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Analisi degli alimenti tramite PCR Real-Time
Introduzione ad una tecnologia all'avanguardia
Obiettivi
Questa presentazione tratterà i seguenti argomenti:
• Quali sono le applicazioni della PCR Real-time?• Come funziona la PCR Real-time?• Che strumenti vengono usati?• Come si presentano i risultati di una Real-time?• Come possono essere usati questi dati per calcolare la
quantità di DNA?
Cos'è la PCR?
Qualsiasi essere vivente (batteri, piante, animali, virus, muffe, alghe) contiene acidi nucleici (DNA/RNA).
Anche alimenti e mangimi sono costituiti da esseri viventi.Gli acidi nucleici di un essere vivente possono essere
estratti utilizzando un metodo appropriato.
Pertanto, utilizzando il metodo appropriato, il DNA (o l'RNA) contenuto in alimenti e mangimi può essere
estratto e purificato dagli altri componenti.
Cos'è la PCR?
La Reazione Catena della Polimerasi (Polymerase Chain Reaction "PCR") è un processo che permette di copiare (amplificare in gergo tecnico) specifici frammenti di DNA (templato in gergo tecnico).
Grazie alla sua specificità, la reazione copia solo questi specifici frammenti di DNA, anche quando
sono dispersi in una moltitudine di altro DNA.Queste copie sono chiamate ampliconi
Cos'è la PCR?
DNA target (Templato)
DNA disperdente
PCR
Ampliconi
Cos'è la PCR?
Gli ampliconi possono essere marcati con degli specifici reattivi chimici che emettono fluorescenza in presenza di DNA.
La PCR quindi consente la rilevazione di DNA di
contaminanti indesiderati, anche se sono dispersi in matrici alimentari/mangimistiche ad abbondante
contenuto di DNA, grazie allo sviluppo di fluorescenza rilevata da un apposito strumento
Cos'è la PCR Real-time?
La PCR Real-time (qPCR) è una tecnica specializzata che permette di visualizzare in tempo reale la progressiva amplificazione di una reazione di PCR, attraverso uno strumento che rileva e misura la fluorescenza
Come vedremo, la PCR Real-time permette di misuraresequenze di DNA presenti in piccole quantità
all'interno di un campione
Le applicazioni della qPCR
La qPCR è diventata una pietra miliare della biologia molecolare nella ricerca di base e nelle diagnosi cliniche. Alcuni esempi di utilizzo: Analisi dell'espressione genica (es. ricerca sul cancro e sulle droghe) Diagnosi e gestione delle malattie (es. quantificazione della carica virale) Miglioramento genetico di animali e piante
Da un decennio la qPCR è anche utilizzata per l'indagine alimentare. Alcuni esempi di utilizzo: Identificazione di patogeni e di microorganismi alteranti Identificazione e quantificazione in percentuale degli OGM negli alimenti Verifica dell'autenticità dei prodotti alimentari Controllo e individuazione della presenza di allergeni nei prodotti alimentari Individuazione delle malattie negli animali da allevamento
Come funziona la PCR Real-time?• Per capire meglio la PCR Real-time, entriamo nel
dettaglio di come funziona in pratica un normale esperimento di PCR.
• Questo hamburger contiene soia anche se non è evidente?
Estrazione del DNA
DNA Soia
DNA disperdente: grano, sesamo,manzo, insalata, cipolla, pomodoro
Aggiungere il DNA estratto in
un tubo semplice(tubo PCR)
Aggiungere i reagenti PCR
nel tubo
Reagenti PCR:• Enzima DNA polimerasi• Primers• dNTPs• Buffer
Allestimento della reazione di PCR
Corsa della reazione PCR
Inserire il tubo PCR nello strumento
Reazione di amplificazione
Lo strumento avvia dei cicli di riscaldamento e raffreddamento dei reagenti presenti nel
tubo PCR
Durante ogni ciclo il templato si
duplica
Alla fine del processo (solitamente 30-40 cicli) la PCR ha amplificato la sequenza del DNA soia
Immaginiamo una PCR Real-time
Per capire meglio la PCR Real-time, proviamo ad immaginarci all'interno del tubo di reazione durante i cicli 23-24-25. Se partiamo da una singola copia di templato soia…
Un mix di reagenti PCR e 223 copie del
templato soia(8388608 copie)
Ciclo 23
Un mix di reagenti PCR e 224 copie del
templato soia(16777216 copie)
Ciclo 24
Un mix di reagenti PCR e 225 copie del
templato soia(33554432 copie)
Ciclo 25
Immaginiamo una PCR Real-time
Se dovessimo tracciare la quantità di DNA presente nel nostro tubo, dall'inizio dell'esperimento fino al ciclo 25, il grafico dovrebbe assomigliare a questo (curva logistica):
Ma…con l'avanzamento della reazione i reagenti si esauriscono progressivamente, di conseguenza questa crescita esponenzale non può continuare per sempre!
Ampl
icon
i
Cicli
Immaginiamo una PCR Real-time
La cinetica complessiva di una reazione PCR è una curva sigmoidale. Questa cinetica può essere monitorata utilizzando dei reagenti che emettono fluorescenza in presenza di DNA amplificato!
Fase di Plateau
Fase lineare
Fase esponenziale
Cicli
Ampl
icon
i
Strumento della Real-time PCR
Per una Real-time PCR occorrono TRE componenti principali:
1. Termociclatore (riscaldamento e raffreddamento del tubo PCR)2. Modulo ottico (rilevazione della fluorescenza nel tubo PCR)3. Computer (interpretazione dei dati di fluorescenza e loro
trasformazione in risultati comprensibili)
Dettaglio 3
Strumento della Real-time PCR
Gli strumenti per la Real-time PCR possono rilevare più di una fluorescenza contemporaneamente (multiplex), quindi:
1. Possiamo avviare più di una reazione nello stesso tubo sullo stesso campione e la cinetica di queste reazioni viene analizzata indipendentemente utilizzando differenti reporter di fluorescenza (per esempio possiamo verificare simultaneamente la presenza di soia e di sedano nel DNA estratto dall'hamburger).
2. Possiamo aggiungere in ogni reazione PCR un controllo interno di amplificazione (IAC) per osservare eventuali inibizioni ed evitare risultati falsi negativi
TargetIAC
Campione positivo Campione negativo Inibizione PCR
Calcolo delle quantità inReal-time PCRDal momento che la PCR segue una esatta cinetica nella
sua fase esponenziale:1. Ad ogni curva si può individuare il punto di intersezione con una
soglia arbitraria (threshold), valore definito "Valore Ct", ovvero il ciclo al quale la fluorescenza diventa significativamente rilevabile
2. L'aumento dei valori Ct è inversamente proporzionali alla quantità iniziale del DNA
3. Ad ogni ciclo di PCR si raddoppia la quantità di DNA rispetto al ciclo precedente (2n dove n=numero di ciclo): ad esempio un estratto di DNA diluito serialmente 10 volte mostrerà una distanza di 3,2 Ct tra una diluizione e l'altra (10=23,2)
threshold
Dal momento che è presente una corrispondenza tra distanza dei Ct e le diluizioni di DNA, la Real-time PCR consente una quantificazione accurata del target di interesse
Se abbiamo materiale standard quantificato disponibile possiamo
effettuare una curva di calibrazione traducendo quindi, attraverso interpolazione, una quantificazione relativa in una quantificazione assoluta, misurando così il campione incognito
Valo
reC
t
0 1 2 3 4 5 6 7
Logaritmo quantità
Punto Standard Campione incognito
Calcolo delle quantità inReal-time PCR
PCR Digitale
Con la PCR digitale il DNA estratto viene messo in piccole gocce, ogni singola goccia si comporta come un singolo tubo PCR
= DNA disperdente (15)
= DNA soia (5)
Risultati
1000 1000 1000 1000 1000
PCR Digitale
Se il DNA target è presente nella goccia, avviene la reazione PCR e si verifica la fluorescenza o in caso contrario rimane buio
Contando il numero di gocce fluorescenti possiamo
determinare il numero assoluto di DNA target presente nel campione di partenza (di seguito il grafico tipico)
= Gocce negative
= Gocce positive
pozzi