Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Oleh :
Didik Wahyudi(1), Sutarno (2), Artini Pangastuti (2) 1. Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta
2. Prodi Biosains Pasca Sarjana UNS Surakarta
QUORUM SENSING Suatu proses yang memungkinkan bakteri dapat
berkomunikasi dengan mensekresikan molekul sinyal
yang disebut autoinducer atau molekul sinyal sebagai
bahasa.
Proses ini memungkinkan suatu populasi bakteri dapat
mengatur ekspresi gen tertentu, tingkah laku dan
fenotipiknya, yang bergantung kepada jumlah populasi
bakteri tersebut dan akumulasi autoinducernya.
Beberapa Peneliti Sistem Quorum Sensing Bakteri
Indiana University
Clay Fuqua
Yonsei University, Seoul, Korea
Selatan.
Yaya Rukayadi
Allison L Adonizio
Florida International
University Miami
MassachusettsUniversity
Djordjevic
DENMARK
UNIVERSITY
Fajar Mustika
School of Life Sciences andTechnology
- ITB
SISTEM QUORUM SENSING BAKTERI
MENGENDALIKAN EKSPRESI GEN
BIOLUMINESCENS
SEKRESI VIRULENSI FACTOR PRODUKSI PIGMEN
(Taga dan Bassler, 2003).
SPORULASI
PEMBENTUKAN BIOFILM
PRODUKSI TOKSIN MOTILITAS
http://www.quiestech.com/content/science/quorum-sensing_more.asp
QUORUM SENSING BLOCKING
Ekstrak Alpina galanga
???
1. sistem quorum sensing, dapat dikembangkan
untuk pengendalian infeksi yang dilakukan
dengan mencegah pengumpulan massa
bakteri atau merusak sistem komunikasinya.
2. Produksi Eksopretease dikendalikan oleh
sistem quorum sensing, sehingga produksi
eksoprotease bisa dijadikan indikator sistem
quorum sensing
BIOFILM BAKTERI Biofilm adalah istilah yang digunakan untuk menggambarkan
suatu lingkungan kehidupan yang khusus dari sekelompok
mikroorganisme, yang melekat ke suatu permukaan, menjadi
mikrolingkungan yang unik.
Ada lima tahap perkembangan
biofilm P. aeruginosa
1. initial attachment
2. irreversible attachment
3. maturation I
4. maturation II
5. dispersion
Pseudomonas aeruginosa
Phylum : Proteobacteria
Class : GammaProteobacteria
Order : Pseudomonadales
Family : Pseudomonadaceae
Penyebab Nosokomial infeksi
paling tinggi dibandingkan
bakteri jenis lainnya (26%)
(Bagian Mikrobiologi Klinik
RSPM Jakarta, 1998).
Lengkuas (Alpinia galanga L)
Klas :Monocots Order :Zingiberales Family :Zingiberaceae Catherine (2002)
Khasiat:
antibakteri, anti fungi, anti tumor,
analgenikum, anti kembung, obat
penyakit kulit. sakit perut , radang
tenggorokan, diare, sariawan, herpes
Zat Kimia yang terkandung dalam Ekstrak etanol Alpinia galanga L
• eskuifelandren.
• fenolik
• ester asam lemak
• asam lemak
• galanal A
• galanal B,
• galanolakton,
• terpen, dan lain-lain.
• asetokavikol asetat,
• p-coumaril siasetat,
• asam palmitat,
• eugenol,
• asetosiugenol asetat,
• bisabolene,
• farnesen,
RUMUSAN PERMASALAHAN
1. Apakah ekstrak Alpinia galanga L mampu menghambat sistem
quorum sensing (produksi eksoprotease, jumlah sel bakteri
dan produksi biofilm) pada Pseudomonas aeruginosa?
2. Berapakah konsentrasi ekstrak Alpinia galanga L yang paling
efektif dalam menghambat sistem quorum sensing (produksi
eksoprotease, jumlah sel bakteri dan produksi biofilm) pada
Pseudomonas aeruginosa?
3. Apakah terdapat perbedaan kemampuan penghambatan
sistem quorum sensing pada Alpinia galanga L yang diperoleh
dengan pelarut polar (eatanol) dan semi polar (etil asetat)?
Sistem Quorum sensing
Pseudomonas aeruginosa
Acyl Homoserin
lactone,
Esktrak Alpinia galanga L
Ekspresi Gen untuk
Faktor Virulensi
Pembentukan Biofilm
Patogen
Penyakit Infeksi
Sistem Quorum Sensing dihambat!
Bakteri Tidak membentuk
Faktor Virulensi dan Biofilm
Tidak Menjadi
Patogen
Infeksi Dihambat.
HIPOTESIS
Ekstrak Alpinia galanga L mempunyai kemampuan dalam menghambat sistem quorum sensing (produksi eksoprotease, jumlah sel bakteri dan produksi biofilm) pada Pseudomonas aeruginosa.
Ada perbedaan kemampuan penghambatan sistem quorum sensing pada Pseudomonas aeruginosa oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut polar (eatanol) dan semi polar (etil asetat).
Waktu dan Tempat Penelitian
Laboratorium Bakteriologi dan Kimia Farmasi AAK Nasional Surakarta pada bulan November 2009 - Juni 2010. Jl. Yos Sudarso 338 Surakarta 57155.
Laboratorium Mikrobiologi, Media Reagensia Balai dan Laboratorium Kimia Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta (Lab. rujukan Nasional bidang Mikrobiologi Klinik, ISO 17025:2005). Bulan Desember 2009 – Juni 2010.
Analisis Data
Ekstraksi Alpinia galanga L
isolasi & Persiapan Bakteri Uji Persiapan Media Biakan
Uji Penghambatan Quorum Sensing
Uji pembentukan Biofilm: Microtiter Plate Polivinil Clorida (PVC)
Kurva Pertumbuhan
BAKTERI UJI
Bakteri strain. Pseudomonas aeruginosa diperoleh dari
Pseudomonas aeruginosa yang diisolasi dari Rumah Sakit
Umum Dr. Moewardi Surakarta
Lengkuas (Alpinia galanga L)
Alpinia galanga L (Lengkuas) yang digunakan dalam penelitian ini adalah jenis Lengkuas
merah besar berumur 4 – 5 bulan, yang didapatkan dari Perkebunan Tanaman Obat di Kecamatan Jatiyoso, Kabupaten Karanganyar,
Provinsi Jawa Tengah
Persiapan Media Biakan
Media yang digunakan dalam
penelitian ini adalah media
Luria-Bertani (LB) dilengkapi
dengan 0,5% glukosa dan 2 %
susu skim (media AB,
mengandung 2,5 mg tiamin /
liter). semua strain yang
diinkubasi pada 37 ° C.
Alpinia galanga L 1 kg DIPARUT & DIKERINGKAN
100 g rimpang diekstrak dalam 500ml etanol 70%
selama 24 jam
DISARING,
Filtrat dievavorasi dengan
Rotary Evaporator
40C Vakum
Setelah kering di tambah 10 ml etanol dan 20 ml
heksana
Dikocok, lapisan etanol dikeringkan jadi kristal
di Larutkan dalam etanol 1% (1:100 w/v)
inokulasi P. aeruginosa ke media agar dengan
spot plate
media LB Agar + 0,5% Glukosa + 2% susu skim
Ditunggu sampai
dingin dan keras
Inkubasi pada suhu 30 C 24 jam
Adanya zona hambatan
disekitar koloni indikasi
adanya enzim
eksoprotease
Pengujian Kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease P. aeruginosa
Endapan dipisahkan, filtrat akan membentuk
warna bila direaksikan dengan NaOH.
Intensitas warna diukur dengan
spektrofotometer OD 440 nm.
Tujuan untuk mengetahui aktivitas
enzim eksoprotease P. aeruginosa.
Prinsip pengujian berdasarkan
metode Hanlon dan Hodges (1981);
kemampuan enzim protease untuk
menghidrolisis Azocasein.
Residu azocasein yang tidak dapat
terhidrolisis oleh enzim eksoprotease
akan diendapkan oleh tricloro acetic acid
Pengukuran Pertumbuhan Bakteri
Kurva pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa diukur dengan
spektofotometer (OD 600nm)
Kultur P.a terhambat diinkubasi dalam 10 ml TSBYE 32C, 24 jam
0,1 ml kultur di TSBYE dipindahkan ke 10 ml LB Broth
VORTEX
100µl dipindahkan ke microtiter Plate PVC
Ditutup dan diinkubasi pada 32C,
20 – 40 jam
Kekeruhan sel dipantau menggunakan
microtiter pembaca pada OD 595
Di bandingkan dengan kontrol
Pewarnaan dengan kristal violet 1%,
lalu dicuci
Analisis kuantitatif
HASIL PENELITIAN
NO
NAMA OBAT
KODE
POTENSI OBAT
(µ GRAM)
HASIL
1 Amoxycillin AML 10 Resisten
2 Amoxycillin Clav.Acid AMC 30 Resisten
3 Cefriaxone CRO 30 Sensitif
4 Ceffazidime CAZ 2 Resisten
5 Clindamisin DA 5 Resisten
6 Ciprofloxacine CIP 5 Resisten
7 Penicillin G P 30 Resisten
8 Sulfamethaxazole SXT 100 Resisten
9 Fosfomycin FOS 50 Sensitif
10 Trimetrhoprim W 5 Resisten
11 Streptomycin SXT 10 Resisten
12 Meropenem MEM 30 Sensitif
13 Imipenem IPM 30 Sensitif
14 Nalidic Acid NA 30 Resisten
15 Amikacin AK 300 Resisten
16 Cloramphenicol C 30 Resisten
17 Gentamycin CN 10 Sensitif
18 Netilmycin NET 15 Sensitif
19 Novobiocin NV 5 Resisten
20 Cephalothin KF 20 Resisten
21 Cefuroxime CXM 30 Resisten
22 Kanamycin KF 15 Resisten
23 Cefepime FEP 30 Sensitif
24 Cefoxitin FOX 30 Resisten
25 Coumpounds CMP 300 Sensitif
26 Ofloxacin OFL 30 Resisten
27 Piperacillin PPR 100 Sensitif
Has
il U
ji Se
nsi
tivi
tas
anti
bio
tik
P. a
eru
gin
osa
H
asil
Iso
lasi
dar
i RSU
Dr.
Mo
ew
ard
i Su
raka
rta
Kurva Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa
Jam
ke
Absorbansi
Jumlah
Bakteri
Log Jumlah
Bakteri
0 0.124 8,9 x 105 5.94939
2 0.119 9,8 x 105 5.98900
4 0.137 3,2 x 106 6.50515
6 0.243 7,7 x 107 7.88649
8 0.482 8,2 x 108 8.91381
10 0.752 1,8 x 1010 10.25527
12 1.066 8,7 x 1011 11.93952
14 1.123 9,8 x 1011 11.99123
16 1.162 3,3 x 1011 11.51851
18 1.104 9,8 x 1011 11.99123
20 1.178 6,2 x 1011 11.79239
22 1.089 8,4 x 109 9.92427
24 1.092 1,4 x 109 9.14612
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Ab
sorb
ansi
Jam ke
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni Pseudomonas
aeruginosa dengan pemberian ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut Etanol
pada medium pertumbuhannya
Konse
ntrasi
Rata-rata Diameter Rata-rata
Luas
Zona Bening
(mm)
Koloni
(mm)
Zona
Bening
(mm)
0% 13.7 18.0 107.7
2% 12.3 16.3 90.1
4% 10.7 14.7 79.6
6% 8.7 10.7 30.4
8% 8.0 0.0 0.0
10% 5.0 0.0 0.0
12% 4.0 0.0 0.0
kontrol 2%
4%
6% 8%
10%
12%
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni Pseudomonas aeruginosa dengan pemberian ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etil
asetat pada medium pertumbuhannya
Konse
ntrasi
Rata-rata Diameter Rata-
rata Luas
Zona
Bening
mm
Koloni
(mm)
Zona
Bening
(mm)
0% 13.0 17.0 94.3
2% 12.0 15.3 71.2
4% 11.3 13.3 38.8
6% 9.0 11.0 31.4
8% 7.0 0 0
10% 6.7 0 0
12% 4.7 0 0
kontrol 2%
8%
10%
12%
6%
4%
No Perlakuan Rata-rata
0 Kontrol 0.872a
1 kontrol + DMSO 0.737a
2 6% Ekstrak dengan pelarut etanol 0.726a
3 8% Ekstrak dengan pelarut etanol 0.655b
4 6% Ekstrak dengan pelarut Etil Asetat 0.705a
5 8% Ekstrak dengan pelarut etil asetat 0.671b
Nilai Rata-rata produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa pada
beberapa perlakuan dengan ekstrak A. galanga L.
Ket : Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
Kurva produksi enzim eksoprotease Pseudomonas aeruginosa
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
U/m
l
Jam ke
kontrol kontrol + DMSO 6% Ekstrak etanol
8% ekstrak etanol 6% Ekstrak Etil Asetat 8% ekstrak etil asetat
Pengukuran Pertumbuhan P. aeruginosa pada berbagai perlakuan
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
OD
(6
00
nm
)
Jam Ke
kontrol kontrol + DMSO 6% Ekstrak etanol
8% ekstrak etanol 6% Ekstrak Etil Asetat 8% ekstrak etil asetat
kontrol (0) ekstrak 6%
pelarut etanol
(1)
ekstrak 6%
pelarut etil
asetat (2)
ekstrak 8%
pelarut etanol
(3)
ekstrak 8%
pelarut etil
asetat (4)
20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam
2.548a 2.503a 1.746b 1.503b 1.722b 1.488b 1.582b 1.226b 1.606b 1.254b
Rata-rata Produksi biofilm (berdasarkan Optical Density) pada P.
aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak
A. galanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat pada konsentrasi
6% dan 8%.
Ket : Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata.
Rata-rata Produksi biofilm pada Pseudomonas aeruginosa yang
terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak Alpinia galanga L
dengan pelarut etanol dan etil asetat pada konsentrasi 6% dan 8%.
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam
kontrol Ekstrak 6% pelarut etanol
Ekstrak 6% pelarut Etil
Asetat
Ekstrak 8% pelarut etanol
Ekstrak 8% pelarut Etil
Asetat
OD
(5
95
nm
)
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
kontrol ekstrak 6% pelarut etanol
ekstrak 6% pelarut Etil
Asetat
ekstrak 8% pelarut etanol
ekstrak 8% pelarut Etil
Asetat
OD
(5
95
nm
) Penurunan Pembentukan Biofilm P. aeruginosa
KESIMPULAN
• Ekstrak Alpinia galanga L mampu menghambat uorum sensing pada P. aeruginosa (pada konsentrasi 8% mampu menghambat produksi eksoproteasenya namun tidak menghambat pertumbuhan selnya, dan pada konsentrasi 6% mampu menghambat pembentukan biofilmnya).
• Tidak ada perbedaan kemampuan penghambatan
quorum sensing pada Pseudomonas aeruginosa oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut polar (etanol) dan semi polar (etil asetat).
TERIMA KASIH