การสอบเทีียบเครื่ื่อง HPLCHPLCdmsc2.dmsc.moph.go.th/webroot/drug/km/lab_instrument... · 2006-10-02 · การสอบเทีียบเครื่ื่อง

การสอบเทียบเครื่องการสอบเทียบเครื่อง HPLCHPLC

Scope

- Operation qualification, OQ

- Performance qualification, PQ

- Maintanance

DEGASSER SAMPLEPREPARATION

WASTE / CORRECT

COLUMN DETECTOR

INLINE FILTRATION PRE-COLUMN RECORDING SYSTEMDATA HANDLING

INJECTIONSYSTEM

SOLVENTSUPPLY

SOLVENTDELIVERYSYSTEM

รูปที่ แสดงองคประกอบของเครื่องโครมาโทกราฟชนดิของเหลวประสิทธิภาพสูง


องคประกอบหลกัที่ตองทําการตรวจสอบ

- Pump

- Injector / Autosampler

- Detector

- Software

ความถี่ : 1 ป / ครั้ง หรือตามความเหมาะสม


Pump

Isocratic pump

- Accuracy

- Precision

- Linearity

Gradient pump

- Proportioning valve


Isocratic pump

อุปกรณ

- Volumetric flask

- Stop clock

- Flow meter

วิธีการตรวจสอบ

แบบที่ 1 : ใช flow meter

แบบที่ 2 : ใช volumetric flask


HP

Water, PE, Shimudzu


FLOW METER

WASTE

MIXER

A B C D

PUMP

PROPORTIONING

VALVE

แบบที่แบบที่ 1 : F1 : Flow meterlow meter


ขอดี : สะดวก รวดเร็ว ถูกตอง

ขอเสีย : เครื่องมือราคาแพง

ตอง recalibrate

MIXER

A B C D

PUMP

PROPORTIONING

VALVE

แบบที่แบบที่ 22 : : Volumetric flaskVolumetric flask

FLASK

Stop clock


ขอดี : อุปกรณราคาถูก มีอยูแลว

ขอเสีย : ใชเวลานาน

Accuracy

จบัเวลาการไหลของ solvent ดวยอัตราการไหลที่ตองการ จน solvent

ถึงขีด คํานวณอตัราการไหล

อตัราการไหล = ปริมาตรของขวด/เวลาที่ใช

Precision

คํานวณ % RSD จากการวัดซ้ํา

Linearity

เขียนกราฟความสัมพันธระหวาง อัตราการไหลที่คํานวณและอตัราการไหลที่ตั้ง คํานวณหาคา correlation coefficient


Waters : Methanol; PE, HP : Water


รูปขดลวดสราง back pressure


Waters : tube ขนาด 3mx0.25mm ; P 500-700 psi

PE : tube ขนาด 20 mx1/32 in ; P 1000 psi

Shimudzu : tube ขนาด 4mx0.1 mm


Proportioning Valve

สารเคมีที่ใช

- Propylparaben 5.6 mg/l in methanol, GPV

- 0.5 % Acetone in water

- 0.2,0.4 % Acetone in water

- 0.1 % Acetone in water

วิธีการ

- ทําทีละคู วัดคา absorbance

- ทําทีละคู วัดคา peak height

- ทําทีละคู วัดคาปริมาณ solvent ที่ลดลง

- ทําทีละ 3 valve วัดคา peak height


Waters

HP

PEDionex

วิธีการที่ 1: หาทีละคูโดยวัดคา absorbance

. เตรียมสารละลาย propylparaben ใน methanol ใหมีความ

เขมขน 5.6 mg/l กรองใสในขวด B

. บรรจุ methanol ในขวด A

. ทําการไลสารละลายเกาในทอ A และ B ออกใหหมด

. ตอทอจาก pump เขาเครื่อง detector โดยไมผานคอลมัน

. ทําการตั้งโปรแกรมปรับสัดสวนของสารละลาย ตามตาราง

. อานคา absorbances ที่ความยาวคลืน่ 256 นาโนเมตร


ตารางแสดงขั้นตอนการตั้งอตัราสวนของ solvent

Step % B % A Time (min) Curve

1 100 0 5 11

2 80 20 5 11

3 60 40 5 11

4 40 60 5 11

5 20 80 5 11

6 0 100 5 11


การคํานวณ

At 0% A, 100% B

Cal. Abs. = Obs. Abs at 100% B - Obs.Abs at 0% B

At 20% A, 80% B

Cal. Abs. = Obs. Abs. at 80% B - Obs. Abs. at 0% B

Absorbance ที่ 80% B คํานวณได ดังนี้

Cal. 80% B = Cal. Abs. at 80% B x 100Cal. Abs. at 100% B

% Difference = (Cal. 80%B - %B) x 100% B


100% PP 100 %MeOH


At 0% A, 100% B

Cal. Abs. = 0.646 – 0.000

At 20% A, 80% B

Cal. Abs. = 0.518 – 0.000

Absorbance ที่ 80% B คํานวณได ดังนี้

Cal. 80% B = 0.518 x 100 = 80.1858

0.646

% Difference = (80.1858 – 80.000) x 100 = 0.23

80.000


ขอดี : ละเอียด สามารถทราบจดุที่ผิดปกติ

ขอเสีย : เสียเวลา การคํานวณคอนขางยุงยาก


วัดคา peak height

วิธีการที่ 2: หาทีละคูโดยวัดคา peak height


เขมขน 5.6 mg/l กรองใสในขวด C,D

. บรรจุ methanol ในขวด A,B

. ทําการไลสารละลายเกาในทอ A ,B ,C และ Dออกใหหมด



. อานคา peak height


ตารางการตั้ง gradient


รูป การทํา gradient


การคํานวณ :

Percent A/C = peak height A/C

peak height full scale

Limited : 10.0 + 0.5ขอดี : ทราบวา valve ไหนมีปญหา

เชน : คํานวณ percent A/C = 9.8

A/D = 10.0

B/C = 9.5

B/D = 10.1

วิธีการที่ 3: ทําทีละคู วัดคาปริมาณ solvent ที่ลดลง

. ใสสาย solvent A และ solvent B ใน graduated cylinder ขนาด 50 ml

. บรรจุ 100 % methanol ในแตละ cylinder 50 ml

. ตัง้ flow 5 ml/min ดวย 50 % A และ 50 % B

. เมื่อ solvent ใน cylinder A ลดลงถึง 25 ml หยุด flow

. คํานวณความแตกตางปริมาตรของ solvent ระหวาง cylinder


วิธีการที่ 4 : ทําทีละ 3 valve วัดคา peak height


เขมขน 5.6 mg/l กรองใสในขวด C,D

. บรรจุ methanol ในขวด A,B

. ทําการไลสารละลายเกาในทอ A,B,C และ Dออกใหหมด



. วัดคา peak height


รูป การทํา gradient


ตารางการคํานวณ


ขอดี : รวดเร็ว

ขอเสีย : ไมสามารถบอกไดวา valve ไหนมีปญหา

Autosamplerขอกําหนดที่ตองทําการตรวจสอบ

1. Accuracy 2. Precision 3. Linearity4. Carryover

กรณีระบบการฉีดของเครื่อง ไมดดูสารละลายเกินปริมาตรที่กําหนด สามารถหา accuracy, precision และ linearity โดยการชั่งน้ําหนกั

กรณีระบบการฉีดของเครื่องดดูสารละลายเกินปริมาตรที่กําหนด

ทําการตรวจสอบในขั้นตอนการตรวจสอบประสิทธิภาพของเครื่องทั้งระบบ (PQ)



วิธีการ :

1. ชั่งน้ําหนกัน้ําใน vial (w1)

2. inject สารในปริมาตรที่ตั้งไว 6- 10 ครั้ง (n)

3. ชั่งน้ําหนกัน้ําใน vial (w2)

ปริมาตรที่ inject = w2-w1/n


Carryover

สารเคมีที่ใช :

- Caffeine 0.25, 0.3 mg/ml in water

- Universal test mix

วิธีการ

Inject sample 6-11 injection -> inject blank (solvent, MP)

คํานวณ peak area จาก chromatogram ของ blank เทียบกบั peak area จาก sample

PE

HP, Dionex

% Carryover = peak area carryover x 100

peak area sample

PE : < 0.02 %

HP : < 0.2 %

Dionex : < 0.1 %


Column , sample heater /cooler

วัดความถูกตองของอณุหภูมิโดยใช thermocouple

Detector

หัวขอกําหนดที่ทําการตรวจสอบ

UV-VIS Detector

- Wavelength accuracy

- Linearity

- Baseline noise / Drift

Diode array detector

- Photometric accuracy

- Linearity- Baseline noise / Drift



- Propylparaben in methanol

- Uracil in methanol

- Caffeine in water

- Pyrene in methanol

- Holmium

- Hg lamp

- Erbium perchlorate


Waters : 15 mg/l

HP

Dionex : DADPE

Shimudzu

Waters : DAD

Waters : Linearity

UVUV--VIS DetectorVIS Detector

Wavelength accuracy : วิธีการ

. เปดสวิทซเครื่อง ทิ้งไวประมาณ 90 นาที

. ใชขอตอที่สวมเขากับ syringe สําหรับฉีดสารตัวอยางตอเขากับทอเขาของ detector

. ใช methanol ฉีดลาง flow cell จนอานคา abs. ไดเทากับศูนย หรือกด Auto zero ของเครื่อง detector เมื่อมี methanol เต็ม flow cell

. ฉีดสารละลายมาตรฐาน propylparaben ความเขมขนประมาณ 5.6 mg/l ใหเต็ม flow cell และใหมั่นใจวาไมมีฟองอากาศ

. ทําการตั้งคาความยาวคลื่นตางๆ ตั้งแต 249 nm ถึง 264 nm โดยการเพิ่มความยาวคลื่นทีละ 1 nm แลวอานคา abs. ของแตละความยาวคลื่น โดยทิง้ ชวงประมาณ 15-30 วินาที เพื่อใหคา abs. คงที่



รูป detector



Linearity test :วิธีการ

. เปดสวิทซเครื่อง UV detector ไวประมาณ 60 นาที

. ใชขอตอที่สวมเขากับ syringe สําหรับฉีดสารตัวอยางตอเขากับทอเขาของ Detector

. ตั้งคาความยาวคลื่นของเครื่องตรวจวัดสารที่ 256 nm

. ใช methanol ฉีดลาง flow cell จนอานคา abs. ไดเทากับศูนย หรือกด auto zero

. ฉีดสารละลาย propylparaben ความเขมขนประมาณ 0.5 mg/l รอจนคา abs. นิ่ง

อานคา abs.

. ทําซ้ําตั้งแตขอ 4-5 โดยฉีดสารละลาย propylparaben ความเขมขน 1, 2, 4, 8

และ 16 mg/l



การประเมินผล :

- คํานวณคา correlation coefficient จากการเขียนกราฟระหวางคา

absorbance และ concentration

- คํานวณคา sensitivity และ % RSD ของคา sensitivity

sensitivity = absorbance/concentration



Baseline noise- WL : 254 nm

- Range : 1 mAU

- Flow rate : 1 ml/min

- Recorder : 1 mVFS, Chart speed 1 cm/min

- Record baseline 30 min

- อานคา baseline noise ในชวง 1 min อานคามากกวา 5 ชวง

PUMP

MeOH

DETECTOR RECORDER

1 mAU

1 min 30 min


Baseline drift- WL : 254 nm

- Range : 1 mAU

- Flow rate : 1 ml/min

- Recorder : 1 mVFS, Chart speed 1 cm/min

- Record baseline 30 min

PUMPMeOH

DETECTOR RECORDER

1 mAU

1 min 30 min

D



Diode array detector

Accuracy : Scan 3 D เปรียบเทียบ wavelength accuracy spectrum plot

รูป spectrum


Waters: erbium perchlorate


Dionex : pyrene

Linearity : วัดคา absorbance ที่ความเขมขนตาง ๆ


Waters : propylparaben

คํานวณ %RSD ของ sensitivity

Baseline noise

Baseline drift

เชนเดียวกับ UV-VIS detector



Software

- มโีปรแกรมปอนขอมลูใหเครื่องคํานวณคา peak area และ peak

height และประเมนิผลที่ไดเปรียบเทียบกับเมือ่ตดิตัง้เครื่อง

- ใชขอมลูเกาที่เคยทําเก็บไวใหเครื่อง คํานวณคา peak area และ peak

height และประเมนิผลเปรียบเทียบกบัขอมลูที่เคยทําไว

Performance qualification

- Pump

- RT precision

- Autosampler

- Precision ( peak area)- Linearity (peak area, volume inject)

- Detector

- Linearity (peak area, concentration)



- propylparaben ที่ความเขมขนตาง ๆ

- caffeine ที่ความเขมขนตาง ๆ

- PQ solution – acetone

- acetophenone

- propiophenone

- butyrophenone


Waters : Condition

Column : symmetry C-18 4.6x75 mm

MP : MeOH : Water = 60:40

Wavelength : 254 nm

Flow : 1 ml/min

HP, Dionex


สารเคมีที่ใช (ตอ)

- Universal test mix - anthracene

- ethylbenzene

- isopropylbenzene

- tert-butylbenzene

- toluene

PE : Condition

Column : C-18(new) 3x3 mm

MP : MeOH::Water = 80:20

Flow : 1.2 ml/min

Wavelength : 260 nm

ตัวอยางการทํา PQสารเคมี - Acetonitrile

- Propylparaben- Methanol- Water HPLC grade

สภาวะการทํางานของระบบ (HPLC condition)Column : C-18 Mobile phase : Acetonitrile : Water = 50 : 50Flow rate : 2.0 ml/minDetector : UV 256 nmInjection Volume : 20 μlSample : Propylparaben 10 mg/ml in methanol


Pump

Precision : คํานวณคา percent relative standard deviation

(%RSD) ของคา retention time ในการ inject 6 ครั้ง



Autosampler

Precision : คํานวณคา percent relative standard deviation (%RSD)

ของคา peak area ในการ inject 6 ครั้ง

Linearity : คํานวณคา correlation coefficient ของกราฟระหวาง peak

area และ volume inject

Detector

Linearity : คํานวณคา correlation coefficient ของกราฟ

เสนตรงระหวาง peak area และ concentration


Maintenance

การรั่วซึมของฟตติ้ง (fitting)

ความถี่ : ทกุครั้งที่ใช ผูดําเนินการ : ผูรับผิดชอบเครื่อง


1. เปดเครื่องใหทํางานตามวิธีการใชเครื่องมือ

2. สังเกตดูการรั่วซึมของเฟสเคลื่อนที่ โดยใชกระดาษกรองดูดซับ หรือการมีคราบเกลือติดอยูตามขอตอตาง ๆ ไดแก compression screw, ferrule, nut และ union หากพบการรั่วซึม ซึ่งเกิดจากการขันเกลียวผิดวิธี เปนผลใหปลายฟตติ้งเสีย ใหเปลี่ยนใหม แลวขันใหถกูวิธี โดยใชมอืขันกอนตามดวยประแจขันใหแนนพอดี

การประเมินผล

ไมมีการรั่วซึมของเฟสเคลื่อนที่ หรือคราบเกลือติดอยูตามขอตอตาง ๆ


ประสทิธิภาพของปม (pump)

ความถี่ : ทุกครั้งที่ใช ผูดําเนินการ : ผูรับผิดชอบเครื่อง

วิธีการ : 1. เปดเครื่องใหทํางานตามวิธีการใชเครื่องมือ

2. สังเกตดูการเปลี่ยนแปลงของคาความดันของระบบการรั่วซึมของเฟสเคลื่อนที่

ที่บริเวณ pump head และฟงเสียงการทํางานของปมที่ผิดไปจากปกติ

3. ตรวจสอบอัตราการไหล โดยการตั้งอัตราการไหลไวที่คาหนึง่ ใชกระบอกตวงรองรับ

เฟสเคลื่อนที่ที่ออกมาจากปมโดยไมติดตั้งคอลัมน อานปรมิาตร เมื่อครบเวลาที่

กําหนดและเปรียบเทียบกับคาที่คํานวณได

การประเมินผล

1. คาความดันของระบบ เปลี่ยนแปลงไมเกิน 10 ปอนดตอตารางนิ้ว

2. ไมมกีารรั่วซึมของเฟสเคลื่อนที่

3. ไมมีเสียงผิดปกติเกิดขึ้นขณะทํางาน

4. ปริมาตรของเฟสเคลื่อนทีท่ี่อานไดเบี่ยงเบนไป จากคาที่คํานวณไดไมเกิน + 3%


ตรวจสอบการรั่วซึมและความสกปรกของระบบฉีดสาร

ความถี่ : ทุกครั้งที่ใช ผูดําเนินการ : ผูรับผิดชอบเครื่อง


1. เปดเครื่องใหทํางานตามวิธีการใชเครื่องมือ

2. ฉดี methanol ความเขมขนรอยละ 50 โดยปรมิาตร

3. สังเกตการรั่วของระบบฉดีสารทัง้ดานหนาและดานหลงั ซึ่งเกิดจาก loop ในระบบฉีดสาร

สกปรก หรือ seal หรือ valve เสียหาย ถาสาเหตุการรั่วซึมเกิดจาก loop สกปรก ใหทํา

ความสะอาดดวย methanol ความเขมขนรอยละ 50 v/v ในแตละกรณีดงันี้

- ระบบฉดีของ Rheodyne ใชเข็มฉีดน้ํายาสําหรบัลางโดยการฉดี methanol ความเขมขนรอยละ 50 โดยปรมิาตร ประมาณ 2 ml

- ระบบฉดีของ “U6K” (Waters) ใหลางโดยการสับคานควบคุม (mode) ไปที่ “load” และ “inject” สลับกันไปมา

- ระบบฉดีอัตโนมัติ กดปุม purge

การประเมนิผล : ไมมกีารรั่ว


ตรวจสอบการอุดตันของ solvent reservoir filter และทอเทฟลอน (Teflon) จาก reservoir

ความถี่ : ทุกเดือน ผูดําเนินการ : ผูรับผิดชอบเครื่อง


1. ถอด solvent reservoir filter ลางโดยการ sonicate นานประมาณ 5-10 นาที

ในกรดไนตริกความเขมขน 6 โมลาร ตามดวยน้ํากลั่นจนหมดกรด

2. ตรวจสอบสภาพของทอเทฟลอน ถาหักงอหรืออุดตันควรเปลี่ยนใหม

การประเมนิผล :

เฟสเคลื่อนที่จาก reservoir ไหลเขาสูระบบไดดี ไมมฟีองอากาศ


การตรวจสอบประสทิธภิาพของคอลัมน


เปดระบบเครื่องใหทํางาน ตั้งสภาวะเครื่องมือตามวิธีการที่กําหนดในใบรับรอง

ของคอลัมนฉดีน้ํายาตรวจสอบและคํานวณคา plate number จากโครมาโตแกรมที่ได

การคํานวณ :

คํานวณตามวิธีที่กําหนดมาในใบรับรองของคอลัมนแตละชนิดหรือคํานวณตามสูตร

n = 16 ( t/w )2

เมื่อ t = ระยะทางจากจุดฉีดถึงยอด peak ทีส่นใจ

w = ความกวางของฐาน peak ทีส่นใจ

การประเมินผล :เปรียบเทยีบคา n ของคอลัมนใหมกับคาที่แจงในใบรับรองของบริษัทผูผลิต ไมควร

ต่ํากวารอยละ 10 สําหรับคอลัมนใหม และรอยละ 50 สําหรับคอลัมนเกา ถาคา n สําหรับคอลัมนเกา

ต่ํากวารอยละ 50 ใหทดลองลางคอลัมน ทดสอบประสิทธิภาพอีกครั้ง ถาไมดีขึ้นควรเตรียมสํารองคอลัมน



การทําความสะอาดคอลัมน


. เปดเครื่องทํางานตามวิธีการใชเครื่องมือเฉพาะระบบปม

. ตรวจสอบการอุดตันของการดคอลัมนกอน โดยติดตั้งเฉพาะการดคอลัมนเขาระบบ

เพียงอยางเดียว

. เปดเครื่องใหทํางาน สังเกตคาความดันในสภาวะการทํางานปกติ ถาความดนัสูงกวา

ปกติแสดงวามีการอดุตัน ในทํานองเดียวกันใหตรวจสอบกับคอลัมนที่ใชงาน ถาพบวามี

การอุดตันของคอลัมน ใหทําการลางตามวิธีการดังนี้

ติดตั้งคอลัมนเขาระบบในทศิทางกลับกับที่แสดงบนคอลัมน ฉี ด DMSO

ปริมาตร 50-200 μlแลวผานคอลัมนดวย methanol ความเขมขนรอยละ 50 v/v

ไมนอยกวา 30 ml เพื่อชะลางเอาสิ่งสกปรก เชน โปรตีน ไขมัน ออกไป จากนั้นกลับทิศทาง

ของคอลัมนใหอยูในทศิทางเดิม เมื่อเปดระบบใหทํางาน สังเกตคาความดันของระบบ

เปรียบเทียบกับความดนัปกติทีเ่คยใชงาน


การตรวจสอบประสทิธภิาพของแหลงกําเนิดแสง

ความถี่ : ทุก 3 เดือน ผูดําเนินการ : ผูรับผิดชอบเครื่อง วิธีการ :

. ประสทิธิภาพของระบบตรวจวัดสัญญาณที่ลดต่ําลงอาจเกิดจากความสกปรกของ flow cell

. สําหรบัเครื่องบางรุน ตรวจสอบประสิทธิภาพของหลอดกําเนิดแสงไดโดยตรง จากการอานคา

พลังงานของหลอดกาํเนิดแสง เปรียบเทียบกับคาที่บันทึกไวในคูมือการใชเครื่อง หรือจาก

บันทกึชั่วโมงที่ใชงานของผูใชเอง

. เครื่องที่ไมมีสวนแสดงคาพลังงานของหลอดกําเนิดแสง ใหเปรียบเทียบความสูงของ peak

ของสารชนิดเดียวกันในขณะทําการสอบเทียบกับที่เคยบันทึกไวเมื่อใชหลอดกําเนิดแสงใหม

ในสภาวะของการใชงานเดียวกันหมายเหตุ

เครื่องมือที่มีการปรับเทียบตัวเองอัตโนมัติในระบบตรวจวัดสัญญาณเมื่อเปดเครื่อง

ใชงาน หากการปรับเทยีบไมผาน มักจะมสีาเหตุจากประสทิธภิาพของหลอดกําเนิดแสงต่ํา



ที่มาของขอมูล

1. สํานักมาตรฐานหองปฏิบัติการ. การตรวจสอบความถูกตองของเครื่องโครมาโต

กราฟชนิดของเหลวความดันสูง. กรมวิทยาศาสตรการแพทย. 1999

2. Operational Qualification of HPLC. Sithiporn association Co., Ltd

3. Operational Qualification of HPLC. Bara,Windsor & Co.,LTD

4. Operational Qualification of HPLC . Agilent Technologies (Thailand) Ltd

5. Operational Qualification of HPLC. Analytical Technology Co., Ltd

6. Operational Qualification of HPLC. Perkin Elmer (Thailand) Ltd

THANK YOU

Documents

การสอบเทีียบเครื่ื่อง HPLCHPLCdmsc2.dmsc.moph.go.th/webroot/drug/km/lab_instrument... · 2006-10-02 · การสอบเทีียบเครื่ื่อง