Embed Size (px)
Citation preview
T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİMDALI
ALFA TALASEMİ MUTASYONLARININ DNA DİZİ ANALİZİ İLE BELİRLENMESİ
Figen GÜZELGÜL
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DANIŞMANI
Prof. Dr. Kıymet AKSOY
ADANA-2010
ii
T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİMDALI
ALFA TALASEMİ MUTASYONLARININ DNA DİZİ ANALİZİ İLE BELİRLENMESİ
Figen GÜZELGÜL
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DANIŞMANI
Prof. Dr. Kıymet AKSOY
Bu tez, Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından
TF2009YL17 nolu proje olarak desteklenmiştir.
Tez No.................
ADANA-2010
iii
TEŞEKKÜR
Çalışmam sırasında bilimsel katkıları ile bana yardımcı olan, eğitimim süresince
büyük özveri ve sabrıyla yardımlarını esirgemeyen, saygıdeğer tez danışmanım Prof.Dr.
Kıymet AKSOY’a çok teşekkür ederim.
Ders aşamasında teorik bilgilerini aktaran, pratik alandaki uygulamalarımda
yardımlarını esirgemeyen Prof.Dr. Nurten Dikmen’e, Prof.Dr. Levent Kayrın’a, Prof.Dr.
Akif Çürük’e ve Prof.Dr. Abdullah Tuli’ye teşekkür ederim.
Yüksek lisans öğrenimim sürecinde desteklerini ve tecrübelerini paylaşan Dr.
Erdinç Yalın’a, Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Asistanlarına, teknik ve diğer
personellere de teşekkür ederim.
Öğrenim hayatım boyunca sabırlarından ve desteklerinden dolayı tüm aileme
çok teşekkür ederim.
Tez çalışmamı TF2009YL17 nolu proje ile maddi olarak destekleyen Çukurova
Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne teşekkür ederim.
iv
İÇİNDEKİLER
KABUL ve ONAY............................................................................................................ii
TEŞEKKÜR.....................................................................................................................iii
İÇİNDEKİLER ................................................................................................................iv
ŞEKİLLER DİZİNİ.........................................................................................................vii
ÇİZELGELER DİZİNİ.....................................................................................................ix
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ.......................................................................x
ÖZET...............................................................................................................................xii
ABSTRACT...................................................................................................................xiii
1.GİRİŞ ve AMAÇ............................................................................................................1
2.GENEL BİLGİLER........................................................................................................3
2.1. Hemoglobin Molekülünün Tarihçesi......................................................................3
2.2. Hemoglobin Molekülünün Yapısı..........................................................................3
2.2.1.Hem’in Yapısı...............................................................................................5
2.2.2.Globin Zincir Gen Yapısı.............................................................................7
2.2.2.1.α-Benzer Globin Gen Kümesi...................................................................7
2.2.2.2.β-Benzer Globin Gen Kümesi...................................................................9
2.3.Hemoglobin Molekülünün Kalıtsal Bozuklukları.................................................10
2.3.1.Anormal Hemoglobinler.............................................................................11
2.3.2.Talasemiler..................................................................................................13
2.3.2.1.β-Talasemi...............................................................................................13
2.3.2.2.α-Talasemi...............................................................................................14
2.3.2.2.1.Delesyonel α-Talasemiler.....................................................................15
2.3.2.2.1.1.α0-Talasemiler....................................................................................15
2.3.2.2.1.2.α+-Talasemiler....................................................................................17
2.3.2.2.2. Delesyonel Olmayan (Nondelesyonel ) α-Talasemiler........................19
2.3.2.2.2.1.RNA “Splincing”i Etkileyen Mutasyonlar........................................20
2.3.2.2.2.2.Poli A Kuyruğu Sinyalini Etkileyen Mutasyonlar.............................20
2.3.2.2.2.3.mRNA Translasyonunun Başlamasını Etkileyen Mutasyonlar.........21
v
2.3.2.2.2.4.Frameshift Delesyonları ....................................................................22
2.3.2.2.2.5.Zincir Sonlanma Mutasyonları..........................................................23
2.3.2.2.3.α-Talasemilerin Klinik Tablosu............................................................25
2.3.2.2.3.1.Sessiz Taşıyıcı....................................................................................26
2.3.2.2.3.2.Hemoglobin Trait...............................................................................26
2.3.2.2.3.3. Hemoglobin H...................................................................................27
2.3.2.2.3.4.Hemoglobin Bart’s.............................................................................28
2.3.2.2.4. α-Talasemilerin Coğrafik Dağılımı ve İnsidansı.................................30
2.3.2.2.4.1.Dünyada α-Talasemi İnsidansı..........................................................30
2.3.2.2.4.2.Türkiye’de α-Talasemi İnsidansı.......................................................31
2.3.2.2.4.3.Çukurova’da α-Talasemi İnsidansı....................................................32
3.GEREÇ VE YÖNTEM.................................................................................................33
3.1.Gereçler..........................................................................................................33
3.1.1.Cihazlar.......................................................................................................33
3.1.2.Kimyasal Malzemeler.................................................................................34
3.2.Örnek Seçimi.................................................................................................35
3.3.Yöntemler......................................................................................................35
3.3.1.Hematolojik Çalışmalar..............................................................................35
3.3.2. Hemoglobin Elektroforezi.........................................................................35
3.3.3.Mikrokolon Kromatografisi ile Hb A2 Ölçümü..........................................37
3.3.4. Modifiye Betke Yöntemi ile Fetal Hemoglobin (Hb F) Ölçümü...............38
3.3.5.Oraklaşma Testi..........................................................................................39
3.3.6.Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC)...........................................39
3.3.7.Tam Kandan DNA İzolasyonu...................................................................41
3.3.8.ARMS Yöntemi ile Mutasyonların Belirlenmesi.......................................43
3.3.8.1. Agaroz Jel Elektroforezi.........................................................................46
3.3.9. Gap PCR Yöntemi ile α-Talasemi Mutasyon Taraması............................46
3.3.9.1. .Agaroz Jel Elektroforezi........................................................................48
3.3.10. DNA Dizi Analizi....................................................................................49
3.3.10.1.Hedef DNA’nın Çoğaltılması ve İşaretlenmesi.....................................49
3.3.10.1.1. Hedef DNA’nın Çoğaltılması............................................................51
3.3.10.1.1.1. Agaroz Jel Elektroforezi.................................................................52
vi
3.3.10.1.2. Çoğaltılmış DNA’nın İşaretlenmesi..................................................53
3.3.10.1.3. Pürifikasyon.......................................................................................54
3.3.10.2.DNA Dizi Analizi Cihazına Örnek Yüklenmesi....................................54
3.3.10.2.1.Örneklerin Cihaza Yüklenmesi...........................................................56
3.3.10.2.2.Verilerin Değerlendirilmesi................................................................57
4.BULGULAR................................................................................................................58
5.TARTIŞMA..................................................................................................................71
6.SONUÇLAR VE ÖNERİLER.....................................................................................79
7.KAYNAKLAR.............................................................................................................80
EK-1: Etik Kurul Onay Formu........................................................................................89
EK-2: Denek Bilgilendirme ve Rıza Olur Formu............................................................90
ÖZGEÇMİŞ....................................................................................................................91
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1.Hemoglobin molekülünün yapısı.......................................................................4
Şekil 2.2.Embriyonik ve fetal gelişimin farklı evrelerinde globin zincir sentezi..............5
Şekil 2.3.Hem’in yapısı.....................................................................................................6
Şekil 2.4. Hem halkasının oksijene ve histidine bağlanması...........................................6
Şekil 2.5. Alfa benzer globin gen kümesi.........................................................................8
Şekil 2.6.Alfa benzer globin gen kümesinin sentezini düzenleyen hipersensitif
bölgeler..............................................................................................................................8
Şekil 2.7. Beta benzer globin gen kümesi.........................................................................9
Şekil 2.8.Beta benzer globin gen kümesinin sentezini düzenleyen hipersensitif
bölgeler.............................................................................................................................9
Şekil 2.9. Hemoglobin varyantlarının ve talasemilerin dünya üzerindeki yayılımı.......11
Şekil 2.10. α0 Talasemilere neden olan delesyonel mutasyonların büyüklükleri...........16
Şekil 2.11. α+ Talasemiye neden olan çaprazlamalar......................................................18
Şekil 2.12. α+ Talasemilere neden olan delesyonel mutasyonların büyüklükleri..........19
Şekil 2.13. A) Hemoglobin “trait”li bir hastanın periferik yayması B) Bazı hemoglobin
“trait”li hastalarda görülebilecek inklüzyon cisimcikli hücre.........................................27
Şekil 2.14. Alfa talasemilerde α/β globin zincirlerinin biyosentezlerinin oranları........29
Şekil 2.15. Dünyada alfa talasemi insidansı....................................................................31
Şekil 3.1. α1 globin geni primerlerinin çoğaltım yöreleri................................................50
Şekil 3.2. α2 globin geni primerlerinin çoğaltım yöreleri................................................51
Şekil 3.3. Lazer destekli kapiller elektroforezin şematik görünümü..............................55
Şekil 3.4. DNA bazlarının farklı dalga boylarında farklı renkler ile görüntülenmesi..56
Şekil 4.1. NBY (4y) olgusunun (Y ailesinin) soy ağacı.................................................60
Şekil 4.2. Homozigot 5 nt’lik delesyon gözlenen NBY (4y) olgusunun DNA Dizi
Analizi görüntüsü...........................................................................................................61
Şekil 4.3. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen AY (30y) olgusunun DNA Dizi
Analizi görüntüsü...........................................................................................................62
viii
Şekil 4.4. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen YY (33y) olgusunun DNA Dizi
Analizi görüntüsü............................................................................................................62
Şekil 4.5. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen AY (9y) olgusunun DNA Dizi Analizi
görüntüsü.........................................................................................................................62
Şekil 4.6. Gap- PCR yöntemi ile 20.5 kb’lık alfa talasemi mutasyonu gözlenen HY(4y)
olgusunun agaroz jel elektroforez görüntüsü...................................................................63
Şekil 4.7. ŞB (35y) olgusunun (B ailesinin) soy ağacı....................................................64
Şekil 4.8. ŞB (35y) ve ŞY (63y) olgularının selüloz asetat kağıt elektroforez
görüntüsü.........................................................................................................................65
Şekil 4.9. ŞB (35y) olgusunun HPLC verileri................................................................66
Şekil 4.10. ŞY (63y) olgusunun HPLC verileri...............................................................67
Şekil 4.11. Hb Stanleyville II (Hb St II) mutasyonu gözlenen ŞB (35 y) olgusunun
DNA Dizi Analizi görüntüsü.........................................................................................68
Şekil 4.12. Hb Stanleyville II (Hb St II) mutasyonu gözlenen ŞY (63 y) olgusunun
DNA Dizi Analizi görüntüsü..........................................................................................68
Şekil 4.13. Gap- PCR yöntemi ile 3,7kb’lık alfa talasemi mutasyonu gözlenen olguların
agaroz jel elektroforez görüntüsü...................................................................................69
Şekil 4.14. ARMS yöntemi ile β IVS-I-110 mutasyonunun agaroz jel elektroforez
görüntüsü.........................................................................................................................70
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ
Tablo 2.1. Embriyonik, fetal ve erişkin dönemde sentezlenen insan hemoglobinleri......4
Tablo 2.2. Hemoglobin molekülünün kalıtsal bozukluklarının sınıflandırılması..........10
Tablo 2.3. Türkiye’de belirlenen alfa globin zincirinden kaynaklı anormal
hemoglobinler..................................................................................................................12
Tablo 2.4. Alfa talasemiye neden olan non-delesyonel mutasyonların listesi................23
Tablo 2.5. Alfa talasemilerin klinik özellikleri...............................................................29
Tablo 3.1. ARMS yönteminde kullanılan primerler.......................................................44
Tablo 3.2. ARMS yönteminde kullanılan β-talasemi mutasyonlarına özgü primerler...45
Tablo 3.3. Gap PCR yönteminde kullanılan α-talasemi mutasyonlarına özgü
primerler..........................................................................................................................48
Tablo 3.4. α1 globin geni primer dizileri.........................................................................50
Tablo 3.5. α2 globin geni primer dizileri.........................................................................51
Tablo 4.1. Olguların hematolojik verileri ve hemoglobin tipleri....................................58
Tablo 4.2. Y ailesinin hematolojik verileri ve mutasyon tipleri.....................................60
Tablo 4.3. B ailesinin hematolojik verileri ve mutasyon tipleri.....................................65
x
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ
α................................................................................................................................... Alfa
β................................................................................................................................... Beta
δ...................................................................................................................................Delta
ε...............................................................................................................................Epsilon
γ................................................................................................................................. Gama
ζ................................................................................................................................... Zeta
θ....................................................................................................................................Teta
Ψ.................................................................................................................................... Psi
C...............................................................................................................................Sitozin
A...............................................................................................................................Adenin
T.................................................................................................................................Timin
G...............................................................................................................................Guanin
HS...................................................................................................................Hipersensitif
RBC........................................................................................................... Alyuvar hücresi
Hb....................................................................................................................Hemoglobin
Hct.....................................................................................................................Hematokrit
MCH.................................................................................Ortalama Eritrosit Hemoglobini
MCV...........................................................................................Ortalama Eritrosit Hacmi
MCHC....................................................Ortalama Eritrosit Hemoglobin Konsantrasyonu
DNA.............................................................................................Deoksiribo Nükleik Asit
RNA.......................................................................................................Ribo Nükleik Asit
mRNA.......................................................................................Mesajcı Ribo Nükleik Asit
dNTP.......................................................................................Deoksi Nükleotit Tri Fosfat
IVS.................................................................................................................İntron dizileri
Fsc.....................................................................................................................Frameschift
Cd..............................................................................................................................Kodon
Del........................................................................................................................Delesyon
URE.........................................................................................Upstream Region Elements
xi
UTR...................................................................................................Untranslation Region
PCR.........................................................................................Polymerase Chain Reaction
RT-PCR.................................................................Real-Time Polymerase Chain Reaction
ARMS.............................................................Amplification Refractory Mutation System
EtBr..........................................................................................................Etidyum Bromür
kb...........................................................................................................................Kilo Baz
bç...........................................................................................................................Baz Çifti
nt...........................................................................................................................Nükleotit
EDTA...............................................................................Etilen Diamin Tetra Asetik Asit
UV...................................................................................................Ultra Viole (mor ötesi)
OD.................................................................................................................Optik Dansite
M................................................................................................................................Molar
N..........................................................................................................................Normalite
μM...................................................................................................................Mikro Molar
pM......................................................................................................................Piko Molar
L...................................................................................................................................Litre
μL......................................................................................................................Mikro Litre
dL...........................................................................................................................Desilitre
fl..........................................................................................................................Femtolitre
g..................................................................................................................................Gram
µg.......................................................................................................................Mikrogram
pg..........................................................................................................................Pikogram
U.................................................................................................................................Ünite
mA.....................................................................................................................MiliAmper
kW...........................................................................................................................Kilovat
nm......................................................................................................................Nanometre
dk..............................................................................................................................Dakika
xii
ÖZET
Alfa Talasemi Mutasyonlarının DNA Dizi Analizi İle Belirlenmesi
Hemoglobinopati, hemoglobin molekülünün polipeptid zincirindeki yapısal değişikler veya sentez bozuklarından kaynaklanan bir kan hastalığıdır. Anormal hemoglobinler ve talasemiler olmak üzere iki kısma ayrılır. Anormal hemoglobinler polipeptid zincirlerini kodlayan genlerdeki çeşitli mutasyonlardan, talasemiler de hemoglobin molekülünün globin zincirlerinin bir ya da daha fazlasının üretimindeki azalmadan kaynaklanmaktadır. α globin zincir sentezindeki azalma α talasemiye, β globin zincir sentezindeki azalma da β talasemiye neden olmaktadır.
α-talasemiler dünyada en yaygın kalıtsal kan hastalığı olarak bilinmektedir. Normal bireylerde her kromozomda iki tane alfa globin geni (α1 ve α2) olmak üzere toplam dört gen (αα/αα) bulunmaktadır. Normal alfa genleri alfa talasemi açısından sağlıklı bireyi (αα/αα); bir genin eksikliği sessiz alfa talasemi taşıyıcısı bireyi (α+ à -α/αα) ; iki alfa geni eksikliği Hb “trait”li bireyi (α+ /α+ à -α/-α) , (α0
à-- /αα); üç alfa geninin eksikliği Hb H hastası bireyi (α+/α0à -α/--) ve dört alfa geninin eksikliği Hidrops fetalisli bireyi (α0/α0 à --/--) ifade etmektedir. α-talasemiye sıklıkla delesyonel mutasyonlar neden olurken bunun yanı sıra nondelesyonel mutasyon tipleri de bulunmaktadır.
Bu çalışmada, iki ailenin alfa talasemi mutasyon tipleri moleküler düzeyde araştırılmıştır. Gap-PCR yöntemi ile, bir olguda 20.5kb’lık ve altı olguda 3.7kb’lık delesyon saptanmıştır. DNA Dizi Analizi yöntemiyle 5nt’lik delesyon içeren bir homozigot olgu ile üç taşıyıcı olgu saptanmıştır. Alfa globin zincir anomalisine neden olan Hemoglobin Stanleyville II ve bunun 3.7kb’lık delesyon ile birlikteliği Türkiye’de ilk defa gösterilmiştir. Anahtar Sözcükler: Hemoglobinopati, Alfa Talasemi, DNA Dizi Analizi
xiii
ABSTRACT
Determination of Alpha Thalassemia Mutations by DNA Sequence Analysis
Hemoglobinopathy is a blood disease arising from the structural changes or shynthesis defects in polypeptide chain of hemoglobin molecule. It is divided into two parts as abnormal hemoglobins and thalassemias. Abnormal hemoglobins stem from the various mutations in genes which encode polypeptide chains while thalassemias result from the decrease in the production of one or more globin chains of hemoglobin molecule. The decrease in α globin chain shynthesis causes α thalassemia and the decline in β globin chain shynthesis gives rise to β thalassemia.
α-thalassemias are known to be the most common hereditary blood disease in the world. In each chromosome of normal individuals, four genes (αα/αα) two of which are alpha globin genes (α1 ve α2) are found. Normal alpha genes figure heathy individuals in terms of alpha thalassemia (αα/αα); the lack of one gene explains individuals who are silent alpha thalassemia carriers (α+ à -α/αα); the lack of two alpha genes explains individuals with Hb “trait” (α+ /α+ à -α/-α) , (α0
à-- /αα); the lack of three alpha genes points out Hb H patients (α+/α0à -α/--) and the lack of four alpha genes reflects individuals with Hydrops fetalis (α0/α0 à --/--). While deletion mutations frequently give rise to α-thalassemia, on the other hand, there are also nondeletion mutation types.
In this study, alpha thalassemia mutation types of two families are analysed in molecular level. Using Gap-PCR method, 20.5kb deletion in one case and 3.7kb deletion in six cases are ascertained. With DNA Sequence Analysis Method, a homozygote case which includes 5 nt deletion and three carrier cases are determined. Hemoglobin Stanleyville II that causes alpha globin chain anomaly and its combination with 3.7kb deletion are indicated first time in Turkey. Key Words: Hemoglobinopathi, Alpha Thalassemia, DNA Sequence Analysis
1
1.GİRİŞ VE AMAÇ
Hemoglobin molekülünün polipeptid zincirlerindeki yapısal değişiklikler veya
sentez bozukluklarından kaynaklanan hemoglobinopatiler, dünyada en sık rastlanılan
kalıtsal kan hastalıklarıdır. Hemoglobinopatiler anormal hemoglobinler ve talasemiler
olmak üzere iki ana sınıfa ayrılırlar1. Normal hemoglobin zincirindeki amino asitlerin
yer değişikliği, çeşitli füzyon ve mutasyonlar sonucu anormal hemoglobinler;
hemoglobin molekülünün yapısındaki globin zincirlerinin mutasyonlar sonucu
sentezlenememesi ya da yetersiz sentezlenmesi sonucunda ise talasemiler meydana
gelir2,3.
Bugüne kadar yapılan araştırmalar sonucunda (http://globin.cse.psu.edu internet
sayfasında) yayınlanan hemoglobinopati sayısı 1382’dir. Bunların arasından anormal
hemoglobin sayısı 1037, talasemi sayısı 395, hem anormal hemoglobin hem de talasemi
kategorisine girenlerin sayısı ise 50’dir4.
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) araştırmalarına göre dünyada hemoglobinopati
taşıyıcı sıklığı % 5,1 olup 266 milyon taşıyıcının olduğu bildirilmektedir5. Verilere göre
her yıl 365.000 hemoglobinopati hastası çocuk dünyaya gelmektedir6,7. Yoğun olarak
Afrika, Asya ve Akdeniz ülkelerinde gözlenmekte olup göçlerle Avrupa, Amerika ve
Avustralya’ya da yayılmıştır5,8. Ülkemizde en yaygın olarak gözlenen hemoglobin
varyantı Hb S olup görülme sıklığı % 0,5 – 44,2 arasındadır. Talasemi taşıyıcısı
sayısının yaklaşık olarak 1,300,000 olduğu, hasta sayısının 4,500 ve yılda 400 yeni
hasta çocuğun doğduğu bildirilmektedir3,5. Ülkemizin özellikle güneyinde talasemi
taşıyıcı sıklığı daha yüksek olup, beta talasemi sıklığı %3,7 iken alfa talasemi
sıklığı %3,3 olarak bildirilmektedir1,9.
KKTC, İtalya ve Yunanistan’da yaklaşık 15 yıldır yapılan toplum çalışmaları ve
doğum öncesi tanı sonucunda hasta çocuk doğumu engellenmiştir. Ülkemizde ise;
doğum hızının yüksek, akraba evliliğinin sık olması, eğitim ve bilgilendirme
çalışmalarının yetersiz ve sürekli olmaması nedeniyle hasta çocuk doğumu
engellenememiştir10. Bu amaca yönelik Sağlık Bakanlığı tarafından 1993 tarihinde,
3960 sayılı ‘Kalıtsal Kan Hastalıkları ile Mücadele Kanunu’ çıkmıştır. Bu amaç
doğrultusunda 33 ilde talasemi merkezleri kurulmuştur7. 33 ilden biri olan Adana’da
Çukurova Üniversitesi Tıp fakültesinde Doğum Öncesi Tanı Merkezi kurulmuştur. Bu
2
hastalıkların genetik tanısına yönelik önce allele spesifik PCR ile mutasyon analizi
yapılmaktadır. Bu yöntemle tanımlanamayan olgular ise DNA Dizi Analiziyle
incelenmektedir.
Bu çalışmada α-talasemi frekansının yüksek olduğu Çukurova bölgesinde Gap-
PCR yöntemi ile tanımlanamayan α-talasemi mutasyon tipleri DNA dizi analizi
yöntemiyle belirlenmiştir.
3
2. GENEL BİLGİ
2.1. Hemoglobin Molekülünün Tarihçesi
William Harvey’in kan dolaşımı üzerine yaptığı çalışmaları takiben Robert
Boyle ve Richard Lower venöz kanın pulmoner dolaşımda oksijenlendiğini ileri
sürmüşlerdir. 1862 yılında Hoppe ve Seyler ilk kez ‘Hemoglobin’ ifadesini kullanarak
yapının oksijen taşıyan pigment olduğunu tanımlamışlardır. 1912 yılında Kuster
tarafından hemoglobinin yapısında yer alan hem halkası çalışılmış ancak 1950’li yıllara
gelene kadar tam olarak hemoglobinin yapısı anlaşılamamıştır. Bu yıllarda Sanger’in
proteinler üzerine yaptığı çalışmalar sonucu hemoglobin molekülünün yapısı
anlaşılmaya başlanmıştır. Pauling, Schroeder, Rhinesmith ve Ingram tarafından yapılan
araştırmalar sonucunda hemoglobin molekülünün iki α ve iki β globin zincirinden
oluşan tetramer yapıda bir protein olduğu öne sürülmüştür. Bu dönemde Perutz ve
çalışma arkadaşları tarafından X-ray analizi sonucunda hemoglobinin üç boyutlu yapısı
çözümlenmiştir. 1960’li yılların başlarında ise hemoglobin molekülünün işlevi Bohr ve
Krogh tarafından açıklanmıştır11.
2.2. Hemoglobin Molekülünün Yapısı
Kırmızı hücrelerde bulunan hemoglobin (Hb) molekülü, 64.5 kDa ağırlığında,
maksimum çapı 6.4nm olan tetramerik proteindir1,12. Hemoglobin molekülünün %96’sı
4 adet globin zincirinden, geri kalanı bu globin zincirlerine bağlı hem’lerden
oluşmaktadır13(Şekil 2.1). Hemoglobin yapısında bulunan globin zincirlerinin amino
asitlerinin cins, sayı ve sırası değişken iken; hem grubu aynıdır.
Sağlıklı yetişkin bireyde hemoglobin A ( Hb A) %95-97, hemoglobin A2 ( Hb
A2) %2-3 ve hemoglobin F ( Hb F) ise % 1’in altındadır2. Hb A, iki α-globin zinciri ve
iki β-globin zincirinden meydana gelmiştir. α-globin zinciri, 141 amino asit; β-globin
zinciri de 146 amino asit içerir. Hb A2, iki α-globin zinciri ve iki δ-globin zincirinden
oluşmaktadır, δ-globin zinciri 146 amino asit içerir. Hb F ise iki α-globin zinciri ve iki
γ-globin zincirinden meydana gelir, γ-globin zinciri 146 amino asit içermektedir11,14,15.
4
Şekil 2.1. Hemoglobin molekülünün yapısı
Embriyonik hayatın erken evresinde, yolk kesesinde Hb Gover 1 (ζ2ε2), Hb
Gover 2 (α2ε2) ile Hb Portland (ζ2γ2) üretilir. Gebeliğin yaklaşık 8. haftasında fetal
karaciğerde, predominant olarak HbF (α2γ2) ve az miktarda (<%10) Hb A sentezi
yapılmaktadır. Gebeliğin 18. haftasından doğuma kadar geçen sürede kırmızı hücre
üretimi yavaş yavaş fetal karaciğerden kemik iliğine geçmektedir13,16 (Tablo 2.1).
Tablo 2.1. Embriyonik, fetal ve erişkin dönemde sentezlenen insan hemoglobinleri
5
Doğumdan sonra Hb F miktarı azalırken buna paralel olarak Hb A üretimi
artmaktadır (Şekil 2.2).
Şekil 2.2. Embriyonik ve fetal gelişimin farklı evrelerinde globin zincir sentezi
2.2.1. Hem’in Yapısı
Hemoglobin molekülü 4 hem halkası ve 4 globin zinciri içerir. Hem grubu, 4
pirol halkasından meydana gelen protoporfirin IX halkası ve bir demir atomundan
oluşmaktadır (Şekil 2.3).
6
Şekil 2.3. Hem’in yapısı
Hem yapısındaki +2 değerlikli demir atomları ( Fe+2) oksijenin ( O2 ) dokulara
taşınmasını sağlar. Demir, hem molekülünün merkezindeki 4 adet azot atomuna ( N);
diğer iki bağı ise porfirin halkasının globin zinciri ile yapar. Hemoglobinde bu
pozisyonlardan biri globin molekülündeki histidine diğeri oksijene bağlanır. Tüm
hemoglobinlerde hem halkasının yapısı aynıdır13,14( Şekil 2.4).
Şekil 2.4. Hem halkasının oksijene ve histidine bağlanması
7
Hem’in konjuge çift bağlardan oluşan yoğun ağ yapısı, görünür spektrumun alt
ucundaki ışınları yutarak moleküle koyu kırmızı renk verir. Tetrapiroller düzlemsel
halka içinde 4 metenil köprüleri ile birbirine bağlanır. Hem halkasının yan zincirleri M
(Metil) , V (Vinil), M, V, M, Pr (Propiyonat), Pr, M şeklinde sıralanır14(Şekil 2.4).
2.2.2. Globin Zincir Gen Yapısı
1950’li yılların sonunda yapılan araştırmalar α ve β globin zincirlerinin farklı
kromozomlardan sentezlendiğini ortaya koymuştur17. Normal insan hemoglobinleri;
gelişim süresince birbirinden farklı α, β, γ, δ, ε, ζ globin zincirlerinden oluşur11,18. Bu
globin zincirleri ise; α-globin gen kümesi ve β-globin gen kümeleri tarafından sentez
edilirler12,18.
2.2.2.1. α-Benzer Globin Gen Kümesi
İnsan α-benzer globin gen kümesi, 16. kromozomun kısa kolunun 13.3
lokusunda yaklaşık 80 kb’lık yer işgal eder19,20. Üç ekzon ve iki intron bölgesinden
oluşan α- globin geni 141 amino asiti kodlamaktadır12,18,21,22. α- geninin ekzon 1’inde
ilk 31 aminoasit, ekzon 2’de (32–99) 68 aminoasit ve ekzon 3’de (100–141) 42
aminoasit kodlanmaktadır. α- globin gen kümesi ve bu bölgeleri sentezleyen DNA
parçası; 5 Alu tekrar ailesi, CpG bölgeleri ve G-C’den zengin bölgeler içermektedir17,21.
α-globin gen kümesi, iki alfa genini (α1 ve α2), bir embriyonik alfa benzeri genini
(ζ2), üç pseudogenini ψζ,ψα2 (µ) ,ψα ve bir de teta geninini (θ) içerir17. 5’ uçtan
başlayarak 3’ ucuna doğru bu genler ζ2, ψζ ,ψζ2(µ), ψα, α2, α1 ve θ şeklinde
sıralanmaktadır11 (Şekil 2.5).
8
Şekil 2.5. Alfa benzer globin gen kümesi α- lokusunda bulunan α2 ve α1 genleri yapısal olarak benzer protein ürünü
vermekte olup sadece kodlanmayan (UTR) 5' ve 3' bölgelerinde dizi farkı
bulunmaktadır. Alfa benzeri gen grubunda yer alan pseudo genlerin (Ψζ, Ψα2, Ψα1)
işlevleri tam olarak bilinmediğinden evrimsel kalıntılar olduğu düşünülmektedir. Teta
(θ1) geninin korunmuş yapısı ve inaktive edici hiçbir mutasyonu taşımaması işlevsel
olabileceğini düşündürmekte ancak bugüne kadar genin protein ürünü bulunamamıştır16.
α- globin gen kümesinin sentezi upstream düzenleyici elementler (α –URE) ile
düzenlenir. α- benzer globin gen kümesinin ekspresyonu 5 farklı DNAaz I HS
(hipersensitif) dizileri tarafından kontrol edilmektedir. Bu diziler HS4, HS8, HS10,
HS33 ve HS40 olup; α- globin gen kümesinin upstream bölgesinde lokalize olmuşlardır.
α-benzer globin gen kümesinin aşırı ekspresyonu durumunda DNAaz I hipersensitif
bölgeler, sentezi kontrol altına almaktadırlar19,20(Şekil 2.6).
Şekil 2.6. Alfa benzer globin gen kümesinin sentezini düzenleyen hipersensitif bölgeler
α-benzer globin genler
Kromozom 16
SEN
9
2.2.2.2. β-Benzer Globin Gen Kümesi
İnsanlarda β-benzer globin gen kümesi 11. kromozomun kısa kolunda 70
kb’dan daha büyük alanda yerleşiktir19,23. Üç ekzon ve iki intron içeren β- geni 146
amino asit kodlamaktadır12,18,21,22. β-geninin ekson 1’inde ilk 30 aminoasit, ekson 2’de
ise 74 (31–104) amino asiti ve ekson 3’de 42 aminoasit (105–146) kodlanmaktadır. β-
globin gen kümesi 8 Alu tekrar ailesi içermektedir13. Ancak CpG bölgeleri
içermemektedir18.
β-benzer globin genler; 5' - ε - Gγ-Aγ – Ψβ1 - δ - β -3' ucuna doğru
sıralanmaktadırlar (Şekil 2.7).
Şekil 2.7. Beta benzer globin gen kümesi β- lokusu üzerinde bulunan Aγ ile Gγ genleri yapısal olarak benzer protein
ürünü vermektedir. Gγ -globin zincirinde 136.amino asit Glisin, Aγ globin zincirinde ise
aynı pozisyonda Alanin amino asiti bulunmaktadır. Beta gen grubunda yer alan Ψβ’nın
bilinen işlevi bulunmamaktadır16.
β-benzer globin gen kümesinin transkripsiyonel düzenleme bölgesi olan LCR
( Locus Control Region) yaklaşık 20kb uzunluğunda, ε geninin 6-18kb önünde yer alır.
LCR’de transkripsiyonel düzenlemeyi yapan 5 farklı HS dizisi bulunmaktadır. Bu
diziler HS1, HS2, HS3, HS4 ve HS5’ten oluşmakta ve bu dizilerden her biri,
transkripsiyonu aktifleştirmede ya da baskılamada görev almaktadırlar23(Şekil 2.8).
β-benzer globin genler
Kromozom 11
SEN
10
Şekil 2.8. Beta benzer globin gen kümesinin sentezini düzenleyen hipersensitif bölgeler
2.3. Hemoglobin Molekülünün Kalıtsal Bozuklukları
Hemoglobin molekülünün yapısında yer alan globin zincirlerindeki
değişikliklerin tümü hemoglobinopatileri meydana getirmektedir24. Hemoglobin
molekülünün yapısında meydana gelen anomali üç ana gruba ayrılmaktadır. Bunlar;
globin zincirlerinin yapısal değişimleri sonucu oluşan anormal hemoglobinler, yapısal
olarak normal globinlerin yetersiz sentezi, ya da hiç sentezlenememesi sonucu oluşan
talasemiler ve fetal hemoglobin sentezinin erişkin dönemde devam etmesi sonucunda
oluşan “Hereditary Persistance of Fetal Hemoglobin (HPFH)” olarak
sınıflandırılır11,25,26( Tablo 2.2).
Tablo 2.2. Hemoglobin molekülünün kalıtsal bozukluklarının sınıflandırılması Anormal Hemoglobinler Talasemiler HPFH
α – Zinciri α - Talasemi Delesyonel
β – Zinciri β - Talasemi Nondelesyonel
γ – Zinciri δβ - Talasemi β – gen kümesine bağlı
δ – Zinciri γδβ -Talasemi β – gen kümesine bağlı
olmayan Füzyon Zincirleri (δβ, βδ, γβ ) γ - Talasemi
δ - Talasemi
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) araştırmalarına göre dünyada hemoglobinopati
taşıyıcı sıklığı % 5.1’dir5. Her yıl yaklaşık 365.000 hasta çocuğun dünyaya geldiği
bilinmektedir6. Günümüze kadar toplam hemoglobin varyantlarının ve talasemilerin
sayısı 1382’dir4. Bu kalıtsal bozukluklar sıklıkla Akdeniz, Afrika ve Asya kıtalarında
görülmekte, ancak göçlerle Amerika, Avrupa ve Avusturalya kıtalarına da
yayılmıştır5,27,28,29(Şekil 2.9).
11
Şekil 2.9. Hemoglobin varyantlarının ve talasemilerin dünya üzerindeki yayılımı
Türkiye’de ilk hemoglobinopati çalışmaları Muzaffer Aksoy tarafından
yapılmaya başlanmıştır7.
2.3.1. Anormal Hemoglobinler
Hemoglobin molekülünün yapısında yer alan globin zincirleri üzerindeki
aminoasit değişikliği sonucu meydana gelmektedir. Hemoglobin molekülünün
polipeptit zincirlerini kodlayan genlerin ekzon bölgelerindeki veya bunun dışındaki
bölgelerde meydana gelen nokta mutasyonları, insersiyonlar ve delesyonlar çeşitli
hemoglobin varyantlarının oluşumuna yol açmaktadır1,5,6.
Anormal hemoglobinlerin çoğu nokta mutasyonu sonucunda oluşmaktadır. Bu
mutasyonlar polipeptid zincirinde bir veya daha fazla aminoasit değişimine neden
olmaktadır. Delesyonlar polipeptid zincirinin kısalmasına, insersiyonlar ise uzamasına
yol açmaktadır. Homolog olmayan crossing-over sonucu oluşan bazı varyantlar ise
normal uzunlukta hibrit polipeptid zincirleri içermektedirler5,28,30,31,32.
Dünyada bilinen anormal hemoglobin sayısı 1037’dir4. Türkiye’de ve dünyada
en yaygın olarak gözlemlenen anormal hemoglobinler Hb S, Hb D, Hb E ve Hb C’dir.
Bu güne kadar Türkiye genelinde belirlenen α globin zincirinden kaynaklı anormal
hemoglobinler Tablo 2.3’te verilmiştir33,34.
12
Tablo 2.3. Türkiye’de belirlenen alfa globin zincirinden kaynaklı anormal hemoglobinler Mutasyonun Adı Mutasyon Tipi
Hb – O – Padova33,35 α-30 (B11) GluàLys (GAGàAAG)
Hb – Hasharon33,34,36 α-47 (CE5) AspàHis (GACàCAC)
Hb – Montgomery33,36 α- 48 (CE6) LeuàArg (CTGàCGG)
Hb – Adana33,37,38,39 α- 59 (E8) GlyàAsp (GGCàGAC)
Hb – J – Anatolia33,40 α- 61 (E10) LysàThr (AAGàACG)
Hb – Ube -233,38 α- 68 (E17) AsnàAsp (AACàGAC)
Hb – Q – İran33,34,41 α- 75 (EF4) AspàHis (GACàCAC)
Hb – Moabit33,42 α- 86 (F7) LeuàArg (CTGàCGG)
Hb- M-Iwate33,43 α- 87 (F8) HisàTyr (CACàTAC)
Hb – Çapa33,39,44 α- 94 (G1) AspàGly (GACàGGC)
Hb – Georgia33,45 α- 95 (G2) ProàLeu (CCGàCTG)
Hb – Strumica33,46 α- 112 (G19) HisàArg (CACàCGC)
Hb – J – Meerut33,47 α- 120 (H3) AlaàGlu (GCGàGAG)
Hb Setif34,48 α- 94 (G1) AspàTyr (GACàTAC)
Hb Bronova34,49 α- 103 His àLeu (CACàTAC)
Hb – J- Paris I2 α 2(A10) AlaàAsp β2 (CàA)
Hb Constant Spring33,36 α- 142 (H19)( +31 uzamış zincir)
Hb Çapa ve Hb Adana ilk kez Türk toplumunda saptanan anormal
hemoglobinlerdir1,6,16,50. Alfa globin zincirinden kaynaklı anormal hemoglobinlerden
Hb Adana, Hb Hasharon, Hb Moabit, Hb Çapa ve Hb Constant Spring unstabil
hemoglobinlerdir16.
Hb Adana varyantı [α- 59 (E8) GlyàAsp (GGCàGAC)] αo-talasemi ile birlikte
tespit edilmiştir ve bu hastada Hb Barts, HbA’dan sonra ikinci majör hemoglobin olarak
bulunmuştur1,16,37.
Hb Ube-2 α- 68 (E17) AsnàAsp (AACàGAC) hızlı hareket eden hemoglobin
varyantı olup ilk kez Japon ırkında gösterilmiştir. Bilginer ve arkadaşları tarafından
1984 yılında bir Türk ailesinde belirlenmiştir38. Bu mutasyonun sadece Japon ve Türk
ırklarında görülmesi populasyon genetiği açısından önemlidir7.
Dinçol ve arkadaşları bir Türk olguda Hb J-Meerut [α120(H3) AlaàGlu
(GCGàGAG)] mutasyonu olduğunu göstermişlerdir. Hb J-Meerut’de, oksijen
13
afinitesinde hafif artış, arteriyel kanda düşük P50 değerleri ve kırmızı kan hücre
sayısında hafif bir artış olduğu bildirilmiştir47,50.
Hb Q- İran [α- 75 (EF4) AspàHis (GACàCAC)] ilk kez İran’da bulunduktan
sonra Aksoy tarafından Türkiye’de de bu varyantın olduğu gösterilmiştir. Özdağ ve
arkadaşları tarafından yapılan çalışmada ilk kez homozigot Hb Q- İran [α- 75 (EF4)
AspàHis] gösterilmiştir41,51.
2.3.2. Talasemiler
Talasemi; hemoglobin molekülünün yapısında yer alan globin zincirlerinden
birisinin veya birden fazlasının sentezindeki azalma veya tamamen yokluğu ile
karakterize olan genetiksel kan hastalığıdır1,25,52,53.
Talasemi ilk defa 1925’de Thomas Cooley tarafından tarif edilmiştir. Daha sonra
bu herediter hemolitik anemiye Van Jaksch anemisi, splenik anemi, eritroblastozis ve
Akdeniz anemisi gibi adlar verilmiştir. George Whipple ve Lesley Bradford
inceledikleri olguların Akdeniz civarı ülkelerden gelmesinden dolayı bu hastalığa
Yunanca deniz anlamına gelen “Thalassemia” adını vermişlerdir. Daha sonra bu
hastalığın yalnız Akdeniz ülkeleri toplumlarında olmadığı diğer toplumlarda da
bulunduğu saptanmıştır7.
Talasemiler, otozomal mutant genler sonucu oluşur. Dünyada en sık görülen
genetik hastalıktır. Özellikle Akdeniz, Orta Asya, Afrika’nın bazı bölümleri Hindistan
ve Asya’yı içine alan kuşakta yüksek sıklıkla gözlenmektedir. Azalmış veya
sentezlenemeyen globin zincirine göre sınıflandırılır25,52,53. En iyi tanımlanan tipleri α, β,
γ, δ, δβ ve εγδβ talasemilerdir54.
Türk toplumunda talasemiye ait ilk moleküler çalışmalar 1987 yılında Akar ve
arkadaşları tarafından yapılmıştır55.
2.3.2.1. β – Talasemi
β – talasemi; hemoglobin molekülünde yer alan β – globin zincirinin sentezinin
azalması ve buna bağlı olarak da α – globin zincirinin sentezinin artması sonucu
karakterize edilen bir hastalıktır. Beta zincir eksikliği sonucu artan alfa zinciri
hemoglobin molekülünün tetramer yapısını oluşturamaz ve kemik iliğindeki gelişen
14
kırmızı hücre öncüleri içinde çökerler. Beta talaseminin klinik şiddeti zincir
dengesizliğinin derecesi ile orantılıdır. Beta geni üzerinde meydana gelen
mutasyonlardan dolayı beta globin zinciri hiç sentezlenemiyorsa β0, az sentezleniyorsa
β+ talasemi olarak ifadelendirilir56. Alfa talasemilerin aksine beta talasemiler daha çok
nokta mutasyonları sonucu oluşurlar57.
β-talasemi Akdeniz ülkeleri ve Türkiye’de sıklıkla gözlenmektedir54. Türkiye’
de talasemi ile ilgili ilk çalışmalar Aksoy tarafından yapılmıştır. Talasemi sıklığını
göstermeye yönelik ilk çalışma ise Çavdar ve Arcasoy tarafından gerçekleştirilmiştir.
Daha sonraki yıllarda β talasemi sıklığına yönelik çalışmalar Türkiye’nin birçok
bölgesinde yapılmış olup yoğunluğun güney illerinde daha yüksek olmak üzere değişik
bölgelerde % 0,6-12 arasında değiştiği saptanmıştır. β-talasemi taşıyıcılığı oranı Türkiye
genelinde %2,1 olmakla birlikte, bu sayı Türkiye’nin bazı yörelerinde %10’a kadar
çıkmaktadır58,59. Bu oran Çukurova bölgesinde ise %3,7 olup 20’nin üzerinde beta
talasemi mutasyonu saptanmıştır60,61,62. β – talasemiyi moleküler düzeyde araştıran
çalışmalarda; Türkiye’de 43’ün üzerinde farklı mutasyon bulunduğu ve β – talaseminin
moleküler düzeyde çok heterojen bir yapı gösterdiği saptanmıştır55,63,64.
Türkiye’de en sıklıkla rastlanan β-talasemi mutasyonu IVS-I-110’dur. Bunu
IVS-I-6, FSC-8, IVS-I-1, IVS-II-745, IVS-II-1, Cd39, -30 ve FSC-5 mutasyonları takip
etmektedir54,60.
2.3.2.2. α - Talasemi
Alfa talasemiler; hemoglobin molekülünün yapısında yer alan alfa globin
zincirindeki azalma veya tamamen engellenmesi ile karakterize edilen yaygın bir
kalıtsal hastalıktır. Normal bireylerde her kromozomda iki tane alfa globin geni (α1 ve
α2) olmak üzere toplam dört gen (αα/αα) bulunmaktadır65. Normal alfa genleri (αα/αα),
bir genin eksikliği (-α/αα), iki alfa geni eksikliği (-α/-α), (--/αα), üç alfa geninin
eksikliği (Hb H hastalığı) (-α/--) ve dört alfa geninin eksikliği (Hidrops fetalis) (--/--)
olarak ifadelendirilmektedir66.
Alfa talasemiye sıklıkla delesyonel mutasyonlar neden olurken bunun yanı sıra
nondelesyonel mutasyon tipleri de bulunmaktadır65,67.
15
Alfa talaseminin iki tipi bulunmaktadır. Bunlardan α-globin zincirinin yokluğu
ile karakterize edilen α0-talasemidir. Diğeri ise hematolojik bulguları tam belirgin
olmayan α+-talasemi’dir15,67. α0-Talasemi her iki globin zincirini içeren büyük
delesyonlar sonucu oluşurken, α+-talasemi iki globin geninin birinin delesyonu ya da
nondelesyonu sonucu oluşur 15.
α- Globin genlerindeki delesyonla birlikte ζ-globin mRNA ekspresyonunda da
bir artış vardır. Normal bireylerde düşük ζ-globin mRNA düzeyleri görülürken, α0 –
talasemi, α+ – talasemi ve Hb H hastalığında ζ/α-mRNA oranı yükselmektedir. α0 –
Talasemi ve Hb H hastalığındaki ζ/α mRNA oran artışı ise daha belirgindir15,67,68.
2.3.2.2.1. Delesyonel α –Talasemiler
2.3.2.2.1.1. α0 –Talasemiler
α0- talasemilerde farklı uzunluklarda delesyonlar saptanmıştır. α0- talasemilerde
gözlenen küçük ve büyük ( –α5.2 ve –α20.5) delesyonlar her iki α-globin genini
etkilemektedir26. Bu tip talasemide, (αα)RA delesyonu hariç, α- globin genlerinin her
ikisindeki tam ya da kısmi delesyonlar meydana gelmektedir15 (Şekil 2.10).
16
Şekil 2.10. α0 Talasemilere neden olan delesyonel mutasyonların büyüklükleri
Delesyonlardan birkaçı α-globin genleri ile birlikte ζ genini de içermektedir. Bu
delesyonlarda heterozigotlar normal gelişip yaşamlarını sürdürebilmekte iken
homozigotlar, embriyonik (ζ2γ2, ζ2ε2, α2ε2) ve fetal (α2γ2) hemoglobinlerine sahip
olmadıklarından gebeliğin erken dönemlerinde kaybedilir26,67.
Önceleri α-talasemilerde delesyonların genin sadece ifade edilen bölgelerinde
olduğu kabul edilmiştir. Ancak delesyonların bu bölgenin her iki ( 5' , 3') uzak ucunda
da olabileceği gösterilmiştir. α globin genlerinin ifadesi ζ2 geninin 5' ucundan 40 kb
uzaklığında bulunan DNA parçasına önemli derecede bağımlı olduğu
gösterilmiştir26,69,70. Bu bilgi, eritroide özgün “DNAaz I-hipersensitif” bölgesiyle
ilişkilidir ve hipersensitif ailesinden HS-40’in etkisi Hatton ve arkadaşları tarafından
alfa talasemili bir hastada gösterilmiştir. Bu hastada (αα)RA mutasyonu ile α- gen
kümesinin HS-40’ı da içine alan 5' tarafında 62 kb’lık bir delesyon bulunmuştur. Bu
olguda her iki α geni tamamen normal olduğu halde işlev göstermediği anlaşılmıştır. Bu
17
bulgulardan sonra aynı bölgede HS-40’ı içine alan farklı delesyon büyüklüklerini içeren
olgular saptanmıştır26,71.
Bernet ve arkadaşlarının 1994 yılında yaptıkları çalışmada bu delesyonları
içeren kromozomların normal kromozomlara göre %1’den az mRNA ürettiğini ve bu
nedenle de α-globin gen ifadelerinin ciddi derecede azaldığını belirtmişlerdir26,72.
α0- talasemilerde gözlenen delesyon tiplerinden bazıları sadece bir iki bireyde
gözlemlenirken bazıları da Akdeniz ve Güney Batı Asya bölgelerinde yaygın olarak
gözlenmektedir26. Bu alfa talasemi tipleri (--MEDI), (-- MEDII), (-(α)20.5), (--SPAN), (--CANT)
ve (-(α)5.2) Akdeniz toplumlarında oldukça yaygındır15,67.
2.3.2.2.1.2. α+ –Talasemiler
Küçük delesyonlar sonucu meydana gelen α+ talasemi’ler dünyada sıkça
görülmektedir. En yaygın olarak 3.7 kb’lık DNA(-α3.7) kaybı gözlenmekte ve bunu
takiben 4.2 kb’lık DNA (-α4.2) kaybı gözlenmektedir15,67,73,74.
α – globin genleri 4 kb büyüklüğünde yüksek homoloji gösteren iki eşleşme
birimleri arasında yer alırlar. Evrim sürecinde eşit olmayan çaprazlanmalar ( crossing
over), insersiyon ve delesyonlarla bu homoloji korunmuş ve bu homolog bölgeler X, Y
ve Z alt ünitelerine ayrılmıştır11,26. Y bölgesinde şimdiye kadar tanımlanmış bir
çaprazlama bulunmamaktadır11. 4.2 kb’lık ve 3.7 kb’lık delesyonlar sonucunda X ve Z
bölgeleri arasında eşit olmayan çaprazlanmalar oluşabilir. Bu eşit olmayan
çaprazlanmalarda -α3.7 sağ tarafta meydana gelen delesyonları ve -α4.2 sol taraftaki
delesyonları göstermektedir15,67,73,74. 3.7 kb uzaklıkta bulunan iki Z dilimi arasında
gerçekleşen çaprazlanmalarda bir globin geni -α3.7 ve üç globin geni αααanti 3.7 içeren
kromozomların oluşumu ile sonuçlanır. Bu tip α+-talaseminin, çaprazlaşmanın Z
parçasının neresinde gerçekleştiğine bağlı olarak üç ayrı türü (-α3.7 I, -α3.7 II, -α3.7 III )
bulunmaktadır. Aynı şekilde 4.2 kb uzaklıkta bulunan çaprazlanmalar sonucunda α-
talasemi -α4.2 ve ααα4.2 kromozomlarının oluşumuna neden olmaktadır11,15,18,26,67,68,73,74
(Şekil 2.11).
18
Şekil 2.11. α+ Talasemiye neden olan çaprazlamalar Bu mutasyonlara ek olarak α+ talasemilere neden olan nadir mutasyonlar da
bulunmaktadır. Asya’da gözlemlenen –α3.5 delesyonu α1 geninin tamamını
kapsamaktadır. İtalya’da gözlemlenen –α5.3 mutasyonu α2 geninin 5' ucunu
kapsamaktadır11,26,74. –α2.7 kb’lık delesyon ise Çinde Hb H hastası olan bir bireyde
rapor edilmiştir18,26. Diğer nadir bir mutasyonda –α2.4 kb büyüklüğündeki mutasyon
olup, Kanadalı ve Çinli Hb H hastasında saptanmıştır. Birbirinden farklı büyüklükte
toplam yedi nadir mutasyonun α+ talasemilere neden olduğu rapor edilmiştir18 (Şekil
2.12).
19
Şekil 2.12. α+ Talasemilere neden olan delesyonel mutasyonların büyüklükleri
2.3.2.2.2. Delesyonel Olmayan ( Nondelesyonel ) α –Talasemiler
Alfa talasemiye neden olan mutasyonlar çoğunlukla delesyonel mutasyonlardır.
“Non-delesyonel” mutasyonlar tek nokta mutasyonu, oligonükleotid insersiyonu ve
delesyonu ile oluşur ve etkilenmiş alfa geni (αT) olarak gösterilir26. “Non-delesyonel”
α talasemi mutasyonları daha çok α2 geninde (αTα) nadir olarak da α1 geninde (ααT)
görülmektedir9.
“Non-delesyonel” α-talasemi, ilk defa 1977 yılında Kan ve arkadaşları
tarafından Hb H’lı bir hastada tanımlanmıştır75. Günümüze kadar dünyada 69 adet
tanımlanmış “non-delesyonel” α+-talasemi bildirilmiştir. Bilinen bu mutasyonların 46
tanesi α2 geninde (αTα), 17 tanesi ise α1 geninde (ααT) ve 5 tanesi ise –α
kromozomunda (-αT) meydana gelmiştir18.
Bazı non-delesyonel mutasyonlar, α-globin gen ifadesinde delesyonel
mutasyonlardan daha ciddi etkilere neden olurlar. Çünkü mutasyonların büyük
çoğunluğu, gen ifadesinin daha baskın olduğu α2 globin zincirinde meydana
gelmektedir. Ayrıca delesyonel mutasyonlardan farklı olarak, nokta mutasyona bağlı
20
olarak genlerden birininin inaktivasyonu sonucu diğer genin ifadesinde telafi edici bir
yükselme gözlenmemektedir. Bazı nondelesyonel mutasyonların sonucunda, α gen
ifadesinin azalışıyla birlikte olan ikincil etkiler de görülmektedir. Bu nedenle,
nondelesyonel mutasyonların yaratabilecekleri patofizyolojik değişiklikler önemlidir25,26.
Non-delesyonel α-talasemiye; RNA “splicing”i etkileyen mutasyonlar, Poli A
kuyruğu sinyalini etkileyen mutasyonlar, mRNA translasyonunu etkileyen mutasyonlar,
Frameshift delesyonları ve zincir sonlanma mutasyonları neden olmaktadır11,18.
2.3.2.2.2.1. RNA “ Splicing”i Etkileyen Mutasyonlar
Bu grupta sekiz mutasyon tipi tanımlanmıştır. Bu mutasyonların beş tanesi α2
globin geninde üç tanesi de α1 globin geninde bulunmuştur. RNA “splicing”i etkileyen
mutasyonlardan birisi (αIVS I, 5nt del α) α2 geninin IVSI 5' donör bölgesinde beş
nükleotidlik delesyon ile oluşmuştur. Bu talasemilerin heterozigotları α-talaseminin
“trait” fenotipine, homozigotları ise α talasemilerin daha ciddi formlarına neden
olurlar11,18,26. α2 geninin IVS-I akspetör bölgesinde görülen (αIVSI-116(AàG) α) mutasyon
ise, anormal splicing ile prematür sonlanma kodonu (kodon 31) oluşturan IVS-I’in
tutulumuna sebep olur11,18,26. Farklı bir “splicing”i etkileyen mutasyon da ilk defa
Surinam ve Hindistan’da görülen (αCd22 (CàT)α) mutasyon tipidir. Bu mutasyon α2
geninde 48. ve 49. kodonların arasında meydana gelen sessiz bir mutasyondur18.
Başka bir “splicing” bozukluğu α1geninin IVS-I bölgesinde 117. kodondaki
mutasyondan (αIVSI-117(GàA) α) kaynaklanmaktadır26,76.
2.3.2.2.2.2. Poli A Kuyruğu Sinyalini Etkileyen Mutasyonlar
AATAAA poli A dizisi 10-30 bç büyüklüğünde olup oldukça korunmuş bir
yapıdır. Günümüze kadar poli A kuyruğu sinyalini etkileyen α2 geninde dört mutasyon
bulunmuştur. İlk poli A kuyruğu mutasyonu Arap toplumlarında gözlenen
(AATAAAàAATAAG, αPA6:AàG) mutasyonudur. Bu mutasyonu heterozigot olarak
taşıyan bireylerde α-talaseminin “trait” formu, homozigot olarak taşıyan bireylerde ise
Hb H formu görülmektedir. Ancak bu mutasyonun dışında α2 geninin inaktivasyonuna
21
neden olan poli A kuyruğu mutasyonları her zaman Hb H’a neden olmazlar. αPA6:AàG
mutasyonu α2 ve α1 genlerinin düzenlenmesini kontrol ettiği bilinmektedir18,26.
Gerçek zamanlı PCR (RT- PCR) ile yapılan analizler neticesinde αPA6:AàG
mutasyonunun en az iki etkisinin olduğu gösterilmiştir. α2 mRNA miktarı azalmakta,
ayrıca poli A kuyruğunun etkilenmesinden dolayı α1 geni de etkilenmektedir18,26.
2.3.2.2.2.3. mRNA Translasyonunun Başlamasını Etkileyen Mutasyonlar
Non-delesyonel mutasyonlardan bazıları mRNA’nın translasyonunu etkiler ve
bu mutasyonlardan altı tanesi başlama dizisini ( CCRCCATG) bozar. Bunlardan bir
tanesi (-αIN:ATGàGTG α) mRNA’nın translasyonunu ortadan kaldırır. Bu mutasyon,
ikinci α talasemi mutasyonuyla birlikte bir olguda (-αIN:ATGàGTG/-α) tanımlanmıştır. Bu
bireyin % 2.4-7.2 oranda Hb H içerdiği ve Hb H hastalığının tipik hematolojik
görünümüne sahip olduğu gösterilmiştir. Diğer bir olgu ise başlama dizisinden 2 bç’lik
delesyonun olduğu (-αIN:2bçdel α) mutasyon tipidir ve bu mutasyonda mRNA
translasyonu %30-50 oranında azalmaktadır. (-αIN:2bçdel/-αIN:2bçdel) homozigot bir
olguda hafif hipokromik mikrositer anemiyle ( Hb:9,7-9,9; MCV:63; MCH:18-20)
birlikte Hb H’ın varlığı gösterilmiştir18,26.
αIN:ATGàACGα mutasyonunun homozigot formunun gözlendiği olgularda, alfa
talaseminin şiddetli klinik seyri gözlenmiştir. Bu mutasyonun heterozigot
formlarında %8-24 oranında Hb H oluştuğu bildirilmiştir18,26.
ααIN:ATGàGTG mutasyonu α1 geninin ifadesi olan mRNAnın translasyonunu
ortadan kaldırdığı gösterilmiştir. Bir ailede gözlenen birleşik heterozigot (--
/ααIN:ATGàGTG) yapı, göreceli olarak daha düşük Hb H (%1.5-3) oluşumuna neden
olmuştur18,26.
Eng ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada başlatma kodonunda farklı bir
delesyon (αIN:ATGà-TG) tanımlamışlardır. Yeni doğan bir bebekte tanımlanan bu
mutasyonun yanında –SEA mutasyonuda bulunmuş ve doğduğunda %25’ten fazla Hb
Bart’s içerdiği ve Hb H’ın da var olduğu bildirilmiştir18.
22
2.3.2.2.2.4. Frameshift Delesyonları
Bu kategoride dört farklı mutasyon tanımlanmış olup bu mutasyonlar üçlü
kodonların içinde tek bir baz değişikliği ile prematüre sonlanma kodonu yaratırlar. Bu
durumda alfa globin zincirinin translasyonu erken sonlanır. Üçlü kodonlarda tek bir
bazın inserisyonu ya da delesyonu ile ya prematüre sonlanma kodonu veya anormal
hemoglobinler oluşmaktadır. İran’da sık gözlenen αcd19;delGα talasemi mutasyon tipi
buna örnektir18.
Diğer bir mutasyon tipi ise 1988 yılında Safaya ve Rieder tarafından siyah bir
Amerikalı’da gösterilmiştir. Hb H hastalığı ve Hb G Philadelphia’sı olan bu bireyde
sadece αG zinciri üretilmektedir (-α/-αG), fakat αA zinciri üretilmemektedir. Safaya ve
arkadaşları –α kromozomunun bu durumuna daha uzaktaki bir mutasyonun neden
olduğunu ileri sürmüşlerdir. Yapılan DNA dizi analizi sonucunda kodon 30 veya kodon
31’de iki nükleotidin delesyonunun (GAG veya AGG) sonucunda oluştuğu
gözlemlenmiştir. İki nükleotidlik delesyonla oluşan frameshift mutasyonu ekzon II’de
kodon 31 ile kodon 54 arasında yeni bir dizinin ortaya çıkmasına hatta 55. kodonda
yeni sonlanma kodonunun (TAA) oluşmasına neden olmuştur. Bu mutasyon -
αcd30/31;del2bç tipi α0 talasemi olarak tanımlanmıştır11,18.
Ayala ve arkadaşları tarafından İspanyol bir ailede α1 geninde tanımlanan
ααcd51–55;13bçdel/αα mutasyon tipinin alfa talasemi “trait”e neden olduğu, bu mutasyonun
62. kodonda yeni bir durdurma sinyali oluşturduğu gösterilmiştir11,18.
Diğer bir başka mutasyon tipi ise, α2 geninde meydana gelmekte ve kodon 113
ile kodon 116 da 12 nükleotidin delesyonu ile dört amino asitin kaybına yol açmaktadır.
Normal bir bireyde alfa globin zincirinde 141 amino asit bulunurken bu mutasyonu
taşıyan bireylerde 137 amino asit bulunmaktadır. Böylece hemoglobin molekülünün
tetramer yapısı bozulmaktadır. Bu mutasyonun heterozigot formları bireylerde Hb
“trait”e neden olmaktadır11,18.
Bugüne kadar saptanan frameshift mutasyonları ve bunlarla birlikte gözlenen
mutasyonlara bağlı olarak ya Hb “trait”e ya da Hb H gözlenmektedir18.
23
2.3.2.2.2.5. Zincir Sonlanma Mutasyonları
α2 globin geninin normal sonlanma kodonunda (TAA) dokuz farklı tek nükleotid
değişimi bulunmuştur. İki mutasyon (TAG ve TGA) anlamsız sonlanma kodonu
oluşturmuştur. Sonlanma kodonundaki bir tek baz değişikliği sonucunda mRNA’nın
translasyonu bir sonraki poli A kuyruğundaki (AAUAAA) sonlanma kodonuna kadar
devam ettiği gösterilmiştir. α2 globin geninde altı mutasyon bulunmuş ama bunlardan
ancak beş tanesi tanımlanmıştır. Sonlanma kodonundaki mutasyon sonucunda uzamış
olan alfa globin zincirindeki 142ci amino asitlerin farklılığı ile Hb Constant Spring (α
142 Gly), Hb Icaria (α 142 Lys), Hb Koya Dora (α 142Ser), Hb Seal Rock (α 142 Glu),
ve Hb Paks (α 142 Tyr) diye adlandırılan hemoglobin varyantları oluşmaktadır.
Bu mutasyonların, MCV değerlerini düşürmediği aksine heterozigot olgularda
MCV değerlerinin yüksek olduğu bildirilmiştir. Homozigot Hb Constant Spring (CS)
olgularında klinik seyrin şiddetli olduğu, ayrıca heterozigot Hb Constant Spring ile α0
birlikteliğinde Hb H olgularının klinik seyrinin beklenmedik bir biçimde şiddetli olduğu
rapor edilmiştir18.
Non-delesyonel mutasyonların neden olduğu alfa talasemi tipleri Tablo 2.4’te
verilmiştir18.
Tablo 2.4. Alfa talasemiye neden olan non-delesyonel mutasyonların listesi Etkilenen Dizi Gen Mutasyon Ülke veya Irk Fenotip
mRNA İşleme Mutasyonları Gizli splicing α2 Cd22; C→T Surinam α+
IVS(donör) α2 IVS I; del 5bç Akdeniz α+
IVS(donör) α1 IVS I; (G→A) Tayland α
IVS(donör) α2 IVS II; 2(T→A) Kuzey Avrupa α+- α0
IVS(akseptör) α2 IVSI; 116 (A→G) Hollanda α+
IVS(akseptör) α1 IVS I; 117 (G→A Asya, Hindistan α+
IVS(akseptör) α2 IVSII;142 (G→A) Arjantina α+- α0
IVS(akseptör) α1 IVSII;148 (A→G) İran α+
Poli A kuyruğu α2 PA; del 16bç Arap α+- α0
Poli A kuyruğu α1 PA6; A→G Orta Doğu, Akdeniz α+- α0
Poli A kuyruğu α2 PA4; A→G Akdeniz, Çin α+- α0
24
Poli A kuyruğu α2 PA; del 2bç Asya, Hindistan, Tayland α+- α0
mRNA Translasyonu Mutasyonları Başlatma kodonu -α3.7 IN; ATG→GTG Afrika α0
Başlatma kodonu -α3.7II IN; del 2bç Kuzey Afrika , Akdeniz α+- α0
Başlatma kodonu α2 IN; ATG→ACG Akdeniz α+
Başlatma kodonu α2 IN; ATG→A-G Vietnam α+
Başlatma kodonu α1 IN; ATG→GTG Akdeniz α+
Başlatma kodonu α2 IN; ATG→-TG Güneydoğu Asya
Ekzon I α1 cd 14; G→A İran α0
Ekzon I α2 cd 19; del G İran α+
Ekzon I α2 Cd22; del C Afrika
Ekzon I α2 Cd 23; G→T Tunus α0
Ekzon I -α Cd 30/31; del 2bç Afrika α0
Ekzon II α2 Cd 39/41; del/ins Yemenli Musevi α+
Ekzon II α1 Cd51–55; del 13bç İspanya α+
Ekzon II α1 Cd62; del G Afrika
Ekzon II α1 Cd 78; del C Siyahlarda, Çinlilerde
Ekzon II α2 Cd 90; A→T Ortadoğu α+
Ekzon III α1 Cd108; delC Musevi α+- α0
Ekzon III α2 Cd113/114; delC Bilinmiyor
Ekzon III α2 Cd113/116;del12bç İspanya α+- α0
Ekzon III α2 Cd116; G→T Afrika α+
Ekzon III α1 Cd131; ins T Tayland α0
Sonlama Kodonu α2 TER;TAA→CAA(ConstantSpring) Güneydoğu Asya α+
Sonlama Kodonu α2 TER; TAA→AAA (Icaria) Akdeniz α+
Sonlama Kodonu α2 TER; TAA→TCA (Koya Dora) Hindistan α+
Sonlama Kodonu α2 TER;TAA→GAA (Seal Rock) Afrika α+
Sonlama Kodonu α2 TER; TAA→TAT (Pakse´ ) Loatian Tayland α+
Translasyon Sonrası Mutasyonlar Ekzon I -α Cd14;T→G Afrika α+
Ekzon I α2 Cd21; G→T Hollandalı α+
Ekzon I α2 Cd29; T→C Akdeniz α+
Ekzon I α2 Cd30; 3bç(del Q) Çin α+- α0
Ekzon I α2 Cd31; G→A (R-L) Çin α+- α0
Ekzon II α2 Cd 32; G→A (Amsterdam, M-I) Surinam-Siyah α+
Ekzon II α2 Cd 35; T→C (Evora, S-P) Filipin Portekiz α+- α0
Ekzon II α2 Cd 35; T→C (Chartres, F-S) Fransa α+
25
Ekzon II α2 Cd 37;del3bç(Heraklion, del P) Yunanistan α+- α0
Ekzon II α2 Cd 59; G→A (Adana, G-D) Türkler α+- α0
Ekzon II α2 Cd 60/61; del3bç (Clinic,del K) İspanya α+- α0
Ekzon II α2 Cd62;del3bç(AghiaSophia,del V) Yunanistan α0
Ekzon II α2 Cd 64–74; del 33bç Yunanistan α0
Ekzon II α2 Cd 66; T→C (Dartmouth, L-P) Kafkas α+- α0
Ekzon II α2 Cd 93; T→G (Bronte, V-G) İtalya α+
Ekzon II α2 Cd 93–99; dupl 22bç İran α+- α0
Ekzon III α2 Cd103; A→T (Hb Bronovo, H-L) Türkler α+- α0
Ekzon III α2 Cd104; G→A (Sallanches, C-Y) Fransa, Pakistan α+
Ekzon III α1 Cd104; T→A (Hb Oegstgeest,C-S) Surinam α+
Ekzon III α2 Cd108; C→A (Hb Bleuland, T-N) Surinam α+
Ekzon III α2 Cd109; T→G (Suan Dok, L-R) Tayland α+
Ekzon III α Cd110; C→A (Petah Tikva, A-D) Orta Doğu α+
Ekzon III α1 Cd119;C→T (Groene Hart ) Fas α+
Ekzon III α2 Cd 125; T→C (Quong Sze, L-P) Çin α+
Ekzon III -α3.7 Cd125; T→A (L-G) Musevi α0
Ekzon III α1 Cd129; T→C (Tunis-Bizerte, L- P) Tunus α+
Ekzon III α2 Cd 129; T→C (Utrecht, L-P) Hollanda α
Ekzon III α2 Cd 130; G→C (Sun Prairie, A-P) Asya, Hindistan α+
Ekzon III α2 Cd131; T→C (Questembert, S-W) Fransa, Yugoslavya α+
Ekzon III α2 Cd132; T→G (Caen, V-G) Kafkas α+
Ekzon III α2 Cd 136; T→C (Bibba, L-P) Kafkas α+
2.3.2.2.3. α- Talasemilerin Klinik Tablosu
Alfa talasemiler, α globin zincir sentezininin azalmasıyla ortaya çıkmaktadır.
Fenotipik olarak alfa talasemi dört kategoride incelenebilir, bunlardan ilki sessiz taşıyıcı
olarak tanımlanan bir alfa globin zincirinin kaybı ve dolayısıyla üç işlevsel alfa globin
zincirinin varlığı ile karakterizedir. Diğeri ise iki alfa globin zincirinin kaybı ve iki
işlevsel alfa globin zincirinin bulunduğu Hb “trait”tir. Üç alfa globin zincirinin kaybı ve
sadece bir işlevsel alfa globin zincirinin bulunduğu talasemi formunu da Hb H hastalığı
olarak ifade edilmektedir. Hiçbir işlevsel alfa globin zincirinin bulunmadığı dördünün
de kaybedildiği durum ise Hemoglobin Bart’s olarak ifade edilmektedir15,18.
26
Normal bireylerin retikülositlerinde α/β globin zincirlerinin oranı 1’e eşittir.
Ancak alfa talasemilerin meydana gelmesi ile bu oran; sessiz taşıyıcılarda 0.8’e,
“trait”te 0.6’ya, Hb H’da 0.3’e ve Hemoglobin Barts’ta 0’a kadar düşmektedir15.
2.3.2.2.3.1. Sessiz Taşıyıcı
Bir allel üzerinde sadece tek alfa genini içine alan (-3.7 kb ve -4.2 kb) delesyonlar
var ise (α-tal-2: -α/αα) sessiz alfa talasemi taşıyıcılığı şeklinde ifade edilmektedir. 3.7 kb
büyüklüğündeki delesyon tüm dünyada en sık karşılaşılan alfa talasemi mutasyonudur. Bu
delesyonlardan birine sahip olan kişiler tamamen sağlıklı olup kan sayım sonuçları ile
taşıyıcı olduklarını belirlemek genellikle zordur. Hematolojik bulgularda bu kişilerde
hemoglobin konsantrasyonu normal, MCV 70-80fl arasında, MCH ise sınırda veya düşük
olabilir. Retikülositlerdeki α/β zincirlerinin oranları normale yakındır15,68.
2.3.2.2.3.2. Hemoglobin Trait
α- Talasemi “trait”te, iki α- globin geninin kaybı ve işlevsel iki α-globin geninin ise
korunması ile ifade edilmektedir. Bazı mutasyonların homozigot formları bazılarının ise
heterozigot formu (-α/-α,-α/αTα ve bazen de αTα/ αTα) hemoglobin traitin meydana
gelmesine neden olmaktadır18. Bu tip alfa talaseminin en sık nedeni 3.7 kb’lık delesyonun
homozigot (-α 3.7/- α3.7) formudur. --/α5.2 ile --/α20.5 arasında yer alan büyük delesyonlar
da bu tip alfa talaseminin oluşmasına neden olmaktadır. Hemoglobin “trait”li bireylerde
genellikle anlamlı mikrositoz, artmış kırmızı hücre sayısı ve hissedilebilir α/β
zincirlerinin oranlarında azalma söz konusudur15,18,68.
α- Talasemi “trait”te, doğumda %5-15 oranında hemoglobin Bart’s görülmektedir.
Bu hemoglobin matürasyon sırasında ortadan kalkmakta yerini aynı miktarda Hb H
almaktadır. Periferik yaymada bazen Hemoglobin H inklüzyon cisimcikli hücre
görülmektedir15,18,68 (Şekil 2.13). Bu fenomen sıklıkla α- talasemi “trait” için tanısal bir test
olarak kullanılmaktadır15,68.
27
Şekil 2.13. A) Hemoglobin “trait”li bir hastanın periferik yayması B) Bazı hemoglobin “trait”li hastalarda
görülebilecek inklüzyon cisimcikli hücre
2.3.2.2.3.3. Hemoglobin H
Hemoglobin H hastalığı alfa globin zincirlerinden birinin nokta mutasyonu ya da
küçük delesyonu veya insersiyonu ile sonuçlanan α+ talasemi ile α0 talaseminin birlikte
görülmesi sonucunda üç işlevsel alfa globin zincirinin kaybı (--/-α) ile karakterize
edilir77. Yalnızca delesyonlarla oluşan tipinin yanı sıra, daha az sıklıkta görülen diğer
Hb H genotipleri, delesyonel ve nondelesyonel bozuklukların birlikte kalıtımını (--/-αT)
ve nondelesyonel bozukluğun homozigotluğunu (ααT/ααT veya αTα/ αTα)
kapsamaktadır9,15,37,77,78,79.
Hb H hastalığında α-globin zinciri ve α-globin mRNA üretimi azalmaktadır.
Buna bağlı olarak α/β globin mRNA oranı genelde 0.5’in altına düşmektedir. Ancak
bazı olgularda bu oranın 0.7 ile 0.2 arasında değiştiği bildirilmiştir18,77,80. Fetal
dönemde bireylerde aşırı γ globin zinciri sentezlenir ki bu da γ4 tetrameri ile karakterize
Hb Bart’sı oluştururken, yetişkin dönemde aşırı β globin zincir sentezi β4 tetrameri ile
karakterize edilen Hb H’ı oluşturur. Bu homotetramerler; yüksek oksijen affinitesine
sahiptirler, hem-hem etkileşimleri azdır ve dokulara daha az miktarda oksijen
taşınmasına neden olurlar77.
Hemoglobin H çoğunlukla talasemi intermedia kliniği göstermekte ancak
mutasyonların çeşitliliğine bağlı olarak klinik seyir de değişken olabilmektedir17,18,21.
Bu hastalarda mikrositoz, 8-10 g/dl arasında değişebilen hemoglobin düzeyine sahip
hafiften orta şiddete kadar varan anemi gözlenmektedir. Kan tablosunda,
A B
28
eritrositlerinde hipokromi görülmektedir15. Bunların dışında bireylerde splenomegali
(dalak büyümesi), safra taşı oluşumu, folik asit eksikliği ve bacak ülserleri gibi
komplikasyonların meydana geldiği rapor edilmiştir81. Klinik olarak genelde derin bir
anemiye sahip olmayan Hb H hastaları kan transfüzyonuna gerek duymadan hayatlarını
sürdürebilirler. Ancak bir enfeksiyon veya diğer nedenlerle birlikte olduğu durumlarda
kan almaları gerekebilir65.
Hb H hastalığı Güneydoğu Asya, Orta Doğu ve Akdeniz ülkelerinde
görülmektedir. Özellikle Güneydoğu Asya ve Çin’in güneydoğusunda yüksek frekansta
(--SEA) mutasyonu ve daha az sıklıkta (--FIL) mutasyonu görüldüğünden bu bölgelerde
Hb H’ın frekansı yüksektir77.
2.3.2.2.3.4. Hemoglobin Bart’s
Hb Bart’s sendromu, dört alfa globin geninin tamamının kaybı (--/--) ile
karakterize edilmektedir. Bu bireyler, orta ya da geç gestasyonel dönemde fetusun
ölümü ile sonuçlanmaktadır. Bu sendrom daima delesyonel mutasyonlardan
kaynaklanmaktadır. Bu infantlardaki başlıca hemoglobin olan Hb Bart’s dört γ (γ4)
zincirinden oluşmaktadır. Delesyondan korunmuş ζ-globin geninin ekspresyonu, fetusu
orta gestasyondan geç gestasyona taşıyan yeterli işlevsel hemoglobin tetramerlerinin
[Hb Portland I (ζ2γ2)] sentezini sağlamaktadır. Doğumda ortalama gestasyonel yaş 32
hafta kadardır. İnfantların yaklaşık %50’si ölü doğmakta ve geriye kalanı da doğumdan
birkaç saat sonra ölmektedir15,68. Güneydoğu Asya ülkelerinde hemoglobin “trait”(--
/αα) frekansı %4-14 olduğundan 200 doğumdan birinde Hb Bart’s (--/--)
görülmektedir18.
Etkilenen infantlarda yaygın ödem, karında asit, büyük genişlemiş karaciğer,
normal ya da hafif büyümüş dalak ve büyük kızarık plasenta görülür. MCV değeri
dolaşan çok sayıdaki çekirdekli eritrositler nedeniyle daima çok yüksektir. Hemoglobin
düzeyi 3-10g/dl arasındadır15,81(Tablo 2.5).
29
Tablo 2.5. Alfa talasemilerin klinik özellikleri Olası Fenotip Genotip MCV MCH HbA2 %HbH
/Barts
Normal αα/αα N N N __
Sessiz taşıyıcı -α3.7/αα ; -α4.2/αα N N N↓ 0
α-Talasemi
“trait”
-α3.7/-α3.7 ; --/αα ; -α/αTα ;-α4.2/-α4.2 ; -α4.2/-
α3.7
N↓ N↓ N↓ 0
Hb H hastalığı --/-α3.7;--/-α4.2;αTα/αTα;--/αCSα; -αT/-αT;--
/αTα
↓ ↓ N↓ 2-10Hb
H
Hb Bart’s --/-- ↓ ↓ _ 80Hb
Bart’s
Hb Barts’ta hiç alfa globin zinciri üretilemediğinden α/β globin zincirlerinin
mRNA oranları da sıfıra yakındır18 (Şekil 2.14).
Şekil 2.14. Alfa talasemilerde α/β globin zincirlerinin biyosentezlerinin oranları
α/β
Glo
bin
Zin
cirl
erin
in B
iyos
ente
zler
inin
Ora
nlar
ı
30
2.3.2.2.4. α-Talasemilerin Coğrafik Dağılımı ve İnsidansı
Hemoglobinlerin üretimlerinde ya da yapılarında meydana gelen bozukluklarla
ifade edilen hemoglobinopatiler, malaryadan kaynaklı ölümlere karşı bireyleri
korumaktadır82,83. Dünya’daki α-talasemi dağılımı Plasmodium falciparum malarya ile
yakından ilişkilidir. 1946 yılında Haldane tarafından yapılan bir çalışmada talaseminin
tropikal bölgelerde yaygın olduğu ve talasemi taşıyıcılarının malaryaya karşı direnç
gösterdiği rapor edilmiştir15.
Malaryaya karşı doğal elemenin hemoglobinopatileri arttırdığına dair kanıtlar
bulunmaktadır. Sıtmanın yaygın olduğu bir bölgede predominant mutasyon olarak
–α3.7III tipinin bulunması malarya ve alfa talasemi ilişkisini desteklemektedir15.
2.3.2.2.4.1. Dünya’da α- Talasemi İnsidansı
α-talasemiler dünyada en yaygın kalıtsal kan hastalığı olarak bilinmektedir18,26,81.
En çok tropikal bölgelerde görülen alfa talasemiler, malaryanın görüldüğü ülkelerde
insidansın yüksek olduğu bilinmektedir. 1946 yılında Vezzoso yaptığı çalışmada
İtalya’da talasemi dağılımının malarya dağılımı ile aynı olduğunu rapor etmiştir7.
Ülkemizi de içine alan Doğu Akdeniz bölgesinde hemoglobinopati taramasında alfa
talasemi sıklığının bu bölgelerde yüksek olduğu rapor edilmiştir26. Dünyada Akdeniz,
Ortadoğu, Hindistan, Çin ve Güneydoğu Asya’da alfa talasemi yaygın olarak
gözlenmektedir84(Şekil 2.15).
31
Şekil 2.15. Dünyada alfa talasemi insidansı
α0-talasemi Akdeniz ülkelerinde ve Asya toplumlarında daha sıklıkla
bulunmakta, Afrika ve Ortadoğu’da ise daha az gözlenmektedir. α+-talaseminin
delesyonel formları daha çok Batı Afrika, Akdeniz, Ortadoğu ve Güneydoğu Asya’da
görülmektedir. Buna karşın α+ talaseminin nondelesyonel formuna daha çok körfez
ülkelerinde rastlanmaktadır. Bu ülkelerde çok sayıda klinik seyri ağır olan Hb H
hastalarına da rastlanmaktadır26.
Siyah Amerikalılarda da α talaseminin insidansı yüksek bulunmuş fakat klinik
açıdan çok önemli olmadıkları rapor edilmiştir15,26.
2.3.2.2.4.2. Türkiye’de α-Talasemi İnsidansı
Türkiye’de yapılan çalışmalarda alfa talasemi taşıyıcı sıklığının %2 oranında
olduğu rapor edilmiştir. Moleküler düzeyde yapılan çalışmalarda ise beş tür delesyon
saptanmıştır. Bunlardan üçü (26.5kb, 20.5kb ve 17.4 kb) aynı allel üzerindeki α2 ve α1
genlerini içine alan ağır alfa talasemi taşıyıcıları (α-tal-1: --/αα) diğer ikisi (-3.7 kb ve -4.2
kb) ise sadece bir alfa genini içine alan (α-tal-2: -α/αα) sessiz alfa talasemi taşıyıcılarıdır.
Alfa 2 geni üzerindeki nondelesyonel alfa talasemi mutasyonlarından Akdeniz ülkelerine
32
spesifik olanlar PA1: AATAAA→AATGAA ve PA2: AATAAA→AATAAG ile IVS1'in
donör kısmındaki 5 nükleotidlik delesyon (-TGAGG) ülkemizde de görülmüştür. Alfa 1
geni üzerinde (Cod 59 GGC→GAC: Gly→Asp ) bulunan ve G→A değişimi ile meydana
gelen dayanıksız Hb Adana varyantı da alfa talasemiye neden olmaktadır. Hb Adana ve
Poly A (PA2) mutasyonları ilk kez Türkiye’de HbH hastalarında tanımlanmıştır56,65,85.
Türkiyede yapılan iki farklı çalışmada Hb SS ile α-talaseminin birlikte kalıtıldığına
dair veriler bulunmaktadır. Eti Türklerinde yapılan çalışmada Hb SS ve α-talasemi
insidansı %17 olarak ifade edilmiştir86,87.
2.3.2.2.4.3. Çukurova’da α-Talasemi İnsidansı
Kılınç ve arkadaşları Adana bölgesinde yeni doğan bebeklerde kordon kanı
çalışması yaptıklarında alfa talasemi taşıyıcı sıklığını %3,3 olduğunu bildirmişlerdir88,89.
Yüreğir ve arkadaşları Adana Karataş bölgesinde yaptıkları çalışmada α+-talasemi (α3.7) ve
α-gen triplikasyonlu olgular bulmuşlardır66. Yine Yüreğir ve arkadaşlarınının yapmış
oldukları bir çalışmada α-talasemi-1(αMED II) ve yeni delesyonel α-talasemi-2 birlikteliği ile
oluşan Hb H hastalığını tanımlamışlardır. Bu yeni nondelesyonel α-talasemi-2
mutasyonunun, α2 globin gen lokusunun poli A kuyruğunda (AATAAAàAATGAA)
olduğunu göstermişlerdir78. Çukurova bölgesinde yapılan aile taramalarında 3.7kb, 17.5kb
ve 20.5kb delesyon içeren α-talasemi ile bunların birleşik heterozigotluğu ile oluşan Hb H
olguları da saptanmıştır90,91,92.
33
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Gereçler
3.1.1. Cihazlar
DNA Dizi Analizi Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer
Thermal Cycler Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler
Otomatik DNA İzolasyon Cihazı Magna- Pure LC
HPLC Agilent 1100
Kan Sayımı Cihazı Coulter Counter T-890
Spektrofotometre Shimadzu UV-120-02
Hassas Terazi Mettler AJ 100
Santrifüj Ependorf 5403
Mikrosantrifüj Beckman Microfuge E
pH metre Beckman Century SS-1
Elektroforez Güç Kaynağı Pharmacia Electroforesis Power Supply EPS500/400
Bio-Rad Power PAC 300
Elektroforez Tankı Bio-Rad Mini Protean II
Mikrodalga Fırın Arçelik MD 551
Mikroskop Nikon
Derin Dondurucu Bosh
Etüv Nüve
Vorteks Nüve NM 110
34
3.1.2. Kimyasal Malzemeler
Glisin Merck
Potasyum siyanür Merck
DE-52 Whatman
Amonyum siyanür Sigma
Sodyum hidroksit Merck
Potasyum siyanoferrat Merck
Amonyum bikarbonat Sigma
Amonyum klorür Merck
Sodyum klorür Merck
EDTA Na2 Merck
Tris Amresco
Borik asit Merck
Sodyum dietil barbital Merck
Dietil barbitürik asit Merck
Ponceau-S Sigma
Trikloroasetik asit Merck
Asetik asit Merck
Selüloz asetat kağıdı Sepraphore III
Whatman kağıdı Whatman III
Taq polimeraz Promega, Fermantas
DNA izolasyon kiti Magna Pure LC
Big Dye Applied Biosystems
Sephadex Sigma
BigDye sekans kiti ABI PRISM
dNTP’ler
Primerler
35
3.2. Örnek Seçimi
Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi etik kurulunun onayı alınmış ve onay
belgesi Ek 1’de verilmiştir. Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalına rutin mutasyon analizi
ve Doğum öncesi tanı için başvuruda bulunan kişiler ve bu kişilerin ailelerinden alınan
kan örnekleri çalışmada kullanılmıştır. Kişilerden onam formu alınmış ve formunun
örneği Ek 2’de verilmiştir. Kan örnekleri EDTA’lı tüpe alınarak tam kan sayımı93,
selüloz asetat elektroforezi94 ve HPLC ile hemoglobin tiplendirilmesi93, mikrokolon
kromatografisi ile HbA2 düzeyi95 ve alkali denatürasyonla HbF96 düzeyleri
belirlenmiştir. Talasemi ve Anormal Hemoglobin tanısı konan olguların lökosit DNA’sı
Magna Pure LC Otomatik DNA İzolasyon Cihazı ile izole edilip +4 derecede
saklanmıştır. Mutasyon tiplendirilmesinde ARMS ve Gap-PCR gibi geleneksel
yöntemler kullanılmıştır. Mutasyonları tanımlanamayan olgular ise DNA Dizi Analizi
yöntemiyle tanımlanmıştır.
3.3. Yöntemler 3.3.1.Hematolojik Çalışmalar
Örneklerin lökosit ve eritrosit sayısı, Hemoglobin (Hb), hematokrit (Hct),
ortalama eritrosit hacmi (MCV), ortalama eritrosit hemoglobini (MCH) ve ortalama
eritrosit hemoglobin konsantrasyonu (MCHC) Coulter T 890 kan sayım cihazı ile
ölçülmüştür93.
3.3.2.Hemoglobin Elektroforezi
Alkali pH’ta hemoglobin molekülü negatif yüklüdür ve elektriksel ortamda anoda
doğru göç eder. Yük değişikliği olan varyantlar ise farklı göç ederler. Alkali ortamda
Selüloz asetat kâğıdı üzerine uygulanan hemolizat örneklerine, elektriksel güç
uygulanarak hemoglobin tiplendirilmesi yapılmıştır94.
36
Ayıraçlar
1. Anot tamponu 0,26 M pH 9,1
Tris 25,2 g
EDTA 2,5 g
Borik asit 1,9 g
Bir miktar saf suda çözülüp, pH 9,1’e ayarlanarak 1 litreye saf su ile
tamamlanmıştır.
2. Katot tamponu 0,2 M pH 8,6
Na-Barbital 5,15 g
Barbital 0,92 g
Bir miktar saf suda çözülüp, pH 8,6’ya ayarlanarak 1 litreye saf su ile
tamamlanmıştır.
3.Boya çözeltisi
500 mg Ponceau-S 100 mL % 5’lik trikloroasetik asitte çözülmüştür.
4.Yıkama çözeltisi
% 5 lik asetik asit
5.Elektroforez koşulları
Süre 45 dk
Voltaj 190-200 volt
Amper 0,75 mA/cm
Uygulama Katodik
6.Taşıyıcı ortam
Selüloz asetat kâğıdı
Yöntem
1. Hemolizat hazırlanması: EDTA’lı tüplere alınan kan örnekleri santrifüj edilerek
plazmasından ayrılmıştır.
2. Eritrositler serum fizyolojik ile üç defa yıkanmıştır.
3. 60 μL eritrosit üzerine 800 μL saf su eklenerek eritrositler parçalanarak hemoliz
edilmiştir.
4. Elektroforez tankının anoduna ve katoduna uygun tamponlar konulmuştur.
5. Anot ve katot tampondan eşit hacim içeren çözeltide selüloz asetat kâğıdı
yaklaşık 10 dakika ıslatılmıştır.
37
6. Selüloz asetat kâğıdına hazırlanan hemolizattan 3 μL katodik olarak tatbik
edilerek elektroforez tankının köprüsüne yerleştirilmiştir.
7. 0,75 mA/cm akım 45 dakika uygulanıp elektroforez bitiminde selüloz asetat
kağıdı Ponceau-S ile boyanmıştır.
8. Yıkama çözeltisi ile selüloz asetat kâğıdı temizlendiğinde hemoglobin
tiplendirilmesi yapılmıştır.
3.3.3. Mikrokolon Kromotografisi ile HbA2 Ölçümü
Hemoglobin molekülünün yüklü gruplarının iyon değiştirici reçineye
bağlanmasıyla HbA2 diğer hemoglobinlerden uzaklaştırılmıştır. Reçineye bağlı HbA2
geliştirici tamponuyla ayrıştırılarak miktarı spektrofotometrede okunmuştur95.
Ayıraçlar
1.Geliştirici A–1 (yıkama için) : 0,2 M Glisin ve 0,01 M KCN saf suda çözülerek
1 L’ ye tamamlanmıştır.
2.Geliştirici A–2: 0,2 M Glisin, 0,01 M KCN ve 0,02 M NaCl saf suda çözülerek
1 L’ ye tamamlanmıştır.
3.Geliştirici B: 0,2 M Glisin, 0,01 M KCN ve 0,2 M NaCl saf suda çözülerek 1 L’
ye tamamlanmıştır.
4. İyon değiştirici DE–52 kolonunun hazırlanması: 1 hacim DE–52 jelinin üzerine
3 hacim geliştirici A–1 eklenerek jel yıkanıp pH’sı 7,2–7,6 arasında oluncaya kadar bu
işleme devam edilmiştir.
Yöntem
EDTA’lı tüplere alınan kan örnekleri santrifüj edilerek plazmasından ayrılmıştır.
Eritrositler serum fizyolojik ile üç defa yıkanmıştır. 50 μL eritrosit üzerine 200 μL saf
su eklenerek eritrositler parçalanarak hemoliz edilmiştir.
Kolon dengelendikten sonra üzerine 60 μL hemolizat tatbik edilerek geliştirici A–
2 ile yıkanıp 8 mL süzüntü toplanmıştır. Bu sırada HbA2’nin kolondan ayrılması
sağlanmıştır.
Total Hemoglobinin reçineden ayrıştırılması için kolon geliştirici B ile
yıkanmıştır. Toplanan süzüntü saf su ile 25 mL’ye tamamlanmıştır. Süzüntünün
38
spektrofotometrede absorbansı 415 nm dalga boyunda saf su körüne karşı okunarak %
HbA2 hesaplanmıştır.
Aşağıdaki eşitliğe göre hesaplama yapılmıştır.
%HbA2 =OD HbA2/ (OD HbA2 + 3,125 x OD HbA)
Referans Aralığı: % 2,5–3,7 95
3.3.4. Modifiye Betke Yöntemi ile Fetal Hemoglobin (HbF) Ölçümü
Hemoglobinler içinde alkaliye en dirençli olanı HbF’dir. Bu özelliğinden
faydalanılarak HbF miktarı belirlenmektedir. NaOH ile denatürasyondan sonra diğer
hemoglobinler amonyum sülfatla çöktürülerek filtre kâğıdından süzülür ve HbF içeren
berrak süpernatan solüsyonunun absorbansı spektrofotometrede 540 nm’de okunup
konsantrasyonu saptanmıştır96.
Aşağıdaki eşitliğe göre hesaplama yapılmıştır.
% HbF = [OD HbF süzüntü / (OD HbToplam x 100)] x100
Referans Aralığı: % 0,8–2,096
Ayıraçlar
1. Siyanür çözeltisi
6,1 M K3Fe(CN)6 ve 0,03 M KCN saf suda çözülerek 1L’ye tamamlanmıştır.
2. 1,2 M NaOH
3. Doymuş Amonyum Sülfat
5,3 M (NH4)2SO4 saf suda çözülerek 100 mL’ye tamamlanmıştır.
Yöntem
Hemolizat 3.3.2. de anlatıldığı gibi hazırlanmıştır. Her bir örnek için 3 deney tüpü
hazırlanıp ayıraçlar oda ısısına getirildikten sonra I.tüpe 3,8 mL siyanür çözeltisi konup
0,2 mL hemolizat ile karıştırılarak 10 dakika bekletilmiştir. Bu karışımdan 2,8 mL II.
tüpe alınıp üzerine 1,2 N NaOH’den 0,2 mL ilave edilip 2 dakika bekletilmiştir. Daha
sonra II. tüpün üstüne 2 mL doymuş amonyum sülfat eklenip 20 dakika bekletilmiş ve
filtre kâğıdından süzülmüştür. Total hemoglobin tayini için I.tüpten 0,4 mL alınıp
üzerine 6,75 mL saf su ilave edilerek III. tüp hazırlanmıştır. II. ve III. tüplerin
absorbansları spektrofotometrede 540 nm’de saf suya karşı okunarak HbF oranı %
olarak hesaplanmıştır.
39
3.3.5. Oraklaşma Testi
Hemoglobin S, oksijensiz ortamda veya güçlü bir indirgeyici ajan olan sodyum
metabisülfit varlığında eritrositlerin orak şeklini almasıyla tanımlanmaktadır50.
Ayıraçlar
0,1 M Na2S2O5 10 mL saf suda çözülerek hemen kullanılmıştır.
Yöntem
Tam kan örneğinden 20 μL alınarak lamın ortasına konup üzerine % 2’lik sodyum
meta bisülfitten bir damla eklenip üzeri lamelle kapatılıp lamelin kenarları entellan veya
oje gibi yapıştırıcı ile hava almaması için kapatılıp 5–30 dk. sonra mikroskopta
eritrositlerin oraklaşması incelenmiştir.
3.3.6. Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi (HPLC)
Sıvı Kromotografisi, hareketli sıvı fazın kolon ya da ince tabaka partikülleri
arasında dağılması esasına göre yapılan ayırma tekniğidir. Bu sistem ile proteinler,
peptidler, ilaçlar ve metabolik ürünler kolaylıkla analiz edilebilmektedir. HPLC,
temelde farklı olmamasına karşın diğer konvansiyonel sıvı kromatografilerinden ileri
teknolojik aletlerin, özel kolonların, çok duyarlı saptayıcıların ve yüksek akış hızlarının
kullanımı ile daha üstün ayırma gücüne sahiptir93,97,98.
HPLC sistemi aşağıdaki bölümlerden oluşmaktadır.
1-Hareketli sıvı deposu
2. Pompalar
3.Enjeksiyon halkası
4.Kolon: Basınca dayanması için çelikten yapılmış bir boru içerisine anyon veya
katyon değiştirici reçine doldurulmuştur.
5.Değişken dalga boyu saptayıcısı : Hb için 415 nm ve globin zincir analizi için
220 nm dalga boyunda okuma yapar.
6.Kaydedici ve integrator: Dedektörden gelen sinyalleri kaydeder ve her
fraksiyonun yüzde değerlerini hesaplar.
7.Sonikator
Açık sistemli klasik kolon kromatografisinde hareketli faz, durgun faz içinden
yerçekimi veya düşük basınçla geçerken, HPLC’de hareketli faz kolon içine yüksek
40
basınç ile pompalanmaktadır. Durgun faz, hareketli faz ve örnek arasındaki
etkileşimlerin tipine bağlı olarak, HPLC’de çeşitli ayrıştırma özellikleri
kullanılabilir93,97,98.
HPLC’ nin; seçiciliğinin yüksek oluşu, duyarlılığı, analiz süresinin kısalığı,
istenilen fraksiyonların saflaştırılması, tekrarlanabilirliği, uygulama kolaylığı ve
mikrogram düzeyinde az örnekle çalışılması gibi özelliklerinden dolayı klasik
kromatografik sistemlere göre üstünlükleri vardır.
Sistemin Özellikleri
1.Sabit akım hızı sağlar, bu nedenle retansiyon zamanları ve pik alanları analizden
analize değişim göstermez.
2.Kompüterize gradyan kontrollü çözelti kompozisyonunun analizden analize
tekrarlanabilirliğini sağlar.
3.Enjeksiyon valfi sayesinde enjekte edilen madde miktarı sabit tutulur ve
istenilen miktarda örnek enjekte edilebilir.
4.Saptayıcılar istenilen duyarlılığı sağlar.
Uygulama Alanları
Oldukça geniş kullanım alanları vardır; peptidler, kimyasallar, ilaçlar, hormonlar,
enzimler, nükleikasitler, proteinler, yiyecekler, aminoasitler ve vitaminler gibi
konsantrasyonu düşük kimyasallar ayrıştırılabilirler93,97,98.
Yöntem
1) Kahverengi şişelere hemolizat çözeltisinden 500 μL, EDTA.K3 tüpüne alınmış
olan tam kandan 2 μL eklenip karıştırılır.
2) Cihazlar kapalıyken purge vanası açılır.
3) Bilgisayar açılır ve Cag Bootp Server tıklanır.
4) HPLC programı açılıp On düğmesine basılır.
5) Ekranda görülen şişe şeklinin üzerindeki yeşil düğmeye basılıp Set up tıklanır ve
çözeltinin kolondan geçiş hızını gösteren Flow kısmına 1.5 mL/dk yazılır.
6) Borulardaki hava boşluğu yoksa purge vanası kapatılır.
7) Sequence düğmesi tıklanıp ardından Sequence Parameter düğmesi tıklanır.
8) Prefix kısmına tarih yazılıp OK düğmesi tıklanır.
9) Sequence düğmesi tekrar tıklanıp Sequence Table düğmesine basılır.
41
10) İnsert Vial Range düğmesine basılıp ekrana gelen Method Name kısmından Hb2
seçilir.
11) From Vial, kaçıncı örnekten başlanacağını, To Vial, kaç örneğin çalışılacağını,
İnjection pervial, örneklerin kaç defa çalışılacağını, İnjection volüm, kaç μL
örnek alınacağını gösterir. İnjection volüm kısmına 10 yazılıp OK düğmesine
basılır.
12) Sample Name kısmına isimler yazıldıktan sonra Sequence düğmesi tıklanıp
sonra Save Sequence tıklanır.
13) Ekrandaki küçük OK düğmelerinden Online Plots düğmesine basılır.
14) Balance düğmesine basılıp Base Line çizgisinin sıfırda olduğu kontrol edilir.
15) Start düğmesine basılıp ardından ekranda çıkan OK düğmesine basılır.
16) Örnekler çalışıldıktan sonra Set up düğmesinden Flow kısmına 0 mL/dk yazılıp
pompa akışı durdurulur.
17) Sonuçlara ulaşmak için Method and Run Control düğmesine basılıp Data
Analyse düğmesine basılır.
18) Kaydedilen dosya tıklanıp print düğmesine basılarak yazıcıda örnekler yazdırılır.
19) Method düğmesi tıklanıp ardından Off düğmesi tıklanır ve bilgisayar kapatılır.
20) En son cihaz kapatılır.
3.3.7. Tam Kandan DNA İzolasyonu
Magna Pure LC Otomatik DNA İzolasyon cihazı ile elde edilmiştir. Manyetik
partikül teknolojisi esastır. Kaotropik tuzlar ve proteinaz K içeren tamponla örnekler
parçalanır. Manyetik cam partiküller eklenerek, DNA bunların yüzeylerine bağlanır.
Bağlanmayan maddeler yıkama basamaklarıyla uzaklaştırılıp saflaştırılmış DNA
toplanır99.
Ayıraçlar
1) Yıkama Tamponu I: PCR inhibitörlerini uzaklaştırmak içindir.
Guanidinyum HCl
Etanol
2) Yıkama Tamponu II: Tuzlar ve proteinleri uzaklaştırmak içindir.
Etanol
42
3) Yıkama Tamponu III: Tuzları uzaklaştırmak içindir.
4) Parçalayıcı / Bağlayıcı Tampon: Tüm hücrelerin parçalanması sağlanarak
nükleik asitlerin serbest kalması sağlanır.
Guanidinyum tiosiyanat
Triton X-100
5) Manyetik Cam Partikül (MGP) süspansiyonu: Kaotropik tuz varlığında,
izoproponol ve bağlayıcı tamponun yüksek iyonik gücüne bağlı olarak DNA’lar MGP
nin silika yüzeyine yapışır.
6) Toplama Tamponu: Saf DNA’yı toplamak içindir.
7) Proteinaz K tampon II: Proteinaz K’nın yeniden tertiplenmesi içindir.
8) Proteinaz K
Yöntem
1) Cihaz açıldıktan sonra bilgisayar açılır.
2) Ekrana gelen MagnaPure yazılım programında Sample Ordering düğmesine
basılır. A1’den başlanarak hasta isimleri yazılır. Files düğmesine basıldıktan
sonra Save düğmesine basılıp kaydedilir.
3) OK düğmesine basıldıktan sonra ekranda gösterilen yerleşim yerine göre
Elution Kartuş, Storage Kartuş ve pipetler yerleştirilir.
4) Solid Waste kısmına poşet takılır.
5) EDTA.K3 tüpüne alınmış olan tam kandan 500 μL Proccessing kartuşuna
sırayla pipetlenir.
6) Kit hazırlığına geçilip ekrandaki sıra ve miktarlarına göre çözeltiler konur.
7) Proteinaz K kendi tamponu ile çözülür (bir şişe için 5 mL tampon).
8) Manyetik Partikül konur.
9) 32 örnek için;
Wash Buffer I 48,8 mL
Wash Buffer II 28,0 mL
Lysis/Binding 16,2 mL
MGP 11,0 mL
Elution Buffer 12,5 mL
Proteinaz K 2,1 mL
eklenir.
43
10) DNA LV Blood 300-500 seçilir.
11) Sample Volume kısmına 500 μL, Elution Volume kısmına 100 μL yazılır.
12) Konulan her şey ekranda işaretlenir.
13) OK düğmesine basılıp program başlatılır.
14) Program bitince cihazın kapağı açılıp DNA’lar Storage kartuştan alınır.
15) Cihazın kapağı kapatılıp ekrandaki Decontamination düğmesine basılır ve 2
saat süre verilir. Action düğmesine basıldıktan sonra Start düğmesine basılır.
16) İki saatin sonunda bilgisayar ve cihaz kapatılır.
3.3.8. ARMS Yöntemi ile Mutasyonların Belirlenmesi
DNA örneklerinin ilgili gen bölgeleri PCR ile amplifiye edildikten sonra
mutasyon tanımlanması gerçekleştirilir1,16,50,98.
Ayıraçlar
Stok Çözeltiler
KCl 2 M
Tris-HCl, pH 8,3 1 M
MgCl2.6H2O 1 M
+4 °C’de saklanır.
10X Cetus Tamponu
2 M KCl 1,25 mL
1 M Tris.HCl 0,5 mL
1 M MgCl2 75 μL
Jelatin 5 mg
Steril saf su 3,2 mL
Jelatinin erimesi için 37 °C’de bekletilir.
Spermidin 1 M
PCR Karışımı (4 mL)
10X Cetus Tamponu 500 μL
Steril saf su 2700 μL
1,25 mM dNTP karışımı 800 μL
Spermidin 1 M 4 μL
44
dNTP Karışımı
dNTP’lerin (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) her birinden (100 mM’lık stoktan) 60 μL
alınıp üzerine 4740 μL steril saf su eklenerek 1,25 mM’lık çözelti hazırlanır.
Primerler
Primerler 5 pmol/ μL olacak şekilde sulandırılır.
10X TBE Tamponu pH 8,3
Tris-HCl 2 M
Sodyum Asetat 3H2O 1 M
EDTA-Na2 10 mM
Saf su ile 1 litreye tamamlanıp pH’sı glasiyel asetik asit ile ayarlanır.
Amplifikasyon Koşulları
Amplifikasyon 24,1 μL’lik reaksiyon hacminde gerçekleştirilir. Reaksiyon
karışımı; PCR karışımı, mutasyonu içeren bölgeye özgü ARMS primeri, ortak primer (1
veya 2), sabit primer, genomik DNA ve Taq polimeraz içermektedir98.
Amplifikasyon Protokolü
PCR Karışımı 20 μL
Ortak primer 1 ve 2 1 μL
5' sabit primer 1 μL
3'sabit primer 1 μL
DNA (0,5-1 μg/mL) 1 μL
Taq polimeraz (5 U/µL) 0,1 μL
ARMS yönteminde kullanılan ortak ve sabit primerler Tablo 3.1’de verilmiştir.
Tablo 3.1. ARMS yönteminde kullanılan primerler Ortak primer 1 5' ACC TCA CCC TGT GGA GCC AC 3'
Ortak primer 2 5' CCC CTT CCT ATG ACA TGA ACT TAA 3'
5' sabit primer 5' CAA TGT ATC ATG CCT CTT TGC ACC 3'
3' sabit primer 5' GAG TCA AGG CTG AGA GAT GCA GGA 3'
45
β-talasemi mutasyonlarına özgü kullanılan ARMS primerleri Tablo 3.2’de
verilmiştir.
Tablo 3.2. ARMS yönteminde kullanılan β-talasemi mutasyonlarına özgü primerler IVS I-110 (G→A) (M) 5' ACC AGC AGC CTA AGG GTG GGA AAA TAC ACT 3'
IVS I-110 (G→A) (N) 5' ACC AGC AGC CTA AGG GTG GGA AAA TAC ACC 3'
IVS I-1 (G→A) (M) 5' TTA AAC CTG TCT TGT AAC CTT GAT ACG AAT 3'
IVS I-1 (G→A) (N) 5' TTA AAC CTG TCT TGT AAC CTT GAT ACG AAC 3'
Cd 39 (C→T) (M) 5' CAG ATC CCC AAA GGA CTC AAA GAA CCT GTA 3'
Cd 39 (C→T) (N) 5' TTA GGC TGC TGG TGG TCT ACC CTT GGT CCC 3'
IVS I-6 (T→C) (M) 5' TCT CCT TAA ACC TGT CTT GTA ACC TTC ATG 3'
IVS I-6 (T→C) (N) 5' TCT CCT TAA ACC TGT CTT GTA ACC TTC ATA 3'
IVS II-1 (G→A) (M) 5' AAG AAA ACA TCA AGG GTC CCA TAG ACT GAT 3'
IVS II-1 (G→A) (N) 5' AAG AAA ACA TCA AGG GTC CCA TAG ACT GAC 3'
Cd 6 (-A) (M) 5' CCC ACA GGG CAG TAA CGG CAG ACT TCT GCC 3'
Cd 6 (-A) (N) 5' CCC ACA GGG CAG TAA CGG CAG ACT TCT GCT 3'
IVS II-745 (C→G) (M) 5' TCA TAT TGC TAA TAG CAG CTA CAA TCG AGG 3'
IVS II-745 (C→G) (N) 5' TCA TAT TGC TAA TAG CAG CTA CAA TCG AGC 3'
- 87 (C→G) (M) 5' CAC TTA GAC CTC ACC CTG TGG AGC CAC CCG 3'
- 87 (C→G) (N) 5' CAC TTA GAC CTC ACC CTG TGG AGC CAC CCC 3'
*M: Mutant primer N: Normal primer
PCR Programı
PCR programı 25 döngü; 94°C’de 1 dk (denatürasyon), 65°C’de 1 dk (yapışma)
ve 72°C’de 1 dk (uzama) olacak şekilde gerçekleştirilir. Son döngü 72°C’de 3 dk olacak
şeklinde tamamlanmıştır.
46
3.3.8.1. Agaroz Jel Elektroforezi
Ayıraçlar
%2’lik Nuesive-Agaroz Jel
Nuesieve 1 g
Agaroz 1 g
100 mL 0,5 X TBE tamponu içinde mikrodalga fırında çözülerek hazırlanmıştır.
Yükleme Tamponu
Brom fenol mavisi %0,05
Gliserol %10
Ficoll %15
5 X TBE Tamponu pH 8,0
Tris baz 54,0 g
Borik asit 27,5 g
EDTA (0,5M pH 8,0) 20 mL
1 L saf suda çözülerek hazırlanmıştır.
Etidyum Bromür Çözeltisi
EtBr 5 μg/mL olacak şekilde saf suda çözülerek hazırlanmıştır.
Yöntem
PCR sonunda amplifiye olan üründen 20 μL alınarak 2 μL yükleme tamponu ile
karıştırıldıktan sonra %2’lik agaroz jele uygulanıp 150 voltta 30 dk yürütülmüştür.
Elektroforez sonrası jel etidyum bromür ile 3 dk boyanıp saf su ile yıkanarak
temizlenmiştir. DNA parçaları UV ile görünür hale getirilerek fotoğrafı çekilmiştir.
Homozigot olgular mutant çalışmada çift bant, normal çalışmada ise tek bant
verirler. Heterozigot olgular hem mutant hem de normal çalışmada çift bant verirler.
Normal olgular ise mutant çalışmada tek bant, normal çalışmada çift bant verirler.
3.3.9. Gap PCR Yöntemi İle α Talasemi Mutasyon Taraması
DNA örneklerinin ilgili gen bölgeleri amplifiye edildikten sonra α talasemi
mutasyon tanımlamaları yapılmıştır100.
47
Ayıraçlar
Primer Karışımı (320µl)
4.2-F stok 5 μL, Saf su 15 μL
4.2-R stok 5 μL, Saf su 15 μL
α2-R stok 2 μL, Saf su 18 μL
α 2/3.7-F stok 2 μL, Saf su 18 μL
3.7/20.5-R stok 2 μL, Saf su 18 μL
SEA-F stok 2 μL, Saf su 18 μL
SEA-R stok 2 μL, Saf su 18 μL
20.5-F stok 2 μL, Saf su 18 μL
MED-F stok 2 μL, Saf su 18 μL
MED-R stok *R: Reverse
2 μL, F: Forward
Saf su 18 μL
Stok Çözeltiler
1. 10× PCR Tamponu
2. 25 mM MgCl2
3. 6 mM dNTP
4. Taq polimeraz
5. Primer karışımı
6. 5xGC Geliştirici
PCR Karışımı (1ml)
Primer Karışımı 320 μL
MgCl2 60 μL
dNTP karışımı 35 μL
10xPCR tamponu 100 μL
5xGC Geliştirici 200 μL
Amplifikasyon Protokolü
PCR Karışımı 25 μL
48
DNA (0,5-1µg/ml) 2 μL
Fast Start Taq polimeraz(5U/µl) 0,25 μL
Gap PCR yönteminde kullanılan primerler Tablo 3.3’de gösterilmiştir100. Tablo 3.3. Gap PCR yönteminde kullanılan α-talasemi mutasyonlarına özgü primerler α2/3.7-F CCCCTCGCCAAGTCCACCC
3.7/20.5-R AAAGCACTCTAGGGTCCAGCG
α2-R AGACCAGGAAGGGCCGGTG
4.2-F GGTTTACCCATGTGGTGCCTC
4.2-R CCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC
SEA-F CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC
SEA-R AGCCCACGTTGTGTTCATGGC
20.5-F GCCCAACATCCGGAGTACATG
MED-F TACCCTTTGCAAGCACACGTAC
MED-R TCAATCTCCGACAGCTCCGAC
*R: Reverse F: Forward
PCR Programı
PCR programı 1ci döngü, 95°C’de 5 dk şeklinde başlamıştır. 30 döngü; 98°C’de
45 sn (denatürasyon), 60°C’de 1 dk 30 sn (yapışma) ve 72°C’de 2 dk 15 sn (uzama)
olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Son döngü 72°C’de 5 dk olacak şekilde
tamamlanmıştır.
3.3.9.1. Agaroz Jel Elektroforezi
Ayıraçlar
%1,5’lik Agaroz Jel
Agaroz 1,5 g
100 mL 0,5 X TBE tamponu içinde mikrodalga fırında çözülerek hazırlanmıştır.
49
Yükleme Tamponu
Brom fenol mavisi %0,05
Gliserol %10
Ficoll %15
5 X TBE Tamponu pH 8,0
Tris baz 54,0 g
Borik asit 27,5 g
EDTA (0,5M pH 8,0) 20 mL
1 L saf suda çözülerek hazırlanmıştır.
Etidyum Bromür Çözeltisi
EtBr 5 μg/mL olacak şekilde saf suda çözülerek hazırlanmıştır.
Yöntem
Amplifiye üründen 20 μL alınarak 2 μL yükleme tamponu ile karıştırıldıktan
sonra %1,5’lik agaroz jele uygulanıp 150 voltta 50 dk yürütülmüştür. Elektroforez
sonrası jel etidyum bromür ile 3 dk boyanıp boyanın fazlası saf su ile yıkanarak
temizlenmiştir. DNA parçaları UV ile görünür hale getirilerek fotoğrafı çekilmiştir.
3.3.10. DNA Dizi Analizi
DNA dizi analizi, baz dizilerinin sırasını ortaya çıkarmak için kullanılan bir
genetik şifre çözme yöntemidir. Otomatik DNA izolasyon cihazıyla elde edilen
genomik DNA’nın belirli bölgeleri PCR yöntemi ile çoğaltılıp floresan madde ile
işaretlenir. Ardından kapiller elektroforez sisteminde bazlara ayrıştırılarak veriler DNA
dizilerine çevrilir101.
3.3.10.1. Hedef DNA’nın Çoğaltılması ve İşaretlenmesi
Önce DNA’nın tanımlanmış hedef bölgesinin PCR yardımıyla çoğaltılması
gerekir. Duyarlılığı en üst düzeye getirmek ve hedef dizilerin okunabilirliğini arttırmak
için yeterli miktarda hedef DNA’nın çoğaltılması gerekir. Elektroforez öncesinde dizi
analizi reaksiyonlarında kullanılan DNA’nın konsantrasyonu, sinyal yoğunluğunu ve
50
çözünürlüğünü etkilemektedir. Bunun için hedef DNA elektroforez ve işaretleme
yapılmadan önce PCR ile çoğaltılır100.
Bu çalışmada geleneksel yöntemlerle tanımlanamayan alfa globin zinciri
üzerindeki mutasyonların tanısı için DNA dizi analizi yöntemi kullanılmıştır. Genin
çoğaltılmasında kullanılan primer dizilerinin içeriği Tablo 3.4 ve 3.5’de ve bu
primerlerin gen üzerindeki çoğaltım yöreleri Şekil 3.1 ve 3.2’de verilmiştir.
Şekil 3.1. α1 globin geni primerlerinin çoğaltım yöreleri Tablo 3.4. α1 globin geni primer dizileri
*R: Reverse F: Forward
51
Şekil 3.2. α2 globin geni primerlerinin çoğaltım yöreleri Tablo 3.5. α2 globin geni primer dizileri
*R: Reverse F: Forward
3.3.10.1.1. Hedef DNA’nın Çoğaltılması
Ayıraçlar
Stok Çözeltiler
1. 10× PCR Tamponu
52
2. 25 mM MgCl2
3. 6 mM dNTP
4. Taq polimeraz
5. Primer
6. 5x GC Geliştirici
PCR Karışımı ( 28,45µl )
10x PCR Tamponu 2,5µl
5x GC Geliştirici 2,5µl
25mM MgCl2 1,5µl
6 mM dNTP 0,75µl
10pmol primer (Forward ) 1 µl
10pmol primer (Reverse) 1µl
Taq polimeraz (5 U/µl) 0,2µl
Saf su 16,5µl
DNA(0.5-1µg/ml) 2,5µl
PCR Programı
PCR programı 1ci döngü, 95°C’de 5 dk olacak şekilde başlatılmıştır. 35 döngü;
95°C’de 45 sn (denatürasyon), 60°C’de 1 dk (yapışma) ve 72°C’de 1 dk 30 sn (uzama)
olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Son döngü 72°C’de 5 dk olacak şekilde
tamamlanmıştır.
3.3.10.1.1.1. Agaroz Jel Elektroforezi
Ayıraçlar
%1,5’lik Agaroz Jel
Agaroz 1,5 g
100 mL 0,5 X TBE tamponu içinde mikrodalga fırında çözülerek hazırlanmıştır.
Yükleme Tamponu
Brom fenol mavisi %0,05
Gliserol %10
53
Ficoll %15
5 X TBE Tamponu pH 8,0
Tris baz 54,0 g
Borik asit 27,5 g
EDTA (0,5M pH 8,0) 20 mL
1 L saf suda çözülerek hazırlanmıştır.
Etidyum Bromür Çözeltisi
EtBr 5 μg/mL olacak şekilde saf suda çözülerek hazırlanmıştır.
Yöntem
Amplifiye olan üründen 20 μL alınarak 2 μL yükleme tamponu ile
karıştırıldıktan sonra %1,5’lik agaroz jele uygulanıp 150 voltta 30 dk yürütülerek verim
kontrol edilmiştir.
3.3.10.1.2. Çoğaltılmış DNA’nın İşaretlenmesi
Ayıraçlar
1. Big Dye® Tampon
2. Big Dye® İşaretleyici
3. PCR Ürünü
4. Primer
Amplifikasyon koşulları
Her bir örnek için;
Big Dye® Tampon 1µl
Big Dye® İşaretleyici 2µl
10pmol primer ( Forward) 2µl
PCR Ürünü 1µl
Saf su 4µl
PCR Programı
PCR programı 1ci döngü 95°C’de 5 dk olacak şekilde başlatılmıştır. 40 döngü;
98°C’de 45 sn (denatürasyon), 60°C’de 1 dk 30 sn (yapışma) ve 72°C’de 2 dk 15 sn
(uzama) olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Son döngü 72°C’de 5 dk olacak şekilde
tamamlanmıştır.
54
3.3.10.1.3. Pürifikasyon
Ayıraçlar
1g sephadex 15ml saf suda çözülmüştür.
Uygulama
1. Düz kolon altta kalacak biçimde üzerine filtreli kolon geçirilir.
2. Filtreli kolona 800µl sephadex pipetlenerek 20°C’de 4000rpm’de 6 dk santrifüj edilir.
3. Floresan ile işaretlenmiş PCR ürünleri sephadexin ortasına pipetlenerek 20°C’de
4000rpm’de 6 dk santrifüj edilir.
4. Sephadexi içeren filtreli kolon atılarak altta kalan işaretlenmiş PCR ürünü cihaza
yüklenir.
3.3.10.2. DNA Dizi Analizi Cihazına Örnek Yüklenmesi
Otomatize DNA Dizi Analizi
Prensip: DNA dizi analizinde birbirinden farklı iki yöntem uygulanmaktadır.
Maxam ve Gilbert’in kimyasal kırılma yöntemi ile Sanger ve Coulson’un zincir
sonlandırılması yöntemidir102.
Bu çalışmada Otomatize DNA dizi analizinde, Sanger ve Coulson’un zincir
sonlandırılması prensibine dayalı yöntem kullanılmıştır. Bu yöntemde, DNA polimeraz
enzimi dNTP’lerin yanında deoksiribozin 3' pozisyonunda OH grubu taşımayan
ddNTP’leri de substrat olarak kullanmaktadır. Sentezlenen DNA iplikçiğine dNTP
eklendiğinde uzama devam ederken, ddNTP’ler eklenince zincir uzaması durmaktadır.
Otomatize DNA dizi analizinde reaksiyonların başlangıcında floresans veren madde ile
işaretli primer veya nükleotidler kullanılarak baz dizilimi gözlenebilir hale
getirilmektedir103.
DNA dizi analizi cihazında anot ve katot kutuplar arasında uzanan bir kapiller,
sıcaklığı sabit tutacak bir ısıtıcı bölge ve anot uca yakın bir bölmede lazer ışık kaynağı
ile kamera bulunmaktadır. Ayrıca kapillerin içine polimer dolduran bir şırınga ile her iki
kutupta elektrik geçirgenliğini sağlayacak tampon hazneleri bulunmaktadır104(Şekil 3.3).
55
Şekil 3.3. Lazer destekli kapiller elektroforezin şematik görünümü Her bir örnek için yeniden polimerle doldurulan kapiller , örnek tüpüne
girdiğinde PCR ile çoğaltılmış ve denatüre edilmiş DNA fragmanlarını elektrokinetik
yöntemle kapiller içerisine alır. Bu aşamadan sonra sabit voltaj ve sabit sıcaklıkta anot
kutba doğru hareket eden DNA fragmanları, kapillerin silika ile kaplanmamış
bölgesinden geçerken lazer ışığını bağlayan bazların rengine göre değişik dalga
boylarında yansılar oluşur. Bu yansılar CCD kamera tarafından algılanır104. Adenin (A)
bazı yeşil, Sitozin (C) bazı mavi, Guanin (G) bazı siyah ve Timin (T) bazı kırmızı renk
verir103 (Şekil 3.4).
Tampon Tampon
56
Şekil 3.4. DNA bazlarının farklı dalga boylarında farklı renkler ile görüntülenmesi
Uygun bilgisayar yazılımı tarafından değerlendirilen bu veriler, ekranda
büyüklük ve yoğunluğu ifade eden pikler şeklinde belirir. Bu pikler bahsedilen yazılım
tarafından daha önce bu yazılıma tanıtılan floresan boyalı ve fragman büyüklüğü bilinen
standartlarla karşılaştırılarak değerlendirilir104.
3.3.10.2.1.Örneklerin Cihaza Yüklenmesi
1- Örnek hazırlandıktan sonra cihazda bulunan örnek tepsisine yerleştirilir.
2- Cihaz başlama komutunu aldıktan sonra kapiller ünitesinin sıcaklığını
elektroforez için uygun sıcaklık olan 60°C’ ye çıkarır.
3- İşaretlenmiş örneklerin tamamı örnek tablasına aplike edilir.
4- Uygun sıcaklık sağlandıktan sonra kapillerin platin çubuğa bağlı serbest ucu,
örnek yükleme ünitesinde bulunan distile su tabağına girer. Cihaz polimer blok
sonunda bulunan ve anoda açılan kapağı kapatır. Polimer şırıngası üzerinde
bulunan piston ile sıkıştırılır. Polimer, anot tarafı kapalı olduğu için hareket
edebileceği tek yön olan kapiller içinde yayılmaya başlar.
DALGA BOYU (nm)
Nor
mal
ize
Em
isyo
n Y
oğun
luğu
57
5- Kapiller, polimer (3130 POP 7TM Performance Optimize Polymer) ile
doldurulduktan sonra serbest kapiller ucu örnek tepsisi üzerinde hareket ederek
örnek içerisine girer.
6- Anot kapağı açılan cihaz üzerinde elektriksel alan yaratılır. Yaratılan elektriksel
alanda tüp içerisinde bulunan DNA parçaları kapiller boru içerisine doğru
harekete geçerler. DNA parçalarının kapillere taşınması için gerekli sürenin
dolması ile akım kesilir ve serbest kapiller ucu distile su içerisine döner.
7- Platin çubuk ile kapiller çevresine örnekten bulaşan kirlilikler temizlenir.
8- Kapiller serbest ucu temizleme sonrası tekrar hareket ederek tampon ( 1 X
EDTA’lı Tampon) içerisine girer. Burası kapiller serbest ucu için son noktadır.
9- Anot kapağı açıldıktan sonra cihaz üzerine tekrar akım tamponu ile polimer blok
arasında 15kV’a varan bir gerilim oluşur. DNA parçaları kapiller serbest
ucundan kapiller boyunca, polimer bloğa doğru harekete geçerler. Bu yürütme
sırasında lazer ünitesi içerisinden geçerler ve yaydıkları floresan ışık ile
saptanırlar. Elektroforez sonlandığında cihaz yeni deney için işlemleri tekrar
eder.
3.3.10.2.2. Verilerin Değerlendirilmesi
Elektroforetik görünümün, anlamlı DNA dizi verilerine dönüştürülmesi için
bilgisayar destekli algoritmalar ve dizi derlemesine gerek duyulur101. Elektroforetik
ünitelerde bulunan lazer ışık kaynağı ile monokromatik bir ışık oluşturulur. Söz konusu
DNA’ nın bulunduğu jelmatriks bu monokromatik ışık ile taranır. Elektroforez
süresince DNA’ ya bağlanan floresan boya ışık ile taranan bölgeye geldiğinde uyarılır.
Uyarılan boya kendi için karakteristik olan dalga boyunda ışığı geri yansıtır. Yansıyan
bu ışık demeti bir detektör tarafından kaydedilir. Kaydedilen veriler bilgisayar
programları ile değerlendirilerek sonuçlar grafiksel ya da matematiksel olarak bilgisayar
ekranına aktarılır. DNA dizi analizi cihazlarında 6 bazdan 1000 baza kadar güvenli
okuma yapılabilmektedir102. Otomatize dizi analizinde, heterozigot olguların
elektroforez pikleri üst üste gelmektedir101.
58
4. BULGULAR
Bu tez çalışmasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya
Anabilim Dalı’na rutin mutasyon analizi ve Doğum öncesi tanı için başvuruda bulunan
iki olgunun ve bu olguların 22 aile fertlerinden kan örnekleri alınmıştır. 24 olgunun
hematolojik özellikleri ve alfa talasemi mutasyon tipleri moleküler düzeyde çalışılmıştır.
Kan örneklerinin hematolojik verileri Coulter Counter T-890 kan sayım cihazında
ölçülmüştür. Örneklerin hemoglobin tiplendirilmesi elektroforez ve HPLC sistemiyle,
HbA2 düzeyi mikrokolon sistemiyle, HbF düzeyi alkali denatürasyon sistemiyle
çalışılmıştır. Bütün olguların lökosit DNA’sı Magna Pure LC Otomatik İzolasyon
Cihazı ile izole edildikten sonra beta talasemi mutasyon tipi ARMS yöntemiyle ve alfa
talasemi mutasyon tipi Gap-PCR yöntemiyle çalışılmıştır. Bu yöntemlerle mutasyon
tipleri belirlenemeyen olgular DNA Dizi Analizi ile çalışılmıştır. Çalışma kapsamına
alınan 24 olgunun hematolojik verileri ve hemoglobin tipleri Tablo 4.1’de verilmiştir.
Tablo 4.1. Olguların hematolojik verileri ve hemoglobin tipleri Olgu C. Yaş WBC
109/L
RBC
1012/L
Hb
g/dl
Hct
%
MCV
fl
MCH
pg
MCHC
g/dl
Hb
Elek.
Hb A2
%
Hb F
%
Y Y E 33 10,0 6,32 14,5 48,3 76,5 23,0 30,1 AA 2,4 0,4
AY K 30 7,0 5,42 13,2 42,8 78,9 24,4 30,9 AA 1,8 0,8
AY K 9 15,5 4,50 10,5 34,4 76,6 23,4 30,6 AA 1,5 0,7
NBY K 4 17,3 6,23 11,2 37,2 59,7 18,0 30,1 AA 1,3 0,5
HT E 44 6,3 6,01 14,5 47,4 78,8 24,1 30,6 AA 2,3 0,8
BT K 41 7,8 4,85 13,7 43,1 88,7 28,1 31,7 AA 1,7 1,0
AT K 21 12,0 4,85 12,5 42,2 86,9 25,8 29,7 AA 1,7 0,9
TT K 17 7,6 4,71 11,0 36,5 77,5 23,3 30,0 AA 2,2 0,8
DT K 15 4,6 4,82 11,2 36,7 76,2 23,2 30,5 AA 1,3 0,7
MT E 10 9,0 5,04 11,5 37,5 74,4 22,8 30,6 AA 2,7 1,0
ZY K 30 9,6 4,72 13,3 42,5 89,9 28,2 31,4 AA 2,6 0,6
H N Y K 9 8,8 4,20 11,4 36,0 85,8 27,3 31,8 AA 3,1 0,7
HY E 4 11,8 4,99 9,6 32,0 64,2 19,2 29,8 AA 2,4 0,9
ŞY E 63 11,0 4,69 12,9 42,6 90,8 27,6 30,4 A? 1,8 0,9
59
HY K 54 8,0 5,23 11,8 40,7 77,9 22,5 28,9 AA 1,9 1,2
ŞB K 35 12,6 4,50 11,8 36,5 81,2 26,3 32,3 A? 2,7 0,9
HB E 32 8,0 6,77 13,6 45,0 66,4 20,1 30,3 AA 4,5 2,5
İK K 37 6,0 4,20 9,7 32,9 78,4 23,0 29,4 AA 1,8 0,9
ÖFK E 16 10,5 5,50 13,9 46,4 84,3 25,4 30,1 AA 2,3 0,8
ÇK E 8 11,3 4,18 10,2 33,1 79,3 24,4 30,8 AA 2,5 1,1
CY E 25 14,0 9,58 14,0 46,7 83,7 25,1 30,0 AA 1,8 1,1
HK K 47 8,0 5,17 15,1 48,3 93,3 29,1 31,3 AA 1,9 1,0
ŞS K 40 12,8 4,97 12,3 40,5 81,4 24,7 30,3 AA 1,9 1,1
ÇS K 16 11,8 4,58 12,5 41,5 90,5 27,2 30,1 AA 2,2 0,7
Rutin mutasyon analizi için başvuruda bulunan NBY (4y) olgusunun ve
ailesinden 12 olgunun DNA örneklerinde alfa talasemi mutasyon tiplendirilmesi
yapılmıştır. Ailenin soyağacı Şekil 4.1’de, olguların hematolojik verileri ve mutasyon
tipleri Tablo 4.2’de verilmiştir.
NBY (4 y)’nin kendisinde, α2-geninin IVS-1 bölgesinde 134.-138. nükleotidleri
arasında 5 nükleotidlik bir parçanın delesyona uğramış olduğu ve bu delesyonu
homozigot olarak taşıdığı DNA Dizi Analiziyle belirlenmiştir ( Şekil 4.2 ve Tablo 4.2 ).
Annesinin (AY), babasının (YY) ve kardeşinin (AY) 5 nükleotidlik delesyonu
heterozigot olarak taşıdıkları belirlenmiştir ( Şekil 4.3-4.5). Anne ve babanın 4.
kuşaktan kardeş çocukları olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.1).
Yine 4. kuşaktan kardeş çocukları olan HT ve BT’nin evli oldukları ve bunların
dört çocuklarının da ( AT, TT, DT ve MT) alfa talasemi mutasyonu içermedikleri
saptanmıştır (Şekil 4.1 ve Tablo 4.2).
3. kuşaktan akraba olan ZY’de (30y) ve dokuz yaşındaki kızı HNY’da (9y)
mutasyon bulunamazken, dört yaşındaki oğlu HY’de (4y) Gap-PCR yöntemiyle 20.5
kb’lık delesyon saptanmıştır (Şekil 4.6).
60
Şekil 4.1. NBY (4y) olgusunun (Y ailesinin) soy ağacı
20,5 kb delesyon içeren olgu
Heterozigot 5nt’lik olgular
Homozigot 5nt’lik olgu
Normal olgular
Kan örnekleri alınamayan olgular Tablo 4.2. Y ailesinin hematolojik verileri ve mutasyon tipleri
Olgu C/Y WBC 109/L
RBC 10
12 /L
Hb g/dl
Hct %
MCV fl
MCH pg
MCHC g/dl
Hb Elk.
HbA2
% HbF %
Mutasyon Tipi
Z Y K/30 9,6 4,72 13,3 42,5 89,9 28,2 31,4 AA 2,6 0,6 αα/αα
HNY K/9 8,8 4,20 11,4 36,0 85,8 27,3 31,8 AA 3,1 0,7 αα/αα
HY E/4 11,8 4,99 9,6 32,0 64,2 19,2 29,8 AA 2,4 0,9 --20.5/αα*
YY E /33 10,0 6,32 14,5 48,3 76,5 23,0 30,1 AA 2,4 0,4 -5nt
α/αα **
AY K /30 7,0 5,42 13,2 42,8 78,9 24,4 30,9 AA 1,8 0,8 -5nt
α/αα**
I.Kuşak
II.Kuşak
III.Kuşak
IV.Kuşak
V.Kuşak
61
* Gap-PCR yöntemi ** DNA Dizi Analizi yöntemi
Şekil 4.2. Homozigot 5 nt’lik delesyon gözlenen NBY (4y) olgusunun DNA Dizi Analizi görüntüsü
AY K /9 15,5 4,50 10,5 34,4 76,6 23,4 30,6 AA 1,5 0,7 -5nt
α/αα**
NBY K /4 17,3 6,23 11,2 37,2 59,7 18,0 30,1 AA 1,3 0,5 -5nt
α/-5nt
α**
HT E/44 6,3 6,01 14,5 47,4 78,8 24,1 30,6 AA 2,3 0,8 αα/αα
BT K/41 7,8 4,85 13,7 43,1 88,7 28,1 31,7 AA 1,7 1,0 αα/αα
AT K/21 12,0 4,85 12,5 42,2 86,9 25,8 29,7 AA 1,7 0,9 αα/αα
TT K/17 7,6 4,71 11,0 36,5 77,5 23,3 30,0 AA 2,2 0,8 αα/αα
DT K/15 4,6 4,82 11,2 36,7 76,2 23,2 30,5 AA 1,3 0,7 αα/αα
MT E/10 9,0 5,04 11,5 37,5 74,4 22,8 30,6 AA 2,7 1,0 αα/αα
α2 globin zinciri TGAGGC 5nt delesyon
62
Şekil 4.3. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen AY (30y) olgusunun DNA Dizi Analizi görüntüsü
Şekil 4.4. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen YY (33y) olgusunun DNA Dizi Analizi görüntüsü
Şekil 4.5. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen AY (9y) olgusunun DNA Dizi Analizi görüntüsü
α2 globin zinciri TGAGGC 5nt delesyon
α2 globin zinciri TGAGGC 5nt delesyon
α2 globin zinciri TGAGGC 5nt delesyon
63
Şekil 4.6. Gap- PCR yöntemi ile 20.5 kb’lık alfa talasemi mutasyonu gözlenen HY (4y) olgusunun agaroz
jel elektroforez görüntüsü 1)HY (4 y) 2) 3.7 KONTROL 3) 20.5 KONTROL 4) MED I KONTROL 5) NORMAL KONTROL
Doğum öncesi tanı için başvuruda bulunan ŞB’nin (35y) kendisinden ve
ailesinden toplam 11 kan örneği alınarak alfa talasemi mutasyon tipleri çalışılmıştır.
Ailenin soyağacı Şekil 4.7’de ve hematolojik verileri ile mutasyon tipleri Tablo 4.3’de
verilmiştir. ŞB’nin (35y) ve babasının (ŞY) (63y) selüloz asetat kağıdı elektroforeziyle
hemoglobin tiplendirilmesi yapıldığında Hb S bandı gözlenmiştir (Şekil 4.8). Ancak
oraklaşma testi negatif çıktığından HPLC ile hemoglobin tiplendirilmesi yapılmıştır.
ŞB’nin HPLC ile Hb D oranı % 26 ve ŞY’nin %23 olduğu saptanmıştır (Şekil 4.9, 4.10).
Bu olguların hemoglobin tipleri moleküler düzeyde incelendiğinde Hb D olmadıkları
saptanmıştır. Bunun üzerine alfa genleri DNA Dizi Analizi ile çalışılmıştır. ŞB ve
ŞY’nin α2-globin geninde 78. kodonda AACàAAA değişimi sonucunda Asnà Lys
amino asitine dönüştüğü ve bu hemoglobinin Hb Stanleyville II (Hb St II) olduğu
belirlenmiştir (Şekil 4.11, 4.12 ).
1
2 3 4 5 ─
+
64
Şekil 4.7. ŞB (35y) olgusunun (B ailesinin) soy ağacı
3,7 kb delesyonunu taşıyan olgular Hb Stanleyville II mutasyonunu taşıyan olgular
Hb Stanleyville II mutasyonu ve 3,7 kb delesyonun ikisini birlikte taşıyan olgu IVS-I-110 mutasyonunu taşıyan olgu Normal olgular Kan örnekleri alınamayan olgular
I.Kuşak
II.Kuşak
III.Kuşak
IV.Kuşak
65
Tablo 4.3. B ailesinin hematolojik verileri ve mutasyon tipleri Olgu C/Y WBC
109/L
RBC
1012/L
Hb
g/dl
Hct
%
MCV
Fl
MCH
pg
MCHC
g/dl
Hb
Elk.
HbA2
%
HbF
%
Mutasyon
Tipi
HK K/47 8,0 5,17 15,1 48,3 93,3 29,1 31,3 AA 1,9 1,0 αα/αα
ŞS K/40 12,8 4,97 12,3 40,5 81,4 24,7 30,3 AA 1,9 1,1 -3.7α/αα*
ÇS K/16 11,8 4,58 12,5 41,5 90,5 27,2 30,1 AA 2,2 0,7 αα/αα
ŞY E/63 11,0 4,69 12,9 42,6 90,8 27,6 30,4 A? 1,8 0,9 -Hb St II
α/αα**
HY K/54 8,0 5,23 11,8 40,7 77,9 22,5 28,9 AA 1,9 1,2 -3.7α/αα*
İK K/37 6,0 4,20 9,7 32,9 78,4 23,0 29,4 AA 1,8 0,9 -3.7α/αα*
ÖFK E/16 10,5 5,50 13,9 46,4 84,3 25,4 30,1 AA 2,3 0,8 αα/αα
ÇK E/8 11,3 4,18 10,2 33,1 79,3 24,4 30,8 AA 2,5 1,1 -3.7α/αα*
ŞB K/35 12,6 4,50 11,8 36,5 81,2 26,3 32,3 A? 2,7 0,9 -3.7α/
-Hb St II
α(*)(**)
HB E/32 8,0 6,77 13,6 45,0 66,4 20,1 30,3 AA 4,5 2,5 A/IVS-
I-110***
CY E/25 14,0 9,58 14,0 46,7 83,7 25,1 30,0 AA 1,8 1,1 -3.7α/αα*
* Gap-PCR yöntemi ** DNA Dizi Analizi yöntemi ***ARMS yöntemi
Şekil 4.8. ŞB (35y) ve ŞY (63y) olgularının selüloz asetat kağıt elektroforez görüntüsü
ŞB ŞY ─
+
66
Şekil 4.9. ŞB (35y) olgusunun HPLC verileri
67
Şekil 4.10. ŞY (63y) olgusunun HPLC verileri
68
Şekil 4.11. Hb Stanleyville II (Hb St II) mutasyonu gözlenen ŞB (35 y) olgusunun DNA Dizi Analizi görüntüsü
Şekil 4.12. Hb Stanleyville II (Hb St II) mutasyonu gözlenen ŞY (63 y) olgusunun DNA Dizi Analizi görüntüsü
Olgulardan ŞB’nin Hb Stanleyville II ile birlikte 3,7 kb’lık delesyonu da taşıdığı
saptanmıştır (Şekil 4.11, 4.13 ve Tablo 4.3). ŞB’nin kocasının ( HB) Hb A2 düzeyi (%
4,5) yüksek olduğu için beta talasemi mutasyon tipi çalışılmış ve ARMS yöntemi ile
IVS-I-110 (GàA) mutasyonu taşıdığı bulunmuştur (Şekil 4.7 , 4.14 ve Tablo 4.3).
ŞB’nin babasının (ŞY) hemoglobin tipi kendisi gibi Hb Stanleyville II olduğu (Şekil
4.12), annesinin (HY) ve iki kardeşinin ise (CY ve İK) 3,7 kb’lık delesyon içerdiği
saptanmıştır (Şekil 4.7, 4.13 ve Tablo 4.3). Kardeşi İK’nın çocuklarından birisi (ÇK)
α2 globin zinciri 78. kodon CàA (AsnàLys) Hb Stanleyville II (Hb St II)
α2 globin zinciri 78. kodon CàA (AsnàLys) Hb Stanleyville II (Hb St II)
69
aynı annesi gibi 3,7 kb’lık delesyon içerdiği, diğer çocuğun (ÖFK) bu mutasyonu
içermediği belirlenmiştir (Şekil 4.7, 4.13 ve Tablo 4.3). ŞB’nin teyzesi ŞS’nin 3,7 kb’lık
delesyon içerdiği fakat çocuğu ÇS’nin ve diğer teyzesi HK’nin alfa talasemi mutasyonu
içermediği saptanmıştır (Şekil 4.7, 4.13 ve Tablo 4.3).
Şekil 4.13. Gap- PCR yöntemi ile 3,7kb’lık alfa talasemi mutasyonu gözlenen olguların agaroz jel
elektroforez görüntüsü 1) ŞS (K/40y)
2) HY (K/54y)
3) İK (K/37y)
4) ÇK (E/8y)
5) ŞB (K/35y)
6) CY (E/25y)
7) 3.7 KONTROL
8) 20.5 KONTROL
9) MED I KONTROL
10) NORMAL KONTROL
4 2 3 5 1 6 7 8 9 10 ─
+
70
Şekil 4.14. ARMS yöntemi ile β IVS-I-110 mutasyonunun agaroz jel elektroforez görüntüsü
1) HB (32y)
2) Negatif Kontrol
3) Pozitif Kontrol
1 - Kont. +Kont. ─
─
+
+
Mutant
Norm
al
71
5. TARTIŞMA
Moleküler düzeyde yapılan çalışmalardan ilki olan hemoglobinopatiler, dünyada
en yaygın olarak gözlenen genetik hastalık grubudur. Hemoglobinopati taşıyıcı sıklığı
Dünya Sağlık Örgütü tarafından %5.1 olarak bildirilmiş ve her yıl yaklaşık olarak
365.000 hasta çocuk dünyaya gelmektedir. Hastalık yoğun olarak Afrika, Asya ve
Akdeniz ülkelerinde görülmesinin yanı sıra göçlerle birlikte Avrupa, Amerika ve
Avustralya toplumuna da yayılmış ve Türkiye’nin özellikle güney ve batı bölgesinde
sıklıkla görülmektedir5.
Hemoglobinopatilerde globin zincirlerindeki yapısal değişimler ve sentez
yetersizliği işlevsel değişikliğe neden olduğu için hastalık olarak karşılaşılmaktadır. Bu
değişimler anormal hemoglobin ve talasemi olarak iki ana sınıfta incelenir105.
Hemoglobinopatilerden özellikle Hb S, α-talasemi ve β-talaseminin sıklıklıkla
görülmesinin nedenlerinden birisi de Afrika, Asya ve Akdeniz ülkelerinde görülen
sıtmaya karşı koruyucu olmalarıdır106. Bu bölgelerde hemoglobinopatilerin varlığıyla
sıtmadan kaynaklı ölümlerin azaldığı görülmüştür81. Bir genetik varyant, enfeksiyon
hastalıklarına karşı koruma sağlıyorsa enfeksiyon hızını bozacak ve epidemiyi
kıracaktır15. Sıtmanın yaygın olduğu bölgelerde klasik bir örnek olan Hb S’in
frekansının yüksek olması bu hipotezi desteklemektedir. Sıtmanın yaygın olduğu
bölgelerde α-talaseminin de arttığı bilinmektedir105. Hb S ve α-talaseminin sıtmaya
karşı bir koruyucu olduğunun bilinmesine rağmen bu konunun mekanizması hakkındaki
bilgiler yetersizdir. Hb S’li örnekler için durum biraz daha aydınlatıcıdır. Eritrositleri
enfekte eden P. Falciparum parazitleri oraklaşan hücrelerde uygun yaşam koşullarını
sağlayamaz. Ancak α-talaseminin nasıl bir mekanizma ile sıtmaya karşı korumada görev
aldığına dair yeterli bilgi bulunmamaktadır81.
Subtropik iklim kuşağında bulunan ülkemizde α-talasemi taşıyıcılığı %2 iken;
Çukurova bölgesinde bu oran %3,3’dür107. α-talasemilerin tanısını koymak zordur,
çünkü hematolojik veriler normal bireyden farklı olmayabilir15. α-talasemi
çalışmalarında örnek seçimi öncelikle demir eksikliği anemisi ekarte edilmiş olguların
Hb, MCV ve Hb A2 düzeyleri değerlendirerek yapılır. Alfa talasemi mutasyonları
sıklıkla delesyonel mutasyonlardan kaynaklıdır. Daha az olarak delesyonel olmayan
mutasyonlar sonucunda görülür. Nondelesyonel mutasyonların sıklığı delesyonel
72
mutasyonların sıklığının üçte biri kadardır5. Türkiye’de delesyonel mutasyonlardan en
sık görüleni 3,7 kb iken bunu takiben 4,2 kb, 20,5 kb, MED I (17,4 kb) ve MED II (26,5
kb) mutasyonları görülmektedir65.
Öner ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada yirmibeş Hb H hastasında, on farklı
genotip saptanmış ve en sık görülen α-talasemi mutasyon tipinin 3,7 kb delesyon
olduğu bildirilmiştir79.
Canatan ve arkadaşları Antalya’da Hb H hastalarının moleküler temelinde α3,7,
α4,2, MED-I ve α20,5 mutasyon tiplerinin olduğunu göstermişler ve Antalya’da α talasemi
taşıyıcı sıklığının düşük olduğunu bildirmişlerdir108.
Kılınç ve arkadaşları Adana bölgesinde yeni doğan bebeklerde kordon kanı
çalışması ile α-talasemi taşıyıcı sıklığını % 3,3 olarak bildirmişlerdir88.
Yüreğir ve arkadaşları, Adana’nın Karataş bölgesinde α3,7 mutasyonlu ve α-gen
triplikasyonlu olgular olduğunu bildirmişlerdir66. Yüreğir ve arkadaşları α-talasemi-1 ve
α-talasemi-2 mutasyonunun yanında α-2-globin geninin poliadenilasyon kuyruğunda
nokta mutasyonu (AATAAA→AATGAA) olduğunu göstermişlerdir78.
Çürük ve arkadaşları iki Türk hastada unstabil α globin varyantı olan Hb Adana
ile kombine alfa talasemi-1 olgularının varlığını göstermişlerdir37. Çürük ve arkadaşları
Çukurova’da beş değişik α gen delesyonu ve dört nondelesyonel mutasyon tipi
tanımlamışlardır109.
Polat uzmanlık tezinde, Mersin yöresinde yaptığı çalışmada sekiz olguda α3,7 ve
bir olguda α20,5 delesyon tipinin varlığını göstermiştir15.
Yalın doktora tez çalışmasında, α talasemiye neden olan mutasyon tiplerinden
α3,7’nin % 45, MED I’in % 28,3, α20,5’nin % 1,7 sıklıkta gözlendiğini ve α4,2
mutasyonuna rastlamadığını bildirmiştir26.
Çürük ve arkadaşları Çukurova’da HbH hastalığı olan, otuziki olgunun altısında
– – MED I(–17,4)/−α3,7, iki olguda – –MED II(–26,5)/α5 nt α, bir olguda – –MED I(–17,4)/−α3,7
+ Hb AS, bir olguda – – MED I(–17,4)/α5 nt α , dokuz olguda – –20,5/−α3,7 , bir olguda – – MED I(–17,4)/αPA1α , bir olguda – –20,5/−α4,2 , iki olguda – –20,5/ααcodon59, üç olguda – – MED II(–26,5)/−α 3,7 , dört olguda – – MED II(–26,5)/α PA 2α , bir olguda α PA 1α/α PA 1α ve
bir olguda – – MED II(–26,5)/α PA 2α + Hb AS varlığını göstermişlerdir9.
Talasemilerin tanısında izlenecek en iyi yol öncelikle hematolojik verilerin
analizidir. Talasemi taşıyıcı tanısında kan sayımı, HbA2 ve HbF düzeyleri
73
kullanılmaktadır. HbA2 oranı mikrokolon sistemiyle, HbF oranı da alkali denatürasyon
sistemiyle yapılmaktadır. MCV ve MCH değerleri sırasıyla 80 fl ve 27 pg altındaki
değerlere sahip olan olgularda talasemi düşünülerek moleküler analizler yapılmaktadır.
HbA2 düzeyi % 3,7 ve/veya HbF düzeyi % 2,0’nin üzerindeki olgular β talasemi
yönünden; HbA2 düzeyi % 3’ün altındaki olgular ise α talasemi yönünden,
araştırılmaktadır50.
Bu çalışmada hematolojik bulguların sınırları oldukça geniş olup; Hb 9,6-15,1
g/dl; Hct % 32,0-48,3; MCV 59,7-93,3 fl; MCH 18,0-29,1 pg; MCHC 28,9-32,3 g/dl;
Hb A2 % 1,3-4,5 ve Hb F % 0,4-2,5 arasında bulunmuştur (Tablo 4.1). Olguların alfa
talasemi mutasyon tiplendirilmesi için moleküler yöntemler kullanılmıştır. Y ailesinin
Coulter Counter T-890 ile kan sayımı yapılmış ve hemoglobin elektroforezi sonucunda
onüç olgunun Hemoglobin tipinin AA olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.1 ve Tablo 4.2).
Mikrokolon kromatografisi yöntemiyle HbA2 düzeyleri % 1,3-3,1 arasında; alkali
denatürasyon yöntemiyle HbF değerleri % 0,4-1,0 arasında bulunmuştur (Tablo 4.2).
Ailenin Gap- PCR ile mutasyon taraması yapıldığında HY (4y) olgusunun 20,5 kb’lık (-
-20,5/αα) delesyonel mutasyon taşıdığı görülmüştür (Şekil 4.6). Bu olgunun 20,5 kb’lık
α-talasemi mutasyonu hemoglobin “trait”i meydana getirmekte ve bu olgunun
hematolojik verilerinden anemik olduğu görülmektedir (Tablo 4.2). Y ailesinde Gap-
PCR yöntemiyle alfa talasemi mutasyonu belirlenemeyen; ancak hematolojik verileri
düşük olan YY (33y), AY (30y), AY (9y) ve NBY (4y) olgularının DNA Dizi
Analizleri yapılmıştır (Şekil 4.2-4.5, Tablo 4.2). DNA Dizi Analizi sonucunda NBY
(4y) olgusunun α2-geninin IVS-1 bölgesinde 134.-138. nükleotidleri arasında 5
nükleotidlik bir parçanın delesyona uğramış olduğu ve bu delesyonu homozigot olarak
taşıdığı, YY (33y), AY (30y) ve AY (9y) olgularının aynı mutasyonu heterozigot olarak
taşıdıkları belirlenmiştir. 5 nükleotidlik delesyonel mutasyonlar RNA ‘splicing’
mekanizmasını etkileyen mutasyonlar olduklarından bu talasemilerin heterozigotları α-
talaseminin “trait” fenotipine, homozigotları ise α talasemilerin daha ciddi formlarına
neden olurlar. Heterozigot olguların hematolojik verilerinin normale yakın oldukları
gözlenmiştir. Heterozigot olgularda frameshift ( çerçeve kayması) meydana gelirken;
homozigot olgularda frameshift meydana gelmez. Y ailesininden ZY (30y); HNY (9y);
HT (44y); BT (41y); AT (21y); TT (17y); DT (15y) ve MT (10y) olgularının alfa
talasemi mutasyonu taşımadıkları gözlenmiştir (Şekil 4.1 ve Tablo 4.2).
74
B ailesinden onbir olgunun kan sayımı yapılmış, mikrokolon kromatografisi
yöntemiyle HbA2 düzeyleri % 1,8-4,5 arasında; alkali denatürasyon yöntemiyle HbF
düzeyleri % 0,7-2,5 arasında bulunmuştur (Şekil 4.7 ve Tablo 4.3). Ailenin Gap- PCR
ile alfa talasemi mutasyon taramasında ŞS (40y); HY (54y); İK (37y); ÇK (8y); ŞB
(35y) ve CY (25y) olgularının 3,7kb alfa talasemi mutasyonunu heterozigot olarak
taşıdıkları görülmüştür (Şekil 4.13). 3,7 kb’lık delesyon sessiz alfa talasemi
taşıyıcılığına neden olmaktadır. Tüm dünyada en sık karşılaşılan alfa talasemi mutasyon
tipi olan 3,7 kb delesyona sahip olan kişiler sağlıklı olup kan sayım sonuçları ile taşıyıcı
olduklarını belirlemek genellikle zordur. Bu delesyonel alfa talasemiyi tek başına taşıyan
olguların hematolojik verileri normale yakındır. B ailesinden HK (47y), ÇS (16y) ÖFK
(16y) ve HB (32y) olgularının alfa talasemi mutasyonlarını taşımadıkları gözlenmiştir
(Şekil 4.7 ve Tablo 4.3).
Ülkemizde sık olarak görülen β-talasemi taşıyıcı oranı %2,1’dir. Çukurova
bölgesinde ise bu oran % 3,7’dir. Türkiye’de en sıklıkla rastlanan β-talasemi mutasyon
tipi IVS-I-110’dur54,60. Atalay ve arkadaşlarının Türkiye’nin dört bölgesinden
yüzotuzdokuz olguda yaptıkları çalışmada IVS-I-110 (GàA) mutasyon oranını %35,9;
IVS-I-6 (TàC) mutasyonu %21,6; IVS-I-1 (GàA) mutasyonu %13,0 ve anlamsız
(nonsense) kodon 39 (CàT) mutasyonu %7,2 olarak rapor etmişlerdir110.
Yüreğir ve arkadaşları tarafından yapılan tarama çalışmasında Çukurova’nın üç
ilinde (Hatay, Adana, İçel) beta talasemi taşıyıcı sıklığı sırasıyla % 5,7, % 1,8 ve % 3,3
olarak bulunmuş ve mutasyon tiplerinin sıklıkları; IVS I-110 (% 54,6), IVS I-1 (% 9,4),
Cd39 (% 8,7), IVS I-6 (% 4,7), Cd8 (% 3,5), IVS II-1 (% 2,7), -30 (% 2,4), IVS II-745
(% 1,9), Cd76 (% 0,8) ve Cd36/37 (% 0,4) olarak verilmiştir60,111.
Yüreğir ve arkadaşları Türkiye’nin güney bölgesinde beta talasemi taşıyıcı
sıklığını ve mutasyon tiplerini çalışmışlar, HbA2 ’si yüksek beta talasemi sıklığını % 3,9
olarak saptamışlar ve en yüksek oranda IVS I–110 mutasyon tipinin görüldüğünü rapor
etmişlerdir112.
Arpacı ve arkadaşlarının çalışmasında; HbF değeri yüksek hemoglobin tipi HbAA
ve beta talasemi mutasyon tipi IVS I-110 olan iki olgu, HbAS ve IVS I-110 olan iki
olgu, HbSF ve IVS I-110 olan bir olgu bildirilmiştir113.
Çürük ve arkadaşları Çukurova’daki β talaseminin genetik heterojenitesini
vurgulamışlar ve bu çalışmada mutasyon tiplerinin oranlarını IVS I–110 (G→A) % 57,3,
75
IVS I–1 (G→A) % 8,3, Cd 39 (C→T) % 6,4, IVS I–6 (T→C) % 5,7, Fsc 8 % 5,5 olarak
bildirmişler, ayrıca bu çalışmada Çukurova’da ilk defa gözlenen Cd 15 ve Fsc 82/83(-
G) mutasyon varlığını göstermişlerdir60.
Arıyürek doktora tez çalışmasında, Konya bölgesinde hemoglobinopati tarama
çalışması yapmış ve bu çalışmada IVS I-110/ IVS I-110 homozigot, IVS II-745/ IVS I-
110 heterozigot ve D/ IVS I-110 çifte heterozigot olguların varlığını göstermiştir. β
talasemi taşıyıcılığı belirlenen olguların mutasyon tiplerinin %74’nün IVS I-110, %
9’nun Cd 8, % 5’nin Cd 39, % 4’nün Cd 5, % 4’nün IVS I-1, % 2’nin IVS II-745, %
1’nin Cd 44 ve -87 olduğunu bildirmiştir6.
Tahiroğlu uzmanlık tez çalışmasında, Hatay’ın Samandağ İlçesindeki üç lisede
hemoglobinopati tarama çalışması yapmış ve mutasyon tiplerinin IVS I-110 ile Cd 39
olduğunu göstermiştir50.
B ailesinden, HB (32y) olgusunun hematolojik verilerinden Hb 13,6 g/dl, MCV
66,4 fl, MCH 20,1 pg, Hb A2 % 4,5 ve Hb F’nin %2,5 olduğu görülmüştür (Şekil 4.7 ve
Tablo 4.3). Hematolojik verilerinden Hb A2 düzeyinin %3,7’den yüksek olması olguyu
β talasemi yönünden incelemeye yönlendirmiştir. Olgunun ARMS yöntemi ile
taramasında dünyada ve ülkemizde en yaygın görülen β talasemi IVS-I-110 (GàA)
mutasyonunu taşıdığı gözlenmiştir (Şekil 4.14). Bu mutasyonun özelliği β globin
zincirinde yeni RNA ‘splicing’ bölgesini oluşturmasıdır. 110. Pozisyondaki GàA
değişikliği β+ talasemi fenotipine neden olmaktadır. HB (32y) olgusunun hematolojik
verilerinden görüldüğü gibi Hb F hafif yüksek bulunmuştur (Tablo 4.3).
Hemoglobin varyantları, polipeptid zincirlerindeki amino asitleri kodlayan
genlerdeki baz değişiminden kaynaklanmaktadır. Bu genlerin ekzon bölgesindeki veya
bu bölge dışındaki nokta mutasyonları, insersiyonlar ve delesyonlar çeşitli anormal
hemoglobinlerin oluşumuna yol açmaktadır. Mutasyonların büyük bir kısmını nokta
mutasyonları oluşturmaktadır. Bu mutasyonlar polipeptid zincirinde aminoasit
değişimine neden olabilirler5.
Dünyada bilinen hemoglobin varyant sayısı 1037’dir4. Türkiye’de ve dünyada en
yaygın olarak gözlemlenen anormal hemoglobinler ise Hb S, Hb D, Hb E ve Hb C’dir.
Bu güne kadar Türkiye genelinde onyedi tanesi α globin zincirinden kaynaklı anormal
hemoglobin belirlenmiştir33,34.
76
Altay çalışmasında, dokuzu kararlı, dördü kararsız ve biri uzamış toplam ondört
α globin zincir anomalisi, ondokuzu kararlı, ikisi kararsız, üçü talasemik, biri
delesyon/insersiyon toplam yirmibeş tip β globin zincir anomalisi, birisi γ globin zinciri
mutasyonuyla oluşan ve ikisi de hibrit hemoglobin olmak üzere toplam kırkiki tip
anormal hemoglobin rapor etmiştir. Akar ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada ise
bunlara ek olarak 2002 yılından sonra Türkiye’de iki α, dört β ve bir δ globin zinciri
mutasyonu sonucu oluşan anormal hemoglobin tipleri bildirilmiştir. Bu anormal
hemoglobinlerden bazıları ilk defa Türk populasyonunda tanımlanmıştır33,34.
Çürük ve arkadaşları ilk kez Hb Adana [α 59 (E8) GlyàAsp (GGC->GAC)]
olarak isimlendirilen unstabil α globin zincir varyantını bulmuşlardır. Bu mutasyonun (α
59 GlnàAsp) α0 talasemi ile birlikteliği saptanmış ve bu hastada Hb Barts’ın , Hb A’
dan sonra ikinci major hemoglobin olarak bulunduğu gösterilmiştir37.
Hb Adana dışında unstabil α globin zinciri varyantı olan Hb Moabit de [α 86
(F7) LeuàArg (CTGàCGG)] Türk toplumunda gözlenmiştir. Hb Moabit, İsviçre’de
yaşayan bir Türk ailesinde rapor edilmiş unstabil hemoglobindir34.
Hb O Padova [α 30 (B11) GluàLys (GAGàAAG)] yetişkin bireylerde total
Hb’nin %18’ini içermekte olup ülkemizde de gözlenmiştir34.
Hb M Iwate [α 87 (F8) HisàArg (CACàTAC)] mutasyonu, Bursa’da yaşayan
bir ailede gözlenmiştir. Bu mutasyonun heterozigot formunda methemoglobin
yükselmesi dışında herhangi bir anomali bulunmazken, homozigot formunun yaşamla
bağdaşmadığı bildirilmiştir34.
Bu çalışmada B ailesinin Hemoglobin tiplendirilmesinde, iki olguda ŞB (35y)
ve ŞY (63y) de Hb S bandı gözlenmiştir (Şekil 4.8 ve Tablo 4.3). Ancak yapılan
oraklaşma testinde bu bantın Hb S olmadığı görülmüştür. HPLC sistemi ile yapılan
incelemede ŞB (35y) olgusunda Hb D oranı %26 ve ŞY(63y) olgusunda %23 olarak
bulunmuştur (Şekil 4.9, 4.10). Moleküler inceleme sonucunda Hb D olmadığı
gözlenmiş ve DNA Dizi Analizi yapılmıştır. Olguların α2-globin geninde 78. kodonda
AACàAAA nükleotit değişimiyle Asnà Lys amino asitine dönüştüğü ve bu
mutasyonun Hb Stanleyville II (Hb St II) olduğu görülmüştür (Şekil 4.11, 4.12 ve Tablo
4.3).
Hb Stanleyville II mutasyonu ilk kez Sudan’lı iki ailede Dherte ve arkadaşları
tarafından bulunmuştur114.
77
Ros ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada Hb Stanleyville, selüloz asetat kağıdı
elektroforezlerinde Hb S’nin olduğu bölgede, pH 6’da Hb D Punjab’ın olduğu bölgede
ve kolon kromatografisinde Hb S ve D bölgelerinden daha alt bölgelerde bant verdikleri
gözlenmiştir. Hb Stanleyville II mutasyon tipinin, α2-globin geninde 78. kodonda
AsparaginàLizin amino asidinin değişimi ile oluştuğu ve bu mutasyonun E ve F
sarmallarının arasında meydana geldiği bilinmektedir. Bu mutasyonun hem plakları ya
da hemoglobin polipeptid zincirleriyle etkileşime girmediği ve bu yüzden tek başına bu
mutasyonun bir patolojisinin bulunmadığı rapor edilmiştir. Ayrıca Stanleyville II
taşıyıcılarında anemik bir durum görülmediği rapor edilmiştir115.
Thillet ve arkadaşları Hb Stanleyville II mutasyonunun işlevlerini ve
özelliklerini anlatan çalışmalarında, Afrika kökenli bireylerde bu mutasyonun varlığını
göstermişlerdir. Bu çalışmada Hb Stanleyville II mutasyonunun hemoglobinin oksijen
affinitesini ve kooperativitesini etkilemediği rapor edilmiştir116.
North ve arkadaşları yaptıkları çalışmada bu mutasyonun Hb S ile birlikteliğini
göstermişlerdir. Hb Stanleyville II’nin, Hb S’in mekanik stabilitesini korumada görev
aldığını bildirmişlerdir117.
Sonati ve arkadaşları Hb Stanleyville-II/Hb A ve Hb Stanleyville-II/Hb S
birlikteliğini göstermişlerdir118.
Wenning ve arkadaşları -3,7α/αα talasemi mutasyonu ile Hb Stanleyville II
mutasyonunun birlikteliğini göstererek bu olguda hafif mikrositer ve hipokromik anemi
olduğunu bildirmişlerdir119.
Draube ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada bu mutasyonun normal koşullar
altında herhangi bir patolojiye neden olmadığı bildirilmiş ve total hemoglobinin
yaklaşık %25’ini bu mutasyonun oluşturduğu rapor edilmiştir120.
Burchal ve arkadaşları Hb S ile Hb Stanleyville II birlikteliğini göstermişler ve
Hb S’li olguların eritrositlerinde oksijensiz koşullarda fibrilleşme olduğu gözlenmiştir.
Hb SS’li olgularla Hb S/ Hb Stanleyville II birlikteliği olan olgular kıyaslandığında Hb
Stanleyville II’nin bulunduğu olguların eritrositlerinin fibrilleşmelerinin azaldığı
bildirilmiştir. Hb Stanleyville II’nin eritrositlerin fibrilleşmelerine karşı inhibitör rol
oynadıkları rapor edilmiştir. Daha önceki yapılan çalışmalarda Hb Stanleyville II
mutasyonu ile 3,7 kb’lık delesyon birlikteliği sonucunda olgularda hafif mikrositer ve
hipokromik anemi olduğu rapor edilmiştir. Ayrıca çalışmada mikrositer ve hipokromik
78
aneminin 3,7kb’lık delesyondan kaynaklı olduğu, Hb Stanleyville II mutasyonunun
patolojisinin bulunmadığı rapor edilmiştir 121.
Bu çalışmada ise Hb Stanleyville II mutasyonunu taşıyan ŞY(63) olgusunun
hematolojik verilerinin tamamen normal olduğu gözlenmiştir (Tablo 4.3). ŞB (35y)
olgusunda Hb Stanleyville II ile 3,7kb’lık delesyonun birlikteliğinin olgunun
hematolojik verilerini fazla etkilemediği gözlenmiştir (Tablo 4.3).
Türkiye’de ilk kez alfa globin zincir anomalisi olan Hb Stanleyville II (Hb St II)
bulunarak doğum öncesi tanı çalışmalarına katkı sağlanmıştır.
79
6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER
1. İki aileden toplamda yirmidört olgunun hematolojik verileri ve moleküler
çalışmaları yapılmıştır.
2. Gap-PCR yöntemi ile alfa talasemi mutasyon tipleri çalışıldığında bir olguda
20,5 kb’lık delesyon, altı olguda 3,7 kb’lık delesyon gözlenmiştir.
3. ARMS yöntemi ile beta talasemi mutasyonlarından IVS-I-110 mutasyonu bir
olguda gözlenmiştir.
4. DNA Dizi Analiziyle Türkiye’de ender gözlenen alfa talasemi mutasyonlarından
olan 5 nükleotitlik delesyon içeren bir homozigot ve üç heterozigot olgu
saptanmıştır.
5. Türkiye’de ilk kez gözlenen alfa globin zinciri anomalisi olan Hb Stanleyville II
bulunmuştur. Bir olguda bu mutasyon tek başına gözlenirken (-Hb St IIα/αα); bir
olguda ise 3,7 kb’lık alfa talasemi (-3,7α/-Hb St IIα) ile birlikteliği gösterilmiştir.
6. Bölgemizde ender görülen Anormal hemoglobinlerin ve talasemi mutasyon
tiplerinin moleküler düzeydeki yapılarının aydınlatılması doğum öncesi tanıya
katkı sağlayacaktır.
80
7. KAYNAKLAR 1) Seydel S G. Hemoglobinopatilerin Mikroarray Yöntemiyle Belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi,
Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstititüsü, Adana, 2007.
2) Vergin C. Anormal Hemoglobinler. 5. Uluslararası Talasemi Yazokulu. Antalya-Türkiye, 20-24
Ekim 2008:47-54.
3) Yaprak I. Talasemi Tipleri ve Kliniği. 5. Uluslararası Talasemi Yazokulu. Antalya-Türkiye, 20-24
Ekim 2008: 43-46.
4) Erişim: (http://globin.csu.edu.tr.) 2010. Erişim Tarihi: 14/05/2010.
5) Dönbak L. İnsan Hemoglobin Varyantları. KSÜ Fen ve Müh Der, 2005; 8: 13–22.
6) Arıyürek SY. Konya Bölgesinin Anormal Hemoglobin ve Talasemi Mutasyon Tiplerinin
Belirlenmesi. Doktora Tezi, Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstititüsü, Adana, 2009.
7) Canatan D. Dünyada ve Türkiyede Talasemi ve Anormal Hemoglobinler. Antalya: Retma, 2007: 11-
19.
8) Kutlu M, Çekmiş H, Başak M, Osman N, Açıkgöz Ö, Sevindir İ, Özcan ÖZ. Talasemiler.
Bakırköy Tıp Der, 2006;2:33-40.
9) Curuk MA. Hb H (beta4) disease in Cukurova, Southern Turkey. Hemoglobin, 2007; 31:265-271.
10) Yaprak I. Beta talasemi tanı ve tedavisinde güncel yaklaşımlar. Sted, 2004; 13(2):58.
11) Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood WG. The Metabolic and Molecular Bases of İnherited
Disease, 8th Ed . USA: International Edition, 2001.
12) Yüregir GT, Attila G. Hemoglobinopatiler ve tanı yöntemleri. ÇÜ Tıp Fak Der, 1997: 1-18.
13) Yüregir GT. Klinik Biyokimya. Adana :ÇÜ Tıp Fakültesi Yayınları, 1990: 132-143.
14) Murray RK, Granner DK, MayesPA, RadwellVW. Harper’s Biochemistry. 21th Ed. London:
Long Medical Book, 1988.
15) Polat G. Alfa Talasemili Bir Ailenin Mutasyon Tiplerinin Moleküler Düzeyde İncelenmesi.
Uzmanlık Tezi, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Adana, 1995.
81
16) Genc A. Hemoglobin Varyantlarının DNA Dizi Analizi ile Belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstititüsü, Adana, 2005.
17) Higgs DR, Vickers MA, Wilkie AO, Pretorius IM, Jarman AP, Weatherall DJ. A review of the
molecular genetics of the human alpha-globin gene cluster. Blood, 1989; 73: 1081-1104.
18) Steinberg MH, Forget BG, Higgs DR, Weatherall DJ. Disorders of Hemoglobin. 2nd Ed. UK:
Cambridge University, 2009.
19) Tang Y, Huang Y, Shen W, Liu G, Wang Z, Tang XB, Feng DX, Liu DP, Liang CC. Cluster
specific regulation pattern of upstream regulatory elements in human alpha- and beta-globin gene clusters. Exp Cell Res, 2008; 314(1):115-22.
20) Tang Y, Wang Z, Huang Y, Liu DP, Liu G, Shen W, Tang X, Feng D, Liang CC. Gene order in
human α-globin locus is required for theirtemporal specific expressions. Genes to Cells, 2006; 11:123–131.
21) Chan V. Education Session 9:Thalassemia: Molecular Defects in α-Thalassemia. IX Congress of Ish-
Asian- Pacific Division. Bangkok-Thaliand; 24-28 Ekim 1999:100-103.
22) Barbour VM, Tufarelli C, Sharpe JA, Smith ZE, Ayyub H, Heinlein CA, Stanley JS, Indrak K,
Wood WG, Higgs DR. α-Thalassemia resulting from a negative chromosomal position effect. Blood, 2000; 96( 3) :800-807.
23) Plant KE, Routledge SJE, Proudfoot NJ. Intergenic transcription in the human β-globin gene
cluster. Mol Cell Biol, 2001; 19 (21): 6507-6514.
24) Genç A, Zeren F, Çürük MA. Hemoglobinopatilerde sorunlu vakaların analizi. 5. Uluslararası
Talasemi Yazokulu. Antalya-Türkiye, 20-24 Ekim 2008; 25-27.
25) Weatherall DJ, Clegg JB. The Thalassaemia Syndromes. 4th ed. London: Blackwell Sience, 2001.
26) Yalın E. α talasemi ve G6PD Enzim Eksikliğine Neden Olan Mutasyonların Moleküler Düzeyde
İncelenmesi. Doktora Tezi, Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Adana , 2004.
27) Huisman THJ. The Hemoglobinopathies. Edinburgh: Churchill Livingstone Com, 1986.
28) Emery AEH, Muller RF. Elements of Medical Genetics. 8thed. London: Churchill Livingstone Com,
1992.
29) Sforza LLC, Menozzi P, Piazza A. The History and Geography of Human Genes. UK: Princeton
Universitiy, 1994.
30) Bunn HF, Forget BG. Molecular Genetic and Clinical Aspects. 2nd Ed. Philidelphia: WB Sounders
Com, 1986.
82
31) Huisman, THJ. The Structure and function of normal and abnormal hemoglobins. Bailieres Clin Haematol, 1993; 6:1-30.
32) Huisman THJ. Blood Disease of Infancy and Childhood, 7th ed. St Louis: Mosby-Year Book Inc,
1995.
33) Altay Ç. Abnormal hemoglobins in Turkey. Turk J Haematol, 2002; 19:63-74.
34) Akar E, Akar N. A review of abnormal hemoglobins in Turkey. Turk J Hematol, 2007; 24:143-145.
35) Kilinc Y, Kumi M, Gurgey A, Altay C, Webber BB, Wilson JB, Kutlar A, Huisman TH.
Hemoglobin-O Padova or alpha (2) 30 (β11) GluàLys beta 2 observed in members of a Turkish family. Hemoglobin, 1985; 9:621-5.
36) İrken G, Oren H, Undar B, Duman M, Gulen H, Ucar C, Sanlı N. Analysis of thalassemia
syndromes and abnormal hemoglobins in patients from the Aegean region of Turkey. Turk J Pediatr, 2002; 44:21-24.
37) Curuk MA, Dimovski AJ, Baysal E, Gu LH, Kutlar F, Molchanova TP, Webber BB, Altay Ç,
Gurgey A, Huisman TH. Hb Adana or alpha 2 (59) (E8) Gly→Asp beta 2, a severely unstable alpha 1-globin variant, observed in combination with the-(alpha) 20.5 Kb alpha-thal-1 deletion in two Turkish patients. Am J Hematol, 1993; 44:270-275.
38) Bilginer A, Lehmann H, Arcasoy A. Hemoglobin Ube-2 (alpha 68 AsnàAsp) observed in a
Turkish family. Hemoglobin, 1984; 8:189-91.
39) Efremov GD. Forty-four years (1955-1999) devoted to hemoglobin research : Titus HJ Huisman
(1923-1999). Hemoglobin, 2001; 25(2): 125-168.
40) Giordano PC, Fodde R, Amons R, Ploem JE, Bernini LF. Hb J Anatolia [alpha 61(E10)
LysàThr]:Structural characterization and gene localization of a new alpha chain variant. Hemoglobin, 1990; 14:119-28.
41) Aksoy M, Gurgey A, Altay C, Kılınc Y, Carstairs KC, Kutlar A, Chen SS, Webber BB, Wilson
JB, Huisman TH. Some notes about HbQ India and Hb Q Iran. Hemoglobin, 1986;10: 215-9.
42) Knuth A, Pribella W, Marti HR, Winterhatter KH. Hb Moabit α 86 (D7) LeuàArg A New
Unstable Abnormal Hb. Acta Haematol, 1979; 61:121-3.
43) Ozsoylu S. Congenital methemoglobinemia due to hemoglobin M. Acta Haematol, 1972; 47:225-32.
44) Dincol G, Dincol K, Erdem S, Pobedimskaya DD, Molchanova TP, Ye Z, Webber BB, Wilson
JB, Huisman THJ. Hb Capa or alpha (2) 94 (G1) AspàGly beta 2, a mildly unstable variant with an AàG (GACàGGC) mutation in codon 94 of the alpha-1 globin gene. Hemoglobin, 1994; 18:57-60.
83
45) Houte DPV, Ende AVD, Eps LWSV, Giordano PC, Bernini LF. Hemoglobin G Georgia in Turkish Family in the Netherlands. Ned Tijdschr Geneeskd, 1986; 130:360-3.
46) Akar N, Arcasoy A, Ata Y. Hb Strumica α112 (G19) HisàArg (CACàCGC) in a Turkish Family.
Hemoglobin, 1991; 15:347-8.
47) Yalcin A, Avcu F, Beyan C, Gurgey A, Ural AU. A case of Hb J- Meerut (or Hb J Birmingham)
[alpha 120 (H3) AlaàGlu]. Hemoglobin, 1994;18:433-5.
48) Dincol G, Elam D, Kutlar A, Kutlar F. Hb Setif [alpha 94(G1) AspàTyr (alpha 2)] detected in a
Turkish family. Hemoglobin, 2003; 27:249-52.
49) Harteveld CL, Steen G, Vlasveld LT, Delft PV, Giordano PC. Hb Bronova a new globin gene
mutation at alpha-2 103(HisàLeu) associated with an alpha thalassemia phenotype. Haematologica, 2006; 91:570-1.
50) Tahiroğlu M. Hatay-Samandağ Yöresindeki Liselerde Hemoglobinopati Tiplendirilmesi ve
Bilgilendirilmesi Çalışması. Uzmanlık Tezi, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Adana, 2010.
51) Ozdag H, Yildiz İ, Akar N. First observation of homozygote Hb Q Iran (alpha 75(EF 4) AspàHis.
Turk Hematol, 2008; 25:48-50.
52) Lukens JN. Wintrobe’s Clinical Hematology. 10th Ed. Egypt:Mass Publising Co, 1999;1405-1448.
53) Loukopoulus D. Thalassemia genotypes and phenotypes. Ann Haematol, 1991; 62:145-150.
54) Başak AN. Talaseminin Moleküler Genetiği. Temel Moleküler Hematoloji Kursu. Mersin-Türkiye,
12-13 Mart 2005:99-106.
55) Akar N, Cavdar AO, Dessi E, Loi A, Pirastu M, Cao A. β-Thalassemia mutations in theTurkish population. J Med Genet, 1987; 24:378–379.
56) Curuk M. Anormal Hemoglobinler ve Talasemiler. Adana: ÇÜ Basımevi, 2005.
57) Haigh H, Kazazian J. The Thalassemia syndromes: Molecular basis and prenatal diagnosis in 1990.
Semin Hemat, 1990; 27(3) :209-228.
58) Arcasoy A. Türkiye’de thalassemia taşıyıcı sıklığı ve anormal hemoglobinler. Ankara Talasemi
Derneği, 1994.
59) Çavdar AO. Türkiye’de talasemi insidansı. Thalassemia Sempozyumu, TÜBİTAK, Ankara, 1981.
60) Curuk MA, Arpacı A, Atilla G, Tuli A, Kılınc Y, Aksoy K, Yuregir GT. Genetic heterogenetiy of
β-thalassemia at Çukurova in Southern Turkey. Hemoglobin, 2001; 25:241-245.
84
61) Curuk MA, Zeren F, Genc A, Aygun SO, Kılınc Y, Aksoy K. Prenatal diagnosis of sickle cell anemia and β-thalassemia in Southern Turkey. Hemoglobin, 2008; 32(6):525-530.
62) Yuregir GT, Arpaci A, Aksoy K, Tuli A, Dikmen N, Ozgunen T, Kılınc Y. Population at risk for
hemoglobinopathies in Cukurova Turkey:Need for prenatal diagnosis. Ann Med Sci, 1995; 4(2):61-69.
63) Basak AN, Ozcelik H, Ozer A, Tolun A, Aksoy M, Agaoglu L, Ridolfi F, Ulukutlu L, Akar N,
Gurgey A, Kırdar B. Moleculer basis of the β-thalassemia in Turkey. Hum Genet, 1992; 89:315-318.
64) Tadmouri GO, Tüzmen Ş, Özçelik H, Özer A, Baig SM, Senga EB, Başak AN. Molecular and
population genetic analyses of β-thalassemia in Turkey. Am J Hematol, 1998; 57:215-220.
65) Çürük MA, Genc A, Hüseynova P, Zeren F, Aksoy K. Cukurova’da alfa talasemi genotipleri ve
Hb H hastalığı. Türk Klin J Pediatr Sci, 2007; 3(10):17-23.
66) Yüreğir GT, Aksoy K, Dikmen N. Alfa talasemi taramasında tek tüp osmotik frajilitenin yeri. Doğa
Tr J Med Sci, 1990; 14:374-380.
67) Polat G, Aksoy K. Alfa talasemilerin moleküler yapısı. Arşiv, 1998; 7(4):349-366.
68) Liebhaber SA. Alpha thalassemia. Hemoglobin, 1989; 13:685-731.
69) Sharpe JA, Summerhill RJ, Vyas P, Gourdan G, Higgs DR, Wood WG. Role of upstream
DNAase I hypersensitive sites in the regulation of human alpha globin gene expression. Blood, 1993; 82:1666-1671.
70) Ren S, Luo XN, Atweh GF. The major regulatory elements upstream of the alpha –globin gene has
classical and inducible enhancer activity. Blood, 1993; 81:1058-1066.
71) Hatton CS, Wilkie AO, Drysdale HC, Wood WG, Vickers MA, Sharpe J, Ayyup H, Pretorius
IM, Buckle VJ, Higgs DR. Alpha-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human alpha globin gene cluster. Blood, 1990; 76:221-227.
72) Bernet A, Sabatier S, Picketts DJ, Ouazana R, Morle F, Higgs DR, Godet J. Targeted
inactivation of the major positive regulatory elements (HS-40) of the human alpha-globin gene locus. Blood, 1995; 86:1202-1211.
73) Salah K, Baysal E. α-Thalassemia in the United Arab Emirates. Acta Haematol, 1998; 100:49-53.
74) Foglietta E, Giancarlo D, Graziani B, Modiano G, Bianco I. Detection of α-globin gene disorders
by a simple PCR methodology. Haematologica, 1996; 81:387-396.
75) Kan YW, Dozy AM, Trecartin R, Todd D. Identification of a nondeletion defect in alpha
thalassemia. N Eng J Med, 1977; 297:1081-1084.
85
76) Curuk MA, Baysal EA, Gupta RB, Sharma S, Huisman TH. An IVS-I-117 (GàA) acceptor splice site mutation in the alpha-1 globin gene is a nondeletional alpha thalassemia-2 determinant in an Indian population. Br J Haematol, 1993;85:148-152.
77) Chui DHK, Fucharoen S, Chan V. Hemoglobin H disease : not necessarily abenign disorder.
Blood, 2003; 103(3): 791-800.
78) Yuregir GT, Aksoy K, Curuk MA, Dikmen N, Fei YJ, Baysal E, Huisman TH. Hb H disease in a
Turkish family resulting from the interaction of a deletional alpha-thalassaemia-1 and a newly discovered poly A mutation. Br J Haematol, 1992; 80:527-532.
79) Oner C, Gurgey A, Oner R, Balkan H, Gumruk F, Baysal E, Altay C. The molecular basis of Hb
H disease in Turkey. Hemoglobin, 1997; 21:41-51.
80) Zago MA, Costa FF, Bottura C. Hemoglobin H disease in three Brazilian families. Rev Brasil
Genet, 1984;1:137-147.
81) Bernini LF. α-Thalassaemia. Baillière’s Clin Haem, 1998; 11(1):53-90.
82) Williams TN, Mwangi T, Wambua S, Peto TEA, Weathwerall DJ, Gupta S, Recker M, Penman
BS, Uyoga S, Macharia A, Mwacharo JK, Snow RW, Marsh K. Negative epistasis between the malaria-protective effects of α+-thalassemia and sickle cell trait. Nature, 2005; 37(11):1253-1257.
83) Flint J, Harding RM, Boyce AJ, Clegg JB. The population genetic of the haemoglobinopathies.
Baillière’s Clin Haem, 1998; 11:1-51.
84) Erişim: (http://science.jrank.org/pages/48501/Sickle-Cell-Anemia-Thalassemia.html) 2010. Erişim
Tarihi: 07/04/2010.
85) Erişim: (http://www.turktalasemi.org/blog.asp?id:137) 2010 . Erişim Tarihi: 08/04/2010.
86) Aksoy M. Hemoglobinopathies in Turkey. Hemoglobin, 1985; 9:209-216.
87) Aluoch JR, Kılınc Y, Aksoy M, Yuregir GT, Bakioglu I, Kutlar F, Huisman THJ. Sickle cell
anemia among Eti Turks:haematological clinical and genetic observations. Br J Hematol, 1986; 64:45-55.
88) Kılınç Y, Kumi M, Gurgey A, Altay C. Adana bölgesinde doğan bebeklerde kordon kanı çalışması
ile alfa talasemi, glukoz 6-fosfat dehidrogenaz enzim eksikliği ve hemoglobin S sıklığının araştırılması. Doğa Tu Tıp Ecz Der, 1986; 10:162-167.
89) Kılınc Y. Hemoglobinopathies in Turkey. Turk J Hematol, 2006; 23:214-216.
90) Polat G, Yuregir GT, Aksoy K. Detection of deletional alpha thalassemia in Cukurova. Ann Med
Sci, 1998; 7:14-17.
86
91) Polat G, Curuk MA, Yuregir GT, Aksoy K. Deletional alpha thalassemias in Cukurova. Ann Med Sci, 1999; 8:22-25.
92) Gali EA, Polat G, Doğdu O, Akgol M, Parlar HR, Arpacı A, Aksoy K, Yuregir GT. A
premaritial screeing programme of hemoglobinopathiesin Hatay. Ann Med Sci, 1999; 8:88-92.
93) Huısman THJ, Jonxis JHP. The Hemoglobinopathies, Techniques of Identification. New York:
Marcel Dekker Inc, 1977.
94) Kohn J. Separation of hemoglobin on cellulose acetate. J Clin Pathol, 1969; 22:109-110.
95) Huisman THJ, Scroder WA, Brodie AN, Mayson M, Jakway J. Microchromatography of
hemoglobin. A simplified procedure for determination of hemoglobin A2. J Lab Clin Med, 1975; 86;700-702.
96) Singer K, Chernoff AA, Sınger L. Studies on abnormal hemoglobins. Alkali denaturation.
Blood,1951; 6:413-423.
97) Huisman THJ. High performance liquid chromatogrphy as a method to identify haemoglobin
abnormalities. Acta Haemat, 1987; 78(2-3):123-6.
98) Aksoy K, Kayrın L, Tuli A, Çürük MA, Atilla G. Anormal Hemoglobinler ve Talasemi Tanısında
Kullanılan Yöntemler. 8. Biyokimya Yaz Okulu, Adana, 2006.
99) Magna Pure LC DNA İsolation Kit-Large Volume. Version December 2008.
100) Chong SS, Boehm CD, Higgs DR, CuttingGR. Single-tube multiplex-PCR screen for common
deletional determinants of alpha–thalassemia. Blood, 2000 95: 360-362.
101) Karahan C. Moleküler Mikrobiyoloji Tanı Prensipleri ve Uygulamaları. Washington: Palme,
2006;153-159.
102) Erişim: (http://yunus.hacettepe.edu.tr/~mergen/derleme/d_sekansteknikleri.pdf) 2010. Erişim
Tarihi: 11/04/2010.
103) Erişim: (http://awcmee.massey.ac.nz/Data/ABI_DNA_Sequncing_Chemistry_Guide.pdf.) 2010.
Erişim Tarihi: 11/04/2010.
104) Aşçıoğlu F, Koluaçık ST, Çetinkaya Ü, Akyüz F. Kapiller elektroforez teknolojisinin klinik ve
adli amaçlı DNA analizlerinde kullanımı: geleneksel jel elektroforez yöntemi ile karşılaştırma. Adli Tıp Der, 2002; 16(2-4):88-93.
105) Adams JG, Coleman MB. Structural hemoglobin variants that produce the phenotype of
thalassemia. Semin Hemat, 1990; 27(3):229-238.
87
106) Flint J, Harding RM, Clegg JB, Boyce AJ. Why are some genetic diseases common? Hum Genet, 1993; 91:91-117.
107) Çürük MA, Arpacı, Gülsev H. Nondelesyonel Alfa Talasemi Mutasyonlarının DNA Dizi
Analizi ile Belirlenmesi. Tübitak. 1997.
108) Canatan D, Oğuz N, Güvendik I, Yildirim S. The incidence of alpha-thalassemia in Antalya-
Turkey. Turk J Haematol, 2002; 19:433-434.
109) Curuk MA, Kilinc Y, Evruke C, Ozgunen FT, Aksoy K, Yüreğir GT. Prenatal diagnosis of
Hb H disease caused by a homozygosity for the alpha-2 poly A (AATAAA-->AATAAG) mutation. Hemoglobin, 2001; 25:255-258.
110) Atalay E, Cirakoglu B, Dincolc G, Atalay A, Kilinc Y, Aytekin H, Yuregir GT, Arpacı A,
Bermek E, Aksoy M. Regional distributions of β-tahalassemia mutations in Turkey. Int J Hematol, 1993; 57(3):207-11.
111) Yüreğir GT, Donma O, Dikmen N, İspir T, Çınar M. Population studies of hemoglobin S and
other variants in Çukurova. The southern part of Turkey. Acta Haemotol, 1987; 50:757-765.
112) Yüreğir GT, Aksungur P, Burgut R. A survey of high A2 β Talasemi, hemoglobin variants,
G6PD deficiency anemia in Karatas, Cukurova, Southern Turkey. Doğa Tr Med Sci, 1989; 13:203-210.
113) Arpacı A, Aksoy K, Yüreğir GT. Preliminary studies for prenatal diagnosis: Incidence and
mutation sites of β-thalassaemia in Antakya, Türkiye. Ann Med Sci, 1992; 1:103-110.
114) Dherte P, Vanderpitte J, Ager JA, Lehmann H. Stanleyville I and II: two new variants of
adult haemoglobin. Br Med J, 1959; 5147:282-4.
115) Ros VG, Beale D, Lehmann H. Haemoglobin Stanleyville II (α 78 AsparagineàLysine). Br
Med J, 1968; 4:92-93.
116) Thillet J, North ML, Rosa J. Functional properties of Hb Stanleyville II α 78 (EF 7)
AsnàLys.Effect of Sodium Cloride. Hemoglobin, 1979; 3(2-3):185-191.
117) North ML, Thillet J, Rosa J. Effect of some physical features and amino acid substitutions on
the mechanical precipitation of hemoglobin. Hemoglobin, 1981; 5(4):379-390.
118) Sonati MF, Kimuro EM, Grotto HZW, Gervasio SA, Costa FF. Hereditary
hemoglobinopathies in a population from Southern Brazil. Hemoglobin, 1996; 20(2):175-179.
119) Wenning MRSC, Kimuro EM, Costa FF, Saad STO, Gervasio S, Jorge SB, Borges E, Silva
NM, Sonati MF. α-Globin genes: thalassemic and structural alterations in a Brazilian population. Braz J Med Bio Res, 2000; 33:1041-1045.
88
120) Draube A, Chemnitz JM, Wickenhouser C, Staib P, Hallek M, Kreuzer KA. Cytomorphologic signs of severe pernicious anemia obscured in a patient with heterozygous hemoglobin Stanleyville II. Eu J Haematol, 2007; 79:360-362.
121) Burchal G, Maxwell E. Haemoglobin Stanleyville II modifies sickle disease phenotype.
Pathology, 2010; 42 (3):310-312.
89
EK-1: Etik kurul onay formu
90
EK-2: Denek Bilgilendirme ve Rıza Olur Formu
Araştırmanın Yürütücüleri:
Prof. Dr. Kıymet AKSOY
Yüksek Lisans Öğrencisi Figen GÜZELGÜL
Prof. Dr. Kıymet AKSOY ve Yüksek Lisans Öğrencisi Figen GÜZELGÜL tarafından yürütülen “ α- Talasemi Mutasyonlarının DNA Dizisi Yöntemi ile Belirlenmesi ” başlıklı Çukurova Üniversitesi Bireysel Araştırma Projesi tarafından desteklenen çalışmada katılımcı olarak yer alacaksınız.
Bu çalışma çerçevesinde, olası mutasyonlarınızın belirlenmesi amacıyla vereceğiniz biyolojik materyal (kan ve DNA örnekleri) DNA dizi analizi ile incelenecek ve tanısı yapılacaktır. Vereceğiniz biyolojik materyal yukarıda bahsedilen amaçların dışında bir amaç için kullanılmayacaktır. Çalışma bilimsel bilgi birikimine katkı sağlamayı amaçlamakta olup, katılımcıya doğrudan bir yarar sağlamayacaktır. Elde edilen sonuçlar sadece bilimsel amaç için kullanılacak, kişisel bilgiler gizli tutulacaktır. Çalışmaya katılmama hakkınız ve istediğiniz zaman çalışmadan çekilme hakkınız bulunmaktadır.
Yukarıda, gönüllüye araştırmadan önce verilmesi gereken bilgileri gösteren metni okudum. Araştırma hakkında bana yeterli yazılı ve sözlü açıklama yapıldı. Bu koşullarda söz konusu Klinik Araştırma’ya kendi rızamla, hiçbir baskı ve zorlama olmaksızın katılmayı kabul ediyorum. Gönüllünün
Adı Soyadı :
İmzası :
Adresi :
Tel (varsa) :
Açıklamayı yapan araştırmacının
Adı Soyadı :
İmzası :
91
ÖZGEÇMİŞ 1984 yılında Adana’da doğdu. İlk ve orta öğretimini burada tamamladıktan
sonra 2002 yılında Mersin Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji bölümünde
öğrenimine başladı ve 2007 yılında mezun oldu. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Sağlık
Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Moleküler Genetik Programı’nda
yüksek lisans öğrenimine başladı.
