Allergeni Alimentari : Attività di controllo e di ricerca ... pdf convegno 9... · allergeni (obbligo di dichiarazione in etichetta) di alcuni ingredienti o sostanze alimentari derivati

IZSTO

Istituto Zooprofilattico

Sperimentale del Piemonte,

Liguria e Valle d’Aosta

Allergeni Alimentari : Attività di controlloe di ricerca degli IIZZSS

Lucia Decastelli SC Controllo Alimenti e Igiene delle preoduzioni IZS PLV

LEGISLAZIONELEGISLAZIONE

Direttiva 2003/89/CE D.Lgs. n. 114 del 08/02/2006

Direttiva 2000/13/CE D.Lgs. n. 109 del 27/01/1992

E’ sancito l’obbligo per i produttori di dichiarare in etichetta tutti gli ingredienti e le sostanze da loro derivate (Tabella 1) abolendo la regola del 25% prevista dalla vecchia Direttiva 2000/13/CE (D. Lgs. N. 109 del 27/01/1992 a livello nazionale), secondo la quale era possibile non indicare i componenti degli ingredienti composti che rappresentavano meno del 25% del prodotto finito e la possibilità di indicare uno degli ingredienti solo con il nome della categoria di appartenenza.

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seguesegue LEGISLAZIONELEGISLAZIONE

Direttiva 2007/68/CEEsclusione dal regime degli

allergeni (obbligo di dichiarazione in etichetta) di alcuni ingredienti o sostanze alimentari derivati dagli ingredienti di cui all'allegato III bis

della direttiva 2000/13/CE, in quanto gli studi effettuati e validati dall’EFSA ne hanno evidenziato la

non tossicità

Direttiva 2006/142/CE

Integrazione della lista degli allergeni con “lupino e prodotti

a base di lupino” e con i “molluschi e prodotti a base di

molluschi”

a) sciroppi di glucosio a base di grano, incluso destrosio;b) maltodestrine a base di grano;c) sciroppi di glucosio a base d'orzo;d) cereali utilizzati per la fabbricazione di distillati o di alcol etilico di origine agricola per liquori ed altre bevande alcoliche

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Novità nel regolamento (UE) n. 1169/2011 del 29.10.2011

.

• Ampliamento della normativa allergeni anche a sett ori diversi dall’industria alimentare

• Coinvolgimento della ristorazione collettiva .

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Novità nel regolamento (UE) n. 1169/2011 del 29.10.2011

.

• Resta il problema indefinito delle “tracce”• Senza limiti di legge si mantiene la situazione di incertezza

a livello sia delle aziende sia dei consumatori

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Allegato II

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ATTIVITA’ DI CONTROLLO Regione Piemonte

• PIANI DI CONTROLLO UFFICIALE

• CAMPIONI INVIATI A SEGUITO DI SEGNALAZIONE DI SINTOMATOLOGIA CLINICA

• ALLERTE

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L’ESPERIENZA PIEMONTESE

ALLERGENI RICERCATI

Molluschi

Molluschi

Crostacei

-

Crostacei

Crostacei

Lattosio

Lattosio

-

-

Molluschi

-

Proteinelatte

Proteine uova

2010

Proteinelatte

Proteine uova

2009

Proteinelatte

Proteine uova

2008

Proteinelatte

Proteine uova

2007

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150202258190Ovoproteine

507479-Crostacei

530

-

171

169

2007

897

78

252

230

2008

733

60

276

121

2009 2010

400Analisi Totali

50Molluschi

150β-lattoglobuline

-Lattosio

L’esperienza piemontese

numero di analisi

Il trend

1,35%= 0 %Crostacei

1,66%= 0 %Molluschi

4%4,26%= 5,26 %Ovoproteine

2,5%7,14%= 4,67 %β-lattoglobuline

0,8%1,73%= 4,1 %Lattosio

20092008 2007

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SERVIZI VETERINARI 2007-2010β-lattoglobuline

TOTALE ANALISI: 899

50 % PREPARAZIONI DI CARNE

6 % ALTRI PRODOTTI

44 % PRODOTTI A BASE DI CARNE


6 % ALTRI PRODOTTI

44 % PRODOTTI A BASE DI CARNE34 campioni NON CONFORMI 3,8%� 18 preparazioni di carne� 13 prodotti a base di carne� 3 altri prodotti

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SERVIZI VETERINARI 2007-2010ovoproteine

TOTALE ANALISI: 850


40 % PRODOTTI A BASE DI CARNE

7 % ALTRI PRODOTTI

32 campioni NON CONFORMI 3,8%� 27 preparazioni di carne� 4 prodotti a base di carne� 1 altri prodotti

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SERVIZI VETERINARI 2007-2010crostacei e molluschi

TOTALE ANALISI: 282

69 % CROSTACEI31 % CROSTACEI

2 campioni NON CONFORMI� 1 crostacei� 1 molluschi

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SERVIZI VETERINARI - 2011

15%

14%

35%

35%

1%

TOTALE ANALISI: 357

� 15% DNA Crostaceo� 14% DNA mollusco� 35% β-lattoglobuline� 35% ovoproteine� 1% lattosio (IZS Lazio e Toscana)

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97% CONFORMI

3% NON CONFORMI

TOTALE ANALISI: 357

•ALIMENTI PRIMA INFANZIA

•PRODOTTI A BASE DI CARNE

•PREPARAZIONI DI CARNE

•PREP. GASTRONOMICHE BASE DI CARNE

•PASTICCERIA E BISCOTTERIA

•CARNI FRESCHE E FRATTAGLIE

•CARNI FRESCHE E FRATT. POLLAME

•SALSE PREPARATE E CONDIMENTI

•PRODOTTI E CONSERVE PESCI

•PRODOTTI E CONSERVE DI CROSTACEI/MOLLUSCHI

•PRODOTTI DELLA PESCA PREPARATI

•PREP. GASTRONOMICHE READY TO EAT


TIPO CAMPIONE

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SUDDIVISIONE NON CONFORMI


hamburger

wurstel

prep carne pollame

impasto per agnolotti

salsiccia

hamburger

polpetta

β-lattoglobuline(n°2 campioni)

Ovoproteine(n°9 campioni)

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73%

13%

14%

SIAN - 2011TOTALE ANALISI: 64

� 73% β-lattoglobuline� 13% ovoproteine� 14% lattosio (IZS Lazio e Toscana)

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SIAN - 2011TOTALE ANALISI: 64

3% NON CONFORMI

97% CONFORMI

•CREME E PASTICCERIA INDUSTRIALE

•PASTE ALIMENTARI

•PREP. GASTRONOMICHE READY TO EAT

•PREPARAZIONI ALIMENTARI DIVERSE

•LATTE E CREMA DI LATTE FRESCHI O CONSERVATI

•ALIMENTI DIETETICI A FINI SPECIALI

•BEVANDE

•SOIA

•PRODOTTI DI PANETTERIA

•CREME E PASTICCERIA FRESCA ARTIGIANALE


•PRODOTTI A BASE DI CEREALI SOFFIATI O TOSTATI

•PASTICCERIA E BISCOTTERIA

TIPO CAMPIONE

NON CONFORMI per β-lattoglobuline�1 campione di Biscotto�1 campione di Alimenti prima infanzia

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Liguria e Valle d’AostaLIMITI DELLE METODICHE

possibili errori di interpretazione causati da:• cross reattività• effetto matrice

eventuale necessità di una fase preliminare di purificazione e di arricchimento del campione

Metodiche senza certificati di validazione (AFNOR - AOAC)• Necessità di validazione “in-house”.

• Materiali di riferimento certificati e circuiti inter-laboratorio non disponibili

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Liguria e Valle d’Aosta Problematiche

• Allerte rifiutate per metodica non accreditata

• Richiesta di quantificazione da parte degli studi legali

• Non conformità rilevata solo con metodica di scrennig

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Liguria e Valle d’AostaCONCLUSIONICONCLUSIONI

•• Non conformitNon conformit àà rilevate soprattutto in aziende di rilevate soprattutto in aziende di piccole dimensioni piccole dimensioni

•• Indispensabile un piano di autocontrollo adeguatoIndispensabile un piano di autocontrollo adeguato

•• Le informazioni al consumatore devono essere Le informazioni al consumatore devono essere trasparenti (presa di coscienza delltrasparenti (presa di coscienza dell ’’OSA)OSA)

•• Utile attivare piani di monitoraggio regionaliUtile attivare piani di monitoraggio regionali

•• Le positivitLe positivit àà riscontrate durante il controllo riscontrate durante il controllo ufficiale devono avere un ufficiale devono avere un ““ seguitoseguito ””

•• Fondamentale che tutte le Regioni attivino piani di Fondamentale che tutte le Regioni attivino piani di monitoraggio o sorveglianzamonitoraggio o sorveglianza

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ALLERGENI TARGET RICERCATI NEL DALLA RETE IZZSS 201 1

XXXXXIZS SICILIA

XXXXIZSSARDEGNA

IZSMEZ

XXXIZSUM

XXXXIZSLT

XXXXIZEVE

XXXXXXXXIZSLER

XXXXIZS PLV

ANIDRIDESOLFOROSA

MOLLUSCHICROSTACEISOIAFRUTTA GUSCIO

SESANOGLUTINEOVOPTCASEINEΒ-LATTO

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ALLERGENI TARGET RICERCATI NEL DALLA RETE IZZSS 201 2

XXXXXIZS SICILIA

XXXX

IZSSARDEGNA

XXXIZSMEZ

XXXIZSUM

XXXXIZSLT

XXXXIZEVE

XXXXXXXXXIZSLER

XXXXIZS PLV

ANIDRIDESOLFOROSA

MOLLUSCHICROSTACEISOIAFRUTTA GUSCIO

SESANOGLUTINEOVOPTCASEINEΒ-LATTO

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CA

MP

ION

I ES

EG

UIT

I RE

TE

IZZ

SS

201

1

3257-1339320473TOTALE CAMPIONI 2011-2012

-057-067-052IZS SICILIA

-075-017-036IZSSARDEGNA

--058-495IZSUM 2011

-074-469-473IZSLT 2011

-------03IZEVE

-351------IZSLER 2011

---29182112214IZS PLV 2011

Confermati ISS

PositiviEseguitiConfermati

ISSPositiviEseguiti

Confermati ISS

PositiviEseguiti

GLUTINEUOVALATTE

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CA

MP

ION

I ES

EG

UIT

I RE

TE IZ

ZS

S 2

012

-1203-30375-13342TOTALE CAMPIONI 2011-2012

-172-1784-270IZS SICILIA

-049-017-016IZSSARDEGNA

--1?110-012IZSMEZ 2012

---048-284IZSUM 2012

-0531; 1?10115-6108IZSLT 2012

------01IZEVE

-029------IZSLER 2012

--01?2101-351IZS PLV 2012

Confermati ISS

Positivi

EseguitiConfermati ISS

Positivi

EseguitiConfermati ISS

Positivi

Eseguiti

GLUTINEUOVALATTE

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Liguria e Valle d’Aosta ATTIVITA’ DI RICERCA

• Approvazione di progetto di Ricerca Finalizzata Ministeriale 2008 dal titolo:

“Messa a punto di dispositivi nanotecnologici (biosensori) per il rilevamento di allergeni in alimenti di origine animale e vegetale”

RICERCA FINALIZZATA 2008 – Riunione di apertura – 14 dicembre 2010

Chi siamo• Azienda Ospedaliera Maggiore della Carità Novara - Rete allergologica

Regione Piemonte• Consiglio Nazionale delle Ricerche - ISPA • Istituto Superiore di Sanità• Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana • Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno• Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d'Aosta • Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna• Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna , • Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia • Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie• Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche• Politecnico di Torino• Università Piemonte Orientale - Dip Scienze Chimiche, Alimentari,

Farmaceutiche e Farmacologiche





Obiettivo generale

Migliorare e uniformare sul territorio nazionale l’applicazione di metodi analitici per la determinazione di allergeni alimentari

Mettere a punto e disporre di metodi analitici innovativi di screening

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Obiettivi specifici•Valutare le performance di metodi analitici (commer ciali o homemade) per la determinazione di allergeni

– Ottenendo dati circa sensibilità, specificità, LOD, LOQ, di metodi quali ELISA, PCR,

Consolidare utilizzo di protocolli standardizzati e c ondivisi per il controllo ufficiale sul territorio nazionale (metodi con performance sovrapponibili, garantendo risultati comparabili )

•Verificare l’applicazione di metodi quantitativi o semiquantitativi

– Indagando sulla possibilità di definire un livello accettabile •Mettere a punto nuovi metodi (cantilever)

– Definendo il grado di denaturazione di alcune proteine; identificando Ac da utilizzare anche contro marker di altre proteine allergizzanti

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Allestimento di due diversi questionari (Kit ELISA e PCR) per valutare i kit attualmente disponibili sul mercato per la ricerca di allergeni in campioni alimentari .

Ciascun questionario è stato inviato alle ditte che commercializzano e/o producono sistemi di analisi dedicati alla ricerca dei seguenti allergeni alimentari: - proteine del latte;- proteine delle uova;- crostacei.

VALUTAZIONI PRELIMINARI

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1) utilizzo di materiale di riferimento certificato

2) campo di applicazione

3) anticorpo policlonale o monoclonale

4) Sensibilità (LOD) (non ci sono pervenuti dati relativi agli altri parametri)

5) elaborazione matematica e espressione del risultato

6) semplicità di esecuzione / tempi di esecuzione

7) Per poter utilizzare un criterio.

CRITERI DI VALUTAZIONE KIT ELISA IN COMMERCIO

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CRITERI DI VALUTAZIONE KIT ELISA IN COMMERCIO

Per poter utilizzare un criterio oggettivo di valut azione si sono assegnati dei punteggi a ciascun indicatore individuato e ne llo specifico sono stati attribuiti i seguenti punteggi:

�criterio 1: da 0 a 5;

�criterio 2: da 0 a 4;

�criterio 3: 0 (anticorpo monoclonale) o 3 (anticorp o policlonale);

�criterio 4: verrà considerato come discriminante in caso di ugual punteggio per diversi kit, in quanto ogni ditta ha eseguito il calcolo del LOD con criteri differenti (in tampone, in matrice, ecc ...)

�criterio 5: 0 o 2;

�criterio 6: 1 per tempi inferiori alle 2 ore, 0 pe r tempi più lunghi.

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Al termine di questo lavoro sono stati individuati:

- 3 kit per la ricerca di ovoproteine,

- 4 kit per la ricerca di beta-lattoglobuline,

- 3 kit per la ricerca di proteine di crostacei

- 1 kit per la ricerca di tracce di DNA di crostacei.

Tutti i sistemi sono stati utilizzati per l’analisi di campioni fortificati

nell’ambito di un circuito interlaboratorio.

CONCLUSIONI STUDIO PRELIMINARE

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Per la preparazione dei campioni del ring test sono state definite le seguenti

matrici fortificate da analizzare:

�polpette di carne contaminate con uova e latte (alimento crudo)

�biscotti contaminati con uova e latte (alimento cotto)

�polpette di pesce contaminate con gambero (alimento crudo)

�sugo di pomodoro e pesce contaminato con gambero (alimento cotto)

METODOLOGIA STUDIO INTERLABORATORIO

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Dopo aver valutato la capacità di recovery dei kit ELISA (per latte, uovo e

crostacei) sono state selezionate le più opportune condizioni di cottura (in termini

di tempo) per biscotti e sugo e sono stati stabiliti gli “spiked levels” per le matrici

fortificate.

E’ stata effettuata la preparazione di 5 campioni (4 concentrazioni e un bianco)

per ogni allergene che ogni U.O. ha analizzato in duplicato e con ciascuno dei 3-4

kit individuati.

Le matrici sono state fortificate utilizzando materiali di riferimento certificati, in

particolare il latte NIST1549 e le uova NIST8445.

METODOLOGIA STUDIO INTERLABORATORIO

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I lavori sono stati eseguiti nei tempi stabiliti, effettuando per ogni Kit e

campione in esame, due determinazioni in modo da poter valutare la

ripetibilità del risultato.

I coefficienti di variabilità sono risultati, in alcuni campioni e per alcuni kit,

molto elevati.

In generale, i Kit per la determinazione delle proteine delle uova sono risultati

decisamente più semplici, veloci e affidabili rispetto a quelli per la ß-

lattoglobulina.

CRITICITA’ RILEVATE IN FASE ANALITICA

ACCURATEZZA

References:1. Official Methods of Analysis (2002) J AOAC Int - Appendix D 2. Abbott. M., Validation procedures for quantitative food allergen ELISA methods: community guidance and best pratices (2010) J

AOAC Int

WORKFLOW STATISTICO

Parametri Statistici di

PRECISIONE

RIPETIBILITA’Intralaboratorio

Deviazione Standard (Sr)

Deviazione Standard Relativa(RSDr)

RIPRODUCIBILITA’Interlaboratorio

Deviazione Standard (SR)

Deviazione Standard Relativa (RSDR)

Coefficiente di HORRAT (indice complessivo di buona precisione se tra 0,5 – 2)

HORRAT=------------RSDR%PRSDR% (dev. st. predetta)

Recovery (R)

(accettabile se tra 80% e 120%)

Z-scores (Z)

Z = ---------------------

(accettabile se tra -3 e +3)

scarto dalla media

dev. st.

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RISULTATI UOVO BISCOTTOACCURATEZZA

Recovery %: intervallo di accettabilità 80%-120%

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L0 L1 L2 L3 L4

RISULTATI UOVO POLPETTEACCURATEZZA


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RISULTATI LATTE BISCOTTOACCURATEZZA


Z-scores: intervallo di accettabilità -3 +3

L0 L1 L2 L3 L4

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RISULTATI LATTE POLPETTEACCURATEZZA


Z-scores: intervallo di accettabilità -3 +3

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CALCOLO DELLA PRECISIONE

Analogamente a quanto presentato per i valori di accuratezza, sono stati calcolati i parametri di PRECISIONE.

Nello specifico è stato effettuato il calcolo del coefficiente di HORRAT che viene considerato accettabile per un valore compreso tra 0.5 e 2.

Tale valore è stato perfettamente rispettato per il target proteine delle uova solo per il KIT della ditta C.

Per le proteine del latte i valori sono accettabili solo ad alcuni livelli di concentrazione

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INTERPRETAZIONE RISULTATI UOVO

In termini generali, le proteine delle uova sono risultate abbastanza stabili a processi di termizzazione, comunque i risultati migliori si sono ottenuti nei prodotti crudi (polpette)

I dati riportati nei grafici relativi al recupero percentuale(recovery) e alla bontàdel risultato analitico ottenuto rispetto al valore atteso sono differenti nei diversi kit testati.

L’analisi critica di tali valori ci permette di affermare che quello più idoneo èrisultato essere il kit della Ditta C in quanto ha un recupero percentuale lineare in tutti i livelli di contaminazione, una buona performance e Z-score accettabili sia nel target crudo, sia in quello sottoposto a cottura.

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INTERPRETAZIONE RISULTATI LATTEIn termini generali, le proteine del latte sono risultate piuttosto sensibili ai processi di termizzazione, comunque, anche in questo caso, i risultati migliori si sono ottenuti nei prodotti crudi (polpette)

I dati riportati nei grafici relativi al recupero percentuale (recovery) e alla bontà del risultato analitico ottenuto rispetto al valore atteso sono differenti nei diversi kit testati.

Il kit della Ditta D non è riuscito ad individuare correttamente nessun livello di contaminazione in nessun laboratorio, pertanto non è adatto agli scopi prefissati.

Il kit della Ditta E ha recovery molto basse che non riproducono quanto dichiarato nel bugiardino (lod in ppb).

I kit più idonei all’utilizzo routinario sembrano quelli delle Ditte C e A

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CANTILEVERSNano-biosensori meccanici

Sono costituiti da travi fissate ad una estremità

PRINCIPIO: sfruttano i cambiamenti delle loro proprietà meccaniche (risonanza delle leve) dovuti alla presenza/assenza di determinate molecole

Sensore

statico

dinamico

si muove per ‘reazione’ se intercetta la molecola a cui è sensibile, non per la modifica del peso

la leva si muove comunque, ciò che varia èla frequenza di risonanza che èinversamente proporzionale alla massa/peso, se intercetta qualcosa diventa quindi più lenta.

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CANTILEVERSMetodo innovativo

metodo meccanico e non chimico

per sondare interazioni di tipo molecolare

la presenza di un batterio o di un antigene fa cambiare la frequenza di risonanza

il sensore ‘comunica’ mediante un segnale laser, registrando la modifica della sua riflessione

Applicazioni:

Vantaggi:• analisi più precise

• campioni più piccoli

• rileva sostanze presenti in quantità minime

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L’attività dall’U.O. Polito :1) fabbricazione dei micro-cantilever (PoliTO);

2) sviluppo di tecniche di funzionalizzazione per

l’immobilizzazione di anticorpi selettivi sulla superficie dei

sensori (PoliTO, anticorpi forniti da InCura Srl);

3) messa a punto di un protocollo sperimentale per la

rivelazione di allergeni ( IZSTO,PoliTO, InCura Srl e

DISCAFF);

4) sviluppo di un sistema di lettura automatizzato

(IZSTO,PoliTO).

ATTIVITA’ SVOLTE NEL WP4: “CANTILEVER ”

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RISULTATI PRELIMINARI WP4

Il protocollo sperimentale per adattare il “Milk II Alert ELISA Kit” InCura Srl alla metodologia a cantilever.

Le soluzioni standard analizzate sono costituite da latte in polvere sospeso a concentrazioni variabili (0-1-6-30 ppm) in buffer contenente BSA oltre a Tween 20, PBS, Thimerosal e un inibitore delle proteasi. E successivamente, sono state utilizzate le medesime concentrazioni di cui sopra di caseine in PBS.

Sono in corso ulteriori valutazioni per accertare l’effettiva efficienza dell’anticorpo utilizzato su dispositivo cantilever.

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Liguria e Valle d’AostaCONCLUSIONICONCLUSIONI

• Importante testare nuove metodiche e rivelare possibili cross-reazioni e necessità di validare le metodiche di screening (Reg. CE 882/04)

• Ampliare allergeni da ricercare (rete IIZZSS) in applicazione Reg. 1169/11

• Stabilire requisiti minimi di performances per kit o per per metodi in house

• Limiti di legge

• Sviluppo e validazione di metodi di conferma (spettrometria di massa, pcr)

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0707IZS SICILIA 2012

0707IZS SICILIA 2011

--02IZSMEZ 2012

--010IZSUM 2012

--010IZSUM 2011

036040IZS PLV 2012

052059IZS PLV 2011

PositiviEseguitiPositiviEseguiti

MOLLUSCHICROSTACEI

CA

MP

ION

I ES

EG

UIT

I RE

TE IZ

ZSS

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ALLERGIE ALIMENTARI: STIMOLARE LA RICERCA PER TUTELARE IL CONSUMATORE

9 NOVEMBRE 2012 TORINO, Via Bologna, 148

Sala Conferenze

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