Bacteriol. 174:7033–

39

CHANG CH. and WINANS SW. 1996. Resection and mutagenesis of the acid pH-inducible P2

promoter of the Agrobacterium tumefaciens virG gene. J. Bacteriol. 178:4717–20

32

DIXON RA, ACHNINE L, KOTA P, LIU CJ, REDDY MSR, WANG L. 2002. The phenylpropanoid

pathway and plant defense—a genomics perspective. Mol. Plant Pathol. 3:371–90

FARRAND, S.K., VAN BERKUM, P.B., and OGER, P., 2003. Agrobacterium is a definable genus

of the family Rhizobiaceae. Int. J. System. Evol. Microbiol., 53, 1681–1687.

GAO R. and LYNN DG. 2005. Environmental pH sensing: resolving the VirA/VirG two

component inputs for Agrobacterium pathogenesis. J. Bacteriol. 187:2182–89

HOLMES, B., and ROBERTS, P., 1981. The classification, identification and nomenclature of

agrobacteria. J. Appl. Microbiol., 50, 443–467.

INOUE, H., NOJIMA, H. and OKAYAMA, H. (1990): High efficiency transformation of

Escherichia coli with plasmids. Genetics, 96, 23-28.

ISH-HOROVICZ D, and BURKE JF. 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res.

9: 2989-98

JIN S, ROITSCH T, ANKENBAUER RG, GORDON MP, NESTER EW. 1990. The VirA protein of

Agrobacterium tumefaciens is autophosphorylated and is essential for vir gene regulation.

J. Bacteriol. 172:525–30

KERSTERS, K., and DE LEY, J., 1984. Genus III, Agrobacterium, in: Krieg, N.R., Holt, J.G.

(Eds.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1, The Williams & Wilkins Co.,

Baltimore 244–254.

KLEE HJ, WHITE FF, IYER VN, GORDON MP, NESTER EW. 1983. Mutational analysis of the

virulence region of an Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. J. Bacteriol. 153:878–83

KRIMI Z, PETIT A, MOUGEL C, DESSAUX Y, NESME X. 2002. Seasonal fluctuations and

longterm persistence of pathogenic populations of Agrobacterium spp. in soils. Appl.

Environ. Microbiol. 68:3358–65

LEE K, DUDLEY MW, HESS KM, LYNN DG, JOERGER RD, BINNS AN. 1992. Mechanism of

activation of Agrobacterium virulence genes: identification of phenol-binding proteins.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8666–70

LEE YW, JIN S, SIM WS, NESTER EW. 1995. Genetic evidence for direct sensing of phenolic

compounds by the VirA protein of Agrobacterium tumefaciens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

92:12245–49

LEE YW, JIN S, SIM WS, NESTER EW. 1996. The sensing of plant signal molecules by

Agrobacterium: genetic evidence for direct recognition of phenolic inducers by the VirA

protein. Gene 179:83–88

33

LI L, JIA Y, HOU Q, CHARLES TC, NESTER EW, PAN SQ. 2002. A global pH sensor:

Agrobacterium sensor protein ChvG regulates acid-inducible genes on its two

chromosomes and Ti plasmid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:12369–74

LOHRKE SM, YANG H, JIN S. 2001. Reconstitution of acetosyringone-mediated Agrobacterium

tumefaciens virulence gene expression in the heterologous host Escherichia coli. J.

Bacteriol. 183:3704–11

MEADE HM, LONG SK, RUVKUN GB, BROWN SE, AUSUBEL FM. 1982 Physical and genetic

characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by

transposon Tn5 mutagenesis. J Bacteriol 149: 114-22

MELCHERS LS, REGENSBURG-TU¨INK TJG, BOURRET RB, SEDEE NJA, SCHILPEROORT RA,

HOOYKAAS PJJ. 1989. Membrane topology and functional analysis of the sensory protein

VirA of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J. 8:1919–25

MCCULLEN C.A. and BINNS A., 2006. Agrobacterium tumefaciens and Plant Cell Interactions

and Activities Required for Interkingdom Macromolecular Transfer. Annu. Rev. Cell Dev.

Biol. 22:101–27

MURUGESAN, S., MANOHARAN, C., VIJAYAKUMAR, R., and PANNEERSELVAM, A., 2010.

Isolation and characterization of Agrobacterium rhizogenes from the root nodules of some

leguminous plants. Int. J. Microbiol. Res., 1, 92–96.

OPHEL, K., and KERR, A., 1990. Agrobacterium vitis sp. nov. for strains of Agrobacterium

biovar 3 from grapevines. Int. J. System. Bacteriol., 40, 236–241.

OROSZ L, SVAB Z, KONDOROSI A, SIK T. 1973. Genetic studies on Rhizobiophage 16-3.

Genes and functions on the chromosome. Mol. Gen. Genet. 125: 341- 50

OTTEN, L., DERUFFRAY, P., MOMOL, E. A., MOMOL, M. T., and BURR, T. J. 1996. Phylogenetic

relationships between Agrobacterium vitis isolates and their Ti plasmids. Mol. Plant-

Microbe Interact. 9:782-786.

PALMER AG, GAO R, MARESH J, ERBIOL WK, LYNN DG. 2004. Chemical biology of

multihost/ pathogen interactions: chemical perception and metabolic complementation.

Annu. Rev. Phytopathol. 42:439–64

PAN SQ, CHARLES T, JIN S, WU Z, NESTER EW. 1993. Preformed dimeric state of the sensor

protein VirA is involved in plant-Agrobacterium signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 90:9939–43

PRATT, C., and POOL, R. 1981. Anatomy of recovery of canes of Vitis vinifera L. from

simulated freezing injury. Am. J. Enol. Vitic. 32:223-227.

34

SAMBROOK J, FRITSCH E. F, MANIATIS T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual -

2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press

SANGWAN RS, BOURGEOIS Y, BROWN S, VASSEUR G, SANGWAN-NORREEL B. 1992.

Characterization of competent cells and early events of Agrobacterium-mediated genetic

transformation of Arabidopsis thaliana. Planta 188:439–56

SHIMODA N, TOYODA-YAMAMOTO A, NAGAMINE J, USAMI S, KATAYAMA M, ET AL. 1990.

Control of expression of Agrobacterium vir genes by synergistic actions of phenolic signal

molecules and monosaccharides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6684–88

SHIMODA N,TOYODA-YAMAMOTO A, SHINSUKE S, MACHICA Y. 1993. Genetic evidence for an

interaction between the VirA sensor protein and the ChvE sugar-binding protein of

Agrobacterium. J. Biol. Chem. 268:26552–58

STACHEL SE, MESSENS E, VAN MONTAGU M, ZAMBRYSKI P. 1985. Identification of the signal

molecules produced by wounded plant cells that activateT-DNA transfer in Agrobacterium

tumefaciens. Nature 318:624–29

STACHEL SE, NESTER EW. 1986. The genetic and transcriptional organization of the vir

region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J. 5:1445–54

TOYODA-YAMAMOTO A, SHIMODA N, MACHIDA Y. 2000. Genetic analysis of the signal

sensing region of the histidine protein kinase VirA of Agrobacterium tumefaciens. Mol.

Gen. Genet. 263:939–47

TURK SCHJ, VAN LANGE RP, REGENSBURG-TUINK TJG, HOOYKAAS PJJ. 1994. Localization of

the VirA domain involved in acetosyringone-mediated vir gene induction in

Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol. Biol. 25:899–907

WANG Y, GAO R, LYNN DG. 2002. Ratcheting up vir gene expression in Agrobacterium

tumefaciens: coiled-coil in histidine kinase signal transduction. Chembiochem 3:311– 17

WATSON, B., CURRIER, T.C., GORDON, M.P., CHILTON, M-D. et al., 1975. Plasmid required for

virulence of Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol., 123, 255–264.

WINANS SC. 1990. Transcriptional induction of an Agrobacterium regulatory gene at tandem

promoters by plant-released phenolic compounds, phosphate starvation, and acidic growth

media. J. Bacteriol. 172:2433–38

WISE AA, VOINOV L, BINNS AN. 2005. Intersubunit complementation of sugar signal

transduction inVirA heterodimers and posttranslational regulation of VirA activity in

Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol. 187:213–23

WOLANIN PM, THOMASON PA, STOCK JB. 2002. Histidine kinases: key signal transducers

outside the animal kingdom. Genome Biol. 3:1–8

35

ZUPAN, J., MUTH, T., DRAPER, O., and ZAMBRYSKI, P. 2000. The transfer of DNA from

Agrobacterium tumefaciens into plants: A feast of fundamental insights. Plant J. 23:11-28.

36

7. Köszönetnyilvánítás

Munkámat a PTE Természettudományi Kar, Biológiai Intézet, Genetikai es Molekuláris

Biológiai Tanszékén végeztem. Hálával tartozom a tanszék összes dolgozójának, hogy

megfelelő hátteret biztosítottak terveim megvalósításához.

37

8. Mellékletek

15. ábra: a meghatározott virA szekvencia A. vitis AT1 törzsből

>4694contig

ggcttgaagcagttggtacacttgcaggaggcatagcgcacgaattcaacaacattcttggggtaattctcggctacgccgaaatggcacaaaacattctacaccgc

cgcacttacgctcgacactacatcgatcgcatcaatgctgaaagcaatcgagcgagactgattattgatcagattcttgcgcttagccggcgacgtgaacggacagc

aaggccgttcaacctgtcggcgttggtgagggagattgcaccttcgttacgtgttgcgctgccttcagaggtggaggtcgatttcaatattcaaagcgctcagatgatt

gtcgaaggaaatccgctcgaaattgagcagatactgatgaacctgtgtaagaacaccgcagcggcttgtataggctccgggcgtatcgaggtcagcgtctatagat

cgtttgtatggaagcataaggtacttgcgaacggcacgatacccgctggcgattacatccttctttcagttgaggataacggtggaggcataggcgaagccgcattg

ccacatatttttgagcctttttttaccacgcgcgcgcaatgcggcggcactgggctggggctctccaccgtgcacggccacgtcagcgcaatggcgggttttgtcgat

gtgatctcaactgttggcagaggtacgcgctttgacatttatctccctc

A felsokszorozásra használt primereket aláhúzással jeleztük

16. ábra: a meghatározott virA szekvencia A. vitis TM4 törzsből

>4691contig

gtgaaatgcagcttatggaactggcggctgggtgtgttagccactatacggtcattaggcgcaagcaatcccagcgagatattctagaacgtcgtttaaaacatgcgg

aacggcttgaagcagttggtacgctcgccggcggcattgcccatgaattcaacaacattttaggtgcagttctcggttacgctgaaatggcgcacaacgttctgcgcc

gccgtactcatgctcgcgactatatcgatcacatcatttccgaaggcaatcgagcgcggttaatcgtcaaccagatccttgcccttagtcgaaagcgtgaccgaacaa

caaaaccattcgatctttcggaattggtgacggtaatcgcgccgtcgttacgggttgggttgcctccgggcgtcgagctcgattttgaatttcatggccatccaatggtt

gtcgaagccaacccacttgagatcgagcagatactgatgaatttgtgcaaaaattccgctgaagcatgcttaggatcagggcgtgtggaggtcagcgcaagaaggt

ctatcataaggaagtacaaggtgcttgcgagcggaaccattcccaccggtgagtatgtccttctttcagtcgaggacaacggcgcaggcataacagaggacgcact

accgcacattttcgagcctttcttcactactcgcgcccgcagcggtggcacgggcttgggattatccacggttcacggtcacgttagcgctatggctggttacatcgac

gtggtatcaattgtcggcaggggtacgcgcttcgacctctacctgccaccttcatcgaagcagcctgtaaattcacagagtttttttgagcctggaagaatcccgctcg

ggaacggagagattgtcgcggtggtcgaacccgacattgcgacgctggaaaggtacgaggagatgatcgcggcgctcggctatgaaccagtcggctttaacacg

ttgaatggtctaatcgactgggtgttggaaggtaaagaacctgatcttgttctaattgaccaaccgtcttttctggat

A felsokszorozásra használt primereket aláhúzással jeleztük

38

9. Hallgatói nyilatkozat

14/1. számú melléklet

NYILATKOZAT854

az írásmű eredetiségéről

Alulírott Radványi Attila (Neptun-kód: W02EYU), büntetőjogi felelősségem tudatában kijelentem,

hogy

A virA szekvenciák azonosítása Agrobacterium vitis törzsekből

című írásomban foglaltak saját, önálló munkám eredményei, ennek elkészítéséhez kizárólag a

hivatkozott forrásokat (szakirodalom, eszközök stb.) használtam fel, írásomat a Pécsi

Tudományegyetem vonatkozó szabályzatainak betartásával készítettem.

Tudomásul veszem, hogy a szerzői jogi szabályok betartását a Pécsi Tudományegyetem

plágiumkereső rendszeren keresztül ellenőrizheti.

Pécs, 2017. május ______

____________________________________

hallgató aláírása

_______________________

854 A módosítást a Szenátus 2015. december 17-ei ülésén fogadta el. Hatályos 2015. december 18. napjától.