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This article was downloaded by: [The UC Irvine Libraries]On: 27 October 2014, At: 01:23Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK
Acta Botanica Gallica: BotanyLettersPublication details, including instructions for authorsand subscription information:http://www.tandfonline.com/loi/tabg20
Analyse en serre de plantes depomme de terre transforméespar Agrobacterium rhizogenesAgnès Dobigny a , Annick Ambroise a , Van Egger a &Line Rossignol aa Laboratoire de Morphogenèse végétaleexpérimentale , bât. 360, Université Paris-Sud ,F-91405 , Orsay CedexPublished online: 26 Apr 2013.
To cite this article: Agnès Dobigny , Annick Ambroise , Van Egger & LineRossignol (1994) Analyse en serre de plantes de pomme de terre transformées parAgrobacterium rhizogenes , Acta Botanica Gallica: Botany Letters, 141:1, 15-26, DOI:10.1080/12538078.1994.10515131
To link to this article: http://dx.doi.org/10.1080/12538078.1994.10515131
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Acta bot. GaUica, 1994, 141 (1), 15-26.
Analyse en serre de plantes de pomme de terre transformees par Agrobacterium rhizogenes
par Agnes Dobigny, Annick Ambroise, Van Egger et Line Rossignol
Laboratoire de Morphogene5e vegetale experimentale, biit. 360, Universite Paris-Sud, F-91405 Orsay Cedex
(Manwcrit re~u le 25 mars 1993; accepte le 21 septembre 1993)
Resume.- Une etude morphologique de plantas de pomme de terre transformees par Agrobacterium rhizogenes (souches a mannopine et a cucumopine) a ete realisee en serre. L'analyse moleculaire par Dot Blot a confirms !'integration du T-DNA du plasmide Ri dans ces plantas. Les plantas transformees, obtenues par regeneration a partir de clones racinaires transformes ou directement neoformees sur section d'entre-nc:euds, ant montre une grande diversite ph9notypique. Plusieurs niveaux de variations ant ete mis en evidence : Ia variation entre plantas issues d'un mArne clone racinaire est mains etendue que cella entre plantas regenerees a partir de clones racinaires independants. D'autre part, les plantas neoformees directement sur section d'entre-nc:euds sont les mains perturoees morphologiquement. Ainsi, ce nouveau mode de transformation permet de limiter Ires nettement Ia variation somaclonale.
Summary.- A morphological study of potato plants transformed by Agrobacterium rhizogenes (mannopine and cucumopine strains) was conducted in the greenhouse. A Dot Blot analysis confirmed the integration of the Ri plasmid TDNA in these plants. The transformed plants obtained by regeneration from transformed root lines or directly formed on internode sections showed a great variation in their phenotypes. Several variation levels have been observed : variation was less extended between plants issued from a same root line than between plants regenerated from independant root lines. Moreover, plants directly produced on internode sections were morphologically less disturbed. This new transformation process seems, therefore, to limit somaclonal variation.
Key words : Solanum tuberosum - Agrobacterium rhizogenes - transformation -greenhouse morphology- Dot Blot.
©Societe botanique de France 1994. ISSN 1253-8078.
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16 ACTA BOTANICA GALLICA
INTRODUCTION
Les travaux sur Ia transformation de Ia pomme de terre par des souches sauvages d'Agrobacterium rhizogenes (15834 ou 1855) ou a l'aide de constructions bacteriennes contenant un plasmide Ri ont debute il y a une dizaine d'annees (Willmitzer et al., 1982). Seuls les plasmides Ri a agropine contenant deux regions T (TL et TR) ont ete utilises par differents auteurs pour transformer un petit nomhre de varietes (Bintje, Desiree, Maris Bard) (Ooms et al., 1985; Hanisch ten Cate et al., 1987) et quelques genotypes diplo'ides et monohaplo'ides (De Vries-Uijtewaal et al., 1988; Visser et al., 1989). La region TR porte les gimes codant pour Ia biosynthese de l'auxine et de l'agropine. La region TL est homologue de l'unique region T des souches a mannopine et a cucumopine (Spano et al., 1982). La presence d'une seule region T dans ces souches est un avantage majeur puisque, grace a Ia presence constante d'opine(s), Ia mise en evidence de l'etat transforme des cellules vegetales est tres rapide et tres aisee. Nous avons alors choisi d'etudier }'influence de souches d'Agrobacterium rhizogenes a cucumopine et a mannopine, non encore employees pour Ia transformation de Ia pomme de terre, sur deux varietes : BF15 et Fanette. Ces souches bacteriennes, non pathogenes dans un premier temps, ont ete utilisees efficacement grace a une bonne maitrise d'un apport auxinique exogene (induction d'ANA a 5 mg.I·1
) et endogene (changement de polarite). L'efficacite de cotransformation, etablie par Ia mise en evidence des opines et de l'activite du gene codant pour Ia 13-glucuronidase, est tres Clevee. La regeneration de plantes entieres a partir des racines transformees a ete obtenue rapidement apres passage par un cal. Une methode de transformation efficace et rapide a
done ete mise au point (Dobigny et al., 1992a). Mais, suite a l'inoculation avec ces souches, un phenomene nouveau est apparu : le developpement de bourgeons transformes directement sur Ia section des entre-nreuds. L'analyse histologique de ces bourgeons montre que ces tiges sont neoformees a partir de cellules corticales de l'entre-nreud et non a partir d'une racine (Dohigny et al., 1992b). Nous avons choisi de transferer en serre un certain nombre' de plantes transformees afrn de les comparer en tenant compte de leur mode d'obtention : regenerations a partir de clones racinaires ou neoformations directes sur sections d'entre-nreuds. Nous avons procede, alors, a des experiences d'hybridations moleculaires afin de confirmer leur etat transforme et effectue une etude morphologique qui porte sur des caracteres des appareils vegetatif et reproducteur.
MATERIEL ET METHODES
Materiel vegetal L'analyse a porte sur : • les deux variates temoins BF15 (INRA, 1947) et
Fanette (INRA, 1984), • un echantillon de quatorze plantas transforrnees,
obtenues ~ partir de clones racinaires transforrnes qui no us ont paru constituer un echantillon representat~ de !'ensemble des plantas transforrnees obtenues par cette methode. Ouatre plantas sont regenerees ~ partir de clones racinaires independants et, pour chacun des deux clones racinaires R4 et R5, cinq plantas issues de cals dille rents ont ate retenues,
• les sept plantas transformees apparues directement sur section d'entre-nO!!uds.
Ces plantas transforrnees et les 2 temoins ayant ate clones, l'essai a porte sur 23 clones au total, chaque clone etant represent& par 4 ~ 7 individus. Les plantas transformees ont ate obtenues apres inoculation avec les souches ~ cucumopine (2659 et 2659 GUS) et ~ mannopine (8196 GUS) (Dobigny et a/., 1992a).
Mise en place de l'essal et conditions envlronnementales de Ia serre Insect-proof
Des plantas in vitro agees de 4 semaines sont transferees pour sevrage dans une serre dans des pots contenant un melange de terreau de Baal (2/5), de
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terreau de feuilles de Mtre (1/5), de terre vegetale (1/5), de sable de Loire (1/5). Trois semaines plus lard, ces plantas sent repiquees en container contenant de Ia terre sablo-limoneuse dans une serre experimentale insect-proof, refroidie par un systilme de type ·cooling·. La temperature varia de 15 a 22•c. Les plantas sent disposees au hasard, avec un espacement de 0,60 m d'une plante a !'autre dans Ia mAma rangee et de 1 m d'ecart entre les rangees. A Ia fin de l'essai, les plantas, a !'exception des tubercules, ont ate detruites en conform~e avec les rilgles en vigueur.
Analyse moleculalra des plantas par Dot Blot L'ADN genomique est extrait a partir de 10 g de
matiilre fralche salon le protocole decrit par Phelep el a/. (1991 ). L'ADN est purifie par centrnugation sur gradient de CsCI (Maniatis at a/., 1982). Les ADNs plasmidiques utilises comma sondes sent extraHs par lyse alcaline (Maniatis el a/., 1982). La sonde DB 145 est un fragment Hindiii-EcoRI de 2,3 Kb qui contient Ia bordure droHe du T-DNA et le gilne de synthilse de Ia cucumopine. La sonde T 218 est un fragment BamH1 de 25 Kb qui recouvre tout le T-DNA, notamment Ia bordure droite, le gilne de synthilse de Ia mannopine, les gilnes assimiles aux gilnes rol (Hansen, 1991 ). Les ADNs vegetaux et plasmidiques sent digeres a 37•c pendant 5h et 1 h respectivement par !'endonuclease de restriction appropriee (1 0 U/~g d'ADN de plante, 1 U/~g d'ADN plasmidique) salon le protocole du four-
Parametres etudles Les observations morphologiques ont ate effectuees
au bout de deux mois et ont porte sur l'appareil vegetatif et reproducteur. Les paramiltres mesures et observes sent regroupes dans le tableau I.
Tableau 1.- Paramiltres mesures et observes sur les appareils vegetatif et reproducteur des plantas transferees en serre insect-proof.
Table 1.- Measured and observed parameters on vegetative and reproductive parts of plants transferred in an insect-proof greenhouse.
Caract~res mesur~s et observ~s
- Hauteur de Ia base de Ia plante 11. Ia base de Ia premi~re cyme infl orescen tielle.
La tige 0 Nombre de cycles inflorescentiels, chacun d'eux se terminant par une inflorescence. Le relais v~g~tatif, qui donner a naissance
principale au nouveau cycle, est assur~ par un bourgeon axillaire de !'avant-derni~re feuille situ~e so us !'inflorescence (Benzine-Tizroutine et coli., 1993). - Surface moyenne de Ia troisi~me feuille situ~e so us !'inflorescence dans Ie deuxi~me cycle (calcul~e 11. I' aide d'un planim~tre Delta T, Area Meter). - Couleur du feuillag~ : Ia Fanette a un feuillage vert clair mat qui contraste avec le vert plus fonc~ brillant des feuilles de BF15. La
Le feuillage couleur des feuilles des pi antes transform~es peut etre vert clair mat (comme Fanette), vert fonc~ brill ant (comme BF15) ou vert tr~s fonc~ brill ant. - Gaufrage du feuillage : les plantes transform~es pr~sentent une grande variation qui va d'une absence de gaufrage (com me Ies t~moins Fanette et BF15) 11. un feuillaRe tr~s Raufr~.
Le syst~me - Intensit~ d'enracinement secondaire. racinaire - Taille des racines principales.
Les fleurs et - Floraison et viabilit~ du pollen (estim~e par Ia coloration rouge
Ies fruits des grains de pollen viables apr~s traitement au carmin ac~tique). 0 Fructification ou non fructification des plantes. 0 Nombre de tu hercules/pied.
Les - Masse de tubercules en g/pied. tubercules Seuls les tubercules de masse sup~rieure 11. 5 g ont ~t~ pris en
compte.
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nisseur (Boehringer). Apres denaturation, les fragments d'ADN de plante sont deposes sur une membrane (Hybond-N, Amersham). Les sondes sont marquees radioactive men! par de l'a32P dCTP grace au kit megaprime (Amersham). Les conditions d'hybridation sont celles decrites par Maniatis er at. (1982). Les membranes hybridees sont autoradiographiees sur film Kodak XOmat.
RESULTATS
1 - Verification de l'etat transforme des plantes
L'ADN des plantes transformees par les souches a cucumopine (2659 et 2659 GUS) est hybride avec Ia sonde DB 145 et celui des plantes transformees par Ia souche a mannopine (8196 GUS) est hybride avec Ia sonde T 218. Aucune hybridation n'a lieu entre les sondes et I'ADN genomique des plantes temoins BF15 et Fanette (Pl. I). Chaque spot montre que l'hybridation a lieu pour chaque clone transforme et revele done Ia presence d'au moins une copie du T-DNA integre dans le genome de ces plantes transformees de pomme de terre. Les resultats presentes sur Ia planche I montrent Ia nature transformee pour 14 plantes sur 23 etudiees mais nous avons detecte Ia presence du T-DNA dans toutes les plantes transferees en serre insect-proof.
2 - Classcmcnt des plantcs transformccs etudiecs
Nous avons choisi de traiter separement les deux populations de plantes : les plantes neoformees a partir de clones racinaires transformes et celles neoformces directement sur section d'entre-nreuds. Un certain nombre de mesures ont cte utilisces pour repartir les 23 clones en groupes et sous-groupes. Ainsi, celles portant sur le caractere hauteur moycnne de Ia plante (h) ont permis de faire un premier classement en etablissant trois groupes de plantes : un groupe tcmoin (T) comprenant Ia
BF15 et Ia Fanette (h = 78 em) et deux autres groupes G
1 h = 37 em) et G
2 (h = 13 em) constitues des 21 clones transformes. Nous avons ensuite affine le classement. A l'interieur du groupe G
1, trois sous-groupes ont pu etre cons
titues : G1., G 1b et G1c en tenant compte
de Ia surface foliaire, de Ia masse de tubercules par pied et du nombre de cycles inflorescentiels. Les resultats portant sur les caracteres mesures sont presentes dans les tableaux II et III (dans lesquels, pour chaque groupe ou sousgroupe, nous avons indique Ia moyenne sur n mesures effectuees et Ia variation observee).
3 - Etude des differents parametres • Caracteres lies a Ia tige principale Toutes les plantes transformees sont
plus petites que les temoins. Celles du groupe G
2 presentent d'ailleurs un na
nisme aigu. La premiere inflorescence rencontree est tres basse chez les clones possedant un nombre eleve de cycles inflorescentiels. II en est ainsi en particulier pour toutes les plantes transformees qui ont un nombre de cycles inflorescentiels plus eleve que celui du temoin Fanette (F7, F9 et F12). Le nombre de cycles inflorescentiels est un bon critere pour evaluer le degre de perturbation du fonctionnement de Ia plante. Les groupes G
1c et G
2 ont un fonctionnement
tres aberrant : le nombre de cycles est en moyenne de 1 ,2.
• Caracteres lies au feuillage Les plantes transformees a fonction
nement perturbe, regroupees en Glc et G
2 vieillissent tres rapidement, de sorte
qu'au moment de !'observation, un certain nombre d'entre elles avaient perdu leurs fcuilles aux deux premiers cycles inflorcscenticls. Ainsi, le nombrc de mesures concernant le feuillagc s'cn est trouve tres reduit, notamment pour les mesurcs de surface foliaire. La planche IIA montre les graduations du
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Planche 1.- Analyse moleculaire des plantas par Dot Blot. A - Plantas transformees avec les souches 2659 et 2659 GUS. a- representation d'une partie de Ia carte de restriction (Hindiii-EcoRI) de Ia region T du plasmide pRi 2659 (Combard et a/., 1987). Le fragment DB 145, localise sur cette carte, est utilise comma sonde ; b - Dots blots realises avec Ia sonde DB 145. B- Plantas transformees avec Ia souche 8196 GUS. a- representation d'une partie de Ia carte de restriction (BamH1) de Ia region T du plasmide pRi 8196 (David et Tempe, 1987). Le fragment T 218, localise sur cette carte, est utilise comma sonde : b - Dots blots realises avec Ia sonde T 218.
Plate I .- Molecular analysis of plants by Dot Blot. A - Plants transformed with 2659 and 2659 GUS strains. a- representation of a part of the restriction map (Hindiii-EcoRI) of the pRi 2659 T region (Combard et a/., 1987). The fragment DB 145, placed on this map, is used as probe ; b - Dots blots realized with the DB 145 probe. B - Transformed plants with the 8196 GUS strain. a - representation of a part of the restriction map (BamH1) of the pRi 8196 T region (David and Tempe, 1987). The fragment T 218, placed on this map, is used as probe; b- Dots blots realized with the T 218 strain.
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Tableau 11.- Caracteres mesures sur las plantas regenerees a partir de clones racinaires transformes. Table 11.- Measured characters on plants regenerated from transformed root lines.
Groupe No clone
T
Gt
Fanette
BF15
F12 , B21 G 1a et B23
Gtb
G1c
B17, Bl8, Bl9 et
B20 B10, Bt3, Bl4, B15
et B24
Btl et B22
Mesures
moyenne variation nombre
moyenne variation nombre
moyenne v ari at ion nombre
moyenne variation nombre
moyenne variation nombre
moyenne variation nombre
Hauteur I Nombre sous la l o tu berc. infloresc. par pied
(em) 7 0
52-90 n = 14
85 77-98 n = 14
3 6 25-52 n = 17
4 0 21-5 8 n = 25
3 6 20-64 n = 21
1 4 9-21 n=8
9,3 3-20
n = 14 5,9 4-13
n = 14
10,4 4-19
n = 17 9,2 2-12
n = 25 6,3 2-15
n = 32
1 '5 0-7
n = 10
Masse tuberc.
par pied (g)
1637 850-2510
n = 14 326
83-654 n = 14
347 157-580
n = 17 2 2 1
77-370 n = 25 1 2 1
12-266 n = 33
1 4 7-49 n = 9
Surface foliaire (mm2J
i Nombre 1 cycles ! infloresc. ~
16 3 4 I 419-39521
n = 14 I
1687 ! 33s-3soo 1
n = 14 i 7 6 4 !
261-21701 n = 14 I 3 2 9 !
75-514 I n = 24 i 1 7 1 !
113-323 1 n = 6 1
1 1 8 i 115-122 I
n = 2 !
3,4 2-4
n = 14
1 '2 1-2
n = 14
3,5 3-5
n = 17 2,7 1 -4
n = 25
1 '3 0-3
n = 22
1 '2 0-4
n = 8
lnflores. = inflorescence ; n = nombre de mesures effecturees. BX BF15 ; FY = plante transformee Y issue de Fanette.
plante transformee X issue de
Tableau Ill.- Caracteres mesures sur las plantas neoformees directement sur Ia section d'entre-nceuds. Table Ill.- Measured characters on plants directly produced on internode sections
Hauteur Nombre Masse Surface i Nombre Groupe No clone Mesures sous Ia 1 o tu berc. tuberc. foliaire I cycles
infloresc. par pied par pied (mm2) I infloresc. (em) (g) !
moyenne 7 0 9,3 1637 1634 i 3,4 Fanette variation 52-90 3-20 850-2510 419-39521 2-4
nombre n = 14 n = 14 n = 14 n = 14 I n = 14
T moyenne 8 5 5,9 326 1 6 8 7 ! 1 '2 BF15 variation 77-98 4-13 83-654 335-3soo 1 1-2
nombre n = 14 n = 14 n = 14 n = 14 I n = 14
moyenne 3 4 9,9 562 11 9 0 I 3,8 Gta F7 et F9 variation 24-45 5-17 139-1117 733-305lf 3-5
nombre n = 10 n = 10 n = 10 n=8 I n = 10
Gt moyenne 3 9 12' 6 244 58 7 i 3 '1 Gtb
B3. B5 et variation 25-61 4-26 97-486 221-11261 2-4
B6 nombre n- 21 n = 21 n = 21 n = 20 n = 21
moyenne 1 2 0,5 9 8 9 I 1. 2 Gz F4 et F8 v ari ati on 5-29 0-2 5-38 44-131 I 0-2 I
nombre n = 8 n = 11 n = 11 n=4 I n = 8
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gaufrage au niveau des feuilles des differentes plantes transformees etudiees. La couleur varie du vert clair mat a vert tres fonce brillant en passant par vert fonce brillant. Le gaufrage le plus prononce est tres souvent associe a Ia couleur vert tres fonce. Le feuillage peut etre majoritairement vert clair pour des plantes transformees issues de Fanette ou vert fonce pour des plantes transformees issues de BFlS. Les plantes les plus proches des temoins, par leur absence de gaufrage et leur couleur, sont les clones B21, Bl4, B3, BS, B6 (proches de Ia BFlS) et F7, F9 (proches de Ia Fanette). Toutefois, Ia surface foliaire de ces plantes est en general plus reduite que celle des temoins (reduction de moitie pour F7 a plus de 9/lOeme pour Bl4) sauf pour F9 pour lequel Ia surface foliaire moyenne est egale a celle du temoin Fanette (Tableaux II et III).
• Caracteres lies au systeme racinaire Nous constatons que toutes les plan
tes transformees etudiees ont des racines de plus faible diametre que les temoins alors que l'intensite d'enracinement secondaire peut etre plus forte, notamment pour les plantes transformees directement sur Ia section d'entrenreuds, pour lesquelles les racines forment le plus souvent un chevelu important. La taille des racines principales diminue progressivement et le diametre est le plus faible pour les plantes les plus aberrantes (G2).
La taille plus reduite, Ia surface des feuilles en general plus petite et le systeme racinaire plus chetif de ces plantes transformees montrent qu'elles manquent de vigueur et qu'elles ont un fonctionnement perturbe. QueUe que soil leur origine, elles vieillissent toutes plus vite que les temoins.
• Caracteres lies aux fleurs et aux fruits
Toutes les plantes transformces appartenant au groupe G fleurissent et mcme souvent celles de (;th" Fanette est
connue pour sa faible fertilite pollinique qui fait d'elle un mauvais parent male en croisement. Dans notre essai, Ia viabilite pollinique du tcmoin Fanette est Ia meme que celle des plantes transformees de cette meme variete les moins perturbces du groupe G
1a (F9, F7 et
Fl2) : environ 10 %. Nous avons cvalue Ia viabilitc pollinique pour deux plantes transformees issues de BFlS : celle de B6 est de 38 % et celle de B3 de 52 %. Ces chiffres sont un peu plus faibles que ceux obtenus pour le tcmoin BFlS dont Ia viabilite pollinique s'eleve a 70 % mais ils ont ete obtenus pour des individus du groupe G1h et non Gia. Tres peu de plantes ont fructifie au cours de l'essai : les deux temoins BF15 et Fanette et seulement deux plantes transformees du groupe G
1a
issues de Fanette obtenues directement sur section d'entre-nreuds (F7 et F9).
• Caracteres lies aux tubercules La tuberisation des plantes transfor
mees est perturbee au niveau de Ia masse de tubercules par pied, toujours plus reduite que celle des temoins. Par contre, nous avons note que quelques plantes transformees ont un nombre de tubercules plus eleve que les temoins (B21, F7, B3, BS et B6). Les plantes du groupe G2 ont une tuberisation quasi nulle, notamment le clone B22 qui n'a donne qu'un tubercule de masse inferieure a 5 g pour une plante sur trois. Les tubercules des plantes transformees sont tous de plus petite taille que ceux des temoins : Ia masse moyenne d'un tubercule de plante transformee issue de Fanette ne represente au maximum qu'un tiers de celle du temoin (Pl. liB). Mais c'est l'aspect du tubercule chez ces plantes transformees qui est le plus perturbe : ils sont tous allongcs avec des ycux proeminents. Quelques clones presentent des yeux avec des feuilles en ccailles charnues (B21, B23, B3, BS et B6) qui donncnt a ces tubercules un aspect de "pomme de pin".
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Planche 11.- Analyse morphologique des plantes en serre. A - Graduation du gaufrage de feuilles de plantas transformees. a- gaufrage (-): temoin Fanette (pas de gaufrage): b- gaufrage (-) (F9) (pas de gaufrage: cgaufrage (+) (F12): d- gaufrage (++)(BIB): e- gaufrage (+++) (824). B- Comparaison de Ia taille des tubercules. a - FS : b - F12 : c - temoin Fanette : d - Morphologie perturbee des tubercules. C - Comparaison des plantas en fonction de leur mode d'obtention. a- temoin Fanette : b- F9 : plante directement formee sur section d'entre-nooud : c - F12 : plante regeneree a partir d'un clone racinaire transforme.
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4 - Comparaison des plantes transformees en fonction de leur mode d'obtention : sur entrc-nreud ou sur racine
Les observations portant sur les caracteres mesures (Tableau II et III) et observes permettent de comparer les plantes du groupe G
1 en fonction de leur
mode d'obtention : neoformations directes sur section d'entre-nceuds ou a partir de racines. Le groupe G
2 n'etant
constitue que de plantes aberrantes, nous ne les comparerons pas. Les mesures quantitatives, telles que la surface foliaire, Ia masse de tubercules et le nombre de cycles inflorescentiels, sont plus grandes pour les groupes G1• et G 1h
des neoformations sur section d'entrenceuds que pour ceux des neoformations sur racines. D'autre part, seul ce premier type de plante a fructifie lors de notre etude (F7 et F9). Elles ne presentent pas de gaufrage, elles possedent l'intensite d'enracinement secondaire Ia plus importante. La couleur varie de vert clair a vert fonce et aucune d'entre elles n'est vert tres fonce. Ceci montre que le fonctionnement des plantes est, de fat;on generale, beaucoup moins perturbe pour les neoformations directes sur entre-nceuds (Pl. IIC).
5 - Correlation entre la morphologic des plantes transformees et le clone racinaire dont elles sont issues
Nous avons choisi dans notre essai de comparer des plantes issues de six clones racinaircs differents et d'autres, neoformees a partir d'un meme clone. Deux clones racinaires transformes (R4 ct RS) ont donne naissance a de nombreuscs regenerations. Pour chacun de
ces deux clones, cinq neoformations ont ete choisies et transferees en serre experimentale pour les analyser morphologiquement (Tableau IV).
Nous constatons que Ia plus grande variation morphologique est observee entre les plantes issues de clones racinaires independants : toutefois, il existe egalement des differences entre les plantes issues d'un meme clone. Ceci est particulierement net pour les plantes neoformees a partir de R4 : une plante (B20) est classee dans le groupe G1h,
3 plantes (BlO, B20 et B24) dans G1c et
une plante (B22) dans le groupe G2
,
c'est-a-dire parmi les plantes les plus perturbees. Ce dernier clone (B22) ne tuberise que tres rarement, ne produit aucune inflorescence et ne depasse pas IS em de hauteur totale, alors que le clone B20 produit en moyenne 13 tubercules pour une masse de 233 g par pied et environ 2 cycles inflorescentiels le long de la tige principale.
DISCUSSION ET CONCLUSION
La nature transformee des plantes que nous avons choisies d'etudier en serre insect-proof avait ete precedemment verifiee par Ia presence d'opine (cucumopine ou mannopine) et/ou par Ia detection de l'activite du gene GUS (Dobigny et al., 1992a et b). L'integration du TDNA a ete confirmee ici par une analyse moleculaire en Dot Blot. Les plantes transformees, quelle que soit leur origine, ont manifeste une grande diversite phenotypique. Cette amplitude de variation a deja ete soulignee par les equipes ayant travaille sur Ia transfor-
Plate 11.- Morphological analysis of plants in greenhouse. A - Variation of foliage crinkling of transformed plants. a - crinkling (-): Fanette control (no crinkling); b - crinkling (-) (F9) (no crinkling) ; c - crinkling (+) (F12) ; d- crinkling (++) (818) ; e -crinkling (+++) (824). 8 -Comparison of the tuber size. a- FS ; b- F12 ; cFanet1e (control) ; d - disturbed morphology of tubers. C - Comparison of plants in correlation with their obtention method. a - Fanette (control) ; b - F9 : plant directly formed on internode sections ; c - F12 : plant regenerated from a transformed root line.
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Tableau IV.- Correspondance entre les clones racinaires transformes et les plantas regenerees qui en son! issues.
Table IV.- Correspondence between transformed root lines and regenerated plants issued from lhPose root lines.
Groupe N° plante Clone racinaire
F12 R14 Gta B21 R12
B23 B17 R5
Gtb B18 B19
Gt B20 BlO R4 B15
Gtc B24 B 13 R5 B14 R45 B 11 R24
02 B22 R4
FY : plante Y issue de Fanette. BX : plante X issue de BF15.
mation de la pomme de terre (Ooms et al., 1985; Hanisch ten Cate et al., 1988). De nombreux caracteres sont modifies tant sur le plan morphologique que physiologique. Nous avions deja observe in vitro des differences entre les clones et surtout entre les clones transformes et les clones temoins (Dohigny, 1992) : nous avons vu ici qu'il existe une correlation entre la morphologic des clones in vitro et celle de ces memes clones en serre. Malgre un fonctionnement parfois perturhe, tous les clones transformes ont tuherise meme si les tuhercules produits sont tres petits et peu nombreux, commc dans le cas du clone B22. Ainsi, la fonction de tuberisation, primordiale pour la culture de la pommc de terre, n'est jamais totalement dHieiente.
Nous avons distingue les resultats obtenus en fonction du mode d'obtention des plantes transformees. Les ncoformations sur sections d'entre-nceuds sont moins perturbees que les plantes issues de clones racinaires transformes. Certaines neoformations directes (F7 et F9) presentent d'ailleurs des caracteres tres proches du temoin Fanette. Ce type de neoformation est obtenu direetement sur sections d'entre-nceuds sans l'intermediaire d'une racine ni d'un cal macroscopiquement visible. Elle ne nccessite aucun apport exogene de substances de croissance. Ces conditions pourraient etre un moyen de limiter Ia variation constatcc in vitro qui pcrturbe souvent le developpement des plantcs de pomme de terre.
Nous avons note une proportion plus
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importante de clones aberrants par rapport aux temoins parmi les plantes regenerees a partir de racines transformees. Cette constatation permet de determiner que la large gamme de variation morphologique observee est due, chez les clones neoformes a partir de racines, pour une part aux genes du TDNA integres et, pour une autre part, au processus de regeneration in vitro. En effet, il est desormais admis que la part la plus importante de la variation provoquee par la culture in vitro, et qualifiee de variation somaclonale (Larkin et Scowcroft, 1981), est attrihuable a la phase cal, comme l'atteste le fait qu'il peut emerger d'un meme cal des plantes tres dissemblables (RossignolBancilhon et al., 1980 ; Benzine-Tizroutine, 1989 ; Benzine-Tizroutine et al., 1993). Les comptages chromosomiques que nous avons deja realises n'ont porte que sur des plantes de BF15 neoformees a partir de clones racinaires transformes par des souches a agropine (15834). Le denomhrement chromosomique a montn~ que ces plantes, meme les plus aberrantes, sont a un niveau tetraplolde ou proche de la tetraploldie: variation de 44 a 48 chromosomes. Nous avons vu qu'il peut exister des formes morphologiques tres differentes du temoin BF15 et tres perturbees qui possedent le meme nombre chromosomique et, inversement, des plantes transformees assez proches du temoin phenotypiquement peuvent etre aneuploldes. Ainsi, aucune correlation n'a pu etre clairement etablie entre la perturbation morphologique et l'aneuploldie.
Hanisch ten Cate et al. (1988) observent que les plantes transformees issues de Bintje different toutes du temoin et presentent une tres large gamme de variation phenotypique. Les caracteristi-
ques de ces plantes sont similaires lorsqu'elles sont issues d'un meme clone racinaire mais different si elles sont neoformees a partir de clones racinaires independants. Par contre, les plantes transformees provenant de Desiree sont toutes semhlables entre elles, quel que soit le clone racinaire dont elles sont issues, et ont un phenotype et un developpement distincts de ceux du temoin non transforme (Ooms et al., 1985). Ainsi, ces auteurs montrent !'influence de Ia variete de pomme de terre employee sur les variations de plantes transformees. Nos observations ont porte sur des plantes transformees de BF15 et de Fanette mais le nombre de clones testes issus de Ia variete Fanette n'est pas assez grand pour comparer le comportement des plantes transformees issues des deux varietes. Toutefois, nous avons mis en evidence !'existence de deux niveaux de variation au sein des plantes transformees de BF15 : variation entre les plantes neoformees a partir de clones racinaires independants et variation, moins etendue semble-t-il, entre les plantes regenerees a partir d'un meme clone racinaire transforme.
L'analyse realisee en serre insectproof fermee a permis d'etudier Ia morphologic des plantes transformees dans les conditions les plus proches des conditions naturelles. En effet, cette etude n'a pas pu etre menee au champ compte tenu des conditions de culture imposees par Ia Commission de Genie Biomoleculaire concernant !'experimentation sur les plantes issues de genie genetique.
Remerciements. · No us tenons a remercier M. Rossignol pour Ia lecture du manuscrit, J.L. David pour les cultures en serre, M.J. Defoug et D. Froger pour !'illustration.
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