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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALTERAÇÕES DO METABOLISMO LIPÍDICO NO TECIDO
ADIPOSO EPIDIDIMAL DE RATOS EM CRESCIMENTO
SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTÉICA
Samyra Lopes Buzelle
Cuiabá – Mato Grosso
2010
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALTERAÇÕES DO METABOLISMO LIPÍDICO NO TECIDO
ADIPOSO EPIDIDIMAL DE RATOS EM CRESCIMENTO
SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTÉICA
Mestranda: Samyra Lopes Buzelle
Orientadora: Profa. Dra. Nair Honda Kawashita
Co-orientadora: Profa. Dra. Valéria Ernestânia Chaves
Cuiabá – Mato Grosso
2010
Dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde – Área de Concentração: Cirurgia, Nutrição e Metabolismo.
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA DESDE QUE CITADA A FONTE. CONTATO: [email protected].
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte
Catalogação na Fonte: Maurício S. de Oliveira – Bibliotecário CRB/1 1860
B923a Buzelle, Samyra Lopes.
Alterações do metabolismo lipídico no tecido adiposo epididimal de ratos em crescimento submetidos à restrição protéica / Samyra Lopes Buzelle. – 2010.
82 f.; il. color. ; 30 cm. -- (inclui figuras e gráficos).
Orientadora: Nair Honda Kawashita
Co-orientadora: Valéria Ernestânia Chaves
Dissertação (mestrado). Universidade Federal de Mato Grosso. Faculdade de Ciências Médicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências da saúde, 2010.
1. Rato. 2. Tecido adiposo. 3. Glicerol-3-fosfato-. 4. Ácido graxo. 5. Dieta hipoprotéica. 6. Metabolismo lipídico. I.Título.
CDU 613.2: 612.015.3
Aos meus pais JOSÉ BUZELLE e EDINEIA LOPES BUZELLE pelo exemplo de amor, coragem e perseverança, dedico.
A SAMUEL AUGUSTO CALDEIRA, por
estar sempre ao meu lado, com paciência, respeito e amor.
AGRADECIMENTOS
Profa. Dra. NAIR HONDA KAWASHITA, pela orientação, por sempre respeitar as dificuldades e individualidades dos seus alunos, por todos os valiosos conselhos e ensinamentos, pelo incentivo e dedicação, e pelo exemplo de amor à ciência.
Profa. Dra. VALÉRIA ERNESTÂNIA CHAVES , pela amizade,
respeito, incentivo e pela indispensável ajuda na realização deste trabalho. Agradeço principalmente pelo exemplo de disposição, solicitude e paciência.
Profa. Dra. AMANDA MARTINS BAVIERA , pela amizade, pelos
conselhos sempre valiosos e pela disponibilidade que me permitiram aprimorar conhecimentos protéicos.
AIR FRANCISCO COSTA , pelo seu calor humano e incansável apoio moral e logístico durante a minha estadia no laboratório.
Profa. Dra. ISIS DO CARMO KETTELHUT e Prof. Dr. LUI Z
CARLOS NAVEGANTES , pela oportunidade de estágio no Laboratório de Controle de Metabolismo, por permitir a realização de experimentos fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho e pelos valiosos ensinamentos.
MARIA ANTONIETA RISSATO GARÓFALO , pela indispensável
ajuda e ensinamentos na realização das técnicas lipídicas e pela paciência e disponibilidade em me acompanhar.
Profas. Dras. SALETE MARIA DA ROCHA CIPRIANO BRITO e
MARIA SALETE FERREIRA MARTINS , pelas importantes contribuições e pela disponibilidade na correção desta dissertação. Profa. Dra. MARIA HELENA GAÍVA , pelas importantes contribuições na qualificação.
SILVIA DE PAULA GOMES e LUCIANA CARVALHO , minha
eterna gratidão por me darem abrigo, carinho e confiança. Vocês estarão sempre na minha memória e no meu coração. DANUBIA FRASSON, pela paciência, pelos ensinamentos e pela ajuda nos experimentos.
PATRICIA CEOLIN, DANIEL DIAS FERES e CARLOS
DECHANDT , meus amigos queridos e companheiros de todas as horas. Meus eternos agradecimentos pelo apoio, amizade, confiança e compreensão. Torço por vocês.
Às colegas do mestrado ANDREZA MENEZES e MAYARA PERON pela excelente relação pessoal que criamos e pelas contribuições nos experimentos. PAULA BAVILONI, pela amizade, companheirismo e parceria de viagem.
Aos pequenos grandes pesquisadores CAROL, RAPHER, GUSTAVO,
ESTHER e DAMIANA , pela atenção, pela disposição em ajudar, e por tornar o laboratório muito mais alegre.
Aos meus queridos amigos não científicos LUCIANA LOPES,
ANDERSON BECKENKAMP e NOEMIA ALMEIDA , por sempre me ouvirem, pelo eterno apoio e compreensão, e por enfrentarem comigo mais este desafio, com amor agradeço. SUELLEN IARA GUIRRA ROSA pela amizade e companheirismo.
Prof. Dr. WANDER MIGUEL BARROS e Prof. Dr. ALEX
SEMENOFF SEGUNDO, por me mostrarem o caminho da ciência e por terem acreditado em mim desde o início.
SILVIA REGINA DE LIMA REIS e CELSO AFONSO e Laboratório
de Avaliação Biológica de Alimentos, pela colaboração e por todo o auxílio durante a realização deste trabalho, principalmente com as dietas.
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior, pela concessão da bolsa.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 1
2. OBJETIVOS................................................................................................................. 13
2.1 Objetivos gerais................................................................................................ 13
2.2 Objetivos específicos....................................................................................... 13
3. MATERIAIS E METODOS....................................................................................... 15
3.1 Animais e tratamento....................................................................................... 15
3.2 Determinação do conteúdo lipídico do TABE................................................. 17
3.3 Dosagem de catecolaminas sérica.................................................................... 17
3.4 Atividade da enzima lipase lipoprotéica (LPL)............................................... 18
3.5 Determinação da velocidade síntese de ácidos graxos de
novo........................................................................................................................
20
3.6 Determinação da velocidade de síntese de glicerol de TAG in vivo com 3H2O e glicose-U-14C.............................................................................................
22
3.7 Determinação do conteúdo de PEPCK por Western blotting.......................... 26
3.8 Atividade da gliceroquinase (GK)................................................................... 28
3.9 Determinação da atividade lipolítica................................................................ 29
3.9.1 Isolamento de adipócitos................................................................... 29
3.9.2 Lipólise.............................................................................................. 30
3.10 Velocidade de renovação de noradrenalina................................................... 31
3.11 Determinação do conteúdo do receptor β2-adrenérgico................................ 32
3.12 Quantificação dos componentes da via de sinalização da insulina................ 33
3.13 Análise estatística........................................................................................... 34
4. RESULTADOS............................................................................................................ 35
4.1 Dados gerais..................................................................................................... 35
4.1.1 Peso corporal, ingestão de dieta e água............................................. 35
4.1.2 Peso e conteúdo lipídico do TABE................................................... 38
4.1.3 Catecolaminas plasmáticas................................................................ 39
4.2 Atividade da LPL............................................................................................. 40
4.3 Velocidade de síntese de ácidos graxos de novo................................. 41
4.4 Velocidade de síntese de glicerol in vivo a partir de 3H2O e 14C-glicose......... 42
4.5 Conteúdo de PEPCK........................................................................................ 43
4.6 Atividade da GK.............................................................................................. 44
4.7 Atividade lipolítica in vitro ............................................................................. 45
4.8 Velocidade de renovação de noradrenalina no TABE..................................... 47
4.9 Conteúdo do receptor β2 adrenérgico.............................................................. 48
4.10 Conteúdo dos componentes da via de sinalização da insulina....................... 49
5. DISCUSSÃO................................................................................................................. 53
6. CONCLUSÃO.............................................................................................................. 60
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS α-MSH α-melanocyte-stimulating hormone
AG Ácido graxo
AgRP Agouti-related protein
AG-TAG Ácido graxo de triacilglicerol
AMP Adenosina monofosfato
ATGL Lipase de triacilglicerol dos adipócitos
ATP Adenosina trifosfato
CART Cocaine and amphetamine-regulated transcript
cAMP Adenosina 3’,5’monofosfato cíclico
DAG Diacilglicerol
DPM Desintegrações por minuto
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
G3P Glicerol-3-fosfato
GK Gliceroquinase
H Hipoprotéica
HP Hiperprotéica
HPLC High performance liquide chromatography
IR-β Receptor de insulina, subunidade beta
IRS1 Substrato do receptor de insulina 1
LHS Lipase hormônio sensível
LPL Lipase lipoprotéica
MAG Monoacilglicerol
mRNA RNA mensageiro
N Normoprotéica
NADPH Nucleotídeo de piridina reduzido
NPY Neuropeptídeo Y
PAT Perilipin, adipophilin/ adipocyte differentiation-related protein and tail-
interacting protein of 47 kA
PDE Fosfodiesterase
PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinase
PI3K Fosfatidil inositol quinase 3
PKA Proteína quinase A
PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluoride
PVDF Polifluoreto de vinilideno
SDS Duodecil sulfato de sódio
SNS Sistema nervoso simpático
STZ Streptozotocina
TAB Tecido adiposo branco
TABE Tecido adiposo branco epididimal
TAG Triacilglicerol
TAM Tecido adiposo marrom
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade
VRI Velocidade de renovação irreversível
RESUMO
Animais submetidos à restrição protéica apresentam aumento no conteúdo de lipídeos nos
depósitos adiposos e carcaça e alterações na composição corporal. Além disso, tem um
aumento nos níveis séricos de leptina e redução nos de insulina plasmáticos. O objetivo do
presente trabalho foi investigar o efeito da dieta hipoprotéica (H) no suprimento de ácidos
graxos (AG) e glicerol-3-fosfato (G3P) e na lipólise no tecido adiposo branco epididimal
(TABE) de ratos em crescimento. Previamente, demonstramos em nosso laboratório que a
dieta H induz aumento do peso e do conteúdo lipídico no TABE de ratos em crescimento. A
atividade simpática e a ação da insulina, dois fatores que controlam o metabolismo de lipídios
também foram investigados. O suprimento de AG foi determinado pela estimativa da: a)
atividade da lipase lipoprotéica (LPL) e b) síntese de novo avaliada pela incorporação de 3H
de 3H2O in vivo. O suprimento de G3P foi determinado pela estimativa da: a) síntese a partir
da glicose e da gliceroneogênese, avaliadas in vivo pela incorporação de 14C de 14C-glicose e 3H de 3H2O e b) fosforilação direta do glicerol que foi avaliada pela atividade da
gliceroquinase (GK). O conteúdo da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK), enzima
chave da gliceroneogênese foi avaliada por Western blotting. A atividade lipolítica foi
avaliada pela liberação de glicerol no meio de incubação na ausência ou presença de
noradrenalina. A dieta H induziu uma redução na atividade da LPL (~40%), mas não alterou a
síntese de novo de AG no TABE de ratos em crescimento. As vias de geração de G3P a partir
da glicose, gliceroneogênese e fosforilação direta do glicerol, no TABE não foram alteradas
nos ratos tratados com dieta H em relação aos tratados com dieta normoprotéica (N). O
conteúdo de PEPCK no TABE também não foi alterado pela dieta H. A lipólise basal foi
similar entre os adipócitos de ratos tratados com dieta N e H, mas a lipólise estimulada por
noradrenalina foi menor nos adipócitos de ratos tratados com dieta H. Esses dados sugerem
que o acúmulo de TAG no TABE é devido a uma menor responsividade do TABE às
catecolaminas. De fato, a dieta H induz um aumento na atividade simpática no TABE,
avaliada pelo turnover de noradrenalina, mas induz uma redução no conteúdo dos receptores
β2 avaliado por Western blotting. A dieta H não alterou o conteúdo de IRβ e AKT, mas
causou uma redução no conteúdo de of IRS-1 (~40%) e na fosforilação da AKT (~60%).
Esses achados poderiam explicar porque o suprimento de glicose da dieta não é acompanhado
do aumento da geração de G3P a partir da glicose e da síntese de AG.
Palavras-chave: rato, tecido adiposo, glicerol-3-fosfato, ácido graxo, dieta hipoprotéica,
metabolismo lipídico
ABSTRACT
The purpose of the present work was to investigate the effect of low protein (LP) diet on the
supply of fatty acid (FA) and glycerol-3-phosphate (G3P) and on lipolysis in the epididymal
(EPI) adipose tissue. Previously, our laboratory showed that the LP diet induces an increase in
the weight and lipid content in the EPI adipose tissue from growing rats. The sympathetic
activity and the insulin action, two factors that control the metabolism of lipids, also were
investigated. The supply of FAs was determinated by estimative of the a) lipase lipoprotein
activity, and b) de novo FA synthesis, evaluated by incorporation of 3H of the 3H2O in vivo.
The supply of G3P was determinated by the estimative of a) the glycolysis and
glyceroneogenesis, evaluated in vivo by incorporation of 14C of 14C-glucose 3H of the 3H2O,
and b) the direct phosphorylation of glycerol was evaluated by glycerokinase activity. The
phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) content, key enzyme of glyceroneogenesis,
was essayed by Western blotting. The lipolytic activity was essayed by glycerol release in the
medium incubation in presence or absence of norepinephrine. The LP diet induced a reduction
in the LPL activity (~40%), but did not affect the de novo FA synthesis in EPI adipose tissue
from growing rats. The pathways of G3P generation, glycolysis, glyceroneogenesis and direct
phosphorylation of glycerol, of EPI adipose tissue did not differ between LP diet-fed and
control rats. The PEPCK content in the EPI adipose tissue also was not changed by LP diet.
The basal lipolysis (nonstimulated) was similar between the adipocytes from rats fed a LP diet
and controls, but the lipolysis stimulated by norepinephrine was lesser in adipocytes from LP
diet-fed rats. These data suggest that the TAG accumulation in EPI adipose tissue is due to a
lesser responsiveness of tissue to catecholamines. In fact, the LP diet induces an increase in
the sympathetic activity, evaluated by norepinephrine turnover, in EPI adipose tissue, but
induce a reduction in the β2 receptors content (~70%), essayed by Western blotting. The LP
diet did not affect the content of IRβ and AKT, but caused reduction in the content of IRS-1
(~40%) and phospho-AKT (~60%), suggesting a possible peripheric resistence to insulin.
This finding could explain why the glucose supply of diet is not accompanied by increase in
the G3P generation from glucose and in the FA synthesis.
Key words: rat, adipose tissue, glycerol-3-phosphate, fatty acid, low protein diet, lipid
metabolism
1
1. INTRODUÇÃO
Classicamente, o papel fisiológico do tecido adiposo branco (TAB) é manter o
suprimento energético para outros tecidos. A síntese de triacilgliceróis (lipogênese) no
período alimentado e a sua quebra (lipólise) nos períodos de aumento da demanda energética
ou jejum, são cruciais para a manutenção do equilíbrio energético do organismo. A
quantidade de triacilgliceróis (TAG) armazenada nos adipócitos será determinada pelo
balanço entre a lipólise e a lipogênese.1,2
Os TAG nos adipócitos são armazenados em gotas lipídicas citosólicas uniloculares,
compostas de um centro de TAG e ésteres de colesterol, circundado por fosfolipídeos e
coberto por proteínas associadas.3 Muitas dessas proteínas são caracterizadas pela presença de
uma sequência de aminoácidos chamada de domínio PAT (perilipin, adipophilin/ adipocyte
differentiation-related protein and tail-interacting protein of 47 kA), sendo a perilipina, a
proteína quantitativa e funcionalmente mais importante.3,4
Os TAG são moléculas compostas de três ácidos graxos (AG) esterificados com uma
molécula de glicerol. Para a formação dos TAG, os AG podem ser provenientes da síntese de
novo a partir de acetil-CoA de diferentes substratos (glicose, aminoácidos), podem ser
captados pela ação da lipase lipoprotéica (LPL) sobre os quilomicrons e lipoproteínas de
muito baixa densidade (VLDL) circulantes, ou podem ainda, ser provenientes da lipólise no
próprio adipócito, cujos AG de TAG (AG-TAG) são parcialmente reesterificados. A taxa de
lipólise e a quantidade de AG reesterificados são parâmetros fundamentais para a definição da
quantidade de AG que serão liberados na circulação.2,5
Os processos que envolvem o ciclo de armazenamento e quebra de TAG são
altamente regulados, sendo que um excesso no acúmulo de TAG pode resultar em obesidade,6
um dos problemas de saúde mais prevalentes na sociedade moderna e que configura um fator
2
de risco para outras desordens metabólicas, incluindo resistência à insulina, diabetes tipo II e
as doenças cardiovasculares.4,7
A lipólise envolve uma classe de enzimas classificadas como hidrolases, sendo a mais
conhecida delas a lipase hormônio sensível (LHS), que atua principalmente como hidrolase de
diacilglicerol (DAG). Recentemente foi descoberta a desnutrina ou lipase de triacilglicerol
dos adipócitos (ATGL) com alta expressão e especificidade para TAG no TAB. Esses
achados levaram a uma nova compreensão da cascata lipolítica onde a ATGL inicia a lipólise
hidrolisando os AG de TAG para a produção de diacilglicerol (DAG), que subsequentemente
é hidrolisado pela LHS gerando outro AG e um monoacilglicerol (MAG). Finalmente, as
lipases de MAG finalizam a degradação, liberando o último AG e uma molécula de glicerol.4
Apesar de papéis distintos na hidrólise das reservas adiposas, a ATGL e LHS atuam
em cooperação e têm efeitos sinérgicos. Foi demonstrado que em ratos knockout para LHS, a
lipólise basal em jejum prolongado, não foi alterada, mas somente parte da lipólise estimulada
por catecolaminas era mantida.8 A regulação nutricional na atividade da ATGL demonstra sua
importância na mobilização dos estoques de TAG, sendo ativada em períodos de jejum e
inibida na realimentação.9 Outra forma de regulação desta enzima, ocorre em nível de RNA
mensageiro (mRNA), pelos glicocorticóides, que causam um aumento dose-dependente na
síntese da enzima em pré-adipócitos 3T3-L1.10
O controle da lipólise nos adipócitos é um processo bastante complexo e altamente
regulado por interações entre vários fatores. A regulação autócrina da lipólise é induzida por
substâncias produzidas pelas células adiposas ou do estroma vascular, como as
prostaglandinas, adenosina e citocinas, particularmente o fator de necrose tumoral α (TNF- α).
A leptina, hormônio sintetizado pelos adipócitos, tem entre seus efeitos autócrinos a
estimulação da lipólise. Em ratos db/db, que não expressam receptores de leptina a lipólise é
reduzida.11
3
A lipólise é um processo estimulado pelo sistema nervoso simpático (SNS) e por
hormônios como a adrenalina e o glucagon, que intensificam o processo da lipólise por
ativação das enzimas relacionadas a este processo. A ação das catecolaminas no TAB
depende principalmente do fluxo de adrenalina na circulação sanguínea e/ou de noradrenalina
via inervação simpática. A adrenalina e noradrenalina estimulam a lipólise através dos
receptores β adrenérgicos lipolíticos e a inibem através dos α2 antilipolíticos.9 Os receptores
α2 são encontrados de maneira significante e com predomínio em relação aos receptores β,
somente no tecido adiposo subcutâneo. Não se encontra esclarecido o papel fisiológico dos
receptores α2, ao contrário da bem estabelecida relevância fisiológica dos receptores β na
ativação da lipólise.12
FIGURA 1 – Ação lipolítica das catecolaminas.
A ação lipolítica das catecolaminas é mediada pelos receptores β1, β2 e β3
adrenérgicos, entretanto o β3 é o receptor predominante nos tecidos adiposos de ratos.13 A
interação das catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) com os receptores β, acoplados à
proteína G estimulatória (Gs), resulta em aumento da atividade adenilato ciclase, aumentando
os níveis intracelulares de adenosina 3’,5’monofosfato cíclico (cAMP) que leva a ativação da
4
proteína quinase A dependente de cAMP (PKA). A PKA é responsável por fosforilar a LHS e
a perilipina A, a principal proteína estrutural localizada na superfície da gota lipídica. A
perilipina A quando fosforilada facilita o acesso da LHS à gota lipídica e expõe a superfície
da gota para a ação das hidrolases que vão promover a hidrólise dos TAG em AG e glicerol
(figura 1).14 O glucagon estimula a atividade lipolítica aumentando diretamente a sinalização
do cAMP e ativação da PKA no TAB.15
A estimulação da lipólise através dos receptores β3 ocorre não somente pela via
adrenérgica clássica descrita acima, mas parte também por uma via independente de cAMP
que envolve a Src quinase, MKK1/2 e ERK. Não se sabe, a natureza exata dos substratos da
ERK envolvidos na ativação da lipólise por esta via.16
Ao contrário das catecolaminas a insulina inibe a lipólise pela fosforilação e ativação
da fosfodiesterase (PDE) específica do cAMP, a PDE-3, que catalisa a hidrólise do cAMP em
AMP, reduzindo os níveis de cAMP e como conseqüência impedindo a fosforilação da LHS e
a lipólise. Quando a insulina se liga ao seu receptor, ele é ativado pela fosforilação em um
resíduo de tirosina, o que causa a fosforilação em substratos intracelulares, os IRS 1 e 2 e a
ligação na subunidade regulatória p85 da fosfatidil inositol quinase-3 (PI3K). Essa ligação
estimula a fosforilação pela PI3K tanto da subunidade regulatória p85 quanto da catalítica
p110. Essa etapa é seguida pela fosforilação da proteína quinase B/Akt e ativação da PDE-3B,
a enzima que cataliza a degradação do cAMP.9
A ação inibitória dos receptores adrenérgicos α2 se faz também pela redução dos
níveis de cAMP, embora esta redução seja decorrente da inibição da adenilato ciclase que
catalisa a formação do cAMP a partir do ATP. Esta inibição é feita pela associação dos
receptores α2 à proteína G inibitória (Gi) e não a Gs como ocorre com os receptores β (figura
1).12
5
Existem, portanto, duas categorias principais de agentes antilipolíticos: a) os que
atuam nos receptores de sete domínios transmembrana acoplados à proteína G inibitória (Gi) e
b) os que ativam receptores com atividade tirosina quinase. Os principais receptores
antilipolíticos acoplados à proteína Gi envolvem os α2 adrenérgicos, receptores do ácido
nicotínico, de prostaglandina E2, adenosina-A1 e Y1 neuropeptídio Y/peptídeo YY. A
insulina e fator de crescimento insulínico 1 são os típicos receptores antilipolíticos com
atividade tirosina quinase.9
A inibição da lipólise não é o único efeito da resposta anabólica da insulina no TAB.
A insulina estimula também a lipogênese, sendo o hormônio mais importante envolvido em
sua regulação. Os efeitos da insulina após sua ligação com os receptores tirosina quinase vão
iniciar a cascata de transdução de sinal, que vão culminar simultaneamente com o
recrutamento dos transportadores de glicose GLUT-4 para a membrana e o aumento da
expressão e/ou ativação por modificação covalente das enzimas da via glicolítica e da
lipogênese.17,18,19
FIGURA 2 – Controle da lipólise e lipogênese.
6
A relação insulina/glucagon é um dos pontos de controle do balanço entre lipólise e
lipogênese. Em situações como o jejum, onde há uma redução na relação insulina/glucagon a
hidrólise dos TAG está aumentada, devido a elevação na sinalização dependente de
cAMP.15,20
Como descrito anteriormente, a formação dos TAG utiliza não só AG sintetizados de
novo, mas também AG pré-formados, provenientes não só da quebra dos TAG endógenos,
mas também da captação dos AG presentes na forma de TAG nas lipoproteínas circulantes.
Trabalhos anteriores21 mostram que no TAB epididimal e retroperitoneal de ratos adaptados à
dieta hiperprotéica (HP) livre de carboidratos, a fração de AG-TAG formados a partir da
síntese de novo, se constitui numa pequena fração, sendo que a maior parte dos TAG é
formada a partir dos AG pré-formados. Em humanos tem sido demonstrado que a maior parte
dos AG armazenados em TAG no TAB é proveniente da corrente sanguínea, sendo apenas
uma pequena fração sintetizada pelo tecido, mesmo após a ingestão de uma dieta
hiperglicídica.22 A captação destes AG é dependente da LPL, enzima encontrada na parede
dos capilares, que atua sobre os TAG presentes nas lipoproteínas, liberando os AG, que serão
esterificados ao glicerol dentro dos adipócitos para a formação do TAG (figura 2). A insulina
favorece também este processo, pela ativação da via da PI3K aumentando a atividade e a
expressão da LPL no TAB com aumento nos níveis de mRNA da enzima.23
Além dos AG, a formação de TAG e o perfeito funcionamento do TAB, dependem da
disponibilidade de glicerol-3-fosfato (G3P) para a esterificação dos AG. Este G3P pode ser
sintetizado a partir da glicose, da fosforilação direta do glicerol pela gliceroquinase e através
de intermediários de três carbonos (lactato, piruvato e alanina) pela via gliceroneogênica
(figura 3).7
7
FIGURA 3 – Vias de formação de glicerol-3-fosfato no TAB.
A via de síntese de G3P a partir da glicose é a via classicamente conhecida tanto no
TAB como no tecido adiposo marrom (TAM), sendo a glicose degradada pela via glicolítica
até diidroxiacetona fosfato, seguido de redução a G3P pela glicerol-3-fosfato desidrogenase.
A geração de G3P pela fosforilação do glicerol pela gliceroquinase (GK), até
recentemente, foi considerada desprezível no TAB, tendo em vista a reduzida atividade desta
enzima neste tecido, quando comparado ao fígado. No entanto, estudos mais recentes
mostram que embora reduzida em relação aos outros tecidos, a atividade da GK no TAB é
mensurável, podendo variar em diferentes situações metabólicas. Animais submetidos à dieta
HP livre de carboidratos têm uma reduzida atividade da GK no TAB retroperitoneal,24
enquanto um aumento de 120% na atividade da GK foi observado no TAB retroperitoneal de
animais adaptados à dieta cafeteria quando comparado ao dos animais submetidos à dieta
balanceada.25 Há trabalhos na literatura que mostram também que a GK se encontra
aumentada em alguns tipos de obesidade, como em camundongos obesos ob/ob e ratos Zucker
fa/fa.26 A importância da GK pode ser observada em um estudo que demonstra que
8
camundongos knockout para o gene da gliceroquinase não sobrevivem por mais de quatro dias
depois de nascidos.27
Além da via de fosforilação do glicerol pela GK e a via de formação de G3P a partir
da glicose, o G3P pode ser sintetizado a partir de precursores não glicídicos pela
gliceroneogênese. As primeiras observações sobre esta via foram feitas ao final da década de
60 e início da década de 70,28,29,30,31 com a constatação de que o TAB epididimal de ratos era
capaz de converter in vitro lactato, piruvato, e aminoácidos glicogênicos em glicerol de TAG.
O fato de estas observações terem sido realizadas no tecido adiposo de animais jejuados e
diabéticos, foi interpretado por Reshef et al. (1970)30 como um mecanismo de redução na
liberação de AG-TAG com a finalidade de prevenir a formação de corpos cetônicos e
consequentemente a acidose, características destas duas situações metabólicas.
Posteriormente, Botion et al. (1998)21 utilizando técnica de dupla marcação (3H2O e –
glicose-U-14C) refutaram a hipótese de Reshef sobre a importância funcional desta via, ao
constatar que ratos adaptados à dieta HP sem carboidratos e com reduzida lipólise
apresentavam aumentada gliceroneogênese. O aumento desta via foi interpretada pelos
autores, como um mecanismo para garantir a geração de G3P, numa situação de baixa
disponibilidade de glicose, assegurando assim, a esterificação dos AG e manutenção dos
depósitos de TAG. Estes animais não apresentavam alteração na ingestão calórica32, mas
apresentavam uma redução de 10-20% do conteúdo de AG totais da carcaça33, apesar de
ingerirem uma dieta isocalórica isenta de carboidratos. Outro aspecto importante destes
estudos foi a constatação de que mesmo em animais com dieta balanceada, a contribuição da
gliceroneogênese era maior (56%) do que a contribuição da glicose (44%) na formação de
G3P no TAB.21 A ocorrência e a importância desta via, também foram demonstradas no
TAM 34 e fígado.21 Aprofundamentos no estudo desta via identificaram a fosfoenolpiruvato
carboxiquinase (PEPCK), considerada inicialmente uma enzima exclusivamente
9
gliconeogênica, como enzima chave também da gliceroneogênese e que catalisa a conversão
de oxaloacetato, um intermediário do ciclo de Krebs, a fosfoenolpiruvato. Animais
geneticamente modificados foram fundamentais nestes estudos, possibilitando a constatação
de que camundongos com deleção gênica para PEPCK apresentam redução da gordura e
aumento da mobilização de AG-TAG do TAB35, enquanto camundongos que superexpressam
esta proteína apresentam alta atividade gliceroneogênica e obesidade.36
A transcrição do gene da PEPCK no TAB requer vários fatores de transcrição que
incluem o PPARγ e C/EBPα. A transcrição do gene da PEPCK citosólica (PEPCK-C) no
TAB é induzida por cAMP e inibida por glicocorticóides e insulina.37 Os AG-TAG liberados
durante a lipólise ativam o PPARγ e induzem a transcrição do gene da PEPCK-C,
aumentando as taxas de re-esterificação em TAG.38
As três vias de geração de G3P acima descritas, se alternam, garantindo a formação
deste metabólito em diferentes condições metabólicas. No estado pós-prandial, onde ocorre
maior taxa de síntese de TAG, quando os ácidos graxos da dieta são esterificados a TAG
principalmente no tecido adiposo, grande parte do G3P é sintetizado a partir da glicose. Esse
processo é estimulado pela insulina, que aumenta a captação e oxidação da glicose nos tecidos
para garantir a disponibilidade de ATP e de G3P requerido para a síntese de TAG.37
Entretanto, durante o jejum, quando a lipólise é induzida por uma baixa relação
insulina/glucagon, a disponibilidade de glicose para a síntese de G3P é limitada, já que a
glicose é requerida por tecidos como cérebro e hemácias. Neste caso, a gliceroneogênese é
fundamental para a geração de G3P. Em ratos tratados com a dieta HP livre de carboidratos, a
síntese de G3P a partir da glicose corresponde a apenas 21% do total.21
Em suma, o tamanho do depósito de TAG é resultante da interação dos vários
processos descritos (lipólise, disponibilidade de AG, formação de G3P), que são determinados
pelo conjunto de alterações hormonais, metabólicas e neurais estabelecido para cada situação
10
nutricional. A utilização de modelos experimentais submetidos a dietas específicas ao
promoverem a alteração destes parâmetros podem contribuir para a compreensão dos
mecanismos regulatórios dos mesmos.
Ratos machos em fase de crescimento submetidos à restrição protéica
O estado nutricional é dependente da qualidade e da quantidade de nutrientes
disponibilizados na dieta. Alterações na sua composição em relação a uma dieta balanceada
(adequada à fase de vida em que se encontra o indivíduo) podem levar a alterações
energéticas e metabólicas importantes.
A literatura mostra dados divergentes e até mesmo contraditórios sobre os efeitos da
redução de proteína na dieta,39,40,41,42 divergências e contradições estas que se jutificam, à
medida que dependem de vários outros parâmetros, como: o grau de restrição protéica, o
tempo de restrição e a fase da vida em que ela ocorre.
Uma resposta comum de adaptação dos organismos à redução de proteínas é a
modificação do padrão de consumo alimentar. Relatos de aumento e diminuição são
encontrados na literatura. No entanto, há um consenso de que em uma situação de aumento no
gasto energético, associado à restrição protéica que não se afaste muito do requerimento do
animal, há um aumento na ingestão alimentar.39,40,41,43,44 Este aumento no consumo parece ser
uma tentativa dos organismos submetidos à esta condição, de compensar a necessidade
protéica.39,41,45 O fato de não haver maneira de estocar aminoácidos no organismo, sugere que
a compensação se dê através da busca de mais proteínas ou aminoácidos, na tentativa de
alcançar o requerimento protéico, até que os sinais neurais e plasmáticos de saciedade sejam
alcançados.40 Diferentemente do que ocorre com a ingestão alimentar, existe um consenso de
que a restrição protéica leva ao aumento do conteúdo lipídico.
11
O nosso modelo experimental foi estabelecido por França et al (2009)39, utilizando
ratos em crescimento submetidos à uma dieta com 6% de proteína (compensada com
carboidratos) por 15 dias, e partiu da premissa de que se trata de uma restrição protéica
moderada numa fase em que ocorre aumento no gasto energético estimulando a ingestão
alimentar.42 O requerimento protéico de ratos em crescimento se situa em torno de 15%,
enquanto que nos adultos cai para 5%.46 Já foi demonstrado que um nível de restrição de 10%
por 12 dias, ocasiona aumento da ingestão em ratos jovens (≈190g)40, assim a oferta de uma
dieta com 6% de proteína aos nossos animais na fase de crescimento, garante um nível
moderado de restrição, onde os parâmetros de aumento da ingestão e maior acúmulo de
depósitos adiposos são alcançados.39
Resultados prévios com estes animais motivaram a continuidade dos estudos sobre o
metabolismo lipídico, uma vez que eles tiveram um ganho energético com alterações
profundas na composição corporal, com redução de proteínas e água, aumento de gordura na
carcaça e no peso e conteúdo de lipídeos nos depósitos de tecido adiposo branco e marrom.
Estes animais apresentaram aumento aproximado de 100% nos níveis de corticosterona e
leptina séricos, sem alterações nos de glucagon. Os baixos níveis de insulina plasmática e
altos níveis de leptina não induzem mudanças na glicemia pós-prandial; entretanto, no jejum
os animais alimentados com a dieta hipoprotéica (H) apresentam níveis de insulina igual aos
dos animais com dieta balanceada com redução na glicemia.39
Um complexo sistema mantém a homeostase energética corporal. A ingestão alimentar
é ajustada em resposta a mudanças na necessidade energética. Há uma comunicação entre os
depósitos de gordura corporais e o sistema nervoso central por meio de moléculas
sinalizadoras que chegam ao cérebro pela circulação sanguínea e vão ativar núcleos
orexígenos ou anorexígenos.47
12
Hormônios como a insulina e a leptina, juntamente com os nutrientes disponíveis na
circulação, indicam a quantidade de energia armazenada. Todos esses sinais agem em
diferentes locais no sistema nervoso central, com as vias convergindo para o hipotálamo, que
contém uma grande quantidade de peptídeos e neurotransmissores que regulam a ingestão
alimentar. Quando a quantidade de TAG nos depósitos adiposos está baixa, o TAB reduz a
secreção de leptina, que sinaliza para um aumento na produção pelo hipotálamo de
neurotransmissores orexígenos, como o neuropeptídio Y (NPY) e agouti-related protein
(AgRP) e diminuição de anorexígenos como α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH) e
cocaine and amphetamine-regulated transcript (CART).47,48
Em ratos jovens submetidos à restrição protéica de 10%, a liberação basal de NPY
pelo tecido hipotalâmico in vitro foi maior do que em ratos alimentados com dieta contendo
20% de proteína.40 Nos ratos tratados com a dieta H, como descrito anteriormente, o nível
plasmático de leptina é duas vezes maior do que a encontrada em animais submetidos à dieta
normoprotéica, apesar da maior quantidade de lipídeos armazenados,39 o que sinaliza pra uma
resistência à leptina nesses animais.
O acúmulo de lipídeos observado nos animais H, acompanhado de aumento na
ingestão calórica apesar dos altos níveis de leptina os torna um ótimo modelo para o estudo do
metabolismo de lipídeos, podendo trazer importante contribuição para a compreensão da
obesidade humana.
Tendo em vista que as abordagens nutricionais para o combate à obesidade não têm
sido eficazes, o interesse na regulação do metabolismo de lipídios se torna fundamental para a
identificação de alvos moleculares do armazenamento lipídico e desenvolvimento de
estratégias para o controle da redução de depósitos adiposos.
13
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
O objetivo deste trabalho foi avaliar a síntese de ácidos graxos e glicerol, bem como a
atividade lipolítica e a sinalização insulínica no tecido adiposo branco epididimal (TABE) de
ratos em crescimento adaptados à dieta hipoprotéica (H) por 15 dias.
2.2 Objetivos específicos
1. Confirmar os dados obtidos por França et al. (2009)35 em animais na fase de
crescimentos submetidos à dieta H, modelo experimental utilizado neste trabalho.
� Acompanhamento da evolução do peso corporal
� Acompanhamento da ingestão de água e alimento
� Determinar o peso e o conteúdo lipídico do TABE
2. Determinar o conteúdo plasmático de noradrenalina e adrenalina
3. Avaliar a origem dos AG esterificados em TAG no TABE
� Determinação da atividade da LPL
� Determinação da velocidade de síntese de AG total in vivo pela
incorporação de 3H de 3H2O
4. Avaliar as vias de geração de G3P
� Determinação da velocidade de síntese de glicerol-TAG in vivo com 3H2O e
glicose-U-14C para avaliar as vias de síntese a partir da glicose e da
gliceroneogênese
� Determinação do conteúdo da PEPCK para avaliar a via da
gliceroneogênese
� Determinação da atividade da gk para avaliar a geração de G3P de TAG
pela fosforilação direta do glicerol
14
5. Avaliar a atividade simpática no TABE
� Determinação da velocidade de renovação de noradrenalina
6. Avaliar a atividade lipolítica
� Determinar a lipólise basal in vitro
� Avaliar a resposta lipolítica à noradrenalina in vitro
� Determinar o conteúdo de receptores β2 no TABE
7. Avaliar o conteúdo dos componentes da via de sinalização da insulina no TABE
� Determinar o conteúdo total de IRβ, IRS-1 e AKT
� Determinar os níveis de fosforilação de AKT (ser-473)
15
3. MATERAIS E MÉTODOS
A parte experimental foi desenvolvida no Laboratório de Bioquímica-Pesquisa do
Departamento de Química, vinculado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). Os experimentos de dosagem de
catecolaminas plasmáticas, velocidade de renovação de noradrenalina e determinação da
velocidade de síntese de glicerol de TAG in vivo com 3H2O e glicose-U-14C foram realizados
no Laboratório de Controle do Metabolismo, na Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo em Ribeirão Preto - SP (FMRP-USP). Os experimentos foram conduzidos com
base nos princípios de boas práticas de laboratório e procedimentos científicos, de acordo com
as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e com a
aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFMT sob protocolo nº
23108.029611/09-7.
3.1 Animais e tratamento
Foram utilizados experimentalmente ratos machos albinos (Rattus norvegicus) da
linhagem Wistar, provenientes do Biotério Central da UFMT. Antes do início do período
experimental, os animais passaram por uma ambientação de dois dias no biotério pertencente
ao Laboratório de Bioquímica Pesquisa, acomodados em caixas de polipropileno e recebendo
água e ração Labina (Purina, Paulínia, SP, Brasil) ad libitum.
Os animais apresentavam no início dos experimentos aproximadamente 30 dias de
vida e peso entre 90-100g. Durante o período experimental os animais foram mantidos
individualmente em gaiolas metabólicas e ciclo claro/escuro de 12 horas, à temperatura de 24
± 2ºC e umidade de ± 55% em suas respectivas dietas (normoprotéica ou hipoprotéica),
recebendo água e alimento ad libitum. O peso corporal e a ingestão de água e alimento foram
16
monitorados a cada dois dias. Todos os experimentos foram realizados com animais
alimentados e iniciados sempre às 7:00 horas.
Foram estabelecidos dois grupos experimentais: o grupo N que recebeu dieta
normoprotéica contendo 17% de proteína e o grupo H que recebeu dieta hipoprotéica
contendo 6% de proteína por um período de 15 dias. As diferenças calóricas ocasionadas pela
redução protéica na dieta H foram compensadas com o equivalente em carboidratos,
mantendo-as isocalóricas (16,3 kJ/g). A dieta normoprotéica segue as recomendações do
Instituto Americano de Nutrição (AIN-93G)49 para roedores em fase de crescimento, prenhez
ou lactação.
Tabela 1 – Composição da dieta normoprotéica e hipoprotéica (g/kg).
Ingredientes
Dieta Normoprotéica (17% de proteína)
g/kg
Dieta Hipoprotéica (6% de proteína)
g/kg Amido 397,5 480 Dextrina 132 159 Sacarose 100 121 Caseína (84% de proteína)* 200 71,5 Óleo de Soja 70 ml 70 ml Fibra 50 50 Mistura de Sais (AIN – 93G)** 35 35 Mistura de Vitaminas (AIN – 93G)** 10 10 L – cistina 3 1 Bitartarato de Colina 2,5 2,5 * Valores corrigidos em função da quantidade de proteína determinada. ** Composição detalhada por Reeves, Nielsen e Fahey (1993).49
As dietas foram preparadas em forma de pó, com os ingredientes pesados em balança
analítica (Marte A500), peneirados em malha 200 e homogeneizados manualmente. As dietas
foram preparadas em quantidade suficiente para todo o período experimental e armazenadas
em recipientes de polipropileno sob temperatura de 5º C.
Em todos os experimentos, o peso corporal e o consumo da dieta durante o período de
15 dias foram acompanhados, confirmando a reprodutibilidade dos dados obtidos por França
et al. (2009)39 para este modelo experimental.
17
Os animais foram eutanasiados sempre por deslocamento cervical e os tecidos
adiposos brancos epididimais (TABE) coletados e pesados após laparotomia mediana. Nos
experimentos em que o tecido não foi utilizado no momento da retirada, seguiu-se o
congelamento em nitrogênio líquido e armazenamento a -80ºC.
3.2 Determinação do conteúdo lipídico do TABE
A extração foi realizada pelo método de Folch et al. (1957).50 O TABE foi
homogeneizado em clorofórmio:metanol (2:1). Em seguida, o material foi filtrado utilizando
papel Whatman nº 1 e ao filtrado foi adicionado água deionizada. Após separação da fase
clorofórmica e aquosa, uma alíquota da fase clorofórmica foi transferida para tubos
previamente pesados, para evaporação à 50˚ C. A quantificação da gordura foi obtida pelo
método gravimétrico.
3.3 Dosagem de catecolaminas sérica
Para a dosagem de adrenalina e noradrenalina no plasma, o sangue de animais
alimentados foi coletado em tubos com heparina e centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos
para a obtenção do plasma. Foram transferidos 0,5 ml do plasma acrescidos de 10 mg de
metabissulfito de sódio para tubos plásticos que foram centrifugados a 5000 rpm durante 10
min à 4ºC. O sobrenadante foi transferido para outro tubo, contendo tampão Tris 24,2% (pH
8,9), 0,5% de metabissulfito de sódio, 2,5% de EDTA, 50 mg de alumina previamente
ativada a 100ºC durante 30 minutos e 20 µl do padrão interno diidroxibenzilamina diluído 100
vezes.
As amostras permaneceram sob agitação constante por 20 minutos e foram
posteriormente centrifugadas a 1000 rpm por 1 minuto. Descartado o sobrenadante, a alumina
18
foi lavada por duas vezes com uma solução contendo 0,004% de EDTA, 0,02% de
metabissulfito de sódio e 0,06% de Tris. As catecolaminas foram extraídas da alumina pela
adição de 0,5 ml de solução eluidora contendo ácido perclórico 0,86 N, metabissulfito de
sódio 0,019% e EDTA 0,02%, seguida de agitação constante por 10 minutos.51 O
sobrenadante foi utilizado para a determinação do conteúdo de adrenalina e noradrenalina por
cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em um cromatógrafo modelo LC-7A,
equipado com uma coluna de fase reversa Spherisorb ODS-II (Sigma-Aldrich), acoplado a um
detector eletroquímico modelo L-ESD-6A e um polígrafo modelo C-R5A, todos da marca
Shimadzu.
3.4 Atividade da enzima lipase lipoprotéica
A determinação da atividade da lipase lipoprotéica (LPL) foi baseada no método de
Nilsson-Ehle e Schotz (1976)52, fundamentada na reação:
TAG (glicerol tri[1-14C]oleato) LPL glicerol + (14C-oleato)
O TAB epididimal foi homogeneizado em sacarose 250 mM, EDTA 1 mM e heparina
20 U/mL (pH 7,4) na proporção de 100 mg de tecido:1 ml de tampão. O homogenado foi
centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos a 4°C e o sobrenadante, abaixo da camada
gordurosa, foi utilizado para determinação da atividade da LPL.53
O substrato, contendo 78 µmol de trioleína, 4 mg de lisolecitina em clorofórmio e 12,5
µCi de glicerol tri[1-14C]oleato em tolueno (Amersham, Sunnyvale, CA, USA) foi preparado
no dia anterior ao ensaio. Os solventes orgânicos foram evaporados sob corrente de nitrogênio
à temperatura ambiente. Após a adição de 5 ml de glicerol a mistura foi homogeneizada
vigorosamente em vórtex.
19
Para o ensaio, a mistura de reação foi preparada, contendo duas partes de substrato,
duas partes de tampão para LPL (Tris 0,2 M, pH 8,8, albumina bovina livre de ácidos graxos
6% e NaCl 0,15 M) e uma parte de soro de rato jejuado por 36 horas. O soro é fonte de
apolipoproteina C-II, um co-fator requerido para a ativação da enzima.
Além dos ensaios contendo a amostra, foram realizados ensaios sem a adição da
amostra (Branco) e tubos contendo além da amostra, NaCl 5M, um inibidor da LPL (Inibido).
Em todos os tubos foram adicionados 100 µL da mistura de reação. No tubo branco foram
acrescentados 150 µL de água destilada, no tubo inibido 50 µL de NaCl 5 M e no
desconhecido 50 µL de água destilada. Após agitação em vórtex e pré-incubação a 37ºC por
15 minutos sob agitação, foram acrescentados 100 µL da amostra nos tubos inibidos e nos
tubos contendo a amostra. A incubação foi mantida por 60 minutos a 37ºC sob agitação (80
ciclos por min) em banho metabólico. A reação foi interrompida com a adição de 3,25 mL da
mistura de extração de VAUGHAN54 (clorofórmio-heptano-metanol 1,25:1,1:1,41)] seguido
de agitação em vórtex. Em seguida, foi adicionado 1 mL de tampão carbonato-borato 0,1 M
(carbonato de potássio 0,05 M e ácido bórico 0,05 M) pH 10,5 e o tubo de reação foi
novamente agitado em vórtex seguido de centrifugação a 500 rpm por 15 min. Alíquotas de
0,8 mL da fase aquosa superior foram transferidas para frascos de cintilação contendo 9 ml de
líquido de cintilação (SX20-5, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) para contagem da
radioatividade em contador de cintilação Tri Carb 2100 TR (Packard, Walthan, MA, USA).
Para o cálculo da atividade da enzima, o DPM da amostra foi subtraído pelo DPM do inibido.
A atividade enzimática da LPL foi expressa em nmol de ácido oléico liberado por minuto por
miligrama de proteína. A dosagem de proteína foi realizada pelo método BCA (Bicinchoninic
acid – Sigma, St Louis, MO, USA).55
20
3.5 Determinação da velocidade de síntese de ácidos graxos de novo
A síntese de AG de novo foi avaliada in vivo pela incorporação de trítio (3H) da água
tritiada (3H2O) em ácidos graxos. A metodologia se baseia na premissa de que a 3H2O se
distribui pelo organismo juntamente com a água corporal e mantém sua atividade específica
constante por longos períodos de tempo, tanto no plasma quanto nos tecidos. Durante a
síntese de ácidos graxos, o 3H é incorporado em ligações estáveis C-H, por meio da troca de
3H com os H dos nucleotídeos de piridina reduzidos (NADPH).56
Para a determinação da síntese de ácidos graxos in vivo, foram administrados 3 mCi
de água tritiada (Amersham) por animal por via intraperitoneal. Uma hora após a injeção os
animais foram eutanasiados por decapitação. O sangue foi coletado em tubos heparinizados e
centrifugados a 2500 rpm por 15 minutos a 4ºC para a obtenção do plasma. Os TAB
epididimais foram retirados, pesados e homogeneizados em mistura clorofórmio: metanol
(2:1) para a extração dos lipídios, transferidos para provetas de vidro e o volume foi
completado para 10 ml com a mesma mistura.50 Após a extração, o material foi filtrado em lã
de vidro, e ao filtrado foi adicionado água deionizada na proporção 1:5. A fase superior foi
descartada, e a fase clorofórmica inferior foi lavada três vezes com mistura de fase superior
composta de clorofórmio, metanol e mistura de sais (0,528 g de CaCl2.H20; 0,732 g de
MgCl2.6H2O; 5,8 g de NaCl em 940 ml de H2O) nas proporções 21,1: 337: 330. Para o
isolamento de ácidos graxos, foi retirada uma alíquota de 4 ml, de onde foi evaporado todo o
clorofórmio em banho maria a 50ºC. Após a adição de 20 ml de KOH etanólico (1 ml de
KOH 14,5 M + 20 ml de álcool etílico), os tubos foram tampados e levados ao banho maria a
80ºC por duas horas para a saponificação dos lipídios. Após esse período, os tubos foram
mantidos destampados no banho a 50ºC para a evaporação do álcool etílico. O material
saponificado foi então lavado três vezes com 8 ml de éter de petróleo para a remoção dos
lipídio não saponificáveis. Posteriormente a amostra foi acidificada com ácido perclórico a
21
6%. Os ácidos graxos foram extraídos com éter de petróleo e transferidos para frascos de
cintilação, de onde o éter foi evaporado. Após a evaporação, foram adicionados 10 ml de
coquetel de cintilação. Para a determinação da atividade específica do trítio no plasma, o
mesmo foi diluído 20 vezes em água deionizada, e uma alíquota de 10 µl da diluição foi
transferida para frasco de cintilação com 10 ml de coquetel de cintilação. A radioatividade no
plasma e a incorporada na fração dos ácidos graxos teciduais foi medida em contador de
cintilação Tri Carb 2100 TR.
A velocidade da síntese de ácidos graxos de novo foi calculada pela seguinte fórmula:
O cálculo se baseia nos trabalhos de Windmueller e Spaeth (1966)56. A atividade
específica da água tritiada (DPM de 3H ÷ mL de H2O) é obtida a partir da radioatividade
plasmática, considerando que cada mL de plasma contém 0,94 mL de água. O fator 109 ÷13,3
corrige a discriminação isotópica e converte átomo-grama de hidrogênio em nmol de ácidos
graxos com 16 átomos de carbono sintetizados. O cálculo pressupõe que metade de todos os
átomos de hidrogênio são provenientes da água. Esta técnica estima a síntese de ácidos graxos
a partir de todas as unidades de dois carbonos, independente do tipo de substrato utilizado.
3.6 Determinação da velocidade de síntese de glicerol de TAG in vivo com 3H2O e
glicose-U-14C
A velocidade de síntese de glicerol total, a partir da glicose e pela gliceroneogênse in
vivo foi determinada em um mesmo animal. A síntese a partir de glicose foi avaliada pela
incorporação de 14C de glicose-U-14C e a síntese total de glicerol pela incorporação de 3H de
22
3H2O. A velocidade da gliceroneogênese foi avaliada pela diferença entre a síntese total e a
síntese a partir da glicose.
A administração de 3H2O e glicose-U-14C foi realizada via endovenosa por meio de
cânula implantada previamente na veia jugular direita, dois dias antes do experimento,
conforme descrito por Harms e Ojeda (1974).57 Cada animal recebeu 3 mCi de 3H2O e 10µCi
de glicose-U-14C diluídos em 0,5 mL de solução salina. Após administração dos
radioisótopos, amostras de 200 µL de sangue foram coletadas em tubos heparinizados nos
tempos 1, 5, 15, 30 e 60 minutos, para obtenção do plasma. Nas amostras de plasma foram
realizadas as seguintes medidas: a) concentração de glicose nas amostras de todos os tempos,
pelo método da glicose oxidase (Kit Labtest, Lagoa Santa, MG) b) atividade específica do
3H2O no plasma (conforme descrita no item 3.5) no tempo 60 minutos; c) determinação da
atividade específica da glicose-U-14C, onde 100 µl da amostra foram adicionados a 300 µl de
HClO4 6% e neutralizados com KOH, sendo a glicose-U-14C e os intermediários de 3
carbonos (lactato e piruvato) separados em coluna cromatográfica de troca iônica (DOWEX
1X8), com base no método de Baker, Huebotter e Schotz (1965)58 com modificações. A
glicose-U-14C inicialmente retida na coluna foi eluída com água obtendo-se duas frações de
1,6 mL. O lactato e piruvato retidos foram eluídos com NaOH 1 M obtendo-se mais duas
frações de 1,6 ml cada. As frações foram recolhidas em frascos de cintilação sendo em
seguida adicionado o coquetel de cintilação para contagem da radioatividade.
Após a coleta do tempo 60 minutos, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical e os TAB epididimais foram retirados, pesados e colocados em mistura de
clorofórmio:metanol na proporção de 2:1 para posterior processamento e extração dos lipídios
totais. A extração dos lipídios totais e ácidos graxos segue o processo já descrito na síntese de
ácidos graxos a partir de 3H2O (Item 3.5). A radioatividade do 3H e 14C incorporada em
lipídios totais e ácidos graxos foi medida em cintilador Packard Tri-Carb 2100 TR em dois
23
canais separados, segundo o método de Hendler (1964).59 A radioatividade do 3H e 14C
incorporada em glicerol de TAG foi determinada pela diferença entre a incorporação nos
lipídios totais e nos ácidos graxos.
A síntese do glicerol “total”, utilizando 3H2O, foi calculada segundo Windmueller e
Spaeth (1966),56 conforme descrito para os ácidos graxos na técnica de lipogênese in vivo
(item 3.5). As taxas de síntese de TAG-glicerol utilizando 3H2O foram estimadas assumindo-
se que cada molécula de glicerol incorporada em TAG contém 3,3 átomos de 3H quando
formado a partir da glicose, ou 5 átomos de 3H quando formado a partir de substratos não
glicídicos via gliceroneogênese.56,60 A taxa de síntese de glicerol obtida a partir da 14C-glicose
foi usada para estimar (usando o fator 3,3) o 3H incorporado em glicerol a partir da glicose,
que foi então subtraído do 3H incorporado em glicerol. Os valores obtidos representam o trício
incorporado em glicerol sintetizado a partir de substratos não glicogênicos, que foram
utilizados para estimar (usando o fator 5) a gliceroneogênese.
O fluxo de carbonos da glicose para a síntese de ácidos graxos e glicerol foi avaliado
segundo o modelo semicompartimental proposto por Baker e Huebotter (1972),61 que se
baseia no modelo de dois compartimentos, no qual todos os produtos finais, incluindo AG e
glicerol de TAG são sintetizados a partir de um pool comum de intermediários.
A análise semicompartimental requer a curva de atividade específica no plasma após
a injeção intravenosa de glicose-U-14C, como também a medida da radioatividade incorporada
nos produtos finais analisados num intervalo de tempo t em condições de steady-state para a
concentração de glicose plasmática. A velocidade do fluxo de glicose para produtos finais é
dada pela expressão:
24
Onde:
R1 = nmoles de produto final sintetizado por minuto;
VRI= velocidade de remoção irreversível de carbonos da glicose (µg de carbonos de
glicose/minuto);
q (60) = % de glicose-U-14C incorporada em todos os produtos finais aos 60 minutos;
K1 = 1/µg de carbonos de glicose. É o fator que converte µg de carbonos da glicose em
nmoles de produto final (ácido graxo ou glicerol). A síntese de 1 nmol de AG contendo 16
átomos de carbono, se totalmente sintetizado a partir de glicose, requer 0,192 µg de carbonos
enquanto a síntese de 1 nmol de glicerol, nas mesmas condições requer 0,036 µg de carbonos
de glicose.
Curva da atividade específica da glicose-U-14C no plasma
Para obtenção da curva utilizou-se a radioatividade plasmática de 14C nos tempos 1, 5,
15, 30 e 60 minutos após injeção intravenosa de glicose-U-14C e a atividade específica foi
calculada, através da porcentagem da radioatividade encontrada no plasma e a concentração
da glicose plasmática.
A curva segue a seguinte equação exponencial de dois termos:
F (t) = a1. e –k1.t + a2. e –k2.t
25
Onde, a1 e a2 representam extrapolações feitas ao tempo zero da curva de atividade
específica, e as unidades k1 e k2 são recíprocas do tempo (min.-1). A relação entre qn(60), k1 e
k2 é a seguinte:
A velocidade de remoção irreversível (VRI) de carbonos da glicose foi calculada a
partir da curva temporal de atividade específica em função do tempo da glicose-U-14C
plasmática. Ela corresponde à recíproca da área sobre a curva.62,63
A dose foi normatizada a 100 e o fator 1000 transforma mg de carbonos da
glicose/minuto em µg de carbonos de glicose/minuto.
Cálculo do q(60):
3.7 Determinação do conteúdo de PEPCK por Western blotting
Para a determinação do conteúdo de PEPCK foi utilizada eletroforese em gel de
poliacrilamida seguido de Western blotting. Foi retirado 1 g de TABE e homogeneizado em 2
ml de tampão 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4) contendo 150 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; 1%
de Triton X-100; 0,1% de SDS; 5 µg/ml de aprotinina; 1mM de PMSF; 10 mM de
26
ortovanadato de sódio; 100 mM de NaF; 10 mM de pirofosfofato de sódio. O homogenado foi
centrifugado a 10000 rpm por 50 minutos à 4ºC, para a remoção dos debris celulares e o
sobrenadante foi separado para a realização da eletroforese e dosagem de proteínas pelo
método de Bradford (1976)64. Aos homogenados foi adicionado tampão da amostra (20% de
glicerol, 125 mM de Tris-HCl, 4% de SDS, 100mM de ditiotreitol, 0,02% de azul de
bromofenol, pH 6,8) na proporção 1:4.
Antes da realização da eletroforese, as amostras foram fervidas a 100ºC por 5 minutos.
Para a determinação do conteúdo de PEPCK e α-tubulina, foram aplicadas 80 µg de proteína
Para a eletroforese foi utilizado gel de poliacrilamida com SDS a 10% (SDS-PAGE), de
acordo com o método descrito por Laemmli (1970)65. Foi utilizado sistema de eletroforese
(modelo mini protean II cell - Bio Rad®) e gel de acrilamida:bisacrilamida (40:1) com 1,5
mm de espessura. O padrão de peso molecular utilizado foi o Kaleidoscope Prestained
Standards 6,6-201 kDa (Bio Rad, Hercules, CA, USA). A corrida foi realizada em tampão de
eletroforese (200 mM de Tris-HCl; 1,52 M de glicina; 7,18 mM de EDTA, 0,4% de SDS; pH
8,3) sob corrente de 50 V até a passagem das proteínas do gel de empilhamento e de 120 V no
gel de separação por aproximadamente duas horas. Ao término da corrida, os géis foram
preparados para a transferência para membranas de PVDF (Amershan Hybond-P Biosciences
- UK England HP97 9NA) de acordo com o método de Towbin et al. (1979)66. O gel foi
colocado em solução de transferência (25 mM de Tris-HCl; 192 mM de glicina; 20% de
metanol e 0,02% de SDS, pH 8,3) com as esponjas, filtros e a membrana. A transferência das
proteínas do gel para a membrana foi conduzida a 120 V, durante 2 horas. Após a
transferência, a membrana foi corada com 0,1% de Ponceau S (Sigma) em ácido acético 5%
para a confirmação da eficiência do processo de transferência. A ligação não-específica de
proteínas à membrana foi reduzida pela pré-incubação da membrana em tampão de bloqueio
com leite desnatado 10% em solução basal TBS-T (10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl,
27
0,1% de Tween-20), seguido de lavagens (3 vezes de 10 minutos com solução basal). As
membranas foram posteriormente incubadas overnight em geladeira com anticorpos primários
correspondentes a cada uma das proteínas, diluídos em solução basal contendo 0,3% de BSA.
Após incubação com o anticorpo primário, foi realizada a lavagem da membrana (3
vezes de 10 minutos com solução basal), e incubação por 2 horas à temperatura ambiente,
com o anticorpo secundário diluído em solução basal.
Em seguida, a membrana foi incubada por 5 minutos com a mistura de reagente (1:1)
do kit de quimiluminescência amplificada Super Signal® West Pico Chemiluminescent
Substrate (Thermo Scientific), o excesso de reagente foi removido e a revelação realizada em
filme Kodak medical X-ray film (Kodak, Rochester, NY, USA). A análise da densitometria foi
realizada utilizando o programa ImageJ (Wayne Rasband, National Institute of Health, NY,
USA). O termo unidade arbitrária refere-se ao valor densitométrico da banda no filme
radiográfico.
A membrana da PEPCK foi incubada na presença do anticorpo primário policlonal
específico rabbit anti-PEPCK (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, USA) na diluição de
1:1000, e anticorpo secundário goat anti-rabbit IgG, horseradish peroxidase conjugate
(Invitrogen, Carisbad, CA, USA), diluição 1:6500. Para α-tubulina foi utilizado o anticorpo
monoclonal mouse anti-α-tubulina (Santa Cruz), diluição 1:750, e anticorpo secundário goat
anti-mouse IgG horseradish peroxidase conjugate (Invitrogen, Carisbad, CA, USA). As
intensidades das bandas da PEPCK foram normalizadas com o conteúdo de α-tubulina.
3.8 Atividade da gliceroquinase
O método utilizado para a medida da atividade da enzima gliceroquinase, se baseia na
fosforilação de glicerol-14C a glicerol fosfato-14C, determinado conforme o trabalho de
Newsholme et al. (1967)67.
28
Para a preparação do homogenado foi utilizado 1 g de TAB em 2 ml de tampão
contendo KCl 1% e EDTA 1 mM, seguido de centrifugação de 5000 rpm por 10 minutos à
4ºC. O infranadante obtido da centrifugação e os tubos contendo 100 µl da mistura de reação
foram pré-incubados à 37º C durante 5 minutos. O meio de reação continha TRIS 100 mM pH
7,5, ATP 6 mM, MgCl2 4 mM, EDTA 1 mM, NaF 25 mM, 2-β-mercaptoetanol 20 mM,
glicerol-U-14C (Perkin Elmer, Walthan, MA, USA) 10 µCi/mL, glicerol 1 mM, fosfocreatina
10 mM, creatina quinase 26,4 U/mL e albumina 1%. Após a pré-incubação, foram
adicionados 20 µl de amostra nos tubos de reação e 100 µl de etanol 98% e 20 µl de amostra
nos tubos “branco”, que foram mantidos em banho maria a 37ºC por 30 minutos. Após o
tempo de incubação, o ensaio foi interrompido pela adição de etanol 98% em todos os tubos
(menos o branco), que em seguida foram centrifugados a 3000 rpm durante 10 minutos a
4ºC. O sobrenadante obtido da centrifugação foi utilizado para a separação do glicerol-14C do
glicerol fosfato-14C por cromatografia de papel ascendente utilizando como solventes: etanol,
amônia e água nas proporções 80:4:16 respectivamente, aplicando-se 20 µl do sobrenadante
da mistura de reação em papel de cromatografia Whatman nº 1. Neste sistema, o glicerol não
fosforilado move-se a frente com o solvente e o glicerol fosfato move-se até 5 cm do ponto de
aplicação da amostra quando o solvente se encontra a 30 cm da origem. Ao final da corrida e
após a evaporação do solvente, o papel foi cortado em tiras de 5 cm a partir do ponto de
aplicação da amostra, e as tiras colocadas em frascos contendo líquido de cintilação. A
contagem de radioatividade se deu em contador de cintilação Tri Carb 2100 TR.
O resultado foi expresso em nmol.mg de proteína-1.min-1, sendo a dosagem de
proteína realizada pelo método de Lowry et al. (1951).68
29
3.9 Determinação da atividade lipolítica
3.9.1 Isolamento de adipócitos
A técnica do isolamento de adipócitos foi baseada no método de Rodbell (1964)69. Os
TAB epididimais de vários animais foram pesados e mantidos em tampão Krebs-Henseleit
(137 mM de NaCl, 4,2 mM NaHCO3, 0,4 mM de MgSO4.7 H2O, 0,5 mM de MgCl2. 6H2O,
0,4 mM de KH2PO4; 5,4 mM de KCl), acrescido de 1% de albumina bovina livre de ácidos
graxos, 27 mM de HEPES e 0,55 mM de glicose, pH 7,4. Após a fragmentação dos tecidos
com auxílio de tesoura, o meio foi aspirado com uma seringa sem agulha. Os fragmentos de
tecido foram transferidos para um frasco plástico contendo tampão na proporção de 1 grama
de tecido: 1,5 ml de tampão contendo 0,55 mM de glicose e 1,5 mg de colagenase tipo I
(Worthinton 128 U/mg). Os frascos foram incubados em banho metabólico a 37ºC sob
agitação constante por 30 minutos. Os adipócitos isolados foram filtrados em meia de “nylon”
e em seguida lavados três vezes com o tampão Krebs-Henseleit sem glicose para a remoção
da colagenase e estromas vasculares. As células foram separadas do tampão por flotação. A
contagem dos adipócitos foi realizada em câmara de Neubauer em microscópio óptico Nikon
Eclipse E200 (Nikon, Mellvile, NY, USA).
3.9.2 Lipólise
Para determinar a lipólise basal e a resposta lipolítica à noradrenalina, alíquotas de 200
µl da suspensão de adipócitos isolados foram incubadas com 800 µl de tampão Krebs-
Henseleit suplementado com 1% de albumina bovina livre de ácidos graxos, 27 mM de
HEPES e 5 mM de glicose, pH 7,4, por 60 minutos na presença de 10-5, 10-6, 10-7 M de
noradrenalina (Sigma). Para a determinação da lipólise basal, foram incubados frascos sem
30
noradrenalina, contendo apenas o tampão. O ensaio foi conduzido em sete frascos para cada
uma das concentrações de noradrenalina e basal.
A reação foi interrompida pela imersão dos frascos em gelo, e o meio de incubação foi
aspirado com auxílio de seringas sem agulha. Após a flotação dos adipócitos remanescentes, o
meio de incubação ausente de adipócitos foi utilizado para determinação da concentração de
glicerol. A taxa lipolítica foi estimada pela liberação de glicerol no meio de incubação
expressa em µmol.106 células-1.h-1. A concentração de glicerol foi determinada
enzimaticamente. Foi utilizado o kit para dosagem de triglicérides (Labtest) que são
determinados de acordo com reações que envolvem as enzimas lípase lipoproteica e
gliceroquinase, e a intensidade da cor formada é proporcional à quantidade de glicerol
presente na amostra.
3.10 Velocidade de renovação de noradrenalina
A velocidade de renovação de noradrenalina foi avaliada pelo método da α-metil-
éster-tirosina,70 um inibidor competitivo da tirosina hidroxilase, enzima chave da biossíntese
de catecolaminas. Para a avaliação da velocidade de redução da concentração de
noradrenalina, foram utilizados 3 grupos de animais: Grupo 0 - não recebeu o tratamento com
α-metil-éster-tirosina (Sigma-Aldrich); Grupo 6 h - recebeu uma dose de 300 mg/kg de α-
metil-éster-tirosina; Grupo 12 h recebeu 2 doses de de α-metil-éster-tirosina: uma dose inicial
de 300 mg/kg e uma segunda dose de 250 mg/Kg, 6 horas após a primeira administração. A
α-metil-éster-tirosina foi administrada intraperitonealmente. Os animais foram eutanasiados
por deslocamento cervical no tempo 0 (Grupo 0), ao final de 6 horas (Grupo 6h) e de 12 horas
(Grupo 12h) e os tecidos epididimais removidos e homogeneizados em ácido perclórico 0,2 N
(deaerado), contendo metabissulfito de sódio 1% e EDTA 1 mM. O homogenado foi
centrifugado sob refrigeração a 1000 rpm durante 10 min e o sobrenadante transferido para
31
um outro tubo, contendo tampão Tris 2 M (pH 8,9), 0,5% de metabissulfito de sódio, 2,5% de
EDTA, 50 mg de alumina previamente ativada a 100ºC durante 30 minutos e 20 µl de
diidroxibenzilamina. As amostras foram agitadas durante 20 minutos, centrifugadas e, após
aspiração do sobrenadante, a alumina foi lavada repetidamente com 3 ml de uma solução
contendo EDTA 0,004%, metabissulfito de sódio 0,02% e Tris 0,06%. As catecolaminas
foram extraídas da alumina pela adição de solução eluidora contendo ácido perclórico 0,86 N,
metabissulfito de sódio 0,019% e EDTA Na2 0,02%, sob agitação por 10 minutos.51 O
conteúdo de noradrenalina foi determinado por cromatografia líquida de alta performance
(HPLC).
A velocidade de renovação (VR) da noradrenalina é o produto da concentração de
noradrenalina no tempo 0 [NORº] pela velocidade de renovação fracional (k):
Após o bloqueio da síntese pela α-metil tirosina, o declínio na concentração de
noradrenalina no TAMI é dado pela seguinte equação:
O valor de k pode ser determinado pelo cálculo da regressão linear dos logaritmos
naturais da concentração de noradrenalina versus o tempo.71
O intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina
foi determinado da seguinte maneira:
32
a) o intervalo de confiança do valor médio da velocidade de renovação fracional (k) e
da concentração de noradrenalina no tempo 0 [NORº] foi estabelecido utilizando o erro
padrão da média de cada um dos fatores;
b) Os limites inferiores da velocidade de k e da [NORº] foram multiplicados para
determinação do limite inferior do intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação
(VR) da noradrenalina.
c) Os limites superiores de k e da [NORº] foram multiplicados para determinação do
limite superior do intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da
noradrenalina.72
3.11 Determinação do conteúdo do receptor �2-adrenérgico
Para a determinação do conteúdo do receptor β2 adrenérgico foi utilizada eletroforese
em gel de poliacrilamida seguido de Western blotting, detalhada no item 3.7. Para a
determinação do conteúdo do receptor β2 foram aplicadas 80 µg de proteína. A membrana foi
incubada na presença do anticorpo primário policlonal específico rabbit anti-receptor β2-
adrenérgico (Abcam, Cambridge, MA, USA) na diluição de 1:1000, e anticorpo secundário
goat anti-rabbit IgG, horseradish peroxidase conjugate (Invitrogen, Carisbad, CA, USA),
diluição 1:6500. Para α-tubulina foi utilizado o anticorpo monoclonal mouse anti-α-tubulina
(Santa Cruz), diluição 1:750, e anticorpo secundário goat anti-mouse IgG horseradish
peroxidase conjugate (Invitrogen, Carisbad, CA, USA). As intensidades das bandas do
receptor β2 foram normalizadas com o conteúdo de α-tubulina.
3.12 Quantificação dos componentes da via de sinalização da insulina
Para a determinação do conteúdo dos intermediários da via sinalização da insulina foi
utilizada eletroforese em gel de poliacrilamida seguido de Western blottingconforme descrito
33
no item 3.7, para os diferentes componentes. Para a determinação do conteúdo e níveis de
fosforilação de AKT (em resíduo 473 de serina - AKT-p-Ser473) foram aplicadas 80 µg de
proteína, e para os conteúdos de IRβ e IRS-1 foram aplicadas 100 µg.
As membranas foram incubadas na presença dos seguintes anticorpos primários
policlonais específicos: rabbit anti-insulin Rβ (Santa Cruz), diluição 1:500; rabbit anti-IRS-1
(Santa Cruz), diluição 1:1000; rabbit anti-AKT (Cell Signaling), diluição 1:500, rabbit anti-
fosfo-AKT (Ser-473) (Cell Signaling, Beverly MA, USA), diluição 1:500.. O anticorpo
secundário utilizado foi o mesmo para todas as membranas: goat anti-rabbit IgG, horseradish
peroxidase conjugate (Invitrogen, Carisbad, CA, USA), diluição 1:6500.
Para a avaliação dos níveis de fosforilação de AKT, o resultado foi expresso
utilizando-se a relação p-AKT/AKT total, para normalizar os níveis de fosforilação da AKT
com o conteúdo total de AKT.
3.13 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão. A análise estatística utilizou
o teste “t de student” para dados com distribuição normal e o teste de Mann-Whitney para
dados não paramétricos. Adotou-se nível de significância de 5% em todos os testes. Para a
análise dos resultados utilizou-se o programa SigmaStat for Windows versão 1.0 (Jandel
Corporation, San Rafael, CA, USA).
34
4. RESULTADOS
4.1 Dados gerais
4.1.1 Peso corporal, ingestão de dieta e água
A coleta dos dados destes parâmetros foi realizada a cada dois dias e teve como
finalidade verificar se os dados obtidos por França et al. (2009)39 na padronização deste
modelo experimental estavam sendo reproduzidos.
Os ratos alimentados com a dieta hipoprotéica, apresentaram ao final de 15 dias, peso
cerca de 20% inferior ao dos animais que receberam a dieta normoprotéica. O ganho diário
de peso foi em média 41% menor, apesar de uma ingestão diária absoluta de alimento 8%
maior (tabela 2, figura 4 e 5). O aumento na ingestão de alimentos pelos animais e a diferença
no peso corporal dos animais H se mostrou estatisticamente significativa próximo ao 5º dia de
tratamento. A média do consumo diário de água desses animais foi cerca de 20% menor à do
grupo controle; essa redução pode ser percebida a partir do primeiro dia de tratamento (tabela
2 e figura 6). Estes achados, corroboram os dados obtidos por França et al. (2009)39 que
motivaram o estudo do metabolismo lipídico nestes animais.
35
TABELA 2 – Peso corporal final, ganho de peso corporal diário, ingestão diária de água,
ingestão diária absoluta e relativa de alimento de ratos tratados com dieta N e ratos tratados
com dieta H por 15 dias.
Parâmetros
Grupos
N H
Peso corporal final (g) 149,3 ± 6,79 131,6 ± 4,50*
Ganho de peso (g/dia) 12,4 ± 0,82 7,26 ± 0,71*
Ingestão alimentar (g/dia) 14,6 ± 0,36 15,8 ± 0,44‡
Ingestão relativa (g/dia.100g de peso corporal) 9,71 ± 0,32 11,9 ± 0,17*
Ingestão de água (ml) 17,3 ± 0,52 13,3 ± 0,24‡
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=9). ‡ p<0,05, teste Mann-Whitney. *p<0,05, teste t de student.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1690
105
120
135
150
165
180
195
210
***
*Pes
o co
rpor
al (
g)
Tempo (dias)
N H
FIGURA 4 – Efeito da dieta hipoprotéica sobre o peso corporal de ratos em crescimento durante 15 dias de tratamento. Os valores representam média ± erro padrão (n=7). *p< 0,05, teste t de student.
36
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1510
15
20
25
30
35
40
45
50
55
*****
Inge
stão
alim
enta
r (g
)
Tempo (dias)
N H
FIGURA 5 – Efeito da dieta hipoprotéica sobre a ingestão alimentar de ratos em crescimento durante os 15 dias de tratamento. Os valores representam média ± erro padrão (n=7). *p < 0,05, teste t de student.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1510
15
20
25
30
35
40
45
50
55
*****
**
Inge
stão
de
água
(m
l)
Tempo (dias)
N H
FIGURA 6 – Efeito da dieta hipoprotéica sobre a ingestão de água de ratos em crescimento durante os 15 dias de tratamento. Os valores representam média ± erro padrão (n=7). *p< 0,05, teste t de student.
37
4.1.2 Peso e conteúdo lipídico do TABE
Em condições normais, o TABE é o maior depósito de tecido adiposo branco visceral.
Como apresentado na tabela 3 e figura 7, o peso do TAB epididimal de ratos H foi cerca de
34% maior que a dos ratos do grupo N. O conteúdo lipídico absoluto no tecido foi
aproximadamente 40% maior nos animais do grupo H.
TABELA 3 – Peso e conteúdo lipídico do TABE de ratos tratados com dieta normprotéica e
ratos tratados com a dieta hipoprotéica por 15 dias.
Parâmetros
Grupos
N H
TAB epididimal (g) 1,84 ± 0,07 2,47 ± 0,13*
Conteúdo lipídico (g/tecido) 1,20 ± 0,10 1,70 ± 0,20*
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=18). *p < 0,05, teste t de student.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
*
BA
Conteúdo lipídico (g/tecido)
*
Pes
o do
TA
B e
pidi
dim
al (
g)
N H
FIGURA 7 – Efeito da dieta hipoprotéica (H) no peso (A) e no conteúdo lipídico (B) do TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=18). *p < 0,05, teste t de student.
38
4.1.3 Catecolaminas plasmáticas
A maior parte das catecolaminas plasmáticas são sintetizadas e armazenadas pelas
células cromafins, principalmente da medula adrenal, de onde são liberadas na corrente
sanguínea para atuar nos receptores adrenérgicos dos tecidos alvo. A dosagem de
catecolaminas mostrou que as concentrações plasmáticas de noradrenalina e de adrenalina em
ratos adaptados à dieta H foram significativamente maiores quando comparadas às
concentrações em animais controle (tabela 4 e figura 8).
TABELA 4 – Concentração de noradrenalina e adrenalina no plasma de ratos em crescimento tratados com dieta N e ratos tratados com dieta H por 15 dias.
Parâmetros
Grupos
N H
Noradrenalina (ng/ml plasma) 1,82 ± 0,20 2,73 ± 0,25*
Adrenalina (ng/ml plasma) 3,87 ± 0,58 5,37 ± 0,37*
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=7). *p < 0,05, teste t de student.
0
1
2
3
4
5
6
*
Adrenalina
Cat
ecol
am
ina
s pl
asm
átic
as
(ng/
ml p
lasm
a)
N H
Noradrenalina
*
FIGURA 8 – Efeito da dieta hipoprotéica na concentração de noradrenalina e adrenalina plasmática em ratos. Os valores representam média ± erro padrão (n=7). *p < 0,05, teste t de student.
39
4.2 Atividade da LPL
A lipase lipoprotéica é uma enzima extracelular localizada no endotélio dos capilares
teciduais responsável pela hidrólise dos TAG das lipoproteínas circulantes em ácidos graxos e
glicerol que podem ser captados pelos adipócitos e esterificados à TAG para armazenamento.
A dieta H induziu uma redução de 37% na atividade da LPL no TABE em relação aos animais
que receberam dieta controle (tabela 5 e figura 9).
TABELA 5 – Atividade da LPL em TABE de ratos em crescimento tratados com dieta N e ratos tratados com a dieta H por 15 dias.
Parâmetros
Grupos
N H
Atividade da LPL
(nmol de AG.mg prot-1. minuto-1)
8,38 ± 0,11 5,27 ± 0,86*
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=8). *p < 0,05, teste t de student.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
HN
Ativ
idad
e d
a LP
L
(nm
ol d
e A
G.m
g pr
ot-1.m
in-1)
*
FIGURA 9 – Efeito da dieta hipoprotéica na atividade da enzima LPL no TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=8). *p < 0,05, teste t de student.
40
4.3 Velocidade de síntese de ácidos graxos de novo
A velocidade de síntese de ácidos graxos de novo no TABE foi medida pela
incorporação de 3H de 3H2O em AG-TAG. Este método avalia a síntese de AG a partir de
todas as fontes. Podemos constatar que não houve alteração significativa na velocidade de
síntese de ácidos graxos nos animais H em relação aos controles (tabela 6 e figura 10).
TABELA 6 – Velocidade de síntese de ácidos graxos in vivo sintetizado de novo no TABE de ratos em crescimento alimentados com a dieta N e alimentados com a dieta H por 15 dias.
Parâmetros
Grupos
N H
Velocidade de síntese de AG de novo
(µmol . g tecido-1.hora-1)
1,59 ± 0,38 1,07 ± 0,28
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=7).
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
HN
Sín
tese
de
ácid
os g
raxo
s de
nov
o
(µm
ol.g
teci
do-1.h
ora-1
)
FIGURA 10 - Efeito da dieta hipoprotéica na velocidade de síntese in vivo de ácidos graxos de novo no TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=15).
41
4.4 Velocidade de síntese de glicerol in vivo a partir de 3H2O e 14C-glicose
Este experimento teve como objetivo estimar a contribuição de carbonos da glicose e
da gliceroneogênese para a síntese de glicerol-TAG em ratos alimentados com a dieta N e H.
A taxa de síntese de glicerol-TAG a partir da gliceroneogênese foi estimada pela diferença
entre a síntese a partir da glicose e a taxa obtida pela incorporação do 3H, que estima a síntese
a partir de todas as fontes de carbono.
Atividade específica da glicose
A curva de atividade específica da glicose-U-14C (% da dose injetada/mg de carbonos
da glicose) dos animais controle foi similar aos tratados com dieta H (figura 11).
1.0
1.2
1.4
1.6
0 10 20 30 40 50 60
0
1
2
3
4
5
6
7
N H
Glic
ose
plas
mát
ica
(mg/
ml
)
Ativ
idad
e es
pecí
fica
da g
licos
e no
pla
sma
(% d
e do
se in
jeta
da.m
g de
car
bono
da
glic
ose
-1)
Tempo (min)
FIGURA 11 – Glicose plasmática e curva de atividade específica da glicose após injeção
intravenosa de glicose-U-14C em ratos em crescimento alimentados com a dieta N ou H no
período de 60 minutos . Os valores representam média ± erro padrão (n=8).
42
A dieta H não alterou de maneira significativa a velocidade de síntese de glicerol a
partir de glicose, pela gliceroneogênese e não alterou também a síntese de glicerol total (soma
das duas vias), quando comparada à síntese observada nos animais N (figura 12).
0
25
50
75
100
125
150
175
200
HN
Sín
tese
in v
ivo
de T
AG
-glic
erol
(nm
ol.g
teci
do-1.m
in-1)
A partir de glicose A partir da gliceroneogenese
FIGURA 12 – Efeito da dieta hipoprotéica na velocidade de síntese in vivo de glicerol de TAG, a partir de glicose e a partir da gliceroneogênese no TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=8).
4.5 Conteúdo da PEPCK
A PEPCK, enzima que catalisa a descarboxilação do oxaloacetato a fosfoenolpiruvato,
tem papel chave na regulação da gliceroneogênese. O conteúdo dessa enzima no TABE foi
avaliado pela técnica do Western blotting. O conteúdo da PEPCK nos tecidos de animais do
grupo H não apresentou diferença em relação ao conteúdo encontrado nos animais do grupo N
(tabela 7 e figura 13).
43
TABELA 7 – Conteúdo de PEPCK no TABE de ratos em crescimento tratados com dieta N e ratos tratados com dieta H por 15 dias.
Parâmetros
Grupos
N H
PEPCK (% do controle) 100,0 ± 9,25 75,8 ± 6,68
Os valores apresentam média ± erro padrão (n= 4 ou 5).
0
20
40
60
80
100
120
N H
PEPCK
α-tubulina
HN
PE
PC
K/α-
Tub
ulin
a(%
dos
con
trol
es)
FIGURA 13 – Efeito da dieta hipoprotéica no conteúdo da enzima PEPCK no TABE de ratos
em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=4 ou 5).
4.6 Atividade da GK
A GK é a enzima que catalisa a fosforilação direta do glicerol a G3P permitindo a
reciclagem do glicerol no TAB. Como podemos constatar na tabela 8 e figura 14, a dieta H
não promoveu alteração na atividade da enzima.
44
TABELA 8 – Atividade da GK em TABE de ratos em crescimento tratados com dieta N e ratos tratados com a dieta H por 15 dias.
Parâmetros
Grupos
N H
Atividade da GK
(nmol . minuto-1 . mg prot-1)
1,44 ± 0,20 1,20 ± 0,08
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=5).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
HN
Ativ
idad
e da
glic
eroq
uina
se
(nm
ol.m
g pr
ot-1.m
in-1)
FIGURA 14 – Efeito da dieta hipoprotéica na atividade da enzima GK no TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=5).
4.7 Atividade lipolítica in vitro
Foram realizados ensaios para avaliar a lipólise basal e a lipólise estimulada utilizando
a noradrenalina como agente lipolítico no meio de incubação. Os resultados mostram que no
estado basal, sem estimulação noradrenérgica, a atividade lipolítica foi semelhante entre os
adipócitos de ratos N e H. Quando incubados com noradrenalina, as células isoladas dos
animais H não foram responsivas ao estímulo em nenhuma concentração de noradrenalina, e
45
mantiveram a liberação de glicerol semelhante ao nível basal. Os adipócitos dos animais N
responderam de maneira direta ao aumento nas concentrações de noradrenalina (tabela 9 e
figura 15).
TABELA 9 – Glicerol liberado por adipócitos isolados de ratos em crescimento tratados com dieta N e ratos tratados com a dieta H por 15 dias, incubados em diferentes concentrações de noradrenalina.
Grupos
Concentrações de noradrenalina (M)
0 10-7 10-6 10-5
Normoprotéico
(µmol glicerol. 106cels-1.h-1)
0,111 ± 0,015 0,183 ± 0,019 0,450 ± 0,050‡ 0,501 ± 0,036‡
Hipoprotéico
(µmol glicerol. 106cels-1.h-1)
0,121 ± 0,015 0,112 ± 0,020* 0,158 ± 0,036* 0,083 ± 0,008*
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=7). *p < 0,05, teste t de student vs controle. ‡ p < 0,05, teste t de student vs basal.
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
*
*
10-510-610-7
Glic
ero
l lib
erad
o
(µm
ol g
licer
ol.1
06 cels-1
.h-1)
N H
0
*
Noradrenalina (M)
FIGURA 15 – Efeito de diferentes concentrações de noradrenalina sobre a liberação de glicerol em adipócitos isolados de ratos adaptados à dieta N e ratos adaptados à dieta H por 15 dias. Os valores representam média ± erro padrão (n=7). *p < 0,05, teste t de student.
46
4.8 Velocidade de renovação de noradrenalina no TABE
A atividade do SNS foi avaliada através da velocidade de renovação de noradrenalina,
sendo esta diretamente relacionada ao turnover de noradrenalina no tecido. A dieta
hipoprotéica causou um aumento de aproximadamente 30% na concentração basal de
noradrenalina no TAB epididimal. A velocidade de renovação (VR) e a renovação fracional
(k) também apresentaram aumento nos ratos tratados com a dieta H em relação aos controles.
A meia vida da noradrenalina nos animais H foi reduzida à metade do tempo nos animais N
(tabela 10 e figura 16). Estes dados confirmam um maior turnover de noradrenalina nos
animais submetidos à dieta H, resultante da maior atividade simpática no TABE.
TABELA 10 – Concentração de noradrenalina, velocidade de renovação fracional (k), velocidade de renovação (VR) e meia vida (t1/2) da noradrenalina no TABE de ratos em crescimento tratados com dieta N e de ratos tratados com dieta H por 15 dias.
Parâmetros
Grupos
N H
Noradrenalina (ng.tecido-1) 18,20 ± 0,81 23,60 ± 1,53*
K (%.h-1) 2,94 ± 0,75 6,14 ± 2,57*
VR (ng. tecido-1.hora-1) 0,53 (0,38-0,70) 1,45 (0,79-2,19)*
t1/2 (h) 23,6 11,3*
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=5). *p < 0,05, teste t de student.
47
7
9
10
12
13
14
16
17
1920
24
0 6 12
7
9
10
12
13
14
16
17
1920
24
Nor
adre
nalin
a (n
g.T
AB
E-1
)
Tempo (h)
FIGURA 16 – Efeito da dieta hipoprotéica no conteúdo de noradrenalina no TABE de ratos
em crescimento após a administração intraperitoneal de α-metil-tirosina. Os pontos
representam média ± erro padrão (n=5).
4.9 Conteúdo de receptor β2 adrenérgico
Os receptores β adrenérgicos estão relacionados à ação lipolítica das catecolaminas. O
receptor β2 adrenérgico está presente na membrana dos adipócitos, sendo um dos sítios de
ligação da noradrenalina. O conteúdo total do receptor foi avaliado por Western blotting. No
TABE de animais em crescimento tratados com a dieta H o conteúdo total do receptor β2
adrenérgico foi reduzido em 66% quando comparado aos animais controle (figura 17).
48
0
20
40
60
80
100
120
140
160
N H
Receptor β2
α-tubulina
*
HN
Rec
epto
r β2
adre
nérg
ico/α
-tub
ulin
a(%
dos
con
trol
es)
FIGURA 17 – Efeito da dieta hipoprotéica no conteúdo do receptor β2 adrenérgico no TABE
de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). *p < 0,05, teste t
de student.
4.10 Conteúdo dos componentes da via de sinalização da insulina
A insulina é um hormônio de grande influência sobre o tecido adiposo branco, que
atua estimulando a lipogênese e inibindo a lipólise. A sinalização da insulina se inicia com
sua ligação ao receptor insulínico. O receptor de insulina é uma proteína heterotetramérica
composto de duas subunidades α extracelulares e duas subunidades β transmembrana. A
ligação da insulina à subunidade α desencadeia a auto-fosforilação da subunidade β, que tem
atividade tirosina quinase e fosforila diversos substratos e proteínas, entre elas IRS-1 e AKT.
A dieta H não alterou o conteúdo de IRβ (tabela 11 e figura 18) e AKT (tabela 11 e
figura 20) no TABE de animais H em relação ao conteúdo destas proteínas nos animais
controles. O conteúdo de IRS-1 foi reduzido em 39% nos animais adaptados à dieta H em
comparação com os animais controles (tabela 11 e figura 19). No TABE dos animais
49
adaptados à dieta H, os níveis de fosforilação de AKT em resíduo de serina-473 foram
reduzidos em 60% em comparação aos níveis observados em animais controles (tabela 11 e
figura 21).
TABELA 11 – Conteúdo de IRβ, IRS-1 e AKT no TABE de ratos em crescimento tratados
com dieta N e ratos tratados com a dieta H por 15 dias.
Parâmetros
(Unidades arbitrárias)
Grupos
N H
IRβ 31789,0 ± 2162,8 36077,0 ± 1716,1
IRS-1 8489,4 ± 250,9 5177,5 ± 616,4*
AKT 24809,3 ± 2137,1 21542,8 ± 2700,1
Os valores apresentam média ± erro padrão (n=5). *p < 0,05, teste t de student.
0,0
5,0x103
1,0x104
1,5x104
2,0x104
2,5x104
3,0x104
3,5x104
4,0x104
H
N
N H
Co
nte
úd
o d
o IR
(Un
idad
es a
rbitr
ária
s)
*
FIGURA 18 – Efeito da dieta hipoprotéica no conteúdo do IRβ no TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=8).
50
0
2500
5000
7500
10000
H
N
N H
Con
teúd
o de
IR
S-1
(Uni
dad
es
arbi
trá
rias)
*
*
FIGURA 19 – Efeito da dieta hipoprotéica no conteúdo de IRS-1 no TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=5). *p < 0,05, teste t de student.
0,0
5,0x103
1,0x104
1,5x104
2,0x104
2,5x104
3,0x104
H
N
N H
Co
nte
úd
o d
e A
KT
(Un
idad
es a
rbitr
ária
s)
*
FIGURA 20 – Efeito da dieta hipoprotéica no conteúdo da enzima AKT no TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=8).
51
0
20
40
60
80
100
120
140
HN
HN
AKT total
p-AKT
*
p-A
KT
/AK
T to
tal
(% d
os c
ontr
ole
s)
FIGURA 21 – Efeito da dieta hipoprotéica nos níveis de fosforilação de AKT (ser-473) no TABE de ratos em crescimento. Os valores representam média ± erro padrão (n=6). *p<0,05, teste t de student.
52
5. DISCUSSÃO
O nosso laboratório tem utilizado como modelo experimental para o estudo do
metabolismo de lipídeos e sua regulação, ratos em crescimento submetidos à dieta com menor
teor de proteínas, compensada (equivalente em calorias) por carboidratos. Este interesse foi
decorrente de observações iniciais, de que estes animais apresentavam aumento na ingestão de
alimento, mesmo com elevados níveis séricos de leptina, que reduz a ingestão, quando
comparado a animais com dieta balanceada nesta mesma fase de desenvolvimento. Além
deste fato, outro aspecto aparentemente contraditório observado nestes animais, é que o ganho
energético ocorre com redução no peso corporal, justificável apenas, por profundas alterações
na composição química destes animais, com aumento de lipídeos e redução de proteínas e
água. Como consequência, eles apresentaram aumento no peso e conteúdo de lipídeos nos
depósitos adiposos (epididimal, retroperitoneal e marrom) e carcaça.39
Os dados obtidos nos experimentos com 3H2O e glicose-U-14C, relacionados às vias de
geração de G3P, sugerem que a velocidade de síntese total e as vias da gliceroneogênese e a
partir da glicose não foram alteradas pela dieta H, mantendo-se nos mesmos níveis dos
animais N. Estes resultados com dupla marcação, elemento chave desta avaliação, são
corroborados pela medida do conteúdo da PEPCK (enzima da gliceroneogênese) que não
sofreu alteração nestes animais. Detalhes técnicos da experimentação da dupla marcação,
como a constatação da reciclagem da glicose-U-14C em outros intermediários como 14C-
piruvato e 14C-lactato também foram avaliados, já que poderiam levar a uma incorreta
avaliação das vias. No entanto, nossos estudos mostram que durante o período experimental
(60 minutos), a porcentagem desses compostos no plasma esteve praticamente constante e uso
destes intermediários pelo tecido foi desprezível quando comparado à utilização de glicose. O
14C-piruvato e 14C-lactato dos ratos controles, em cada tempo avaliado (1, 5, 15, 30 e 60
53
minutos) representaram respectivamente 0,03, 0,02, 0,02, 0,02 e 0,01% da dose injetada de
glicose-U-14C, enquanto que a glicose-U-14C representou 2,17, 1,32, 0,85, 0,49 e 0,20% da
dose injetada. Este procedimento foi realizado para os grupos N e H, sendo os resultados
obtidos nos dois grupos, bastante similares. Assim sendo, assumimos que não houve
reciclagem de 14C ou 3H em níveis significativos durante o experimento, considerando que as
taxas obtidas representam valores mínimos.
O tratamento com a dieta H proporciona uma situação diferenciada, e parece ser a
primeira situação in vivo em que o nível plasmático de insulina encontra-se reduzido no
estado pós-prandial39 sem alterar as vias de geração de G3P. Resultados prévios obtidos in
vitro mostram que o jejum, diabetes induzido por streptozotocina (STZ) e dieta hiperprotéica
(HP) reduzem a insulina plasmática e induzem no TABE, um aumento na gliceroneogênese e
uma redução na utilização de glicose.21,28,29,73,74 Por outro lado, em ratos tratados com uma
dieta do tipo cafeteria, ocorre aumento na insulina plasmática e na captação de glicose
acompanhados por uma redução na gliceroneogênese.25 Além da já observada redução do
nível plasmático de insulina39, a menor atividade da insulina sugerida pela redução na
fosforilação da AKT e no conteúdo total de IRS-1 nos animais tratados coma dieta H (tabela
11 e figuras 19 e 21) poderia contribuir para a não alteração na captação de glicose, apesar de
uma maior ingestão de carboidratos pela dieta, que poderia limitar a formação de G3P por
esta via.
A maior ativação do SNS nos animais H, observado em nossos experimentos pela
medida do turnover de noradrenalina (tabela 10 e figura 16), pode também resultar em um
prejuízo na captação de glicose estimulada pela insulina. Mulder et al. (2005)75 mostraram
que a exposição de adipócitos isolados de ratos ao isoproterenol (agonista β adrenérgico) leva
a uma redução na captação de glicose estimulada pela insulina. Este fato parece estar
54
associado não à ligação da insulina ao seu receptor, mas à cascata de fosforilação da via de
sinalização da insulina.76,77
Apesar da influencia da atividade adrenérgica sobre o transporte de glicose ser
dependente principalmente dos receptores β3,78 foi demonstrado que a estimulação β
adrenérgica inibe a captação de glicose em adipócitos 3T3-L1 via receptores β2 e β3, por
interferir na translocação do GLUT-4.77 Achados de Frasson (2010)79 indicam que a insulina
tem papel preponderante sobre a captação de glicose em relação à ação das catecolaminas
sobre este transporte. Outras condições com aumento da atividade simpática e resistência
insulínica são descritas na literatura.80,81 Em situações experimentais em que os níveis de
insulina estão reduzidos e os de catecolaminas aumentados, como jejum, diabetes (STZ), e a
dieta H, favorecem a redução na captação de glicose. Nos animais tratados com a dieta H se
observa que apesar da redução de proteínas na dieta ser compensada por carboidratos, não
constatamos aumento da formação de G3P a partir da glicose.
A incubação de adipócitos 3T3-L1, estimulados por insulina, com antagonistas
seletivos para cada um dos três receptores β adrenérgicos (individualmente) não previne os
efeitos inibitórios da adrenalina na captação de glicose, já a inibição conjunta dos receptores
β2 e β3 extinguiu os efeitos da adrenalina, tanto quanto a inibição dos três receptores,75 o que
indica que as catecolaminas podem inibir o efeito estimulatório da insulina principalmente por
uma soma das respostas via receptores β2 e β3.
Embora não contemplados quanto à associação de altos níveis de insulina com
aumento da síntese de G3P a partir da glicose e redução a partir da gliceroneogênese, nossos
resultados reforçam um aspecto já observado em outros experimentos: a regulação recíproca
destas vias, isto é o aumento de uma delas, leva a redução da outra (e vice-versa), uma vez
que não constatamos alteração nas duas vias. A hipótese de que o suprimento de G3P é
55
controlado por mudanças recíprocas na via a partir da glicose e da gliceroneogênese são
encontrados em estudos com outros tipos de dieta além da dieta cafeteria e HP.82
Além da importância do controle hormonal nestas vias, não podemos descartar que
nutrientes que compõem a dieta podem participar diretamente desta regulação. Variações
destas vias em situações experimentais na ausência de hormônios já foram constatadas. A
incubação de fragmentos de TAB epididimal de ratos adaptados à dieta HP na presença de
glicose (5 mM) reduziu a incorporação de [1-14C]-piruvato em glicerol de TAG, sugerindo
uma redução da gliceroneogênese (Brito and Migliorini, dados não publicados). Além disso, a
administração de glicose a ratos em jejum diminui a atividade da PEPCK no fígado em 4 a 8
horas; efeito este que pode ser reduzido pela administração concomitante de 2-deoxi-D-
glicose, um potente inibidor do metabolismo de carboidratos.83
Além da gliceroneogênese e a partir da glicose, não podemos descartar a formação de
G3P pela fosforilação direta do glicerol. Apesar de reduzida, a atividade da GK no TAB de
ratos é detectável e encontra-se bastante aumentada (100%) no TAB retroperitoneal de
animais H.84 Foi demonstrado anteriormente que a atividade da GK é estimulada pelo sistema
nervoso simpático no TAB de ratos alimentados com dieta cafeteria,25 no entanto, apesar do
aumento na atividade simpática no TABE dos ratos H, observado pelo aumento da velocidade
de renovação de noradrenalina (tabela 10 e figura 16), e dos altos níveis plasmáticos de
adrenalina e noradrenalina (tabela 4 e figura 8), a atividade da GK não foi alterada. Assim
como nos animais H, ratos em jejum por 48h, que também apresentam aumento na atividade
simpática no TABE85 apresentaram uma redução na atividade da GK (Frasson and Migliorini,
dados não publicados). Estes achados nos permitem supor que a atividade da GK no TAB não
seja regulada exclusivamente por fatores neurais; sendo que, os fatores hormonais,
principalmente a insulina, também participem desta regulação, uma vez que nesta situação
(dieta H) o nível de insulina se encontra reduzido. Na dieta cafeteria, temos uma situação de
56
elevados níveis de insulina sérica e aumento na atividade simpática; diferente, dos animais
adaptados à dieta H em que constatamos reduzidos níveis de insulina e redução também em
intermediários da via de sinalização deste hormônio. Além disto, a redução do conteúdo de
receptores β2 constado em nossos experimentos (figura 17), podem justificar a ausência do
efeito simpático na GK nestes animais.
Outro componente da síntese de TAG avaliado neste trabalho foram as vias que
disponibilizam os AG para a esterificação com o G3P. Os nossos dados mostram que a
velocidade de síntese de AG total avaliada in vivo com 3H2O não foi alterada nos animais H e
sugere que a captação dos AG circulantes está reduzida, diante dos achados da reduzida
atividade da LPL nestes animais (tabela 5 e figura 9).
Apesar das vias de geração de G3P não estarem aumentadas e as vias de fornecimento
de AG estarem reduzida nos animais H, é fato que ocorre um aumento no peso e no conteúdo
lipídico do tecido, dados nossos (tabela 3 e figura 7) que confirmam os achados de França et
al. (2009).39 As bases bioquímicas do acúmulo de TAG têm sido estudadas no TABE de
camundongos durante a fase de crescimento, adaptados a uma dieta com alta quantidade de
lipídios e livre de carboidratos ou uma dieta com baixa quantidade de lipídios e elevada de
carboidratos, e demonstram in vivo uma alta degradação de TAG ocorrendo
concomitantemente com aumento na lipogênese, avaliada pela incorporação de 2H2O em GLI-
TAG e AG-TAG. Nas duas dietas a velocidade da lipólise é aproximadamente 50% da
velocidade de síntese.86 Nos nosso grupo experimental (H), o fator preponderante para o
acúmulo de lipídeos parece ser a perda de responsividade do tecido a ação lipolítica das
catecolaminas (tabela 9 e figura 15), por redução dos receptores β2 (figura 17) que mediam a
ação lipolítica das catecolaminas, uma vez que não foi constatado nenhum aumento na
lipogênese. Como descrito anteriormente, os efeitos lipolíticos gerados pelas catecolaminas
(noradrenalina e adrenalina) no TAB é mediado pelo controle da atividade da adenilato
57
ciclase pelos receptores estimulatórios β1, β2 e β3 e inibitório α2. A redução do conteúdo de
receptores β2 adrenérgicos no TABE dos animais H observado em nossos experimentos, pode
ser interpretado como uma tentativa de reduzir a suscetibilidade do tecido às catecolaminas,
com finalidade de preservar os estoques de TAG, numa situação de reduzida lipogênese no
tecido.
A redução do conteúdo de IRS-1 e da fosforilação da AKT no TABE dos animais
tratados com a dieta H se justifica uma vez que os níveis plasmáticos de insulina estão
menores, indicando uma menor atividade deste hormônio no tecido. O aumento da atividade
simpática observada no turnover de noradrenalina pode estar relacionado com a baixa
atividade da insulina neste tecido, o que causa a redução na captação de glicose, e
consequentemente a não alteração da síntese de G3P a partir da glicose e da síntese de AG de
novo. Porém, a redução do conteúdo de receptores β2 pode ser uma tentativa do tecido de
preservar os estoques de TAG em resposta ao aumento do influxo de catecolaminas. O
trabalho de Murder et al. (2005)75 sugere que a inibição da captação de glicose estimulada por
insulina envolve a ativação conjunta dos receptores β2 e β3. O papel dos receptores β3 já é bem
conhecido na estimulação da lipólise. A ativação crônica de receptores β adrenérgicos pelos
elevados níveis de catecolaminas, poderia ser a causa da desensibilização e subseqüente
redução da quantidade de receptores na membrana de adipócitos.87
Nos animais tratados com dieta H apesar de ter uma maior atividade simpática, o
TABE não responde às catecolaminas (lipólise e receptores β2), além disso tem uma redução
na atividade da insulina (demonstrado pelos experimentos da via de sinalização). Estes
mecanismos provavelmente se desenvolvem na tentativa de preservar os estoques de TAG no
TABE.
Já é bem estabelecido que os efeitos adrenérgicos envolvem a produção, fosforilação e
translocação da LHS para a gota lipídica. No entanto, juntamente com a LHS, outras
58
hidrolases são necessárias para a completa hidrólise dos estoques de TAG, o que sugere uma
regulação bastante complexa da mobilização dos AG. Novos experimentos, incluindo a
resposta dos adipócitos a agonistas seletivos e agentes lipolíticos intracelulares, são
necessários na investigação dos mecanismos bioquímicos que estão por traz da redução da
lipólise induzida pela dieta H.
59
6. CONCLUSÃO
O acúmulo de TAG observado no TABE de ratos em crescimento tratados com a dieta
H provavelmente se deve a uma redução da lipólise, uma vez que os resultados demonstraram
que: a) nenhuma das três vias de geração de G3P foi alterada e b) a velocidade de síntese total
de AG in vivo não foi alterada pela dieta e houve uma redução na captação de AG da
circulação. Estes resultados são condizentes com o perfil neural e hormonal observados nestes
animais, onde os principais hormônios (catecolaminas e insulina) que influenciam o balanço
lipólise/lipogênese estão com atividade reduzida no TABE. Apesar de terem maiores níveis
plasmáticos de catecolaminas e aumento da atividade simpática, constatado no aumento do
turnover de noradrenalina, existe uma redução significativa no conteúdo dos receptores β2
adrenérgicos. Além disso, os resultados do conteúdo dos intermediários da via de sinalização
da insulina demonstraram redução no conteúdo de IRS-1 e fosforilação da AKT,
provavelmente devido a uma menor ação deste hormônio no TABE, o que poderia explicar
porque apesar de ter um maior fornecimento de glicose pela dieta não há alteração na via de
geração de G3P a partir de glicose e nem o aumento da síntese de AG.
60
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Langin, D. Control of fatty acid and glycerol release in adipose tissue lipolysis. C. R.
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2. Nascimento CMO, Ribeiro EB, Oyama LM. Metabolism and secretory function of
white adipose tissue: effect of dietary fat. An Acad Bras Cienc. 2009; 81(3): 453-66.
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proteins that regulate cellular lipid stores. Biochim Biophys Acta. 2009;1791(6):419-
40.
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utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 2009; 20(9):424-8.
5. Gibbons GF, Islam K, Pease RJ. Mobilisation of triacylglycerol stores. Biochim
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6. Watt MJ, Steinberg GR. Regulation and function of triacylglycerol lipases in cellular
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