Actividades del CNA en la detección de alérgenos ... · • Aislamiento de los ácidos nucleicos: EXTRACCION • Amplificación y detección de las secuencias diana ... uso de un

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Actividades del CNA en la detección de alérgenos alimentarios: Detección de Avellana

mediante PCR

Mª del Camino Martín-Forero

Servicio de Biotecnología

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Reglamento (UE) Nº 1169/2011 del Parlamento Europeo y del Consejo,

sobre la información alimentaria facilitada al consumidor

Obligatoriedad de etiquetar por :

Presencia/ausencia del ingrediente alergénico, no a

partir de un determinado umbral del alergeno

ANEXO IICereales que contengan Gluten

CrustáceosHuevos

PescadosCacahuetes

SojaLeche

Frutos de cáscaraApio

MostazaSésamo

Sulfitos y dióxido de azufre>10mg/kgAltramucesMoluscos

……..y sus derivados

Jornadas de Referencia 2014. Análisis de alimentos. Majadahonda 10 al 12 de Junio

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Detección de alergenos mediante métodosBiológicos moleculares.

Consideraciones generales

Norma UNE-EN 15634-1(Septiembre-2009)


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Norma UNE-EN 15634-1

• Describe el procedimiento para detectar de forma cualitativa y/ocuantificar ADN como marcador de constituyentes o ingredientes alimentarios potencialmente alergénicos, mediante el análisis de ácidos nucleicos extraídos a partir de la muestra sometida a estudio

» Detección cualitativa de ADN diana

» Detección cuantitativa de ADN diana


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5.- PROCEDIMIENTO

• El análisis cualitativo consiste en la extracción específica y la detección de secuencias diana de ácidos nucleicos presentes en la porción para análisis

• Un resultado cualitativo debe demostrar claramente la presencia o ausencia de la diana estudiada, en relación a los controles apropiados y dentro de los límites de detección del método analítico empleado y de la porción para análisis analizada



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• Aislamiento de los ácidos nucleicos: EXTRACCION

• Amplificación y detección de las secuencias diana específicas

• Confirmación de la especificidad del fragmento amplificado

• Cuantificación de los fragmentos amplificados en referencia a los calibradores

5.2.-Generalidades



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6.-AISLAMIENTO/EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

• Preparación de la muestra

• Extracción de ADN

• Cuantificación del ADN

• Calidad del ADN:

▲Pureza A260/A280 . Libre de inhibidores

▲La calidad del ADN se puede comprobar mediante el uso de un sistema de PCR basado en la amplificación de una diana universal


Se recomienda

preparar

dos porciones

para análisis a partir

de cada muestra


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7.-AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIAS DIANA ESPECÍFICAS• 7.2.-Diseño de primers:

– Entre 18 y 30 nucleótidos de longitud.

– Se debe determinar experimentalmente la Tª óptima de hibridación.

– Mantener la proporción GC:AT en 50:50 o lo mas cercana posible

– Evitar los tramos Gs y Cs en segmentos cortos Mayor estabilidad interna

– Mínima complementariedad en extremos 3´para evitar los dímeros

– Mínima estructura secundaria interna

– Mínima formación de dímeros de la sonda de detección específica diseñada para la PCR

• Validación de los primers:

– Teórica

– Experimental: capacidad de discriminar de los mismos entre el ADN diana y clases, órdenes, familias, géneros y especies relacionadas REACTIVIDAD CRUZADA

Norma UNE-EN 15634-1Jornadas de Referencia 2014. Análisis de alimentos. Majadahonda 10 al 12 de Junio

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•7.3.-Procedimiento de PCR

– Reacción óptima no más de 40 ciclos. En aplicaciones de PCR en tiempo real puede utilizarse un nº de ciclos mayor

– Escoger un tamaño de amplicón adecuado a la muestra:

– para muestras procesadas ( ADNs desnaturalizados): 60-150 pb

– Para muestras no procesadas hasta 250 pb

– Las secuencias diana no tienen que provenir directamente del ADN que codifica las secuencias de las proteínas alergénicas, ya que estas no se detectan directamente. Pero tienen que ser específicas de la diana concreta

• Controles de la PCR

» Control positivo de ADN diana

» Control negativo de ADN diana

» Blanco de extracción

» Control de los reactivos de la amplificación: Agua


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10.-EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

• Expresión de un resultado positivo

“Para la muestra X se detectó la presencia de la secuencia diana Y”

• Expresión de un resultado negativo:

“Para la muestra X no se detectó la presencia de la secuencia

diana Y”El LOD del método es de x número de copias, determinadas con ABC (identificando el MR). Un nº de copias x corresponde a z mg de constituyentes alergénicos/kg de alimento


Expresión ambigua: +/-


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11.-INFORME DE ANÁLISIS

• Resultados expresados como ya se ha indicado

• Descripción de la especificidad del método analítico

• Material de referencia utilizado

• Referencia a esta norma europea


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ESTUDIO REALIZADO EN EL CNA

PARA COMPROBAR

LA EFECTIVIDAD DE LA

PCR DE AVELLANA


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Detección de ADN de avellana mediante PCR en tiempo real

• Determinación de la sensibilidad del ensayo

�Preparación de la avellana mezclada y molida

�Extracción de la mezcla de avellana

�Detección de ADN de Avellana

• Comparación PCR vs ELISA sobre muestras reales

• Comprobación del L.C. del ELISA mediante PCR

�Preparación de muestras cargadas


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Preparación del Patrón de Avellana

•Pesar avellanas molidas (mezcla 1:1 tostadas-crudas)

•Lavado con Hexanox 3

•Centrifugación

•Anotar cuidadosamente el peso del extracto seco

•Calcular la pérdida relativa de peso debida al desengrasado


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CTAB

Método Guanidina/Wizard®

EXTRACCIÓN DE ADN DEL PATRÓN DE AVELLANA


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RENDIMIENTOExtracción

Patrón de Avellana


ConcentraciónPureza

A260/280Método

42,6 1,56 G-Wizard

17 1,41 G-Wizard

21,1 1,37 G-Wizard

22 1,57 G-Wizard

19,4 1,49 G-Wizard

130,4 1,58 G-Wizard

237,7 1,59 G-Wizard

112,3 1,61 G-Wizard

117,9 1,62 G-Wizard

146,4 1,54 G-Wizard

114 1,59 G-Wizard

52,3 1,64 G-Wizard

44,4 1,61 G-Wizard

64,7 1,51 G-Wizard

55,8 1,58 G-Wizard

135 1,57 G-Wizard

68,6 1,47 G-Wizard

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PCR Avellana

COMPONENTE [ ] INICIAL [ ] FINAL µl/reacción

TaqMan Universal (BioRad)

12,5

Primer F 10µM 300nM 0,75

Primer R 10µM 300nM 0,75

Sonda 10µM 200nM 0,50

Agua libre de nucleasas 5,5

ADN 5

Volumen Total 25

ETAPA Tª (ºC) TIEMPO (s) Nº de CICLOS

1 DESNATURALIZACIÓN 95 180 1

2 AMPLIFICACIÓN 95 15

3 EXTENSIÓN 60 60 45

Secuencia diana : Gen que codifica la proteína Cor a 1


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Sensibilidad del ensayo

Sensibilidad: 0,005 ng de ADN de avellana

El tamaño del genoma de C.avellana es 0,48 pg(Bennett MD, Smith JB (1991) Philos Trans R Soc London B 334:309-345)

LD absoluto de 10 copias de genoma de avellana

•Preparación de solución de trabajo : 20 ng/ul de ADN•Curva: Concentración de 100 ng – 0,005 ng

CONCENTRACIÓN CURVA 1 CURVA 2 CURVA 3 CURVA 4 CURVA 5 CURVA 6 SD

ng

ST1 100 21,8196 20,1585 22,3154 21,0109 19,3769 18,1843 1,55

ST2 10 25,2469 23,3342 25,5869 24,2057 22,5807 21,3769 1,61

ST3 1 28,5956 26,5351 29,0228 27,5357 26,0347 24,8476 1,59

ST4 0,1 31,9123 29,8700 32,2767 30,8308 29,3236 28,1851 1,57

ST5 0,01 33,3778 32,8995 35,3786 34,6325 32,8088 31,3649 1,43

ST6 0,005 36,6321 34,1201 35,6541 35,0809 34,3196 32,5891 1,39

Pendiente -3,189 -3,227 -3,173 -3,339 -3,435 -3,339

R2 0,992 0,999 0,997 0,993 0,998 0,999

Eficiencia 106% 104% 107% 99% 96% 99%


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Comparación ELISA/PCR sobre muestras reales MUESTRA RESULTADO ELISA RESULTADO PCR

mg/kg

Bollo Qé caña.

8 37,35± 1,02

Galletasc/chocol

>20 36,54±1,33

Corazones barquillo

<2,5 ND

Conguitos

>20 38,50±3,85

Turrón de cacahuete

<2.5 38,33±1,41

Muestras DUDOSAS

(Puede contener trazas de avellana)

Cereales trigo y chocolate

>20 34,30±0,24

Muesli. Barritas cereales > 20 33,59±0,15

Barritas cereales.Avellanas

> 20 25,03±0,02

Palitos de trigo con chocolate y avellanas

> 20 27,37±0,05

Minis de Bollycao

> 20 29,63±0,06

Knoppers

> 20 24,07±0,05

Muestras POSITIVAS

(Figura Avellana como ingrediente)

Fruta y fibra

> 20 24,66±0,01

Phoskitos .Crash (2%) <2.5 ND

Copos de maíz

< 2.5 ND

Desayuno a la taza

< 2.5 ND

MiniDinosaurios

< 2.5 ND

Pan molde sin corteza

< 2.5 37,33±0,46

Muestras NEGATIVAS

(No figura avellana como ingrediente)

Galletas multivitaminadas

9 37,69±0,82


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Comprobación del L.D. del ELISA mediante PCR

• Se prepararon muestras negativas cargadas:

– al L.C del ELISA (2,5 mg/kg)

– al doble del L.C (5 mg/kg)

• Detección de ADN de avellana mediante PCR cualitativa (PCR en tiempo real)

•Muestras por duplicado / 3 réplicas de PCR

•Controles positivos:

•LD absoluto (0,005 ng de avellana≈ 10 copias)

•0,01 ng ≈20 copias


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33,19±1,67Control L.D. (0,01 ng)

MUESTRAS BLANCO NIVEL 2,5 mg/kg NIVEL 5 mg/kg

Control L.D. (0,005 ng) 34,73±1,41

Control efecto matriz (Arroz) 35,89±0,56 37,26±1,36

Turrón ND 37,41±2,51

Cereales infantiles ND 40,60±0,44

Galletas maría ND 36,95±0,66

Corazones barquillo 36,49±1,01 36,29±1,64

Galletas 37,04±0,92 36,87±1,03

Minidinosaurios choc. 36,20±0,91 35,76±1,08

Bizcocho 36,81±2,02 35,04±1,29

Copos de maíz ND 38,56±0,47

Phoskitos Crash ND 40,87±1,23

Desayuno a la taza ND 41,46±1,44


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1.- Los resultados obtenidos mostraron que los métodos de PCR podrían considerarse una opción válida para la detección de avellana en muestras de alimentos

2.- El sistema de PCR en tiempo real utilizado en este trabajo, mostrósuficiente sensibilidad para la detección de ADN de avellana.

3.- Mediante el estudio comparativo PCR vs ELISA se comprobó que el método era capaz de detectar ADN de avellana en las muestras en las que se había detectado proteína alergénica.

4.- En algunas ocasiones, en muestras complejas, no ha sido posible la detección mediante PCR de una concentración de avellana igual al Límite de Cuantificación de la técnica ELISA, posiblemente debido al efecto matriz.


CONCLUSIONES

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Muchas gracias!!

Servicio de BiotecnologíaMª Isabel Prieto Santos [email protected] 913380688Mª del Camino Martín-Forero [email protected] 913380928Mercedes Fernández de la PueblaMª Isabel Rodríguez PérezSilvia Gil AlcaldeJosefina Gangoso HerrerasEsther Rico CañadaMªLuisa Salvador PulgarMíriam Gómez Martín

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