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Fachbereich Versorgungstechnik
Bachelorstudiengang Bio- und Umwelttechnik
Sommersemester 2011
Analytik des Ligninabbaus
durch Weißfäulepilze
Erstprüfer Frau Prof. Dr. rer. nat. Wilharm
Zweitprüfer: Prof. Dr. Ulrich Zaiß
Bachelorarbeit
Riccardo Gengerke, Matrikel-Nr. 20822132
Geb. am 04.09.1975 in Teterow - Deutschland
1
Eigenständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Bachelorarbeit selbstständig angefertigt
und mir zuteilgewordenen Hilfen sowie das benutzte Schrifttum am Ende dieser
Arbeit angegeben habe.
Diese Arbeit hat in dieser oder abgeänderter Form keiner anderen Prüfungsbehörde
vorgelegen.
Wolfenbüttel, den 24.08.2011 Riccardo Gengerke
2
Inhaltsverzeichnis
1. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................................. 7
2. EINLEITUNG ................................................................................................................................................ 8
3. ZIELSTELLUNG ........................................................................................................................................ 11
4. GRUNDLAGEN ......................................................................................................................................... 12
4.1. LIGNIN .................................................................................................................................................. 12
4.2. CELLULOSE .......................................................................................................................................... 13
4.3. HEMICELLULOSE .................................................................................................................................. 15
4.4. WEIßFÄULEPILZE (PLEUROTUS OSTREATUS UND DONKIOPORIA EXPANSA) ...................................... 15
4.5. ENZYME ............................................................................................................................................... 17
4.5.1. Enzymkinetik ............................................................................................................................. 18
4.5.2. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14).......................................................................................... 19
4.5.3. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13) ...................................................................................... 20
4.5.4. Laccase (EC 1.10.3.2) ............................................................................................................. 20
4.6. PHOTOMETRIE ..................................................................................................................................... 21
4.7. BIOGASPRODUKTION ........................................................................................................................... 23
5. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................................ 24
5.1. PILZKULTUREN ..................................................................................................................................... 24
5.2. MEDIEN ................................................................................................................................................ 26
5.2.1. Nähragar .................................................................................................................................... 26
5.2.2. Nährbouillon .............................................................................................................................. 26
5.2.3. Minimalmedium ........................................................................................................................ 26
5.2.4. Substrate für den Ligninabbau ............................................................................................... 27
5.3. KULTIVIERUNGSMETHODEN ................................................................................................................. 29
5.3.1. Konservierung der Pilzkulturen .............................................................................................. 32
5.4. LIGNINBESTIMMUNG ............................................................................................................................ 33
5.4.1. Probenvorbereitung ................................................................................................................. 33
5.4.2. Quantitative Ligninbestimmung nach (J. H. Ross, 1933); verändert nach Vasilic, 2011 33
5.4.3. Bestimmung des Ligninanteils in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN EN ISO
13906, 2008) .............................................................................................................................................. 35
5.5. ENZYMATISCHE AKTIVITÄT .................................................................................................................. 37
5.5.1. Vorbereitung ............................................................................................................................. 38
5.5.2. Puffer und Lösungen für die Enzymtests .............................................................................. 38
5.5.3. Lignin-Peroxidase-Aktivität (EC 1.11.1.14) .......................................................................... 40
5.5.4. Laccase-Aktivität (EC 1.10.3.2) ............................................................................................. 42
5.5.5. Mangan-Peroxidase-Aktivität (EC 1.11.1.13)....................................................................... 42
5.6. BIOGASPRODUKTION ........................................................................................................................... 42
5.6.1. Quantitative Auswertung nach Entwurf VDI 4630 (VDI-Richtlinie, 2004) ........................ 43
6. ERGEBNISSE ............................................................................................................................................ 46
6.1. KULTIVIERUNG DER WEIßFÄULEPILZE ................................................................................................. 46
6.1.1. Waldpilz ..................................................................................................................................... 46
6.1.2. Pleurotus ostreatus Stamm 1833 .......................................................................................... 47
6.1.3. Donkioporia expansa Stamm 9690 ....................................................................................... 51
6.1.4. Kultivierung auf ligninhaltigen Substraten ............................................................................ 52
6.2. LIGNINBESTIMMUNG ............................................................................................................................ 55
6.2.1. Ligninbestimmung der verwendeten Substrate (nach J. H. Ross, 1933) ........................ 55
6.2.2. Ligninbestimmung der verwendeten Substrate in Anlehnung an DIN EN ISO 13906
(DIN EN ISO 13906, 2008) ...................................................................................................................... 56
6.2.3. Ligninabbau durch Weißfäulepilze ........................................................................................ 57
6.3. ENZYMATISCHE AKTIVITÄT .................................................................................................................. 58
3
6.3.1. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14).......................................................................................... 58
6.3.2. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13) ...................................................................................... 63
6.3.3. Laccase (EC 1.10.3.2) ............................................................................................................. 64
6.4. BIOGASAUSBEUTEN ............................................................................................................................. 65
7. DISKUSSION DER ERGEBNISSE ........................................................................................................ 67
7.1. KULTIVIERUNG DER WEIßFÄULEPILZE ................................................................................................. 67
7.1.1. Waldpilz ..................................................................................................................................... 67
7.1.2. Pleurotus ostreatus .................................................................................................................. 68
7.1.3. Donkioporia expansa ............................................................................................................... 70
7.2. LIGNINBESTIMMUNG ............................................................................................................................ 70
7.2.1. Ligninbestimmung nach (J. H. Ross, 1933 Volume 92, Numbers 3-4) ............................ 71
7.2.2. Bestimmung des Ligninanteils in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (65..120, 2008) ... 71
7.2.3. Ligninabbau durch Weißfäulepilze ........................................................................................ 72
7.3. ENZYMATISCHE AKTIVITÄT .................................................................................................................. 73
7.3.1. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14).......................................................................................... 74
7.3.2. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13) ...................................................................................... 75
7.3.3. Laccase (EC 1.10.3.2) ............................................................................................................. 76
7.4. BIOGASPRODUKTION ........................................................................................................................... 76
8. FAZIT/AUSBLICK ..................................................................................................................................... 77
9. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................................... 78
10. ANHÄNGE ............................................................................................................................................. 82
10.1. TABELLEN ........................................................................................................................................ 82
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Heizöläquivalent Energiepflanzen (Quelle: www.bio-power.com) ....................... 10
Abbildung 2: Möglich Produkte der Lignocellulose (Quelle: Kamm B., Umsicht Tage, 2003) 10
Abbildung 3: Strukturformeln der Grundbausteine des Lignins Quelle: (Falk Saupe, 2003) .. 12
Abbildung 4: Strukturformel eines Ausschnittes aus einem Ligninmolekül Quelle: (Falk
Saupe, 2003) ....................................................................................................................................... 13
Abbildung 5: β-1,4- Glucankette eines Cellulose-Moleküls Quelle: (Gerard Tchetseubu Saha,
2010) ..................................................................................................................................................... 14
Abbildung 6: Die Ultrastruktur der unlignifizierten Zellwand ........................................................ 14
Abbildung 7: Reaktion Lignin-Peroxidase Quelle: (IUBMB, 2006) .............................................. 19
Abbildung 8: Oxidation von ABTS (A) zum Kationenradikal (B) und zum Dikation (C) Quelle:
(Falk Saupe, 2003) ............................................................................................................................. 21
Abbildung 9: Lambert-Beer'sche Gesetz Quelle: (Ott, 2004) ...................................................... 22
Abbildung 10: Schema des anaeroben Abbaus organischer Substanz Quelle: (Andreas
Lemmer, 2010) .................................................................................................................................... 24
Abbildung 11: Schottflasche mit Pleurotus ostreatus auf Holzspäne ......................................... 25
Abbildung 12: Fritsch Schneidemühle (Keller im Geb. 4 am Exer) ............................................ 28
Abbildung 13: Zellkulturflasche mit Pleurotus ostreatus 8 d alt in Minimalmedium ................. 31
Abbildung 14: Versuchsaufbau Gewinnung Säure-Detergens-Lignin durch Kochen mit einer
starken Säure ...................................................................................................................................... 34
Abbildung 16: Waldpilz und Bakterien nach 3 d in 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme mit
Digitalkamera) ..................................................................................................................................... 46
4
Abbildung 17: Waldpilz nach 21 d bei 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme über die PC-
Anwendung NIS-Elements) ............................................................................................................... 46
Abbildung 18: Grünschimmelbefall (7 d alte Kultur) ...................................................................... 47
Abbildung 19: Mikroskopische Aufnahme von Konidiophoren und Phialiden bei 1000-facher
Vergrößerung (Aufnahme über die PC-Anwendung NIS-Elements) .......................................... 47
Abbildung 20: Pilzmycel nach 7 d Wachstum in Flüssigmedium ................................................ 48
Abbildung 21: Pilzmycel in Malzextrakt-Bouillon; links eine 6 d alte Kultur mit weißen Mycel
und rechts eine 8 d alte Kultur mit schwarzen Konidien ............................................................... 48
Abbildung 22: Auf der linken Seite ist eine Sporangie bei 1000-facher Vergrößerung zu
sehen (Aufnahme mit Digitalkamera), ............................................................................................. 49
Abbildung 23: geschlossene Sporangie bei 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme mit PC-
Anwendung NIS-Elements) ............................................................................................................... 49
Abbildung 24: Pleurotus ostreatus auf Malzextrakt-Agar; Links eine 15 d alte und Rechts eine
9 d alte Pilzkultur ................................................................................................................................ 50
Abbildung 25: Mycel des Pleurotus ostreatus bei 1000-facher Vergrößerung (aufgenommen
mit PC-Anwendung NIS-Elements); ................................................................................................ 50
Abbildung 26: Pilzmycel des Donkioporia expansa nach 6 d Wachstum auf Malextrakt-Agar
............................................................................................................................................................... 51
Abbildung 27: Mycel des Donkioporia expansa bei 1000-facher Vergrößerung
(aufgenommen mit der PC-Anwendung NIS-Elements); .............................................................. 51
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: internationale Klassifizierung von Enzymen Quelle: (Nelson & Cox, 2001) ........... 18
Tabelle 2: Kultivierung von Pleurotus ostreatus und Waldpilz auf ligninhaltigen Substraten mit
PBS-Puffer pH 5,5 .............................................................................................................................. 52
Tabelle 3: Kultivierung von Pleurotus ostreatus auf ligninhaltigen Substraten mit
Leitungswasser am 06.07. und 20.07.2011 ................................................................................... 53
Tabelle 4: Kultivierung von Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa auf ligninhaltigen
Substraten mit Leitungswasser am 26.07., 05.08. und 09.08.2011 ........................................... 54
Tabelle 5: Soll/Ist-Vergleich der Ligningehalte nach (J. H. Ross, 1933 Volume 92, Numbers
3-4) ........................................................................................................................................................ 55
Tabelle 6: Soll/Ist-Vergleich der in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN EN ISO 13906,
2008) ermittelten Ligningehalte ........................................................................................................ 56
Tabelle 7: Ligninabbau von Pappelholzsubstraten mit und ohne Pilzbewuchs (Schimmelpilz),
bestimmt in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 .............................................................................. 57
Tabelle 8: Ligninbestimmung nach (Ross, 1933) .......................................................................... 82
Tabelle 9: Ligninbestimmung in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (65..120, 2008) ............... 83
Tabelle 10: Ligninabbau durch Weißfäulepilze .............................................................................. 84
Tabelle 11: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,0025 mM und 0,000625 mM ......................... 85
Tabelle 12: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,00025 mM bei 20 und 35 °C .......................... 86
Tabelle 13: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,00025 mM bei 55 und 75 °C .......................... 87
Tabelle 14: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 und 0,000625 mM ........................................... 88
Tabelle 15: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 mM (7d gelöst gelagert) und 0,001 mM ...... 89
Tabelle 16: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 mM (doppelte Substratmenge) und 0,005 mM
............................................................................................................................................................... 90
Tabelle 17: LiP-Substratumsatz mit OPD durch Pleurotus ostreatus von den alten
Stammkulturen .................................................................................................................................... 91
5
Grafikverzeichnis
Figure 1: Soll/Ist-Vergleich der nach nach (J. H. Ross, 1933 ) ermittelten Ligningehalte ....... 55
Figure 2: Soll/Ist-Vergleich der in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN EN ISO 13906,
2008) ermittelten Ligningehalte ........................................................................................................ 56
Figure 3: Ligninabbau von Pappelholzsubstraten mit und ohne Pilzbewuchs (Schimmelpilz),
bestimmt in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 .............................................................................. 57
Figure 4: ABTS-Oxidation mit gekaufter LiP bei verschiedenen Temperaturen ....................... 58
Figure 5: OPD-Oxidation mit verschiedenen Konzentrationen der gekauften LiP ................... 59
Figure 6: Test der LiP-Aktivität mit OPD ......................................................................................... 60
Figure 7: Nachweis der Lignin-Peroxidase in Flüssigkulturen des Donkioporia expansa und
Pleurotus ostreatus ............................................................................................................................ 62
Figure 8 : Nachweis Mangan-Peroxidase in Flüssigkulturen Donkioporia expansa und
Pleurotus ostreatus ............................................................................................................................ 63
Figure 9: Nachweis Laccase in Flüssigkulturen des Pleurotus ostreatus und Donkioporia
expansa ................................................................................................................................................ 64
Figure 10: Methanerträge aus ligninhaltigen Substraten mit und ohne Pilz .............................. 66
Abkürzungs- und Symbolverzeichnis
∑VN Netto-Gasvolumen des Substrats für die betrachtete Versuchsdauer ∑VIS Summe der Gasvolumina des Versuchs mit Impfschlamm für die
betrachtete Versuchsdauer ε molarer Extinktionskoeffizient A Absorption ABTS 2,2´- Azino- bis(3- ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure) ADL Säure-Detergens-Lignin (acid detergent lignin) ADF Säure-Detergens-Faserrückstände (acid detergent fiber) Akt. Aktivität BHKW Blockheizkraftwerk CCH4f Methankonzentration im feuchtem Gas in Vol.-% CCH4tr Methankonzentration im trockenem Gas in Vol.-% CH4 Methan Ckorrtr korrigierte Konzentration der Biogaskomponente im trockenen Gas in
Vol.-%. C:N Kohlenstoff:Stickstoff-Verhältnis CO2 Kohlenstoffdioxid Ctr gemessene Konzentration der Biogaskomponente im trockenen Gas in D.E. Weißfäulepilz Donkioporia expansa deion. deionisiert EC Effektkonzentration EK Endkonzentration Fa. Firma gem. gemäß GPS Getreide-Ganzpflanzsilage GV Glühverlust H2 Wasserstoff H2O Wasser H2S Schwefelwasserstoff
6
Lacc Laccase LiP Lignin-Peroxidase lN Liter Volumen unter Normbedingungen Lsg. Lösung mf die Masse des Tiegels mit der Frischmasse mg Milligramm mg/l Milligramm pro Liter mIS Masse des für die Mischung benutzten Impfschlammes mM Millimolar mM Masse des im Kontrollversuch benutzten Impfschlammes MM Malzmedium MnP Mangan-Peroxidase MR Maissilage/Roggensilage (GPS) MS Massenspektrometrie mT die Masse des leeren Tiegels mtr die Masse des Tiegels mit der getrockneten Frischmasse mU Milliunits N Normal NH3 Ammoniak OPD ο- Phenylendiamin oTM organische Trockenmasse oTR organische Trockenrückstand oTS organische Trockensubstanz p0 Normdruck = 1013 hPa p Druck der Gasphase pH dekadische Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität POD Peroxidase P.O. Pleurotus ostreatus pw Dampfdruck des Wassers RT Raumtemperatur spez. spezifische T0 Normtemperatur = 273 K TM Trockenmasse TR Trockenrückstand UV Ultraviolett va Veratrylalkohol VB Volumen des produzierten Biogases VIS(korr.) Gasvolumen, das aus dem Impfschlamm entwickelt wurde VK Kopfraumvolumen in ml Vol.-% prozentualer Anteil am Volumen VS spezifische auf die Glühverlustmasse bezogene Faulgasproduktion
während der Versuchszeit Vtr
0 Volumen des trockenen Gases im Normzustand wT Gewichtsprozent Trockenrückstand der Probe wV Gewichtsprozent Glühverlust der Trockenmasse
7
1. Zusammenfassung
Das primäre Ziel war es, analytische Verfahren für die Ligninbestimmung bzw. für
den Ligninabbau und für die enzymatische Aktivität der Weißfäulepilze zu etablieren.
Zur Bestimmung des Ligningehalts bezogen auf die Trockenmasse wurden
gravimetrische Verfahren getestet. Bei diesen Verfahren werden, bis auf das Lignin
und die Mineralstoffe, alle Bestandteile mit einer starken Säure hydrolysiert. Nach
Filtern des Säure-Lignin-Detergens und anschließendem Trocknen des Filtrats kann
das Lignin ausgewogen werden. Nach der selbst abgeänderten Methode, die sich in
den Grundzügen an die (DIN EN ISO 13906, 2008) anlehnt, konnten gute
Ergebnisse erzielt werden. Jedoch kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob
dieses Verfahren auch auf Futtermittel und Gärreste übertragbar ist.
Weiterhin wurde die Enzymaktivität mit verschiedenen Substraten photometrisch
bestimmt. Hier eignet sich ABTS aufgrund seiner Nachweisempfindlichkeit und
seiner Einsatzmöglichkeit für zwei Enzyme (Laccase und Lignin-Peroxidase)
insbesondere als Substrat.
Das Verfahren zur Bestimmung der Mangan-Peroxidase-Aktivität ist noch nicht
optimal, da die spektrale Grundabsorption zu hoch lag und die spektrale Absorption
auf über 1 anstieg. Eine Verdünnung kommt nicht infrage, weil dies die Konzentration
der Enzyme senkt. Hier ist die Enzymgewinnung zu optimieren.
Laccase konnte bei Pleurotus ostreatus nachgewiesen werden. Diese produzierte er
jedoch nur im Minimalmedium. Lignin-Peroxidase und Mangan-Peroxidase konnten
sowohl Pleurotus ostreatus als auch Donkioporia expansa nachgewiesen werden.
Auch hierfür eignete sich das Minimalmedium am besten.
Auf Standardnährmedien wie z. B. Malzextrakt-Agar oder in Flüssigmedien war die
Anzucht von Pilzen problemlos möglich. Voraussetzung hierfür ist, dass frische und
lebensfähige Pilzkulturen zur Verfügung stehen und steril gearbeitet wird.
Die Kultivierung auf ligninhaltigen Substraten gestaltete sich schwieriger, da hier trotz
der Verwendung frischer und lebensfähiger Kulturen ein Schimmelbefall stattfand.
Was evtl. an einer ungenügenden Sterilisation der Substrate gelegen haben könnte.
Jedoch bildeten sich auch Pilzkulturen ohne Schimmelbefall aus.
8
2. Einleitung
Ein zentrales Thema unserer Zeit ist die Erschließung oder effektivere Nutzung von
Rohstoff- und Energiequellen. Diese Quellen sollten erneuerbar, umweltverträglich,
sicher und möglichst kostengünstig sein. Um diesen Anforderungen gerecht zu
werden, bedarf es einer sorgfältigen Prüfung hinsichtlich der Umsetzbarkeit und
Umweltverträglichkeit.
Dabei spielen Pflanzen als Energiequelle und nachwachsender Rohstoff eine
besondere Rolle. Denn sie sind mit einem relativ geringen Energieeintrag schnell in
großen Mengen verfügbar. Pflanzen und Algen - auch einige Bakteriengruppen -
betreiben Fotosynthese, um ihren Energiebedarf zu decken. Bei diesem
biochemischen Prozess wandeln diese Organismen die Strahlungsenergie der
Sonne in chemische Energie um. Diese wird unter anderem dazu verwendet, um aus
Kohlenstoffdioxid (CO2) und Wasser (H2O) energiereiche organische Verbindungen -
Biomasse - zu synthetisieren. Diese Biomasse ist ein wertvoller Energiespeicher, der
durch den Menschen als Nahrungsmittel, Futtermittel oder zur Energiegewinnung
genutzt wird. Auch die heutzutage von uns genutzten fossilen Energieträger
entstanden vor mehreren Hunderttausend bis mehreren Millionen Jahren aus
Mikroorganismen wie Algen. Die Algen bildeten die Grundlage für Erdöl sowie
Erdgas und Pflanzen wie z. B. Farne die Grundlage für Stein- sowie Braunkohle
(http://de.wikipedia.org/ vom 12.07.2011 um 18:30 Uhr). Die fossilen Energieträger
bildeten sich im Laufe der Jahrmillionen aus diesen abgestorbenen Organismen
durch hohen Druck und hohe Temperaturen in sauerstofffreien
Sedimenteinschlüssen.
Da diese Energieträger nur begrenzt zur Verfügung stehen und der in Ihnen über
Jahrtausende gespeicherte Kohlenstoff durch Verbrennung innerhalb kürzester Zeit
als CO2 in die Atmosphäre abgeben wird, müssen diese fossilen Energieträger durch
erneuerbare umweltverträgliche Energien ersetzt werden. Deshalb werden vermehrt
Energiepflanzen wie zum Beispiel Mais angebaut, deren Körnermaissilage 42,4 %
Stärke, 5,8 % Rohprotein und 2,5 % Fett enthält (Hermann Englert, 2009). Diese
energiehaltigen Bestandteile können durch Mikroorganismen leicht abgebaut
werden. Bei einem Abbau unter Ausschluss von Sauerstoff (anaerobe Verhältnisse)
entsteht Biogas. Das Biogas besteht zu 50 bis 75 % aus Methan. Methan enthält viel
Energie, die bei Verbrennung freigesetzt wird. Diese Energie wird zur Strom- und
Wärmeerzeugung genutzt. Aber auch die weiteren Bestandteile der Pflanze wie
9
Lignin, Cellulose und Hemicellulose sind mit einen Anteil von 17 bis 20 % auf die
Trockensubstanz der Maissilage bezogen (http://de.wikipedia.org/wiki/Silage vom
01.08.2011 um 16:30 Uhr) ein wichtiger Energiespeicher. Diese Bestandteile werden
bei Futterpflanzen Rohfaser genannt werden. Die Cellulose kann auch durch die am
Gärprozess beteiligten Mikroorganismen abgebaut und zu Biogas umgewandelt
werden. Jedoch gestaltet sich der Abbau der Cellulose und Hemicellulose für die
Mikroorganismen schwieriger als der von der Stärke. Der Abbau ist teilweise gar
nicht möglich, da die Cellulose/Hemicellulose mit Lignin, das nur durch wenige
Organismen abgebaut werden kann, umschlossen/durchwachsen ist. Mit Maissilage
kann ein Methanertrag zwischen 295 und 380 l Methan/kg organische Trockenmasse
erzielt werden (Hermann Englert, 2009). Dadurch, dass hauptsächlich Mais als
Energiepflanze dient und wir in Deutschland laut des Fachverband Biogas e. V.
(http://www.biogas.org, vom 26.07.2011 um 19:45 Uhr) bis Ende 2011
siebentausend Biogasanlagen haben werden, findet auf den landwirtschaftlichen
Anbauflächen eine Monokultivierung statt. Ansonsten kann der Bedarf an
Energiepflanzen nicht abgedeckt werden. Dies hat einen Humusabbau, eine
Bodenverdichtung und Bodenerosion zur Folge. Weiterhin muss intensiv mit
Stickstoff gedüngt werden, was zu klimaschädlichen Lachgasemissionen führt
(http://www.greenpeace.de/fileadmin/gpd/user_upload/themen/landwirtschaft/FS_Bio
gas_03_2011.pdf vom 26.07.2011 um 19:50 Uhr). Nachteilig ist auch, dass für die
Erzeugung des Biogases Nahrungsmittel wie Mais, Roggen und Weizen eingesetzt
werden. Deshalb muss an der Verwertung der organischen Reststoffe geforscht
werden, um das Potenzial der Energiepflanzen besser auszuschöpfen. Denkbar
wäre den Gärrest der Biogasanlagen so aufzubereiten, dass die nicht verwertbare
Rohfaser den am Biogasprozess beteiligten Mikroorganismen zugänglich wird.
Weiterhin könnten dann Grünschnitt, Stroh und andere Pflanzenreste bei
entsprechender Aufbereitung mit in den Biogasprozess einfließen. Ein anderer
Ansatzpunkt ist schnell wachsende Hölzer einzusetzen, denn diese habe bezogen
auf die Anbaufläche einen höheren Energieertrag (siehe Abb. 1).
10
Abbildung 1: Heizöläquivalent Energiepflanzen (Quelle: www.bio-power.com)
Die in der Abb. 1 genannten Triticale sind laut (http://de.wikipedia.org/wiki/Triticale,
vom 12.07.2011 19:00 Uhr) eine Kreuzung aus weiblichem Weizen (Triticum
aestivum L.) und männlichem Roggen (Secale cereale L.).
Schnell wachsende Baumarten wie Pappel können 20 bis 30 Jahre als Dauerkultur
genutzt werden (Boelcke, 2006). Die Ernte der Sprossmasse kann laut (Boelcke,
2006) alle 3 bis 10 Jahre erfolgen. Der Vorteil liegt in einer geringeren
Bodenbelastung und einer geringeren Düngung als beim Mais. Hölzer werden bisher
vielseitig eingesetzt z. B. als Baumaterial, für die Zellstoffherstellung, in Bioraffinerien
oder zur Holzgasherstellung. Dabei ist ihr Potenzial als Lieferant von Lignocellulose-
Produkten sehr viel größer (Abb. 2).
Abbildung 2: Möglich Produkte der Lignocellulose (Quelle: Kamm B., Umsicht Tage, 2003)
11
Um an die einzelnen Bestandteile der Lignozellulose, die auch aus Stroh und
anderen ligninhaltigen Pflanzen gewonnen werden kann, zu gelangen, würde sich
eine biochemische Vorbehandlung durch Pilze anbieten. Denn besonders
Weißfäulepilze sind in der Lage Lignin zu lösen und die Cellulose freizulegen. Die
Gruppe der Rotfäulepilze kann die Cellulose vollständig abbauen und lässt das
Lignin übrig. Im Bereich der Lignocelluloseprodukte wird an vielen Stellen z. B. an
der Technischen Universität Wien am Institut für Verfahrenstechnik, Umwelttechnik
und Technische Biowissenschaften oder dem Institut für Lebensmittelchemie und
Lebensmittelbiotechnologie (LCB) der Justus-Liebig-Universität Gießen (JLU)
geforscht, um diese bisher wenig genutzte Rohstoffquelle zugänglich zu machen. Die
Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Braunschweig hat verschiedene
Weißfäulepilze zur Erhöhung des Futterwerts von Getreidestroh getestet. Dabei
sollte durch den Ligninabbau der Weißfäulepilze die Verdaulichkeit des Strohs
verbessert werden. Die in-vitro getestete Verdaulichkeit konnte durch die
Vorbehandlung mit Pilzen je nach verwendetem Pilz laut (Peter Lebzien & Institut für
Tierernährung, 2003) um 9,5 bis 16,9 % verbessert werden. Diese Beobachtungen
könnten sich evtl. auf eine Vorbehandlung ligninhaltiger Substrate durch Pilze für
eine anschließende anaerobe Fermentation übertragen lassen. Dann könnten nach
dem Ligninabbau die Zellwandkohlenhydrate z. B. der schnell wachsenden Hölzer,
des Gärrests oder des Strohs zu Biogas umgesetzt werden. Entweder setzt man den
ligninhaltigen Substraten Lignin abbauende Enzyme, die aus Pilzen gewonnen
wurden, vor bzw. während des Biogasprozesses zu oder man lässt den Pilz die
Substrate vor der Fermentation zersetzen. Wenn man für die Pilz-Variante einen
Speisepilz einsetzt, dann würde sich durch den Verkauf der Speisepilze eine
zusätzliche Einnahmequelle erschließen.
3. Zielstellung
In dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf der Analytik der enzymatischen Aktivität
der Weißfäulepilze und dem Ligninabbau der Substrate. Für eine Vergleichbarkeit
sollen verschiedene Weißfäulepilzarten zum Ligninabbau eingesetzt werden. Durch
diese Arbeit sollen analytische Verfahren etabliert werden, die eine Aussage über die
Quantität des Ligninabbaus und das Potenzial des zum Ligninabbau eingesetzten
Pilzes ermöglichen. Dabei kommen analytische Standardverfahren zum Einsatz, bei
12
denen geprüft werden soll, ob sie für die örtlichen Gegebenheiten infrage kommen
und inwieweit eine Abänderung zur Reduzierung des Arbeitsaufwands möglich ist.
Einhergehend mit den primären Zielen fallen weitere Fragestellung an. Zum einen
müssen die Pilze angezüchtet werden und zum anderen sind geeignete Substrate zu
beschaffen, die für die Pilzzucht vorzubereiten sind. Weiterhin soll zusätzlich die
Auswirkung des Ligninabbaus auf den Biogasprozess untersucht werden. Hierzu
sind Gärversuche im Batch-Verfahren gemäß (VDI-Richtlinie, 2004) durchzuführen
und auszuwerten.
4. Grundlagen
4.1. Lignin
Der Aufbau des Lignins erfolgt aus definierten Untereinheiten. Diese Untereinheiten
werden offensichtlich nach dem Zufallsprinzip zusammengesetzt, wobei ein
Riesenpolymer entsteht, das sich durch die ganze Pflanze zieht. Die
Grundbausteine/Untereinheiten sind p- Cumarylalkohol, Coniferylalkohol und
Sinapylalkohol (Abb. 3).
Abbildung 3: Strukturformeln der Grundbausteine des Lignins Quelle: (Falk Saupe, 2003)
A: p- Cumarylalkohol; B: Coniferylalkohol; C: Sinapylalkohol
Diese methoxylierten Phenylpropaneinheiten werden dreidimensional zu einem
Polymer verknüpft (Abb. 4). Die Zusammensetzung des Lignins variiert je nach
Pflanzengruppe. Bei Nadelbäumen z. B. macht Coniferylalkohol den
Hauptbestandteil aus.
13
Abbildung 4: Strukturformel eines Ausschnittes aus einem Ligninmolekül Quelle: (Falk Saupe, 2003)
Lignin wird nachträglich in die sekundäre Zellwand, die hauptsächlich aus Cellulose
besteht, eingelagert und schützt so die Cellulose und die darunter liegende primäre
Zellwand, die größtenteils aus Hemicellulose besteht. Dieser Verholzungsprozess -
Lignifizierung - verhindert einen enzymatischen Verdau durch andere Organismen,
da es nur von einigen Pilzen abgebaut werden kann. Weiterhin verleiht Lignin der
Pflanze mechanische Stabilität. Dadurch, dass Lignin aufgrund seiner phenolischen
Gruppen hydrophob ist, werden die Seitenwände vom wasserleitenden Gewebe
versiegelt und eine Verdunstung des Wassers verhindert. Zwischen den beiden
Zellwandschichten befindet sich eine dünne Schicht Pektin, die die Zellwand
zusammenhält.
4.2. Cellulose
Cellulose ist der Hauptbestandteil der Pflanzen-Zellwand und die häufigste
organische Verbindung auf der Erde. Die Cellulose ist ein Polysaccharid, das aus
Monosacchariden (β-D-Glucose-Molekülen) aufgebaut ist. Die Glukosebausteine
14
werden dabei ß-1,4-glycosidisch über das C-Atom 1 des einen Monosaccharids mit
dem C-Atom 4 des darauffolgenden Monosaccharids verbunden (Abb. 5).
Abbildung 5: β-1,4- Glucankette eines Cellulose-Moleküls Quelle: (Gerard Tchetseubu Saha, 2010)
Ein Cellulosemolekül kann aus mehreren tausend Monosacchariden aufgebaut sein.
Cellulose kann durch Wasser und die meisten organischen Lösungsmittel nicht
aufgelöst werden. Hierzu bedarf es einer starken Säure oder bestimmter Reagenzien
wie z. B. Dimethylsulfoxid/Lithiumchlorid laut (http://de.wikipedia.org/wiki/Cellulose
vom 04.0.2011 um 20:15 Uhr). Bei der Lösung in starken Säuren in Verbindung mit
erhöhten Temperaturen wird die Cellulose zu Glucose gespalten.
Die Cellulose ist eine Struktursubstanz indem sie Fibrillen bildet. Die fibrillären
Strukturen entstehen durch die parallele Anordnung von Cellulosemolekülen. Eine
Vielzahl von Fibrillen bilden dann Pflanzenfasern, die verholzt sein können (Abb. 6).
Abbildung 6: Die Ultrastruktur der unlignifizierten Zellwand
(a) Teil der Zellwand mit Mittellamelle, Primärwand und dreischichtiger Sekundärwand;
(b) Makrofibrillen; (c) Makrofibrillen bestehen aus Mikrofibrillen von ungefähr 10 nm Durchmesser;
(d) Micellen sind Teile der Mikrofibrillen in denen die Cellulosemoleküle parallel liegen;
(e) Teile einer Micelle mit parallel verlaufenden, gitterförmig angeordneten Cellulosemolekülen
Quelle: (w3.forst.tu-muenchen.de/~scriptmaster/skripte/holzaufbau/Holzchemie.pdf vom 29.07.2011
um 22:10 Uhr)
Die in der Abb. 6 gekennzeichneten Tüpfel sind dünne Stellen oder Aussparungen in der
Sekundärwand von Pflanzen. Sie dienen dem Stoffaustausch zwischen benachbarten Zellen.
15
4.3. Hemicellulose
Die Hemicellulosen sind neben Cellulose und Lignin eine Hauptkomponente der
Zellwand. Sie bilden mit Pektin eine Matrix, in die Cellulosefibrillen eingebettet sind
(PEÑA et al., 2001; CARPITA und MCCANN, 2002; BUNZEL und STEINHART,
2003). Hemicellulosen lassen sich nicht klar definieren. So bilden die Hauptketten
heterogene oder monomere Polysaccharide, die aus verschiedenen
Grundbausteinen aufgebaut sein können. Die häufigsten Monosaccharid
Grundbausteine sind zum einen Pentosen mit D-Xylose und L-Arabinose sowie zum
anderen Hexosen wie D-Glucose, D-Mannose und D-Galactose. Der Name des
Polymers leitet sich vom am häufigsten verbauten Monosaccharid ab und wird mit
der Endung ane versehen. Hauptvertreter des Heteropolymers sind z. B.
Arabinoxylane und Xyloglucane (CARPITA und MCCANN, 2002; BUNZEL und
STEINHART, 2003) und die der Homopolymere Xylan, Mannan und Galactan. An
den Hauptketten verzweigen sich weitere Monosaccharide, sodass ein
unregelmäßiges Makromolekül entsteht.
Hemicellulose lässt sich durch Alkalibehandlung oder kurzzeitige Extraktion mit
verdünnter, heißer Säure lösen. Dabei gehen Lignin und Cellulose nicht in Lösung
(http://de.wikipedia.org/wiki/Hemicellulose vom 04.08.2011 um 18:10 Uhr).
4.4. Weißfäulepilze (Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa)
Die für diese Arbeit verwendeten Pilze Pleurotus ostreatus (Trivialname:
Austernseitling) und Donkioporia expansa (Trivialname: ausgebreiteter Hausporling
oder auch „Eichenporling“) zählen zu den Weißfäulepilzen, die vornehmlich Lignin
umsetzen. Die Bezeichnung Weißfäulepilze bezieht sich auf die Weißfärbung des
vom Pilz befallenen Holzes. Denn nach dem Ligninabbau bleibt die weißliche
Cellulose zurück. Hierdurch wird das Holz aufgehellt. Die Weißfäulepilze zeichnen
sich dadurch aus, dass sie komplexe Stoffe wie Lignin abbauen können. Die Pilze
sekretieren dazu über ihr Mycel Enzyme nach außen. Diese Enzyme spalten dann
Polymere wie z. B. Lignin. Im Anschluss werden die Abbauprodukte zur weiteren
Verwertung durch den Pilz aufgenommen. Während Pleurotus ostreatus in der Natur
16
vorwiegend auf Laubholz zu finden ist, kann Donkioporia expansa auch Nadelholz
zersetzen.
Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa gehören laut (http://de.wikipedia.org;
Suche der Pilzgattung vom 11.08.2011 um 17:45 Uhr) zu den höheren Pilzen
(Eumycota) und hier zur Abteilung der Basidiomyceten (Ständerpilze). Sie leben als
Saprophyten vom toten oder geschwächten organischen Material. Pilze gehören zu
den Eukaryoten,aber bilden neben Tieren und Pflanzen eine eigene Klassifikation.
Sie besitzen eine feste Zellwand, die als Strukturkomponente Chitin besitzt. Beide
Pilze leben in Zellverbänden, die durch Hyphen gebildet werden. Das
Hyphenwachstum ist eine asexuelle Vermehrung durch Querteilung. Bei dieser
Wachstumsform verlängern sich die gestreckten Einzelzellen, die sich durch eine
Querwand in mehre Zellen teilen können. Die Hyphen verzweigen sich und bilden ein
Pilzgeflecht, das Mycel. Diese Wachstumsform kommt bei den meisten Pilzen vor,
zum Beispiel bei Schimmelpilzen oder höheren Pilzen. Pilzarten, die als runde bzw.
ovale Einzelzellen vorkommen und sich durch Sprossung vermehren bezeichnet man
als Hefen. Eine besondere Form der Sprossung ist die Bildung von Konidien, die der
asexuellen Verbreitung der Pilze durch die Luft dienen. Konidien werden von
Schimmel- und Fadenpilzen gebildet. Die Konidien sind resistent gegenüber
Trockenheit und UV-Licht. Die Basidiomyceten bilden vorwiegend ein Mycel. Zur
Bildung eines Fruchtkörpers (Basidie) kommt es nur zu bestimmten Jahreszeiten
oder erst nach einigen Jahren. An der Basidie bilden sich Konidien mit einem
haploiden Chromosomensatz. (Pilze, 2011)
Pleurotus ostreatus ist vorwiegend als Speisepilz bekannt. Er wird aber auch mit
großem Erfolg in der Umweltsanierung zum Abbau von polycyclischen aromatischen
Kohlenwasserstoffen (PAKs) und polychlorierten Biphenylen (PCBs) eingesetzt
(Ulbricht, 2001). Laut (Thorn, 1984) ist Pleurotus ostreatus nematophag. Dies
bedeutet, dass er in der Lage ist, Nematoden mit Toxocysten zu vergiften, um ihn im
Anschluss durch in den Nematoden eindringende Pilzhyphen zu verdauen.
Donkioporia expansa ist ein bekannter Holzschädling, der durchfeuchtete Hölzer in
Gebäuden befällt und zerstört.
Pilze werden seit Langem vom Menschen genutzt. So setzten Hefen wie
Saccharomyces cerevisiae durch Gärung Glucose zu Ethanol um. Schimmelpilze wie
Aspergillus niger werden für die Herstellung von Citronensäure eingesetzt. Andere
Pilze veredeln wiederum Käse oder produzieren Antibiotika für medizinische Zwecke.
Die Stoffwechselprodukte oder Enzyme finden in vielen Bereichen wie z. B. in der
17
Lebensmittel- und Pharmaindustrie, Medizin und im Haushalt als Backmittel
Anwendung (Antranikian, 2006). Das Pilzmycel wird sogar als Verpackungsmaterial
verwendet und ersetzt so Styropor. Diese Idee wurden von Eben Bayer und Gavin
McIntyre durch die Gründung ihres Unternehmens Ecovative design
(http://www.innovationstuntmen.com/?p=2405, vom 12.08.2011 um 14:55 Uhr)
erfolgreich umgesetzt.
4.5. Enzyme
Enzyme sind Proteine, die biochemische Reaktionen katalysieren können. Sie
übernehmen in Organismen wichtige Funktionen z. B. im Stoffwechsel, beim
Kopieren der Desoxyribonukleinsäure (DNA) und beim Transkribieren der
Ribonukleinsäure (RNA). Enzyme setzten die Aktivierungsenergie einer
biochemischen Reaktion herab und beschleunigen oder ermöglichen diese so. Das
passende Substrat wird dabei spezifisch im aktiven Zentrum des Enzyms gebunden.
Nachdem das Substrat in das Reaktionsprodukt umgewandelt wurde, wird es
freigesetzt. Das Enzym verbraucht sich dabei nicht und nimmt seine Funktion so
lange war, wie passendes Substrat vorhanden ist oder ein Inhibitor die
Substrataufnahme verhindert. Inhibitoren sind Proteine, die z. B. das aktive Zentrum
entweder dauerhaft oder kurzzeitig blockieren. Sie werden vom Organismus
produziert, um die Enzymaktivität entsprechend ihren Bedürfnissen zu regeln. Die
Enzyme haben je nach Organismus und Funktion verschiedene pH- und
Temperaturoptima.
18
Weiter werden sie gemäß unten aufgeführter Tabelle 1 in verschiedene Klassen
eingeteilt.
Tabelle 1: internationale Klassifizierung von Enzymen Quelle: (Nelson & Cox, 2001)
In dieser Arbeit liegt das Hauptaugenmerk auf den Oxidoreduktasen. Da den
dazugehörigen Enzymen Mangan-Peroxidase, Lignin-Peroxidase und Laccase eine
Beteiligung am Ligninabbau nachgewiesen wurde. Diese Enzyme werden durch
Weißfäulepilze produziert und liegen extrazellulär vor.
4.5.1. Enzymkinetik
Die Reaktionsgeschwindigkeit gibt an, welche Stoffmenge an Substrat pro Zeiteinheit
in einem bestimmten Volumen umgesetzt wurde. Sie ist abhängig von der
Temperatur, dem pH-Wert, der Salzkonzentration sowie der Konzentration der
Substrate und Produkte. Das Steigern der Temperatur führt zu einer erhöhten
Reaktionsgeschwindigkeit, bis das Enzym denaturiert.
Im Zusammenhang mit der Reaktionsgeschwindigkeit steht die Enzymaktivität, die
die Menge des aktiven Enzyms in der Probe angibt. Sie ist proportional zur
Reaktionsgeschwindigkeit. Die Enzymaktivität wird in Units (U) angegeben. Ein U ist
diejenige Menge Enzym, welche unter angegebenen Bedingungen ein Mikromol
Substrat pro Minute umsetzt (1 U = 1 µmol/min).
Die spezifische Aktivität gibt an, wie viel des gesuchten Enzyms in der Probe ist
(U/mg). Hierzu muss die Proteinmenge bekannt sein oder durch Bestimmung der
Trockensubstanz in der Probe ermittelt werden (Ulbricht, 2001).
19
4.5.2. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14)
Die Lignin-Peroxidase wird z. B. aus Kulturen des Weißfäulepilzes Phanerochaete
chrysosporium gewonnen. Es ist ein Hämprotein, das Wasserstoffperoxid als
Elektronenakzeptor benötigt. Lignin-Peroxidasen oxidieren phenolische und
aromatische Substrate. Sie oxidieren aber auch nicht-phenolische aromatische
Verbindungen, wie Veratrylalkohol (3,4-Dimethoxybenzylalkohol) (HEINFLING,
1998). Durch eine Elektronenübertragung wird ein Kation gebildet, das Spaltungen
an aromatischen Ringstrukturen bewirkt. Dadurch bilden sich instabile, radikalische
Strukturen.
Abbildung 7: Reaktion Lignin-Peroxidase Quelle: (IUBMB, 2006)
Die nachfolgende Angaben beziehen sich auf die vom Phanerochaete chrysosporium
gewonnene Ligin Peroxidase. Diese Daten stammen aus der biologischen
Datenbank (BRENDA, 2011).
Molekulargewicht: 40 kDa
pH-Optimum: 2,6; 3; 3,5; 3,6; 4,5; 4,8; 5 (Mehrfachnennungen in der Literatur)
Temperaturbereich: 25 bis 75°C
(bei pH 5 werden 100 % Peroxidaseaktivität bei 55 °C erreicht
und bei 35°C mehr als 75 %; steigen die Temperaturen über
75°C verliert die Peroxidase 66% ihrer Aktivität)
20
4.5.3. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13)
Die Mangan-Peroxidase, welche ebenfalls von Phanerochaete chrysosporium
produziert wird und extrazellulär vorliegt, ist auch ein Hämprotein. Das Enzym
benötigt Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor und oxidiert zweiwertige
Manganionen, die im Holz enthalten sind, zu dreiwertigen Ionen. Dreiwertige
Manganionen sind Oxidationsmittel, die als Chelatkomplexe durch organische
Säuren, welche der Pilz bildet, stabilisiert werden. Dieser Redox-Mediator greift unter
Radikalbildung aromatische Strukturen im Ligninmolekül an (Martin Hofrichter, 6. J A
H R G A N G).
Die Merkmale der Mangan-Peroxidase von Phanerochaete chrysosporium stammen
aus der biologischen Datenbank (BRENDA, 2011).
Reaktionsgleichung: 2 Mn+2 + 2 H+ + H2O2 = 2 Mn+3 + 2 H2O
Molekulargewicht: ca. 40 kDa
pH-Optimum: 3; 3,5; 4; 4,5; 4,8; 5 (Mehrfachnennungen aufgrund
unterschiedlicher Literaturangaben)
Temperaturbereich: 25 bis 45 °C
(bei 25°C ca. 80 % der maximalen Enzymaktivität und bei
45 °C werden ca. 60% erreicht)
4.5.4. Laccase (EC 1.10.3.2)
Die Laccase (Polyphenoloxidase) ist sauerstoffabhängig. Sie kommt in Pilzen,
Pflanzen sowie in einigen Insekten und Bakterien vor. Hauptsächlich ist Laccase in
Lignin abbauenden Weißfäulepilzen zu finden. Es ist ein kupferhaltiges Glykoprotein
(Falk Saupe, 2003). Auch sie katalysieren, wie Mangan-Peroxidase, eine Ein-
Elektronen-Oxidation. Es werden Radikale gebildet, die die phenolischen und nicht
phenolischen aromatischen Verbindungen dann oxidierten. Dabei wird molekularer
Sauerstoff reduziert und Wasser gebildet.
21
Durch Mediatoren wie z. B. 2,2´- Azino-bis(3- ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure)
(ABTS) werden auch nicht-phenolische Untereinheiten des Lignins angegriffen (Falk
Saupe, 2003).
Abbildung 8: Oxidation von ABTS (A) zum Kationenradikal (B) und zum Dikation (C)
Quelle: (Falk Saupe, 2003)
Angaben der biologischen Datenbank BRENDA zur Laccase des Pleurotus
ostreatus.
Molekulargewicht: 59 bis 66 kDa
pH-Optimum: 3; 3,6; 4; 4,5; 5,3; 5,5; 6; 6,2 (Mehrfachnennungen
aufgrund der unterschiedlichen Literaturangaben)
Temperaturbereich: 30 bis 80 °C
4.6. Photometrie
Photometrie ist die Bestimmung der Konzentration eines Stoffes in Lösung. Dabei
wird die Änderung der Intensität eines definierten Lichtstrahls einer bestimmten
Wellenlänge gemessen. Die elektromagnetische Strahlung tritt in Wechselwirkung
mit dem gelösten Stoff des Probematerials. So erzeugt z. B. die ultraviolette
Strahlung (200 – 380 nm) eine Anregung innerer Elektronen bzw. von
Valenzelektronen oder die Strahlung im sichtbaren Bereich (380 – 780 nm) eine
Anregung der Valenzelektronen. Je nach Atom- und Molekülart werden eng
begrenzte gequantelte Energiebeträge aus dem Lichtstrahl absorbiert. Durch eine
Spektralanalyse können für ein Atom oder Molekül die Wellenlängen ermittelt
werden, bei denen Absorptionen auftreten. Diese ermittelten Wellenlängen sind
22
charakteristisch für diesen Stoff. Die Wellenlänge, die durch den Stoff am stärksten
absorbiert wurde, kann gezielt eingesetzt werden, um die Konzentration dieses
Stoffes zu ermitteln.
Zwischen der Konzentration eines absorbierenden Stoffes und der Lichtabsorption
besteht ein proportionaler Zusammenhang, der durch das Lambert-Beer’sche Gesetz
beschrieben wird. Voraussetzung für das Lambert-Beer’sche Gesetzt ist eine
monochromatische Strahlung und ein absorbierender Stoff in stark verdünnter
Lösung. Dieses Gesetz beschreibt die Absorption der Intensität (Φ0) der
monochromatischen Strahlung, die beim Durchgang durch eine absorbierende
Lösung mit Schichtdicke (d) auf den Betrag Φ geschwächt wird.
Abbildung 9: Lambert-Beer'sche Gesetz Quelle: (Ott, 2004)
Durch das Vermessen von Standardlösungen deren Stoffmengenkonzentration
bekannt ist, kann eine Kalibrierkurve erstellt werden. Für den linearen Bereich der
Kalibrierkurve wird der bezogene molare spektrale Absorptionskoeffizient ermittelt.
Dieser Absorptionskoeffizient dient zur Berechnung der Konzentration dieses Stoffes,
der in unbekannter Menge in Lösung vorliegt, zusammen mit der Schichtdicke und
dem ermittelten spektralen Absorptionsmaß. Die Kalibrierkurve verläuft unterhalb des
spektralen Absorptionsmaßes 1 linear. Deshalb muss die Probe entsprechend
verdünnt werden, damit das Lambert-Beer’sche Gesetz angewendet werden kann.
Je steiler die Kalibriergerade verläuft, desto empfindlicher ist der Nachweis des
entsprechenden Stoffes. Um die Absorption der Lösung, in der sich der Stoff
befindet, zu berücksichtigen, wird nur das Absorptionsmaß des Lösungsmittels
vermessen und als Blindwert von den Werten der Proben abgezogen.
23
4.7. Biogasproduktion
Der Biogasprozess läuft unter anaeroben Bedingungen ab. Dabei bilden
Mikroorganismen durch den Abbau organischer Materialien Biogas. Biogas besteht
hauptsächlich aus Methan (CH4) – 50 bis75 Vol.-% - und Kohlenstoffdioxid (CO2) –
25 bis 50 Vol.-%. Die weiteren Komponenten, wie Ammoniak (NH3),
Schwefelwasserstoff (H2S), Wasserdampf und andere gasförmige oder
verdampfbare Bestandteile, entstehen in Abhängigkeit von dem eingesetzten
Substrat.
Die Biogasentstehung ist ein vierstufiger Prozess, an dem unterschiedliche
Bakteriengruppen beteiligt sind. Bei der Hydrolyse (1. Schritt) werden die Polymere
wie z. B. Kohlenhydrate, Eiweiße und Fette in Oligomere und Monomere wie
Aminosäuren, Mehrfach- sowie Einfachzucker und Fettsäuren gespalten. Diese
Zwischenprodukte werden bei der Acidogenese (2. Schritt) zu niederen organischen
Säuren (Essig-, Propion- und Buttersäure), Milchsäure, Alkohole und H2 sowie CO2
abgebaut. H2 und CO2 können durch Methan bildende Bakterien direkt zu Methan
umgesetzt werden. Während der Acetogenese (3. Schritt) werden Fett- und
Carbonsäuren sowie die niederen Alkohole zu Essigsäure, Wasserstoff und
Kohlenstoffdioxid abgebaut. Die acetogenen Wasserstoffbildner sind das schwächste
Glied im Biogasprozess und aus energetischen Gründen von den Methan bildenden
Bakterien abhängig. Diese müssen den Wasserstoffpartialdruck niedrig halten, damit
die Abbaureaktion der Wasserstoffbildner möglich ist. Deshalb sollte der pH-Wert
(6,5 bis 8) und die Temperatur (37°C – mesophil bzw. 55 °C – thermophil) an das
Optimun der acetogenen Wasserstoffbildner angepasst werden (FNR, 2010).
24
Bei der Methanogenese (4. Schritt) wird aus Essigsäure sowie Wasserstoff und
Kohlenstoffdioxid Methan gebildet.
Abbildung 10: Schema des anaeroben Abbaus organischer Substanz Quelle: (Andreas Lemmer, 2010)
5. Material und Methoden
5.1. Pilzkulturen
Pleurotus ostreatus Stamm 1833 und Donkioporia expansa Stamm 9690 wurden von
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in
Braunschweig bezogen. Die Pilzkulturen befanden sich bei Anlieferung auf
Schrägagarröhrchen, die verschlossen waren. Davon wurden Stammkulturen auf
dem vom DSMZ empfohlenen Medium angelegt. Die verwendeten Stammkulturen
des Pleurotus ostreatus waren bereits ca. 5 Monate alt und wurden bei 25 °C im
Brutschrank aufbewahrt. Sie wurden zuvor für eine andere Arbeit benutzt. Daher
stammte auch noch eine andere Kultur des Pleurotus ostreatus auf gehäckseltem
Holz.
25
Diese Kultur befand sich in einer steril verschlossenen 5 Liter Schottflasche auf dem
Dachboden (Abb. 10).
Abbildung 11: Schottflasche mit Pleurotus ostreatus auf Holzspäne
Zudem wurde noch Körnerbrut des Pleurotus ostreatus (Austernseitling oder Pearl
Oyster) über die Fa. Samentraum Gassmann GmbH unter www.samentraum.de
gekauft. Die mit Pilzmycel bewachsenen Getreidekörner waren getrocknet und
luftdicht verpackt. Diese Körnerbrut wurde von der Fa. Mr Fothergill’s Seeds Ltd in
Suffolk Großbritannien hergestellt und ist für die Anzucht auf Stroh oder Holz für den
privaten Gebrauch gedacht.
Weiterhin wurde ein Waldpilz benutzt, der in einem Waldstück auf einen
abgestorbenen Baumstamm gefunden wurde und darauf eine schleimige Kultur
bildete. Den Waldpilz fand Frau Prof. Dr. rer. nat. Wilharm und brachte hiervon eine
Probe mit.
26
5.2. Medien
5.2.1. Nähragar
Die Nährmediumempfehlung des DSMZ war für beide Pilze identisch.
Es wurde ein Malzextrakt Pepton Agar empfohlen. Mit der Zusammensetzung:
Malzextrakt 30,0 g
Soya-peptone 3,0 g
Agar 15,0 g
deion. Wasser 1000,0 ml
pH 5,6
Verwendet wurde ein Malzextrakt-Agar mit dieser Zusammensetzung von der Fa.
Merck.
5.2.2. Nährbouillon
Als Flüssigmedium diente eine Malzextrackt-Bouillon ebenfalls von der Fa. Merck.
Von der Bouillon wurde soviel eingewogen, dass 30 g Malzextrakt pro 1000 ml deion.
Wasser enthalten waren. Zusätzlich kamen auf diese Menge 3 g Pepton, das
allerdings abweichend von der Vorgabe aus einem Fleischextrakt anstatt aus Soya
stammte.
5.2.3. Minimalmedium
Um die Bildung extrazellulärer lignocellulytischer Enzyme zu fördern, wurde ein
flüssiges Minimalmedium eingesetzt, das als einzige Kohlenstoffquelle Strohmehl
enthielt.
Als Anhalt diente ein Rezept, das sich laut einem Forschungsprojekt der Protagen
AG (Dr. H. Bouws, et al., 2008) besonders eignete. Das verwendete Medium enthielt
3 % (abgeändert von 2 % auf 3 %) fein gemahlenes Rapsstroh mit einer
Partikelgröße < 0,25 mm (empfohlen wurden Ø 2 - 4 mm).
27
Inhaltsstoffe für 100 ml deion. Wasser:
MgSO4 0,05 g
KH2PO4 0,15 g
Hefeextrakt 0,2 g
Spurenelementlösung 0,1 ml
Rapsstroh (gemahlen) 3,0 g
Zusammensetzung der Spurenelementlösung:
FeCl3 × 6 H2O 0,08 g/l
ZnSO4 × 7 H2O 0,09 g/l
MnSO4 × H2O 0,03 g/l
CuSO4 × 5 H2O 0,005 g/l
EDTA 0,4 g/l
5.2.4. Substrate für den Ligninabbau
5.2.4.1. Stroh
Getreidestroh wird von vielen Pilzzüchtern empfohlen. Es ist auch das im
professionellen Bereich meist genutzte Pilzsubstrat. Laut der Internetseite
www.biopilze-Berlin.de (Klein, 2011) kann Getreidestroh besonders gut verwertet
werden, da der Lignin/Cellulose/Hemicellulose-Komplex des Strohs für den Pilz
leichter aufzuschließen ist als der von Holz. Weiterhin ist das Kohlenstoff-Stickstoff-
Verhältnis (C:N-Verhältnis) im Stroh mit 40:1 für den Pilz wesentlich günstiger als
beim Holz, wo das C:N-Verhältnis bei 500:1 liegt (Klein, 2011). Dadurch ist eine
schnellere Besiedlung des Substrates durch den Pilz möglich. Die Eigenschaften des
Getreidestrohs bringen auch Nachteile mit sich. Denn durch die leichtere
Verfügbarkeit der Nährstoffe im Stroh können sie auch durch andere Organismen als
dem inokulierten Pilz abgebaut werden. Zum Beispiel könnten sich Schimmelpilze
durchsetzen, die ein schnelleres Mycelwachstum haben als z. B. Pleurotus ostreatus.
28
Das trockene Getreidestroh wurde von einem Bauern geholt und mit einer
Schneidemühle der Fa. Fritsch GmbH (Abb. 11) auf eine Partikelgröße < 10 mm
gebracht.
Abbildung 12: Fritsch Schneidemühle (Keller im Geb. 4 am Exer)
5.2.4.2. Pappelholz
Als schnell wachsende Holzart wurde Pappel ausgewählt. Das Substrat wurde
einmal aus Kaminholz, das bereits 2 Jahre zum Trocknen lagerte, und frischen
Pappelzweigen gewonnen. Ein Gartenhäcksler der Fa. Bosch mit der Bezeichnung
AXT 2500HP (Standort: Keller Geb. 4 am Exer) brachte die frischen Pappelzweige
auf eine für die Schneidemühle der Fa. Fritsch geeignete Größe. Die Schneidemühle
machte dann aus den Holzstücken Holzsplitter, die kleiner als 10 mm waren.
Um aus dem Kaminholz ein Substrat mit größtmöglicher Oberfläche zu schaffen,
wurden aus ihm Späne herausgebohrt. Die Rinde des Kaminholzes wurde nicht
mitbenutzt.
29
5.2.4.3. Gärrest
Der Gärrest stammte aus einer Biogasanlage, die nur Maissilage und
Ganzpflanzensilage als Substrat einsetzt. Der Gärrest wurde bereits auf der Anlage
eingedickt, indem Wasser und Substrat separiert wurden. Eine weitere Aufbereitung
war nicht erforderlich, da sich im Gärrest keine großen Partikel befanden. Bis zur
Benutzung befand sich der Gärrest im Kühlschrank.
5.3. Kultivierungsmethoden
Für ein gutes Wachstum der Weißfäulepilze müssen optimale Bedingungen
geschaffen werden.
Da beide Pilze, Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa bei einer Temperatur
von 25 °C sowie einem pH-Wert von 5,6 (Empfehlung DSMZ) gut wachsen, musste
hier nicht unterschieden werden. Für den Waldpilz wurden dieselben
Wachstumsbedingungen angenommen.
Für die Kultivierung des Pleurotus ostreatus auf Stroh oder Holz existieren zahlreiche
Anleitungen. Umfassende Angaben zur Handhabung und Aufzucht des
Austernseitlings liefert (Hyungjong Kwon, 2004). Dieses Pilzhandbuch beschreibt die
Speisepilzzucht im großtechnischem Stil für kommerzielle Zwecke. Demnach
benötigt der Pilz 20 bis 25 °C und Dunkelheit für sein Mycelwachstum. Die
Kolonisationszeit auf ligninhaltigen Substrat wird mit 15 bis 25 Tagen angegeben.
Weiter steht im Kapitel 5-1 des Mushroom Growers Handbooks 1, dass der pH-Wert
des Substrats in einem Bereich von 5,0 bis 6,5 (Hyungjong Kwon, 2004) liegen sollte.
Es wird beschrieben, dass man diesen pH-Wert durch die Zugabe eines Puffers wie
z. B. Gips oder Kalk mit 3 % Massenanteil halten kann. Der Wasseranteil des
Substrats soll laut Kapitel 3 (Hyungjong Kwon, 2004) bei 65 % liegen und der der
Luft zwischen 65 und 70 %. Wenn der Wasseranteil im Substrat zu hoch ist, dann
kann es gemäß (Hyungjong Kwon, 2004) leichter zu Kontaminationen kommen.
Durch Belüftung ist die Kohlenstoffdioxidkonzentration unterhalb 600 bis 1000 ppm
zu halten. Zur Ausbildung von Fruchtkörpern kommt es erst bei einer Temperatur von
15 °C. Im Internetforum kulturpilz.de (http://kulturpilz.de/viewtopic.php?t=863, vom
15.08.2011 um 22:40 Uhr) wird darauf hingewiesen, dass gemäß dem Buch
30
„Pilzanbau“ von Prof. Jan Ivan Lelley (Gesellschafter-Geschäftsführer der
Gesellschaft für angewandte Mykologie und Umweltstudien GmbH (GAMU), Institut
für Pilzforschung in Krefeld) Pleurotus ostreatus vorwiegend Lignin abbaut, solange
er die Strukturproteine der Zellwand, die an das Lignin gebunden sind, als einzige
Stickstoffquelle nutzen kann. Wenn eine andere Stickstoffquelle vorliegt, wird auch
die Cellulose abgebaut. Weiterhin wird erwähnt, dass das Pilzmycel des
Austernseitlings bei einer Substratmischung aus niedermolekularen Kohlenhydraten
wie z. B. Saccharose und Maltose und Stäre mit hochmolekularen wie Cellulose,
Hemicellulose und Lignin schneller wächst als ohne diese Substratbeimischung.
Da Donkioporia expansa Bausubstanz aus Holz zerstört, findet man zu ihm häufig
Publikationen zu diesem Thema, aber keine Untersuchungen, die die optimalen
Wachstumsbedingungen beschreiben. Jedoch ist Donkioporia expansa ebenso wie
Pleurotus ostreatus ein Waldpilz, der unter anderem in Mitteleuropa beheimatet ist.
Darum wurde davon ausgegangen, dass Donkioporia expansa auf ligninhaltigen
Substraten dieselben Lebensbedingungen wie Pleurotus ostreatus benötigt.
Um Verunreinigungen durch andere Organismen wie z. B. Schimmelpilze zu
vermeiden, war steril zu arbeiten. Prinzipien des sterilen Arbeitens sind in (Munk,
2001) ab Seite 7-22 zu finden. Das Befüllen der Kulturgefäße, Gießen der
Kulturplatten und das Animpfen erfolgten unter einer Sterilbank mit einer vertikalen
turbulenzarmen Luftströmung. Die Medien und Kulturgefäße wurden zur Sterilisation
bei 121 °C gesättigtem Wasserdampf für 15 min autoklaviert. Die Arbeitsgeräte und
Sterilbank sind vor und nach der Benutzung mit 70 % Ethanol bzw.
Desinfektionsmittel gereinigt worden. 100 g der Desinfektionslösung enthielten 50,0 g
1-Propanol und 0,08 g Glyoxal. Unter der Sterilbank befand sich zusätzlich noch ein
Bunsenbrenner, mit dem das Impfbesteck ausgeglüht wurde. Während des Arbeitens
waren Latexhandschuhe zu tragen und der Kontakt mit verunreinigten Flächen zu
vermeiden.
Als Erstes wurden Stammkulturen auf Agar-Platten inokuliert, die in einem
Brutschrank dunkel bei konstanten 25 °C inkubierten. Durch ständiges Erneuern der
Stammkulturen blieben diese frisch und verfügbar. Zum Animpfen einer neuen
Malzextrakt-Agar-Platte oder einer Malzextrakt-Bouillon erwies es sich am
geeignetsten, ein kleines rechteckiges Stück Agar mit Mycel aus der Stammplatte
auszustechen und auf die neue Platte oder Bouillon zu überführen. So wird auch das
Substratmycel und nicht nur das Luftmycel übertragen.
31
Nachdem sich genügend Mycel auf den Platten gebildet hatte, wurden diese
komplett zerkleinert, ausgewogen und in das Gefäß mit dem Substrat überführt.
Gutes durchmischen mit einem sterilen Spatel sorgte für einen optimalen Kontakt
zwischen Substrat und Pilzmycel. Ein Gummistopfen, der mit zwei PVC-Schläuchen
durchstochen war und an dessen Ende Sterilfilter (< 0,22 µm) saßen, verschloss die
Kulturgefäße. Die so vor Luftkeimen geschützten Kulturen kamen bei
Zimmertemperatur in einen Schrank, damit die Pilzkulturen vor der
Sonneneinstrahlung geschützt waren.
Als Kulturgefäße dienten 1 l Erlenmeyerkolben. Diese wurden mit zuvor
getrocknetem Substrat bzw. frischem Substrat, dessen Gehalt an Trockensubstanz
vorher bestimmt wurde, und Leitungswasser befüllt, sodass der Massenanteil des
Wassers zwischen 60 und 70 % lag. Dieser Wasseranteil wird von verschiedenen
Pilzzüchtern empfohlen unter anderem von www.seiberts.de
(http://agrar.seibertz.de/pilze/PILZ.html, vom 25.05.2011) und (Hyungjong Kwon,
2004). Der Wasseranteil wurde nach dem Autoklavieren noch einmal gravimetrisch
überprüft.
Zusätzlich wurden Pilzkulturen in Flüssigmedium angesetzt, um aus ihnen leichter
extrazelluläres Enzym gewinnen zu können. Hierzu wurden zum Einen 100-ml-
Erlenmeyerkolben benutzt, die mit 20 bzw. 50 ml Flüssigmedium gefüllt waren. Nach
Inokulation sollte ein autoklavierter Cellulosestopfen das Eindringen von Luftkeimen
verhindern. Weiterhin wurden von Herrn Prof. Dr. Ulrich Zaiß Zellkulturflaschen (Abb.
13) bereitgestellt, die bei gleichen Füllvolumen, wie die Erlenmeyerkolben, eine
größere Oberfläche haben. Ein Schraubverschluss mit Belüftungsmembran schützt
die Zellkulturen vor Kontamination mit Fremdorganismen.
Abbildung 13: Zellkulturflasche mit Pleurotus ostreatus 8 d alt in Minimalmedium
Bei dieser Variante stand den Pilzen mehr Wachstumsfläche als in den
Erlenmeyerkolben zur Verfügung. Dadurch können sich mehr Enzyme im Medium
32
ansammeln. Auch die Flüssigkulturen inokulierten in einem Klimaschrank bei 25 °C
und Dunkelheit.
Die Überwachung der Zuchtergebnisse erfolgte mikroskopisch mit einem Mikroskop
der Fa. Nikon (eclipse 50i). Für die Probenahme des Pilzmycels wurde gem. (Zaiß,
2011) verfahren. Durch leichtes Aufdrücken eines durchsichtigen Klebestreifens auf
das Pilzmycel konnte eine optimale Menge Mycel auf die Klebefläche übertragen
werden. Der Klebestreifen mit Pilzmycel wurde auf einen Objektträger geklebt und
konnte nun mikroskopiert werden. Das Mikroskop bot die Möglichkeit einen Laptop
anzuschließen, auf dem die Bilder des Mikroskops übertragen wurden. Mithilfe der
Computer-Anwendung NIS-Elements von Nikon konnten die Schwarz-Weiß-Bilder
bearbeitet, ausgewertet und in einer Datei gespeichert werden. Mit einer
Digitalkamera wurden zusätzlich Farbfotos erstellt. Hierzu wurde das Objektiv der
Digitalkamera vor das Okular des Mikroskops gehalten. Die Digitalkamera musste
richtig positioniert werden, bis das mikroskopierte Objekt im Sucher der Kamera zu
sehen war. Nun war ein Aufnahme problemlos möglich.
5.3.1. Konservierung der Pilzkulturen
Um immer über aktive Pilzkulturen zu verfügen, müssen diese in regelmäßigen
Abständen auf frisches Substrat überführt werden.
Für eine längere Lagerung müssen die Pilzkulturen haltbar gemacht werden.
Zum Einen ist dies möglich, indem man die mit Mycel bewachsenen Malzextrakt-
Agar-Platten in einem Kühlschrank aufbewahrt. Dann bleiben die Pilzmycelien für ca.
4 Monate lebensfähig (Mai, 2011). Eine andere Variante ist, das Pilzmycel in
Reinstwasser zu suspendieren. Diese Suspension kann dann für ca. 2 Jahre im
Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt werden (Mai, 2011). Jedoch gebe es zu dieser
Methode seitens Frau Mai noch keine Erfahrungswerte.
Es ist ohne Weiteres möglich das Pilzmycel bei -20 °C aufzubewahren
(CABMICHAEL, 1962). Das Mycel wurde so wie es war eingefroren und keiner
weiteren Behandlung unterzogen.
33
5.4. Ligninbestimmung
Die Ligninbestimmung soll Aufschluss über die Lignin-Abbauleistung der Pilze geben
und als Vergleichsparameter zwischen den Pilzarten dienen. Da sich mit der
mikroskopischen Ligninbestimmung z. B. durch Einfärbung mit salzsaurem
Phloroglucinol nur eine Aussage zur Qualität des Ligninabbaus treffen lässt, wurde
ihr die gravimetrische Ligninbestimmung vorgezogen.
5.4.1. Probenvorbereitung
Die zuvor gehäckselten ligninhaltigen Materialien wurden für mindestens 24 h bei
105 °C getrocknet. Danach wurde das Material in einer Schwingmühle der Fa.Fritsch
GmbH fein gemahlen. Dieses Mehl wurde bei einer Maschenweite von 0,25 mm
abgesiebt und der Siebdurchgang weiter verwertet. So konnte sichergestellt werden,
dass das Mehl eine Partikelgröße < 0,25 mm hat. Diese Proben wurden dann für die
Ligninbestimmung gem. den nachfolgend beschriebenen Verfahren benutzt oder
trocken gelagert, wenn sie nicht sofort analysiert wurden.
5.4.2. Quantitative Ligninbestimmung nach (J. H. Ross, 1933); verändert
nach Vasilic, 2011
Zur Entfernung störender Holzinhaltsstoffe erfolgte zunächst eine 16-stündige
Extraktion des ligninhaltigen Materials mit gleichen Volumenanteilen Ethanol und
Cyclohexan (Ethanol:Cyclohexan 1:1). Dieser Extrakt wurde im Anschluss 24 h bei
105 °C getrocknet. Von dem getrockneten Material wurden dann 1 g in einen 100-ml-
Erlenmeyerkolben überführt und mit 20 ml 72 %-iger Schwefelsäure übergossen. Der
Kolben wurde mit einem Cellulosestopfen verschlossen. In dem Kolben befand sich
ein Magnetrührer, der die Mischung mithilfe einer Magnetrührerplatte 16 h bei 300
rpm umrührte. Es war darauf zu achten, dass sich keine Klumpen bildeten. Diese
waren gegebenenfalls mit einem Glasrührer zu zerstoßen.
34
Nach dem Rühren in 72 %-iger Schwefelsäure wurde die Mischung in ein
hitzebeständiges Gefäß umgefüllt und mit 875 ml deion. Wasser verdünnt. Das
Gefäß wurde mit einem Rückflusskühler versehen und die Mischung dann 2 Stunden
lang gekocht. Der Versuchsaufbau ist auf Abbildung 14 zu sehen.
Abbildung 14: Versuchsaufbau Gewinnung Säure-Detergens-Lignin durch Kochen mit einer starken
Säure
Im Anschluss war das Lignin mit doppelten, zuvor ausgewogenen Cellulosefiltern
abzufiltern. An den Wänden des zum Kochen benutzten Gefäßes blieb ein
Niederschlag zurück. Damit kein Lignin verloren ging, wurde dieser Niederschlag mit
deion. Wasser auf den Filter gespült. Der Filterrückstand war solange mit heißem
deion. Wasser zu spülen, bis sich ein neutraler pH-Wert einstellte. Die Filter kamen
zum Trocknen über Nacht bei 105 °C in einen Trockenschrank. Vor dem Wiegen
wurden die getrockneten Filter in einem Exsikkator auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die beiden Filter wurden dann einzeln abgewogen. Die Gewichtsdifferenz aus Filter
mit Filtrat und leerem Filter ergab nach (J. H. Ross, 1933) die Ligninmenge. Da die
Cellulosefilter größere Gewichtsdifferenzen hatten, wurde für eine genauere
Bestimmung des Ligningehalts die Bestimmung der Gewichtsdifferenz in dieser
Arbeit folgendermaßen abgewandelt. Das Leergewicht für den tatsächlich zum
Filtrieren benutzten Filter (F2) wurde von diesem nach Filtern und Trocknen
abgezogen. Dann wurde noch zusätzlich der gemittelte durch trocknen verursachte
Gewichtsverlust der Cellulosefilter Subtrahiert. Der mittlere Gewichtsverlust ergab
sich aus allen Blindproben, also aus den Filtern (F1), auf denen sich kein Rückstand
befand.
35
Der prozentuale Ligningehalt wurde nach folgender Formel berechnet.
Details zur Formel LigningehaltRoss
:
mittlere Masse von allen Blindproben (Filter ohne Rückstand)
mittlere Masse von allen Blindproben (Filter ohne Rückstand) nach dem Trocknen
mF2 Masse des zweiten leeren Filters
mF2tr Masse des zweiten getrockneten Filters mit Filtrat
mS Masse des eingewogenen Substrats
5.4.3. Bestimmung des Ligninanteils in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN
EN ISO 13906, 2008)
Die meisten Verfahren zur Bestimmung des Ligningehalts ähneln sich in ihren
Verfahrensschritten (J. H. Ross, 1933; HALSE, 1926; Klason, 1908). Nach einer
Extraktion der leicht löslichen Bestandteile (Proteine, kurzkettige Kohlenhydrate) folgt
zunächst eine Vorhydrolyse der Hemicellulose. Im Anschuss wird die Cellulose durch
das Kochen mit einer starken Schwefelsäure Hydrolysiert. Die Norm legt das
Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an unlöslichen Säure-Detergens-
Faserrückständen (ADF) und Säure-Detergens-Lignin (ADL) in Futtermitteln fest. In
der Norm wird der ADL-Gehalt nicht durch Rückflusskochen mit einer starken Säure
bestimmt, sondern durch Hydrolyse mit einer starken auf 15 °C gekühlten Säure,
wobei die Reaktionstemperatur auf 20 bis 23 °C gehalten wird. Da dies eine
Arbeitserleichterung darstellt und die Abarbeitung mehrerer Proben besser möglich
ist, wurde die Norm in Abwandlung zur Ligninbestimmung eingesetzt.
Im Nachfolgenden wird nur die Lingninbestimmung in Anlehnung an die DIN EN ISO
13906 beschrieben. Hierbei wurde auf die Analyse des ADF-Gehalts verzichtet. Die
Abänderung zur Bestimmung des ADL-Gehalts bestand darin, dass anstatt
Frittentiegel (Porengröße 40 bis 60 µm) Glasfaser Vorfilter Bestell-Nr.: 13430-130-G
von der Fa. Sartorius AG benutzt wurden. Weiterhin wurden die Kolben und die
Schwefelsäure nicht gekühlt und der Filterrückstand wurde anstatt mit heißem
36
Wasser mit deion. Wasser, das Raumtemperatur hatte, säurefrei gewaschen. Die
Massen wurden mit einer Feinwaage von Satorius bis auf 1 mg ermittelt. Als Erstes
waren 1 g getrocknetes und gemahlenes Material, dessen Partikel nicht größer als
0,25 mm waren, in einen 100-ml-Erlenmeyerkolben einzuwiegen. Dort kamen dann
ein Magnetrührer und 20 ml 72 %-ige Schwefelsäure hinzu. Mit einem Glasstab
wurden evtl. Verklumpungen aufgelöst. Der Inhalt der Erlenmeyerkolben wurden 3
Stunden mithilfe einer Magnetrührerplatte bei 300 rpm ständig vermischt. Nach
Ablauf der 3 h erfolgte die Filtration des Kolbeninhalts durch den Glasfaserfilter, der
sich in einem Trichter befand. Das Filtrat konnte in ein geeignetes Gefäß oder in den
Ausguss, der ständig mit Wasser nachgespült wurde, ablaufen. Der Filterrückstand
wurde sofort mit deion. Wasser gespült, bis das Filtrat säurefrei war. Die Prüfung des
pH-Werts erfolgte per Teststreifen oder pH-Meter. Bei der Prüfung des pH-Werts mit
dem pH-Meter musste ein Teil des Filtrats in einem Gefäß aufgefangen werden.
Damit kein Lignin verloren ging, wurden die Rückstände im Erlenmeyerkolben und
am Magnetrührer mit deion. Wasser auf den Filter gespült. Die abgetropften Filter
wurden in ein Porzelantiegel überführt und für mindestens 5 h, meistens jedoch über
Nacht, bei 105 °C in einen Trockenschrank mit Umluft getrocknet. Nachdem die Filter
im Exsikkator auf Raumtemperatur abgekühlt waren, konnte deren Masse bestimmt
werden. Die Filter konnten ohne Tiegel gewogen werden, da sie fest und starr waren.
Damit konnten Gewichtsschwankungen des Tiegels ausgeschlossen werden. Um
den Aschegehalt des Filterrückstandes zu ermitteln, kamen die getrockneten Filter
mit Rückstand für 5 h bei 550 °C in einen Muffelofen. Anschließend kühlten die Filter
in einen Exsikkator auf Raumtemperatur ab. Die Masse der Filter konnte wieder
einzeln aufgezeichnet werden. Zur Bestimmung des mittleren Gewichtsverlusts der
Filter wurden 3 leere Filter getrocknet sowie verascht und jedes Mal ausgewogen.
37
Die Auswertung erfolgte nach folgender Formel:
Details zur Formel Ligningehalt in %:
Masse von Filter und Rückstand nach dem Trocknen
Masse von Filter und Rückstand nach dem Veraschen
mittlere Masse von allen Blindproben (Filter ohne Rückstand) nach dem Trocknen
mittlere Masse von allen Blindproben (Filter ohne Rückstand) nach dem Veraschen
Masse der Untesuchungsprobe
5.5. Enzymatische Aktivität
Die enzymatische Aktivität der Weißfäulepilze wurde mit einem Spektrometer
(UNICAM UV/VIS Spektrometer UV2) photometrisch anhand der entstehenden
Oxidationsprodukte über die Zeit bestimmt. Die Änderung der Absorption wurde
minütlich für 5 bis 10 Minuten verfolgt. Die Berechnung der Aktivität erfolgte nach
folgender Formel gem. (Falk Saupe, 2003), die ggf. an das eingesetzte Volumen und
evtl. Verdünnungen anzupassen war.
Formel 1: Berechnung der Enzymaktivität Quelle: (Falk Saupe, 2003)
38
5.5.1. Vorbereitung
Vorbereitend wurde mit Pilzmycel bewachsenes Flüssigmedium zunächst
geschüttelt. Dann wurde es mit einem Cellulosefilter (Porenweite von 8 bis 12 µm)
abfiltriert. Sollte die Pilzkultur weiter bestehen bleiben, um den Verlauf der
enzymatischen Aktivität aufzunehmen, wurde nur ein Teil des Flüssigmediums mit
einer Spritze abgezogen und mit einem Cellulosefilter vorfiltriert. Das Filtrat wurde
auf eine Spritze aufgezogen. Dann wurde der Spritzeninhalt durch einen
Spritzenfilter mit einer Porenweite von 0,22 µm gedrückt. Dieses Filtrat konnte nun
zur weiteren Analyse benutzt werden. Die Proben wurden am Tag der Analyse frisch
vorbereitet.
5.5.2. Puffer und Lösungen für die Enzymtests
0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5
29,41 g Na3C6H5O7 x2 H2O wurden in 900 ml deion. Wasser gelöst. Der pH-Wert war
mit 2M Salzsäure auf 4,5 einzustellen. Danach wurde die Lösung mit deion. Wasser
auf 1 l aufgefüllt. Der Puffer lagerte im Kühlschrank für maximal eine Woche.
0,1 M H2O2-Stammlösung
Aus einer 30 %-igen H2O2-Lösung wurde durch Verdünnen mit deion. Wasser eine
0,1 M H2O2-Lösung hergestellt. Die Stammlösung wurde jedes mal frisch angesetzt.
1 mM ABTS (2,2´-Azino- bis(3- ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure))
Summenformel: C18H24N6O6S4
Molare Masse 548,70 g/mol
5 mg ABTS wurden in 10 ml Natriumcitratpuffer 0,1 M, pH 4,5 gelöst. Die Lösung
wurde bei +4 °C für maximal eine Woche aufbewahrt.
39
18,49 mM o-Phenylendiamin (1,2-Diaminobenzol, 1,2-Phenylendiamin)
Summenformel: C6H8N2
Molare Masse: 108,14 g/mol
20 mg OPD wurden in 10 ml Natriumcitratpuffer 0,1 M, pH 4,5 gelöst. Die Lösung ist
bei Licht und Wärme unbeständig. Entweder wird ein Aliquote bei -20 °C gelagert
oder die Lösung immer frisch angesetzt.
0,25 M Weinsäure, pH 2,5
2,3-Dihydroxybernsteinsäure (Weinsäure)
Summenformel: C4H6O6
Molare Masse: 150,09 g/mol
7,504 g Weinsäure wurden in 200 ml deion. Wasser gelöst. Der pH-Wert von 2,5 war
ggf. mit einer Natriumhydroxidlösung (NaOH) einzustellen.
10 mM Veratrylalkohol (3,4-Dimethoxybenzylalkohol, va)
Summenformel: C9H12O3
Molare Masse: 168,19 g/mol
0,084 g va wurden in 50 ml Weinsäurepuffer, pH 2,5 gelöst.
1 M Weinsäure, pH 5,0
2,3-Dihydroxybernsteinsäure (Weinsäure)
Summenformel: C4H6O6
Molare Masse: 150,09 g/mol
15.09 g Weinsäure wurden in 100 ml deion. Wasser gelöst. Der pH-Wert von 5,0 war
mit einer Natriumhydroxidlösung (NaOH) einzustellen.
0,01 M Mangan(II)-sulfat-Lösung
Summenformel: MnSO4
Molare Masse: 223,06 g/mol (Tetrahydrat)
0,0223 g wurden in 10 ml 0,1 M Weinsäurepuffer, pH 5,0 gelöst und bei nicht
gebrauch bei +4 °C aufbewahrt.
40
5.5.3. Lignin-Peroxidase-Aktivität (EC 1.11.1.14)
Zum Nachweis und Bestimmung der Aktivität der Lignin-Peroxidase, kamen drei
unterschiedliche Substrate zum Einsatz ABTS, OPD und va.
Zur Überprüfung des Analyseverfahrens wurde Lignin-Peroxidase als Puder mit einer
angegebenen spezifischen Enzymaktivität von >0.1 U/mg von der Fa. Sigma-Aldrich
bezogen. Eine Unit wird von der Fa. Sigma-Aldrich wie folgt angegeben: Ist die
Menge an Enzym, welche 1 µmol 3,4-dimethoxybenzyl Alkohol (Veratrylalkohol) pro
Minute bei pH 3,0 und 30 °C oxidiert (Quelle:
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=de&N4=42603|SIGMA
&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=Customer_Favorit
es-_-Detail_Page-_-Text-42603, vom 10.08.2011 um 21:45 Uhr). Bei den Tests mit
der gekauften Lignin-Peroxidase wurde die Temperatur der zu vermessenden Probe
variiert, um die Enzymaktivität zu steigern und dadurch evtl. die
Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Hierzu wurde zunächst eine Enzymlösung mit
1 g/l mit Reinstwasser erstellt. Diese Enzymlösung wurde vor der Analyse frisch
angesetzt. Daraus wurden verschiedene Probemengen entnommen, sodass das
Enzym in unterschiedlichen Stoffmengenkonzentration getestet werden konnte.
Zum Erhitzen bzw. Warmhalten des Analyse-Mixes befand sich der Mix in
Eppendorf-Caps und die wiederum in einem Thermomixer der Fa. Eppendorf. Der
Thermomixer konnte auf die gewünschte Temperatur eingestellt und das Mixen
abgestellt werden. Zum Vermessen des Mixes wurde dieser mit einer Pipette in eine
Küvette überführt und nach dem Vermessen wieder in das Eppendorf-Cap im
Thermomixer, um die Probe bis zum nächsten Messzeitpunkt auf Temperatur zu
halten..
5.5.3.1. 2,2´-Azino- bis(3- ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure) (ABTS)
Das Diammoniumsalz 2,2'-Azino- bis(3-ethylbenthia oder 2,2´-Azino- bis(3-
ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure) ist ein Redoxindikator, der in stabile Radikale
gespalten werden kann. Die Radikale sind photometrisch nachweisbar. Zusätzlich
wird das am Stoffwechsel beteiligte freie Radikal Wasserstoffperoxid benötigt.
41
Die Messung erfolgte in Anlehnung an (LEONTIEVSKY, 2001), anstatt einen 20 mM
Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5 zu verwenden, wurde ein 0,1 M
Natriumcitratpuffer, pH 4,5 benutzt (Falk Saupe, 2003). Der Reaktionsmix enthielt
0,4 ml Probe, 0,2 ml Substrat (0,2 mM), 5 µl von der 0,1 molaren H2O2-Stammlösung
(0,5 mM). Das Restvolumen der 1 ml Einwegküvette mit einer Schichtdicke von 1 cm
wurde mit 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5 aufgefüllt. In der Referenz-Küvette
ersetzte 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5 die Probe. Die Zunahme der Absorption
wurde minütlich bei einer Wellenlänge von 436 nm vermessen. Mit dem spezifischen
Absorptionskoeffizienten ε436 = 29 300 l M-1cm-1 von (LEONTIEVSKY, 2001) konnte
die Substratumsetzung und Enzymaktivität berechnet werden.
5.5.3.2. o- Phenylendiamin (OPD)
Der Reaktionsmix in der 1 ml Küvette bestand aus 0,1 ml Probe, 25 µl Substrat (0,46
mM), 5 µl Wasserstoffperoxid (0,5 mM) und der Rest des Volumens wurde mit 0,1 M
Natriumcitratpuffer, pH 4,5 aufgefüllt gemäß (Falk Saupe, 2003) in Anlehnung an
(CARDEMIL, 2003). Auch hier ersetzte 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5 in der
Referenz-Küvette die Probe. Die Änderung der Absorption wurde minütlich bei 450
nm gemessen. Die Berechnung der Enzymaktivität erfolgte auf Grundlage des
spezifischen Absorptions- oder Extinktionskoeffizienten ε450 = 1 010 l M-1cm-1 von
(CARDEMIL, 2003).
5.5.3.3. Veratrylalkohol (3,4-Dimethoxybenzylalkohol, va)
Da die Messung im UV-Bereich bei 310 nm erfolgte, wurde für die Messung der
Lignin-Peroxidase-Aktivität mit va eine 2 ml Quarzküvette mit einer Schichtdicke von
1cm verwendet,. Der Mix enthielt 2 mM Veratrylalkohl, 0,4 mM Wasserstoffperoxid,
50 mM Weinsäure, pH 2,5 und genügend enzymhaltige Probe. Die
Absorptionszunahme soll laut (KIRK, 1988) 0,2 pro Minute erreichen.
Mit dem spezifischen Absorptionskoeffizienten ε310 = 9300 l M-1cm-1 von (KIRK, 1988)
wurde die Enzymaktivität berechnet.
42
5.5.4. Laccase-Aktivität (EC 1.10.3.2)
Als Substrat diente ABTS. Der Reaktionsmix enthielt bis auf das Wasserstoffperoxid
die selben Bestandteile wie die zur Messung der Lignin-Peroxidase (siehe Kapitel
4.5.3.1.). Die Absorption wurde ebenfalls bei 436 nm gemessen. Der spezifische
Absorptionskoeffizient war identisch.
5.5.5. Mangan-Peroxidase-Aktivität (EC 1.11.1.13)
Die Mangan-Peroxidase-Aktivität wurde nach Vorgabe (Maria J. MARTINEZ, 1996)
analysiert. Die Enzymaktivität konnte direkt durch die Bildung des Mn+3-Weinsäure-
Komplex aus Mangan(II)sulfat und Weinsäure bei einer Wellenlänge von 238 nm
gemessen werden. Der spezifischen Absorptionskoeffizienten wird mit
ε238 = 6500 l M-1cm-1 angegeben. Der Reaktionsmix befand sich in einer 2 ml
Quarzküvette und enthielt 0,1 mM MnSO4, 0,1 mM H2O2, genügend Probe und in
Abwandlung 0,1 M Weinsäure (anstatt 0,1 M Natriumtartrat, Summenformel:
C4H4Na2O6). Die Änderung der Absorption wurde wieder minütlich aufgenommen.
5.6. Biogasproduktion
Um zu sehen, ob sich der Ligninabbau durch Weißfäulepilze positiv auf die
Biogasproduktion auswirkt, wurden die mit Pilzmycel durchwachsenden ligninhaltigen
Substrate anaerob fermentiert. Zum Vergleich wurden auch unbehandelte Substrate
fermentiert. Eine Trennung von Substrat und Pilzmycel wurde nicht durchgeführt, da
die im Mycel gespeicherte Energie ebenfalls zu Biogas umgewandelt werden sollte.
Jedoch bestand das Risiko einer Hemmung, da Pilze Toxine produzieren können.
Aber für eine Übertragung auf die Praxis wäre eine Trennung von Pilzmycel und
aufbereiteten Substrat unvorteilhaft. Die Durchführung der Gärtests erfolgte nach
Maßgabe des Entwurfs der VDI-Richtlinie 4630 „Vergärung organischer Stoffe“ von
2004 als Batch-Verfahren. Ein Versuch erfolgte im thermophilen Temperaturbereich
bei 55 °C in 1 l Erlenmeyerkolben, die mit einem Gummistopfen versehen waren
durch den ein Schlauch in einen Gassammelbeutel führte. Als Animpfschlamm diente
43
die separierte Gärrestflüssigkeit einer thermophilen Biogasanlage, die hauptsächlich
mit Mais gefüttert wird. Eine zweite Versuchsreihe wurde im mesophilem
Temperaturbereich bei 37 °C gefahren. Die Substrate wurden in verschlossenen 3,5 l
Erlenmeyerkolben fermentiert. Das Gas konnte mit einem Gassammelbeutel
aufgefangen werden. Hier diente ein Faulschlamm aus einer kommunalen
Kläranlage als Animpfmaterial.
Zunächst wurde die Trockensubstanz (TS) nach DIN EN 12880 (308, 2001-02) und
organische Trockensubstanz (oTS) nach DIN EN 12879 (308, 2001-02) bestimmt.
Mit diesen Werten konnten die Einwagen des Substrats und des Impfschlamms gem.
nachfolgend angegebenen Massernverhältnis berechnet werden.
Substrat)
Das Substrat soll im Verhältnis zum Impfschlamm keinen zu großen Anteil haben,
um Hemmungen durch zu hohe Säurekonzentrationen zu vermeiden und einen
ausreichenden Stoffübergang zu gewährleisten. Ansonsten wird der Ansatz zu
dickflüssig und das Substrat könnte im Impfschlamm nicht gut suspendiert werden.
Ein guter Stoffübergang wird durch tägliches Schwenken der Ansätze unterstützt.
Zur Bestimmung der Methankonzentration wurde ein Mehrgasmessgerät (Sewerin
Multitec 540) benutzt.
5.6.1. Quantitative Auswertung nach Entwurf VDI 4630 (VDI-Richtlinie,
2004)
5.6.1.1. Gasvolumen des trockenen Gases
Dabei ist
Vtr0 Volumen des trockenen Gases im Normzustand in mlN
V abgelesenes Volumen des Gases in ml p Druck der Gasphase zum Zeitpunkt der Ablesung in hPa pw Dampfdruck des Wassers in Abhängigkeit von der Temperatur des
umgebenden Raumes in hPa T0 Normtemperatur = 273 K p0 Normdruck = 1013 hPa T Temperatur des Faulgases bzw. des umgebenen Raumes in K
44
5.6.1.2. Methankonzentration im trockenen Gas
Dabei ist
CCH4tr Methankonzentration im trockenen Gas in Vol.-%
CCH4f Methankonzentration im feuchten Gas in Vol.-%
p Druck der Gasphase zum Zeitpunkt der Ablesung in hPa
pw Dampfdruck des Wassers in Abhängigkeit von der Temperatur des
umgebenden Raumes in hPa
Quelle: Dampfdrucktabelle des Kilolabors der ETH Zürich
http://www.volker-goebel.biz/Dampfdrucktabelle_GTKW_MV4.pdf
5.6.1.3. Kopfraumkorrektur
Da zu Beginn des Gärtests das restliche Volumen mit Stickstoff als Inertgas
aufgefüllt wurde, war eine Kopfraumkorrektur notwendig. Das Kopfraumvolumen der
3,5 l Erlenmeyerkolben betrug 1,74 l und das der 1 l Kolben 0,8 l.
Das Inertgas bewirkt anfangs eine Verdünnung der Biogaskomponenten. Deshalb ist
bei der Ermittlung der Gaszusammensetzung die Konzentration zu korrigieren. Bis
auf die letzte Messung der Biogaskomponenten wurde immer die korrigierte
Konzentration der Biogaskomponente für weitere Berechnungen oder Angaben
benutzt.
Dabei ist
Ckorrtr korrigierte Konzentration der Biogaskomponente im trockenen Gas in Vol.-%
Ctr gemessene Konzentration der Biogaskomponente im trockenen Gas in Vol.-%
VK Kopfraumvolumen in ml
VB Volumen des produzierten Biogases in ml ()
t Messzeitpunkt (t2>t1)
45
Ergänzend wurde nachfolgende Formel genutzt, wenn nur ein Messwert der
Biogaskomponenten zur Verfügung stand.
Dabei ist
Ckorrtr korrigierte Konzentration der Biogaskomponente im trockenen Gas in Vol.-%
Ctr gemessene Konzentration der Biogaskomponente im trockenen Gas in Vol.-%
VK Kopfraumvolumen in ml
VB Volumen des bis zum Zeitpunkt t2 produzierten Biogases in ml
5.6.1.4. Anteil der Gasproduktion des Impfschlammes
∑
Dabei ist
VIS(korr.) Gasvolumen, das aus dem Impfschlamm entwickelt wurde in mlN
∑VIS Summe der Gasvolumina des Versuchs mit Impfschlamm für die betrachtete
Versuchsdauer in mlN
mIS Masse des für die Mischung benutzten Impfschlammes in g
mM Masse des im Kontrollversuch benutzten Impfschlammes in g
5.6.1.5. spezifische auf die Glühverlustmasse (oTS) bezogene
Biogasproduktion
∑
Dabei ist
VS spezifische auf die Glühverlustmasse bezogene Faulgasproduktion während
der Versuchszeit in lN/kgGV
∑VN Netto-Gasvolumen des Substrats für die betrachtete Versuchsdauer in mlN
m Masse des eingewogenen Substrats in g
wT Trockenrückstand der Probe in %
wV Glühverlust der Trockenmasse der Probe in %
46
6. Ergebnisse
6.1. Kultivierung der Weißfäulepilze
6.1.1. Waldpilz
Die Kultivierung der Waldpilzprobe war auf den Standardmedien Malzextrakt-Agar
und –Bouillon problemlos möglich. Der Waldpilz bildete anscheinend durch
Querteilung Hefen. Zusätzlich waren unter dem Mikroskop stäbchenförmige
Bakterien zu erkennen (Abb. 16). Die Besiedelung der Platten erfolgte innerhalb von
3 Tagen.
Abbildung 15: Waldpilz und Bakterien nach 3 d in 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme mit Digitalkamera)
Die Pilzzellen waren oval bis zylindrisch und 5 bis 10 µm lang (Abb. 17).
Abbildung 16: Waldpilz nach 21 d bei 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme über die PC-Anwendung NIS-Elements)
47
6.1.2. Pleurotus ostreatus Stamm 1833
Wie schon erwähnt, wurden für die Anzucht mehrere Monate alte Stammplatten
benutzt, die im Brutschrank bei 25 °C lagerten. Diese Platten waren dicht mit einem
weißen Mycel besiedelt. Nachdem Animpfen neuer Platten bildete sich zunächst ein
weißes Pilzmycel, das sich nach drei Tagen grün färbte (Abb. 18).
Abbildung 17: Grünschimmelbefall (7 d alte Kultur)
Hiervon wurde ein Probe unter dem Mikroskop bei 1000-facher Vergrößerung
analysiert (Abb. 19). Auf dem Foto sind hauptsächlich Konidien mit einem
Durchmesser von ca. 1,8 µm zusehen. Desweiteren ist der Konidienträger
(Konidiophor) mit seinen Phialiden zusehen. Phialiden sind flaschenförmige Zellen,
die Konidien bilden.
Abbildung 18: Mikroskopische Aufnahme von Konidiophoren und Phialiden bei 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme über die PC-Anwendung NIS-Elements)
48
In der Malzextrakt-Bouillon bildete sich ein aufschwimmendes Pilzmycel aus, das
sich nicht grün färbte sonder weiß blieb und recht kompakt war (Abb. 20).
Abbildung 19: Pilzmycel nach 7 d Wachstum in Flüssigmedium
Dieses Pilzmycel wurde zum Animpfen von ligninhaltigen Substraten benutzt. Mit
dem Ergebnis, dass es zu keinem Mycelwachstum kam oder sich Grünschimmel
bildete. Diese Versuchsreihen wurden abgebrochen und nicht weiter ausgewertet
Die über das Internet beschaffte Körnerbrut des Austernseitlings wurde benutzt, um
ligninhaltiges Substrat direkt damit anzuimpfen bzw. Stammkulturen auf Malzextrakt-
Agar-Platten und in Malzextrakt-Bouillon zu züchten. In allen Fällen kam es zu einem
schnellen Mycelwachstum, sodass die Platten und Kolben innerhalb von 4 Tagen
dicht bewachsen waren. Auch in den ligninhaltigen Substraten bildete sich schnell
ein dichtes Mycel aus. Das Pilzmycel war zunächst weiß mit einem fädigen
Luftmycel. Jedoch kam es bei älteren Kulturen zur Bildung dunkelbrauner bis
schwarzer Konidien (Abb. 21). Dieser Schwarze Köpfchenschimmel trat dann auch
bei anderen Pilzkulturen auf, die von der Körnerbrut stammten, sondern von anderen
Stammkulturen.
Abbildung 20: Pilzmycel in Malzextrakt-Bouillon; links eine 6 d alte Kultur mit weißen Mycel und rechts eine 8 d alte Kultur mit schwarzen Konidien
49
Eine nähere mikroskopische Betrachtung bei einer 1000-fachen Vergrößerung zeigt
kugelförmige Sporenträger (Sporangien), die auf Abbildung 22 und 23 zu sehen sind.
Abbildung 21: Auf der linken Seite ist eine Sporangie bei 1000-facher Vergrößerung zu sehen (Aufnahme mit Digitalkamera), Rechts ist ein Bildausschnitt dieser Sporangie bei 1000-facher Vergößerung mit Größenangaben abgebildet (Aufnahme mit PC-Anwendung NIS-Elements)
Abbildung 22: geschlossene Sporangie bei 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme mit PC-Anwendung NIS-Elements)
50
Das Mycel des Pleurotus ostreatus, der sich in der 5 l Schottflasche auf dem
Dachboden befand, verhielt sich nach Kultivierung auf den Nährmedien ganz anders.
Das Wachstum war wesentlich langsamer als bei den anderen Pilzkulturen. Die
Besiedelung einer Malzextrakt-Agar-Platte dauerte 7 bis 10 Tage. Das gebildete
Pilzmycel war weiß und fädig (Abb. 24).
Abbildung 23: Pleurotus ostreatus auf Malzextrakt-Agar; Links eine 15 d alte und Rechts eine 9 d alte Pilzkultur
Eine Konidienbildung wurde bei diesen Platte nicht beobachtet. Betrachtete man das
Pilzmycel bei 1000-facher Vergrößerung, dann waren nur Hyphen ohne Querwände
(Septen) erkennbar (Abb. 25).
Abbildung 24: Mycel des Pleurotus ostreatus bei 1000-facher Vergrößerung (aufgenommen mit PC-Anwendung NIS-Elements); unten links ist der Maßstab für 10 µm und in der Bildmitte die Hyphendicke mit 2,45 µm zu sehen
Pleurotus ostreatus konnte auch im Flüssigmedium sowohl in der Malzextrakt-
Bouillon als auch im Minimalmedium kultiviert werden.
51
6.1.3. Donkioporia expansa Stamm 9690
Der Pilz Donkioporia expansa stand erst ab dem 29.07.2011 zur Verfügung. Das
Mycelwachstum war mit 7 bis 10 d zum Besiedeln einer Agar-Platte zeitlich ähnlich
wie beim Pleuratus ostreatus und sah ebenfalls weiß und fädig aus (Abb. 26).
Abbildung 25: Pilzmycel des Donkioporia expansa nach 6 d Wachstum auf Malextrakt-Agar
Auch dieses Mycel wurde unter dem Mikroskop bei 1000-facher Vergrößerung
betrachtet (Abb. 27).
Abbildung 26: Mycel des Donkioporia expansa bei 1000-facher Vergrößerung (aufgenommen mit der PC-Anwendung NIS-Elements); Die rechte Bildhälfte, die mit der gelben Linie abgetrennt wurde, zeigt eine Probe des Pilzes vom originalen Stamm aus dem Schrägagar und die linke Bildhälfte das Mycel einer bereits ausplattierten Pilzkultur , die von diesem Schrägagar entnommen wurde. Die Maßstabsangabe beträgt 10 µm. Die Mycelbreite 1,75 µm Rechts und 2,08 µm Links, wobei schräg gemessen wurde. Die Verdickungen haben eine Breite von 4,44 µm Links und 5,74 µm Rechts.
Mit den Stammkulturen gelang es frische Pappelholzspäne im 2. Kulturansatz vom
09.08.2011 zu besiedeln. Der 1. Kulturansatzt wurde von Schimmel befallen und
bildete schwarze Konidien.
52
6.1.4. Kultivierung auf ligninhaltigen Substraten
Zur Kultivierung der Pilze auf ligninhaltigen Substraten wurde bei den ersten Versuchsreihen PBS-Puffer mit einen pH-Wert von 5,5
benutzt, um den pH-Wert der Substrate in einen für den Pilz optimalen Bereich zu bringen. Diese Maßnahme wurde bei den weiteren
Versuchen wieder verworfen. Das Mycelwachstum wurde rein optisch beurteilt. Bei den meisten Ansätzen kam es zu Grünschimmelbildung
oder zu keinem sichtbaren Wachstum. Der Ansatz Nr. 2 vom 16.06.2011 bildete zunächst ein dichtes weißes Mycel, das sich durch das
ganze Substrat zog. Jedoch bildeten sich im weiteren Verlauf schwarze Konidien. Dieser Ansatz mit dem dazugehörigen Nullansatz Nr. 1
wurde für eine thermophile Biogasproduktion verwendet. Für einen mesophilen Gäransatz wurden die Kulturen 4 und 5 vom 20.07.2011
verwendet. In diesen Versuchsansätzen wuchs in allen mit Pappelfrischholz Ansätzen ein Pilz, auch im Nullansatz, welcher nicht angeimpft
wurde. In den Versuchsansätze 1 und 2 vom 05.08.2011 sowie im Ansatz 2 vom 09.08.2011, die mit Pilzkulturen angeimpft wurden, konnte
nach 10 bis 15 Tagen ein verstärktes Mycelwachstum beobachtet werden. Das weiße Mycel durchzog nur punktuell ein Teil des Substrats
und blieb bis zum 23.082011 weiß.
In den nachfolgenden Tabellen 2, 3 und 4 werden die Einwaagen, pH-Werte der Substrate und Wasseranteile aufgeführt.
Tabelle 2: Kultivierung von Pleurotus ostreatus und Waldpilz auf ligninhaltigen Substraten mit PBS-Puffer pH 5,5
Nr. Datum Substrat Pilz Leergewicht in g Trockensubstrat in g
pH (20°)
Beginn
PBS-Puffer pH
5,5 in g Impfmasse in g Gesamtgewicht in g
Gewicht nach
autoklavieren in g TS Substrat n %
Wassergehalt der
Einwaagen in %
1 16.06.2011 Pappel Kaminholz ohne 285,36 59,02 6,72 141,9 0 486,28 485,3 100 70,63
2 16.06.2011 Pappel Kaminholz P.O. Körnerbrut 299,46 59,55 6,72 140,34 5 504,35 501,8 100 70,21
3 16.06.2011 Stroh ohne 294,62 10,09 6,15 23,81 0 328,52 321,9 100 70,24
4 16.06.2011 Stroh P.O. Körnerbrut 299,25 10,32 6,15 27,29 5 341,86 338,4 100 72,56
5 16.06.2011 Pappel Kaminholz P.O. aus Boui. v. 07.06. 122,98 10,49 6,72 24,62 20 178,09 175,1 100 70,12
6 16.06.2011 Pappel Kaminholz Waldpilz aus Boui. v. 07.06. 118,4 10,54 6,72 23,32 20 172,26 172 100 68,87
7 16.06.2011 Spelzen ohne 122,66 9,63 5,85 27,87 0 160,16 157,5 100 74,32
8 16.06.2011 Spelzen P.O. Körnerbrut 117,72 9,58 5,85 28,95 5 161,25 159,2 100 75,14
9 16.06.2011 Gärrest ohne Gülle P.O. Körnerbrut 118,68 41,77 8,46 0 5 165,45 164,6 24,63 75,37
10 16.06.2011 Gärrest ohne Gülle ohne 125,65 44,89 8,46 0 0 170,54 168,8 24,63 75,37
53
Tabelle 3: Kultivierung von Pleurotus ostreatus auf ligninhaltigen Substraten mit Leitungswasser am 06.07. und 20.07.2011
Nr. Datum Substrat Pilz Leergewicht in g Trockensubstrat in g pH (20°) BeginnLeitungswasser in gImpfmasse in g Gesamtgewicht in g
Gewicht nach
autoklavieren in g TS Substrat n %
Wassergehalt der
Einwaagen in %
1 06.07.2011 Stroh ohne 282,76 41,78 6,37 78,67 0 403,19 404,38 100 65,31
2 06.07.2011 Stroh P.O. Körnerbrut 287,44 42,81 6,37 78,61 6,6 408,52 409,76 100 64,74
3 06.07.2011 Stroh P.O. Dejan 315,23 42,23 6,37 81,59 4 439,07 439,53 100 65,89
4 06.07.2011 Gärrest ohne Gülle P.O. Körnerbrut 305,84 31 8,55 67,21 3,4 404,03 404,78 100 68,43
5 06.07.2011 Gärrest ohne Gülle P.O. Dejan 302,18 21,26 8,55 40,6 3 364,05 365,55 100 65,63
6 06.07.2011 Pappel Kaminholz P.O. Dejan 116,66 15,56 6,74 30,91 2,7 163,13 162,27 100 66,52
7 06.07.2011 Pappel Kaminholz P.O. Körnerbrut 129,43 14,73 6,74 26,96 3,4 171,16 170,6 100 64,67
Nr. Datum Substrat Pilz Leergewicht in g Trockensubstrat in g pH (20°) BeginnLeitungswasser in gImpfmasse in g Gesamtgewicht in g
Gewicht nach
autoklavieren in g TS Substrat n %
Wassergehalt der
Einwaagen in %
1 20.07.2011 Stroh ohne 283,6 51,27 6,35 105,23 0 440,1 440,1 84,7 72,25
2 20.07.2011 Stroh P.O. original 298,52 51,26 6,35 132,42 28,8 511 482,2 84,7 76,36
3 20.07.2011 Stroh P.O. original 304,69 56,15 6,35 177,66 21,44 559,94 538,5 84,7 79,66
4 20.07.2011 Pappel frisch gehäckselt ohne 293 101,28 6,65 45,52 0 439,8 439,8 68,95 52,43
5 20.07.2011 Pappel frisch gehäckselt P.O. original 283,86 100,8 6,65 50,84 31,3 466,8 435,5 68,95 54,17
6 20.07.2011 Pappel frisch gehäckselt P.O. original 306,33 98,86 6,65 75,51 23,11 503,81 480,7 68,95 60,91
54
Tabelle 4: Kultivierung von Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa auf ligninhaltigen Substraten mit Leitungswasser am 26.07., 05.08. und 09.08.2011
Nr. Datum Substrat Pilz Leergewicht in g frisch dann autoklaviert pH (20°) BeginnLeitungswasser in gImpfmasse in g Gesamtgewicht in g
Gewicht nach
autoklavieren in g TS Substrat n %
Wassergehalt der
Einwaagen in %
1 26.07.2011 Pappel frisch P.O. Dachboden 297,2 168,7 6,65 86 10,8 562,7 558,2 36,87 75,58
2 26.07.2011 Pappel frisch P.O. Dachboden 293,5 160,7 6,65 101,1 10,6 565,9 560,8 36,87 77,37
3 26.07.2011 Pappel frisch ohne 296,9 167,86 6,65 80,84 0 545,6 542,3 36,87 75,11
Nr. Datum Substrat Pilz Leergewicht in g Trockensubstrat in g pH (20°) BeginnLeitungswasser in gImpfmasse in g Gesamtgewicht in g
Gewicht nach
autoklavieren in g TS Substrat n %
Wassergehalt der
Einwaagen in %
1 05.08.2011 Stroh trocken P.O. Dachboden 298,52 30,15 6,35 70,02 38,1 398,69 398,6 100 69,90
2 05.08.2011 Stroh trocken P.O. Dachboden 287,44 29,75 6,35 69,89 34,5 387,08 391,5 100 70,14
4 05.08.2011 Stroh trocken ohne 283,6 33,32 6,35 70,76 0 387,68 405,3 100 67,99
Nr. Datum Substrat Pilz Leergewicht in g frisch mit 40% H2O pH (20°) BeginnLeitungswasser in gImpfmasse in g Gesamtgewicht in g
Gewicht nach
autoklavieren in g TS Substrat n %
Wassergehalt der
Einwaagen in %
1 09.08.2011 Pappel frisch Donkioporia expansa 296,35 86,87 6,65 64,3 19,8 447,52 378,3 68,95 60,38
2 09.08.2011 Pappel frisch Donkioporia expansa 291,18 92,43 6,65 77,1 18,4 460,71 377,8 68,95 62,41
55
6.2. Ligninbestimmung
Als Sollwert für den Ligningehalt wurden für das Stroh 19,8 %, für die Laubhölzer 25,2 %
und für die Nadelhölzer 27,9 % ermittelt (Friedl, 2010).Eine Angabe zum verwendeten
Verfahren zur Ermittlung des Ligningehalts wurde nicht gemacht.
6.2.1. Ligninbestimmung der verwendeten Substrate (nach J. H. Ross, 1933)
Die angegebenen Werte sind Mittelwerte aus mehrfach Bestimmungen. Dem Mittelwert
des Strohs und der Spelzen liegen jeweils 4 Werte zugrunde sowie dem der Sägespäne
und des Pappelholzs jeweils 6 Werte.
Tabelle 5: Soll/Ist-Vergleich der Ligningehalte nach (J. H. Ross, 1933 Volume 92, Numbers 3-4)
Figure 1: Soll/Ist-Vergleich der nach nach (J. H. Ross, 1933 ) ermittelten Ligningehalte
Zusätzlich wurde die Standardabweichung vom Mittelwert als Linie bei den IST-Werten
eingezeichnet.
Spelzen Stroh Pappel(Kaminholz)Sägespäne(Nadelholz)
mittlere gemessene Ligningehalt in % 24,66 28,81 26,48 27,60
Ligningehalt in % laut Literaturangabe 19,8 25,2 27,9
Standardabweichung σ 3,73 9,78 3,02 4,73
56
6.2.2. Ligninbestimmung der verwendeten Substrate in Anlehnung an DIN EN
ISO 13906 (DIN EN ISO 13906, 2008)
In der Tabelle werden die Mittelwerte der Ligningehalte aus jeweils drei Werten
angegeben. Die Tabelle wird in der Grafik Figure 2 dargestellt.
Tabelle 6: Soll/Ist-Vergleich der in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN EN ISO 13906, 2008) ermittelten Ligningehalte
Figure 2: Soll/Ist-Vergleich der in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN EN ISO 13906, 2008) ermittelten Ligningehalte
Stroh Pappel(Kaminholz) Sägespäne(Nadelholz)
mittlere gemessene
Ligningehalt in % 22,90 26,54 29,32
Ligningehalt in % laut
Literaturangabe 19,8 25,2 27,9
Standardabweichung σ 3,01 2,28 1,90
57
6.2.3. Ligninabbau durch Weißfäulepilze
Nachfolgend wurde der Ligninabbau für die zur Biogasproduktion eingesetzten
Pappelholzsubstrate bestimmt. Verglichen wurden die Substrate ohne Pilzbewuchs mit
denen, die mit einem Pilzmycel des Schwarzköpfchen Schimmel durchwachsen waren.
Dem angegebenem Mittelwert liegen 2 Werte zugrunde.
Tabelle 7: Ligninabbau von Pappelholzsubstraten mit und ohne Pilzbewuchs (Schimmelpilz), bestimmt in Anlehnung an DIN EN ISO 13906
Figure 3: Ligninabbau von Pappelholzsubstraten mit und ohne Pilzbewuchs (Schimmelpilz), bestimmt in Anlehnung an DIN EN ISO 13906
Pappel(frisch) Pappel(Kaminholz)
Ligningehalt in %
Nullansatz 21,47 26,30Ligningehalt in %
Substrate mit Pilz
bewachsen 25,06 30,91
Abbauzeit in d 18,00 33,00
Abweichung in % 3,59 4,61
58
6.3. Enzymatische Aktivität
6.3.1. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14)
Als Erstes soll die zugekaufte Lignin-Peroxidase betrachtet werden. Mit ihr wurde versucht
alle vorhandenen Substrate umzusetzen. Die Konzentrationsangaben wurden mit der
Massenkonzentration und dem Molekulargewicht der LiP, das ca 40 kDa beträgt,
berechnet. Zusätzlich wurde das Verhalten des Enzyms bei Temperaturerhöhung
beobachtet. Bei einer Temperatur von 55 °C steigt die Absorption genauso stark an als ob
die 10-fache Menge an LiP verläge. Die Grenze der Erhöhung der Enzymaktivität durch
eine steigende Temperatur ist bei 75 °C erreicht, ab hier fällt die Enzymaktivität stark ab.
Figure 4: ABTS-Oxidation mit gekaufter LiP bei verschiedenen Temperaturen
59
Beim Test des OPD als Substrat für die gekaufte LiP wurde auf eine Änderung der
Temperatur verzichtet, da die Aufnahme des Verlaufs bereits mit ABTS als Substrat
erfolgte. Hier wurde der Kurvenverlauf bei verschiedenen Konzentrationen der LiP über
die Zeit aufgezeichnet.
Figure 5: OPD-Oxidation mit verschiedenen Konzentrationen der gekauften LiP
60
Die gekaufte Lignin-Peroxidase wurde auch mit den Substraten Veratrylalkohol und
Mangansulfat getestet. Hier konnte jedoch keine Änderung der Absorption gemessen
werden.
Die ersten Pilzkulturen in Malzextrakt-Bouillon, welche von den alten Stammkulturen des
des Pleurotus ostreatus stammten aber vermutlich Schimmelpilze waren, wurde auf ihre
enzymatische Aktivität hin untersucht. Es konnte jedoch kein Substratumsatz von OPD,
ABTS oder va gemessen werden und somit auch keine enzymatische Aktiviät. In Figure 4
wird der Messverlauf mit OPD als Substrat beispielhaft aufgezeigt, auf die Darstellung der
anderen Substrate wurde verzichtet. Ein Filtrat aus der Malzextrakt-Bouillon nach 7 und 15
d Wachstumsdauer des Waldpilzes wurde ebenfalls untersucht, auch hier konnte keine
Veränderung der Absorption gemessen werden.
Figure 6: Test der LiP-Aktivität mit OPD
verwendet wurden Filtrate des Pleurotus ostreatus kultiviert aus alten Stammkulturen und aus der Körnerbrut. Daraus sind dann Schimmelpilze in der Malzextrakt-Bouillon angewachsen.
61
Weiterhin wurden noch Pilzkulturen von Pleurotus ostreatus, der aus der Kultur in der 5 l
Schottflasche stammte, und von Donkioporia expansa vermessen. Die erste Enzymprobe
wurde nach 12 d bzw. 8 d beim D.E. im Minimalmedium aus den Medien (Malzextrakt-
Bouillon und Minimalmedium) mit einer Spritze abgezogen. Die selben Pilzkulturen wurden
dann noch einmal nach 22 d Wachstumszeit von P.O. bzw. nach 20 d Wachstumszeit von
D.E. entnommen. Die zeitliche Verlauf der Enzymaktivität wurde in den ersten 5 bzw. 10
Minuten nach dem Start der Reaktion durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid
aufgenommen. Diese Zeit ist ausreichend, um die enzymatische Aktivität zu ermitteln.
Denn diese würde sich innerhalb des linearen Kurvenverlaufs nur um die
Messungenauigkeiten ändern
62
Figure 7: Nachweis der Lignin-Peroxidase in Flüssigkulturen des Donkioporia expansa und Pleurotus ostreatus
63
6.3.2. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13)
Auch hier wurden die Pilzkulturen von Pleurotus ostreatus aus der Kultur in der 5 l Schottflasche und von Donkioporia expansa untersucht.
Untersucht wurden die Enzyme der Pilzkulturen in der Malzextrakt-Bouillon und im Minimalmedium. Die Enzymproben waren identisch mit
denen für den Nachweis der LiP und wurden zuerst nach 12 d bzw. 8 d beim D.E. im Minimalmedium aus den Medien entnommen. Die zweite
Probe wurde nach 22 d Wachstumszeit von P.O. bzw. nach 20 d Wachstumszeit von D.E. analysiert. Auch reichten 5 Messezeit um die
Enzymaktivität zu bestimmen.
Figure 8 : Nachweis Mangan-Peroxidase in Flüssigkulturen Donkioporia expansa und Pleurotus ostreatus
64
6.3.3. Laccase (EC 1.10.3.2)
Die verwendeten Enzymproben sind mit denen im Kapitel 6.3.2 beschriebenen identisch. Nur die Kulturen des P.O. im Minimalmedium zeigen
eine Laccaseaktivität.
Figure 9: Nachweis Laccase in Flüssigkulturen des Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa
65
6.4. Biogasausbeuten
Zu den Biogasausbeuten wird der Verlauf des Methanertrages bezogen auf die organische
Trockensubstanz (bzw. Trockenrückstand) in der Figure 10 graphisch dargestellt. Die
Kopfraumkorrektur wurde berücksichtig, der Wasserdampfanteil herausgerechnet und das
Volumen auf Normwerte umgerechnet. Die Gärtests liefen nicht 35 d, weil zum Ende
dieser Versuche kein weiteres Biogas entstand. Die Gärtests wurden doppelt angesetzt.
Aus Platzgründen erfolgte die thermophile Biogasproduktion nur in 1 l Erlenmeyerkolben.
Bei den thermophilen Ansätzen wurde die Pilze und Nullansätze mit Pappelspänen aus
Kaminholz verwendet. Mesophil wurden mit Pilz bewachsene und unbewachsene
Pappelspäne aus frischen Ästen eingesetzt.
Die mesophilen Ansätze konnten aufgrund der geringen Gasproduktion nur einmal
gemessen werden.
66
Figure 10: Methanerträge aus ligninhaltigen Substraten mit und ohne Pilz
67
7. Diskussion der Ergebnisse
7.1. Kultivierung der Weißfäulepilze
In einer Zuchtanleitung für die Aufzucht von Austernseitlingen auf Holz von
(Gassmann, 2011) wird darauf verwiesen, dass lebend geschlagene Hölzer zu
verwenden sind. Diese Hölzer seien aber erst nach 4 bis 6 Wochen zu verwenden,
da die im Holz enthaltenen Gerbstoffe (Tannine) eine Besiedelung des Holzes durch
den Pilz verhindern könnten. Die verwendeten frischen Pappelhölzer wurden nur
wenige Tage nach dem Schlagen mit Pilzen angeimpft. Diese Hölzer wurden ohne
weiteres von Pilzen besiedelt. Hauptsächlich von Schimmelpilzen aber auch von
Donkioporia expansa. Trotzdem sollte die Hemmung durch Gerbstoffe nicht außer
Acht gelassen und die Hölzer entsprechend vorbereitet werden, vielleicht wäre so ein
schnelleres Mycelwachstum möglich gewesen.
Im weiteren werden die einzelnen Pilzarten hinsichtlich ihrer Zuchtergebnisse auf
den verwendeten Substraten Malzextrakt-Agar, Malzextrakt-Bouillon, Minimalmedium
(insofern verwendet) und ligninhaltige Feststoffe betrachtet.
7.1.1. Waldpilz
Der Waldpilz wuchs problemlos auf dem Malzextrakt-Agar und in der
Malzextraktbouillon. Auf den Agar-Platten und in der Malzextrakt-Bouillon konnte
eine Erstbesiedelung durch Bakterienkolonien beobachtet werden. Hier scheint es
eine Symbiose zwischen Pilz und Bakterien zu geben. Denn diese Kolonien waren
mit Pilz- und Bakterienzellen vermischt und nicht durch irgendwelche toxischen
Ausscheidungen des Pilzes voneinander getrennt. Sie bildeten anscheinend eine
natürliche Mischkultur. Im Laufe der Zeit kam es zu einer starken Zunahme der
Pilzzellen, sodass mit dem Mikroskop nur noch dicht aneinander gedrängte Pilzzellen
zu sehen waren. Durch Zugabe von 50 mg/l Ampicillin in die Malzextrakt-Bouillon
konnte eine Isolierung des Pilzes erreicht werden. Unter dem Mikroskop wurde die
Anwesenheit von Bakterien überprüft. Ein verändertes Hyphenwachstum konnte
durch die Abwehsenheit der Bakterien nicht beobachtet werden. Diese Isolierung war
68
jedoch nicht vollständig. Nach Ausstrich dieser anscheinend isolierten Kultur auf
Medien ohne Ampicillin setzten sich auch wieder Bakterienkulturen durch. Es
mussten also Bakterien die Antibiotikabehandlung überstanden haben, die unter den
Mikroskop aufgrund ihrer geringen Anzahl nicht zu erkennen waren. Auf Stroh und
Pappespäne aus Kaminholz wurde kein Wachstum beobachtet. Die Kulturen wurden
zunächst rein äußerlich beurteilt und einmal nach 12 d mikroskopisch untersucht.
Da sich diese Pilze anscheinend nicht durch Hyphenwachstum vermehren und die
Proben aus der Malzextrakt-Bouillon keine enzymatische Aktivität aufwiesen, ist
dieser Pilz evtl. nicht in der Lage, Holz zu zersetzten oder ihm fehlten die richtigen
Voraussetzungen hierzu. Allerdings müsste die Enzymaktivität des Waldpilzes auf
Minimalmedium untersucht werden. Denn auch die Weißfäulepilze zeigten erst im
Minimalmedium eine Enzymaktivität.
7.1.2. Pleurotus ostreatus
Das eigentliche Hauptaugenmerk lag auf P.O., jedoch gestaltete sich dessen
Anzucht anfangs schwierig. Das Problem war der Befall durch Trichoderma und
andere Schimmelpilze (Schwarzer Köpfchenschimmel). Dieser Grünschimmelbefall
konnte einmal rein optisch an der grünen Färbung des Mycels, aber auch
mikroskopisch durch die Ausbildung der typischen Konidienträger belegt werden
(Abb. 18 und 19). Solange Trichoderma keine Konidien ausbildet, ist sein Mycel nicht
von dem des Pleurotus ostreatus zu unterscheiden (Hyungjong Kwon, 2004). Dies
war anscheinend besonders in den Flüssigmedien der Fall, da ihm dort
wahrscheinlich genügend Nährstoffe zur Verfügung standen. Deshalb wurden
anfangs diese Pilzkulturen für die des Pleurotus ostreatus gehalten und für die
weitere Arbeit wie die Kultivierung auf ligninhaltigen Substraten verwendet. Da auf
den Agar-Platten immer wieder Grünschimmelbefall sichtbar war, wurde ständig
nach der Fehlerquelle gesucht. Die verwendeten Stammkulturen waren mit einem
schneeweissen Mycel bedeckt. Deshalb wurde die Fehlerquelle im Bereich der
Handhabung und Sterilität vermutet. Daraufhin wurden die Geräte, die Sterilbank
sowie der Brutschrank einer gründlichen Reinigung unterzogen und es wurde noch
intensiver darauf geachtet, steril zu arbeiten. Dadurch konnte der
Grünschimmelbefall jedoch nicht verhindert werden. Testplatten, die bis auf das
69
Animpfen mit Stammkulturen identisch behandelt wurden, zeigten keinen Pilz oder
Bakterienbefall. Der Grünschimmel zog sich immer entlang des Plattenausstrichs
und breitete sich nie punktuell aus. Dies lässt vermuten, dass die verwendeten
Stammkulturen mit Konidien des Trichoderma verunreinigt waren. Die Kontamination
könnte beim Öffnen der Platten über die Luftkeime erfolgt sein. Da die Körnerbrut
des Austernseitlings aus dem Pilzzuchthandel eine günstige Alternative darstellte,
wurde mit ihr versucht, Kulturen des Pilzes zu züchten. Da sich diese Pilzkulturen
ganz anders verhielten und zunächst ein weisses Mycel hatten, wurde zunächst
angenommen, dass es sich um Pleurotus ostreatus handelte. Da das Luftmycel
dieser Kulturen sehr ausgeprägt war, was auf Sporangienträger deutet, und nach
einer längeren Wachstumsphase schwarze Konidien bildete (Abb. 21), konnte davon
ausgegangen werden, dass es sich um eine Schimmelart handelte. Die
mikroskopischen Aufnahmen belegen diese Annahme, da hierauf Sporangiosporen
zu sehen sind (Abb. 22). Daher wird vermutet, dass es sich hierbei um
Köpfchenschimmel (Mucor sp.) handelt. Eine Kultur des Pleurotus ostreatus, die sich
verschlossen auf Holzspänendem befand, wurde alternativ als Inokulat verwendet.
Hiervon wurde etwas Mycel zum Animpfen mehrerer Malzextrakt-Agar-Platten
entnommen. Diese Pilzkulturen wuchsen sehr viel langsamer und breiteten sich
sternartig aus. Das Luftmycel war auch nicht so ausgeprägt und auch nach langen
Wachstumsphasen von bis zu 22 d konnte keine Konidienbildung festgestellt werden.
Es wurde angenommen, dass es sich hierbei um Reinkulturen des Pleurotus
ostreatus handelte. Diese Pilzkulturen wurden weiter angezüchtet und unter anderem
auf ligninhaltige Substrate überimpft. Bei den frischen Pappelhölzern, konnte sich
aber wiederum ein Köpfchenschimmel durchsetzen. Der Köpfchenschimmel befiel
auch den Nullansatz. Es wird davon ausgegangen, dass sich seine Konidien bereits
auf dem Holz befanden und das Autoklavieren des Substrates nicht ausreichend war,
um ihn abzutöten. Die am 05.08.2011 mit Pleurotus ostreatus angeimpften
Strohmedium wurden augenscheinlich vom gewünschtem Pilz bewachsen, da diese
Mycelien bisher keine Konidien bildeten und der Nullansatz keine Pilzbewuchs zeigt.
Dieses Substrat konnte nicht mehr für eine Biogasproduktion verwendet werden, da
hierfür nicht mehr genügend Zeit zur Verfügung stand.
70
7.1.3. Donkioporia expansa
D.E. konnte sowohl auf Malzextrakt-Agar, als auch in den Flüssigmedien kultiviert
werden. Ein Vergleich der mikroskopischen Aufnahmen vom Mycel der original
Kulturen aus dem Schrägagar mit den daraus inokulierten Stammkulturen zeigt die
selbe Wuchsform (Abb. 27).
Das Hypenwachstum des D.E. ist ähnlich schnell oder langsam wie das des P.O..
Dies wird daran liegen, dass sie unter natürlichen Bedingungen auf Holz wachsen.
Dort gelangen sie nur schwer an die benötigten Nährstoffe und haben ihren
Stoffwechsel darauf angepasst. Da sie bei der Verwertung von Holz konkurrenzlos
sind, ist ein schneller Stoffwechsel auch nicht notwendig
Die mit D.E. bewachsenen Pappelspäne konnten aufgrund der verbliebenen Zeit
nicht mehr für einen Gärtest verwendet werden.
7.2. Ligninbestimmung
Da die Ligninabbauleistung der Pilze festgestellt werden soll, wurden im Grunde zwei
gravimetrische Verfahren getestet. Wie schon erwähnt wurde auf die optische
Beurteilung durch Einfärben des Lignins verzichtet, da mit ihr ein quantitativer
Vergleich nicht möglich wäre. Bei dem verwendetem Verfahren zur Bestimmung des
Ligningehalts wird das Ligninpolymer nicht in seiner Gesamtheit erfasst. Denn es
wird bei den angewendeten Verfahren hydrolisiert, sodass Bestandteile verloren
gehen können und andere schwer abbaubare Stoffe mit erfasst werden (Falk Saupe,
2003). Das gesamte Lignin könnte evtl. durch ein biologisches Verfahren mit
Rotfäulepilzen, die nur die Cellulose und Hemicellulose abbauen, bestimmt werden
(Friedl, 2010). Aufgrund der unterschiedlichen Pflanzenzusammensetzung, die
Standort-, Nährstoff- und Witterungsabhängig ist, sind in der Literatur schwankende
Angaben zum Ligningehalt zu finden. Dies tritt besonders stark bei der
Ligninbestimmung (ADL-Gehalt) von Futtermitteln und Grünpflanzen auf. Auch ein
homogenes Stoffgemisch kann nicht immer sichergestellt werden, so kann bei
Ganzpflanzensubstraten aus Holz mal mehr oder weniger Rinde enthalten bzw. bei
denen aus Getreide kann die Masse der enthaltenen Samen unterschiedlich sein.
71
7.2.1. Ligninbestimmung nach (J. H. Ross, 1933 Volume 92, Numbers 3-
4)
Die Ligninbestimmung nach Ross lieferte gute Ergebnisse. Besonders im Vergleich
zu den Literaturangaben der Hölzer betrugen den Abweichungen nur 1,28 % bei den
Laubhölzern und 0,3% bei den Nadelhölzern. Bei den Literatur angaben wurde keine
Aussage zum angewendeten Verfahren gemacht mit dem der Ligningehalt bestimmt
wurde.
Ein Vergleich der ermittelten Werte untereinander ist schwierig, da diese Werte stark
schwankten. Besonders beim Stroh lag die Standardabweichung vom Mittelwert mit
9,78 besonders hoch. Aber auch die Standardabweichung der Nadelhölzer mit 4,73
und der Laubhölzer mit 3,02 sind recht hoch, sodass ein Abbaugrad des Lignins
schwer vergleichbar wäre.
Bis halbwegs gute Ergebnisse erreicht wurden, bedurfte es viel Übung. Am
wichtigsten war es, das Filtrat nach dem Hydrolysieren säurefrei zu waschen. Es
sollte solange gespült werden bis die Schwefelsäurereaktion aufhört (J. H. Ross,
1933). Da aber keine Reaktion beobachtet werden konnte wurde der pH-Wert als
Parameter für das Beenden des Spülens gewählt. Wurde das Filtrat nicht säurefrei
gewaschen, was passiert ist, weil anfangs alte Indikatorstreifen zur Bestimmung des
pH-Werts benutzt wurden, erhöhte sich das Filtergewicht. Weiterhin stellte es sich als
schwierig heraus die Cellulosefilter zu trocken, ohne dass sie ein wenig verbrannten.
Der Umstand, dass das ligninhaltige Substrat mit 72 %-iger Schwefelsäure gekocht
werden muss, macht dieses Verfahren schwieriger in der Handhabung. Denn es
konnten nur wenige Proben gleichzeitig abgearbeitet werden. Das Kochen war
ständig zu beobachten, um zu sehen ob die Apparatur noch dicht ist. Aus diesen
Gründen empfiehlt es sich, dieses Verfahren nicht für große Probemengen zu
benutzten.
7.2.2. Bestimmung des Ligninanteils in Anlehnung an DIN EN ISO 13906
(65..120, 2008)
Dieses Verfahren wurde gleich zu Beginn stark abgeändert, um es so einfach wie
möglich zu halten. Die Bestimmung des ADF-Gehalts wurde ausgelassen, weil der
72
Fokus auf den ADL-Gehalt lag. Für spätere Untersuchungen wäre der ADF-Gehalt
allerdings ein Indikator für die Abbauleistung der Hemi- und Cellulose. Ebenso wurde
auf einen Vergleich mit vollständig nach der DIN-Norm abgearbeiteten Proben
verzichtet, da Literaturwerte zur Verfügung standen und der benötigte Frittentiegel
(Porengröße 40 bis 60 µm) nicht benutzt werden konnte. Die Filtertiegel wurden wie
erwähnt durch Glasfaser Vorfilter Bestell-Nr.: 13430-130-G von der Fa. Sartorius AG
ersetzt, da sie Hitzebeständig sind und dabei ihr Eigengewicht kaum verändern. Eine
Angabe zur Porenweite der Glasfaserfilter wird durch den Hersteller nicht gemacht.
Deshalb wurde durch Probieren geklärt, ob die Filterleistung ausreichend ist. Was
der Fall war.
Dieses Verfahren lieferte sehr gut Ergebnisse und wurde daher auch zur
Bestimmung der Abbauleistung genutzt. Die Literaturwerte konnten ähnlich gut, wie
nach der Methode von (Ross, 1933), ermittelt werden. Entscheidend ist aber die
Tatsache, dass die Standardabweichung um den Mittelwert mit 3,01 beim Stroh, 2,28
beim Pappelholz und 1,90 beim Nadelholz geringer ausfielen und ein Vergleich
verschiedener Proben genauer ausfallen würde als bei der Methode nach Ross,
1933. Hinzu kommt eine Arbeitserleichterung, Zeitersparnis und höhere
Arbeitssicherheit. Das Extrahieren und Kochen fällt weg und auf der Rührerplatte
konnten bis zu 16 Proben gleichzeitig 3 h gerührt werden. Laut DIN-Norm ist kein
ständiges Rühren notwendig, dies wurde aber nicht ausprobiert. Die Extraktion der
leicht löslichen Bestandteile könnte evtl. bei Gräsern, Futtermitteln oder beim Gärrest
notwendig werden, da sich in diesen Substraten mehr Proteine und leicht lösliche
Kohlenhydrate befinden als in den in dieser Arbeit untersuchten Substraten.
7.2.3. Ligninabbau durch Weißfäulepilze
Ein Ligninabbau der mit Pilz bewachsenen ligninhaltigen Substrate konnte nicht
festgestellt werden. Die Werte des Ligningehalts bestimmt in Anlehnung an (DIN EN
ISO 13906, 2008) waren nach dem Bewuchs durch Pilze lagen höher als die vor der
Behandlung ermittelte Ligningehalte. Das frische Pappelholz hatte einen 3,59 % und
das Kaminpappelholz einen 4,61 % höheren Ligningehalt nach dem Bewuchs mit
den Pilzen. Diese Werte liegen aber im Bereich der ermittelten Varianz. Der Grund
für die Varianz wird in der Probenzusammensetzung liegen und auch an dem
73
Verfahren selbst. Ein Abbau des Lignins konnte im Nachhinein auch nicht erwartet
werden, da die untersuchten Materialien ausschließlich mit Schimmelpilzen
bewachsen waren, was unter dem Mikroskop überprüft wurde.
Generell ist festzuhalten, dass für einen Vergleich der Weißfäulepilze untereinander
ein Ligninabbau von mindestens 5 % stattfinde müsste, damit diese Änderung mit
dem Verfahren in Anlehnung an die DIN EN ISO 13906 als Ligninabbau
wahrgenommen wird, Denn die in den Versuchen zur Ligninbestimmung in
Anlehnung an DIN EN ISO 13906 ermittelte Standardabweichung von ca. 2, hat eine
Varianz von 4 % zur Folge. Damit müsste die Abbauleistung der Pilze größer als 5 %
sein, um einen Ligninabbau feststellen zu können.
7.3. Enzymatische Aktivität
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität beschränkte sich auf die wichtigsten
bekannten Lignin abbauenden Peroxidasen: Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14),
Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13) und Laccase (EC 1.10.3.2).
Allgemein lässt sich festhalten, dass sich das Minimalmedium sehr gut eignete, um
die Produktion von Peroxidasen zu provozieren. Die Aufarbeitung der Enzymproben
ist dagegen noch verbesserungswürdig, da anscheinend zu wenig Enzym in der
Probe war bzw. war beim Nachweis der Mangan-Peroxidase die Extinktion zu hoch,
was an Bestandteilen der Nährlösung liegen könnte. Als Maßnahme zur
Aufkonzentration wird häufig auch die Ultrafiltration der Probe beschrieben unter
anderem von (Falk Saupe, 2003). Weiter ist es möglich, die Enzyme mittels einer
Säulenchromatographie abzutrennen. Es wurde auch von (Ulbricht, 2001)
beschrieben die Substrate oder Pilzmycele in dem zur photometrischen Analyse
verwendetem Puffer zu eluieren und anschließend die Pufferlösung durch einen
Spritzenfilter zu filtrieren.
Die ersten Pilzkulturen zeigten keine Peroxidaseaktivität, da es sich bei ihnen
vornehmlich um Schimmelpilze handelte.
74
7.3.1. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14)
Durch den Kauf der Lignin-Peroxidase konnten ABTS, OPD und va als Substrat
getestet und mit einander verglichen werden. Da bei Sigma-Aldrich keine Angabe zur
Herkunft des Enzyms gemacht wurde, musste das Molekulargewicht mittels SDS-
PAGE (englisch: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
bestimmt werden. Hierzu wurden 10 µl der 1 g/l LiP-Lösung zusammen mit
Laufpuffer in eine Tasche des Sammelgels aufgetragen. Nach Durchlaufen und
Einfärben des Trenngels, konnte mithilfe Molekulargewichtsmarker eine Proteingröße
von ca. 40 kDa abgelesen werden. Damit könnte die LiP von Phanerochaete
chrysosporium stammen.
Der Veratrylalkohol und das Mangansulfat sprachen nicht auf die LiP an. Trotz
verschiedenster Variationen von LiP-Konzentration und Substratmenge, konnte keine
merkliche Änderung der Absorption aufgezeichnet. werden. Auch eine Oxidation des
ABTS ohne die Zugabe von Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor war nicht
möglich. Die Pufferlösung des Veratrylalkohols könnte evtl. von pH 2,5 auf 3,0
geändert werden oder in der Lösung befinden sich noch störende Bestandteile aus
dem Medium.
ABTS erschien aufgrund der Absorptionszunahme als Substrat für den LiP-Nachweis
besser geeignet als OPD. Weiterhin kann es auch für die Laccase verwendet
werden. Negativ beim ABTS ist, das der Kurvenverlauf des Absorptionsmaßes nur
einen geringen linearen Anteil hat. Was sich wiederum nachteilig auf die
Nachweisempfindlichkeit auswirken kann. Dagegen verläuft die Änderung der
Absorption durch aus OPD gebildete Radikale wesentlich linearer.
In der Dissertation von (Falk Saupe, 2003) wird OPD aufgrund der linearen
Kurvenverläufe als das optimale Substrat angesehen.
Durch Variation der Probentemperatur konnte die Nachweisempfindlichkeit deutlich
gesteigert werden. Das Temperaturoptimum lag dabei bei 55 °C und das
Temperaturmaximum bei 75 °C, so wie es auch bei (BRENDA, 2011) angegeben ist.
Beim Kurvenverlauf der bei 75 °C vermessenen Probe ist mit der Zeit ein deutlicher
Einbruch zu sehen, da das Temperaturmaximum anscheinend zu lange auf das
Enzym einwirkte oder die Temperatur durch messtechnisch bedingte
Temperaturschwankungen. kurzzeitig über 75 °C lag, wodurch das Enzym
denaturierte.
75
Für den Enzymnachweis der tatsächlichen P.O.-Kulturen und der D.E.-Kulturen
wurde nur noch ABTS als Substrat eingesetzt. Ein geringfügiger Nachweis von LiP
gelang nur bei der 20 Tage alten Kultur des D.E. im Minimalmedium. Laut (Ottow,
2011) soll P.O. lediglich MnP und Laccase als Lignin abbauende Enzyme
produzieren.
7.3.2. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13)
Die gekaufte Lignin-Peroxidase konnte Mangansulfat als Substrat nicht umsetzen.
Bei der Bestimmung der MnP-Aktivität störte die Eigenabsorption des
Flüssigmediums. Es wurde versucht diese Absorption des Nährmediums über den
Blindwert abzuziehen. Indem beim Blindwert die Probe nicht durch Pufferlösung
sondern durch Nährmedium ersetzt wurde. Dies Führte jedoch zu einem negativem
Absorptionsmaß, welches sich im Laufe der Zeit auch nicht veränderte.
Den Pilzkulturen des D.E. und P.O. in den Zellkulturflaschen im Minimalmedium
konnte sowohl nach 12 d bei P.O. und nach 8 d bei D.E. als auch nach 22 d bei P.O.
und nach 20 d bei D.E. eine MnP-Aktivität nachgewiesen werden. Die
Enzymausschüttung der beiden Pilze ist dabei sehr ähnlich. In der Malzbouillon
konnte nach 8 bzw. 12 d keine MnP nachgewiesen werden. Erst nach 20 bzw. 22 d
ist MnP im Medium messbar. Wahrscheinlich wurden die Nährstoffe aufgebraucht
und die Pilze so gezwungen MnP zu produzieren, um sich mit ihrer Hilfe andere
Nährstoffquellen zu erschließen. Einen zusätzlichen Effekt könnte die Tatsache
haben, dass durch die Probenahme und Verdunstung, bzw. nimmt der Pilz beim
Wachstum Wasser auf, eine Aufkonzentration der Enzyme erfolgte. Dieser Effekt der
Aufkonzentration könnte sich bei dem Minimalmedium stärker ausgewirkt haben.
Denn hier wurde bereits zu Anfang MnP produziert und es sieht so aus als ob bei der
zweiten Messung mehr MnP vorliegt. Wahrscheinlicher ist, dass diese nun nur
konzentrierter vor lag. Für diese Pilzkulturen wurde das gleiche Volumen an
Nährmedium eingesetzt und auch die Animpfmasse war identisch. Ein Vergleich der
Pilze untereinander zeigt, dass die Produktionsraten der MnP dicht beieinander
liegen. Beim P.O. konnte ein höherer Verlauf der der Absorption aufgezeichnet
werden. Was aber dadurch bedingt sein könnte, dass die Kulturen des P.O. zum
Zeitpunkt der Messung 4 bzw. 2 Tage älter waren. Hinzu kommen noch
76
Abweichungen aufgrund von Messungenauigkeiten. In der Quellen (Sovan Sarkar,
1996) wird die MnP des P.O. als Isoenzym beschrieben, das ein und dieselbe
Reaktion vermittelt aber in verschiedenen Formen auftritt. So ist dem Pilz evtl. eine
bessere Regulation des Substratabbaus möglich.
Ob P.O. durch dieses Isoenzym einen bessere Ligninabbauleistung hat, konnte nicht
geklärt werden, da der Vergleich der Abbauleistungen nicht gelang.
7.3.3. Laccase (EC 1.10.3.2)
Aufgrund der Literaturangaben wurde zumindest bei P.O. ein Nachweis der Lacc.
erwartet.
Nur den P.O.-Kulturen im Minimalmedium konnte die Anwesenheit von Lacc.
nachgewiesen werden. Mit zunehmenden alter der Pilzkultur wurde eine höhere
Absorption aufgezeichnet. Dies könnte aber, wie schon bei der MnP begründet, an
der Aufkonzentration des Mediums liegen.
7.4. Biogasproduktion
Bei der Biogasproduktion sollte durch den Ligninabbau die Cellulose und
Hemicellulose für die am Biogasprozess beteiligten Bakterien besser zugänglich
werden. Diese Voraussetzungen konnten nicht geschaffen werden, da nachweislich
Schimmelpilze die zur Biogasproduktion eingesetzten Substrate besiedelten. In
diesem Zusammenhang konnte auch kein Ligninabbau festgestellt werden. Die
Gärtests erfolgten aber trotzdem, da sie als Blindprobe Auskunft darüber geben, ob
sich evtl. auch Schimmelpilze positiv auf den Biogasprozess auswirken.
Referenzsubstrate sollten verdeutlichen, dass der benutzte Impfschlamm aktiv war.
Bei den thermophilen wurde 90 % Maissilage und 10 % GPS verwendet, weil diese
Substrate auch auf der Anlagen, von der der Impfschlamm stammte, eingesetzt
werden. Cellulose diente bei den mesophilen Ansätzen als Referenzansatz.
Cellulose wird von (VDI-Richtlinien, 2004) als Referenz empfohlen.
Der Referenzwert der Mais-/GP-Silage liegt 140 lN/KgoTR weit unter dem Literaturwert
339 lN/KgoTR von der (KBTL,2011).
77
Mit dem unbehandelten Pappelholz konnte im thermophilen Bereich ein besseres
Ergebnis erzielt werden als im mesophilem Bereich. Bei mesophilen Temperaturen
konnte wiederum aus dem mit Pilz bewachsenen Pappelholz mehr Methan
gewonnen werden als aus dem unbehandelten.
8. Fazit/Ausblick
Die Pilzkultivierung legt den Grundstein für die weiteren Analysen und ist wichtig für
den Ligninabbau. Sie gestaltete sich schwieriger als anfangs angenommen. Im Laufe
der Zeit konnten die Probleme behoben werden und die Handhabung wurde leichter.
Es ist grundsätzlich darauf zu achten, dass frische Pilzkulturen zur Verfügung stehen
und Besiedelungen durch Schimmelpilze vermieden bzw. erkannt werden. Durch den
Schimmelbefall erhielt man ein besseres Verständnis für die Notwendigkeit des
sterilen Arbeitens. Denn ein Schimmelbefall kann viel Zeitkosten, wenn Pilzkulturen
neu angesetzt werden müssen. Denn Bei den Weißfäulepilzen kann mit einer Dauer
von 7 d bis 10 d zum bewachsen einer Agar-Platte gerechnet werden. Beim
besiedeln ligninhaltiger Substrate kann dies, abhängig von der Substrat- und
Animpfmenge, entsprechend länger dauern. Auch das besiedeln der Substrate wie
Stroh oder Pappel funktionierte mit aktiven Pilzkulturen und befolgen der
Zuchtanleitung, jedoch schwieriger. Hier sind evtl. andere Möglichkeiten für die
Aufzucht zu finden. In (Hyungjong Kwon, 2004) wird häufig die Aufzucht in großen
Plastiksäcken beschrieben. Vielleicht eignet sich diese Variante besser.
Zur Messung der enzymatischen Aktivität sollten andere Aufreinigungsverfahren als
die Angewandte benutzt werden. Da eine Aufkonzentration der Probe die
Nachweisempfindlichkeit erhöht. Die von (Ulbricht, 2001) bereits erwähnte
Aufreinigung ist gut geeignet, um die Enzymaktivität der Pilze auf Feststoffen zu
untersuchen. Hier wird bewachsenes Substrat in Pufferlösung eluiert, was sich auch
die Eigenabsorption durch das Nährmedium verhindert.
Die Frage, ob ein Ligninabbau die Biogasausbeuten steigert, konnte leider nicht
geklärt werden. Da kein Material zur Verfügung stand in dem es zum Ligninabbau
kam. Dies werden wohl erst weitere Untersuchungen klären können.
Wie eingangs erwähnt sind Lignocelluloseprodukte gefragte Rohstoffe mit
vielseitigen Einsatzmöglichkeiten. Auch in diesem Bereich wären weitere
Forschungen denkbar, um Möglichkeiten zu finden diese Rohstoffe mithilfe von
lignocellulytischen Enzymen der Pilze zugänglich zu machen.
78
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VDI-Richtlinien, 2004. Entwurf VDI 4630 Vergärung organischer Stoffe, s.l.: VDI.
Prof. Dr. Ulrich Zaiß, Gespräch vom 27.07.2011 um 10.00 Uhr
82
10. Anhänge
10.1. Tabellen
Tabelle 8: Ligninbestimmung nach (Ross, 1933)
Die Rot markierten Werte wurden nicht berücksichtigt, das es sich um Ausreißer aufgrund verbrannter Cellulosefilter handelte.
Substrat Substrat in g Filter1 (Ecke fehlt) in g Filter 2 in g Filter1 trocken in g Filter2 trocken mit Rückstand in g Ligningehalt in % Mittelwert Standardabweichung
Spelzen 1,06 1,722 1,757 1,63 2,12 29,36
Spelzen 1,01 1,826 1,809 1,759 2,073 21,01
Spelzen 1,01 1,759 1,809 1,826 2,073 21,01
Spelzen 1,005 1,745 1,789 1,698 2,115 27,28
Stroh 1,03 1,739 1,759 1,64 2,28 45,55
Stroh 1,01 1,713 1,78 1,717 2,067 23,29
Stroh 1,01 1,717 1,78 1,713 2,045 21,11
Stroh 1,02 1,744 1,775 1,675 2,085 25,31
Sägespäne 1,07 1,713 1,807 1,66 2,24 35,62
Sägespäne 1,01 1,795 1,698 1,815 1,999 24,67
Sägespäne 1,01 1,795 1,698 1,775 1,999 24,67
Sägespäne 1,04 1,784 1,711 1,764 2,102 32,61
Sägespäne 1,003 1,811 1,797 1,788 2,099 24,94
Sägespäne 1,005 1,79 1,829 1,776 2,113 23,10
Pappel 1,01 1,82 1,819 1,815 2,187 31,31
Pappel 1,01 1,815 1,819 1,82 2,144 27,05
Pappel 1,02 1,865 1,785 1,845 2,118 27,57
Pappel 1,03 1,737 1,814 1,466 1,865 -0,08
Pappel 1,002 1,797 1,769 1,765 2,056 23,47
Pappel 1,008 1,809 1,812 1,763 2,096 23,03
Pappel 1,03 1,737 1,814 1,466 1,865 -0,08
27,60 4,73
26,48 3,02
24,66 3,73
9,7828,81
83
Tabelle 9: Ligninbestimmung in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (65..120, 2008)
Probe
Einwaage in g
(Partikelgröße
<0,25mm)
Filtergewicht leer
in g
(Glasfaserfilter) Filter2 trocken mit ligninF2 nach GV Ligningehalt [%] Mittelwert Standardabweichung
Pappel (Kaninholz) 0,987 2,613 2,865 2,532 29,72
Pappel (Kaninholz) 1,002 2,595 2,862 2,568 25,38 26,54 2,28
Pappel (Kaninholz) 1,001 2,619 2,834 2,549 24,51
Sägespäne (Nadelholz) 1,005 2,61 2,863 2,553 26,90
Sägespäne (Nadelholz) 0,997 2,589 2,871 2,537 29,52 29,32 1,90
Sägespäne (Nadelholz) 1,006 2,599 2,869 2,512 31,54
Stroh 0,996 2,62 2,878 2,569 27,04
Stroh 1,035 2,62 2,842 2,578 21,67 22,90 3,01
Stroh 1,023 2,618 2,843 2,599 19,97
84
Tabelle 10: Ligninabbau durch Weißfäulepilze
Probe Zeit des Ligninabbaus in d
Einwaage in g
(Partikelgröße
<0,25mm)
Filtergewicht leer
in g
(Glasfaserfilter) Filter2 trocken mit ligninF2 nach GV Ligningehalt [%] Mittelwert
Pappel frisch+P.O. v. 20.07.
(dann mesophil fermentiert) 18 1,075 2,624 2,873 2,571 24,40
Pappel frisch+P.O. v. 20.07.
(mesophil fermentiert) 18 0,981 2,591 2,837 2,545 25,72 25,06
Pappel frisch unbehandelt 0 1,023 2,605 2,854 2,552 25,64
Pappel frisch unbehandelt 0 0,992 2,594 2,794 2,541 21,51 23,57
Pappel frisch v. 20.07.
Nullansatz mit Schimmel
(mesophil fermentiert) 18 0,981 2,61 2,83 2,561 23,38
Pappel frisch v. 20.07.
Nullansatz mit Schimmel
(mesophil fermentiert) 18 1,09 2,619 2,83 2,577 19,57 21,47
Pappel Kaminholz unbehandelt 0 1,031 2,623 2,885 2,566 27,09
Pappel Kaminholz unbehandelt 0 1,03 2,617 2,842 2,551 24,40 25,75
Pappel Kaminholz Nullansatz v.
16.06. (thermophil fermentiert) 33 0,928 2,62 2,843 2,558 26,44
Pappel Kaminholz Nullansatz v.
16.06. (thermophil fermentiert) 33 0,911 2,603 2,824 2,546 26,16 26,30
Pappel Kaminholz+P.O. v.
16.06. (thermophil fermentiert) 33 1,036 2,602 2,965 2,546 36,62
Pappel Kaminholz+P.O. v.
16.06.(thermophil fermentiert) 33 0,981 2,62 2,843 2,556 25,21 30,91
85
Tabelle 11: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,0025 mM und 0,000625 mM
Zusammensetzung in ml Volumen Zusammensetzung in ml Volumen
Puffer Probe Substrat H2O2 Puffer Probe Substrat H2O2
0,695 0,1 0,2 0,005 1 0,77 0,025 0,2 0,005 1
Massekonzentration
Enzym mg/l 100
Stoffmenge Enzym in
mM/l 0,0025
Massekonzentration
Enzym mg/l 25
Stoffmenge
Enzym in mM/l 0,000625
Zeit in min Blindwert Lip mit ABTS
Lip gekauft 0,0025 mM
mit ABTS
Konzentration Produkt
µmol/l
Enzymaktivität
U/ml [µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivität
U/mg
[μmol/min·mg] Blindwert Lip mit ABTS
Lip 0,000625mM
mit ABTS
Konzentration
mol/l
Enzymaktivität
U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivität
U/mg
[μmol/min·mg]
0 1,205 1,346 0,141 4,81 1,218 1,218 0 0,00
1 1,204 1,426 0,222 7,58 0,028 0,276 1,219 1,22 0,001 0,03 0,001 0,055
2 1,202 1,485 0,283 9,66 0,021 0,208 1,219 1,243 0,024 0,82 0,031 1,256
3 1,202 1,535 0,333 11,37 0,017 0,171 1,212 1,252 0,04 1,37 0,022 0,874
4 1,203 1,565 0,362 12,35 0,010 0,099 1,214 1,262 0,048 1,64 0,011 0,437
5 1,202 1,591 0,389 13,28 0,009 0,092 1,214 1,271 0,057 1,95 0,012 0,491
6 1,204 1,619 0,415 14,16 0,009 0,089 1,216 1,282 0,066 2,25 0,012 0,491
7 1,202 1,635 0,433 14,78 0,006 0,061 1,214 1,291 0,077 2,63 0,015 0,601
8 1,203 1,651 0,448 15,29 0,005 0,051 1,215 1,301 0,086 2,94 0,012 0,491
9 1,204 1,668 0,464 15,84 0,005 0,055 1,212 1,31 0,098 3,34 0,016 0,655
10 1,202 1,743 0,541 18,46 0,026 0,263 1,214 1,349 0,135 4,61 0,051 2,020
15 1,202 1,758 0,556 18,98 0,005 0,051 1,214 1,356 0,142 4,85 0,010 0,382
20 1,202 1,823 0,621 21,19 0,022 0,222 1,214 1,397 0,183 6,25 0,056 2,239
25 1,204 1,88 0,676 23,07 0,019 0,188 1,214 1,435 0,221 7,54 0,052 2,075
30 1,204 1,922 0,718 24,51 0,014 0,143 1,219 1,469 0,25 8,53 0,040 1,584
35 1,205 1,959 0,754 25,73 0,012 0,123 1,219 1,502 0,283 9,66 0,045 1,802
40 1,205 1,989 0,784 26,76 0,010 0,102 1,22 1,535 0,315 10,75 0,044 1,747
50 1,205 2,038 0,833 28,43 0,017 0,167 1,218 1,593 0,375 12,80 0,082 3,276
60 1,204 2,062 0,858 29,28 0,009 0,085 1,22 1,637 0,417 14,23 0,057 2,294
70 1,206 2,081 0,875 29,86 0,006 0,058 1,22 1,678 0,458 15,63 0,056 2,239
80
90
100 1,205 2,1 0,895 30,55 0,007 0,068 1,224 1,755 0,531 18,12 0,100 3,986
110
120
130 1,208 2,1 0,892 30,44 0,000 1,228 1,796 0,568 19,39 0,051 2,020
86
Tabelle 12: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,00025 mM bei 20 und 35 °C
Zusammensetzung in ml Volumen T Zusammensetzung in ml Volumen t
Puffer Probe Substrat H2O2 20 Puffer Probe Substrat H2O2 35
0,785 0,01 0,2 0,005 1 0,785 0,01 0,2 0,005 1
Massekonzentration
Enzym mg/l 10
Stoffmenge Enzym in
mM/l 0,00025
Massekonzentration
Enzym mg/l 10
Stoffmenge
Enzym in mM/l 0,00025
Zeit in min Blindwert A Lip mit ABTS
Lip 0,00025mM bei
20°C mit ABTS
Konzentration Produkt
µmol/l
Enzymaktivität
U/ml [µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivität
U/mg
[μmol/min·mg] Blindwert A Lip mit ABTS
Lip 0,00025mM
bei 35°C mit ABTS
Konzentration
Produkt µmol/l
Enzymaktivität
U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivität
U/mg
[μmol/min·mg]
Referenz Probe lief mit, deshalb wurde kein Blindwert angegeben
0 0 0,013 0,013 0,44 0 0,023 0,023 0,78
1 0 0,019 0,019 0,65 0,020 2,048 0 0,026 0,026 0,89 0,010 1,024
2 0 0,022 0,022 0,75 0,010 1,024 0 0,029 0,029 0,99 0,010 1,024
3 0 0,026 0,026 0,89 0,014 1,365 0 0,032 0,032 1,09 0,010 1,024
4 0 0,028 0,028 0,96 0,007 0,683 0 0,048 0,048 1,64 0,055 5,461
5 0 0,03 0,03 1,02 0,007 0,683 0 0,062 0,062 2,12 0,048 4,778
6 0 0,038 0,038 1,30 0,027 2,730 0 0,067 0,067 2,29 0,017 1,706
7 0 0,049 0,049 1,67 0,038 3,754 0 0,085 0,085 2,90 0,061 6,143
13 0 0,064 0,064 2,18 0,051 5,119 0 0,093 0,093 3,17 0,027 2,730
18 0 0,084 0,084 2,87 0,068 6,826 0 0,106 0,106 3,62 0,044 4,437
22 0 0,098 0,098 3,34 0,048 4,778 0 0,159 0,159 5,43 0,181 18,089
32 0 0,138 0,138 4,71 0,137 13,652 0 0,214 0,214 7,30 0,188 18,771
42 0 0,173 0,173 5,90 0,119 11,945 0 0,275 0,275 9,39 0,208 20,819
52 0 0,218 0,218 7,44 0,154 15,358 0 0,336 0,336 11,47 0,208 20,819
82 0 0,314 0,314 10,72 0,328 32,765 0 0,471 0,471 16,08 0,461 46,075
92 0 0,356 0,356 12,15 0,143 14,334 0 0,514 0,514 17,54 0,147 14,676
112 0 0,391 0,391 13,34 0,119 11,945 0 0,554 0,554 18,91 0,137 13,652
87
Tabelle 13: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,00025 mM bei 55 und 75 °C
Zusammensetzung in ml Volumen t Zusammensetzung in ml Volumen t
Puffer Probe Substrat H2O2 55 Puffer Probe Substrat H2O2 75
0,785 0,01 0,2 0,005 1 0,785 0,01 0,2 0,005 1
Massekonzentration
Enzym mg/l 10
Stoffmenge
Enzym in mM/l 0,00025
Massekonzentration
Enzym mg/l 10
Stoffmenge
Enzym in mM/l 0,00025
Zeit in min Blindwert A Lip mit ABTS
Lip 0,00025mM
bei 55°C mit
ABTS
Konzentration
Produkt µmol/l
Enzymaktivität
U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivität
U/mg
[μmol/min·mg] Zeit in min Blindwert A Lip mit ABTS
Lip 0,00025mM bei
75°C mit ABTS
Konzentration
Produkt µmol/l
Enzymaktivität U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivität
U/mg
[μmol/min·mg]
Referenz Probe lief mit, deshalb wurde kein Blindwert angegeben
0 0 0,111 0,111 3,79 0 0 0,111 0,111 3,79
2 0 0,165 0,159 5,43 0,164 16,382 2 0 0,165 0,165 5,63 0,184 18,430
4 0 0,183 0,23 7,85 0,242 24,232 4 0 0,183 0,183 6,25 0,061 6,143
6 0 0,198 0,32 10,92 0,307 30,717 6 0 0,183 0,183 6,25 0,000 0,000
13 0 0,215 0,46 15,70 0,478 47,782 13 0 0,183 0,183 6,25 0,000 0,000
18 0 0,233 0,589 20,10 0,440 44,027 18 0 0,181 0,181 6,18 -0,007 -0,683
28 0 0,248 0,709 24,20 0,410 40,956 28 0 0,154 0,154 5,26 -0,092 -9,215
50 0 0,486 0,862 29,42 0,522 52,218 50 0 0,102 0,102 3,48 -0,177 -17,747
88
Tabelle 14: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 und 0,000625 mM
Zusammensetzung in ml Volumen Zusammensetzung in ml Volumen
Puffer Probe Substrat H2O2 Puffer Probe Substrat H2O2
0,87 0,1 0,025 0,005 1 0,945 0,025 0,025 0,005 1
Massekonzentration
Enzym mg/l 100
Stoffmenge
Enzym in mM/l 0,0025
Massekonzen
tration Enzym
mg/l 25
Stoffmenge Enzym
in mM/l 0,000625
Zeit in min Blindwert A LiP mit OPD
Lip 0,0025mM
mit OPD
Konzentration
Produkt µmol/l
Enzymaktivität
U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivität
U/mg
[μmol/min·mg] Blindwert
A LiP mit
OPD
Lip 0,000625mM mit
OPD
Konzentration
Produkt µmol/l
Enzymaktivität
U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivität
U/mg
[μmol/min·mg]
0 1,242 1,247 0,005 4,95 1,24 1,242 0,002 1,98
1 1,242 1,317 0,075 74,26 0,693 6,931 1,24 1,246 0,006 5,94 0,158 6,337
2 1,242 1,34 0,098 97,03 0,228 2,277 1,239 1,252 0,013 12,87 0,277 11,089
3 1,242 1,37 0,128 126,73 0,297 2,970 1,24 1,256 0,016 15,84 0,119 4,752
4 1,242 1,392 0,15 148,51 0,218 2,178 1,239 1,259 0,02 19,80 0,158 6,337
5 1,242 1,425 0,183 181,19 0,327 3,267 1,239 1,263 0,024 23,76 0,158 6,337
6 1,245 1,451 0,206 203,96 0,228 2,277 1,239 1,269 0,03 29,70 0,238 9,505
7 1,242 1,484 0,242 239,60 0,356 3,564 1,242 1,275 0,033 32,67 0,119 4,752
8 1,243 1,507 0,264 261,39 0,218 2,178 1,241 1,277 0,036 35,64 0,119 4,752
9 1,244 1,544 0,3 297,03 0,356 3,564 1,242 1,281 0,039 38,61 0,119 4,752
10 1,245 1,585 0,34 336,63 0,396 3,960 1,241 1,285 0,044 43,56 0,198 7,921
15 1,243 1,731 0,488 483,17 1,465 14,653 1,242 1,301 0,059 58,42 0,594 23,762
20 1,245 1,872 0,627 620,79 1,376 13,762 1,241 1,32 0,079 78,22 0,792 31,683
25 1,245 1,989 0,744 736,63 1,158 11,584 1,239 1,34 0,101 100,00 0,871 34,851
30 1,243 2,121 0,878 869,31 1,327 13,267 1,241 1,35 0,109 107,92 0,317 12,673
35 1,245 2,322 1,077 1066,34 1,970 19,703 1,24 1,357 0,117 115,84 0,317 12,673
40 1,245 2,451 1,206 1194,06 1,277 12,772 1,241 1,366 0,125 123,76 0,317 12,673
50 1,245 2,591 1,346 1332,67 1,386 13,861 1,24 1,377 0,137 135,64 0,475 19,010
60 1,242 2,709 1,467 1452,48 1,198 11,980 1,24 1,378 0,138 136,63 0,040 1,584
70
80
90 1,245 2,913 1,668 1651,49 16,515 165,149 1,243 1,403 0,16 158,42 6,337 253,465
100
110
120 1,243 3,01 1,767 1749,50 17,495 174,950 1,239 1,465 0,226 223,76 8,950 358,020
130
89
Tabelle 15: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 mM (7d gelöst gelagert) und 0,001 mM
Zusammensetzung in ml Volumen Zusammensetzung in ml Volumen
Puffer Probe Substrat H2O2 Puffer Probe Substrat H2O2
0,87 0,1 0,025 0,005 1 0,93 0,04 0,025 0,005 1
Massekonzen
tration Enzym
mg/l 100
Stoffmenge
Enzym in
mM/l 0,0025
Massekonzen
tration Enzym
mg/l 40
Stoffmenge
Enzym in
mM/l 0,001
Zeit in min Blindwert
A LiP mit
OPD
Lip 7d alt
0,0025mM mit
OPD
Konzentration
Produkt
µmol/l
Enzymaktivitä
t U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivitä
t U/mg
[μmol/min·mg] Blindwert
A LiP mit
OPD
Lip 0,001mM
mit OPD
Konzentration
Produkt
µmol/l
Enzymaktivitä
t U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktiv
ität U/mg
[μmol/min·
mg]
Referenz Probe lief mit, deshalb wurde kein Blindwert angegeben Referenz Probe lief mit, deshalb wurde kein Blindwert angegeben
0 0 0,018 0,018 17,82 0 0,008 0,008 7,92
1 0 0,021 0,021 20,79 0,030 0,297 0 0,021 0,021 20,79 0,322 8,045
2 0 0,031 0,031 30,69 0,099 0,990 0 0,032 0,032 31,68 0,272 6,807
3 0 0,037 0,037 36,63 0,059 0,594 0 0,042 0,042 41,58 0,248 6,188
4 0 0,045 0,045 44,55 0,079 0,792 0 0,052 0,052 51,49 0,248 6,188
5 0 0,051 0,051 50,50 0,059 0,594 0 0,06 0,06 59,41 0,198 4,950
6 0 0,057 0,057 56,44 0,059 0,594 0
7 0 0,062 0,062 61,39 0,050 0,495 0
8 0 0,069 0,069 68,32 0,069 0,693 0
9 0 0 0 0,092 0,092 91,09 2,277 56,931
10 0 0 0 0,129 0,129 127,72 0,916 22,896
15 0 0 0 0,157 0,157 155,45 0,693 17,327
20 0 0 0
25 0 0 0
30 0 0 0
35 0 0 0
40 0 0 0 0,238 0,238 235,64 5,891 147,277
50 0 0 0 0,253 0,253 250,50 0,371 9,282
60 0 0 0 0,278 0,278 275,25 0,619 15,470
90
Tabelle 16: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 mM (doppelte Substratmenge) und 0,005 mM
Zusammensetzung in ml Volumen Zusammensetzung in ml Volumen
Puffer Probe Substrat H2O2 Puffer Probe Substrat H2O2
0,845 0,1 0,05 0,005 1 0,77 0,2 0,025 0,005 1
Massekonzen
tration Enzym
mg/l 100
Stoffmenge
Enzym in
mM/l 0,0025
Massekonzen
tration Enzym
mg/l 200
Stoffmenge
Enzym in
mM/l 0,005
Zeit in min Blindwert
A LiP mit
OPD
Lip 0,0025mM
doppelte
Substratmenge
Konzentration
Produkt
µmol/l
Enzymaktivitä
t U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktivitä
t U/mg
[μmol/min·mg] Blindwert
A LiP mit
OPD
Lip 0,005mM
mit OPD
Konzentration
Produkt
µmol/l
Enzymaktivitä
t U/ml
[µmol/min*ml]
spez.
Enzymaktiv
ität U/mg
[μmol/min·
mg]
Referenz Probe lief mit, deshalb wurde kein Blindwert angegeben Referenz Probe lief mit, deshalb wurde kein Blindwert angegeben
0 0 0,019 0,019 18,81 0 0,042 0,042 41,58
1 0 0,072 0,072 71,29 0,525 5,248 0 0,138 0,138 136,63 0,475 2,376
2 0 0,141 0,141 139,60 0,683 6,832 0 0,178 0,178 176,24 0,198 0,990
3 0 0,198 0,198 196,04 0,564 5,644 0 0,206 0,206 203,96 0,139 0,693
4 0 0,229 0,229 226,73 0,307 3,069 0 0,232 0,232 229,70 0,129 0,644
5 0 0,254 0,254 251,49 0,248 2,475 0 0,26 0,26 257,43 0,139 0,693
6 0 0,31 0,31 306,93 0,554 5,545
7 0 0,333 0,333 329,70 0,228 2,277
8 0 0,348 0,348 344,55 0,149 1,485
9 0 0,365 0,365 361,39 0,168 1,683
91
Tabelle 17: LiP-Substratumsatz mit OPD durch Pleurotus ostreatus von den alten Stammkulturen
Zusammensetzung Blindwert ohne Medium 0,095 bereits abgezogen
Probe Subst H2O2 Puffer
0,4 0,2 0,005 0,395
P.O. v. 15.06. (14 Tage)
Zeit in min POD mit OPD bei 450 nm Konzentration µmol/l Enzymaktivität U/ml [µmol/min*ml]
1 0,224 7,65
2 0,232 7,92 0,000682594
3 0,24 8,19 0,000682594
4 0,239 8,16 -8,53242E-05
5 0,245 8,36 0,000511945
6 0,242 8,26
0 0
P.O. v. 16.06. (13 d)
Zeit in min POD mit OPD bei 450 nm Konzentration mol/l Enzymaktivität U/ml [µmol/min*ml]
1 0,148 5,05
2 0,148 5,05 0
3 0,148 5,05 0
4
5
1
P.O. v. 07.06. (23 d)
Zeit in min POD mit OPD bei 450 nm Konzentration mol/l Enzymaktivität U/ml [µmol/min*ml]
1 0,294 10,03
2 0,298 10,17 0,000341297
3 0,298 10,17 0
4 0,298 10,17 0
5 0,297 10,14
1 0
Körnerbrut v. 23.06. (7d)
Zeit in min POD mit OPD bei 450 nm Konzentration mol/l Enzymaktivität U/ml [µmol/min*ml]
1 0,111 3,79
2 0,111 3,79 0
3 0,111 3,79 0
4
5