Analiza BD GeneOhm™ MRSA

BD Diagnostics BD GeneOhm™ MRSA

Analiza BD GeneOhm™ MRSA

REF 441242 200 testova

REF 441244 48 testova

DOPS03-09-V3CR2 Datum: 11/2009.


Sadržaj Svrha uporabe --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Sažetak i objašnjenje testa ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Princip postupka------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Reagensi ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Mjere opreza ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4 Dani materijali---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4 Pohranjivanje, rukovanje i stabilnost ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 5 Prikupljeni uzorci ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 5 Reagensi ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5 Potrebni materijali koji nisu priloženi ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 5 Upute za uporabu----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 Prikupljanje uzorka --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 Priprema uzorka------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 Postupak Analize BD GeneOhm™ MRSA --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 Kontrola kvalitete------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 7 Pozitivne i negativne kontrole-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 Kontrole obrade uzorka---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8 Uzgoj kliničkih uzoraka ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8 Metoda žica-pločica -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8 Bujon za uzgajanje mikroorganizama---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8 Tumačenje rezultata-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 Nevaljani ciklus analize --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 Nerazriješen uzorak -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 Uzorak nije određen uslijed grješke modula I-CORE® ------------------------------------------------------------------------------------------ 9 Ograničenja postupka------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 9 Tvari koje se upliću --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------10 Očekivane vrijednosti -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------10 Karakteristike rada---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------10 Klinički učinak -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 Analitička specifičnost --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12 Analitička osjetljivost ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12 Ponovljivost----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12 Literatura--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------13 Indeks simbola ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------14

DOPS03-09-V3CR2 - 2 -


Hrvatski

Svrha uporabe Analiza BD GeneOhm™ MRSA je kvalitativan in vitro dijagnostički test za izravno opažanje naseljavanja u nosu meticilin-rezistentne bakterije Staphylococcus aureus (MRSA) kao pomoći u sprječavanju i kontroli infekcija MRSA-om u ustanovama zdravstvene skrbi. Test obavljen instrumentom SmartCycler® s uzorkom uzetim štapićem s vatom iz nosa s pacijenata u opasnosti od naseljavanja kolonija rabi polimeraznu lančanu reakciju (polymerase chain reaction, PCR) za pojačavanje DNK MRSA i fluorogenične hibridizacijske sonde specifične za metu za opažanje pojačane DNK. Analiza BD GeneOhm™ MRSA nije namijenjena ya dijagnosticiranje infekcija MRSA-om, niti za nadzor tretmana kod infekcija MRSA-om. Prateće kulture neophodne su samo za otkrivanje organizama za epidemiološku tipizaciju ili za daljnje testiranje susceptibilnosti.

Sažetak i objašnjenje testa Uzme se nazalni uzorak i prenese u laboratorij rabeći preporučeni štapić s vatom s Stuartovim medijem (Liquid Stuart Medium) (pogledajte „Potrebne materijale koji nisu priloženi“). Radi testiranja se štapić s vatom stavi u spremnik uzorka. Uzorak je koncentriran i liziran. Izvjesna količina lizata doda se reagensima PCR-a koji sadrže primere specifične za MRSA koji se rabe za pojačanje genske mete, ako ona postoji. Analiza isto tako uključuje unutarnju kontrolu (IC) za opažanje inhibicijskih uzoraka za PCR i za potvrđivanje nepovrjedivosti reagensa. Pojačane mete opažaju se hibridizacijskim probama označenim prigušenim fluoroforima (molekularni markeri). Pojačavanje, opažanje i tumačenje signala obavljaju se automatski programskom podrškom Cepheid SmartCycler®. Čitav postupak traje od 60 do 75 minuta, ovisno o broju uzoraka koji se obrađuju. Radi otkrivanja MRSA za eoidemiološju tipizaciju ili za daljnje testiranje susceptibilnosti na antibiotike mogu se injektirati odgovarajući mediji s kulturama tijekom pripreme uzorka ili do 24 sata nakon pripreme uzorka.

S. aureus je glavni uzročnik nosocomijalnih („bolničkih“) infekcija. Najviše se prijenosa bakterije događa putem kontaminiranih ruku osobe koja nosi S. aureus. Iako S. aureus uzrokuje infekcije s kliničkim pojavnostima koje variraju od pustula do sepsi i smrti,1 obično se nalazi u nosu ili na koži zdravih osoba (asimptomatski nositelji). Liječenje infekcija sa S. aureus postalo je stvarni izazov s pojavom sojeva rezistentnih na ranije učinkovite antimikrobske agense. Meticilin-rezistantni sojevi Staphylococcus aureus često se susreću u ustanovama zdravstvene skrbi, i predstavljaju 50% izolata od S. aureus dobivenih u bolnici u nekim sjevernoameričkim bolnicama.2 Čimbenici rizika za infekcije s MRSA u ustanovama zdravstvene skrbi uključuju produženi boravak u bolnici, blizinu pacijenata zaraženih s MRSA, izloženost višestrukim i produljenim tretmanima antibioticima širokog spektra, te nazalno nošenje MRSA. Rani pregled pacijenata u svezi nazalnog nošenja MRSA radi identifikacije takvih pacijenata koji zahtijevaju izolaciju može biti dio učinkovitog programa kontrole infekcije za MRSA. Sve sadašnje tehnike otkrivanja MRSA zahtijevaju korak uzgoja kultura i izolaciju čistih kolonija nakon čega slijedi ili testiranje susceptibilnosti na oksacilin, opažanje gena mecA ili opažanje proteina koji se veže na penicilin (PBP 2a) kodiran genom mecA. To povećava vrijeme razlučivanja statusa nositelja MRSA na najmanje 16 sati, s vremenom medijana od više od 48 sati. Uz brzinu kojom se infekcije sa S. aureus mogu širiti, posebno u ustanovama zdravstvene skrbi gdje su nositelji uobičajeni, mogućnost dobivanja rezultata za nazalne nositelje MRSA na dan prijama predstavlja stvarnu prednost za programe kontrole zaraze.

Princip postupka Nakon lizije doći će do pojačavanja mete (sekvenca u blizini mjesta umetanja na mobilnom genetičkom elementu na kromosomu [Staphylococcal Cassette Chromosome mec, SCCmec]). Ako nema tvari inhibitora PCR-a, doći će i do pojačavanja IC-a, fragmenta DNK od 335-bp uključujući sekvencu od 277-bp koje nema u MRSA.

Pojačana DNK opaža se molekulskim markerom, jednolančanim oligonukleotidom koji se oblikuje u oblik ukosnice, označenim na jednom kraju prigušivačem, a na drugom kraju fluorescentnim obojenjem za opažanje (fluorofor). Ako nema mete, fluorescencija se priguši. Ako je meta prisutna, struktura ukosnice se otvara nakon hibridizacije marker/meta, što rezultira fluorescentnom emisijom. Za opažanje amplikona MRSA, molekulski marker sadrži fluorofor FAM na 5’ kraju i ne-fluoroscentni prigušivač DABCYL na 3’ kraju oligonukleotida. Za opažanje amplikona IC, molekulski marker sadrži fluorofor TET na 5’ kraju i prigušivač DABCYL na 3’ kraju oligonukleotida. Svaki hibrid marker-meta fluorescira na valnoj duljini karakterističnoj za fluorofor rabljen u tom određenom molekulskom markeru. Količina fluorescencije u svakom danom ciklusu, ili nakon ciklusa, ovisi o količini specifičnih amplikona prisutnih u taj trenutak. Programska podrška SmartCycler® simultano nadgleda fluorescenciju koju emitira svaki molekulski marker, tumači sve podatke i daje konačni rezultat na kraju cikličkog programa (vidjeti poglavlje „Tumačenje rezultata“).

Reagensi

Analiza BD GeneOhmTM MRSA 48 testova 200 testova

Spremnik uzorka (Sample Buffer) 60 X 1 mL 240 X 1 mL

Spremnik Tris-EDTA

Epruveta za liziju (Lysis tube) 50 epruveta 200 epruveta

Staklene kuglice

Glavna mješavina (svaka za 8 reakcija) (Master Mix) 8 epruveta 34 epruvete

< 0,0005% kompleks DNK polimeraze

< 0,001% Unitarnja kontrola - neinfektivna DNK koja sadrži sekvence veze primera MRSA i jedinstvenu sekvencu za hibridizaciju sonde

< 0,002% primera

< 0,002% molekularnih sondi

< 0,05% dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Goveđi serum albumin

Ugljikohidrat

MgCl2

< 0,001% neinfektivne genomske DNK Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990)

DOPS03-09-V3CR2 - 3 -


Kontrolna DNK (Control DNA) 8 epruveta 34 epruvete

Spremnik Tris-EDTA

Ugljikohidrat

< 0,001% neinfektivne genomske DNK (ATCC 43300)

Razrjeđivač (Diluent) 8 X 700 μL 34 X 700 μL

Spremnik Tris-HCl

MgCl2

(NH4)2SO4

KCl

Mjere opreza Ova analiza rabi se samo za in vitro dijagnostiku.

• Ne rabite komplet ako je sigurnosni pečat na vanjskom kartonu slomljen.

• Ne rabite reagense ako je njihova zaštitna vrećica otvorena ili poderana pri dolasku.

• Zaštitne vrećice glavne mješavine i kontrolne DNK zatvorite brzo s patentnim zatvaračem nakon svake uporabe.

• Ne rabite reagense ako nema upijača vlage u vrećicama glavne mješavine i kontrolne DNK.

• Ne uklanjajte upijač vlage iz vrećica glavne mješavine i kontrolne DNK.

• Reagensi nisu zamjenjivi između grupa.

• Nikad ne izvlaćite reagense iz različitih epruveta, čak ni ako su iz iste grupe.

• Ne rabite reagense nakon isteka roka trajanja.

• Ne zamjenjujte kapice poklopaca između reagensa budući da može doći do kontaminacije koja može kompromitirati rezultate testa.

• Izbjegavajte kontaminaciju reagensa mikrobima i deoksiribonukleazom (DNAse) kad izvlačite tvari iz epruveta. Preporuča se uporaba sterilnih jednokratnih vršaka pipetora slobodnih od DNAse ili vršaka pipetora s pozitivnom zapreminom.

• Kako bi se izbjeglo zagađivanje okliša s amplikonima gena tcdB, ne otvarajte reakcijske epruvete nakon pojačavanja.

• Rabite novi vršak pipetora za svaki uzorak ili reagens.

• Obavljanje analize izvan preporučenih vremenskih okvira može stvoriti pogrješne rezultate. Analize koje nisu završene unutar određenog vremena potrebno je ponoviti.

• Mogu se testirati dodatne kontrole u skladu sa smjernicama ili zahtjevima lokalnih, pokrajinskih i/ili državnih propisa ili organizacija koje donose propise.

• U slučajevima kad se testovi PCR-a s otvorenim epruvetama obavljaju u istom području laboratorija, posebni i odvojeni radni prostori se trebaju rabiti za pripremu uzoraka i aktivnosti pojačavanja/opažanja. Potrepštine i oprema trebaju se pridijeliti svakom prostoru i ne smiju se prenositi iz jednog prostora u drugi. Moraju se nositi rukavice, i moraju se mijenjati kad se iz jednog prostora prelazi u drugi. Rukavice se moraju promijeniti prije rukovanja suho hlađenim reagensima.

• Ne smrzavajte uređaj za uzimanje uzorka. Pohranite na sobnoj temperaturi. Kad je neotvaran, uređaj za uzimanje uzorka je stabilan do isteka naznačenog nadnevka.

• Uvijek rukujte s uzorcima kao da su infektivni i u skladu s postupcima u sigurnom laboratoriju, kao što su oni opisani u Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories3 (Biološka sigurnost u mikrobiološkim i biomedicinskim laboratorijima) i dokumentu CLSI Document M29.4

• Dok rukujete s reagensima kompleta nosite zaštitnu odjeću i rukavice za jednokratnu uporabu. Nakon obavljene analiye temeljito operite ruke.

• Ne izvlačite pipetom pomoću ustiju.

• U prostorima gdje se rukuje uzorcima ili reagensima kompleta ne pušite, ne jedite i ne pijte.

• Odložite nerabljene reagense i otpad u skladu s lokalnim, pokrajinskim i/ili državnim propisima.

Dani materijali • Spremnik uzorka (Sample Buffer)

• Epruveta za liziju (Lysis tube)

• Glavna mješavina (Master Mix)

• Kontrolna DNK (Control DNA)

• Razrjeđivač (Diluent)

• Reakcijske epruvete SmartCycler® 25 µL

• Naljepnice za identifilaciju uzoraka

DOPS03-09-V3CR2 - 4 -


Pohranjivanje, rukovanje i stabilnost Prikupljeni uzorci

Uzorci se trebaju čuvati tijekom prijevoza na temperaturi između 2 i 30 °C. Zaštitite od smrzavanja ili izlaganja prevelikoj toplini.

Uzorci za koje je dokazano da su potencijalno interferirajuće tvari (npr. krv, suvišne nazalne izlučevine, itd.) moraju se testirati unutar 24–36 sati. Inače se uzorci mogu pohraniti do 5 dana na 2–8 °C prije analize.. Uzorci se mogu držati na sobnoj temperaturi (15–30 °C) do 36 sati prije analize.

Reagensi Pozor: Uvjeti pohranjivanja moraju slijediti odredbe napisane na svakoj vrećici. Epruvete koje nisu u zaštitnoj vrećici i one nerabljene tijekom za to određenog

vremena trebaju biti odložene.

Sastavnica kompleta Master Mix i Control DNA

(bijela i crvena naljepnica) Lysis tube (žuti čep) Sample Buffer i Diluent

(plavi čep, odnosno crna naljepnica)

Temperatura 2–25 °C 2–25 °C 2–25 °C Zapečaćena vrećica Stabilnost Nadnevak isteka trajanja Nadnevak isteka trajanja Nadnevak isteka trajanja

Temperatura 2–8 °C1 2–25 °C 2–25 °C2

Otvorena vrećica Stabilnost 1 mjesec3 Nadnevak isteka trajanja 2 mjeseca3

1 Kad originalni pečat na vrećici bude slomljen, pažljivo zatvorite vrećicu patentnim zatvaračem nakon svake uporabe i pohranite na odgovarajućoj temperaturi. 2 Iako se ti reagensi mogu pohraniti na sobnoj temperaturi, moraju se čuvati sa svojim pratećim reagensima iz iste grupe na 2–8 °C. 3 Ako je vrećica pravilno zatvorena patentnim zatvaračem nakon svake uporabe.

Sastavnice kompleta izvan njihove zaštitne vrećice Master Mix i Control DNA

(bijela i crvena naljepnica)

Temperatura 15–25 °C Nerekonstruirane epruvete Stabilnost 2 sata

Temperatura 2–8 °C Originalni spremnik Stabilnost 3 sata

Temperatura 2–8 °C Rekonstruirane epruvete1

Epruveta SmartCycler®

Stabilnost 1 sat 1 Odložiti nerabljene epruvete nakon isteka kašnjenja.

Potrebni materijali koji nisu priloženi • Stuartov medij BBL™ CultureSwab™ (Becton Dickinson, kataloški broj. 220099), Stuartov medij Copan Transystem™ (Copan Italia International, kataloški

broj. 141C.USE), Stuartov medij Copan Venturi Transystem™ (Copan Diagnostics Inc., kataloški broj. 141C.US), Jednostruki Stuartov medij HealthLink TransPorter™ (HealthLink, kataloški broj. 4432)

• Bakterija Staph aureus BBL™ CHROMagar™, kataloški broj 214982, agar s manittolom (MSA) kataloški broj 221773 ili 221271 ili ekvivalentni mediji (neobvezatno).

• Uređaj Vortex Genie 2 (Fisher) s držačem mikroepruveta od 1,5 mL ili odgovarajući uređaj za obradu više uzoraka, može se rabiti prilagoik s vi[e držača

• Micropipetori (točan raspon između 1–10 µL, 10–100 µL i 100–1000 µL)

• Sterilni vršci pipetora blokirani filtrom slobodni od DNAse ili vršci pipetora s pozitivnom zapreminom

• Sterilne pipete za prijenos s tankim vrškom (npr VWR kataloški brojevi 14670-329, 14670-332) ili produženi sterilni vršci, blokirani filtrom, slobodni od DNAse od 1250 µl (npr. MATRIX kataloški broj 8255)

• Škare

• Gaze

• Rukavice za jednokratnu uporabu, bez pudera

• Mikrocentrifuga za brzo (mora doseći 14 000 x g) i sporo centrifugiranje.

• Uređaj za suho zagrijavanje za epruvete od 1,5 mL ili vodena kupka

• Led ili uređaj za hlađenje za epruvete od 1,5 mL

• Alat za skidanje čepova (npr. MATRIX kataloški broj 4469) (neobvezatno)

• Zaporni sat ili programator vremena

• Startni sustav SmartCycler® s programskom podrškom Dx Software (sklop za obradu, priručnik, komplet pribora i stolno računalo) (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA)

DOPS03-09-V3CR2 - 5 -


Upute za uporabu

Prikupljanje uzorka

Kako bi se dobio odgovarajući uzorak, mora se točno slijediti postupak prikupljanja uzoraka.

Rabeći preporučeni štapić s vatom sa Stuartovim medijem (pogledajte „Potrebne materijale koji nisu priloženi“), uzimaju se nazalni uzorci u skladu sa sljedećim postupkom:

1. Navlažite štapić s vatom s dvije kapljice (oko 50 µL) sterilnog fiziološkog seruma (slana otopina) ili ga rabite suhog.

2. Pažljivo stavite štapić s vatom u nosnicu pacijenta (štapić s vatom mora biti umetnut do 2,5 cm (1 palac) od ruba nosnica).

3. Zavrtite štapić s vatom 5 puta.

4. Umetnite isti štapić s vatom u drugu nosnicu i ponovite uzimanje uzoraka kao u 2 i 3.

5. Stavite štapić s vatom u njegov spremnik.

6. Označite spremnik.

7. Prenesite štapić s vatom u laboratorij u skladu sa standardnim radnim postupcima bolnice.

8. Pogledajte poglavlje „Pohranjivanje, rukovanje i stabilnost—Prikupljeni uzorci“ za pohranjivanje i rukovanje.

Priprema uzoraka

Pozor: Za svaki uzorak koji će se analizirati potrebna je jedna epruveta spremnika uzorka (Sample Buffer, plavi čep) i jedna epruveta za liziju (Lysis tube, žuti čep). Još je jedna dodatna epruveta spremnika uzorka (Sample Buffer, plavi čep) potrebna za svaku skupinu od 20 uzoraka koji će se analizirati. Izvadite potreban broj epruveta iz njihovih zaštitnih vrećica, uklonite višak zraka i zatvorite brzo vrećice patentnim zatvaračima.

Za uzgoj kliničkih uzoraka (obrisak) prije obavljanja Analize BD GeneOhm™ MRSA, radi detalja pogledajte poglavlje Uzgoj kliničkih uzoraka—Metoda žica-pločica. .

1. Stavite napravu za skupljanje uzoraka (štapić s vatom) u epruvetu spremnika uzoraka (plavi čep).

Označite epruvetu spremnika uzorka na čepu i/ili naljepnicom za epruvetu.

2. Slomite dršku štapića s vatenim vrhom i čvrsto zatvorite epruvetu.

Držite držak štapića s vatenim vrhom u blizini ruba epruvete (rabite gazu da smanjite na najmanju mjeru rizik od kontaminacije). Podignite štapić s vatenim vrhom nekoliko milimetara s dna i savijajte držak na rubu epruvete kako biste ga slomili. Alternativna metoda: pomoću škara prerežite držak. Pazite da čep čvrsto zatvara.

3. Zavrtite velikom brzinom jednu minutu.

Ako se obrađuje više uzoraka, može se rabiti prilagodnik s više držača.

4. Prenesite cijelu staničnu otopinu u epruvetu za liziju (žuti čep).

Rabite sterilnu pipetu za prijenos s tankim vrškom ili mikropipetor P-1000 s produženim vrškom.

Za uzgoj kliničkih uzoraka s preostalim obriskom, radi detalja pogledajte poglavlje Uzgoj kliničkih uzoraka - Bujon za uzgajanje mikroorganizama

5. Centrifugirajte velikom brzinom (između 14 000 x g i 21 000 x g) 5 minuta na sobnoj temperaturi.

6. Uklonite supernatant i odložite ga.

Rabite sterilnu pipetu za prijenos s tankim vrškom; pazite da ne dotaknete kuglicu. Rabite novu pipetu za prijenos za svaki uzorak.

7. Dodajte 50 µL iz spremnika uzorka epruveti za liziju; čvrsto zatvorite.

Rabite novi vršak pipetora za svaki uzorak. S jednom epruvetom spremnika uzorka može se pripremiti do 20 uzoraka. Za više od 20 uzoraka, rabite onoliko epruveta spremnika uzorka koliko je potrebno (čuvajte nerabljeni spremnik za daljnje korake postupka BD GeneOhm™ MRSA).

8. Zavrtite 5 minuta velikom brzinom.

Ako se obrađuje više uzoraka, može se rabiti prilagodnik s više držača.

9. Centrifugirajte kratko epruvetu za liziju (brza vrtnja).

Malom brzinom 2 do 5 sekundi; da se sadržaj dovede na dno epruvete.

10. Grijte na 95 ± 2 °C dvije (2) minute.

Rabite uređaj za suho zagrijavanje za epruvete od 1,5 mL ili vodenu kupku.

11. Držite epruvetu za liziju na ledu ili na uređaju za hlađenje.

Liyati su stabilni do 4 sata na 2–8 °C. Ako lizati nisu bili rabljeni na kraju ovog vremenskog okvira, pohranite ih na -20 ± 5 °C za kasniju uporabu.

DOPS03-09-V3CR2 - 6 -


Postupak Analize BD GeneOhm™ MRSA

Pozor: Jedna rekonstruirana (dekonzervirana) epruveta glavne mješavine (Master Mix, bijela oznaka) dat će dovoljno reagensa za obavljanje osam reakcija. Uzmite jednu epruvetu SmartCycler® po uzorku za analizu i 2 dodatne epruvete SmartCycler® za pozitivnu i negativnu kontrolu. Jedna (1) pozitivna i jedna (1) negativna kontrola moraju se uključiti u svako izvršavanje Analize BD GeneOhm™ MRSA. Jedna kontrolna DNK (Control DNA, crvena naljepnica) potrebna je za svako izvršavanje analize. Jedna epruveta za razrjeđivanje (Diluent, crna naljepnica) potrebna je za rekonstituciju do 3 epruvete glavne mješavine. Izvadite potreban broj epruveta iz njihovih zaštitnih vrećica, uklonite višak zraka, i zatvorite brzo vrećice patentnim zatvaračem.

Pripremite upravo dovoljno epruveta SmartCycler® da napunite raspoložive module I-CORE® na uređaju SmartCycler®.

1. Stavite potreban broj epruveta glavne mješavine na led ili na uređaj za hlađenje za epruvete od 1,5 mL.

2. Dodajte 225 µL razrjeđivača (crna naljepnica) svakoj epruveti glavne mješavine.

Umetnite vršak mikropipetora kroz opnu čepa epruvete glavne mješavine. Ne umećite vršak preduboko u čep. Unesite razrjeđivač. Kasnije odložite nerabljeni razrjeđivač.

3. Zavrtite epruvetu (epruvete) kroz 5–10 sekundi.

4. Stavite potreban broj epruveta SmartCycler® na uređaj za hlađenje SmartCycler®.

Omogućite jednu epruvetu SmartCycler® po uzorku i još dvije epruvete SmartCycler® za kontrole. Izbjegavajte dodirivanje prozora za optičko opažanje na donjim rubovima epruvete i donjim površinama romboidnog oblika.

Sljedeći koraci MORAJU se obaviti unutar vremenskog okvira od jednog sata:

5. Dodajte 25 µL rekonstruirane glavne mješavine u epruvete SmartCycler®.

Uklonite čep opnu prije pipetiranja reagensa. Unesite tekućinu u rezervoar (gornji dio) epruveta SmartCycler®. Označite epruvete SmartCycler® na čepu. Može se rabiti etiketa za označavanje uzorka (nalazi se u kompletu). Nerabljena glavna mješavina odmah pohranjena na 4–8 °C kroz najviše tri sata izvan svjetla može se rabiti za trenutno ponovno testiranje nerazriješenih rezultata, ako je potrebno. Nakon tog vremena odložite nerabljenu glavnu mješavinu.

6. Dodajte 2,8 µL svakog liziranog uzorka različitim prethodno napunjenim epruvetama SmartCycler®; zatvoreite epruvete.

Pazite da ne usišete kuglice kad pipetirate u epruvetu za liziju. Nakon dodavanja uzorka pomaknite pipetu dolje i gore 2–3 puta u rezervoaru da se osigura prijenos cijele količine. Rabite novi mikropipetor za svaki uzorak.

7. Stavite epruvetu s kontrolnom DNK (crvena naljepnica) na led ili na uređaj za hlađenje za epruvete od 1,5 mL.

8. Dodajte 225 µL iz spremnika uzorka (plavi čep) epruveti s kontrolnom DNK.

Rabite epruvetu spremnika uzorka od koraka 7 od protokola Pripreme uzorka. Umetnite vršak mikropipetora kroz opnu čepa epruvete s kontrolnom DNK. Ne umećite vršak preduboko u čep. Unesite uzorak iz spremnika uzorka.

9. Zavrtite epruvetu kroz 5–10 sekundi.

10. Dodajte 2,8 µl rekonstruirane kontrolne DNK predzadnjoj epruveti SmartCycler® (pozitivna kontrola); zatvorite epruvetu.

Nakon dodavanja uzorka pomaknite pipetu dolje i gore 2–3 puta u rezervoaru da se osigura prijenos cijele količine. Označite kao pozitivnu kontrolu. Nerabljena kontrolna DNK odmah pohtanjena na 4–8 ˚C kriz najviše 3 sata, zaštićena od svjetlosti, for može se rabiti za pripremu nove pozirivne kontrole u slučaju trenutnog ponovnog testiranja nerazriješenih rezultata. Nakon tog razdoblja odložite nerabljenu kontrolnu DNK.

11. Dodajte 2,8 µL iz spremnika uzorka (plavi čep) posljednjoj epruveti SmartCycler® (negativna kontrola); zatvorite epruvetu.

Rabite epruvetu spremnika uzorka iz koraka 7 protokola Pripremanja uzorka. To je za nadzor kontaminacije PCR-a do koje može doći tijekom rukovanja uzorcima. Označite kao negativnu kontrolu. Poslije odložite neuporabljeni uzorak iz spremnika uzorka.

12. Centrifugirajte sve reakcijske epruvete 5–10 sekundi.

Rabite posebno prilagođenu mikrocentrifugu pruloženu uz instrument SmartCycler®.

13. Držite epruvete na 2–8 °C na uređaju za hlađenje SmartCycler® prije stavljanja na instrument.

Preostali lizati trebaju se smrznuti na -20 ± 5 °C za kasniju uporabu, ako je to potrebno.

14. Napravite ciklus s protokolom Analize BD GeneOhm™ MRSA.

Ako je potrebno, pogledajte Priručnik programske podrške SmartCycler® Dx. Parametre identifikacije uzoraka morate unijeti prije pokretanja ciklusa.

15. Umetnite svaju reakcijsku epruvetu u modul I-CORE® uređaja SmartCycler® i zatvorite poklopac uređaja I-CORE®.

Smjestite pozitivnu i negativnu kontrolu na njihova odgovarajuća mjesta (vidjeti poglavlje „Kontrola kvalitete“) Pritisnite sve epruvete čvrsto na njihovo mjesto.

16. Pokrenite ciklus.

Kontrola kvalitete Pozitivne i negativne kontrole

Postupci kontrole kvalitete osmišljeni su za nadzor rada analize. Pozitivna kontrola namijenjena je za nadzor velike pogrješke u svezi reagensa. Negativna kontrola rabi se za opažanje kontaminacije reagensa ili okoliša (ili prenošenja) uslijed ili DNK MRSA ili amplikona MRSA. Pozitivna i negativna kontrola kontrole su analize (kontrole ciklusa). Nevaljana kontrola čini nevaljanim ciklus. Konačno, unutrašnja kontrola ugrađena u svaku reakcijsku mješavinu namijenjena je nadzoru inhibicije PCR-a kod svakog uzorka i nepovredivosti reagensa.

DOPS03-09-V3CR2 - 7 -


Jedna pozitivna kontrola i jedna negativna kontrola moraju biti uključene u svaki ciklus analize na uređaju SmartCycler®. Programska podrška automatski pridružuje poziciju kontrola na instrumentu (pogledajte Priručnik programske podrške SmartCycler® Dx).

Kontrole obrade uzorka

Kontrolni sojevi mogu se testirati u skladu sa smjernicama ili zahtjevima lokalnih, pokrajinskih i/ili državnih propisa ili organizacija koje donose propise. Referentni soj MRSA (npr. American Type Culture Collection [Američka zbirka tipova kultura], ATCC 43300) ili dobro karakterizirani klinički izolirat MRSA može se rabiti kao kontrola obrade uzorka dok se kultura Staphylococcus aureus osjetljivog na meticilin (npr. ATCC 29213) ili bilo kojeg drugog ne-Staphylococcus aureus (npr. Staphylococcus epidermidis ATCC 14990) može rabiti kao vanjska negativna kontrola.

Ponovno razrijedite izolirane kolonije sa pločice, nakon 18 do 24 sata na krvnom agaru s 5% ovčje krvi (npr. BBL™ Trypticase Soy Agar [TSA II] s 5% ovčje krvi, BD kataloški broj 221239 ili 221261) u slanoj otopini do zamućenosti od 0,5 McFarland (~1.5 X 108 CFU/mL). Razrijedite sa slanom otopinom da dobijete otopinu od ~106 CFU/mL. Umočite preporučeni štapić s vatenim vrškom sa Stuartovom medijem (Pogledajte Potrebne materijale koji nisu priloženi) u bakterijsku otopinu, istisnite višak tekućine, stavite štapić s vatenim vrškom u njegov spremnik (kako bi se omogućio kontakt s medijem za prijenos), i ostavite stajati na sobnoj temperaturi 5 minuta. Obradite i testirajte kao klinički uzorak (pogledajte poglavlja „Priprema uzorka“ i „Postupak Analize BD GeneOhm™ MRSA“), uključujući kontrole. Svi uzorci i kontrole trebaju dati vrijedeće rezultate (bez nevaljanih pozitivnih ili negativnih kontrola, bez neuspješne unutrašnje kontrole).

Za općenito vođenje kroz kontrolu kvalitete (QC), korisnik može pogledati CLSI MM35 ili C24.6

Uzgoj kliničkih uzoraka Kako bi se obavilo testiranje antimikrobske susceptibilnosti ili epidemiološka tipizacija, klinički se uzorci mogu uzgojiti u dva različita koraka postupka Analize BD GeneOhm™ MRSA. To se može obaviti sa naprave za uzimanje uzorka (štapić s vatom) prije obavljanja BD GeneOhm™ MRSA metodom žica-pločica, ili se može učiniti sa štapićem s vatom nakon postupka pripremanja uzorka pomoću koraka obogaćivanja.

Metoda žica-pločica

Ova se metoda rada s kulturom može obaviti prije postupka pripremanja uzorka za Analizu BD GeneOhm™ MRSA.

1. Uklonite napravu za uzimanje uzorka (štapić s vatom) iz njenog spremnika.

2. Cijepite pločicu agarom s manittolom (MSA) razmazivanjem preko prvog kvadranta pločice.

3. Vratite štapić s vatom u spremnik ili ga slomite u epruveti spremnika uzorka (plavi čep) Analize BD GeneOhm™ MRSA i nastavite u skladu s uputama iz poglavlja „Pripremanje uzorka“.

4. S iglom žičane petlje razmažite cjepivo u preostale kvadrante MSA.

5. Inkubirajte pločicu MSA 24–48 sati na 35 °C.

6. Identificirajte i potvrdite kolonije S. aureus i testirajte rezistentnost na meticilin u skladu sa standardnim metodama.

Bujon za uzgajanje mikroorganizama

Ova se metoda uzgajanja kultura može obavljati sa štapićima s vatom preostalim u epruveti spremnika uzorka nalon prijenosa stanične otopine u epruvetu za liziju. Stapići s vatom mogu se pohraniti na 2–8 °C u zatvorenoj epruveti spremnika uzorka ido 24 sata prije uzgajanja; može se dogoditi da povrat ne uspije s uzorcima s malim količinama MRSA.

1. Dodajte 1,0 mL bujona za uzgajanje mikroorganizama u epruvete spremnika uzorka u kojima je štapić s vatom.

Preporuča se dodavanje TSB (tryptic soy broth) s 6,5% NaCl.

2. Inkubirajte 24–48 sati na 35 °C.

3. Obavite subkulturu na odgovarajućem krutom mediju 24–48 sati na 35 °C.

Preporučuje se agar s 5% ovčje krvi.

4. Identificirajte i potvrdite kolonije S. aureus i testirajte rezistentnost na meticilin u skladu sa standardnim metodama.

DOPS03-09-V3CR2 - 8 -


Tumačenje rezultata Algoritam za odlučivanje Analize BD GeneOhm™ MRSA ugrađen je u programsku podršku SmartCycler®. Tumačenje rezultata analize obavlja se u skladu sa sljedećim kriterijima:

Rezultat kako je izvijestila analiza Rezultat IC koji je Tumačenje rezultata1

NEG (negativan) PASS (prolazno) Nije opažena DNK MRSA, nije vjerojatna nazalna kolonozacija MRSA

POS (pozitivan) NA (nije primjenjivo) Opažena DNK MRSA, nazalna kolonozacija MRSA

Unresolved (Nerazriješeno) FAIL (neuspješno) Nerazriješeno – grješka inhibicijskog uzorka ili reagensa

ND (nije određeno) ND (nije određeno) Nije određeno zbog grješke modula I-CORE®

(s kodovima upozorenja ili pogrješke2 )

IC – Unutrašnja kontrola; NA – nije primjenjivo; ND – nije određeno. 1 Rezultati Analize BD GeneOhm™ MRSA mogu se uzeti kao vodilja za izolaciju i razinu mjera opreza u skladu s programima i praksom institucije. 2 Pogledajte Priručnik progamske podrške SmartCycler® Dx radi tumačenja kodova upozorenja i pogrješaka.

Nevaljana pozitivna ili negativna kontrola čini ciklus analize nevaljanim. U takvim slučajevima rezultati tog ciklusa analize nisu valjani i ne smiju se izvijestiti. Nevaljani ciklus analize ili su na zaslonu i u izvještajima istaknuti kodovi pogrješke instrumenta ili upozorenja. Prije izvještavanja o rezultatima o MRSA, uvijek provjerite da je ciklus analize valjan.

Radi ispisa rezultata pogledajte Priručnik progamske podrške SmartCycler® Dx.

Nevaljani ciklus analize Rabeći smrznuti lizat (smrznute lizate) pripremite nove reakcijske epruvete za sve kliničke uzorke u tom ciklusu analize, zajedno s novim kontrolnim epruvetama.

Nerazriješen uzorak Ponovite testiranje s odgovarajućim smrznutim lizatom uzorka. Pokazano je da ciklus smrzavanja-odmrzavanja smanjuje učinak inhibitorskih tvari za PCR.

Uzorak nije određen razriješen uslijed grješke modula I-CORE®

Ponovite testiranje s odgovarajućim smrznutim lizatom uzorka. Za tumačenje kodiranih poruka o upozorenju ili grješci pogledajte Priručnik programske podrške SmartCycler® Dx.

Ograničenja postupka • Učinak ove analize uszanovljen je instrumentom SmartCycler®, s nazalnim uzorcima dobivenim od hospitaliziranih pacijenata ili od pacijenata na prijamu,

te s uzorcima prikupljenim rabeći sustav Copan Venturi Transystem® sa Stuartovin medijem. Stoga se ovaj proizvod može rabiti samo sa instrumentom SmartCycler®; štoviše, uporaba sustava prikupljanja i prijenosa uzoraka koji nisu navedeni u Potrebnim materijalima koji nisu priloženi se ne preporučuje. Drugi klinički izvori nisu utvrđeni, i značajke učinka ovog testa nepoznate su na drugim vrstama uzoraka ili populacijama pacijenata.

• Negativni rezultati testa mogu se javiti i zbog nepravilnog prikupljanja uzorka, nepravilnog rukovanja ili pohranjivanja, prisutnosti inhibitora, tehničke pogrješke, pomiješanih uzoraka ili zbog toga što je broj organizama u uzorku manji od analitičke osjetljivosti testa. Kako bi se izbjegli pogrješni rezultati, potrebno je pažljivo slijediti upute dane u ovom tekstu i u Priručniku programske podrške SmartCycler® Dx. Uporaba ovog testa mora se ograničiti na osoblje uvježbano za postupak i za uporabu uređaja SmartCycler®.

• Iako nema potrebe za pripremanjem reagensa, i iako je osnovna tehnička operacija pipetiranje, za pravilno obavljanje ove analite ključni su dobri laboratorijski postupci. Zbog visoke analitičke osjetljivosti ovog testa, potrebno je poduzeti krajnju pažnju kako bi se očuvala čistoća svih reagensa, posebice u slučajevima kod kojih se više količina tvari uzima iz epruvete.

• Prebiranje određuje stanje kolonizacije u danom trenutku i može varirati ovisno o tretmanu pacijenta (npr. režim dekolonizacije), stanju pacijenta (npr. ako aktivno ne izbacuje MRSA) ili izloženosti okolišu visokog rizika (npr. kontakt s nositeljem MRSA, duga hospitalizacija). Nadzor stanja kolonizacije treba se činiti u skladu s politikom bolnice.

• Rezultati Analize BD GeneOhm™ MRSA trebaju se rabiti kao dodatak napora kontrole nosocomijalnih infekcija na identifikaciji pacijenata koji zahtijevaju povaćane mjere opreza. Test nije namijenjen identifikaciji pacijenata sa infekcijom stafilokokom. Rezultati se ne smiju rabiti kao vodilja ili nadzor tretmana infekcija MRSA.

• Pozitivan rezultat Analize BD GeneOhm™ MRSA nužno ne indicira neuspjeh tretmana iskorijenjivanja bakterije, budući da DNK može preostati. Negativan rezultat koji je uslijedio nakon prethodnog pozitivnog testa može značiti uspjeh tretmana iskorijenjivanja bakterije ili do njega može doći uslijed isprekidanog izbacivanja bakterije.

• Analiza BD GeneOhm™ MRSA može nekad dati nerazriješene ili nevaljane rezultate zbog nevaljane kontrole, pa je stoga potrebno ponovno testiranje što može dovesti do kašnjenja u dobivanju rezultata.

• Pozitivni rezultat testa nužno ne ukazuje na prisutnost održivih organizama. On je, međutim, vjerojatan pokazatelj postojanja MRSA budući da Analiza BD GeneOhm™ MRSA simultano opaža mobilni genetički element na kromosomu (SCCmec cassette, koji nosi gen mecA ) i specifičnu sekvencu S. aureus lociranu unutar gena orfX. Analiza BD GeneOhm™ MRSA ne opaža izravno gen mecA niti protein koji se veže na penicilin (PBP 2a) kodiran tim genom.

• Pokazano je da Analiza BD GeneOhm™ MRSA opaža različite tipove MRSA koji su bili povezani s infekcijama dobivenim u bolnici ili u društvu; vrjednovanja nisu utvrdila fenotipske ili genotipske značajke izolata MRSA za identifikaciju sojeva koji mogu biti zarazniji u bolničkom okruženju.

• Mutacije ili polimorfizmi područja veze primera ili sonde mogu utjecati na opažanje novih ili nepoznatih inačica MRSA, što rezultira lažnim negativnim rezultatom Analize BD GeneOhm™ MRSA.

DOPS03-09-V3CR2 - 9 -


Tvari koje se upliću Tvari koje se mogu uplesti uključuju, ali nisu ogeaničene na, sljedeće: Krv, preobilne nazalne izlučevine/sluz, tvari za smanjivanje nazalnih izlučivanja, te tvari koje se povremeno rabe za olakšavanje suhoće i/ili nadraženosti nosa. Prisutnost previše nazalnih izlučevina i krvi može inhibirati PCR i može dati nerazriješene rezultate. U studiji obavljenoj na 786 nazalnih uzoraka izvješteno je kod 43% prikupljenih uzoraka o tvarima koje se potencijalno mogu uplitati. Ukupno je bilo 35 (4,5%) nerazriješenih uzoraka. Od tih 35 uzorakam za 24 nije izvješteno o potencijalno interferirajućim tvarima, bilo je 10 uzoraka s nazalnim izlučevinama i kombinacija tvari kod jednog uzorka. Dvadeset sedam (27) ih je bilo razriješeno nakon cikluza smrzavanje-odmrzavanje. Za 8 uzoraka koji nisu mogli biti razriješeni, za 4 nisu primijećene potencijalno interferirajuće tvari, nazalne izlučevine su opažene za tri uzorka, a kombinacija tvari za jedan uzorak.

Očekivane vrijednosti Ljudi su prirodan rezervoar S. aureus. Kolonizacija može biti prolazna ili stalna i može trajati godinama. Stope prenošenja od 25 do 30% bile su javljene za S. aureus za opću populaciju, a stope od 10 do 40% za pokretne bolesnike ili one na prijamu.7 S. aureus rezistentna na meticilin sada predstavlja preko 50% izolata iz S. aureus dobivenih u bolnici u nekim sjevernoameričkim bolnicama.2

U istražiteljskoj studiji za Analizu BD GeneOhm™ MRSA, ukupna stopa nazalnog nošenja utvrđena kulturom (S. aureus izplirana u uzorcima bilo kojom tehnikom s kulturama) bila je 36,1%, s rasponom od 33–40%. Pedeset jedan posto (51%) izolata S. aureus bili su rezistentni na meticilin po metodi prebiranja agara meticilinom. (Mueller-Hinton agar pločica s dodatkom oksacilina [6 μg/mL] i NaCl [4% w/v]) za ukupnu nazalnu stopu nošenja MRSA od 18,6%. Uzorak Analizu BD GeneOhm™ MRSA, ukupna stopa nazalnog nošenja MRSA bila je 20,3%.

Karakteristike rada

Klinički učinak

Karakteristike rada Analize BD GeneOhm™ Cdiff MRDA određene su prospektivnom istraživačkom studijom na više mjesta. U studiji su sudjelovala 4 medicinska centra, dva u Kanadi i dva u Sjedinjenim Državama s postojećim programima prebiranja MRSA baziranim na kulturama. Da bi sudjelovali u studiji, pacijenti su morali dati pismeni pristanak i biti podobno za prebiranje MRSA u skladu s bolničkim praksama i nisu dobivali antibiotičke terapije usmjerene na MRSA. Kriteriji koji su se nadzirali uključivali su, ali nisu nužno bili ograničeni na: sustavan pregled svih pacijenata pri prijamu, ranije infekcije ili nošenje MRSA, prijevoz iz jedne u drugu instituciju, duži boravci u bolnici ili povijest boravaka u bolnici, te kontakt s nositeljima MRSA. Referenta metoda sastajala se od početne analize s testom probiranja s agarom nakon selektivnog uzgoja na agaru s mannitolom. Uzorci negativni na MRSA bili su podvrgnuti dodatnoj analizi koja se sastojala od koraka obogaćivanja u epruveri s hranjivom podlogom trypticase soy broth (TSB) koja je sadržavala 6,5% NaCl nakon čega je slijedio test probiranja sa agarom na oksacilin. Uzorak kulture pozitivan na MRSA bio je definiran kao uzorak potitivan na MRSA bilo kojom od tehnika s kulturom.. Uzorak kulture negativan na MRSA bio je definiran kao uzorak negativan na MRSA s obje od tehnika s kulturom. Za metodu probiranja sa selektivnim rastom na agaru s mannitolom (MSA), pločice su bile izravno cijepljene s nazalnim uzorcima brisa nakon čega je slijedila inkubacija na 35 °C kroz 24 do 48 sati. Kad je bilo potrebno, vjerojatne kolonije S. aureus bile su podvrgnute subkulturi na pločicama agara s 5% ovčje krvi i inkubirane kroz 24–48 sati na 35 °C. Kolonije izolirane na drugi način bile su testirane izravno s pločica MSA. Vjerojatne stafilokokne kolonije bile su potvrđivane testom aglutinacije lateksa ili testom koagulaze u epruveti. Potvrđene kolonije S. aureus bile su testirane na pločici s agarom Mueller-Hinton kojoj je dodan oksacilin (6 μg/mL) i NaCl (4% w/v) inkubiran na 33 do 35 °C (ne više od 35 °C) puna 24 sata. Probiranje MRSA s korakom obogaćivanja u bujonu tryptic soy (TSB) koji sadrži 6,5% NaCl isto je tako obavljeno u slučajevima kad je dobiven negativan rezultat za MRSA metodom probiranja MSA. U tu svrhu bujoni TSB bili su cijepljeni nakon izravnog stavljanja na MSA, inkubirani preko noći na 35 °C, podvrgnute subkulturi pločica agara s 5% ovčje krvi kroz 24–48 sati na 35 °C i pločice su pohranjene na 2–8 °C radi testiranja, ako je ono bilo potrebno. Potvrđivanje vjerojatnih kolonija i određivanje rezistentnosti na meticilin bili su obavljeni kako je ranije opisano. Na jednom mjestu istraživanja, svaki je uzorak bio testiran rabeći obje metode probiranja kulture. Ukupno je bilo prikupljeno 786 nazalnih uzoraka prikupljenih preporučenim štapićem s vatom sa Stuartovim medijem (Pogledajte Potrebne materijale koji nisu priloženi), koji su bili prebirani za MRSA referentnom metodom kulture opisanom ranije i Analizom BD GeneOhm™ MRSA. U usporedbi s referentnom metodom kulture, Analiza BD GeneOhm™ MRSA identificirala je 92,5% uzoraka pozitivnih na MRSA bilo kojom tehnikom kultura, te 96,4% negativnih uzoraka obim tehnikama (Tablice 1 i 2). Za testiranu populaciju, to ima za rezultat negativnu prediktivnu vrijednost od 98,2% i pozitivnu prediktivnu vrijednost od 85,4%.

Tablica 1. Rezultati dobiveni Analizom BD GeneOhm™ MRSA u usporedbi s referentnom metodom.1

Analiza BD GeneOhm™ MRSA

Pozitivno Negativno Ukupno

Pozitivno 135 11 146 Tehnike kulture

Negativno 23 609 632

Ukupno 158 620 778 1 Osam (8) uzoraka koji su početno dali nerazriješene rezultate, ostali su nerazriješeni nakon ponovnog testiranja Analizom BD GeneOhm™ MRSA i nisu uključeni u tablicu. Svih 8 bilo je

negativno na kulture.

Za četrnaest (14) od 23 uzorka negativna na kulture, ali pozitivna Analizom BD GeneOhm™ MRSA, daljnim istraživanjem utvrđeno je da su pozitivni na kulturu MRSA, što je rezultiralo s ukupno 148 uzoraka pozitivnih na kulturu i Analizom BD GeneOhm™ MRSA od ukupno 160 uzoraka pozitivnih na kulturu. Za 2 uzorka od onih pozitivnih na kulturu, ali negativnih na Analizu BD GeneOhm™ MRSA, niti jedan od izolata koji je pokazao rezistentnost na meticilin na pločici s agarom i oksicilinom, moglo se pokazati da nose mecA kad su bili testirani s testom PCR specifičnim za mecA, kojeg su opisali Martineau et al.8

DOPS03-09-V3CR2 - 10 -


Tablica 2. Učinak Analize BD GeneOhm™ MRSA dobiven na mjestima istraživanja u usporedbi s referentnom metodom.

Osjetljivost (95% CI)1 Specifičnost (95% CI)1 Broj nerazriješenih uzoraka2 Nevaljano/ukupan broj ciklusa

Mjesto 1 86,8% (n = 38) (71,9–95,6%) 99,6% (n = 261) (97,9–100%) 6 0/26

Mjesto 2 100% (n = 30) (88,4–100%) 98,0% (n = 102) (93,1–99,8%) 16 0/21

Mjesto 3 89,3% (n = 28) (71,8–97,7%) 90,8% (n = 119) (84,1–95,3%) 11 1/15

Mjesto 4 94,0% (n = 50) (83,5–98,7%) 94,0% (n = 150) (88,9–97,2%) 2 2/27

Ukupno 92,5% (n = 146) (86,9–96,2%) 96,4% (n = 632) (94,6–97,27%) 35 3/89

1 Binomni 95% intervali pouzdanosti. 2 Svi su uzorci bili narazriješeni zbog pogrješke unutarnje kontrole, što je indikativno za inhibiciju ili grješku reagensa. Dvadeset sedam (27) od 35 bili su razriješeni ponovljenim testiranjem.

Tipizacija SCCmec uzoraka pozitivnih na kulturu MRSA prema Oliviera i de Lencastre9 otkrili su uzorke tipova I, II i IV. Nije bilo uzoraka SCCmec tipa III izoliranih u studiji. No, u odvojenoj studiji bili su testirani i opaženi referentni sojevi i drugi klinički izolati svih tipova SCCmec Analizom BD GeneOhm™ MRSA.

Učinak određen na mjestima istraživanja Analize BD GeneOhm™ MRSA, i pojedinačne tehnike kulture u usporedbi s referentnom tehnikokm kulture (obje tehnike kulture) prikazan je u Tablicama 3 i 4.

Tablica 3. Rezulati dobiveni Analiyom BD GeneOhm™ MRSA i svakom tehnikom prebiranja kultura s uzorcima pozitivnim na MRSA prema referentnoj metodi kultura.

Osjetljivost (95% CI)2

Mjesto Učestalost MRSA1

Analiza BD GeneOhm™ OxaMSA3 OxaTSB4

Mjesto 1 12,7% (38/300) 86,8% (71,9–95,6%) 81,6% (65,7–92,3%) nije određeno

Mjesto 2 21,7% (30/138) 100% (88,4–100%) 93,3% (77,9–99,2%) nije određeno

Mjesto 3 18,9% (28/148) 89,3% (71,8–97,7%) 64,3% (44,1–81,4%) nije određeno

Mjesto 4 25,0% (50/200) 94,0% (83,5–98,7%) 80,0% (66,3–90,0%) 78,0% (64,0–88,5%)

Ukupno 18,6% (146/786) 92,5% (86,9–96,2%) 80,1% (72,7–86,3%) nije određeno

1 Određeno na temelju rezultata dobivenih referentnom metodom kultura (kombinacija OxaMSA i OxaTSB). 2 Binomni 95% intervali pouzdanosti. 3 Test probiranja s agarom s oksacilinom nakon selektivnog uzgoja na MSA. 4 Test probiranja s agarom s oksacilinom nakon obogaćivanja u TSB sa 6,5% NaCl. Na mjestu 4 testirani svi uzorci s obje tehnike kultura dok su na ostalim mjestima testirani samo uzorci

negativni metodom kultura OxaMSA.

Tablica 4. Rezultati dobiveni Analizom BD GeneOhm™ MRSA i svakom tehnikom probiranja kultura s uzorcima negativnim na MRSA po referentnoj metodi kultura.

Specifičnost (95% CI) 2

Mjesto MSSA1

Analiza BD GeneOhm™ MRSA OxaMSA3 OxaTSB4

Mjesto 1 73/262 99,6% (97,9–100%) 100% (98,6–100%) nije određeno

Mjesto 2 25/108 98,0% (93,2–99,8%) 100% (96,4–100%) nije određeno

Mjesto 3 24/120 90,8% (84,1–95,3%) 100% (96,9–100%) nije određeno

Mjesto 4 16/150 94,0% (88,9–97,2%) 100% (97,6–100%) 100% (97,6–100%)

Ukupno 138/640 96,4% (94,6–97,7%) 100% (99,4–100%) nije određeno

1 Broj MSSA u ukupnoj populaciji kultura negativnih na MRSA. 2 Binomni 95% intervali pouzdanosti. 3 Test probiranja s agarom s oksacilinom nakon selektivnog uzgoja na MSA. 4 Test probiranja s agarom s oksacilinom nakon obogaćivanja u TSB sa 6,5% NaCl. Na mjestu 4 testirani svi uzorci s obje tehnike kultura dok su na ostalim mjestima testirani samo uzorci

negativni metodom kultura OxaMSA.

DOPS03-09-V3CR2 - 11 -


Analitička specifičnost Testirana je genomska DNK iz 37 sojeva ATVV koji predstavljaju vrste filogenetički povezane sa S. aureus i pripadnici nazalne simbioznre flore, 27 sojeva (15 referentnih sojeva i 12 kliničkih izolata) koagulaza-negativnih stafilokoka osjetljivih na meticilin i 44 soja (dva referentna soja i 42 klinička izolata) koagulaza-negativnih stafilokoka rezistentnih na meticilin. Specifičnost je bila 100%. Kao što je naznačeno u Tablici 4, 138 uzorka analizirana tehnikom kultura smatrani su na istraživačkim mjestima da sadrže meticilin-rezistentne S. aureus. Sedam (7) ih je dalo pozitivne rezultate s Analizom BD GeneOhm™ MRSA. Daljnjim istraživanjem s pojačanim tehnikama kulture, za 4 je pokazano da stvarno sadrže MRSA.

Analitička osjetljivost

Analitička osjetljivost (granica opažanja, LOD) Analize BD GeneOhm™ MRSA bila je određena sa 7 sojeva MRSA. Kvantificirana kultura i pročišćena genomska DNK razrijeđena u spremniku uzorka Analize BD GeneOhm™ MRSA bili su testirani u 5 ponavljanja. LOD je bio definiran kao najmanja koncentracija pri kojoj je barem 92,5% svih ponavljanja bilo testirano pozitivno. LOD Analize BD GeneOhm™ MRSA je 15 genomskih kopija po reakciji. LOD u CFU je 5 CFU/reakcija. Uzimajući u obzir čimbenik razrijeđivanja radi obrade uzoraka, to se prevodi u približno 325 CFU/bris.

Ponovljivost

Skupina od 10 simuliranih uzoraka s različitim koncentracijama MRSA i dvije kontrole (pozitivna i negativna) Analize BD GeneOhm™ MRSA bila je testirana u triplikatu tri različita dana na svakom od tri mjesta (10 uzoraka i još dvije kontrole testirano X 3 X 3 dana X 3 mjesta). To je bilo ponovljeno s tri grupe reagensa.

Tablica 5. Kumulativni podatci studije ponovljivosti.

Identifikacija uzorka Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Potpuno slaganje Potpuno slaganje u %

Negativno 27/27 27/27 27/27 81/81 100%

Negativno 27/27 27/27 27/27 81/81 100%

Slabo pozitivno1 19/27 18/27 16/27 53/81 65%

Jako pozitivno 27/27 27/27 27/27 81/81 100%

Jako pozitivno 27/27 27/27 27/27 81/81 100%

Slabo pozitivno1 14/27 13/27 18/27 45/81 56%

Pozitivno 27/27 27/27 27/27 81/81 100%

Pozitivno 27/27 27/27 27/27 81/81 100%

Slabo pozitivno 27/27 27/27 27/27 81/81 100%

Pozitivno 27/27 27/27 27/27 81/81 100%

Pozitivna kontrola 26/27 27/27 27/27 80/81 99%

Negativna kontrola 26/27 27/27 27/27 80/81 99%

Ukupno slaganje 301/324 301/324 304/324 906/972 93%

Ukupno slaganje u % 93% 93% 94% 93% 1 Uzorci s CFU ispod granice opažanja analize.

DOPS03-09-V3CR2 - 12 -

BD Diagnostics BD GeneOhm™ MRSA Assay

Literatura

1 Centers for Disease Control and Prevention. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin or soft tissue infection in a state prison. Mississippi, 2000. MMWR 2001; 50:919-922.

2 National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 to June 2002, issued August 2002. Am J Infect Control. 2002; 30:458-475.

3 Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Richmond JY and McKinney RW (eds) (1993). HHS Publication number (CDC) 93-8395.

4 Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline – Second edition. Document M29 (Refer to the latest edition).

5 Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline. CLSI document MM3-A2 (Refer to the latest edition).

6 Clinical and Laboratory Standards Institute. Statistical Quality Control for Quantitative Measurements: Principles and Definitions; Approved Guideline – Second Edition, Document C24 (Refer to the latest edition).

7 Jernigan, J.A. et al. Prevalence of and risk factors for colonization with methicillin-resistant Staphylococcus aureus at the time of hospital admission. Infect Control Hosp Epidemiol. 2003; 24:409-414.

8 Martineau, F. et al. Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44(2) : 231-238

9 Oliveira, D.C. and H. de Lencastre. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2002; 46:2155-2161.

Ovaj se komplet prodaje prema licenci tvrtke Public Health Research Institute of the City of New York, Inc. i može se rabiti u okviru patentnih prava PHRI samo za ljudsku in vitro kliničku dijagnostiku. Kupnja ovog proizvoda dozvoljava kupcu da ga rabi za pojačavanje i opažanje nukleinskih kiselina ili sekvenci nukleinskih kiselina u sklopu ljudske in vitro dijagnostike. Ovime se ne osigurava nikakav opći patent ili bilo kakva druga dozvola osim ovog posebnog prava o uporabi po kupnji.

DOPS03-09-V3CR2 -13-

BD Diagnostics BD GeneOhm™ MRSA Assay

Indeks simbola

Simbol Značenje

Kataloški broj

In vitro dijagnostička uporaba

Proizvođač

Ovlašteni europski predstavnik

Sadrži dovoljno za „n“ testova

Kod serije

Rabiti do

Temperaturno ograničenje

Zaštititi od svjetlosti i vlage

Ponovno zapečatite vrećice nakon uporabe

Pogledajte upute za uporabu

Kutija 1 od 3

Služba za kupce: 1.888.436.3646

DOPS03-09-V3CR2 -14-

Documents

Analiza BD GeneOhm™ MRSA