ปัญหาพ ิเศษ - Chem ku-kpschem.flas.kps.ku.ac.th/SLIDE/OTHER/2016-SPC59-EXAMPLE.pdf · 2016-05-10 · ตัวอย่างตัวเล่มปัญหาพ

ตวอยางตวเลมปญหาพเศษ (ดดแปลงจากเนอหาจรง)

ปญหาพเศษ

การศกษาฤทธการตานอนมลอสระของสารสกดหยาบพอลแซกคาไรดจาก

เสนใยของเชอเหดตบเตา

Study on Antioxidant Activity of Crude Polysaccharides from

Mycelia of Boletus colossus Heim.

นางสาวพรพมล กจวชา

โครงการจดตงภาควชาเคม คณะศลปศาสตรและวทยาศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

พ.ศ. 2558


ใบรบรองปญหาพเศษ

โครงการจดตงสายวชาเคม คณะศลปศาสตรและวทยาศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

วทยาศาสตรบณฑต

ปรญญา

เคม สาขา

โครงการจดตงภาควชาเคม ภาควชา

เรอง การศกษาฤทธการตานอนมลอสระของสารสกดหยาบพอลแซกคาไรดจากเสนใยของเชอเหดตบเตา

Study on Antioxidant Activity of Crude Polysaccharides from Mycelia of Boletus colossus Heim.

นามผวจย นางสาวพรพมล กจวชา

ไดพจารณาเหนชอบโดย

ประธานกรรมการ ( อาจารยวนเพญ เหลาศรไพบลย, Ph.D. )

กรรมการ ( อาจารยนงพงา จรสโสภณ, ปร.ด.. )

โครงการจดตงสายวชาเคม คณะศลปศาสตรและวทยาศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตรรบรองแลว

( ผชวยศาสตราจารยฐตยา แซปง, Ph.D. )

ประธานคณะกรรมการดาเนนงานโครงการจดตงสายวชาเคม วนท เดอน พ.ศ.


ปญหาพเศษ

เรอง

การศกษาฤทธการตานอนมลอสระของสารสกดหยาบพอลแซกคาไรดจากเสนใยของเชอเหดตบเตา


โดย

นางสาวพรพมล กจวชา

เสนอ

โครงการจดตงสายวชาเคมคณะศลปศาสตรและวทยาศาสตรมหาวทยาลยเกษตรศาสตร เพอความสมบรณแหงปรญญาบตรวทยาศาสตรบณฑต (เคม)

พ.ศ. 2558


พรพมล กจวชา 2558: การศกษาฤทธการตานอนมลอสระของสารสกดหยาบพอลแซกคา

ไรดจากเสนใยของเชอเหดตบเตาปรญญาวทยาศาสตรบณฑต (เคม) โครงการจดตง

ภาควชาเคม ประธานกรรมการทปรกษา: อาจารยวนเพญ เหลาศรไพบลย, Ph.D. 56

หนา

สรปเนอหาของปญหาพเศษ วาทาอะไร มจดประสงคอะไร ดวยวธอะไร ไดผลอยางไร ใน 1 ยอหนา (ไมควรมรป ตาราง หรอการอางอง)

การศกษาสารสกดหยาบจากเสนใยเชอเหดตบเตาเพอใชเปนสารตานอนมลอสระ โดยสกดเสนใยเชอเหดตบเตาดวยโดยการสกดเยนดวยวธการหมกและการสกดรอนดวยวธการกลนแบบไหลกลบจากนนนามาตกตะกอนพอลแซกคาไรดดวย 95% เอทานอล สารสกดทไดแยกไดเปน 4 ประเภท คอ พอลแซกคาไรดสกดเยน นาสกดเยน พอลแซกคาไรดสกดรอน และนาสกดรอน จากนนทดสอบความสามารถในการตานอนมลอสระโดยวธ DPPH radical scavenging capacity และวธ Reducing power ผลการทดสอบพบวาจากนาสกดรอนมความสามารถในการตานอนมลอสระไดดทสด (IC50 = 85.59 μg/mL) และมความสามารถในการเปนตวรดวซไดดทสด จากการวเคราะหโครงสรางสารโดยวธฟเรยรทรานฟอรมอนฟราเรดสเปกโทรสโกป พบวา สารสกดทง 4 สวน เปนสารประกอบพอลแซกคาไรด ทมทง α-configuration และ β-configuration ซงจากผลการทดลองนสรปไดวาสารสกดจากเสนใยเชอเหดตบเตามศกยภาพในการใชเปนสารตานอนมลอสระจากธรรมชาตได

/ /

ลายมอชอนสต ลายมอชอประธานกรรมการ


Pornpimol Kitwicha 2015: Study on Antioxidant Activity of Crude Polysaccharides from Mycelia of Boletus colossus Heim., Bachelor of Science (Chemistry), Department of Chemistry. Special Problem Advisor: Ms. Wanpen Laosripaiboon, Ph.D. 56 p.

This study was to investigate the inhibitory effect of crude extracts from Boletus colossus Heim. on antioxidant activity. The mycelia of Boletus colossus Heim. was extracted with deionized water. Two methods of extractions: cold extraction by maceration and hot extraction by reflux were carried out. Polysaccharides were precipitated from the aqueous solution by 95% ethanol. There were four fractions of crude extracts: cold water polysaccharide extract, cold water extract, hot water polysaccharide extract and hot water extract. DPPH radical scavenging capacity assay and the reducing power assay had been used to evaluate the antioxidant activities. Hot water extract showed the highest activity of DPPH inhibition (with IC 5085.59 μg/mL)and reducing power. Analysis of these extracts by FT-IR showed the spectra of polysaccharide compounds in α and β-

configurations. Therefore, these results indicated that all crude extracts from B. colossum Heim. mycelia could potentially be used as natural antioxidants.

/ /

Student’s signature Advisor’s signature


กตตกรรมประกาศ

ขอขอบพระคณอาจารยวนเพญ เหลาศรไพบลย อาจารยทปรกษาปญหาพเศษทกรณาให

ความร คาแนะนา คาปรกษา ตลอดระยะเวลาในการทาปญหาพเศษครงน และขอบพระคณ

คณะกรรมการปญหาพเศษและคณาจารยทกทานทใหคาแนะนาในการแกไขรายงานปญหาพเศษ

ขอขอบคณเจาหนาทโครงการจดตงภาควชาเคม คณะศลปศาสตรและวทยาศาสตรทกทาน

ทใหความชวยเหลอในเรองของอปกรณการทดลอง สารเคม และเครองมอตางๆ

ขอขอบคณเพอนๆ ทกทานทใหความชวยเหลอ ใหคาปรกษา และคอยเปนกาลงใจใหในการ

การทาปญหาพเศษ

ทายสดขอขอบคณบดา มารดา ทคอยใหกาลงใจ และชวยเหลอสนบสนนในการศกษาเปน

อยางดตลอดมา

พรพมล กจวชา

พฤษภาคม2558

i


สารบญ

หนา

สารบญ i

สารบญตาราง ii

สารบญภาพ iii

คาอธบายสญลกษณ คายอ และอกษรยอทใช iv

คานา 1

วตถประสงค 3

การตรวจเอกสาร 4

งานวจยทเกยวของ 4

อปกรณและวธการ 6

อปกรณและสารเคม 6

วธการ 7

สถานทและระยะเวลาทาการวจย 9

ผลและวจารณผล 11

การสกดสารจากเชอเหดตบเตา 11

การหาปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมด 18

สรปและขอเสนอแนะ 21

เอกสารและสงอางอง 22

ภาคผนวก 23

ภาคผนวก ก) การเตรยมสารเคม 24

ประวตการศกษา และการทางาน 27

ii


สารบญตาราง

หนา

ตารางท 1 สวนตางๆทสกดไดจากเหดตบเตา 13

ตารางท 2 เปอรเซนตการยบยงอนมลอสระ DPPH 15

ตารางท 3 ปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกดหยาบ 19

iii


สารบญภาพ

หนา

ภาพท 1 เหดตบเตาทโตเตมท 2

ภาพท 2 เปอรเซนตการยบยงอนมลอสระ 16

ภาพท 3 กลไกการเกดปฏกรยา 20

ภาพท 4 IR สเปกตรมของสารสกดหยาบ 20

iv


คาอธบายสญลกษณ คายอ และอกษรยอทใช

UV = ultraviolet VIS = visible FTIR = Fourior Transform Infrared PDA = potato dextrose agar PDB = Potato dextrose broth DPPH = 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

1


การศกษาฤทธการตานอนมลอสระของสารสกดหยาบพอลแซกคาไรดจากเสนใยของเชอเหดตบเตา


คานา

กลาวถงพนฐานความเปนมา ปญหาและเหตผลททาการวจยโดยเนนความสาคญของงานททา อธบายวตถประสงคและขอบเขตทแนนอน ทฤษฎและแนวคด ประโยชนทจะไดจากการวจย ทงนตองไมคดลอกจากเนอหาของผอนแตใหเรยบเรยงเปนภาษาของตนเอง

ตงแตอดตมนษยรบประทานเหดกนอยางแพรหลายในทกชนชาตเนองจากรสชาตทอรอยและ

กลนทเปนเอกลกษณ ทาใหมการพฒนาการเพาะเหดจนเกดเปนอตสาหกรรมทมมลคาทางการตลาด

สง เหดทเปนทนยมและมมลคาทางการตลาด เชน เหดฟาง เหดนางฟา และ เหดหอม นอกจากจะ

นามาใชเปนอาหารไดแลว เหดหลายชนดยงมคณสมบตในการรกษาโรค ซงมาการนาไปใชกนในหลาย

ประเทศโดยเฉพาะแถบเอเชยตะวนออก เชน ประเทศจน ญปน เกาหล และรสเชยตะวนออก

การใชเหดในทางยานนแตโบราณใชวธสกดสารสาคญในเหดดวยนารอน ซงตอมาพบวาสาร

สกดเหลานเปนคารโบไฮเดรตพวกพอลแซกคาไรด โดยพอลแซกคาไรดทพบมากทสดในดอกเหดคอ

เบตากลแคน (ß glucans) ตอมาเมอนาพอลแซกคาไรดทเตรยมไดจากเหดเหลานมาทดสอบ

คณสมบตทางยาแลวพบวามคณสมบตหลายอยางทสามารถนามาใชในทางการแพทยและเภสชกรรม

ได เชน คณสมบตชวยตานมะเรงเนองอก ชวยกระตนภมคมกน ชวยใหแผลประสานและลดการตด

เชอ ชวยลดนาตาลในเลอด เปนตน คณสมบตการตานมะเรงของกลแคนจะออกฤทธไดดขนเมอใช

รวมกบการใชเคมบาบด (Chemotherapy) มการคนพบวาเหดอยางนอย 700 ชนด (species) จาก

182 สกล (Genera) สามารถสรางพอลแซกคาไรดทมคณสมบตเปนยาตานมะเรงได

เหดตบเตา (Bolete) เปนเหดพนบานของไทยมชอวทยาศาสตรคอ Boletus colossus

Heim.อยในวงศ Boletaceae ชอเรยกอนไดแก เหดหา เหดผง เหดเผง หรอเหดผงคราม หมวกเหดม

ลกษณะโคงนนรปกระทะควา เสนผาศนยกลางประมาณ 15 เซนตเมตร มขนละเอยด คลายกามะหย

สนาตาลดา เมอบานเตมทกลางหมวกเวาเลกนอย ผวสนาตาลดาเมอถกความชนจะลนมอ เนอส

2


เหลองออนหนา เมอดอกเหดบานเตมทจะเปลยนเปนสเหลองอมเขยวหรอเหลองอมนาตาล กานส

นาตาลดาใตหมวกลงมาสออนกวาเปนสนาตาลเหลองออนยาว 4-6 เซนตเมตร (ภาพท 1) ใช

รบประทานได เชอวามสรรพคณทางยาเชน เปนยาบารงหวใจ บารงกาลง บารงตบ บารงปอด

กระจายโลหต ดบพษรอนภายในรางกายบาบดอาการปวดหลง ปวดขอ ปวดเสนเอนและกระดก

ปองกนการชกกระตก คนจนใชเปนสมนไพร แกเคลดขดยอก และปวดกระดก

ภาพท 1 เหดตบเตาทโตเตมท

จากสรรพคณของเหดทกลาวมาขางตน จงทาใหผวจยเกดความสนใจทจะสกดสารพอล

แซกคาไรดจากเชอเหดตบเตา และนามาทดสอบฤทธการตานอนมลอสระ และศกษาเกยวกบ

คณสมบตของสารสกดทมฤทธทางชวภาพ

3


วตถประสงค

จดมงหมายของการวจย มขอบเขตทแนนอน (เชนระบแหลงทมา สายพนธ หรอกระบวนการทจาเพาะ) เขยนสน ๆ ใหไดใจความชดเจน

1. เพอศกษาคณสมบตของสารสกดหยาบพอลแซกคาไรดจากเสนใยเชอเหดตบเตา

2. เพอทดสอบฤทธตานอนมลอสระของสารสกดหยาบพอลแซกคาไรดจากเสนใยเชอเหด

ตบเตา

4


การตรวจเอกสาร

ทฤษฎทเกยวของโดยตรง (หากตองการใสขอมลความรทวไป รายละเอยดเกยวกบเทคนควธ หรอทฤษฎพนฐาน ควรใสในสวนของภาคผนวก) สรปขอมลหรอผลงานทมผทามาแลวเฉพาะสวนทมความสาคญตองานวจยน (ใชเพออางอง) ควรอานเอกสารใหเขาใจและเรยบเรยงขนใหมเปนสานวนของตวเองทกระชบ ถกตอง เขาใจงาย ไมลอกมา อยานาบทคดยอมาใส การอางองควรอางองจากตนฉบบหรองานทมความแรกเรม หากเปนเนอหาทแพรหลายอยแลวอาจอางองจากผเขยนทไดรบการยอมรบอยางแพรหลายในแวดวงนน

งานวจยทเกยวของ

จากการศกษาสรรพคณทางยาของเหดหงเกอกมา (Phellinus rimosus) ซงอยในวงศ

Hymenochaetaceae ซงมการนามาใชเปนสวนผสมในตารบยารกษามะเรง รกษาโรคเรม อาการ

ปวดห และอาการผนคนปวดรอน โดยเปรยบเทยบฤทธตานอนมลอสระและฤทธตานการกอกลาย

พนธของสารสกดจากเหดหงเกอกมาทสกดดวยเอทานอลนา และการสกดดวยสารละลายดาง

ทาการศกษาฤทธตานอนมลอสระโดยวธ 2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl radical assay (DPPH

assay) และ Ferric reducing antioxidant power assay (FRAP assay) รวมถงการศกษาฤทธตาน

การกอกลายพนธโดยวธ Ames test ซงทดสอบกบเชอแบคทเรย คอ Salmonella typhimurium

strain TA98 และ TA100 สารสกดทออกฤทธตานอนมลอสระ และฤทธตานการกอกลายพนธทด

ทสด คอ สารสกด P.rimosus โดยการสกดดวยเอทานอล (ชลดา 2555)

มการรายงานวาสารชโซไฟแลน (Schizophyllan) ซงเปนสวนหนงของสารสกดจากเหด

แครงเปนสารพอลแซกคาไรดทไมสามารถยอยสลายโดยเอนไซมในกระเพาะอาหารได ดงนนจงม

คณสมบตเปนสารทเรยกวา probiotics เปนอาหารของจลนทรยทมประโยชนในลาไสใหญไดเปน

อยางด ชวยใหระบบการยอยอาหารเปนไปอยางมประสทธภาพ รวมทงยงลดความเสยงการเกดมะเรง

ลาไสอกดวยและยงชวยลดคอเรสเตอรอลในเลอดอกดวย (Aida 2009)

Isabel และคณะ (2007) ไดรายงานการศกษาคณสมบตสารตานอนมลอสระของเหดสนส

แดง (Lactarius deliciosus) และเหดฟางอสราเอล (Tricholomaportentosum) โดยสกดสารจาก

หมวกเหดและกานดอกเหดดวยเมทานอล เพอหาความสามารถในการรดวซและความสามารถยบยง

อนมลอสระโดยวธทดสอบทางเคม และวดปรมาณฟนอลกทงหมดหาเพอประเมนผลตอฤทธตาน

5


อนมลอสระของสารสกดของเหดทงสอง และพบวาเหดทงสองชนดแสดงใหเหนวามศกยภาพของสาร

ตานอนมลอสระ แตเหดสนสแดงจะมฤทธมากกวาเหดฟางอสราเอล

อจฉราและจรเวท (2552) ไดศกษาชนดของนาตาลในดอกเหด โดยการสกดพอลแซกคาไรดจากดอกเหดตนแรด สกดดวยนารอนผสมเอทลแอลกฮอล ทอณหภม 95 องศาเซลเซยส และจาแนกชนดของนาตาล ดวยเครองโครมาโทกราฟฟของเหลวสมรรถนะสง ผลการสกดและจาแนกพอลแซกคาไรดของดอกเหดตนแรด 7 สายพนธ จากดอกเหดสด ไดนาตาลหลกเปนทรฮาโรส

อภชาตและประกตตสน (2551) ไดทาการศกษาฤทธทางชวภาพของสารประกอบเชงซอนพอลแซกคาไรด-โปรตน (polysaccharide-protein complex) ทสกดไดจากเสนใยของเหดตบเตาดา (Phaeogyroporus portentosus) ซงเปนเหดทนยมบรโภคอยางแพรหลายในประเทศไทยเรมตนดวยการสกดสารสกดหยาบจากเสนใยเหดดวยนารอน และตกตะกอนดวยเอทานอล ผลการทดลองยนยนวาสารประกอบเชงซอนทสกดไดจากเหดตบเตาดาเปนแหลงของสารทมฤทธตานอนมลอสระ และฤทธยบยงการเจรญของเซลลมะเรงทมศกยภาพในการพฒนาเปนผลตภณฑทางเภสชกรรมได

นฤมล (2557) ไดศกษาการนาเหดพนบานของไทยมาพฒนาเปนเวชสาอาง โดยทดสอบสารตานอนมลอสระในเหดกวา 10 ชนด พบวาเหดแครงมสารตานอนมลอสระมากกวาเหดอนๆ และสามารถนามาพฒนาสตรผลตภณฑบารงผวจากเหดแครงซงมคณสมบตชวยเพมความชมชนใหเซลลผวหนงได

รนฤดและคณะ (2549) จากการทดลองสกดพอลแซกคาไรดจากเหดกนไดมาใชทดสอบฤทธในการเปนสารแอนตออกซแดนทและการกาจดอนมลอสระ โดยเปนเหดพนบานในเมองไทย 4 ชนด และเหดยามาบชตาเกะ จากการศกษาคณสมบตของพอลแซกคาไรดสกดจากเหดทงหมด 5 ตวอยาง พบวา เหดทกชนดมสารทมฤทธเปนสารแอนตออกซแดนทและกาจดอนมลอสระในระดบทตางกนออกไป โดยเหดยามาบชตาเกะ (Hericium erinaceus) มประสทธภาพสงสด รองลงมาคอ เหดขอนขาว (L. polychrous) เหดแครง (S. commune BUB-1) และเหดผงหลวง (Boletus sp.) ตามลาดบ

6


อปกรณและวธการ

เฉพาะทจาเปนและสาคญตองานวจย อปกรณในหองปฏบตการทวไปไมจาเปนตองระบ ยกเวนมความจาเพาะ เชน กระดาษกรองเบอร 34

อปกรณและสารเคม

อปกรณและเครองมอ

1. เครอง UV-VIS spectrophotometer (T60 UV-Visible Spectrophotometer)

2. เครองระเหยแบบหมน (Rotary Evaporator, Buchi, R-210, Switzerland)

3. เครองปนเหวยง (Centrifuge, Sorval, RC26Plus, USA)

4. เครองฟเรยรทรานฟอรมอนฟราเรดสเปกโทรมเตอร (Fourier Transfrom Infrared

Spectrometer, FTIR, PerkinElmer, UATR Two)

5. แผนใหความรอน (Hot plate Stirrer, Beurer, Germany)

6. เครองชง 4 ตาแหนง (Mettler Toledo, PG802-S)

7. เครองวด pH (Sper Scientific, USA)

8. เครองทาแหงแบบแชแขง (Freeze Dryer, Snijders scientific type 2040)

9. ชดกรองสญญากาศ (Gast, DOA-P504-BN)

สารเคม

1. เอทานอล 95% (95% ethanol, C2H5OH)

2. เมทานอล (Methanol, CH3OH) (AR, QReC, New Zealand)

3. โซเดยมคลอไรด (Sodium chloride, NaCl) (Sigma-ALORICH, Switzerland)

4. กรดซลฟรก (Sulfuric acid) (Sigma-ALORICH, Switzerland)

5. โฟลนซโอแคลทรรเอเจนต (folin-ciocalteu reagent) (Carlo erba, France)

6. 3.6 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, C18H12N5O6) (Sigma-ALORICH,

Switzerland)

7


ตวอยางทใชในการศกษา

เชอเหดตบเตา (Boletus colossus Heim.) ไดรบความอนเคราะหจาก รศ.ดร. ประภาพร

ตงกจโชค ภาควชาพชสวน คณะเกษตรกาแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน

วธการ

วธดาเนนงานวจย การวางแผนการทดลอง อาจแบงเปนหวขอแยกใหชดเจน

1. การเตรยมเชอเหดตบเตา

นาเชอเหดตบเตาเลยงบนอาหารวน PDA เกบรกษาไวทอณหภมเฉลย 26-30 องศาเซลเซยส

และเปลยนถายเชอทก 1-2 เดอน เตรยมเชอเหดโดยยายเสนใยบรสทธจากสตอกเชอทเตรยมไว ลง

บนอาหารเชอพดเอใหมในจานเลยงเชอเพมปรมาณเชอเหดบมทอณหภมหองเปนเวลาประมาณ 28

วน ใชเครองมอเจาะจกคอรก เจาะเสนใยและอาหารเลยงวนบรเวณรอบนอกของโคโลนใหเปนชน

กลม สาหรบใชในการศกษาตอไป

2. การสกดสารจากเชอเหดตบเตา

นาสารละลายเชอเหดตบเตาทเลยงในอาหารเลยงเชอ PDB ปรมาตร 5 ลตร บมท

อณหภมหองเปนเวลาประมาณ 60-70 วน แยกเสนใยและของเหลวออกจากกนโดยการกรอง

สญญากาศ นาสวนทเปนเสนใยทกรองไดไปลางนาสะอาด ผงลมเยน ทาใหแหงโดยเครองทาแหงแบบ

แชแขงบดใหละเอยด เกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะนาไปสกดในขนตอไป

8


2.1 การสกดเยนโดยวธการหมก (Maceration) ดดแปลงจากวธของ Ming-Chi และคณะ

(2007) โดยนาเสนใยเชอเหดตบเตาบดแหง 10 กรม สกดดวยนาปราศจากไอออน 1 ลตร ทอณหภม

30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนกรองดวยกระดาษกรองเบอร 4 เพอแยกกากและ

สารละลาย นาสวนทเปนสารละลายไประเหยตวทาละลายออกโดยเครองระเหยแบบหมนจนเหลอ

ปรมาตร 200 มลลลตร จากนนนาสารละลายทเขมขนมาตกตะกอนพอลแซกคาไรด โดยการเตม

95% เอทานอล ปรมาตร 800 มลลลตร (4 เทา) ทงไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24

ชวโมง นาสารละลายไปปนเหวยงทความเรวรอบ 5,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ไดตะกอน

พอลแซกคาไรดและสารละลายใส นาสวนตะกอนพอลแซกคาไรดไปทาใหแหงโดยใชเครองทาใหแหง

แบบแชแขง และสวนสารละลายนาไประเหยตวทาละลาย 95% เอทานอล ออกโดยเครองระเหยแบบ

หมนและทาใหแหงโดยใชเครองทาใหแหงแบบแชแขง ไดสาร 2 สวน คอ พอลแซกคาไรดสกดเยน

และนาสกดเยน

2.2 การสกดรอนโดยวธการกลนแบบไหลกลบ ดดแปลงจากวธของ Ming-Chi et al. (2007)

โดยนาเสนใยเชอเหดตบเตาบดแหง 10 กรม สกดดวยนาปราศจากไอออน 1 ลตร ทอณหภม 95

องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 ชวโมง จากนนกรองดวยกระดาษกรองเบอร 4 เพอแยกกากและ

สารละลาย นาสวนทเปนสารละลายไประเหยตวทาละลายออกโดยเครองระเหยแบบหมนจนเหลอ

ปรมาตร 200 มลลลตร จากนนนาสารละลายทเขมขนมาตกตะกอนพอลแซกคาไรด โดยการเตม

95% เอทานอล ปรมาตร 800 มลลลตร (4 เทา) ทงไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24

ชวโมง นาสารละลายไปปนเหวยงทความเรวรอบ 5,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ไดตะกอน

พอลแซกคาไรดและสารละลายใส นาสวนตะกอนพอลแซกคาไรดไปทาใหแหงโดยใชเครองทาใหแหง

แบบแชแขง และสวนสารละลายนาไประเหยตวทาละลาย 95% เอทานอล ออกโดยเครองระเหยแบบ

หมนและทาใหแหงโดยใชเครองทาใหแหงแบบแชแขง ไดสาร 2 สวน คอ พอลแซกคาไรดสกดรอน

และนาสกดรอน

9


3. การทดสอบการตานอนมลอสระโดยวธ DPPH

3.1 DPPH radical scavenging capacity assay การทดสอบการตานอนมลอสระโดยวธ

DPPH ทดสอบโดยดดแปลงจากวธของ Maja et al. (2011) โดยนาสารละลาย DPPH ในเมทานอล

ความเขมขน 0.2 มลลโมลาร ปรมาตร 1 มลลลตร เตมในสารสกดทไดทง 4 สวนทความเขมขนตาง

25, 50, 100, 150, 200, 300 และ 400 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 2 มลลลตร บมไวท

อณหภมหองในทมดเปนเวลา 30 นาท วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 514 นาโนเมตร ดวย

เครอง UV-VIS Spectrophotometer เปรยบเทยบความสามารถในการกาจดอนมลอสระโดยใชสาร

มาตรฐานบวทลเลทเตดไฮดรอกซโทลอน (BHT) ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา คานวณหา

เปอรเซนตการตานอนมลอสระจาก

3.2 ความสามารถในการเปนตวรดวซ (Reducing Power) การทดสอบการตานอนมลอสระ

โดยวธ Reducing Power ทดสอบโดยดดแปลงจากวธของ Isabel และคณะ. (2007) นาสารสกดท

ไดทง 4 สวนทความเขมขนตาง 25, 50, 100, 150, 200, 300 และ 400 พพเอม 2.5 มลลลตร ผสม

กบโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร (ความเขมขน 200 มลลโมลาร พเอช 6.6) ปรมาตร 2.5 มลลตร และ

1% โดยมวลตอปรมาตร โพแทสเซยมเฟอรรคไซยาไนด ปรมาตร 2.5 มลลลตร ทาการบมทอณหภม

50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท หลงจากนนเตม 10% โดยมวลตอปรมาตร กรดไตรคลอโรอะซ

ตก ปรมาตร 2.5 มลลลตร นาสารผสมปนเหวยงท 650 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท นา

สารละลายในชนบน 5 มลลลตร เตมนาปราศจากไอออน 5 มลลลตร และ 0.1% โดยมวลตอปรมาตร

เฟอรรคคลอไรด ปรมาตร 1 มลลลตร วดคาการดดกลนแสงท 700 นาโนเมตร โดยใชบวทลเลทเตด

ไฮดรอกซโทลอน (BHT) เปนตวควบคมบวก (positive control) ความเขมขน 5, 10, 25, 50, 100,

150, 200, 300 และ 400 พพเอม ทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา คานวณเปอรเซนตความสามารถ

ในการเปนตวรดวซโดยใชสตร

สถานทและระยะเวลาทาการวจย

สถานท

หองปฏบตการเคม โครงการจดตงภาควชาเคม คณะศลปศาสตรและวทยาศาสตร

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จงหวดนครปฐม

10


ระยะเวลาในการทดลอง

ตงแตเดอนพฤศจกายน พ.ศ. 2557 – เดอนเมษายน พ.ศ. 2558

11


ผลและวจารณผล

ผลการทดลองคอขอมลทไดจากการวดหรอศกษาโดยตรง แสดงโดยใช ภาพ ตาราง กราฟ แผนผง ประกอบคาอธบาย วจารณผลการทดลอง คอการนาขอมลมาวเคราะหตอ และเชอมโยงกบวตถประสงค อธบายวาผลทไดเปนไปตามเปาหมายหรอสมมตฐานหรอไม คลายหรอตางจากงานอนอยางไร เพราะอะไร โดยใชทฤษฎหรอเหตผลประกอบทชดเจน และประโยชนทไดจากการทดลองน

ผลการทดลองในการศกษานแบงออกเปน 3 สวนไดแกการสกดสารจากเชอเหนตบเตา การ

วเคราะหสารทได การทดสอบสมบตของสาร

การสกดสารจากเชอเหดตบเตา

เมอบมเชอเหดตบเตาทอณหภมหองเปนเวลา 63 วน สารละลายใสสเหลองออนจะเปลยน เปนส

นาตาลเขมจนดา เราสามารถแยกเสนใยเชอเหดตบเตาและของเหลวออกจากกนโดยการกรอง จะได

ของเหลวสนาตาลเขมและเสนใยเชอเหดตบเตา เมอสกดสวนทเปนเสนใยเชอเหดตบเตาบดแหงดวย

ตวทาละลายนาปราศจากไอออน โดยการสกด 2 วธ ไดแกการสกดเยนโดยวธการหมก (Maceration)

และสกดรอนวธการกลนแบบไหลกลบ (Reflux) โดยการสกดเยนโดยวธการหมก (Maceration) ได

สารสกดสารละลายสนาตาลเขม เมอระเหยตวทาละลายออกโดยเครองระเหยแบบหมน นา

สารละลายทเขมขนมาตกตะกอนพอลแซกคาไรด โดยการเตม 95% เอทานอล (4 เทา) ทงไวท

อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง นาสารละลายไปปนเหวยง ไดสาร 2 สวน คอ พอล

แซกคาไรดสกดเยนและนาสกดเยน สวนการสกดรอนโดยวธการกลนแบบไหลกลบ (Reflux) จะได

สารสกดสารละลายสนาตาลเขม ระเหยตวทาละลายออกโดยเครองระเหยแบบหมน นาสารละลายท

เขมขนมาตกตะกอนพอลแซกคาไรด โดยการเตม 95% เอทานอล (4 เทา) ทงไวทอณหภม 4 องศา

เซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง นาสารละลายไปปนเหวยง ไดสาร 2 สวน คอ พอลแซกคาไรดสกดรอน

และนาสกดรอนโดยเปอรเซนตและสของสารสกดหยาบจากเสนใยเชอเหดตบเตาแสดงใน

12


ตารางท 1

13


ตารางท 1 สวนตางๆทสกดไดจากเหดตบเตา

สารสกดหยาบ เปอรเซนตสารสกดหยาบ สของสารละลาย

พอลแซกคาไรดสกดรอน 24.54 สนาตาลออน

นาสกดรอน 15.80 สนาตาลออน

พอลแซกคาไรดสกดเยน 20.19 สนาตาลเขม

นาสกดเยน 19.22 สนาตาลเขม

จากตารางท 1 พบวา ไดสารสกดทมลกษณะเปนของแขงสนาตาลเขม จะไดสารสกดทง 4

สวน คอ พอลแซกคาไรดสกดรอนและนาสกดรอน และพอลแซกคาไรดและนาสกดเยน โดยพอล

แซกคาไรดสกดรอนและนาสกดรอนมเปอรเซนตสารสกดหยาบเทากบ 24.54 และ 20.29 ตามลาดบ

พอลแซกคาไรดสกดเยนและนาสกดเยนมเปอรเซนตสารสกดหยาบเทากบ 15.80 และ 19.22

ตามลาดบ จากนนนาไปละลายดวยนาปราศจากไอออนเพอใชในการศกษาตอไป

การทดสอบความสามารถในการตานอนมลอสระ

จากการทดสอบความสามารถของสารสกดทง 4 สวนทความเขมขนตางๆ โดยวธ DPPH ซง DPPH

เปนเรดคล (radical) โดยปกตจะมสมวง เมอ DPPH ทาปฏกรยากบสารทมฤทธในการตานอนมล

อสระ สมวงของ DPPH จะกลายเปนสเหลอง โดยจะวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 514 นาโน

เมตร ดวยเครอง UV-Vis spectrometer และใชบวทเลเตดไฮดรอกซโทลอน (BHT) เปนตวควบคม

บวกพบวาไดผลดงแสดงใน

14



15


ตารางท 2 เปอรเซนตการยบยงอนมลอสระ DPPH

ความเขมขน

(μg/mL)

เปอรเซนตการยบยงอนมลอสระ DPPH

พอลแซกคาไรดสกดรอน

นาสกดรอน พอลแซกคาไรดสกดเยน

นาสกดเยน BHT

25 28.84±3.83 17.99±2.35 24.03±1.05 14.45±1.57 89.03±0.36

50 33.28±4.58 31.35±0.51 27.51±1.29 25.24±0.58 91.55±0.36

100 40.49±1.60 59.11±2.15 36.45±0.71 49.22±0.68 92.03±0.10

150 44.32±3.20 82.61±2.56 42.43±0.92 68.17±2.53 91.25±0.10

200 46.03±1.38 87.60±1.43 49.55±0.91 77.30±0.54 89.25±1.16

300 54.51±0.18 87.88±0.34 57.65±0.37 90.36±1.01 90.18±0.09

400 61.76±0.96 88.15±0.67 61.65±1.58 90.64±3.93 90.08±0.16

จาก

16


ตารางท 2 พบวาสารสกดทง 4 สวนทความเขมขน 25, 50, 100, 150, 200, 300 และ400

ไมโครกรมตอมลลลตร ใหผลการยบยงอนมลอสระ DPPH ไดด พอลแซกคาไรดสกดรอนความเขมขน

400 ไมโครกรมตอมลลลตร มเปอรเซนตการยบยงอนมลอสระสงทสดเทากบ 61.76 และเปอรเซนต

การยบยงอนมลอสระตาทสดทความเขมขน 25 ไมโครกรมตอมลลลตร เทากบ 28.84 นาสกดรอน

ความเขมขน 400 ไมโครกรมตอมลลลตร มเปอรเซนตการยบยงอนมลอสระสงทสดเทากบ 88.15

และเปอรเซนตการยบยงอนมลอสระตาทสดทความเขมขน 25 ไมโครกรมตอมลลลตร เทากบ 17.99

พอลแซกคาไรดสกดเยนความเขมขน 400 ไมโครกรมตอมลลลตร มเปอรเซนตการยบยงอนมลอสระ

สงทสดเทากบ 61.65 และเปอรเซนตการยบยงอนมลอสระตาทสดทความเขมขน 25 ไมโครกรมตอ

มลลลตร เทากบ 24.03 นาสกดเยนความเขมขน 400 ไมโครกรมตอมลลลตรจากขอมลตารางท 2 นา

คามาพลอตกราฟระหวางเปอรเซนตการตานอนมลอสระกบความเขมขนของสารสกดทง 4 สวนเพอ

หาคา IC50พบวาไดผลดงภาพท 2

(ก) (ข)

ภาพท 2 เปอรเซนตการยบยงอนมลอสระ

ความสามารถในการเปนตวรดวซ (Reducing power assay)

การทดสอบความสามารถในการเปนตวรดวซ ของสารสกดทง 4 สวนทความเขมขนตางๆ โดยวธ

Reducing power ซงเปนการศกษาความสามารถในการรดวซ หรอใหอเลกตรอนของสารสกดแก

สารอนมลอสระแลวทาใหเปลยนเปนสารทคงตว โดยวดปฏกรยารดกชนของ Fe3+(CN-)6 ไปเปน

Fe2+(CN-)6 ซงถาสารสกดมความสามารถในการรดวซไดมากจะทาใหสารละลายเปนสนาเงนเขมขน

ซงจะแสดงถงความสามารถในการตานออกซเดชนทด โดยจะวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน

17


700 นาโนเมตร ดวยเครอง UV-Vis spectrometer โดยใชบวทเลเตดไฮดรอกซโทลอน (BHT) เปน

สารละลายมาตรฐานเปรยบเทยบโดยทาการทดลองตวอยางละ 3 ซา และคานวณเปอรเซนต

ความสามารถในการเปนตวรดวซของสารสกดทง 4 สวน ซงไดผลดงแสดงใน

18



การหาปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมด

การหาปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมด (ภาพท 3) โดยนาสารสกดทง 4 สวนมาทดสอบ

กบ 10% Folin-Ciocalteu’s Phenol reagent ใชกรดแกลลกความเขมขน 5, 10, 25, 50, 100,

150 และ200 พพเอม เปนสารมาตรฐาน นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 725 นาโนเมตร

19


ตารางท 3 ปรมาณสารประกอบฟนอลกในสารสกดหยาบ

สารสกดหยาบ ปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมด

(mg กรดแกลลก/g สารสกดหยาบ)

พอลแซกคาไรดสกดรอน 21.03±0.96

นาสกดรอน 69.66±1.47

พอลแซกคาไรดสกดเยน 47.28±2.80

นาสกดเยน 62.30±1.91

จากสเปกตรมอนฟราเรดสเปกโทสโกปของสารสกดซงแสดงในภาพท 4 พบวาสเปกตรมสาร

สกดทง 4 สวนใหผลการทดลองทมแนวโนมในทางดยวกน คอ พบหมฟงกชนท1000-1200 cm-1

(pyranose ring), 3200-3400 cm-1 (O-H stretching), 2927-2929 cm-1(C-Hstretching), 1654

และ 1560 cm-1(protein), 844 cm-1 (α-configuration) และ 891 cm-1 (β-configuration)

สเปกตรมทศกษาสามารถระบไดวาเปนทง α-configuration และ β-configurationซงสเปกตรมท

ไดสอดคลองกบงานวจยของ Zuofa et al. (2013)ทไดทาการศกษาพบหมฟงกชนท 3300-3500cm-

1 (O-H stretching), 2927-2930 cm-1(C-Hstretching), 1640 cm-1(เอไมดของ C=O), 1485-1350

cm-1(–CH (C-CH2)), 1000-1200 cm-1(pyranose ring) 850 cm-1(α-configuration),1080 cm-1

(β-configuration) และ 350-600 cm-1โครงรางหลกของวงไพราโนส

ภาพท 3 กลไ

ภาพท 4 IR ส

จาก

ผลการวจยกอ

การศกษาคน

ไกการเกดปฏ

สเปกตรมของ

การศกษาพบ

อนหนาน และ

นควาเพมเตมใ

ตวอยางตว

ฏกรยา

งสารสกดหยา

บวาสารสกดห

ะมความเปนไ

นรายละเอยด

วเลมปญหาพเศษ (

าบ

ยาบเชอเหดต

ไปไดในการพฒ

ดตอไป

(ดดแปลงจากเนอห

ตบเตาสามารถ

ฒนาเพอนาไป

หาจรง)

ถตานอนมลอส

ปใชในเชงการ

สระไดด ซงสน

รคา ซงจาเปน

20

นบสนน

นจะตองม

21


สรปและขอเสนอแนะ

สรปสาระสาคญของการทดลองและผลทได ปญหาและจดออน ประโยชนของงานน และขอเสนอแนะสาหรบการวจยในขนตอไป

จากการสกดสารออกฤทธจากสารสกดหยาบเชอเหดตบเตาโดยนาปราศจากไอออน ใน

อตราสวน 10:1 (กรมตอลตร) ตกตะกอนพอลแซกคาไรดดวยตวทาละลาย 95% เอทานอล โดยการ

สกด 2 วธ การสกดเยนโดยวธการหมก และการสกดรอนโดยวธสกดแบบไหลกลบ พบวาไดสารสกดท

มลกษณะเปนของแขงสนาตาลเขม จะไดสารสกดทง 4 สวน พอลแซกคาไรดสกดรอนไดเปอรเซนต

ของสารสกดหยาบสงทสดเทากบ 24.54 และ พอลแซกคาไรดสกดเยนไดเปอรเซนตสารสกดหยาบตา

ทสดเทากบ 15.80

การทดสอบการตานอนมลอสระดวยวธ DPPH ทความเขมขน 25, 50, 100, 150, 200, 300

และ 400 ไมโครกรมตอมลลลตร พบวาเปอรเซนตการตานอนมลอสระมแนวโนมสงขนเมอความ

เขมขนของสารสกดสงขนและนาสกดรอนสามารถยบยงอนมลอสระไดดทสดทความเขมขน 400

ไมโครกรมตอมลลลตร มคาเทากบ 88.15±0.67%

จากการศกษาพบวาสารสกดหยาบเชอเหดตบเตา สามารถตานอนมลอสระได ซงนาจะเปน

ประโยชนสงมากถอเปนอกทางเลอกหนงทนาสนใจ และสามารถนาเชอเหดตบเตาไปศกษาคนควาใน

ขนสงตอไป

22


เอกสารและสงอางอง

หนงสอ: ผแตง. ปทพมพ.ชอหนงสอ. ครงทพมพ (ถาม). สานกพมพ, สถานทพมพ

รายงานการประชม สมนา: ผเขยน. ปทพมพ. ชอเรอง, หนาทพมพ. ใน ชอบรรณาธการ (ถาม). ชอการประชม ครงท. สานกพมพหรอหนวยงานทจดการประชม, สถานทพมพ

วทยานพนธ : ผเขยน. ปทพมพ. ชอวทยานพนธ. ระดบวทยานพนธ, ชอมหาวทยาลย

บทความในวารสาร: ผเขยน. ปทพมพ. ชอบทความ. ชอวารสาร ปท (ฉบบท): หนา.

ขอมลจากเวบไซต: ผเขยน. ปทพมพ. ชอเรอง. ชอหวของเวบไซต. แหลงทมา: วนทสบคนขอมล

การอางองในตวเลมสาหรบวารสารไทย (บหรน 2556) และ (ชลดา, พรพรรณ and เมธน 2555) กรณทเปนวารสารภาษาตางประเทศ (Aida, Shuhaimi, Yazid and Maaruf 2009) และ (Ming-Chi 2007)

การอางอง (บางสวน)

ชลดา จดประกอบ, พรพรรณ เหลาวชระสวรรณ และเมธน ผดงกจ. 2555. ฤทธตานอนมลอสระและฤทธตานการกอกลายพนธของสารสกดเหดหงเกอกมา. วารสารเภสชศาสตรอสาน 10 (5): 175-179.

บหรน พนธสวรรค. 2556. อนมลอสระ สารตานอนมลอสระและการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระ. วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย 21 (3): 275-286.

Aida, F. M. N. A., M. Shuhaimi, M. Yazid, and A. G. Maaruf. 2009. Mushroom as a potential source of probiotics: a review. Trend in Food Science &Technology 20: 567-575.

Ming-Chi, T., T. Song, P. Shih, and G. Yen. 2007. Antioxidant properties of water-soluble polysaccharides from Antrodia cinnamomeain submerged culture. Food chemistry 104: 1115-1122.

23


ภาคผนวก

24


ภาคผนวก ก) การเตรยมสารเคม

สารละลาย BHT ความเขมขน 1,000 ppm

เตรยมสารละลาย BHT ทความเขมขนเดยวกบเหดตบเตา โดยชง BHT 0.0100 กรม มา

ละลายในนาปราศจากไอออน 10 มลลลตร จะได BHT ความเขมขน 1,000 พพเอม

สารละลายฟอสเฟตบฟเฟอร เขมขน 200 mM pH 6.6 ปรมาตร 250 mL

เตรยมไดจากไดโซเดยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (Na2HPO4) มวลโมเลกลเทากบ 141.96 กรม/

โมล และ โซเดยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (NaH2PO4) มวลโมเลกลเทากบ 120 กรม/โมล

25


ภาคผนวก ข) อนมลอสระและสารตานอนมลอสระ

อนมลอสระ

อนมลอสระ (Free radicals) คอโมเลกลหรอไอออนทมอเลกตรอนโดดเดยว พบไดทงใน

สงแวดลอม ในสงมชวต โดยเฉพาะอยางยงกระบวนการเมตาบอลซม (metabolism) ในเซลล

โมเลกลของออกซเจนทกลายเปนอนมลอสระจะมความวองไวในการเขาทาปฏกรยามาก และสามารถ

ดงอเลกตรอนจากโมเลกลอนมาแทนทอเลกตรอนทขาดหายไปเพอใหตวเองเกดความสมดลหรอ

เสถยร ซงปฏกรยานจะเกดขนอยางตอเนองเปนปฏกรยาลกโซในเซลล อนมลอสะทสาคญ ไดแก

oxygen radical, superoxide radical, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, transition

metals, carbonate radical (CO3•), nitrate radical (NO3•), methyl radical (CH3•),

superoxide radical (O2•), peroxy radical (ROO•), reactive oxygen species (ROS) เปนตน

อนมลอสระสามารถทาลายชวโมเลกลทกประเภททงในเซลลและสวนประกอบของเซลล

สงมชวต เชน ลพด โปรตน เอนไซม ดเอนเอ อารเอนเอ เซลลเมนเบรน ซงเปนสาเหตใหเซลลตาย

การเกดการกลายพนธของดเอนเอในเซลล และกอใหเกดโรคตางๆ ไดแก โรคชรา โรคมะเรง โรคหวใจ

ขาดเลอด โรคความจาเสอม โรคขออกเสบ โรคภมแพ อนมลอสระนอกจากจะเกดภายในสงมชวตแลว

ยงเกดจากปจจยภายนอก ไดแก การไดรบเชอโรคเกยวกบภมคมกน จากรงส จากมลภาวะ เชน ควน

บหร และแกสจากทอไอเสย จากอาหารทไหมเกรยม หรอ จากยาบางชนด เชน โดโซรบซน

(doxorubicin) เพนนซลลามน (penicillamine) พาราเซตามอล (paracetamol) เปนตน ซงโมเลกล

ทมความสามารถทจะกาจดอนมลอสระและปองกนโรคทเกดไดเรยกวา สารตานอนมลอสระ

(Antioxidant) สารอาหารและแรธาตตางๆ ทสาคญทเปนสารตานอนมลอสระ เชน วตามนซ

สารตานอนมลอสระ

สารตานอนมลอสระถอวามความสาคญตอกระบวนการออกซไดซอนมลอสระ หรอสามารถ

ยบยงปฏกรยาออกซเดชน โดยในสงมชวตจะมระบบการปองกนการทาลายเซลลและเนอเยอจาก

อนมลอสระ ประกอบดวยสารตานอนมลอสระมากมายหลายชนดททาหนาทแตกตางกนไป ซงมทงท

เปนเอนไซมและไมเปนเอนไซม สารประกอบทละลายในนาและสารประกอบทละลายในไขมน

โดยสารตานอนมลอสระเหลานมกลไกการทางานตานอนมลอสระดวยกนหลายแบบ เชน ดกจบอนมล

อสระ (radical scavenging) การยบยงการทางานของออกซเจนทขาดอเลกตรอน (singlet oxygen

quenching) จบกบโลหะทสามารถเรงปฏกรยาออกซเดชนได (metal cheation) หยดปฏกรยาการ

26


สรางอนมลอสระ (chain-breaking) เสรมฤทธ (synergism) และยบยงการทางานของเอนไซม

(enzyme inhibition) ทเรงปฏกรยาอนมลอสระ เปนตน

27


ประวตการศกษา และการทางาน

ชอ-นามสกล

วนเดอนปเกด

สถานทเกด

ประวตการศกษา

ระดบประถมศกษา โรงเรยน (จงหวด)

ระดบมธยมศกษาตอนตน โรงเรยน (จงหวด)

ระดบมธยมศกษาตอนปลาย โรงเรยน (จงหวด)

ผลงานดเดนและรางวลทางวชาการ

1.

ทนการศกษาทไดรบ 1.

Documents

ปัญหาพ ิเศษ - Chem ku-kpschem.flas.kps.ku.ac.th/SLIDE/OTHER/2016-SPC59-EXAMPLE.pdf · 2016-05-10 · ตัวอย่างตัวเล่มปัญหาพ