Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 - ti · Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro 11.5. Albero filogenetico 11.6. Classificazione secondo .S

Blanca M. Fernandez Rodriguez

Lavoro di diploma

Formazione Tecnico in Analisi Biomediche SSS

Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno

Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2per l’identificazione di muffe di interesse clinico

Lavoro svolto presso Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona

2007

Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 1

Indice

1. Riassunto, Abstract 3

2. Introduzione 4

3. I funghi 5

4. La classificazione 6

5. Gli aspetti clinici 7

6. Le regioni ITS1 e ITS2 8

7. Materiali e metodi

7.1. Campioni

7.2. Coltura

7.3. Estrazione

7.4. PCR

7.5. Seminested PCR

7.6. Controlli

7.7. Elettroforesi

7.8. Purificazione dei prodotti PCR

7.9. Reazione di sequenza

7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza

7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica

7.12. Analisi delle sequenze

7.13. Costruzione dell’albero filogenetico

10

10

10

10

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13

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14

14

14

8. Risultati

8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA

8.2. Coltivazione su piastra

8.3. Estrazione e amplificazione

8.4. Sequenze

8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante analisi

delle sequenze

8.6. Albero filogenetico

15

15

17

17

18

18

19

9. Discussione 27

10. Bibliografia 28


11. Allegati

11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti,

Zigomiceti, e basidiomiceti

11.2. Lista dei campioni

11.3. Lista delle sequenze di riferimento

11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro


11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras,

delle specie usate in questo lavoro

30

31

34

37

39

42

44


1. Riassunto

Il numero delle micosi é in continuo aumento

soprattutto nei pazienti ospedalizzati ed

immunocompremessi. Una rapida ed accurata

diagnosi permette d’iniziare una terapia

antimicotica adeguata. Le tecniche

diagnostiche comunemente usate in

laboratorio per l’identificazione dei miceti

sono tecniche biochimiche , sierologiche e

fenotipiche. Purtroppo queste tecniche

prevedono tempi d’esecuzione lunghi e non

sempre forniscono risultati accurati

nell’identificazione della specie.

Per questo motivo l’Istituto Cantonale di

Microbiologia ha deciso di testare come

tecnica d’analisi per l’identificazione delle

muffe patogene l’utilizzo della polymerase

chain reaction (PCR). Una tecnica che si

presenta con un’alta sensibilità e specificità.

In questo lavoro abbiamo sfruttato la PCR per

ottenere le sequenze di una regione altamente

variabile presente nel DNA ribosomale, e

regioni ITS1 e ITS2, mediante l’utilizzo di

primers universali (ITS1, ITS4).Le sequenze

ottenute, appartenenti a 56 ceppi di 36 specie

diverse, sono state confrontate con le

sequenze presenti nella GenBank

(NCBI).L’identificazione genotipica che

questa ha fornito é stata confrontata con

l’identificazione morfologica.

Le due tecniche d’analisi mostrano

un’identificazione identica a livello di genere

per il 98,2% e a livello di specie per il 44,6% .

L’identificazione fenotipica é risultata più

specifica a livello di specie per il 21,4%.

Mentre l’identificazione genotipica é risultata

più discriminante solamente per il 7,14%. Il

12,5% dei ceppi analizzati ha mostrato dei

risultati discrepanti fra le due tecniche

d’identificazione. In conclusione si può dire

che l’analisi delle diverse specie di funghi

mediante l’utilizzo delle sequenze ITS non

può essere un valido sostitutivo

dell’identificazione morfologica .

Abstract

Invasive fungal diseases are increasing in

immunocompromised and hospitalized

patients. Early detection and accurate

identification of the fungi permits a rapid and

optimal initiation of antifungal therapy.

The diagnosis of mould is generally based on

biochemical, serological and phenotype

identification. However these methods take

time and do not always lead to a precise

identification of the microorganism. For this

reason, the Cantonal Institute of Microbiology

decided to test a molecular biological

technique, the polymerase chain reaction

(PCR), as identification procedure. In fact

PCR technology promises more rapid and

specific identification.

In this work we have evaluated the feasibility

of the sequence analysis of the internal

transcribed spacer regions (ITS) of the

ribosomal DNA for the identification of

pathological moulds.

The ITS sequences were obtained by

amplification of the ITS region (ITS1-5,8S-

ITS2) with universal fungal primers (ITS1,

ITS4). The sequence analyses of 56 strains for

a total of 36 different species were compared

to reference data available at the GenBank

database, and the genotypic identification was

compared with phenotype identification.

For 98,2% of the strains, both methods gave

concordant results at the genus level. Of

these, 44,6% were assigned to the identical

species. Phenotypic criteria were more

specific in 21,4% and genotypic criteria were

more discriminative for 7,14%. 12,5% of the

strains showed discrepant results. We can

therefore conclude that identification of

medically important moulds at the level of

species by ITS sequencing is not a viable

alternative to conventional identification

methods.


Figura 1. Tempi di crescita su piastra per

lieviti, muffe e funghi dimorfi [20]

2. Introduzione

Il numero delle infezioni fungine é in continuo aumento soprattutto nei pazienti

immunocompromess [1]. L’identificazione precisa delle diverse specie nella diagnostica delle

micosi gioca dunque un ruolo molto importante per l’orientamento del trattamento medico.

Prendiamo per esempio il genere Scedosporium dove il Scedosporium apiospermun é sensibile ad

una determinata gamma di antimicotici mentre ill Scedosporium prolificans si mostra resistente alla

maggior parte di essi [2]. Oppure consideriamo il genere degli Aspergillus che comprendente più di

180 specie diverse, ma la principale causa di problemi broncopolmonari, delle cheratiti, delle

sinusiti, sopratutto nei pazienti immunocompromessi, sono unicamente l’Aspergillus fumigatus, l’A.flavus e A. terreus [3, 4].

L’identificazione delle diverse specie fungine può essere effettuata con l’analisi diretta al

microscopio ottico del campione, mediante la

coltura su piastra e la differenziazione morfologica

delle diverse strutture, con test sierologici per la

ricerca di antigeni o anticorpi e test biochimici.

Oggi queste tecniche non sono più soddisfacenti

soprattutto a livello diagnostico poiché sono

tecniche laboriose, poco standardizzabili e con

tempi di esecuzione molto lunghi in particolar

modo per quanto riguarda la coltura su piastra i qui

tempi variano da specie a specie, ma richiedono un

minimo di 48h d’incubazione [2].

In oltre nella maggior parte dei casi queste tecniche

non forniscono risultati accurati poiché presentano

una bassa specificità nell’identificazione della

specie [2].

L’utilizzo di tecniche di biologiamolecolare

permette invece un’identificazione rapida e specifica

con una sensibilità maggiore.

Molte pubblicazioni propongono infatti varie tecniche

fra le quali troviamo la PCR, la Real-time PCR, la PCR-Elisa, la RFLP (Restriction Fragment

Polymorfism) ecc. [5, 6, 7, 8, 21].

In questo lavoro si é deciso di testate come tecnica d’analisi per l’identificazione delle diverse

specie di muffe l’amplificazione mediante la PCR della regione altamente variabile ITS1 e ITS2

presente nel DNA ribosomiale.

Studi precedenti propongono l’utilizzo dei geni ribosomali poiché si presentano in più copie

all’interno del genoma e mostrano regioni conservate, come per esempio i geni 18S, 28S e 5.8S

comuni a tutti i funghi, e delle regioni altamente variabili fra le differenti specie, come le regioni

ITS. Queste regioni variabili sono quindi sfruttabili per la classificazione filogenetica e dunque

anche per un’identificazione a livello di specie necessaria per la diagnostica.[1, 3, 9, 10, 11].


3. I Funghi

Gli organismi che costituiscono il regno dei funghi sono organismi eucarioti, non fotosintetici,

aerobi o anaerobi, pluricellulari o unicellulari. Possono presentarsi come lieviti, muffe o funghi

dimorfi, essere saprofiti, parassiti oppure vivere in simbiosi con l’organismo ospite. Sono provvisti

di una parete cellulare rigida, che può essere pluristratificata, composta da cellulosa, emicellulosa o

chitina e presentano un citoplasma spesso multinucleato.

I lieviti sono organismi unicellulari ovali di 3-5 µm di diametro; si riproducono principalmente per

gemmazione e possono formare delle pseudoife.

Le muffe sono funghi pluricellulari caratterizzati da un elemento di crescita tubulare ramificato

detto ifa. L’ifa può essere suddivisa da setti parietali o no: ifa settata o cenocitica. Dal suo sviluppo

per estensione apicale e laterale viene a formarsi il micelio (o tallo). Il micelio viene detto

vegetativo se aderisce e penetra nel terreno di coltura o nel tessuto ospite, riproduttivo o aereo se le

sue ife si proiettano sulla superficie del terreno e portano le cellule riproduttive o spore.

I fungi dimorfi sono definiti come miceti in grado di presentarsi sotto forma di lieviti o muffe al

variare delle condizioni ambientali [4, 12].

I funghi si riproducono in maniera asessuata o in maniera sessuata attraverso la produzione di spore.

I due tipi di riproduzione possono alternasi durante il ciclo vitale. A dipendenza dello stadio in qui

si trova l’organismo, se nella forma telomorfa (riproduzione sessuata) o nella forma anamorfa

(riproduzione asessuata) possono prende una diversa nomenclatura. La specie Aspergillus nidulans,

per esempio, nella sua forma telomorfa prende il nome di Emericella nidulans (vedi allegato 11.4).

Se alla forma anamorfa é stata attribuita la stessa forma telomorfa allora si parla si sinamorfismo

[13].

Per molte specie e sconosciuta la forma telomorfa, perché l’organismo non é in grado di riprodursi

sessualmente oppure perché non é stata ancora identificata. Questi fungi vengono classificati in un

gruppo tassonomico artificiale: i Deuteromiceti o funghi imperfetti. Oggigiorno però, mediante

l’impiego di analisi molecolari la maggior parte dei Deuteromiceti é assegnata alla divisione degli

Ascomiceti ed una piccola parte ai Basidiomiceti [5].

La produzione assesuata avviene per scissione, gemmazione o formazione di spore. Queste a loro

volta possono essere prodotte per frammentazione e distacco di una parte della ifa oppure per

sporulazione. Le spore possono essere di tipo diverso, fra le più frequenti troviamo le tallospore,

formate per trasformazione di elementi preesistenti del tallo, oppure le conidiospore, prodotte da ife

specializzate.

La riproduzione sessuata prevede invece la plasmogamia e la cariogamia. Nei zigomiceti due ife

riproduttive si uniscono formando una zigospora all’interno della quale si formerà lo zigote che in

seguito a meiosi verrà liberato ed inizierà la fase asessuata.

Nei ascomiceti gli organi riproduttivi si uniscono formando l’asco contenente le ascospore. Nei

Basidiomiceti il corpo fruttifero produce numerosi basidi ciascuno dei quali svilluppa 4 spore [14].

(vedi tavole 11.1)


4. La classificazione

La classificazione odierna prevede quattro divisioni del regno dei funghi: Ascomycota,

Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota [13].

Le diverse specie sono state raggruppate in base alle caratteristiche morfologiche del tallo e delle

strutture riproduttive. Dal 1970, per ovviare alle differenti classificazioni presenti in letteratura

dovute soprattutto alle nomenclature diverse attribuite alla stessa specie, si é cercato d’introdurre fra

i criteri che definiscono una specie l’analisi del DNA. Il regno dei funghi é comunque in continua

evoluzione con ca. 20 nuove specie all’anno [5, 9, 15].

Tabella 1. Divisione del regno dei funghi con alcune classi ed ordini di intersesse medico [13]

Ascomicota

Archiascomycetes Pneumocystidiales

Hemiascomycetes Saccharomycetales

Euascomycetes Chaetothyriales Clavicipitales Dothideales Eurotiales Hypocreales Leotiales Microascales Onygenales Ophiostomatales Pezizales Phyllachorales Pleosporales Sordariales

Basidiomycota

Hymenomycetes Agaricales Stereales Tremellales

Urediniomycetes Sporidiales

Ustilaginomycetes Microstomatales Tilletiales Ustilaginales

Zygomicota

Zygomycetes Entomophthorales Mortierellales Mucorales

Chytridiomycota

Gli Ascomiceti rappresentano il più grande gruppo tassonomico del regno dei funghi. Raggruppano

il 50% di tutte le specie fungine e aprossimativamente l’80% dei funghi patogeni. Sono

caratterizzati da una riproduzione asessuata mediante la formazione di conidiospore e da una

riproduzione sessuata mediante la formazione di aschi contenenti le ascospore.

I Basisiomiceti comprendono circa 23'000 specie sopratutto funghi a cappello mangerecci. Sono

caratterizzati dalla formazione di copri fruttiferi contenenti numerosi basidi ciascuno dei quali

sviluppa 4 spore durante la riproduzione sessuata.


Fra i Zigomiceti, caratterizzati dalla formazione di zigospore, troviamo 1% di tutte le specie del

regno dei funghi, molti dei quali responsabili di infezioni cutanee e gastrointestinali nell’uomo.

In fine i Chitridiomiceti rappresentano i funghi meno sviluppati, caratterizzati sopratutto da una

struttura unicellulare e da una riproduzione asessuata mediante la formazione di zoospore [ 4, 9].

(vedi tavole 11.1)

5. Gli aspetti clinici

Su più di 10'000 specie descritte all’incirca 100 sono coinvolte in micosi umane o animali. Le

micosi possono essere superficiali se colpiscono solo i peli e gli strati più esterni dell’epidermide

senza provocare dunque una risposta immunitaria [13]. Vengono comunemente denominate con il

nome di tigna o piedra [4].

Le micosi cutanee coinvolgono invece l’epidermide, i capelli, le unghie e le mucose esterne come

per esempio quelle dei genitali [13]. Queste micosi sono causate sopratutto dai generi

Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton [4].

Le micosi sottocutanee interessano cute, sottocute, muscoli e ossa. La malattia si sviluppa

lentamente e può impiegare anche degli anni dopo la penetrazione per raggiungere il tessuto sotto

cutaneo [4].

Ci sono in fine le micosi profonde o sistemiche che colpiscono gli organi interni ed i visceri. Sono

causate sopratutto da funghi dimorfi penetrati all’interno dell’organismo per inalazione delle spore,

in seguito ad operazioni chirurgiche, tramite l’utilizzo di cateteri, ecc.. L’infezione nasce con una

lesione polmonare che può diventare cronica ed entrare nel sistema sanguineo fino a raggiungere

altri organi [4, 13,].

Tabella 2. Alcuni miceti d’importanza medica [4]


Troviamo poi le infezioni causate da fungi opportunisti come per esempio l’aspergillosi causate

soprattutto dall’ Aspergillus fumigatus, un fungo presente ovunque in natura che penetra all’interno

dell’organismo mediante l’inalazione delle spore causando problemi allergici e broncopolmonari.

Un’altro esempio di infezioni da funghi opportunisti sono le candidosi, causate dalla Candidaalbicans comunemente presente nella flora normale delle nostre mucose che prende il sopravvento

quando questa viene alterata. Queste micosi colpiscono sopratutto i neonati, i pazienti

immunocompromessi in seguito a neoplasie, leucemie, chemioterapie, AIDS oppure pazienti in cure

intensive, gli ustionati ed inseguito all’utilizzo prolungato di antibiotici [3,10,13].

6. Le regioni ITS1 e ITS2

I ribosomi degli organismi eucariotici sono formati da due subunità strutturali, 60S e 40S, costituite

da frammenti di rRNA e proteine che prendono il nome dalla misura della loro velocità di

sedimentazione, in seguito a centrifugazione, definita in unità di Svedberg (S).

La subunità 60S presenta i frammenti di rRNA 28S, chiamato anche LSU (large subunit), 5,8S e 5S

e circa 50 proteine. La subunità 40S presenta un unico frammento di RNA 18S, chiamato anche

SSU (small subunit) e circa 33 proteine.

Al momento della traduzione del mRNA queste subunità si uniranno per formare i ribosomi 80S

[16].

Tabella 3. Struttura dei ribosomi procarioti ed eucarioti [16]

Subunità rRNA Proteine

50S 23S + 5S ~ 31 PROCARIOTI 70 S

30S 16S ~ 21

60S 28S + 5,8S + 5S ~ 50 EUCARIOTI 80 S

40S 18S ~ 33

I geni che codificano per i diversi frammenti di rRNA sono geni ripetuti, costituenti

dell’organizzatore nucleolare, NOR (Nucleolus organizer region). All’interno del cromosoma sono

raggruppati in unità strutturali separate da sequenze spaziatrici non codificanti, NTS

(nontranscribed spacer) o IGS (intergenic spacer).

Ogni unità strutturale é costituita da un spaziatore trascritto esterno, ETS (external transcribed

spacer), situato all’estremità 3’ del gene 18S, due spaziatori trascritti interni, ITS (internal

transcribed spacer), situati rispettivamente: l’ITS1 fra il gene 18S ed il gene 5,8S, l’ITS2 tra il gene

5,8S e l’estremità 3’ del gene 28S ed in fine il gene 5S separato dal gene 28S da una sequenza

spaziatrice non codificante.

I geni 18S, 5,8S e 28S verranno trascritti dalla DNA polimerasi I in un pre-rRNA 45S che in

seguito a maturazione tramite eliminazione delle sequenze spaziatrici ETS ed ITS formerà i

rispettivi frammenti di rRNA. Il gene 5S verrà transcritto dalla DNA polimerasi III nel suo

corrispettivo rRNA.[6, 9, 17]


Figura 2. Struttura dei geni ribosomali degli organismi eucarioti


7. Materiali e metodi

7.1. Campioni

I diversi ceppi di fungi usati per questo lavoro provengono da una raccolta interna all’ICM

effettuata dal 1995 al 2005. La raccolta comprende ceppi ottenuti da campioni clinici, ceppi

provenienti da corsi di aggiornamento effettuati presso la BioMérieux e ceppi provenienti da

controlli di qualità della NEQAS (National External Quality assesment Service, Regno Unito), tutti

identificati morfologicamente all’interno dell’istituto.

I campioni sono conservati a temperatura ambiente in acqua sterile.

7.2. Coltura

I ceppi sono stati coltivati su piastre di Petri, contenenti 25 ml di agar Sabouraud Cloramfenicolo

(SAB CHL-D, bioMérieux, Svizzera), ed incubati a 37°C.

7.3. Estrazione

Per l’estrazione del DNA sono state testate due metodiche differenti previste per il mini kit DNeasy

Plant (Metodica 1) e per il kit QIAamp DNA extraction della QIAGEN (QIAGEN, Svizzera)

(Metodica 2). Le due metodiche presentano una versione modificata dei processi di lisi previsti per i

protocolli originali.

Metodica 1

Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura e depositarla in una

provetta Eppendorf. Aggiungere ca. 1,5 ml di azoto liquido ed attendere per ca. 30 s fino a completa

evaporazione dell’azoto. Mediante l’utilizzo di un pestello, schiacciare il micelio congelato fino a

ridurlo in una polvere fine.

Aggiungere 400 µl di tampone AP1 e 4µl di RNase A (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera

(vedi anche reagenti seguenti)) e vortexare vigorosamente. Incubare il tutto per 10 min a 65°C

miscelando 2 o tre volte durante l’incubazione. Aggiungere 130 µl di tampone AP2 ed incubare per

altri 5 min al freddo, immergendo le provette Eppendorf in un contenitore con ghiaccio.

Centrifugare il lisato per 5 min a 20'000 x g e trasferire il sovranatante in una QIAshedder Mini spin

column (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera). Centrifugare per 2 min a 20'000 x g e

aggiungere 795 µl di tampone AP3/E.

Pipettare 650 µl della soluzione in una DNeasy Mini spin column (DNeasy Plant Mini kit,

QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Ripetere il passaggio precedente con la

rimanente quantità di soluzione.


Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta, aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio

AW e centrifugare per 1 min a 6'000 x g . Ripetere l’operazione e centrifugare 2 min a 20'000 x g.

Eluire il DNA con 200 µl di tampone AE.

Metodica 2

Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura ed incubarla per

10 min a 98°C in 200 µl di soluzione di lisi contenente 5 µl di NaOH 1M, 20 µl SDS al 5%, e 175µl

H2O. Neutralizzare la soluzione con 200 µl di HCl 25 mM. Aggiungere 400 µl di tampone di lisi

AL (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera (vedi anche reagenti seguenti)) ed incubare per

altri 10 min a 98°C [7]. Aggiungere 400 µl di etanolo al 100% e centrifugare per 5 sec a 20'000 x g.

Caricare 600 µl del supernatante su una colonnina DNA Mini spin (QIAamp DNA Mini Kit,

QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g.

Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta ed aggiungere 500µl di soluzione di lavaggio

AW1. Centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Riposizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta

ed aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio AW2 . Centrifugare per 3 min a 20'000 x g.

Effettuare un’ulteriore centrifugazione per 1 min a 20'000 x g per asciugare completamente la

membrana della colonnina. Eluire il DNA con 200 µl di tampone di eluizione AE.

7.4. PCR

La PCR prevede l’amplificazione della regione ITS che comprende i geni spaziatori non codificanti

ITS1 e ITS2 ed il gene 5,8S, mediante l’utilizzo del forward primer ITS1 ed il revers primer ITS4

(Microsynth, CH) [3].

ITS1: 5’- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G -3’ 19 bp ITS4: 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’ 20 bp

Il mix di reazione per un campione contiene 28,65 µl H2O molecular grade (FLUKA, Svizzera),

5 µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP,

dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera),

1µl ITS1, 1µl ITS4 10 µM (Microsynth, Svizzera), 0,1 µl UNG (1U/µl)(Uracil DNA Glicosilasi,

Roche, Svizzera) e 10 µl di DNA estratto.

La reazione d’amplificazione é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700,

USA) e prevede un ciclo di prePCR di 5 min a 37°C, per l’attivazione dell’UNG e 15 min a 95°C

seguito da 40 cicli suddivisi in: 30 sec a 95 °C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C per l’estensione del

frammento. Si conclude con un’estensione finale 72°C per 1 min.


7.5. Seminested PCR

Per i campioni per i quali la PCR ha fornito scarse quantità di amplificato é stata eseguita una

reazione di seminested PCR mediante l’utilizzo del forward primer ITS86 ed il reverse primer ITS4

[18].

ITS86: 5’- GTG AAT CAT CGA ATC TTT GAA C -3’ 22 bp ITS4: 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’ 20 bp

Il mix di reazione per un campione contiene 37, 75 µl H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 5

µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP,

dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera),

1µl ITS86, 1µl ITS4 10µM (Microsynth, Svizzera) e 1 µl di DNA amplificato.

I diversi passaggi della reazione d’amplificazione corrispondono a quelli visti per la PCR (vedi

paragrafo precedente).

7.6. Controlli

Per il controllo delle reazioni d’amplificazione sono stati usati 3 controlli positivi. Il BRF 15

Trichophyton rubrum, isolato da un campione clinico di pelle. Il BRF 24 Candida glabrata, isolato

da un espettorato e il BRF 32 Cladosporium sp. isolato da un campione clinico proveniente da

un’infezione batterica. La grandezza del loro prodotto di amplificazione con i primer ITS1 e ITS4

corrisponde rispettivamente a : Candida glabrata 820 bp, Cladosporium sp. 549 bp, Trichophytonrubrum 692 bp [6, 7].

Figura 3. Migrazione elettroforetica in

gel d’agarosio 1,5% dei controlli positivi.

1) DNA Molecular Weight Marker XIV

100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo

negativo, 3) campione 135, 4) 46, 5) 27,

6) 79a, 7) 79b, 8) BFR 32 Cladosporium sp. 549 bp, 9) BFR 15 Trichophyton rubrum 692 bp, 10) BFR 24 Candida glabrata 820 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


7.7. Elettroforesi

I prodotti ottenuti dopo amplificazione sono stati fatti migrare mediante elettroforesi su gel di

agarosio al 1,5% in tampone TBE 1x a 10Volt/cm2

per circa 30 min. Per ogni campione sono stati

depositati 10µl dell’amplificato. Dopo elettroforesi il gel é stato immerso per circa 10 min in una

soluzione di bromuro di etidio (0,5-1.0 µg/ml), lavato in acqua e depositato in un transilluminatore

UV per la messa in evidenza dei frammenti di DNA.

7.8. Purificazione dei prodotti PCR

I campioni amplificati sono stati purificati mediante l’utilizzo di colonnine Montage PCR (Milliore,

Svizzera) sulle quali sono stati depositati 40 µl di amplificato. Dopo centrifugazione per 5 min a

1'020 x g, il DNA é stato eluato con 20 µl di tampone di eluizione AE (QIAamp DNA Mini Kit,

QIAGEN, Svizzera) e con sucessiva centrifugazione di 2 min a 1'020 x g.

7.9. Reazione di sequenza

Per ogni amplificato purificato sono state effettuate due reazione di sequenza usando separatamente

il primer ITS1 o il primer ITS86, per i campioni amplificati con la seminested PCR, e il primer

ITS4.

Il mix di reazione di sequenza contiene 2 µl di BigDye Reaction Mix, 3µl di tampone 5x Buffer

BigDye (ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Applied Biosystems, USA), 4µl di

H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 3µl di un primer 1µM(ITS1, ITS86 o ITS4) (Microsynth,

Svizzera) per mix di reazione e 3 µl di DNA purificato.

La reazione di sequenza é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700, USA) e

prevede 25 cicli suddivisi in: 10 sec a 96 °C per la denaturazione del DNA, 5 sec a 50°C per

l’ibridazione del primer e 4 min a 60°C per l’estensione del frammento.

7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza

I prodotti ottenuti dalla reazione di sequenza sono stati purificati mediante l’utilizzo di mini colonne

di Sephadex G50 (Sephadex G50 fine, Amersham Bioscences) ottenute mediante centrifugazione di

900µl della soluzione di Sephadex per 3 min a 770 x g. Sulle colonnine sono stati caricati e

centrifugati, per 3 min a 770 x g, i 15µl del prodotto della reazione di sequenza.


7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica

I prodotti purificati della reazione di sequenza sono stati sequenziati mediante l’utilizzo del

sequenziatore automatico ABI Prism 310 (Applied Biosystems, USA). Sul sequenziatore sono stati

caricati 5 µl di prodotto della reazione di sequenza e 15 µl di H2O molecular grade (FLUKA,

Svizzera).

7.12. Analisi delle sequenze

Le sequenze ottenute sono state corrette manualmente mediante la lettura dell’ettroferogramma e

mediante l’allineamento dei frammenti ottenuti con il forwar primer ed il revese primer.

L’allineamento delle sequenze é stato effettuato con il programma MEGA 3.0 (Molecular Evolution

Genetics Analysis).

Le sequenze consenso sono state confrontate con le sequenze presenti nella GenBank usando il

BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) della NCBI (National Center for Biotecnology

Information, USA) per l’identificazione del frammento.

L’identificazione é stata fatta in base alla maggior percentuale di omologia della sequenza

analizzata rispetto alle sequenze presenti nella banca dati.

Le sequenze presenti nella GenBank con maggior omologia sono state prese come sequenze di

riferimento e sono state introdotte nel programma d’analisi MEGA 3.0. Queste sequenze sono state

in seguito utilizzate come riferimento per il taglio del frammento nella regione esatta ITS1 ed ITS2.

7.13. Costruzione dell’albero filogenetico

Le sequenze ottenute e le sequenze di riferimento prese dalla GenBank (NBCI) sono state allineate

mediante l’uso del programma MEGA 3.0. La costruzione dell’albero, che rappresenta le relazioni

esistenti tra le sequenze, é stata fatta in base al numero di differenze di nucleotidi utilizzando il

metodo matematico UPGMA (Unweighted pair group method using aricmetic averages).


8. Risultati

8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA

L’ottenimento del DNA da amplificare inizia con la lisi cellulare, ma la struttura della parete

cellulare dei funghi composta da chitina, glucani, lipidi e peptidi presenti in forma variabile da

specie a specie, influisce con le diverse metodiche di estrazione che siano enzimatiche, chimiche o

fisiche. Trovare un metodo che sia adatto per tutte le diverse especie risulta dunque molto difficile

[5].

Per questo lavoro sono state testate due metodiche che si basano su due processi di lisi diversi. La

Metodica 1 prevede una lisi cellulare mediante reazione meccanica, chimica e termica, mentre la

Metodica 2 si basa su reazioni chimiche e termiche.

L’efficienza dell’estrazione del DNA delle due metodiche è stata verificata mediante l’utilizzo della

PCR con i primers ITS1 e ITS4 effettuata su 8 campioni appartenenti a 8 specie diverse aventi lo

stesso volume di eluizione pari a 200 µl di tampone AE (QIAamp DNA Mini Kit, DNeasy Plant

Mini Kit, QIAGEN, Svizzera).

Si è ottenuta un’amplificazione di 7/8 campioni con la Metodica 1 e di 8/8 campioni con la

Metodica 2.

Tabella 4. Campioni usati per il confronto delle 2 metodiche di estrazione

L’analisi dei diversi amplificati migrati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1,5% ed

evidenziati con bromuro di etidio non mostra differenze significative delle diverse bande di

migrazione.

I tempi di esecuzione per ambedue le metodiche si aggirano attorno ai 30 min ca..

Estrazione DNA SpecieIdentificazione fenotipica

Ceppo No. Micoteca Metodica 1 Metodica 2

Aspergillus candidus M6558/03 90 + +

Aspergillus flavus Neqas 6657/M19635 94 + +

Aspergillus fumigatus - 56 + +

Aspergillus nidulans R10937/03 91 + +

Aspergillus japonicus M9618/CQ015888 62 + +

Aspergillus ochraceus M45878/02 82 + +

Aspergillus versicolor Neqas 6406/M35301 83 + +

Malbranche sp. M42299 N.P. - +


Figura 4.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 1 (versione

modificata DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio. 1) DNA

Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4) 91, 5)

82, 6) 94, 7) 83, 8) 62, 9) M42299, 10) 90

Figura 5 Figura 6.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 2

(versione modificata QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio.

1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4)

90, 5) M42299, 6) 94, 7) 62, 8) 83, 9) 82, 10) 91

Per lo svolgimento del lavoro si è così scelto l’utilizzo della Metodica 2, non solo per il maggior

numero di risultati positivi ma anche perché si presenta manualmente più facile da eseguire. Infatti,

questa metodica presenta un minor numero di passaggi riducendo dunque i rischi di contaminazione

e soprattutto non prevede l’utilizzo dell’azoto liquido; sostanza non facilmente maneggiabile.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


8.2. Coltivazione su piastra

Sono stati coltivati su piastra agar Sabouraud Cloramfenicolo a 37°C, 86 ceppi appartenenti a 49

specie diverse (vedi allegato 11.2) selezionati dalla micoteca in modo casuale. Si è riscontrata una

crescita per 77/86 campioni .

Tabella 5. Campioni non cresciuti

SpecieIdentificazione fenotipica

Ceppo No. Micoteca

Absidia corymbifera Neqas 5891/M9621 64

Acremonium sp. Neqas 6210/M7440 75

Alternaria alterneta Neqas 6325/M19931 78

Alterneria alternata CQ12.96 35

Aspergillus terreus CQ99/M14318 54

Aureobasidium sp. - 57

Cunninghamella berthalletiae CQ99/M28018 53

Geotrichum candidum ID ZH/95 1

Mucor sp. 48

8.3. Estrazione e amplificazione

Sono state eseguite 143 estrazioni, utilizzando la Metodica 2, per i 77 ceppi con un’amplificazione

positiva della regione ITS1-5,8S-ITS2 per 66/77 campioni.

Per i campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophyton tonsurans 3, è stata

eseguita una seconda amplificazione di PCR seminested poiché la prima amplificazione a fornito

scarse quantità di amplificato.

Tabella 5 Estrazioni DNA non riuscite

SpecieIdentificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca

Caldosporium cladosporioides M29240 71

Cladosporium sp. M753/97 41

Cladosporium sphaerospermum Neqas 7355/M5569 140

Cunninghamella bertholletiae Neqas 6659/M19638 96

Fusarium oxysporum R36234 119

Fusarium solani M35303/02 79

Hormographiella aspergillata R8459 139


Tabella 5. (Continuazione)

SpecieIdentificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca

Malbranchea sp. Tbc22067 113

Microsporum persicolor corso 2004 BioMérieux 135

Monascus ruber CQ99 2

Trichoderma sp. M948 27

8.4. Sequenze

Sono state ottenute 56/66 sequenze della regione ITS1-5.8S-ITS2 di 56 ceppi differenti appartenenti

a 36 specie diverse (vedi allegato 11.2.) mediante l’amplificazione con i primer ITS1 e ITS4. Le

sequenze corrette (vedi.) presentano una lunghezza variabile fra 286-810 bp e un omologia

compresa fra il 90-100 % con le sequenze di riferimento prelevate dalla GenBank (NCBI).

Come sequenze di riferimento sono state prese dalla GenBank (NCBI) 80 sequenze che

presentavano la maggior percentuale di omologia per le rispettive sequenze analizzate. Queste

sequenze provengono dall’analisi di ceppi certificati e ceppi ottenuti da altri istituti di ricerca.

(vedi allegato 11.3)

Le sequenze dei campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophytontonsurans 3, ottenute con la seminested PCR sono state escluse dal lavoro poiché non coprivano

l’intero gene.

8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante l’analisi delle sequenze

Fra i campioni per i quali si é ottenuta la sequenza del frammento ITS1-5.8S-ITS2, l’identificazione

morfologica forniva un’identificazione a livello di specie per 44/56 ceppi. I restanti 12 ceppi erano

identificati a livello di specie.

L’identificazione mediante l’analisi delle sequenze ha fornito invece un’identificazione a livello di

specie per 36/56 ceppi, di genere 19/56 e di ordine 1/56.

Tabella 6. Confronto fra identificazione morfologica e genotipica

Identificazione morfologica Analisi della sequenza

Specie 78,6% (44/56) 64,3% (36/56)

Genere 21,4% (12/56) 33,9% (19/56)

Ordine - 1,8% (1/56)


Messe a confronto, le due tecniche presentano un’identificazione identica per 32/56 campioni di qui

25 campioni identificati a livello di specie e 7 a livello di genere con un’omologia con le sequenze

di riferimento che varia dal 90-100%.

Si può notare come per tre ceppi differenti di Aspergillus flavus la sequenza risulta identica alla

sequenza della specie Aspergillus oryzae.Il campione No. 98 Absidia corymbifera presenta un’omologia al 100% con l’Absidia corymbifera ATCC 46774. La sequenza di riferimento però, copre solamente la regione 5.8S-ITS2.

L’identificazione fenotipica a livello di specie risulta più discriminante per 12/56 campioni, mentre

a livello di genere per 1/56 campioni.

Al contrario l’identificazione a livello di specie effettuata mediante l’analisi delle sequenze risulta

più discriminante per 4/56 campioni le qui percentuali di omologia variano fra il 92-100%.

Infine per 7/56 campioni otteniamo delle identificazioni contrastanti. Di questi, 6 campioni sono

comunque classificati correttamente a livello di genere.

Dunque possiamo dire che l’identificazione mediante l’analisi delle sequenze fornisce

un’identificazione identica a l’identificazione fenotipica a livello di genere per 55/56 campioni.

Tabella 7. Confronto fra identificazione fenotipica ed identificazione mediante l’analisi delle sequenze a livello di

genere e specie

No. campioni Percentuale

Identificazione fenotipica a livello di genere identica

all’identificazione mediante sequenza

55/56 98,2%

Identificazione fenotipica a livello di specie identica

all’identificazione mediante sequenza

25/56 44,6%

Identificazione fenotipica a livello di specie più

discriminante

12/56 21,4%

Identificazione mediante sequenza a livello di specie

più discriminante

4/56 7,14%

Risultati discrepanti fra fenotipo e sequenza a livello

di specie

7/56 12,5%


L’albero filogenetico é stato creato mediante il programma MEGA 3.0 introducendo 80 sequenze di

riferimento provenienti dalla GenBank (NCBI) e le 56 sequenze ottenute appartenenti a 36 specie

diverse. L’albero mostra un buon raggruppamento degli ordini e delle famiglie salvo per il

campione 55 Paecilomices lilacinus, appartenente all’ordine delle Eurotiales, e il campione 99

Geotricum candidum, appartenente appartenente all’ordine dei Saccharomycetales, i quali si

trovano raggruppati all’interno dell’ordine delle Hypocreales. (vedi allegato 11.5)


Tabella 8. Tabelle risultati

A. Identificazione fenotipica a livello di specie identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2

No. MicotecaICM Ceppo


SpecieIdentificazione ITS

Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI)

No. GenBank (NCBI)

98 Neqas 6758/M34707 Absidia corymbifera Absidia corymbifera 100% di omologia con Absidia corymbifera ATCC 46774 AF117937

90 M6558/03 Aspergillus candidus Aspergillus candidus 100% di omologia con Aspergillus candidus ATCC 1002 AY373842

18 DSM 816/95 Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus 100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847

102 - Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus 100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847

5 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790


15 CQ99 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790



62 M9618/CQ015888 Aspergillus japonicus Aspergillus japonicus 100% di omologia con Aspergillus japonicus CBS 61178 AY585562

100% di omologia con Aspergillus aculeatus CBS 17266 AY585558

32 R5340 esp 96 Aspergillus niger Aspergillus niger 100% di omologia con Aspergillus niger ATCC 16888 AY373852

37 CQ97/M89 Aspergillus terreus Aspergillus terreus 100% di omologia con Aspergillus terreus ATCC 1012 AY373871

83 Neqas 6406/M35301 Aspergillus versicolor Aspergillus versicolor 100% di omologia con Aspergillus versicolor 2014 AM158229

99% di omologia con Aspergillus versicolor ATCC 9577 AY373880

138 Corso BioMérieux Epidermophyton floccosum Epidermophyton floccosum 100% di omologia con Epidermophyton floccosum ATCC 26072 AY213646

99 Neqas 6759/M34711 Geotrichum candidum Galactomyces geotrichum 99% di omologia con Galactomyces geotrichum YF01C DQ668351

76 M19220/02 Microsporum canis Microsporum canis 100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657

100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329

111 M21559 Microsporum canis Microsporum canis 100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657


11 VA2397/97 Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61 AJ970141

117 M35037 Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 99% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 161.69 AJ000621


A. (continuazione)

No. Micoteca ICM Ceppo




No. GenBank (NCBI)

136 Corso BioMérieux Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61 AJ970141

137 Corso BioMérieux Microsporum praecox Microsporum praecox 100% di omologia con Microsporum praecox CBS 468.74 AJ970148

55 CQ00/17436 Paecilomyces lilacinus Paecilomyces lilacinus 100% di omologia con Paecilomyces lilacinus ATCC 10114 AY213665

61 Neqas 5775/M38017 Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii 99% di omologia con Paecilomyces variotii NRRL 1115 AF033395

Paecilomyces variotii 97% di omologia con Paecilomyces variotii ATCC 22319 AY373941

149 Neqas 7640/M36113 Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii 99% di omologia con Paecylomices variotii NRRL 1115 AF033395

97% di omologia con Paecylomices variotii ATCC 22319 AY373941

N.P.1 VA460449 Schizophyllum comune Schizophyllum commune 100% di omologia con Schizophyllum commune HNO34 AF280758

1 N.P., campione non presente nella micoteca


B. Identificazione fenotipica a livello di genere identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2





No. GenBank (NCBI)

51 - Acremonium sp. Acremonium sp. 100% di omologia con Acremonium sp. KMU 4529 AB158290

100% di omologia con Acremonium strictum UW 836 AY138844

116 M25474 Acremonium sp. Hypocreales sp. 97% di omologia con Hypocreales sp. LM92 EF060464

68 Neqas 6019/M22420 Exophiala sp. Exophiala sp. 90% di omologia con Exophiala sp. CBS 115831 AY857539

90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589

24 - Fusarium sp. Fusarium sp. 100% di omologia con Fusarium oxysporum Ppf15 EF495237

100% di omologia con Fusarium sp. 448 AY729069

100% di omologia con Fusarium subglutinans CNFM 960512 AY898246

72 M4938 Penicillium sp. Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903

100% di omologia con Penicillium commune wb153 AF455544

100% di omologia con Penicillium sp. PC6 EF105368

93 R13266/03 Penicillium sp. Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium citrinum WM 05.3 DQ249207

100% di omologia con Penicillium westlingii NRRL 800 AF033423

105 R5798 Trichoderma sp. Trichoderma sp. 100% di omologia con Hypocrea jecorina ATCC 24449 DQ000625

100% di omologia con Hypocrea schweinitzii ICMP 5426 X93966

100% di omologia con Trichoderma longibrachiatum ATCC52326 Z48935

147 M39284/05 Trichoderma sp. Trichoderma sp. 100% di omologia con Hypocrea koningii GJS 95-175 AF456923

100% di omologia con Hypocrea rufa GJS 96-47 AJ230685

100% di omologia con Trichoderma koningiopsis Dis326h DQ379015

100% di omologia con Trichoderma ovalisporum Dis 203c DQ315458

100% di omologia con Trichoderma sp. YM2 AB297794


C. Identificazione fenotipica a livello di specie più discriminante dell’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2





No. GenBank(NCBI)

50 CQ98/9792 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782

100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857

94 Neqas 6657/M19635 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782


N.P. CQR5708 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782


91 R10937/03 Aspergillus nidulans Aspergillus sp. 100% di omologia con Emericella nidulans NRRL 2395 AY373888

100% di omologia con Emericella dentata IFM 42021 AB249000

100% di omologia con Emericella quadrilineata UWFP 613 AY213644

100% di omologia con Emericella cleistominuta IFM 48170 AB248989

100% di omologia con Emericella rugulosa IFM 54242 AB249002

82 M45878/02 Aspergillus ochraceus Aspergillus sp. 99% di omologia con Aspergillus ochraceus ATCC 18412 AY373854

99% di omologia con Aspergillus westerdijkiae NRRL 35197 DQ250530

25 M1023/95 Aspergillus versicolor Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus versicolor NHRC-FE078 AJ937755

100% di omologia con Emericella nidulans 2172 AM158232

90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589

86 M4859/03 Fusarium oxysporum Fusarium sp. 99% di omologia con Fusarium oxysporum 10L-201-Mexico AY904065

99% di omologia con Fusarium bulbicola NRRL 13618 U61676

99% di omologia con Gibberella sacchari wb 395 AF455450

99% di omologia con Fusarium lactis NRRL 25200 U61681

99% di omologia con Gibberella moniliformis FV 4773 AY428795

34 CQ12.96 Fusarium solanii Fusarium sp. 100% di omologia con Fusarium oxysporum FO-05 AY928412

100% di omologia con Fusarium solani WB 853 AY569560


C. ( Continuazione)





No. GenBank(NCBI)

133 Corso BioMérieux Microsporum audouinii Microsporum sp. 99% di omologia con Microsporum audouinii CBS 344.50 AJ252333

100% di omologia con Microsporum rivalieri CBS 409.51 AJ000625

100% di omologia con Microsporum langeronii CBS 408.51 AJ252334

134 Corso BioMérieux Microsporum canis Microsporum sp. 99% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657


99% di omologia con Microsporum ferrugineum CBS 426.63 AJ252338

143 Neqas 7432/M14243 Penicillium Chrysogenum Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903

100% di omologia con Penicillium commune wb153 AF455544

100% di omologia con Penicillium sp. PC6 EF105368

81 CQ5/02/M19992 Rhizopus oryzae Rhizopus sp. 100% di omologia con Rhizopus oryzae CBS 395.95 AY213684

100% di omologia con Rhizopus japonicus AHU6525 AB097347

100% di omologia con Rhizopus microsporus AHU6527 AB097348

100% di omologia con Amylomyces rouxii SDM34 AB181338


D. Identificazione a livello di specie mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 più discriminante dell’identificazione fenotipica





No. GenBank(NCBI)

110 M21439 Chaetomium sp. Chaetomium funicola 92% di omologia con Chaetomium funicola CBS 141.50 AJ279450

20 M1292/97 Chrysosporium sp. Chrysosporium keratinophilum 100% di omologia con Chrysosporium keratinophilum IFO 7584 AJ131681

46 M19793/98 Penicillium sp. Penicillium nalgiovense 100% di omologia con Penicillium nalgiovense IBT 12108 AJ004895

N. P. M42299 Malbranchea sp. Auxarthron conjugatum 97% di omologia con Auxarthron conjugatum GFI 149 AJ608967


E. Risultati discrepanti fra identificazione fenotipica e identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 a livello di specie





No. GenBank(NCBI)

13 M430/95 Aspergillus candidus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790

69 Neqas 6020/M22415 Aspergillus nidulans Emericella corrugata 100% di omologia con Emericella corrugata IFM 54743 AB264794

21 M41912/01 Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus reticulisporus 100% di omologia con Aphanoascus reticulisporus AJ390381

Chrysosporium articulatum 100% di omologia con Chrysosporium articulatum UAMH 4320 AJ007841

95 Neqas 6658/M19637 Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus fulvescens 100% di omologia con Aphanoascus fulvescens UAMH 5117 AF038357

40 M742/97 Curvularia lunata Curvularia trifolii 100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403 AF455446

38 M1609/96 Exophiala spinifera Exophiala jeanselmei 100% di omologia con Exophiala jeanselmei CBS 463.80 AY163552

Exophiala oligosperma 100% di omologia con Exophiala oligosperma IP 2118.92 DQ836797

100 Neqas6760/M34712 Paecilomyces lilacinus Curvularia trifolii 100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403 AF455446


9. Discussione

L’identificazione della specie nella diagnostica delle micosi gioca un ruolo fondamentale per lo

svolgimento del trattamento medico. Un’identificazione basata sulla morfologia delle ife o delle

spore non é purtroppo sempre facile da eseguire poiché specie molto vicine filogeneticamente

possono presentare tratti fenotipici uguali o difficilmente differenziabili.

Oltre alle difficoltà di identificazione morfologica dobbiamo prendere in considerazione i tempi che

la crescita su piastra prevede: tempi troppo lunghi per un tipo di diagnostica che vuole risultati

precisi in tempi sempre più brevi.

In questo lavoro si é voluto così testare una tecnica alternativa, che fosse più specifica rispetto alla

morfologia nella determinazione della specie, e che in un futuro potesse essere applicata ad una

determinazione direttamente dal campione.

Si é deciso quindi, di effettuare l’identificazione dei diversi funghi mediante analisi delle sequenze

dei geni ITS1-5.8S-ITS2.

Le sequenze di 56 ceppi appartenenti a 36 specie diverse ottenute tramite amplificazione del DNA

ribosomale, mediante l’impiego di primers specifici per i funghi, sono state confrontate con le

sequenze presenti nella GenBank (NCBI) ed i risultati ottenuti sono stati messi a confronto con

l’identificazione fornita dalla morfologia.

I risultati ottenuti mostrano un’alta specificità di questa tecnica nell’identificazione esatta a livello

di genere con un’identificazione corrispondente all’identificazione morfologica di 55/56 (98,2%)

ceppi.

A livello di specie purtroppo si é riscontrato che l’identificazione morfologia riesce ad essere più

discriminante con un’identificazione di specie di 44/56 ceppi (78,6%) rispetto all’identificazione

mediante l’analisi delle sequenze che posiziona a livello di specie 36/56 (64,3%) ceppi fra i quali

solamente 25 con un’identificazione identica all’identificazione fenotipica.

Da notare che per 4 campioni dove la morfologia forniva solo la classificazione a livello di genere

l’identificazione mediante la sequenza é risultata più discriminante.

Si può dunque concludere che l’identificazione dei diversi funghi mediante l’analisi dei geni ITS1-

5,8S-ITS2 non può sostituire un’identificazione morfologica bensì essere un appoggio in caso di

difficoltà nell’identificazione fenotipica.

Altre prospettive di analisi potrebbero contemplare invece l’utilizzo dell’amplificazione della

regione ITS accompagnata dall’amplificazione di un’altro gene ribosomiale come potrebbe essere il

28S o il 18S. Oppure ancora si potrebbe cercare di classificare le diverse specie mediante l’utilizzo

di geni codificanti per alcune proteine come l’actina, la chitina sintetasi, l’acetil coenzima sintetasi e

sopratutto l’Ŭ-tubulina e la ɓ-tubulina, due geni che si presentano altamente variabili fra le diverse

specie [9,19].


10. Bibliografia

1. J. L. Rakeman, U. Bui, K. LaFe, Y.-C. Chen, R. J. Honeycutt, B. T. Cookson; Multilocus

DNA Sequence Comparisons Rapidly Identity Pathogenic Molds; Journal of Clinical

Microbioly, 43, 3324-3333, 2005

2. J. Pontón; Diagnostico micróbiologico de las micosis; Revista Iberoamericana de Micología,

19, 25-29, 2002

3. T. Henry, P. C. Iwen, S. H. Hinrichs; Identification of Aspergillus Species Using Internal

Transcribed Spacer Regions 1 and 2; Journal of Clinical Microbiology, 38, 1510-1515, 2000

4. L. M. Prescott, J. P. Harley, D. A. Klein; Microbiologie; 2° ed., De Boeck Université,

Bruxelles, 2003

5. D. E. Ciardo; Molecular Identification of Fungal Pathogens using the ITS Region; Diss.

ETH 16410, 2006

6. L. B. Lourenço, P. C. A. Garcia, S. M. Recco-Pimentel; Restriction fragment analysis of the

ribosomal DNA of Paratelmatobius and Scythrophrys species (anura, Leptodactyliadae);

Genetics and Molecular Biologi, 26, 139-143, 2003

7. P. H. Hendolin, L. Paulin, P. Koukila-Kähkölä, V. J. Antilla, H. Malmberg, M. Richardson,

J. Ylikoski; Panfungal PCR and Multiplex Liquid Hybridization for Detection of Fungi in

Tissue Specimens; Journal of Clinical Microbiology, 38., 4186-4192, 2000

8. SH. Mirhendi, P. kordbacheh, B. Kazemi, S. Samiei, M. Pezeshki, MR. Khorramizadeh; A

PCR-RFLP Method to identification of the Important Opportunistic Fungi: Candida Species,

Cryptococcus neoformans, Aspegillus fumigatus and Fusarium solani; Iranian Journal

Publique Health, 30, 103-106, 2001

9. J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical

Microbiology Reviews, 12, 454-500, 1999.

10. S. N. Leaw, H. C. Chang, H. F. Sun, R. Barton, J. Bouchara, T. C. Chang; Identification of

Medically Yeast Species by Sequence Analysis of the Internal Transcribed Spacer Regions;

Journal of Clinical Microbiology, 44, 693-699, 2006

11. S. F. Yeo, B. Wong; Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive

Fungal Infections; Clinical Microbiology Reviews, 15, 465-484, 2002

12. G. Delfino, E. Lanciotti, G. Liguri, M. Stefani; Medicina e Biologia, Dizionario

enciclopedico, 2° ed., Zanichelli, 2003

13. G.S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras; Atlas of Clinical fungi; 2° ed., Universitat

Rovira i Virgili, Netherlands, 2000

14. G. Deysson, A. Delcourt; Cryptogamie, Mycologie générale et appliquée; 2° ed., SEDES et

C.D.U., Paris, 1980


15. M. R. Costa, C. Da Silva Lacaz, M. Kawasaki, Z. P. De Camargo; Conventional versus

molecular diagnostic test; Medical Mycology, 38, 139-145, 2000

16. Lodish et al.; Biologie moléculaire de la cellule; 3° ed. De Boeck Université, Bruxelle, 1997

17. D. LJ Lafontaine, D. Tollervey; Ribosomal RNA, Encyclopedia of life Sciences,

www.els.net, 2001

18. C. Ferrer, F. Colom, S. Frases, E. Mulet, J. L. Abad, J. L. Alió; Detection and Identification

of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5,8S Ribosomal DNA Typing in Ocular

Infections; Journal of Clinical Microbiology, 39., 2873-2879, 2001

19. P. J. Keeling; Congruent evidence from Ŭ-tubulin and ɓ-tubulin gene phylogenies for a

zygomycete origin of microsporidia; Fungal Genetics and Biology, 38, 298-309, 2003

20. A. J. Morris, T. C. Byrne, J. F. Madden, L. B. Reller; Duration of Incubation of Fungal

Cultures; Journal of Clinical Microbiology, 34, 1583-1585, 1996

21. J. Loeffler, N. Henke, H. Hebart, D. Schmidt, L. Hagmeyer, U. Schumacher, H. Einsele;

Quantification of Fungal DNA by Using Fluorescence Resonance Energy Transfer and the

Light Cycler system; Journal of Clinical Microbiology, 38, 586-590, 2000

22. H. Einsele, H. Hebart, G. Roller, J. Löffler, I. Rothenhöfer, C. A. Müller, R. A. Bowden, J.

Van Burik, D. Engelhard, L. Kanz, U. Schumacher; Detection and Identification of Fungal

Pathogens in Blood by Using Molecular Probes; Journal of Clinical Microbiology, 35, 1353-

1360, 1997

23. K. Voigt, E. Cigelnik, K. O’Donnell; Phylogeny and PCR Identification of Clinically

Important Zygomycetes Based on Nuclear Ribosomal-DNA Sequence Data; Journal of

Clinical Microbiology, 37., 3957-3964, 1999


11. Allegati


11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti,Zigomiceti e Basidiomiceti

Tavola 1. Ascomiceti

J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology

Reviews, July, 454-500, 1999.


Tavola 2. Zigomiceti


Reviews, July, 454-500, 1999.


Tavola 3. Basidiomiceti


Reviews, July, 454-500, 1999.


11.2. Lista dei campioni

Specie Ceppo No. Micoteca No. Sequenza

Sequenza ITS1-5.8S-ITS2 Lunghezza frammento bp

Absidia corymbifera Neqas1 5891/M9621 64 -

Absidia corymbifera R12109/01 66 -

Absidia corymbifera Neqas 6758/M34707 98 810

Acremonium sp. CQ97/M89 39 -

Acremonium sp. M18768/98 45 -

Acremonium sp. - 51 492

Acremonium sp. Neqas 6210/M7440 75 -

Acremonium sp. M25474 116 488

Alternaria alterneta Neqas 6325/M19931 78 -

Alterneria alternata CQ12.96 35 -

Aphanoascus fulvescens M732/ZH96 31 -

Arthrinium phaeospermium M29513/05 146 -

Aspergillus candidus M430/95 13 512

Aspergillus candidus M6558/03 90 508

Aspergillus clavatus DSM 816/95 18 515

Aspergillus clavatus - 102 515

Aspergillus clavatus Neqas 7021/M19740 109 -

Aspergillus flavus CQR5708 N.P.2 / CQR5708 510

Aspergillus flavus CQ98/9792 50 510

Aspergillus flavus Neqas 6657/M19635 94 510

Aspergillus fumigatus - 5 512


Aspergillus fumigatus CQ99 15 512



Aspergillus glaucus CQ00/M19448 58 -

Aspergillus japonicus M9618/CQ015888 62 490

Aspergillus nidulans Neqas 6020/M22415 69 481

Aspergillus nidulans R10937/03 91 481

Aspergillus niger R5340 esp 96 32 514

Aspergillus ochraceus M45878/02 82 504

Aspergillus terreus CQ97/M89 37 523

Aspergillus terreus CQ99/M14318 54 -

Aspergillus versicolor M1023/95 25 482

Aspergillus versicolor Neqas 6406/M35301 83 471

Aureobasidium sp. - 57 -

Bipolaris sp. M26530 115 -

Caldosporium cladosporioides M29240 71 -

Chaetamium sp. M21439 110 488




Chrysosporium keratinophilum M41912/01 21 515

Chrysosporium keratinophilum Neqas 6658/M19637 95 516

Chrysosporium sp. M1292/97 20 520

Cladosporium sp. M753/97 41 -

Cladosporium sphaerospermum Neqas 7355/M5569 140 -

Cunninghamella berthalletiae CQ99/M28018 53 -

Cunninghamella bertholletiae Neqas 6659/M19638 96 -

Curvularia lunata M742/97 40 515

Epidermophyton floccosum corso 2004 BioMérieux 138 695

Exophiala sp. Neqas 6019/M22420 68 540

Exophiala spinifera M1609/96 38 541

Fusarium oxysporum M4859/03 86 461

Fusarium oxysporum R36234 119 -

Fusarium solani M35303/02 79 -

Fusarium solanii CQ12.96 34 489

Fusarium sp. - 24 459

Geotrichum candidum ID ZH/95 1 -

Geotrichum candidum Neqas 6759/M34711 99 286

Hormographiella aspergillata R8459 139 -

Malbranche sp. M42299 N.P. / M42299 492

Malbranchea sp. Tbc22067 113 -

Microsporum audouinii corso 2004 BioMérieux 133 649

Microsporum canis M19220/02 76 652

Microsporum canis M21559 111 652

Microsporum canis corso 2004 BioMérieux 134 652

Microsporum gypseum VA2397/97 11 581

Microsporum gypseum M35037 117 534

Microsporum gypseum corso 2004 BioMérieux 136 581

Microsporum persicolor corso 2004 BioMérieux 135 -

Microsporum praecox corso 2004 BioMérieux 137 555

Monascus ruber CQ99 2 -

Mucor sp. - 48 -

Ochroconis sp. M31577/01 70 -

Paecilomyces lilacinus CQ00/17436 55 511

Paecilomyces lilacinus Neqas6760/M34712 100 515

Paecilomyces variotii Neqas 5775/M38017 61 528

Paecylomices veriotii Neqas 7640/M36113 149 528

Penicillium Chrysogenum Neqas 7432/M14243 143 500

Penicillium sp. M19793/98 46 500

Penicillium sp. M4938 72 500

Penicillium sp. R13266/03 93 468

Rhizopus oryzae CQ5/02/M19992 81 562

Schizophyllum comune VA460449 N.P. / VA460449 549




Trichoderma sp. M948 27 -

Trichoderma sp. R5798 105 552

Trichoderma sp. M39284/05 147 519

Trichophyton tonsurans CQ95/M106 3 -

1. National External Quality assesment service, UK

2. Non presente nella micoteca


11.3. Lista delle sequenze di riferimento

Specie Ceppo GenBank (NCBI) No. Referenza

Lunghezza sequenza bp ITS1-5.8S-ITS2

Absidia corymbifera ATCC1 46774 AF117937 420 sequenza parziale 5.8S-ITS2

Acremonium sp. KMU 4529 AB158290 492

Acremonium strictum UW 836 AY138844 492

Amylomyces rouxii SDM34 AB181338 562

Aphanoascus fulvescens UAMH 5117 AF038357 516

Aphanoascus reticulisporus - AJ390381 515

Arthroderma gypseum CBS2 258.61 AJ970141 581

Arthroderma gypseum CBS 161.69 AJ000621 534

Aspergillus aculeatus CBS 17266 AY585558 490

Aspergillus candidus ATCC 1002 AY373842 508

Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847 515

Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782 510

Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 512

Aspergillus japonicus CBS 61178 AY585562 490

Aspergillus niger ATCC 16888 AY373852 514

Aspergillus ochraceus ATCC 18412 AY373854 502

Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857 510

aspergillus terreus ATCC 1012 AY373871 523

Aspergillus versicolor NHRC-FE078 AJ937755 482

Aspergillus versicolor ATCC 9577 AY373880 482

Aspergillus versicolor 2014 AM158229 471

Aspergillus westerdijkiae NRRL3 35197 DQ250530 501

Auxarthron conjugatum GFI 149 AJ608967 494

Chaetomium funicola CBS 141.50 AJ279450 494

Chrysosporium articulatum UAMH 4320 AJ007841 515

Chrysosporium keratinophilum IFO 7584 AJ131681 520

Curvularia trifolii wb 403 AF455446 515

Emericella cleistominuta IFM 48170 AB248989 481

Emericella corrugata IFM 54743 AB264794 481

Emericella dentata IFM 42021 AB249000 481

Emericella nidulans NRRL 2395 AY373888 481

Emericella nidulans 2172 AM158232 402

Emericella quadrilineata UWFP4 613 AY213644 481

Emericella rugulosa IFM 54242 AB249002 481

Epidermophyton floccosum ATCC 26072 AY213646 695

Exophiala jeanselmei CBS 463.80 AY163552 541

Exophiala oligosperma IP5 2118.92 DQ836797 541

Exophiala sp. CBS 115831 AY857539 520

Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589 519

Fusarium bulbicola NRRL 13618 U61676 461

Fusarium lactis NRRL 25200 U61681 461

Fusarium oxysporum Ppf15 EF495237 459

Fusarium oxysporum 10L-201-Mexico AY904065 461

Fusarium oxysporum FO-05 AY928412 494

Fusarium solani WB 853 AY569560 494

Fusarium sp. 448 AY729069 459

Fusarium subglutinans CNFM 960512 AY898246 459


Specie Ceppo GenBank (NCBI) No. Referenza

Lunghezza sequenza bp ITS1-5.8S-ITS2

Galactomyces geotrichum YF01C DQ668351 286

Gibberella moniliformis FV 4773 AY428795 461

Gibberella sacchari wb 395 AF455450 461

Hypocrea jecorina ATCC 24449 DQ000625 552

Hypocrea koningii GJS 95-175 AF456923 519

Hypocrea rufa GJS 96-47 AJ230685 519

Hypocrea schweinitzii ICMP 5426 X93966 552

Hypocreales sp. LM92 EF060464 487

Microsporum audouinii CBS 344.50 AJ252333 649

Microsporum canis ATCC 23828 AY213657 652

Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329 652

Microsporum ferrugineum CBS 426.63 AJ252338 652

Microsporum langeronii CBS 408.51 AJ252334 649

Microsporum praecox CBS 468.74 AJ970148 555

Microsporum rivalieri CBS 409.51 AJ000625 649

Paecilomyces lilacinus ATCC 10114 AY213665 511

Paecilomyces variotii NRRL 1115 AF033395 529

Paecilomyces variotii ATCC 22319 AY373941 514

Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903 500

Penicillium citrinum WM 05.3 DQ249207 468

Penicillium commune wb153 AF455544 500

Penicillium nalgiovense IBT 12108 AJ004895 500

Penicillium sp. PC6 EF105368 500

Penicillium sp. ZN 105 DQ810189 468

Penicillium westlingii NRRL 800 AF033423 468

Rhizopus japonicus AHU6525 AB097347 562

Rhizopus microsporus AHU6527 AB097348 562

Rhizopus oryzae CBS 395.95 AY213684 562

Schizophyllum commune HNO34 AF280758 549

Trichoderma koningiopsis Dis326h DQ379015 519

Trichoderma longibrachiatum ATCC 52326 Z48935 552

Trichoderma ovalisporum Dis 203c DQ315458 519

Trichoderma sp. YM2 AB297794 519

1. American Type Culture Collection, USA

2. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands

3. Northen Regional Research Laboratory, USA

4. University of Washington Fungal Project, USA

5. Pasteur Institute Collection Fungi, France


11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro

Anamorfismo Telomormismo

Monascus ruber Absidia corymbifera Acremonium sp. Acremonium strictumAlternaria alternata Amylomyces rouxii (Mucor rouxii) Arthrinium phaeospermum Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus cleistominutus Emericella cleistominuta Aspergillus corrugatus Emericella corrugata Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicus (Aspergillus aculeatus) Aspergillus nidulans Emericella nidulans

Emericella quadrilineata Emericella dentata

Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzaeAspergillus rugulosus Emericella rugulosa Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Aureobasidium sp. Discophaerina sp. Bipolaris sp. Cochliobolus sp. Caldosporium cladosporioides Chaetomium funicolaChaetomium sp. Chrysosporium articulatumChrysosporium keratinophilum Aphanoascus keratinophilusChrysosporium sp. Aphanoascus fulvescens Chrysosporium sp. Aphanoascus sp. Chysosporium sp. Aphanoascus reticulisporus Cladosporium sp. Cladosporium sphaerospermum



Cunninghamella bertholletiae Curvularia lunata Cochliobolus lunatus Curvularia trifolii Cochliobolus sp. Epidermophyton floccosum Exophiala jeanselmeiExophiala oligosperma, ( Melanchlenus oligospermus, Rhinocladiella atrovirens) Exophiala sp. Exophiala spinifera Exophiala xenobioticaFusarium bulbicola (Fusarium sacchari)

Gibberella sacchari

Fusarium lactis (Fusarium Moniliforme) Fusarium oxysporum Fusarium solani Nectria haematococcaFusarium sp. Gibberella sp.

Nectria sp. Fusarium subglutinansFusarium verticillioides Gibberella moniliformis Geotrichum candidum Galactomyces geotrichumHormographiella aspergillata Coprinopsis cinerea Malbranchea sp. Auxarthron sp. Malbranchea sp. Auxarthron conjugatum Microsporum audouinii (Microsporum rivalieri) Microsporum canis (Microsporum distortum)

Arthroderma otae

Microsporum ferrugineumMicrosporum gypseum Arthroderma gypseum Microsporum langeroniiMicrosporum persicolor Arthroderma persicolor Microsporum praecox Mucor sp. Ochroconis sp. Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium Chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium communePenicillium nalgiovense Penicillium sp.



Penicillium westlingii Rhizopus microsporusRhizopus oryzae (Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus) Schizophyllum commune Trichoderma citrinoviride Hypocrea schweinitzii Trichoderma koningii Hypocrea koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Hypocrea sp. Trichoderma ovalisporum Trichoderma reesei Hypocrea jecorina Trichoderma sp. Hypocrea sp. Trichophyton tonsurans Tricoderma viride Hypocrea rufa

Referenze

1. D. E. Ciardo; Molecular Identification of Fungal Pathogens using the ITS Region; Diss.

ETH 16410, 2006

2. G.S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras; Atlas of Clinical fungi; 2° ed., Universitat

Rovira i Virgili, 2000

3. NCBI, Taxonomy Browser. http://ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html


11.5. Albero


11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras, delle specie usate in questo lavoro

Ascomicota Euascomycetes Eurotiales Trichomaceae

Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus cleistominutus Aspergillus corrugatus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicusAspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzaeAspergillus rugulosus Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium Chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium communePenicillium nalgiovense Penicillium sp. Penicillium westlingii Epidermophyton floccosum

Ascomicota Euascomycetes Onygenales Onygenaceae

Chrysosporium articulatumChrysosporium keratinophilum Chrysosporium sp. Chrysosporium sp. Chysosporium sp.

Malbranchea sp.


Ascomicota Euascomycetes Onygenales Arthrodermataceae

Microsporum audouiniiMicrosporum canis Microsporum ferrugineumMicrosporum gypseum Microsporum langeroniiMicrosporum persicolor Microsporum praecox Epidermophyton floccosum

Ascomicota Euascomycetes Sordariales Chaetomiaceae

Chaetomium funicolaChaetomium sp.

Ascomicota Euascomycetes Hypocreales Hypocreaceae

Acremonium sp. Acremonium strictumTrichoderma citrinoviride Trichoderma koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Trichoderma ovalisporum Trichoderma reesei Trichoderma sp. Trichophyton tonsurans Tricoderma viride Fusarium bulbicolaFusarium lactis Fusarium oxysporum Fusarium solani


Fusarium sp. Fusarium subglutinansFusarium verticillioides

Ascomicota Euascomycetes Chaetothyriales Herpotrichiellaceae

Exophiala jeanselmeiExophiala oligosperma, ( Melanchlenus oligospermus, Rhinocladiella atrovirens) Exophiala sp. Exophiala spinifera

Ascomicota Euascomycetes Pleosporales Pleosporaceae

Curvularia lunata Curvularia trifolii

Basidiomycota Hymenemycetes Stereales Schizophyllaceae

Schizophyllum commune

Zygomicota Mucorales Mucoraceae

Absidia corymbiferaRhizopus microsporusRhizopus oryzae Amylomyces rouxii Rhizopus microsporusRhizopus oryzae Schizophyllum commune


Ringraziamenti

Ringrazio coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro. In primo luogo ringrazio il direttore

dell’Intituto Cantonale di Microbiologia, il Dr. Orlando Petrini, per avermi concesso la possibilità di

svolgere il mio lavoro di diploma presso il loro laboratorio di sierologia.

Ringrazio la Dr.ssa Gladys martinetti per la fiducia che mi ha concesso in questi mesi e soprattutto

per la scelta dell’argomento del lavoro di diploma; un lavoro che mi ha coinvolto pienamente.

Ringrazio la Dr ssa Antonella Demarta Aeschbacher e la Dr.ssa. Simona Casati per avermi seguito

durante l’elaborazione dei dati

Non in minor modo rigrazio i tecnici in analisi biomediche Anna Paola Caminada, Marilena

Chiaravalloti, Karin Gervasoni-Bolgiani, Tecla Fondrini per il loro importante supporto tecnico

Ed in fine ringrazio il direttore della Scuola Medico Tecnica Andrea Boffini, le docenti Daniela

Marcacci, Sonja Marci e Susan Gilbert.

Documents

Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 - ti · Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro 11.5. Albero filogenetico 11.6. Classificazione secondo .S