1

1. วตถประสงค

1.1 เพอใหนกศกษารและเขาใจกระบวนการ การเตรยมสารเคมในการท าปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอ 1.2 เพอใหการปฏบตงานสะดวก รวดเรว และเปนมาตรฐานเดยวกน 2. ขอบเขต

คมอการปฏบตงานน ครอบคลมขนตอนการปฏบตงานการเตรยมสารเคมในการท าปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอ 3. ค าจ ากดความ สารเคม หมายถง สสารวสด ทใชในหรอไดจากกระบวนการเคม การเพาะเลยงเนอเยอพช หมายถง การขยายพนธพชโดยการใชเทคนคการเพาะเลยงในหองทดลอง ซงสามารถท าไดหลายแนวทาง มวตถประสงคเพอขยายปรมาณใหไดมากในเวลาสนและตรงตามพนธ ซงมวธการพนฐานแตกตางกนตามชนดของชนสวนของพชทน ามาใชเพาะเลยง คอ การเพมปรมาณยอด โดยการเพาะเลยงตายอด และตาขาง การสรางยอดพเศษจากเซลลใดๆ โดยกระบวนการ organogenesis การสรางคพภะจากเซลลรางกายโดยไมเกดจากการผสมของเซลลสบพนธ 4. หนาทความรบผดชอบ

4.1. เจาหนาทหองปฏบตการ มหนาทเตรยมหองปฏบตการใหพรอมใชงานอยเสมอ 4.2. เจาหนาทหองปฏบตการ มหนาทเตรยมสารเคมในหองปฏบตการ

5. การตรวจเอกสาร

สารเคมในการเพาะเลยงเนอเยอ องคประกอบหลกของ อาหารสงเคราะหสตรตางๆ โดยทวไป มดงตอไปน

1. เกลออนนทรย ใหแรธาตทจ าเปนตอการเจรเเตบโตของพชทวๆ ไป ไดแก ไนโตรเจน (N) ฟอสฟอรส (P)

โพแทสเซยม (K) แคลเซยม (Ca) ซลเฟอร (S) แมกนเซยม (Mg) เหลก (Fe) แมงกานส (Mn) สงกะส (Zn) โบรอน (B) ทองแดง (Cu) โคบอลต (Co) และโมลบดนม (Mo) บางสตรเตมไอโอดน (I) ดวย ซงพบวาใหผลด

คมอการปฏบตงาน การเตรยมสารเคมในการท าปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอ โปรแกรมวชาชววทยา คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย

2

ส าหรบการเจรเของรากและแคลลส ชนดและปรมาณ ของเกลอทมแรธาตเหลาน มความส าคเตอการเจรเเตบโตของเนอเยอและเซลลพชมาก เชน ธาตไนโตรเจน (N) โดยทวไป มกใหอยางนอย 25-60 มลลโมลาร ในรปเกลอไนเทรต แตกพบวา การใชเกลอแอมโมเนยม 2 - 20 มลลโมลารดวย กจะใหผลดยงขน ส าหรบการเลยงแคลลสของยาสบ และการเพาะเมลดกลวยไมบางชนด นอกจากนน เกลอแอมโมเนยม ยงมสวนชวยรกษาสมดลของคา pH หรอระดบความเปนกรดดาง ของอาหารเลยงเนอเยอพชดวย เชนเดยวกบการใชสารอนทรย แตบางครงพบวา เกลอแอมโมเนยม อาจมผลยบยงการเจรเ ของเนอเยอพชบางชนดได สวนธาตเหลกมกเตรยมใหอยในรปทละลายน าไดด โดยรวมกบ ไดโซเดยมอดทเอ เกบในททไมถกแสง ทงน เพอใหเหลกอยในรปทพชใชไดนาน และท าใหพช ไมมภาวะขาดธาตเหลก

2. คารโบไฮเดรต ไดแก น าตาลซงจะใหพลงงานแกเนอเยอพช เพอใชในการเจรเเตบโตในหลอดทดลอง นยมใช ซโครส

(sucrose) เปนสวนใหเ ประมาณรอยละ 1 - 5 โดยน าหนก

3. วตามน ชวยใหการท างานของเอนไซมตางๆ เปนไปไดอยางด ปกตพชสามารถสงเคราะหวตามนไดเอง แตใน

หลอดทดลอง อาจสรางไดไมเพยงพอ จงมกตองเตม ใหเสมอๆ คอ ไทอามน (Thiamine) 0.1-1.0 มลลกรมตอลตร นอกจากน การใหวตามนเสรมจ าพวกนโคทนกแอซด (Nicotinic acid), ไพรดอกซนไฮโดรคลอไรด (Pyridoxine hydrochloride) ไมโออนอซทอส (myoinositol) โฟลกแอซด (folic acid) และแคลเซยมดเพนโททเนต (Ca D-pentothenate) เสรมดวย ยงชวยกระตนการเจรเของเนอเยอพชบางชนดอกดวย

4. กรดแอมโน กรดแอมโนเปนแหลงใหไนโตรเจนทพชจะไดรบเรวกวาจากเกลออนนทรย แตไมสามารถใชแทนกนได

ทงหมด แมวา กรดแอมโนจะไมใชสารประกอบทจ าเปนตองเตมในอาหารเลยงเนอเยอพช แตมการทดลองทแสดงวา การเตมเคซน-ไฮโดรไลเซต (casein hydrolysate) รอยละ 0.02-1 ซงประกอบดวยกรดแอมโนหลายชนด ชวยใหมการพฒนาของเนอเยอเปนอวยวะไดดขน และมรายงานการใชกรดแอมโน เชน แอล-ไทโรซน (L - tyrosine) แอล-อารจนน (L argenine) แอล-เซอรน (L-serine) และเอไมดบางชนด เชน แอล-กลทามน (L glutamine) แอล-แอสพาราจน (L-asparagine) ในการเลยงเนอเยอพช พบวา มผลชวยชกน าใหเกดยอด ราก และเอมบรโอ จากเซลลทไมเกยวกบเพศดวย

5. กรดอนทรย การเตมกรดอนทรยบางตว โดยเฉพาะทเซลลพชใชในวฏจกร ไทรคาบอกซเลต Tricarboxylic acid

(TCA) ของปฏกรยาหายใจ เชน ซเทรต (citrate) มาเลต (malate) ซกซเนต (succinate) หรอ ฟมาเรต (fumarate) ชวยใหเซลล และโพรโทพลาสตของพชเจรเได และยงบรรเทาผลเสย จากการใชแอมโมเนยม เปนแหลงไนโตรเจนเพยงอยางเดยว pyruvate มผลชวยสงเสรมการเจรเของเซลลทเลยงในปรมาณนอยๆ ได สวน ascorbic acid ชวยลดการเกดสน าตาล ของสารประกอบ phenolic ทเนอเยอพชบางชนดสรางขน และ

3

มผลยบยงการเจรเได นอกจากน กรดอนทรยบางชนด เชน เมส (MES หรอ 2 (N-morpholino) ethane sulphonic acid) ยงชวยรกษาสมดล ของความเปนกรดดาง ของอาหารสงเคราะหอกดวย

6. สารประกอบจากธรรมชาตทนยมใช เชน น ามะพราว กลวยบด มนฝรง สารสกดจากมอลต สารสกดจากยสต อมลชนปลา ถานกมมนต

(activated charcoal) สารประกอบจากธรรมชาตเหลาน ในบางครง ไมสามารถทดแทนกนได ดวยสารอนใด ในอาหารเลยงเนอเยอพช แตพบวา ใหผลดตอการเจรเ ของเนอเยอพชในหลอดทดลอง บางชนดยงชวยท าหนาทรกษาสมดลของความเปนกรดดาง และบางชนด ชวยดดซบสารทเปนพษ เนองจากมมากเกนไปดวย

7. สารควบคมการเจรเของพช ซงหมายรวมถงฮอรโมนพชดวย ทนยมใช ไดแก ออกซน และไซโทไคนน เนองจากจะชวยกระตนการ

แบงเซลล การเจรเเตบโต และการเกดเปนโครงสรางตางๆ ของเนอเยอพชในหลอดทดลอง โดยทออกซน และไซโทไคนน ทใสในอาหารสงเคราะห จะชวยเสรมฮอรโมน ทเซลลพชสรางขนเอง จากการทดลองเลยงเนอเยอยาสบ และพชอกหลายชนด พบวา ออกซนชกน าใหเกดแคลลส และในพชใบเลยงคหลายชนดพบวา หากใชออกซนรวมกบไซโทไคนน จะชวยใหแคลลส เพมปรมาณไดดขน นอกจากน จากการทดลองศกษาการสรางยอดและรากในยาสบ พบวา หากไดรบสดสวนของปรมาณออกซน : ไซโทไคนนต า เน อเยอทเลยงในหลอดทดลอง จะมการพฒนาเปนยอด และจะพฒนาเปนราก เมอไดรบสดสวน ของปรมาณ ออกซน : ไซโทไคนนสง สวนการเกดโซมาตกเอมบรโอ เชน ในการเลยงเนอเยอรากแครอตนน มกตองถกกระตนดวยออกซน เชน ทโฟร-ด (2, 4-D หรอ 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid) ในปรมาณสงกอน แลวจงลด หรองดการใหออกซน เพอใหเซลลของแคลลสพฒนา เปนโซมาตกเอมบรโอ การตอบสนองตอฮอรโมนในพชแตละชนด อาจตางกนได ทงน ขนอยกบชนดของเนอเยอ และชนดของพช ซงมระดบฮอรโมนภายใน ทแตกตางกน สวนฮอรโมน เชน จบเบอเรลลนส (gibberellins) น ามาใชเพอชวยใหยอดเจรเยดตวขนได แตมกมผลยบยงการเกดยอด ราก และโซมาตกเอมบรโอ เมอใชในปรมาณมาก ส าหรบสารยบยงการเจรเ เชน แอบซสซกแอซด (abscissic acid) นยมใชในการเพาะเลยงเนอเยอคอนขางนอย สวนสารชะลอการเจรเ เชน แพกโคลบวทราโซล (paclobutrazol) อาลาร (alar) ฯลฯ ใชอยบาง ในกรณทตองการชะลอการเจรเเตบโตของยอด เพออนรกษพนธพช ในหลอดทดลอง

8. สารทท าใหอาหารแขงตวและวสด พยงเนอเยอพช โดยทวไปมกใชวน (agar) และเจลาตนผสมลงในอาหารเพอท าใหแขงตว คณภาพ และราคา ของสาร

ทใชท าใหอาหารเลยงเนอเยอพชแขงตวมหลายระดบ ควรระมดระวงการใชสารคณภาพต า เนองจากไอออน แปง และไขมน ทปะปนอยจะไปท าปฏกรยากบองคประกอบอนๆ ของอาหาร และมผลยบยง การเจรเของเนอเยอพช นอกจากน วสดพยงเนอเยอ ในกรณเลยงในอาหารเหลว อาจใชกระดาษกรอง ทพบเปนสะพาน เพอวางเนอเยอพชไมใหจมลงไปใตอาหารเหลว ส าล และใยสงเคราะห กสามารถชวยพยงเนอเยอพชในอาหารเหลวได

4

สารเคมทจ าเปนในการเพาะเลยงเนอเยอพชแยกเปนหมวดหม ไดดงน

1. สารเคมทใชในการท าความสะอาด แยกเปนสารเคมทใชท าความสะอาดหองท างานและอปกรณเครองแกว เชน น ายาลางจาน ผงซกฟอก น ายาฆาเชอโรค สารเคมทใชในการท าความสะอาดชนพช ไดแก เอทานอล 95% เอทานอล 70% แคลเซยมไฮโปคลอไรด หรอน ายาคลอรอกซ เปนตน

2. สารเคมทใชในอาหารเพาะเลยง ซงประกอบดวยสารอนนทรยพวกเกลอแรตางๆ ทจ าเปนตอการเจรเเตบโตของพชและสารอนทรยทเตมในอาหาร เพอกระตนการเจรเเตบโต ไดแก ฮอรโมน วตามน กรดอะมโน น าตาล วน เปนตน ถาเปนหองปฏบตการขนาดเลก อาจจะสงซออาหารส าเรจมาใชเพอความสะดวกและรวดเรว

การเตรยมอาหารเพาะเลยง

ความส าเรจในการเพาะเลยงเนอเยอพชขนอยกบชนดของอาหารทใช ซงประกอบดวยธาตอาหารจ าเปนส าหรบการเจรเเตบโตของเซลลพชซงอาจแตกตางจากการเจรเเตบโตของตนพช เชน รากของมะเขอเทศทงตนเตบโตดวยธาตอาหารจากปยทให รวมทงสารอนทรยอนทใบสงเคราะหขน แลวสงไปยงราก สวนเนอเยอจากสวนราก เมอน ามาเพาะเลยงตองการปรมาณธาตอาหารตางออกไปเพอใหเจรเตามปกต ซงจะตองใสเขาไปในอาหาร เพราะวาไมไดรบจากใบเหมอนกรณแรก ซง White (1943) พบวารากมะเขอเทศสามารถเจรเเตบโตไดอยางไมจ ากด หากวาไดรบสารอาหารและไวตามนบางอยาง ดงนน ทงชนดและปรมาณของธาตอาหารและฮอรโมนจงมผลตอชนดของเนอเยอทเราตองการจะชกน าใหเกด ซง Skoog และ Miller (1957) ไดแสดงใหเหนถงผลของฮอรโมนทมตอการเกดรากหรอยอดของยาสบ เปนตน กลาวโดยรวมแลว พชทงตนหรอเนอเยอทน ามาเพาะเลยง มความตองการธาตอาหารในการเจรเเตบโตเชนเดยวกน นอกจากธาตอาหารหลกทมความตองการปรมาณมาก เรยกวา macronutrients แลวยงมธาตอาหารรองทตองการปรมาณนอย เรยกโดยรวมๆ วา micronutrients รวมทงฮอรโมน (หรอสารควบคมการเจรเเตบโต) ไวตามน แหลงของธาตคารบอน และอาจมสารอนทรยอนๆ ดวย รวมทงสนประมาณ 20 ชนด ธาตอาหารเหลานอยในรปของสารประกอบทางเคม ในการเตรยมอาหารจะตองน าสารเคมเหลานมาผสมรวมกนใหเหมาะสมส าหรบชนดพช ดงนน วตถประสงคของการเตรยมอาหาร กเพอใหรถงชนดและหลกการเตรยมอาหารส าหรบเพาะเลยงเนอเยอพช

วสดอปกรณ 1. สารเคมบรสทธชนดตางๆ 2. เครองชงชนดละเอยดและชนดหยาบ 3. เครองวดความเปนกรด-ดาง 4. หมอนงความดน 5. เครองกวนแมเหลก 6. ภาชนะแกวหรอพลาสตกชนดตางๆ

5

วธการ ก. การเตรยมหวเชอ (Stock Solution) เพอความสะดวกในการเตรยมอาหาร สารเคมทใชเปนองคประกอบสวนใหเจะตองเตรยมไวในรปของ Stock Solution มกจะเตรยมไวครงละ 1 ลตร ขนอยกบปรมาณของการใชบางชนดอาจเกบไวไดนานโดยการแชแขง การเตรยม Stock Solution ทกชนดทกลาวถงในทน มหลกเกณฑอยวาใหใสสารเคมลงในภาชนะทมน ากลนบรสทธ (ควรเปน double deionized distilled water) ภาชนะตองเปนแกว (หรอพลาสตกชนดทนการกดกรอนของสารเคมไดด) เชน Erlenmeyer flask หรอ beaker ขนาด 1-2 ลตร โดยใสสารทละชนด ในขณะทภาชนะตงอยบน magnetic stirring plate ทคนอยตลอดเวลา รอใหสารเคมแตละชนดละลายหมด จงเตมชนดอนตามลงไป เมอใสครบทกชนดแลว จงปรบปรมาตรใหไดตามทตองการ stock solution ทเปนไวตามนและฮอรโมน จะตองปรบปรมาตรดวย volumetric flask เสมอ สวน stock solution ทเปน macro-elements อาจปรบปรมาตรโดยใชประบอกตวงกได

1. Macronutrient Stock (ปรมาณเปนกรมตอลตร) ทจ าเปนจะใชม 4 ชนด

MSI B5I N6A YPI NH4NO3 16.50 - - 1.65 KNO3 19.00 25.00 - 25.00 CaCl2.2H2O 4.40 1.50 1.66 1.76 MgSO4.7H2O 3.70 2.50 1.86 3.70 KH2PO4 1.70 - 4.00 5.10 KCL - - - - (NH4)2SO4 - 1.50 4.62 - NaH2PO4.H2O - 1.50 - -

2. Micronutrient Stock (ปรมาณเปนกรมตอลตร) ใหปรบปรมาตรใน volumetric flask

MSII B5II N6B H3BO3 0.6200 0.3000 0.32 MnSO4.H2O 1.5640 1.0000 0.67 (หรอ MnSO4.4H2O = 0.88 ก. ) ZnSO4.7H2O 0.8600 0.2000 0.30 KI 0.0830 0.0750 0.16 Na2MoO4.2H2O 0.0250 0.0250 - CuSO4.5H2O 0.0025 0.0025 - CoCl2.6H2O 0.0025 0.0025 -

6

3. Vitamin Stock (ปรมาณเปนกรมตอลตร) ใหเตรยมใน volumetric flask

MSII B5II* N6B YPII Glycine 0.200 - 0.400 0.770 Thiamine.HCL 0.010 1.000 0.200 0.025 Nicotinic acid 0.050 0.100 0.100 0.130 Pyridoxine.HCL 0.050 0.100 0.100 0.025 Myo-inositol 10.000 10.000 - - D-Pantothenic acid - - - 0.025

* ใหเกบโดยการแชแขง กอนใชตองทงใหละลายจนหมดเสยกอนหรอแชน ารอนใหละลาย พวก Stock solution ชนดทตองเกบแชแขง อาจแบงใสขวดพลาสตกขนาดเลก เชน หลอดพลาสตกชนดทใชในหองปฏบตการทวไป แตไมควรใสเตมหลอด ซงนอกจากจะไมแตกเมอแชแขงแลว ยงสะดวกในการน ามาใชแตละครงดวย 4. อนๆ NaFeEDTA (0.1 M) (สารละลายเหลก) ถาใช Na2EDTA.2H2O ใหใช 37.22 กรม (ถาไมมน าใช 33.5 กรม) กบ FeSO4.7H2O จ านวน 27.8 กรม ใสรวมกนใน Erlenmeyer flask ขนาด 2 ลตร เตมน า 1 ลตร แลวตอสายยางตรงกลางมทกรองอากาศ โดยมส าลอดไมแนนเกนไปในหลอดแกวทตอเชอมสายยางดานหนงกบ pipette จมอยในสารละลาย ปลายสายยางอกดานหนงตอเขากบทอลม ส าลมไวดกเศษผงทอาจผานมากบอากาศ ปดฝาดวยฟอลย ใหมชองส าหรบอากาศออกได ปลอยอากาศผานเขาไปในของเหลวขณะทคนตลอดเวลา ปรบอากาศทเปาาใหแรง แตไมใหของเหลวกระเดนขนขางบน ปลอยทงไวประมาณ 5-6 ชวโมง หรอรอจนสารละลายใสกลายเปนสสนมเหลก แลวปรบปรมาตรดวย volumetric flask ใหครบ 1 ลตร แบงใสภาชนะสชาเกบในตเยน

2,4-D (100 mg/l) ชง 2,4-D 100 mg/l เทลงใน beaker 400 ml ละลายดวย 95% alcohol ประมาณ 2 ml เตมน ารอน 50-100 ml ลงใน beaker ลาง beaker หลายๆ ครง เพอให 2,4-D ออกใหหมดแลวเทลงในกระบอกตวงเกอบครบ 1000 ml แลวปรบ pH เปนประมาณ 5.0 แลวเตมน าจนครบ 1000 ml ใน Volumetric flask เทใสขวดแกวจกเกลยว เกบในตเยน

ABA (10 mM) ชง abscisic acid 264 mg ละลายดวย 0.1-1 N KOH ประมาณ 2 ml เมอละลายหมดแลว เตมน าประมาณ 80 ml ปรบ pH เปน 5.8 แลวปรบปรมาตรใน volumetric flask ใหได 100 ml จะได ABA stock 10 mM เกบโดยการแชแขง ใหหลกเลยงการถกแสงนานๆ อาจหมภาชนะบรรจดวยฟอลย เมอจะน ามาใชตองทงใหละลาย แบงบางสวนมากรอง (filter sterilized) ตามทตองการ แลวใชไปเปตดดใสอาหาร

7

6BA (หรอ BAP; 20 mg/L) ชง 6-benzyladenine (หรอ benzylaminopurine) 20 mg ละลายดวย 0.1 N HCLประมาณ 2-3 mL ใน beaker อาจเตม 1 N HCL 1-2 หยด เพอละลายดขนหรออาจอนใหรอนกได เตมน าลงใน beaker 50-100 mL ลางใหสารเคมออกใหหมดจาก beaker เลกแลวเทลงในภาชนะใหเขนใหเกอบครบ 1 ลตรกอนปรบ pH เปน 5 และปรบปรมาตรใน Volumetric flask 1000 mL เกบในขวดแกวในตเยน

IAA (100 mg/L) เตรยมวธเดยวกบ 2,4-D โดยใช indoleacetic acid 100 mg แบงเกบในหลอดพลาสตกแชแขง ให filter sterilize ลงในอาหาร เนองจากใชนอยอาจเตรยมเพยง 200 มล.

IBA (1 mM; 0.2 mg/mL) ชง Indolebutyric acid 21.3 mg ละลายดวย 2-5 mL 70% alcohol อาจอนใหรอนเลกนอย เพอใหละลายไดดขน เตมน าใหปรมาตรใกลเคยง 100 mL แลวจงปรบ pH ประมาณ 5 แลวปรบปรมาตรใน volumetric flask ใหได 100 mL แบงเกบในหลอดพลาสตก ถาเปนขวดแกวอาจจะแตกเมอแชแขง

NAA (100 mg) เตรยมวธเดยวกบ 2,4-D โดยใช naphthaleneacetic acid 100 mg เกบในขวดแกวในตเยน

Dicamba (175 mg/L) ละลาย dicamba 175 mg ในน ารอน หรออาจใช 70% alcohol ปรบปรมาตรใหครบลตร ใน volumetric flask เกบในขวดแกวในตเยน

Kinetin (20 mg/L) เตรยมวธเดยวกบ 6BA โดยใช Kinetin (6-furfurylamino purine) 20 mg เกบในขวดแกวในตเยน

Thaimine.HCL (100 mg/L) ละลาย thiamine.HCL 100 mg ในน า ปรบปรมาตรใน volumetric flask ใหครบ 1 ลตร เกบในขวดแกวในตเยน

Thidiazuron (TDZ; 0.1 mg/mL) เตรยม 100 mL โดยใช TDZ 10 mg ละลายใน volumetric flask ดวย DMSO (dimethyl sulfoxide) จ านวน 2-3 หยด ถายงไมละลายอาจใช 5N KOH 1-2 หยด เตมน าใหครบ 100 mL ใน volumetric flask จะไดสารละลายใสเกบไวในตเยน

TIBA (100 mg/L) ละลาย 2,3,5-triiodobenzoic acid จ านวน 25 mg ดวย 70% alcohol ประมาณ 1-2 mL แลวเตมน าใหครบ 250 mL ใน volumetric flask เกบในขวดแกวในตเยน (ใชวธกรองใสอาหาร)

8

GA3 (20 mg/L) ชง GA3 20 mg ละลายดวย 70% alcohol ประมาณ 2-3 mL ใน beaker อาจอนใหรอนเพอใหละลายดขนกได เตมน าลงใน beaker 50-100 mL ลางใหสารเคมออกใหหมดจาก beaker เลก แลวเทลงในภาชนะใหเขนใหเกอบครบ 1 ลตรกอนปรบ pH เปน 5.8 และปรบปรมาตรใน volumetric flask 1000 mL เกบในขวดแกวในตเยน

RT Vitamins อาจเตรยมไวครงละ 1 ลตร แบงเกบโดยการแชแขง เมอน ามาใชใหแชภาชนะบรรจในน าเยนจนละลายหมดกอน จะตอง filter sterilize เทานน เตรยมโดยใชสารตอไปน (ปรมาณ mg/L)

Nicotinic 200 Pyridoxine.HCL 200 D-Biotin (vitamin H) 100 Choline chloride 100 D-Pantothenic acid 100 Thiamine.HCL 100 Folic acid 50 p-Aminobenzoic acid 50 Riboflavin 50 Cyanocobalamin (B12) 0.15

หมายเหต การเตรยม RT vitamins อาจจ าเปนตองท าใหสารละลายมคา pH สง 7-9 เพอให folic acid ละลายแลวปรบ pH ใหเหลอ 7 ไดสารละลายสเหลองออน 8P Organic Acids (mg/100 mL)

Pyruvic acid (sodium salt) 200 Citric acid (anhydrous) 400 Malic acid 400 Fumaric acid 400

8P Sugars & Sugar Alcohol (g/100 mL)

Cellobiose 2.5 Mannitol 2.5 Mannose 2.5 Fructose 2.5

9

Rhamnose 2.5 Ribose 2.5 Sorbitol 2.5 Sucrose 2.5 Xylose 2.5

หมายเหต สงเกตวาปรมาณเปน mg และ g ตอน า 100 mL ทง 2 ชนดน ใหเกบโดยการแชแขง กอนใชตองท าใหละลายหมดเสยกอน สามารถใสอาหารกอนการนงได 8P Vitamins (mg/L)

Myo-inositol 10,000 L-ascorbic acid 200 Vitamin A (retinol) 1 Vitamin D3 (cholecalciferol) 1

HCL Stock (ส าหรบเครองวด pH) ใหเตรยมในตดดควน (hood) โดยใสในน า volumetric flask แลวแชไวในน าแขงใหเยนน าไปตงบน stirring plate และคนตลอดเวลา คอยๆ เตม conc. HCL (เขมขน 37%) จ านวน 416.5 มล. ลงไปชาๆ แลวปรบปรมาตรหลงจากเยนแลวใหครบ 1 ลตร จะได 5 N (normal) HCL

การเตรยม 1 N HCL ใหใช 200 mL HCL เขมขน 5 N ผสมน า 800 mL การเตรยม 0.1 N HCL ใหใช 20 mL HCL เขมขน 5 N ผสมน า 980 mL

KOH Stock เตรยม 10 N KOH ใหใช KOH บรสทธ 85% จ านวน 660.12 กรม หรอใช KOH 86.4% จ านวน 649.3 กรม คอยๆ เตมเกลด KOH ทละนอยลงใน flask ขนาด 2 ลตร ทตงบน stirring plate ทคนตลอดเวลา เมอละลายหมดแลวปลอยไวใหเยน จงปรบปรมาตรใหครบ 1 ลตร ใน volumetric flask

การเตรยม 5 N KOH ใหใช 10 N KOH 500 mL ผสมน า 500 mL การเตรยม 1 N KOH ใหใช 10 N KOH 100 mL ผสมน า 900 mL

การเตรยม 0.1 N KOH ใหใช 10 N KOH 10 mL ผสมน า 990 mL ถาใช NaoH (97%) เตรยม 10 N ใช 412.4 กรม/ลตร

Alcohol 70% (ปรมาตร 1 ลตร) ใช alcohol 95% จ านวน 737 mL ผสมกบน า 263 mL (ค านวณจากสตร V1P1=V2P2) V1 คอปรมาตรของ P1 (alc. 95%) ทจะตองใช V2 คอปรมาตรของ P2 (alc. 70%) ทตองการเตรยม หมายเหต สารละลายทเปน stock solution บางชนด หากไมคอยไดใชมากกควรเตรยมปรมาณลดลง เพราะไมควรเกบไวนานหลายเดอนเกนไป

10

ข. ชนดของอาหาร ความส าเรจในการเพาะเลยงเนอเยอพชในหลอดหรอภาชนะในหองเพาะเลยงขนอยกบปจจยหลายอยาง ทส าคเยงอยางหนงคอการเลอกใชอาหารทเหมาะสมกบชนดของเนอเยอและชนดพช องคประกอบของอาหารทส าคเคอ แรธาตอาหารทไดจากสารเคม แหลงของธาตคารบอน ไวตามน และสารควบคมการเจรเเตบโต อาจมบางชนดเพมเตมจากทกลาวนอกเพอวตถประสงคบางอยาง ชนดของอาหารทใชกนมากโดยเฉพาะอยางยงเมอตองการใหเนอเยอพฒนาเปนคนพช คอ MS (Murashige and Skoog, 1962) และ LS (Linsmaier and Skoog, 1965) นอกจากนกม B5 (Gamborg et al., 1968), N6 (Chu et al., 1975), SH (Schenk and Hildebrant, 1972) และ WPM (woody plant medium ของ Lloyd and McCown, 1980) ชนดหลงส าหรบเพาะเลยงพวกไมยนตน อาหารเพาะเลยงกลวยไมมหลายชนด เชน VW (Vacin and Went, 1949) Knudson (1922) และสตรดดแปลงจากอาหาร MS เปนตน แรธาตตางๆ 1. แหลงธาตคารบอน (Carbon Source) แหลงของสารอาหารทใหคารบอนทนยมใชมาก คอ น าตาลทราย (sucrose) หรอ glucose บางกรณอาจใช fructose, maltose, lactose และ galactose แต sucrose มราคาถกและใหผลดในอาหารสวนมาก

2. แรธาตจากสารเคม (Inorganic Salts) ปรมาณแรธาตทตองการในอาหารสตรตางๆ อาจผดแผกกนตามชนดของเนอเยอทใชมแรธาตทตองการมาก (macronutrients) ประกอบดวย N, P, K, Ca, Mg และ S สวนธาตอาหารทใชนอย (micronutrients) ทจ าเปนม Fe, Mn, Zn, B, Cu และ Mo อาหารบางชนดอาจตองใส Co, I, Na และ Cl

3. แรธาตจากสารอนทรย (Organic Source) แหลงส าคเของธาตไนโตรเจน คอ สารประกอบโปรตนตางๆ ซงจดเปนกลมกรดอะมโน เชน casein hydrolysate, casamino acids, asparagine, glutamine และ proline นอกจากนอาจใสสารประกอบอน เชน adenine ซงมกจะชวยการเกดเอมบรโอ

4. กรดอนทรย (organic Acids) บางกรณจ าเปนส าหรบการเตบโตของเซลลพชทเลยง ในอาหารทใชแอมโมเนยมเปนแหลงของไนโตรเจน จงตองใสกรดอนทรยบางชนด เชน citrate, succinate หรอ malate เปนตน ฮอรโมน สารควบคมการเจรเเตบโต (plant growth regulators) มความจ าเปนในอาหารหลายชนดและมกจะมสวนประกอบระหวาง auxin และ cytokinin ในอตราสวนทเหมาะสม ซงจะมผลถงการเกดยอดและราก สารพวก cytokinin (หรอทมผลคลายคลง) จะกระตนใหเกดยอด แตถามสารพวก auxin มกจะกระตนใหเกดราก สารทเปน cytokinin ทใชกนมาก เชน zeatin, kinrtin และ 6BA (6-benzyladenine) พวกทใชเปน auxin เชน 2,4-D, NAA, IBA และ IAA เปนตน และสารสงเคราะหอนทน ามาใช ไดแก 2,4,5-T (2,4,5-

11

trichlorophenoxy acetic acid), dicamba (3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid) และ picloram (4-amino-3,5,6,-trichloropicolinic acid) เปนตน ขอควรระวง ในการใชฮอรโมน คอการเสอมฤทธ ถาใชไมถกตอง สารบางชนดไมทนความรอนสง บางชนดเสอมสภาพดวยแสง Nissen และ Sutter (1990) พบวา IBA คงทนดกวา IAA หลงจากนง ไมวาจะอยในอาหารเหลวหรออาหารแขง อาหารเหลวหลงนงสเเสย IAA ถง 40% สวน IBA สเเสยเพยง 20% หรอเมอไดรบแสง 20 วน IAA ในอาหารแขงลดลงถง 97% สวน IBA ลดลงเพยง 60% เมอเทยบกบในทมด ซงลดลง 70 และ 30% ตามล าดบ ดงนน อาหารทเตรยมทงไวหลายวน ปรมาณฮอรโมนดงกลาวกลดลงมากแลว โดยเฉพาะอยางยงเมอไดรบแสง ดงนน อาหารทใชเพาะเลยงเนอเยอจงควรเปนอาหารทเตรยมใหม ไมควรใชอาหารทเกบไวนาน โดยเฉพาะอยางยงอาหารทมฮอรโมน การเตรยมอาหารจงเตรยมเพยงพอใชในชวงเวลาสนๆ และควรน าไปใชหลงจากเตรยมแลว 3-4 วน เพอแนใจวาไมมการปนเปอนดวยจลนทรยระหวางการเตรยมอาหาร ไวตามน ปกตพชสงเคราะหไวตามนตางๆ ไดเอง แตการใสไวตามนชวยใหเซลลเจรเเตบโตไดดขน เชน ไวตามนบ 1 (thiamine), ไวตามนบ 6 (pyridoxine), nicotinic acid และ myo-inositol เปนตน สารชนดหลงเปนแหลงของคารโบไฮเดรต แตมผลในการกระตนการเจรเเตบโตคลายพวกไวตามน จงมกจะเตรยมเปนหวเชอรวมกบพวกไวตามน อนๆ อาหารเพาะเลยงบางชนดส าหรบเฉพาะพชอาจตองการสวนประกอบของอาหารอยางอนอก เชน ผงถาน (activated charcoal) ซงจะชวยดดซบสารประกอบบางอยางทเนอเยอขบออกมาในอาหาร เปนการชวยใหเซลลเตบโตดขน แตกอาจดดซบสารประกอบบางอยางทใสลงในอาหารไดดวย จงกลบมผลเสยได ผงถานสามารถดดซบฮอรโมนไวมาก เชน ถาใสผงถาน 0.25% ในอาหารเหลว MS ทม IAA หรอ IBA ระหวาง 10-500 µM จะหมดฤทธโดยสนเชงถาใสออกซนดงกลาว 1000 µM จะเหลอ IAA 44.7% และ IBA 12.5% เทานนในอาหารเหลว อาหารทใชควรรองคประกอบทแนนอน เพอผลลพธทคงท อยางไรกตามบางกรณ องคประกอบบางอยางไมสามารถรสวนประกอบทแนนอน เชน น ามะพราว และวนทใชเตรยมอาหารแขง สตรอาหารทวๆ ไป ทมน ามะพราวซงอาจมรสารอาหารบางอยางทจ าเปนส าหรบการเจรเเตบโต มกจะใชน ามะพราว 10-15% โดยปรมาตร วนทใชควรจะบรสทธเทาทจะเปนไปได การเปลยนชนดของวนอาจมผลถงผลลพธทจะได ว นธรรมดาเตรยมจากสาหรายทะเล องคประกอบอาจไมแนนอน (ไมคอยบรสทธ) แมแตปรมาณวนทใชกขนกบชนดและตราหรอบรษทผผลต สวน Gelrite (ชอการคา) บรสทธกวา เพราะเปน polysaccharide ทไดจากแบคทเรย Pseudomonas เปนตน น าคนผลไมอาจจ าเปนส าหรบการเพาะเลยงบางชนด เหดหหนทใสลงในอาหารเพาะเมลดกลวยไมสกลรองเทานาร ชวยใหไดผลดกวาการไมใช เปนตน หรอตองใสกลวยหอม น าตมมนฝรง น ามะเขอเทศ หรอน าสมคน ในอาหารบางชนด

12

ความเปนกรดเปนดาง (pH=pondus hydrogenii=mass of hydrogen) อาหารสวนใหเจะไดรบการปรบความเปนกรด-ดาง ระหวาง 5.5-6.0 ถาต ากวา 5.5 วนอาจไมคอยแขงตว ถาสงเกนไปอาหารกจะแขงมาก ปกตแลวหลงจากนงอาหาร pH จะลดลงระหวาง 0.6 ถง 1.3 หนวย จะลดลงอกเมอเนอเยอพชขบถายกรดออกมา และจะมผลตอการเจรเเตบโตของเยอเยอ ตารางท Stock Solution ส าหรบสตรอาหาร MS, B5 และ VW

สารเคม MS1 B5 VW Macronutrients (g/l) (MSI) KNO3 19.0 5.25 NH4NO3 16.5 - (NH4)2SO4 - 5.0 MgSO4.7H2O 3.7 2.5 2.52 CaCl2.2H2O 4.4 1.5 - KH2PO4 1.7 - 2.5 NaH2PO4.H2O - 1.5 - Macronutrients (g/l) (MSII) (B5II) MnSO4.H2O - 1,000 57 MnSO4.4H2O 2,230 - (B5I) H3BO3 620 300 25.0 ZnSO4.7H2O 860 200 - KI 83 75 1.5 Na2MoO4.2H2O 25 25 - CuSO4.5H2O 2.5 2.5 - CoCl2.6H2O 2.5 2.5 - Vitamins (mg/L) (ใหเกบแชแขง) (MSIII) (B5III) Glycine 200 - - Nicotinic acid 50 100 - Pyridoxine.HCL 50 100 - Thiamine.HCL 10 100 - Myo-inositol 10,000 1,000 -

1. อาหาร LS เหมอน MS ยกเวนไวตามน ซงมเพยง Thiamine 0.4 มก./ลตร และ myo-inositol 100 มก./ลตร

2. บางคนเตรยมสารละลายนแยกตางหาก เดยวๆ เปน VWII 3. บางคนเตรยมสารนรวมกบ macronutrients โดยใชสารนหนกเปน มก./ลตร

13

ตารางท องคประกอบของอาหาร MS (Murashige and Skoog, 1962), B5 (Gambrog et al., 1968), N6 (Chu et al., 1975), NN (Nitsch and Nitsch, 1969), SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) และ WPM (Lloyd and McCown, 1980)

องคประกอบ MS1 B5 N6 NN SH WPM Major salts, mg/L NH4NO3 1,650 - - 720 - 400 KNO3 1,900 2,500 2,830 950 2,500 - CaCl2.2H2O 440 150 166 166 200 96 MgSO4.7H2O 370 250 185 185 400 370 KH2PO4 170 - 400 68 - 170 (NH4)2SO4 - 150 463 - - - NH4H2PO4 - - - - 300 - NaH2PO4.H2O - 150 - - - - Ca(NO3)2.4H2O - - - - - 556 K2SO4 - - - - - 990 Minor salts, mg/L KI 0.83 0.75 0.8 - 1.0 - H3BO4 6.2 3.0 1.6 10 5.0 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 - 3.3 19 - - MnSO4.H2O - 10 - - 10 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 2.0 1.5 10 1.0 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 0.25 0.25 0.25 0.1 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 0.025 0.025 0.025 0.2 0.25 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 - 0.025 0.1 - Na2.EDTA2 37.2 37.2 37.2 37.2 20 37.2 FeSO4.7H2O

2 27.8 27.8 27.8 27.8 15 27.8 Vitamins and organics, mg/L Myo-inositol 100 100 - 100 1,000 100 Nicotinic acid 0.5 1.0 0.5 5.0 5.0 0.5 Pyridoxine.HCL 0.5 1.0 0.5 0.5 0.5 - Thiamine.HCL 0.1 10 1.0 0.5 5.0 1.6 Glycine 2.0 - 40 5.0 - - Hormones, mg/L Auxin 0.1-5.0 0.1-5.0 0.2-2.0 -3 0.5 0.1-5.0 Cytokinin 0.01-2 0.01-2 1 -3 0.1 0.1-3.0 Sucrose 30 g 20 g 50 g 20 g 25 g 20 g pH 5.8 5.5 5.8 5.5 5.8 5.6

1. Linsmaier and Skoog (1965) medium มองคประกอบธาตอาหารเหมอน MS, แตไวตามนมเพยง Thiamine 0.4 มก./ลตร และ myo-inositol 100 มก./ลตร

2. Ferric NaEDTA หรอ Sequestrene 300 Fe อาจใชแทนสารเคมนได 3. ปรมาณขนกบชนดของอาหาร

14

6. ผงกระบวนการท างาน

เลอกสารเคมทเตรยมจากตเกบสารเคม

ศกษาวธการเตรยมสารเคมจากคมอ

ชงสาร, ละลายสาร,ปรบปรมาตร ตามคมอ

เทสารใสขวดทเตรยมไว พรอมเขยนฉลาก ขางขวดดวย

จดเกบสารเคมทเตรยมเรยบรอยแลวในตเยน

15

7. ขนตอนการปฏบตงาน

ท ขนตอน รายละเอยด 1 เลอกสารเคมทเตรยมจากตเกบสารเคม เลอกสารทตองการเตรยมจากตสารเคม 2 ศกษาวธการเตรยมสารเคมจากคมอ ศกษาวธการเตรยมใหละเอยดจากคมอการเตรยมสารเคม 3 ชงสาร, ละลายสาร,ปรบปรมาตร ตามคมอ ชงสาร, ละลายสาร,ปรบปรมาตรดวยน ากลน ตามคมอ 4 เทสารใสขวดทเตรยมไว พรอมเขยนฉลากแปะ

ขางขวดดวย เทสารใสขวดทเตรยมไว พรอมเขยนฉลาก วน/เดอน/ป ทเตรยมสารแปะขางขวดดวย

5 จดเกบสารเคมทเตรยมเรยบรอยแลวในตเยน จดเกบสารเคมทเตรยมเรยบรอยแลวในตเยน 8. แนวทางในการปฏบตงานของบคลากร

8.1 ใหค าแนะน าเกยวกบสารเคม และการเตรยมสารเคม 8.2 เลอกใชสารเคมและดวธการเตรยมใหถกตอง 9. มาตรฐานคณภาพงาน

9.1 เชควธการเตรยมสารเคมจากคมอและปฏบตตามใหถกตอง 10. ระบบตดตามประเมนผล

10.1

11. เอกสารอางอง

11.1 บทปฏบตการการเพาะเลยงเนอเยอพช ปยะดา ตนสวสด และอารย วรเญวฒก ฉบบปรบปรง 2551

11.2 http://kanchanapisek.or.th/kp6/sub/book/book.php?book=31&chap=5&page=t31-5-infodetail03.html

12. แบบฟอรมทใช -

13. ปเหา/ ความเสยงส าคเทพบในการปฏบตงานและแนวทางการแกไขปเหา

-

16

ภาคผนวก

17

ตารางผนวกท 1 รายชอสารเคมบางชนดพรอมน าหนกโมเลกล

ชอ สตรเคม น าหนกโมเลกล Ammonium dihydrogen phosphate NH4H2PO4 115.03 Ammonium monohydrogen phosphate (NH4)2HPO4 132.10 Ammonium chloride NH4CI 153.49 Ammonium hydroxide NH4OH 35.05 Ammonium nitrate NH4NO3 80.04 Ammonium sulfate (NH4)2SO4 132.14 Boric acid H3BO3 61.83 Calcium chloride CaCI2.2H2O 147.02 Calcium nitrate Ca(NO3)2.4H2O 236.15 Citric acid, anhydrous C6H8O7 192.13 Citric acid, mobohydrate C6H8O7.H2O 210.14 Cobalt chloride CoCI2.6H2O 237.93 Cobalt nitrate Co(NO3)2.6H2O 291.80 Cobalt sulfate CoSO4 155.00 Cupric chloride CuCI2.2H2O 170.50 Cupric sulfate, anhydrous CuSO4 159.60 Cupric sulfate, pentahydrate CuSO4.5H2O 249.68 EDTA, disodium salt Na2EDTA.2H2O 372.24 EDTA, sodium ferric salt (13% Fe) FeEDTA 366.85 Ferrous chloride FeCI2.2H2O 198.80 Ferrous sulfate FeSO4.7H2O 278.01 Glucose (dextrose) C6H12O6 180.16 HEPES N-2-hydroxyethyl acidpiperazine-N’-2-ethane sulfonic

C8H18N2O4S 238.30

Kinetin (6-furfuryl aminopurine) C10H9N5O 215.20 Magnesium chloride MgCI2.6H2O 203.30 Magnesium nitrate Mg(NO3)2.6H2O 256.40 Magnesium sulfate, anhydrous MgSO4 120.40 Magnesium sulfate, heptahydrate MgSO4.7H2O 246.48 Manganese sulfate, anhydrous MnSO4 151.00

18

ชอ สตรเคม น าหนกโมเลกล Manganese sulfate, monohydrate MnSO4.H2O 169.01 Manganese sulfate, tetrahydrate MnSO4.4H2O 223.01 Maltose, anhydrous C12H22O11 342.31 Mannitol C6H14O6 182.17 MES (2-N-morpholino-ethane sulfonic acid) 195.20 Myo-inositol C6H12O6 180.16 Potassium chloride KCI 74.56 Potassium dihydrogen phosphate KH2PO4 136.10 Potassium ferricyanide K3Fe(CN)6 329.30 Potassium ferrocyanide K3Fe(CN)6.3H2O 422.40 Potassium iodine KI 166.00 Potassium nitrate KNO3 101.10 Potassium hydroxide KOH 56.10 Potassium sulfate K2SO4 174.10 Silver nitrate AgNO3 169.90 Sodium chloride NaCI 158.40 Sodium dihydrogen phosphate NaH2PO4.H2O 138.00 Sodium monohydrogen phosphate NaH2PO4.7H2O 268.10 Sodium molybdate Na2MO4.2H2O 241.95 Sodium hydroxide NaOH 40.01 Sodium sulfate Na2SO4 142.17 Sorbitol C6H14O6 182.17 Sucrose C12H22O11 342.31 Zinc chloride ZnCI2 136.28 Zinc sulfate ZnSO4.7H2O 287.54

19

กรดอะมโน ค ายอ น าหนกโมเลกล Alanine ALA 89.09 Arginine ARG 174.20 Asparagine ASN 132.12 Aspartic acid ASP 133.10 Cysteine CYS 121.16 Glutamic acid GLU 174.13 Glutamine GLN 146.20 Glycine GLY 75.10 Histidine HIS 155.16 Isoleucine ILE 131.17 Leucine LEU 131.17 Lysine LYS 146.19 Methionine MET 149.21 Phenylalanine PHE 165.19 Proline PRO 115.13 Serine SER 105.09 Threonine THR 119.12 Tryptophan TRP 204.22 Tyrosine TYR 181.19 Valine VAL 117.15

ไวตามน น าหนกโมเลกล Fructose 180.16 Galactose 180.16 Glucose 180.16 Lactose 360.30 Maltose 360.31 Mannitol 182.17 Ribose 150.13 Sorbitol 182.17 Sucrose 342.31

20

ไวตามน น าหนกโมเลกล Xylose 150.13

ไวตามน น าหนกโมเลกล p-Aminobenzoic acid 137.13 Ascorbic acid 176.12 Biotin 244.30 Choline chloride 139.63 Folic acid 441.40 Myo-inositol 180.16 Nicotinamide (niacinamide) 122.12 Nicotinic acid (niacin) 123.11 Pantothenate, calcium salt 476.53 Pyridoxine hydrochloride 205.64 Riboflavin (vitamin B2) 376.40 Thiamine hydrochloride 337.28 Vitamin A (retinol) 286.45 Vitamin B12 1355.40 Vitamin D3 (cholecalciferol) 384.62

ฮอรโมนและสารควบคมการเจรเเตบโตพช ค ายอ น าหนกโมเลกล

Abscisic acid ABA 264.3 Adenine ADE 135.1 Adenine hemisulfate 184.2 Ancymidol ANC 256.3 N6-Benzyladenine (6-benzylaminopurine) BA 225.3 Chlorocholine chloride CCC 158.1 p-Chlorophenoxyacetic acid CPA 186.6 Dicamba (3,6-dichloro-o-anisic acid) DCA 221.0 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 221.0 6-(∂, ∂-Dimethylallylamino) purine (2-isopentenyladenine) 2iP 203.2

21

ฮอรโมนและสารควบคมการเจรเเตบโตพช ค ายอ น าหนกโมเลกล Gibberellic acid GA3 346.4 Indole-3-acetic acid IAA 175.2 Indole-3-butyric acid IBA 203.2 Jasmonic acid JA 210.3 Kinetin (6-furfurylaminopurine) KIN 215.2 1-Naphthaleneacetic acid NAA 186.2 Picloram (4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid) PIC 241.5 Silver nitrate AgNO3 169.9 Thidiazuron (N-phenyl-N’ –(1,2,3-thidiazol-5-yl) urea) TDZ 220.2 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 255.5 Zeatin ZT 219.2

ตารางผนวกท 2 สารเคมบางอยางทใชในงานเพาะเลยงเนอเยอและเกบรกษา

ชอสาร อกษรยอ น าหนกโมเลกล เกบท °ซ 1. Benzyladenine BA 225 5 2. Isopentenyl adenine or Dimethylallylamino purine

2iP 203 0

3. Kinetin KIN 215 0 4. Zeatin, trans isomer ZT* 219 0 5. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 221 5 6. Naphtaleneacetic acid NAA 186 5 7. Indolebutyric acid IBA* 203 5 8. Indoleacetic acid IAA* 175 0 9. Gibberellic acid GA* 346 0 10. Dicamba DCA 221 5 11. Picloram PIC 240 5 12. Abscisic acid ABA* 264 0 หมายเหต 1. สารเคมทมเครองหมาย * จะตอง filter sterilize เทานน ลงในอาหารทอน

22

2. การเตรยมหมายเลขท 1-4 ใหละลายใน 1 N HCl จ านวน 1-3 mL หรออาจอนเลกนอย แลวปรบ pH เปนประมาณ 5.8 การเตรยมหมายเลขท 5.10 ใหละลายใน 70% alcohol 1-3 mL อาจอนดวย แลวปรบ pH เปน 5.8 การเตรยมหมายเลขท 11-12 ใหละลายใน 1 N KOH 1-3 mL ปรบ pH เปน 5.8 ตารางผนวกท 3 คาแปลงจากมลลกรมตอลตรเปนไมโครโมลารของฮอรโมนบางชนด

(จาก Dixon and Gonzales, 1994) ชนดของฮอรโมน NAA 2,4-D IAA IBA BAP Kinetin 2iP Zeatin น าหนกโมเลกล 186.2 221.0 175.2 203.2 225.2 215.2 203.2 219.2 มลลกรม/ลตร (mg/L)

ไมโครโมลาร (µM)

0.0001 0.0005 0.0004 0.0005 0.0005 0.0004 0.0005 0.0005 0.0005 0.001 0.005 0.0045 0.006 0.005 0.004 0.005 0.005 0.005 0.005 0.027 0.023 0.028 0.025 0.022 0.023 0.025 0.023 0.01 0.054 0.045 0.057 0.049 0.044 0.046 0.049 0.046 0.05 0.27 0.226 0.285 0.246 0.222 0.232 0.246 0.228 0.10 0.54 0.452 0.570 0.492 0.444 0.465 0.492 0.456 0.25 1.34 1.13 1.43 1.23 1.11 1.16 1.23 1.14 0.50 2.69 2.26 2.85 2.46 2.22 2.32 2.46 2.28 1.0 5.37 4.52 5.71 4.92 4.44 4.65 4.92 4.56 5.0 26.85 22.62 28.54 24.61 22.20 23.23 24.61 22.81 10.0 53.71 45.25 57.08 49.21 44.40 46.47 49.21 45.62 25.0 134.26 113.12 142.69 123.03 111.01 116.17 123.03 114.05 50.0 268.53 226.24 285.39 246.06 222.02 232.34 246.06 228.10 ตารางผนวกท 4 สารควบคมการเจรเเตบโตทนยมใชในการเพาะเลยงเนอเยอพช

(ดดแปลงจาก Dixon and Gonzales, 1994) กลม ชอ ตวยอ ขอสงเกต

ออกซน (Auxin)

Indole-3-acetic acid IAA เปนออกซนธรรมชาต ใชชกน าแคลลสทความเขมขน 10-30 µM ใชความเขมขนต าลงท 1-10 µM จะกระตน organogenesis เสอมสภาพเมอถกแสง และถก oxidize โดยเซลลพชไดงาย มกนยมใชออกซนสงเคราะหดานดนมากกวา IAA

Indole-3-butyric acid IBA ใชชกน ารากจากยอดทพฒนาจากกระบวนการ organogenesis โดยอาจใชความเขมขนต า (1-50 µM) ตลอดระยะเวลาเกดราก หรอใชความเขมขนสง (100-250 µM) เปนเวลา 2-10 วน แลว

23

ยายไปยงอาหารปราศจากสารควบคมการเจรเเตบโต อาจใชจมเพอชกน ารากจากยอดภายใน/ภายนอกขวดทดลอง

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

2,4-D เปนออกซนสงเคราะหทนยมใชมากทสดในการชกน าแคลลส และเพาะเลยงแคลลส และเซลลแขวนลอย ในสภาพ dedifferentitate มกใชเดยวๆ (1-50 µM) หรอรวมกบ NAA

p-Chlorophenoxyacetic acid pCPA คลาย 2,4-D แตนยมใชนอยกวา 1-Naphtaleneacetic acid NAA สารสงเคราะหโครงสรางคลาย IAA นยมใชเปนออกซนเดยวๆ (2-

20 µM เพอชกน าแคลลสและการเจรเของแคลลส/เซลลแขวนลอย หรอ 0.2-2 µM เพอชกน าราก) หรอใชรวมกบ 2,4-D

ไซโตไคนน (Cytokinin)

6-Furfurylaminopurine (Kinetin) KIN มกใชในอาหารเพอชกน าแคลลส การเจรเของแคลลส และเซลลแขวนลอย และการชกน า morphogenesis (1-20 µM) ความเขมขนสงกวาน (20-50 µM) อาจใชกระตนการเพมปรมาณอยางรวดเรวของยอด ตาขาง/ตาพเศษ หรอเนอเยอเจรเ

6-Benzylaminopurine BAP ใชส าหรบชกน าแคลลส การเจรเของแคลลส และเซลลแขวนลอย (0.5-5.0 µM) ส าหรบชกน า morphogenesis (1-10 µM) นยมใชมากกวา Kinetin ในการกระตนการเพมปรมาณอยางรวดเรวของยอด ตา หรอเนอเยอเจรเ (5-50 µM)

N-Isopentenylaminopurine 2iP นยมใชนอยกวา KIN หรอ BAP ส าหรบชกน าและเพาะเลยงแคลลส (2-50 µM) ชกน า morphogenesis (10-20 µM) หรอเพมปรมาณอยางรวดเรวของยอด ตา หรอเนอเยอเจรเ (30-50 µM)

Zeatin ZT ใชนอยมากส าหรบอาหารเพาะเลยงแคลลสหรอเซลลแขวนลอยสามารถใชกระตน morphogenesis (0.05-10 µM) สลายตวเมอถกความรอน autoclave ไมได

จบเบอเรลลน (Gibberellin)

Gibberellin A3 GA3 มกไมใชในการเพาะเลยงแคลลสหรอเซลลแขวนลอย สามารถสงเสรมการเจรเของยอดเมอเตมในอาหารชกน ายอดท 0.03-14 µM และใชเพมการพฒนาของ embryo/ovule สลายตวเมอถกความรอน autoclave ไมได

กรดแอบไซสก (Abscisic acid)

Abscisic acid ABA ใชปองกนการงอกกอนก าหนด และสงเสรมการพฒนาทปกตของ somatic embryos ทความเขมขน 0.04-10 µM

หมายเหต ความเขมขนทใชเปนคาทรวบรวมจากผลงานตพมพส าหรบพชหลากหลายสปชส การใชกบพชชนดใดชนดหนงทไมมผทดลองมากอน ควรทดลองหาความเขมขนทเหมาะสมกอน