ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ

KESİN RAPORU

Ephestia kuehniella’da transferin geninin moleküler karakterizasyonu ve savunma reaksiyonlarındaki rolü üzerinde araştırmalar

Prof. Dr. Neşet KILINÇER

Dr. Nurper GÜZ

Proje No: 08B4347005 Başlama Tarihi: 2008 Bitiş Tarihi: 2010 Rapor Tarihi: 2010

Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2010 "

I. Projenin Türkçe adı: Ephestia kuehniella’da transferin geninin moleküler karakterizasyonu ve savunma reaksiyonlarındaki rolü üzerinde araştırmalar

Projenin İngilizce adı: Molecular characterization of Ephestia kuehniella transferin and its putative role in defense reactions

Projenin Türkçe özeti:

Transferin böceklerde demir metabolizmasında rol alan önemli bir proteindir. Transferin proteininin demir taşıma fonksiyonunun yanı sıra böceklerde savunma reaksiyonlarında antibiyotik bir ajan olarak, üreme sisteminde jüvenil hormon tarafından regüle edilerek vitellojenik bir protein olarak görev aldığı bilinmektedir. Bu çalışmada model olarak seçilen Ephestia kuehniella ve endoparazitoidi Venturiacanescens ilişkisinde incelenmek üzere transferin geninin moleküler karakterizasyonu ve parazitlenmiş bireylerin farklı dönemlerinde transferin geninin ekspresyonundaki değişimin belirlenmesi amaçlanmıştır. Moleküler yöntemlerin kullanımıyla gerek parazitoid yumurtasına ve gerekse larvasına karşı olası bir savunma reaksiyonunun ip uçlarının ortaya konması hedeflenmiştir. Ayrıca Ephestiatransferin geninin transkripsiyonel profili ve yaralanmanın transferin ekspresyonuna etkisi ortaya konmaya çalışılmıştır. Son olarak Ephestia larvalarının bakteri ile enfeksiyonu sonucunda ortaya çıkabilecek transferin ekspresyon değişikliği saptanmıştır. Ephestia kuehniella transferin cDNA’sı revers transkripsiyon polymeraz zincir reaksiyonu (RT PCR) ve cDNA uçlarının hızlı çoğaltılması (RACE) yöntemleriyle klonlanmıştır. 2458 bç uzunluğundaki cDNA’nın 683’lik bir aminoasiti kodladığı saptanmıştır. Ortaya çıkan aminoasit sekansının incelenmesiyle Ephestia transferin geninin Chilo suppressalis’e %76, Galleria mellonella’a %75, Plutella xylostella’ya %74, Manduca sexta’ya %74, Bombyx mori’ye %73, Spodoptera litura’ya %72, Choristoneura fumiferana’ya %71 oranında benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca elde edilen sekansta olası demir bağlama bölgelerinin N terminal lobda olduğu tahmin edilmektedir. Ephestia’nın baş, toraks, barsak, yağ dokusu ve ovarylerinin dissekte edilmesiyle yapılan RT PCR analizi sonucunda transferin transkriptlerinin en fazla yağ dokusunda ve ovarylerde olduğu saptanmıştır. Ephestia’nın farklı gelişme dönemlerinde transferin mRNA’sının ekspresyon profilini incelemek için yapılan Northern blot analizi sonucunda transferin ekspresyonunun en fazla görüldüğü dönemler sırasıyla otuz üç günlük larva, otuz üç günlük erkek larva ve pupadır. En düşük transferin ekspresyonu ise yumurta ve erginlerde saptanmıştır. Ephestialarvalarının steril iğne ile yaralanması sonucunda transferin ekspresyon düzeyi RT PCR ile belirlenmiş bunun sonucunda kontrol gurubuna göre artış göstermesi transferinin yara tamirinde ve bu aşamada olabilecek melanin reaksiyonlarında rolü olabileceği saptanmıştır. Önceki çalışmalarda belirtildiği gibi Ephestia larvalarının E. coli bakterisiyle enfekte edilmesiyle transferin mRNA seviyesi artış göstermiş ve bu artışın en fazla altıncı saatte olduğu ve 24 saat sonra bile kontrol grubuna göre yüksek kaldığı gözlenmiştir. Son olarak Ephestia’nın endoparazitidi olan Venturia canescens ile parazitlenmesi sonucu parazitlenmiş larvalarda transferin ekspresyon düzeyinin kademeli olarak arttığı bulunmuştur. Elde edilen sonuçlarla konukçu parazitoid ilişkisinde olası savunma reaksiyonlarında transferinin rolüne açıklık getirilmeye çalışılmıştır.

Projenin İngilizce özeti:

Tranferrin is an iron transport protein playing an important role in iron metabolism in insects. It is also a

vitellogenic protein and an antibiotic agent regulated by juvenile hormone. In this study, a full length

cDNA encoding a putative iron binding transferin in the Mediterranean flour moth (EkTrf) is

characterized. The clone (2458 bp) encodes a protein of 683 amino acids with a molecular weight of

approximately 76 kDa. The deduced amino acid sequence showed significant homology with known

insect transferins from Chilo suppressalis (76%), Galleria mellonella (75%), Plutella xylostella (74%),

Manduca sexta (74%), Bombyx mori (73%), Spodoptera litura (72%), and Choristoneura fumiferana

(71%). The EkTrf appears to have residues comprising iron binding sites only in N terminal lobe. RT

PCR analysis indicated that EkTrf transcripts were predominantly abundant in the fat body and ovary.

EkTrf was expressed exclusively at the final larval instars of both male and female and also in pupae.

Analysis of parasitized larva of Ephestia by its endoparasitoid Venturia canescens showed that

transferin expression is induced following parasitoid challenge suggesting EkTrf may play an additional

role in immunity. In similar to other reports, EkTrf increased upon bacterial infection at 6 h post

treatment and remained high until 24 h. Additionally, RT-PCR analysis revealed that EkTrf was

upregulated by wounding.

II. Amaç ve Kapsam

Bu proje ile depolarda ekonomik olarak zarar meydana getiren Ephestia kuehniella’da transferin geninin moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Bu amaçla öncelikle transferin cDNA’sının klonlanması ve sekans analizi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen aminoasit sekanslarının diğer böcek gruplarıyla karşılaştırılması yapılarak transferin geni bakımından filo genetik ilişkiler ortaya konmaya çalışılmıştır. Daha sonra Ephestia’nın endoparazitoidi olan Venturia canescens’in konukçuda meydana getirdiği savunma reaksiyonunun transferin geni ekspresyonu üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bunun için sekansı çıkarılmış cDNA’nın bir bölgesinden işaretli probun kullanımı ile parazitlenmiş veparazitlenmemiş konukçulardan Northen blot analizi yapılarak transferin ekspresyon düzeyleri belirlenmeye çalışılmıştır.

III. Materyal ve Yöntem

Böcek kültürlerinin yetiştirilmesi:

Bu çalışmada ana materyal olarak Ephestia kuehniella ve parazitoidi Venturia canescens kullanılmıştır. E. kuehniella un ve kepek karışımında yetiştirilmiştir. Her iki böceğin üretimi 25±1 °C sıcaklık, % 60-70 orantılı nem, 16 saat aydınlık 8 saat karanlık koşulların sağlandığı iklim odalarında gerçekleştirilmiştir. Ortalama 29 günlük Ephestia larvalarına bal ile beslenen yaklaşık 10-15 parazitoid salınmış 24 saat sonra uzaklaştırılmıştır. Konukçu içerisinde gelişimini tamamlayarak çıkış yapan ergin parazitoitler bal verilerek beslenmiştir. Parazitlenmiş larvaların kullanıldığı deneylerde larvaların parazitlendiğinden emin olmak için larvalar parazitlendikten sonra her bir larva mikroskop altında dissekte edilerek içerisinde Venturia yumurtası ya da larvası olup olmadığı kontrol edilmiştir. Bu amaçla öncelikle Venturia’nın ovarylerindeki yumurtalar mikroskop altında dissekte edilerek görüntülenmiştir.

Ephestia kuehniella’da transferin cDNA’sının sekans analizi

Yapılan çalışmalarda Ephestia kuehniella’dan transferin geninin dizisine rastlanmamıştır. Bunun için önce Ncbi (National Center for Biotecnology Information)’ın web sitesinden böceklerde saptanan transferin genine ait sekanslar incelenmiştir. Daha sonra bu sekansların birbirine benzerlik gösterdiği korunmuş bölge seçilerek bu bölgeye uygun primer dizaynı yapılmıştır. Larvalardan RNA ekstraksiyonu yapılarak cDNA sentezine gidilmiştir. Elde edilen cDNA dizayn edilen primerler ile çoğaltılarak klonlanması yapılmıştır.

RNA ekstraksiyonu: Ephestia kuehniella larvaları 1,5 ml’lik ephendorf tüpünün içine konulmuştur. Sıvı nitrojen içine daldırılıp dondurulmuşur. Üzerine 200 µl Trizol Reagent (Invitrogen) eklenmiştir. Steril bir havaneli yardımıyla böcekler Trizol reagent içinde ezilmiştir. Üzerine 800 µl daha Trizol reagent eklenmiştir. Vortex yardımıyla hafifçe karıştırıldıktan sonra nükleoprotein yapısının tamamıyla çözülmesi için 5 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. En yüksek devirde 10 dakika santrifüj edilmiştir. Üst kısımda toplanan sıvı yeni ephendorf tüplerine aktarılmıştır. Bu tüplere 200 µl chloroform eklenmiştir. Ephendorf tüplerinin ağzı kapatıldıktan sonra tüpler elde 15 saniye sallanarak sıvıların iyice karışması sağlanmıştır. Ephendorflar oda sıcaklığında 2-3 dakika bekletilmiştir. Daha sonra tüpler 15 dakika 4°C’de 12 000 g hızda santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrasında 3 faz oluşmuştur. Bunlardan en üstteki renksiz sıvı alınarak yeni ephendorflara aktarılmıştır. Üzerine 500 µl isopropyl alkol eklenmiştir. Örnekler hafifçe karıştırılarak 10 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra 10 dakika 12 000 g hızda 4°C’de santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası elde edilen sıvı uzaklaştırılmıştır. Altta kalan RNA peleti 1 ml %75’lik alkol ile yıkanmıştır. Son olarak 5 dakika 7 500 g hızda 4°C’de santrifüj edilmiştir. Peletin üzerindeki sıvı uzaklaştırılarak peletin hava yoluyla kuruması sağlanmıştır. Pelet kurutulduktan sonra büyüklüğüne göre belli oranda distile su eklenmiştirve RNA peletinin su içerisinde çözünmesi sağlanmıştır. cDNA sentezi: Ekstrakte edilen RNA’nın kalitesi ve miktarı Nanodropta ölçülmüştür. Eğer yeterli miktarda RNA elde edilmişse total RNA’dan cDNA sentezi yapılmıştır. cDNA sentezinden önce RNA DNA Free Kit (Ambion) ile muamele edilerek temizlenmiştir. RNA’nın DNAse ile muamele edilmesi: Temizlenecek RNA temiz bir epphendorfa aktarılarak üzerine onda biri kadar 10xDNAse I buffer ve 1 µl rDNAse I eklenmiştir. 37°C’de 20-30 dakika bekletilmiştir. Üzerine RNA miktarının onda biri kadar DNAse inactivation reagent eklenerek oda sıcaklığında iki dakika bekletilmiştir. Daha sonra 10 000 g devirde 1,5 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda elde edilen RNA temiz bir epphendorf tüpünealınmıştır. cDNA sentezi için ImProm-II Reverse Transcription System (Promega) kullanılmıştır. 0,2 ml’lik steril ephendorfların çerisine yaklaşık 1 ug RNA, reaksiyon başına 0,5 ug Oligo (dT) primeri eklenerek reaksiyon 5 µl distile suya tamamlanmıştır. Tüpler önceden ısıtılmış 70°C’de 5 dakika bekletilmiştir ve hemen buz içerisine alınmıştır. cDNA sentez reaksiyonu aşağıdaki kimyasallar eklenerek hazırlanmıştır. 4 µl ImProm-II 5xReaksiyon buffer 4,8 µl 6mM MgCl2 1 µl 0,5 mM dNTP 1 µl 20 ünite Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 1 µl ImProm-II Reverse Transcriptase 3,2 µl Distile su Önceden Oligo dT ile muamele edilmiş RNA yukarıdaki reaksiyon karışımı içerisine eklenerek 25°C’de 5 dakika bekletilmiştir. Daha sonra 42°C’de yaklaşık 1 saat bekletilerek cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Reverse transcriptase enzimini inaktive etmek için 15 dakika 70°C’de bekletilmiştir. cDNA’nın PCR ile çoğaltılması: Elde edilen cDNA ile transferin genine spesifik primerler ile PCR yapılmıştır. PCR reaksiyonu için 50 µl’lik mastermix hazırlanarak 0,5 ml’lik ephendorf tüpüne konularak thermocycler’a konulmuştur. 10 µl 5xPCR Buffer 5 µl 25 mM MgCl2 1 µl 10 mM dNTP Mix 1 µl 10 mM Reverse Primer 1 µl 10 mM Forward Primer

0,5 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl) 1 µl cDNA 35,5 µl distile su Aşağıda verilen PCR koşulları denemelerle optimize edilmiştir. Başlangıç denatürasyonu 95 °C’de 1-3 dakika Denatürasyon 94-95 °C’de 0,5-2 dakika Primer annealing (bağlanma) sıcaklığını hesaplamak için önce erime sıcaklığı hesaplanmıştır. Bu sıcaklık değeri primerde yer alan nükleotid sayısı kullanılarak 4 (G+C)+2 (A+T) °C formülünden hesaplanarak bulunmuştur. Annealing değeri olarak en düşük erime sıcaklığından 5 °C düşük olan sıcaklık kullanılmıştır. Annealing için 40 °C-65 °C arasında bir sıcaklıkta 0,5-2 dakika arasında tutulmuştur. Extension (uzatma) sıcaklığı 70-75 °C arasında 1-3 dakika Son extension (uzatma) sıcaklığı 72 °C’de 5-15 dakika 25-40 arasında döngü kullanılmıştır. Çalışma süresince kullanılan primer dizileri aşağıda verilmiştir: Transferin primerleri

İleri (Forward):

L1: 5’-TTC CGK TAY SAR GCH GTH ATH GT-3’

L2: 5’-AAG ATM CCW TRA CDA TGY TGA TGA A-3’

L3: 5’-AAC TAY ACN GAR GTC ATY GA-3’

L4: 5’-TGG TTC ACH AAM GTH YTD GG-3’

L5: 5’-GTG TCG TGC TAT GTC TGT GTT C-3’

Geri (Reverse)

L1: 5’-TGC CAM GGT CTN GCN GCC CA-3’

L2: 5’-CCH ARD ACK TTD GTG AAC CA-3’

L3: 5’-GCA TTR TTR AAR ATR ACR TTR TYR TTC TT-3’

L4: 5’-ATD GHH TTR AAY TTB TCR AAG TC-3’

L5: 5’-CCG TCT CTC TGT TTA GGC AA-3’

PCR ürünlerinin jelde görüntülenmesi: Elde edilen PCR ürünleri agarose gel elektroforezi ile kontrol edilmiştir. Genellikle %1,2 agaroz jel kullanılarak 100 V’da yaklaşık 1 saat koşturulmuştur. Jeldeki bantlar transilluminatör yardımıyla görüntülenmiştir. Jel ekstraksiyonu: cDNA bölgesinin PCR yoluyla çoğaltılmasından sonra istenilen büyüklükte olan bant seçilerek jel ekstraksiyonu yapılmıştır. Jel ekstraksiyonu için Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) kullanılmıştır. İstenilen büyüklükte olan bant UV ışığı altında seçilerek steril bir jilet ile kesilerek 1,5 ml’lik ephendorfa konulmuştur ve jelin ağırlığı tartılmıştır. Ephendorf içindeki jelin üzerine 10 mg jel için 10 µl membrane binding solüsyonu eklenmiştir. Vortekslenip 50-65ºC’de 10 dakika jelin erimesi beklenmiştir. Eriyen jel minikolon içerisine konarak 16 000 g hızda 1 dakika santrifüj edilmiştir. Altta kalan sıvı uzaklaştırılarak kolonun üzerine 700 µl membrane washing solüsyonu eklenmiştir. 1 dakika 16 000 g devirde santrifüj edildikten sonra alttaki sıvı atılacak bu işlem 500 µl membrane washing solüsyon ile bir kere daha tekrarlanmıştır. Bu defa 16 000 g devirde 5 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüjden sonra altta toplanan sıvı atılarak aynı kolon 1 dakika daha santrifüj edilmiştir. Üstteki

kolon 1,5 ml’lik ephendorfa yerleştirilerek üzerine 50 µl nuclease free su eklenmiştir. Oda sıcaklığında 1 dakika bekletildikten sonra 1 dakika 16 000 g’de santrifüjlenmiştir. Ephendorfa toplanan ürün -20 ºC’de saklanarak bir sonraki aşamada kullanılmıştır. cDNA’nın klonlanması: Elektroforezden sonra elde edilen ürün beklenilen büyüklükte ise ve yeterli ise klonlama işlemlerine başlanmıştır. Sekansı çıkarılmak istenen bölge klonlama vektörü içine konmuştur. Klonlama vektörü olarak pGEM T Easy Vector System II (Promega) kullanılmıştır. Öncelikle vektör içine konulacakcDNA miktarı hesaplanmıştır. Bunun için şu formül kullanılmıştır. Kullanılacak vektörün miktarı (ng) x insert edilecek bölgenin büyüklüğü (kb) x insert/vektörün molar oranı

Vektörün büyüklüğü

Daha sonra cDNA vektör içine ligasyon (bağlama) reaksiyonu ile konulmuştur. Ligasyon işlemi için birisi pozitif kontrol diğeri standart reaksiyon olmak üzere 2 reaksiyon gerçekleştirilmiştir. Standart reaksiyon: 2x Rapid Ligation Buffer 5 µl pGEM T Easy Vector (50 ng) 1 µl PCR ürünü hesaplanarak belirlenmiştir T4 DNA Ligase 1 µl Toplam reaksiyon 10 µl’e tamamlanacak şekilde distile su eklenmiştir. Pozitif kontrol reaksiyonu: 2x Rapid Ligation Buffer 5 µl pGEM T Easy Vector (50 ng) 1 µl Insert edilecek kontrol DNA 2 µl T4 DNA Ligase 1 µl Toplam reaksiyon 10 µl’e tamamlanacak şekilde distile su eklenmiştir. 0,5 ml’lik ephendorf tüplerine yukarıda belirtilen maddeler bir araya konularak karıştırılmış oda sıcaklığında 1 saat bekletilmiştir. Ligasyon işleminden sonra transformasyon yapılmıştır. Vektöre bağlanmış DNA E. coli bakteri hücresine transforme edilmiştir. Bunun için plasmidi içine alacak olan özel E. coli bakteri hücresi ( JM 109 High Efficiency Competent cell Promega) kullanılmıştır. -70 °C ‘de muhafaza edilen E. colicompetent hücresi çıkarılarak buz içerisinde eritilmiştir. İçinden 50 µl alınarak 1,5 ml’lik ephendorf tüpüne konulmuştur. Üzerine 2 µl ligation reaksiyonundan eklenmiştir. Hafifçe karıştırılarak buz içerisinde yaklaşık 20 dakika bekletilmiştir. Ephendorflar önceden sıcaklığı 42°C’e ayarlanmış su banyosunda 45-50 saniye bekletilmiştir. Daha sonra buza alınarak burada 2 dakika kadar bekletilmiştir. Üzerine 950 µl LB solüsyonu eklenmiştir. 1,5 saat 37°C’de çalkalayıcıda bekletilmiştir. LB (Luria broth) agar ortamı hazırlanarak içerisine 50 mg/ml oranında ampiciline eklenerek cam petri kaplarına dökülmüştür. LB ortamı donduktan sonra üzerine X-Gal ve IPTG eklenerek 150 µl transforme edilmiş hücreler ortama yayılmıştır. Petriler 37°C’de bir gece bekletilmiştir. Ertesi gün rekombinant koloniler seçilerek ampiciline içeren LB solüsyonuna alınarak 15 ml’lik falcon tüpler içerisinde 37°C’de bir gece çalkalayıcıda bekletilmiştir. Plasmid izolasyonu: Elde edilen rekombinant plasmid DNA’sı Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) kiti kullanılarak izole edilmiştir. Rekombinant kolonilerin LB solüsyonunda bir gece büyütülmesinden sonra ertesi sabah spektrofotometrede A600 değerleri okunmuştur. Eğer plasmidin kopya sayısı yüksek ise 1-5 ml’si, eğer plasmidin kopya sayısı düşük ise 10 ml’si alınarak falcon tüplerine konarak 10 000 g hızda 5 dakika santrifüj edilmiştir. Üstteki sıvı atılarak peletin üzerine 250 µl cell resuspension solüsyonu eklenmiş peletin vorteks ya da pipet yardımıyla çözünmesi sağlanmıştır. Daha sonra elde edilen sıvı 1,5 ml’lik ephendorflara aktarılmıştır. Bunun üzerine 250 ul cell lysis solüsyonu eklenerek ephendorflar elde çalkalanarak karıştırılmıştır. 5 dakika oda sıcaklığında içindeki sıvı saydam bir hale gelene kadar bekletilmiştir. Üzerine 10 ul Alkaline protease solüsyonu eklenmiştir. Ephendorflar yine elde çalkalanarak solüsyonun karışması sağlanarak yaklaşık 5 dakika kadar oda sıcaklığında bekletilmiştir. Alkaline protease eklememizin nedeni izole edilen DNA’nın kalitesini

olumsuz yönde etkileyecek olan endonükleazları ve diğer proteinleri inaktive etmektir. Daha sonra 350 ul neutralization solüsyonu eklenerek elde karıştırılmıştır. 14 000 g hızda 10 dakika santrifüj edilmiştir. Böylelikle plasmid DNA’sı pürifiye etmeye hazır hale gelmiştir. Santrifüjden sonra elde edilen sıvıdan yaklaşık 850 ul alınarak spin kolon içerisine konmuştur. Bu işlem sırasında ephendorfun dibindeki pelete dokunmamaya dikkat edilmiştir. Kolona aktarılan sıvı 1 dakika en yüksek devirde santrifüjlenmiştir. Spin kolonun altında toplanan sıvı atılmıştır. Üzerine 750 ul column wash solüsyonu eklenmiştir. Bir dakika en yüksek devirde santrifüj edildikten sonra yine altta kalan sıvı uzaklaştırılmıştır. Üzerine 250 ul column wash solüsyonu eklenerek bir kez daha yıkama işlemi gerçekleştirilmiştir. Aynı şekilde en yüksek devirde 2 dakika santrifüj edilerek column temiz bir 1,5 ml’lik ephendorf üzerine konmuştur. Plasmid DNA’sının üzerine 100 ul nuclease free su eklenerek 1 dakika en yüksek devirde santrifüj edilerek plasmid DNA’sı izole edilmiştir. Restriksiyon analizi: İzole edilen plasmid DNA’sı birkaç ephendorf tüpüne ayrılarak bir kısmı restriksiyon enzimleriyle kesilerek kontrol edilmiştir. Restriksiyon enzimleri olarak vektörü kesimleyen 2 enzim (Nde I ve Sph I New England Biolabs) kullanılmıştır. Restriksiyon kesimlemesi için aşağıdaki reaksiyon kullanılmıştır. 3 µl plasmid DNA’sı NE Buffer 2 1,5 µl Nde I 0,5 µl Sph I 0,5 µl Distile su 9,5 µl Yukarıda belirtilen kimyasallar ephendorf tüpünde bir araya getirilerek 37°C’de yaklaşık 3 saat bekletilmiştir. Daha sonra kesimlenmiş ve kesimlenmemiş plasmid DNA’sı %1,2’lik agaroz jelde koşturularak sekansı çıkarılmak istenen bölgenin vektör içine klonlanıp klonlanmadığı kontrol edilmiştir. Belli bir cDNA bölgesinin sekans analizi: Elde edilen PCR ürünü agaroz jel elektroforezi ile kontrol edilerek elektroforez sonucu vektör ve cDNA’nın bantları uygun büyüklükte ise klonlanmış cDNA’nın sekans kiti (Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Beckman Coulter) kullanılarak Beckman CEQ 8800 sekans cihazı yardımıyla analizi yapılmıştır. Sekans analizinden önce sekans PCR’ı yapılmıştır. Bunun için vektör içine klonlanmış cDNA’dan 5 µl 94 °C’de 4 dakika denatüre edilerek hemen buz içerisine alınmıştır. Sekans PCR reaksiyonunun içerisine 5 µl denatüre edilmiş DNA, 2 µl 1,6 pmol T vektörün sekans primeri (T7 veya Sp6), 5 µl premix ve 8 µl distile su eklenmiştir. PCR için 96°C’de 3 dakika, 96 °C’de 20 saniye, 55 °C’de 20 saniye, 60 °C’de 4 dakika kullanılarak toplam 35 döngülük bir program kullanılmıştır. Daha sonra elde edilen PCR sekans ürünleri Agencort CleanSEQ (Beckman) ile temizlenmiştir. Bunun için PCR’dan alınan örneklerin üzerine 20 µl Agencourt CleanSEQ eklenmiştir. % 85’lik ethanolden 62 µl konularak SPRIplate üzerinde yaklaşık 8 dakika bekletilmiştir. Ethanol uzaklaştırılarak 100 ul tekrar ethanol eklenerek 3 dakika daha bekletilmiştir. Ethanol pipet yardımıyla uzaklaştırılıp 10 dakika daha oda koşulunda bekletilmiştir. 40 µl Sample loading solution eklenerek karıştırılacak daha sonra sample plate üzerine aktarılmıştır. Örneklerin üzerine birer damla mineral yağı damlatılarak buffer plate ile birlikte Beckman Coulter CEQ 8800 cihazında analiz edilmiştir. Sekans analizi sonuçları Ncbi’da bulunan veri tabanı ile karşılaştırılarak değerlendirilmesi yapılmıştır. Elde edilen sekansın doğruluğu kontrol edildikten sonra transferin cDNA’sının bilinmeyen bölgelerinin sekans analizi benzer şekilde First Choice RLM RACE kit (Ambion) kullanılarak yapılmıştır. Bu kit yardımıyla sekansı çıkarılmış bölgeden yararlanılarak 5’ ve 3’ yönünde ilerlenmiştir. RACE kitin protokolü aşağıda verilmiştir. 5’ RACE için yapılan işlemler: Önceden belirtildiği şekilde Trizol kullanılarak total RNA ekstraksiyonu yapılmıştır. Elde edilen RNA jelde görüntülenerek nanodropta değerlerine bakılmıştır. RACE kit için kullanılan RNA’nın temiz

olması başarılı sonuç alınması açısından son derece önemlidir. Bunun için gerekirse RNAtemizlenmiştir. RNA’yı temizlemek için Rneasy mini kit (Qiagen) kullanılmıştır. Temizlenecek olan RNA hacmi DEPC ile muamele edilmiş su ile toplam 100 ul’ e tamamlanmıştır. Üzerine kit içerisinde bulunan RLT bufferdan 350 ul eklenerek karıştırılmıştır. Bu şekilde sulandırılımış olan RNA’nın üzerine 250 ul %96-100 oranında ethanol eklenerek pipetle karıştırılmıştır. Elde edilen karışımdan 700 µl alınarak Rneasy mini kolon içerisine konulmuştur. 10 000 g devirde 15 saniye santrifüj edilmiştir. Santrifüjden sonra üstteki kolon 2 ml’lik yeni bir collection tüpüne alınmıştır. Üzerine 500 µl RPE buffer eklenerek 15 saniye 10 000 g’de santrifüj edilmiştir. Altta toplanan sıvı atılmıştır. Üzerine tekrar 500 RPE buffer eklenerek 2 dakika daha aynı devirde santrifüj edilmiştir. Alttaki sıvı uzaklaştırılarak 1 dakika en yüksek devirde santrifüj edilmiştir. Daha sonra kolon temiz bir 1,5 ml’lik epphendorf tüpüne konularak üzerine 30-50 ul Rnase free su eklenmiştir ve 10 000 g’de 1 dakika santrifüj edilmiştir. RNA son kez Dnase ile muamele edilecek elde edilen temiz RNA’nın miktarı nanodropta okunarak yeterli miktarda ise RACE işlemlerine devam edilmiştir. 5’ RACE için 10 ug total RNA kullanılmıştır. Önce RNA Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIP) ile muamele edilmiştir. Bunun için bir epphendorf tüpünün içerisine 10 µg total RNA, 2 µl 10xCIP buffer,2 µl Calf Intestine Alkaline Phosphatase ve toplam hacim 20 µl olacak şekilde su konulmuştur. Reaksiyon hafifçe karıştırılarak 37°C’de bir saat bekletilmiştir. Daha sonra reaksiyonu sonlandırmak için 15 µl Ammonium Acetate Solution, 115 µl su ve 150 µl acid phenol:chloroform eklenerek karıştırılarak 5 dakika oda sıcaklığında 10 000 g devirde santrifüj edilmiştir. Üstte toplanan sıvı temiz bir epphendorfa aktarılarak üzerine 150 ul chloroform eklenmiştir. 5 dakika daha aynı sıcaklık ve devirde santrifüj edildikten sonra üstteki sıvı yine temiz bir epphendorf tüpüne alınmış üzerine 150 µl isopropanol eklenmiştir. Vorteks yardımıyla karıştırıldıktan sonra 10 dakika buz içerisinde bekletilmiştir. 20 dakika en yüksek devirde santrifüj edildikten sonra elde edilen pellet 500 µl % 70’lik soğuk ethanol ile yıkanmıştır. 5 dakika daha en yüksek devirde santrifüj edilerek ethanol uzaklaştırılmış ve pelletin kurutulması beklenmiştir. Kuruyan pelletin üzerine 11 µl su ilave edilerek pelletin çözünmesi sağlanmıştır. Sonraki aşamada RNA Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP) ile muamele edilmiştir. Bunun için CIP ile muamele edilmiş RNA’dan 5 µl alınarak üzerine 1 µl 10xTAP buffer, 2 µl Tobacco Acid Pyrophosphatase ve 2 µl su eklenerek 37°C’de bir saat bekletilmiştir. Bu işlemlerden sonra RNA’ya 5’ RACE adaptörü bağlanmıştır. Bunun için 2 µl CIP ve TAP ile muamele edilmiş RNA üzerine 1 µl 5’RACE adaptörü, 1 µl 10xligase buffer, 2 µl T4 RNA Ligase (2.5 U/µl) ve 4 µl su eklenerek 37°C’de bir saat bekletilmiştir. Adaptörün bağlanmasından sonra reverse transcriptase reaksiyonu yapılmıştır. 2 µl adaptör bağlanmış RNA, dNTP karışımından 4 µl, random dekamerlerden 2 µl, 2 µl 10xRT buffer, 1 µl RNase inhibitor, 1 µl M-MLV Reverse Transcriptase ve üzerine su eklenerek toplam reaksiyon 20 µl’e tamamlanmıştır. 42°C’de bir saat bekletildikten sonra RACE PCR yapılmıştır. RACE PCR’da rutin PCR mastermiksi hazırlanmıştır. Bunun için 1 µl RT reaksiyonundan alınıp üzerine 10xPCR buffer, dNTP mix, 5' RACE gene-specific outer primer (10 µM), 5' RACE Outer Primer, thermostable DNA polymerase (0.25 µl of 5U/µl) ve su eklenerek reaksiyon 50 µl’e tamamlanmıştır. Thermocyclera konarak 3 dakika 94 °C’de bir döngü, 94°C’de 30 saniye, 60°C’de 30 saniye, 72°C’de 30 saniye toplam 35 döngü ve son olarak 72°C’de 7 dakikalık bir programda PCR yapılmıştır. PCR reaksiyonunun başarısız olması halinde farklı programlar denenmiştir. Elde edilen PCR ürünleri jelde görüntülenerek ikinci bir PCR yapılmıştır. Nested PCR’da kalıp olarak ilk PCR ürünü kullanılmış, primer olarak 5' RACE gene specific inner primer (10 µM) kullanılmıştır. PCR’lar sonunda beklenen ürünlerin alınmasıyla daha önceden anlatılan klonlama yöntemiyle istenilen bölgenin sekansı çıkarılmıştır. 3’ RACE için yapılacak işlemler: 3’ RACE PCR 5’ RACE’e göre biraz daha basit olup CIP ya da TAP muamelesini gerektirmez. 1 µg total RNA alınarak 3’ RACE adaptörü kullanılarak reverse transcriptase reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Bu reaksiyonda 2 µl 1 µg total RNA, 4 µl dNTP mix, 2 µl 3' RACE Adapter, 2 µl 10X RT Buffer, 1 µl RNase Inhibitor, 1 ul M-MLV Reverse Transcriptase ve 8 ul su kullanılacaktır. Reaksiyon karışımı bir saat süreyle 42 °C’de bekletilmiştir. Daha sonra 5’RACE’de olduğu gibi transferin genine spesifik inner

ve outer primerler ile PCR’lar yapılarak 3’ yönünde ilerlemeye çalışılmıştır. Aşağıda 5’ ve 3’ RACE PCR stratejisini özetleyen bir şekil bulunmaktadır.

RACE PCR için kullanılan primer dizileri aşağıda verilmiştir: RACE PCR primer dizileri

L1A 5’ Reverse outer primer: 5’-C C A T T A T G G G C C A A G C A T-3’

L1A 5’ Reverse inner primer : 5’-A C T G A C A C A A C G A A C A T A G

C T G A-3’

L 1 A 5’ Gene specific primer : 5’-T G G G G T C A A C A G A A A C G T

C-3’

L 1 A 3’ RACE inner primer: 5’-A T A A T G G C G G C G A T A G T C G-

3’

L 1 A 3’ RACE outer primer: C A G T T C C C T G A T A A A T G C G A C-

3’

3’ outer primer: 5’-T T G C C T A A A C A G A G A G A C G G-3’

3’ inner primer: 5’-C C T G G C T T T C G G T G A A A A C T G T-3’

(K:G or T; Y: C or T; S: G or C; R: A or G; M: A or C; W:A or T; B: G, T or C; H: A,T or C; D: G, A or T; N: A, G, T, C)

Northern Blot analizi: RNA örneklerinin agaroz jelde ayrılması: %1-%1,5 agaroz jelin hazırlanması: 1,5-3 g agaroz 1xMOPS buffer içerisinde mikrodalgada çözülmüştür. Biraz soğutulduktan sonra üzerine 8,1 ml %37’lik formaldehyde eklenmiştir. Hazırlanan jel uygun büyüklükte taraklar takılmış elektroforez tankına dökülmüştür. Jelin polymerize olması beklenmiştir. 1 litrelik 10xMOPS’un hazırlanması: 200 mM MOPS buffer 50 nM Sodium acetate 20 mM EDTA Yukarıda yazılan kimyasallar bir araya getirilerek 1 litre distile su içerisinde çözülmüştür. pHsı yediye

ayarlanmıştır. Hazırlanan MOPS buffer steril filtreden geçirilerek ışık geçirmeyen bir ortamda +4°C’de muhafaza edilmiştir. RNA yükleme bufferının hazırlanması: 250 µl formamide 83 µl %37’lik formaldehyde 50 µl 10xMOPS 50 µl %100 RNase free Glycerol 10 µl %2,5 Bromophenol blue 1,5 µl etidium bromide 57 µl DMDC veya DEPC ile muamele edilmiş su Ekstrakte edilen RNA miktarı ve kalitesi spektrofotometrede ölçülmüştür. 1 µg total RNA için 2 katı kadar miktarda RNA yükleme bufferı temiz bir ephendorf tüpünün içine konularak 65°C’de 10 dakika denatüre edilmiştir. Denatüre edilmiş örnekler hemen buz içerisine alınmıştır. Jelin poymerize olmasından sonra elektroforez tankının içerisine koşturma bufferı olarak jeli kapatacak şekilde 1xMOPS buffer eklenmiştir. Hazırlanan RNA örnekleri jele yüklenmiştir. 70 voltta yaklaşık 5-6 saat koşturulmuştur. Daha sonra jeldeki bantlar transilluminatör yardımıyla görüntülenmiştir. RNA’nın membrana transfer edilmesi: Jeldeki formaldehyde’i uzaklaştırmak için jel 2 kere on beşer dakika 20xSSC solüsyonu içerisinde yıkanmıştır. 20xSSC solüsyonunun hazırlanması: 3 M NaCl 300 mM Sodium citrate Yukarıdaki kimyasallar tartılarak 1 litre distile su içerisinde çözülmüştür. pH’sı yediye ayarlanmıştır. Plastik bir tepsi üzerine cam bir plaka konmuştur. Tepsi içerisine 20xSSC doldurulmuştur. Cam plakanın tam ortasına uzunlamasına önceden 20xSSC ile ıslatılmış Whatman 3MM kâğıdı konmuştur. Kâğıdın üzerine SSC ile yıkanmış jel yerleştirilmiştir. Steril cam bir pipetle jel ile kağıt arasında kalan hava kabarcıkları alınmıştır. Jelin üzerine aynı büyüklükte kesilmiş naylon membran (Amersham Hybond N+) konulmuştur. Üzerindeki hava kabarcığı pipet yardımıyla çıkarılmıştır. Membranın üzerine jel ile aynı büyüklükte kesilmiş 2 adet Whatman 3 MM kâğıdı konmuştur. En üste yine aynı büyüklükte kesilmiş havlu kâğıtlar konmuştur. Bunun üzerine 200-500 g civarında ağırlık konmuştur. RNA’nın membranan transfer olması için yaklaşık bir gece bekletilmiştir. Ertesi gün RNA’yı membran üzerine sabitleştirmek için RNA kısmı üstte kalacak şekilde membran UV crosslinker fırınının içerisinde 120°C’de 30 dakika ya da 80 °C’de 2 saat bekletilmiştir. Northern blot’ın prehibridizasyonu: Prehibridizasyon için DIG Easy Hyb Granülleri kullanılmıştır. Granüller 64 ml steril distile su eklenerek 37°C’de 5 dakika karıştırılarak çözülmüştür. Membran hibridizasyon şişesine yerleştirilmiştir. 10x10 cm’lik bir membran için 10-15 ml prehibridizasyon buffer eklenerek 68°C’de bir gece hibridizasyon fırınında döndürülerek prehibridize edilmiştir. Ertesi gün prehibridizasyon solüsyonu dökülerek membran üzerine içinde işaretlenmiş probun olduğu hibridizasyon solüsyonu eklenmiştir. İşaretlenmiş probun hazırlanması: Probu işaretlemek için PCR Dig probe Synthesis kit kullanılmıştır. Materyal olarak cDNA klonlanmasında kullanılan plasmid DNA’sı (10-100 pg) ve transferin için dizayn edilmiş primerler kullanılmıştır. İşaretlemeye başlamadan önce kitin içerisindeki malzemelerin enzim hariç buz üzerinde erimesi sağlanmıştır. Hafifçe vorteksleyip yarım dakika santrifüjlenmiştir. Aşağıda verilen çizelgedeki reaksiyonlar hazırlanmıştır.

Kimyasallar Transferin probu İşaretlenmemiş DNA kontrolü

İşaretlenmiş kit kontrol probu

Su 50 µl’e tamamlanır

50 µl’e tamamlanır

29,25 µl

10xPCR Buffer (MgCl2 dahil)

5 µl 5 µl 5 µl

PCR işaretleme karışımı

5 µl - 5 µl

dNTP stok solüsyonu

- 5 µl -

Transferin primeri F

5 µl 5 µl Kit primeri (5µl)

Transferin primeri R

5 µl 5 µl Kit primeri (5µl)

Enzim karışımı 0,75 µl 0,75 µl 0,75 µl DNA 1 µl 1 µl Kit kontrol

DNA’sı (5 µl) Toplam reaksiyon 50 µl 50 µl 50 µl

Yukarıdaki çizelgede belirtilen reaksiyonlar 0,5 µl’lik bir ephendorfa konup thermocyclara konmuştur. Uygun PCR koşulları denemelerle belirlenmiştir. PCR ile amplifiye edilmiş işaretlenmiş probun etkinliğinin kontrolü elde edilen PCR ürünlerinin jelde koşturulmasıyla saptanmıştır. Jelden elde edilen bantlar işaretlenmiş kit kontrol probu ve işaretlenmemiş DNA kontrolü ile kıyaslanmıştır. İşaretlenmiş transferin probunun büyüklüğü istenen büyüklükte ise kullanılacak prob miktarı saptanmıştır. Kit protokünde belirtildiği gibi standart prob konsantrasyonu 1 ml hibridizasyon bufferı için 2 µl prob kullanılmıştır. Konsantrasyonu belirlenen prob hibridizasyon bufferının içerisine eklenerek membranın üzerine dökülerek ön denemelerle belirlenmiş hibridizasyon sıcaklığında 1 gece hibridizasyon fırınında hibridize edilmiştir. Membranın yıkanması ve RNA bantlarının görüntülenmesi için Dig High Prime DNA Labelling and Detection Starter Kit II (Roche) kullanılmıştır. Hibridizasyon tamamlandıktan sonra probun bulunduğu hibridizasyon bufferı daha sonraki Northern blot deneylerinde kullanılmak üzere –20°C’de saklanmıştır.Membran farklı yıkama solüsyonlarıyla hibridizasyon fırını içerisinde yıkanmıştır. İlk önce membran 2 kere beşer dakika 2xSSC, %0,1 SDS solüsyonu içerinde 15-25°C’de yıkanmıştır. Daha sonra 65-68°C’de 2 kere on beşer dakika 0,5xSSC, %0,1 SDS solüsyonunda yıkanmıştır Bu yıkamalardan sonra membran özel hazırlanacak yıkama solüsyonu (0,1 M Maleik asit, 0,15 M NaCl (pH 7,5), % 0,3 Tween 20) içerinde 5 dakika daha yıkanmıştır. Kit içerisinde bulunan 10xBlocking (bloklama) solüsyonu 1xMaleik asit solüsyonu ile seyreltilerek 1xBloklama solüsyonu hazırlanmıştır. Yıkamalardan sonra membran üzerine spesifik olmayan bağlanmaları engellemek için 10 ml 1xbloklama solüsyonu dökülerek yarım saat uygun sıcaklıkta hibridizasyon fırınında bekletilmiştir. Daha sonra kit içerisinde bulunan ve işaretlenmiş proba bağlanacak olan anti digoxigenin AP antibody solüsyonu 5 dakika 10 000 rpm’de santrifüjlenmiştir. Bloklama solüsyonu içine 1: 10 000 oranında antibody solüsyonu eklenecek bunun 10 ml’si alınarak membran yarım saat daha bu solüsyonda bekletilmiştir. Membran önceden maleik asit ile hazırlanmış yıkama solüsyonu ile 2 kere on beşer dakika yıkanmıştır. Daha sonra kit protokolünde önerildiği gibi alkaline fosfotaz bufferı olan detection bufferı hazırlanmıştır. Bunun için 0,1 M Tris HCl ve 0,1 M NaCl distile su içerinde çözülerek pHsı 9,5a ayarlanmıştır. Membran hazırlanan bu solüsyonun 20 mililitresi ile 5 dakika yıkanmıştır. Membran hibridizasyon şişesinden çıkarılmıştır. Bantların görüntülenmesi için CSPD Ready to use isimli kimyasaldan 1 ml membranın üzerine dökülmüştür. Oda sıcaklığında 5 dakika bu kimyasala maruz bırakılmıştır. Kimyasalın fazlası alınarak membran şeffaf naylon bir poşetin içerisine konarak etrafı kapatılmıştır. Northern blot sonucu elde edilen bantlar jel görüntüleme sistemiyle görüntülenmiştir.

IV. Analiz ve Bulgular

Ephestia’da transferin kodlayan geni karakterize etmek için revers transkripsiyon PCR ve RACE PCR

protokolü izlenmiştir. Bu amaçla önce son dönem Ephestia larvaları toplanarak total RNA izolasyonu

yapılmıştır. Elde edilen RNA cDNA sentezinde kullanılmıştır. Daha önceki çalışmalarda Ephestia

transferine rastlanmadığı için başka transferin dizilerinden yararlanılarak dejenere primerler dizayn

edilmiştir. cDNA’nın kalıp olarak kullanılmasıyla Taq polymeraz yardımıyla PCR yapılmıştır. Elde

edilen PCR ürünleri klonlanmış ve sekansları çıkarılmıştır. Tüm cDNA’nın bulunması için beş adet

primer yardımıyla önce tüm genin ufak parçalar halinde dizi analizi yapılmış daha sonra RACE kit

yardımıyla 3’ ve 5’ yönünde ilerlenmiştir. Aşağıda RNA izolasyoundan başlamak üzere elde edilen tüm

sonuçlar verilmiştir.

RNA ekstraksiyonu sonrası elde edilen RNA’nı kalitesi ve miktarı %1’lik agaroz jelde kontrol

edilmiştir. Ekstrakte edilen RNA’nın ve temizlenmiş RNA’nın % 1’lik agaroz jelde koşturulduktan

sonra çekilmiş fotoğrafı görülmektedir.

Şekil: A: Ephestia RNA’sı B: Temizlenmiş Ephestia RNA’sı

RNA’nın nanodropta okunması sonucunda yeterince saf olmaması durumunda RNeasy mini kit

(Qiagen) kullanılarak temizlenmiştir. Nanodropta ölçüm sonrası değerleri genellikle OD 260/280 oranı

1,8-2 arasında olan OD 260/230 oranı ise 1,8 ve üstünde olan örnekler deneylerde kullanılmıştır.

cDNA sentezinden önce RNA olası DNA kontaminasyonuna karşı rDNase I (Ambion) ile muamele

edilerek temizlenmiştir. Ardından Oligo dT ve revers transkriptaz kullanılarak cDNA sentezi

gerçekleştirilmiştir. Elde edilen cDNA kullanılarak transferin için dizayn edilmiş dejenere primerler ile

A B

PCR yapılmıştır. Ancak bu aşamadan önce cDNA’nın kalitesi kontrol edilmiştir. cDNA’nın kalitesini

kontrol etmenin en iyi yolu daha önce çalıştığı bilinen kontrol primerleriyle PCR yapmaktır. Ancak

transferin primerleri ilk defa kullanılacağından ve dejenere olduklarından bu amaç için ‘housekeeping’

gen adı verilen actin, tubulin, GAPDH gibi sürekli olarak her dokuda eşit miktarda ekspresse olan

genlerden birisinin kullanımına karar verilmiştir. Ancak literatürde Ephestia için daha önce çalışılan

hiçbir kontrol geni bulunamadığından bu genler arasından actin seçilerek öncelikle Ephestia’ya ait actin

geninin dizisi materyal metod kısmında açıklandığı gibi çıkarılmış daha sonra belirlenen bu diziye

spesifik primerler dizayn edilerek cDNA’nın PCR yoluyla kontrolü yapılmıştır. Actinin klonlaması ile

ilgili sonuçlar ilerleyen bölümlerde verilmiştir. Aşağıdaki şekilde elde edilen cDNA’nın actine spesifik

primerler ile çoğaltılarak kalitesinin iyi olduğu gösterilmiştir.

Şekil: cDNA’nın kontrolü amacıyla Ephestia actin primerleriyle yapılan PCR

cDNA’nın PCR yoluyla çoğalabildiğinden emin olduktan sonra transferin için dizayn edilen primerler

ile PCR’lar yapılmıştır. Transferin için dizayn edilen primerlerin gerek ilk defa kullanılması gerekse

dejenere olmalarından dolayı ilk bağlanma sıcaklığını tayin etmek için öncelikle gradient PCR

yapılmıştır. Gradient PCR için Biorad marka thermocycler kullanılmıştır. Cihaz otomatik olarak verilen

iki sıcaklık değerinden en düşük sıcaklık ile en yüksek sıcaklık değerini otomatik olarak on iki farklı

sıcaklığa bölerek her bir kuyucukta farklı bağlanma sıcaklığı ile PCR reaksiyonu gerçekleştirmiştir.

Cihazın kullandığı 50 ile 60 derece arasındaki sıcaklık değerleri aşağıda sıralanmıştır.

1. 50 °C

2. 50,3 °C

3. 50,9 °C

4. 51,7 °C

5. 52,8 °C

6. 54,3 °C

7. 56 °C

8. 57,4 °C

9. 58,5 °C

10. 59,2 °C

11. 59,8 °C

12. 60 °C

Transferin için dizayn edilmiş her bir primer için önce 50 ile 60 derece arasındaki sıcaklıklar ile PCR

yapılmıştır. PCR rünlerinin % 1,5’luk agaroz jelde koşturulması sonucu elde edilen bant profilleri

aşağıdaki şekillerde sunulmuştur.

Şekil: L1 primerleriyle yapılan gradient PCR sonucu

Şekil: L2 primerleriyle yapılan gradient PCR sonucu

Şekil: L3 primerleriyle yapılan gradient PCR sonucu

Şekil: L4 primerleriyle yapılan gradient PCR sonucu

Şekil: L5 primerleriyle yapılan gradient PCR sonucu

Her bir primer için bağlanma sıcaklıkları belirlendikten sonra hepsi için tekrar normal PCR yapılmış ve

%1,5’luk agaroz jelde yürütülmüştür.

PCR sonuçları agaroz jelde kontrol edildikten sonra amplikonlar istenilen büyüklükte ise jel

ekstraksiyonuna geçilmiştir. Jel ekstraksiyonu sonrası PCR ürününde gerçekleşen kayıptan dolayı beş

adet 50 µl’lik PCR ürünü bir araya getirilerek %1,5’luk agaroz jele yüklenmiştir. Jele yüklenen PCR

ürünleri ve kesilen bantlar işaretlenerek aşağıdaki şekilde gösterilmiştir.

Şekil: Jel ekstraksiyonu öncesi jelde ekstrakte edilecek bantların görünümü

Jelden kesilen PCR ürünleri T vektör içine klonlanmıştır. Bu amaçla öncelikle vektör içine konulacak

ürün miktarı nanodropta ölçülerek hesaplanmıştır. Hesaplamalar için kullanılan förmül aşağıda

verilmiştir.

Kullanılacak vektörün miktarı (ng) x insert edilecek bölgenin büyüklüğü (kb) x insert/vektörün molar oranı

Vektörün büyüklüğü

Metod kısmında açıklandığı şekilde vektör içine konan PCR ürünlerinin E. coli hücresine

transformasyonu yapılmıştır. Daha sonra LB (Luria Broth) ortamında yetiştirilen rekombinant

kolonilerin seçimi yapılarak plasmid içerisinden izolasyonları yapılmıştır. Plasmid izolasyonundan

sonra elde edilen ürünler tekrar agaroz jelde kontrol edilmiştir.

Plazmid izolasyonundan sonra sekans reaksiyonuna geçmeden önce doğru bölgenin klonlanıp

klonlanmadığı restriksiyon analizi ile kontrol edilmiştir. Bu amaçla izole edilen plazmid restriksiyon

L1 L2 L3

L4 L5

enzimleriyle kesimlenmiş ve agaroz jelde kontrol edilmiştir.

Şekil: Restriksiyon analizi ile klonlanmış PCR ürününün kontrolü

Restriksiyon analizi ile klonlanmış PCR ürünleri beklenilen büyüklükte ise dizisi çıkarılmak istenen

bölge hem T7 primeri ile hem de SP6 primeri ile çift yönlü okuma için sekans PCR’ı ile çoğaltılarak

sekans cihazına konulmuştur. Yapılan sekans analizlerinin sonuçları ve analizleri aşağıda verilmiştir.

>Trf L1 SP6

CGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTGCCAAGGTCTA

GCCGCCCATGAACATGGTCTTCTATCACCGACCGGGACTTTAGAACCATCAGCACAGAGATATCTGAAG

TTGGTTGGGTCTTCCGATGAAGCGGATGCTGGGATTGTACCTAGGGGTAATCCAAAGAATTTGTGGACG

TAGAAGTCTTTAGTGAAAGCGACTTCGCCGCCATTATGGGCCAAGCATCTGAGCGCCCCTTCGTAACCG

CTGTTCTCGTCAGGATAGTCGCATTTATCAGGGAACTGACACAACGAACATAGCTGACTGTATTGTTTC

TTCCACAAACTATTGACCTTTGGGTCGGGCGACCAAGAGCCCACAATGCAGGACTGCTTGAAGAATGAG

GATAGCGCTTTCAGCTCATTTTCCTTCGGCGATATCTCCCGGTTGTTCATTTTTGGGAATACTTCACGT

TTCATTAGCATTGTCAGTGGTATTTTATATCCGACCTTTTCTGTTGACCCCAGTGTGGCAAGACTTTAA

TCCTTTGAGTCCGTCCAAGCTATTGATCGGCCAATCCTTGTGGACCACAATGACAGCCTCGTAACGGA

>Trf L1 T7

CGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTGCCAAGGTCTA

GCCGCCCATGAACATGGTCTTCTATCACCGACCGGGACTTTAGAACCATCAGCACAGAGATATCTGAAG

TTGGTTGGGTCTTCCGATGAAGCGGATGCTGGGATTGTACCTAGGGGTAATCCAAAGAATTTGTGGACG

TAGAAGTCTTTAGTGAAAGCGACTTCGCCGCCATTATGGGCCAAGCATCTGAGCGCCCCTTCGTAACCG

CTGTTCTCGTCAGGATAGTCGCATTTATCAGGGAACTGACACAACGAACATAGCTGACTGTATTGTTTC

TTCCACAAACTATTGACCTTTGGGTCGGGCGACCAAGAGCCCACAATGCAGGACTGCTTGAAGAATGAG

GATAGCGCTTTCAGCTCATTTTCCTTCGGCGATATCTCCCGGTTGTTCATTTTTGGGAATACTTCACGT

TTCATTAGCATTGTCAGTGGTATTTTATATCCGACCTTTTCTGTTGACCCCAGTGTGGCAAGACTTTAA

TCCTTTGAGTCCGTCCAAGCTATTGATCGGCCAATCCTTGTGGACCACAATGACAGCCTCGTAACGGA

Elde edilen diziler Ncbi’in web sitesindeki veri bankasından diğer dizilerle karşılaştırılmıştır

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Bu karşılaştırma sonucunda sekansı çıkarılan dizilerin

transferin genine ait olduğu ve diğer böcek transferinlerine yüzde kaç benzerlik gösterdiği

gösterilmiştir.

Şekil: L1 primerinin çoğalttığı transferine ait sekansın veri tabanındaki diğer transferin sekansları ile benzerliklerinin karşılaştırılması

>Trf L2 SP6

CAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCCCAAGA

CGTTGGTGAACCAGCCAGGTTTTGCGTTTGCACCAGCGTTGGAAAGCTGCTTAATTTTCTCTCTCAGGG

GCGTCAAACGAGCCAAAACATCGTTATGACCAAGTAGACCTTGCCATGGTCTGGCGGCCCATGAACATG

GTCTTCTATCACCGACCGGGACTTTAGAACCATCAACACAGAGATATCTGAAGTTGGTTGGGTCTTCCG

ATGAAGCGGATGCTGGGATTGTACCTAGGGGTAATCCAAAGAATTTGTGGACGTAGAAGACTTTAGTAA

AAGCGACTTCGCCGCCATTATGGGCCAAGCATCTGAGCGCCCCTTCGTAACCGCTGTTCTCGTCAGGAT

AGTCGCATTTATCAGGGAACTGACACAACGAACATAGCTGACTGTATTGTTTCTTCCACAAACTGTTGA

CCTTTGGGTCGGGCGACCAAGAGCCCACAATGCAGGACTGCTTGAAGAATGAGGATAGCGCTTTCAGCT

CATTTTCCTTCGGCGATATCTCCC

>Trf L2 T7

AAGATCCCATTGACAATGCTGATGAAACGTGAAGTGTTCCCAAAAATGAACAACCGGGAGATATCGCCG

AAGGAAAATGAGCTGAAAGCGCTATCCTCAGTGTGCTTTCAAGCAGATCCTGCATTGTGGGCTCTATGG

TCGTCCCAGACCCAAAGGTCAATAGTTGTGTGGAAGACAACAGATACAGTCAGCTATGTTCGTAGTGTC

AAGTTCCCAGATAAATGCAGACTATCCTGACGAGAACAGCGGTTACGAAGGGGCGCTCAGATGCTGGGC

CCATAGTGGCGGCGAAGATCTGCTGTCACTATAGTCTACTACGTCCACAAATACTTTGGATTACCCCTA

GGTACAATCCCAGCATCCGCTTCATCGGAAGACCCAACCAATCTTCGAGTATATCTCTGTGTCGATGGT

TCTAAAGTCCCGGTCTGTGATAGAAGGACCGTGCTCATGGGCCGCCAGACCATGGCGAGGTCTACTGAG

GTCATAACGATGT

Şekil: L2 primerinin çoğalttığı transferine ait sekansın veri tabanındaki diğer transferin sekansları ile benzerliklerinin karşılaştırılması

>Trf L3 SP6

TCCCGGCCGCCATGGCGGCTCGCGGGAATTCGATTAAGATCCCTTGACTATGTTGATGAAACGTGAAGT

ATTCCCAAAAATGAACAACCGGGAGATATCGCCGAAGGAAAATGAGCTGAAAGCGCTATCCTCATTCTT

CAAGCAGTCCTGCATTGTGGGCTCTTGGTCGCCCGACCCAAAGGTCAATAGTTTGTGGAAGAAACAATA

CAGTCAGCTATGTTCGTTGTGTCAGTTCCCTGATAAATGCGACTATCCTGACGAGAACAGCGGTTACGA

AGGGGCGCTCAGATGCTTGGCCCATAATGGCGGCGAAGTCGCTTTCACTAAAGTCTTCTACGTCCACAA

ATTCTTTGGATTACCCCTAGGTACAATCCCAGCATCCGCTTCATCGGAAGACCCAACCAACTTCAGATA

TCTCCGTGTTGATGGTTCTAAAGTCCCGGTCGGTGATAGAAGACCATGTTCATGGGCCGCCAGACCATG

GCAAGGTCTACTTGGTCATAACGATGTNTTGGCTCGTTTGACGCCCCTGAGAGAGAAAATAAGCAGCTT

TCCAACGCTGGTGCAAACGCAAAACCTGGCTGGTCCACCAACGTCCTGGGAATCACTAGTGAATCCGCG

GCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGGAGAGCTCC

>Trf L3 T7

ACTGACACAACGAACATAGCTGACTGTATTGTTTCTTCCACAAACTATTGACCTTTGGGTCGGGCGACC

AAGAGCCCACAATGCAGGACCGCTTGAAGAATGAGGATAGCGCTTTCAGCTCATTTTCCTTCGGCGATA

TCTCCCGGTTGTTCATTTTTGGGAATACTTCACGTTTCATTAGCATTGTCAGTGGTATTTTATATCCGA

CGTTTCTGTTGACCCCAGTGTGGCAAGACTTTAATCCTTATGAGTCCGTCCAAGCTATTGATCGGCAAA

TCCTTGTGGACCACAATCACGGCTTGGTACCTGGAACTCCGCATCTGGCTCATCATCAGTTCTGTACTC

TTGGAAGAGAACGAAGTCCTGGTTGGGTATTTTGGAAGCCACATACATGTCTTCAGGGTCCACAGGGAC

GAAGTCCGCTTGGCGTGAGTTGTATGTACTGCAGAGCACTCCATTCTATCTCGGGGCCGCCACACATTC

TAGTTTCTCCTTGCTTTTTGTGTGCTACCTCCAGCATGATCTCGCAATCCCTTCATGA

Şekil: L3 primerinin çoğalttığı transferine ait sekansın veri tabanındaki diğer transferin sekansları ile benzerliklerinin karşılaştırılması

>Trf L4 SP6

TCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTATGGC

CTTAAATTTGTCGAAGTCGAAATTCATCGTACTTTCTAAACCCGTAGCGCCATTACTAAAAAGTATATT

ATTGTTCTTCAAGAACTCTCCATAAATGTTGAAGAGATCAGTCCTTTTTTCCAATAACTTGGCCAGACT

TAATGGAGTGAACGCTATGGAGACGTCAGATTCGACAGTTTTCACCGAAAGCCAGGCTCTAGAAGGTGC

CATGACGATGTTACATGTCGGGTAGTTGGACAGCTTGTCGCGACCACCCGTCTCTCTGTTTAGGCAAAG

CAGTTCGTATTCTGACTCATCGTATTTATCTAAGTCTCCGCTAGACACGAAGACAACGTCGGCTCGACC

TTCCTGAAGACATTTCAGAGGAGTGTTGTCGCTCAAACATTGTTTCTTCAGCGATGATACGTCATCTCC

TTTTGGGTTATTTTCTGGCTTATCAACCCCAGGTAAACATGATCCTGCAGAGAAGAATTCTGACATCTT

TTGAACGCACTGTCCGTTAGA

>Trf L4 T7

CGTATTGGGTCTCTCTGAGAAAACCCACCATGTGGCAGATAACATTCCCATCAAGCCTAAGGCATACTT

GGACAAAGCTAATTACACTGCGGTGATTGAAAGGGGACATGGACCTCTAGAACCATATTGTCAGGATGT

GTGTGACGTCGAACGTACGCGCTGGAGAAGTGTCGTGCTATGTCTGTGTTCGCCTTCAGCCGGGACATC

CGGCCCATGCTGGACGGTGTTCAAGGAGCCTTCCGTACTGACGACTGCTTGCGGAGCGTCCGAGACAAC

GGCTCTGACCTGGCTGCAGTGGACGACATCATGAGTGGCCTCTGCC

Şekil: L4 primerinin çoğalttığı transferine ait sekansın veri tabanındaki diğer transferin sekansları ile benzerliklerinin karşılaştırılması

>Trf L5 SP6

CGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCCGTCTCTCTGT

TTAGGCAAAGCAGTTCGTATTCTGACTCATCGTATTTATCTAAGTCTGCGCTAGACACGAAGGCAACGT

CAGCTCGACCTTCCTGAAGACATTTCAGAGGAGTGTTGTCGCTCAAACACTGTTTCTTCAGCGATGATA

CGTCATCTCCTTTTGGGTTATTTTCTGGCTTATCAACCCCAGGTAAACATGATCCTGCAGAGAAGAATT

CTGACATCTTTTGAACGCACTGTCCGTTAGAATTGGTAATTTTCCCCTTGTTGATGAGGTAGAACAGCG

GTGCGTGAAGACCACTGAAGGTTCCGTAAGAGTTGTGGCATGACCTTTTGCCTCTCAAGTCATCTATAG

TGTTGTAAGTGGTGCCCTTCTTGATCACAGCGACGGCATAGTGGGGTGTCTTCTTGTCTCCATACACCT

CGTGAAAGACCGGGTGCAGGCCGTATTTGTTGGAGGCAGAGGCCACTCTGATGTCGTCCACTGCAGCCA

GGTCAGAGCCGTTGTCTCGGACGCTCCGCAAGCAGTCGTCGTCGGAAGGCTCCTGAACACAGTCCAG

>Trf L5 T7

TCCCGGCCGCCATGGCGGCTCGCGGGAATTCGATTGTGTCGTGCTATGTCTGTGTTCGCCTTCAGCCGG

GACATCCGGCCCATGCTGGACTGTGTTCAGGAGCCTTCCGACGACGACTGCTTGCGGAGCGTCCGAGAC

AACGGCTCTGACCTGGCTGCAGTGGACGACATCATGATGTGGCCTCTGCCTCCAACAAATACGGCCTGC

ACCCGGTCTTTCACGAGGTGTATGGAGACAAGAAGACACCCCACTATGCCGTCGCTGTGATCAAGAAGG

GCACCACTTATCAACACTATAGCATGACTTGAGAGGCAAAAGGTCATGCCACAACTCTTACGGAACCTA

CAGTGGTCTTCATCGCACCGCTGTACTAGCCTCATCAACAATGGGGAAAATTACCAATTGCTAACGGAC

ATGTGCGTATCAAAATGATGTCAGAATGCTTCTCTGCAGGATCATGTCTACCTGGGGTGGAT

Şekil: L5 primerinin çoğalttığı transferine ait sekansın veri tabanındaki diğer transferin sekansları ile benzerliklerinin karşılaştırılması

Yukarıdaki analizlerden anlaşılacağı üzere elde edilen dizilerin transferin genine ait olduğu

kanıtlanmıştır. Ayrıca yine yapılan analizler sonucunda Ephestia transferin dizisinin en fazla yakınlık

gösterdiği böcek türleri Plutella xylostella, Choristoneura fumiferana, Bombyx mori, Chilo

suppressalis, Galleria mellonella ve Spodoptera litura’dır.

Ephestia transferin cDNA’sında pek çok bölgenin dizisi elde edildikten sonra 3’ ve 5’ uçlarının

sekanslarını çıkarmak için 3’ ve 5’ RACE protokolünden yararlanılmıştır. Aşağıda özetlendiği şekilde

primerleri dizayn edilen RACE kitin protokolü detaylı bir biçimde metod kısmında verilmiştir.

Şekil: FirstChoice® RLM-RACE Kit protokolünden alınmış olup RACE için kullanılacak primer dizilerinin dizaynını gösteren şekil

5’ RACE kiti kullanılarak Ephestia transferin dizisinin 5’ ucuna doğru ilerlemek amacıyla iki çift

primer kullanılarak nested PCR yapılmıştır. Önce dıştaki primerler kullanılarak PCR yapılmış daha

sonra elde edilen PCR ürünü ile içteki primerler kullanılarak ikinci bir PCR daha yapılmıştır. Bu

PCR’lar sonucu elde edilen bantların resmi aşağıdaki şekilde verilmiştir.

Şekil: 5’ RACE dış primerle yapılan PCR sonucu

Şekil: 5’ RACE iç primerler ile yapılan PCR

Şekil: 5’ RACE ürünlerinin jelden ekstrakte edilmesi

Şekil: 3’ RACE dış primerler ile yapılan PCR sonucu

Şekil: 3’ RACE iç primerler ile yapılan PCR sonucu

Şekil: 3’ RACE ürünlerinin jelden ekstrakte edilmesi

RACE ürünleri T vektör içine daha önce anlatıldığı şekilde klonlanmış ve sekans analizi yapılmıştır.

Aşağıda RACE ürünlerinin dizi analizleri verilmiştir.

>5’ RACE T7

CAACGCGTAGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCGCGGAT

CCAGACGCTGCGTTTGCTGGCTTTGATGAAAAGTATCTCGGCAAGTGTCATCGTGGCCAGTGGTCACAC

AACATGGCTTTAAAATATTTACCGTGGCTAATTGCATTGATCGTTTGTGTTCATAGCAAATCACCGTAT

AAAATATGTGTGCCGGCACAATTCATGAAGGATTGCGAGATCATGCTGGAGGTAGAAACAAAAAGCAAG

GAGAAACTAGAATGTGTGGCGGCCCGAGATAGAATGGAGTGCCTGCAGTACATACAACAACGCCAAGCG

GACTTCGTCCCTGTGGACCCTGAAGACATGTATGTGGCTTCCAAAATACCCAACCAGGACTTCGTTCTC

TTCCAAGAGTACAGAACTGATGATGAGCCAGATGCGGAGTCCCGGTACCAAGCCGTGATTGTGGTCCAC

AAGGATTTGCCGATCAATAGCTTGGACGGACTCAAAGGATTAAAGTCTTGCCACACTGGGGTCAACAGA

AACGTCAGATATAAAATACCACTGACAATGCTAATGAAACGTGAAGTATTCCCAAAAATGAACAACC

>5’ RACE SP6

CGCGTAGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCGCGGATCCA

GACGCTGCGTTTGCTGGCTTTGATGAAAAGTATCTCGGCAAGTGTCATCGTGGCCAGTGGTCACACAAC

ATGGCTTTAAAATATTTACCGTGGCTAATTGCATTGATCGTTTGTGTTCATAGCAAATCACCGTATAAA

ATATGTGTGCCGGCACAATTCATGAAGGATTGCGAGATCATGCTGGAGGTAGAAACAAAAAGCAAGGAG

AAACTAGAATGTGTGGCGGCCCGAGATAGAATGGAGTGCCTGCAGTACATACAACAACGCCAAGCGGAC

TTCGTCCCTGTGGACCCTGAAGACATGTATGTGGCTTCCAAAATACCCAACCAGGACTTCGTTCTCTTC

CAAGAGTACAGAACTGATGATGAGCCAGATGCGGAGTTCCGGTACCAAGCCGTGATTGTGGTCCACAAG

GATTTGCCGATCAATAGCTTGGACGGACTCAAAGGATTAAAGTCTTGCCACACTGGGGTCAACAGAAAC

GTCGGATATAAAATACCACTGACAATGCTAATGAAACGTGAAGTATTCCCAAAAATGAACAACC

Şekil: 5’ RACE primerlerinin çoğalttığı transferine ait sekansın veri tabanındaki diğer transferin sekansları ile benzerliklerinin karşılaştırılması

>3’ RACE T7

CCCGGCCGCCATGGCGGCCTGCGGGAATTCGATTCCTGGCTTTCGGTGAAAACTGTCGAATCTGACGTC

TCCATAGCGTTCACTCCATTAAGTCTGGCCAAGTTATTGGAAAAAAGGACTGATCTCTTCAACATTTAT

GGAGAGTTCTTGAAGAACAATAATATACTTTTTAGTAATGGCGCTACGGGTTTAGAAAGTACGATGAAT

TTCGACTTCAATAAGTTCAAGACTTATCACGATGTTATTTCTAACTGTGGATTAGCTTAACCGAGATAC

AAAAAGTGATTGAAATTATTTTTTTAAGTTACGTTTGTTAGTCTGCGGATTAACTTAACCGAGATACAA

GATATGAAATTATTTTTTTAAGTTTCGTTTGTTAGTATGTAGGTAACTAACATAGGTTAATTTAATTTG

GTTAGATAATGGAAAATCCCATTTCTGAATCTCATCCCATTTAAAAGTCTGAGTTGTATACTACTGACA

TTATGATAATAAATGAATACTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

>3’RACE SP6

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAGTATTCATTTATTATCATAATGTCAGTATGTATACAACTCA

GACTTTTAAATGGGATGAGATTCAGAAATGGGATTTTCCATTATCTAACCAAATTAAATTAACCTATGT

TAGTTACCTACATACTAACAAACGAAACTTAAAAAAATAATTTCATATCTTGTATCTCGGTTAAGTTAA

TCCGCAGACTAACAAACGTAACTTAAAAAAATAATTTCAATCACTTTTTGTATCTCGGTTAAGCTAATC

CACAGTTAGAAATAACATCGTGATAAGTCTTGAACTTATTGAAGTCGAAATTCATCGTACTTTCTAAAC

CCGTAGCGCCATTACTAAAAAGTATATTATTGTTCTTCAAGAACTCTCCATAAATGTTGAAGAGATCAG

TCCTTTTTTCCAATAACTTGGCCAGACTTAATGGAGTGAACGCTATGGAGACGTCAGATTCGACAGTTT

TCACCGAAAGCCAGGAATCGAA

Şekil: 3’ RACE primerlerinin çoğalttığı transferine ait sekansın veri tabanındaki diğer transferin sekansları ile benzerliklerinin karşılaştırılması

Elde edilen tüm diziler bilinen diziler ile karşılaştırılarak birleştirilmiş, doğruluğu kontrol edilmiş ve

transferin geninin tüm cDNA sekansı elde edilmiştir. Buna göre Ephestia kuehniella’da transferini

kodlayan dizi aşağıda verilmiştir.

>Ephestia kuehniella transferin

TCGCGGATCCAGACGCTGCGTTTGCTGGCTTTGATGAAAAGTATCTCGGCAAGTGTCATCGTGGCCAGTGGTCACACAACATGGCTTTAAAATATTTACCGTGGCTAATTGCATTGATCGTTTGTGTTCATAGCAAATCACCGTATAAAATATGTGTGCCGGCACAATTCATGAAGGATTGCGAGATCATGCTGGAGGTAGAAACAAAAAGCAAGGAGAAACTAGAATGTGTGGCGGCCCGAGATAGAATGGAGTGCCTGCAGTACATACAACAACGCCAAGCGGACTTCGTCCCTGTGGACCCTGAAGACATGTATGTGGCTTCCAAAATACCCAACCAGGACTTCGTTCTCTTCCAAGAGTACAGAACTGATGATGAGCCAGATGCGGAGTTCCGGTACCAAGCCGTGATTGTGGTCCACAAGGATTTGCCGATCAATAGCTTGGACGGACTCAAAGGATTAAAGTCTTGCCACACTGGGGTCAACAGAAACGTCGGATATAAAATACCACTGACAATGCTAATGAAACGTGAAGTATTCCCAAAAATGAACAACCGGGAGATATCGCCGAAGGAAAATGAGCTGAAAGCGCTATCCTCATTCTTCAAGCAGTCCTGCATTGTGGGCTCTTGGTCGCCCGACCCAAAGGTCAATAGTTTGTGGAAGAAACAATACAGTCAGCTATGTTCGTTGTGTCAGTTCCCTGATAAATGCGACTATCCTGACGAGAACAGCGGTTACGAAGGGGCGCTCAGATGCTTGGCCCATAATGGCGGCGAAGTCGCTTTCACTAAAGTCTTCTACGTCCACAAATTCTTTGGATTACCCCTAGGTACAATCCCAGCATCCGCTTCATCGGAAGACCCAACCAACTTCAGATATCTCCGTGTTGATGGTTCTAAAGTCCCGGTCGGTGATAGAAGACCATGTTCATGGGCCGCCAGACCATGGCAAGGTCTACTTGGTCATAACGATGTTTTGGCTCGTTTGACGCCCCTGAGAGAGAAAATTAAGCAGCTTTCCAACGCTGGTGCAAACGCAAAACCTGGCTGGTCCACCAACGTATTGGGTCTCTCTGAGAAAATCCACCATGTGGCAGATAACATTCCCATCAAGCCTAAGGCATACTTGGACAAAGCTAATTACACTGCGGTGATTGAAAGGGGACATGGACCTCCAGAACCTATTGTCAGGATGTGTGTGACGTCGAACGTAGCGCTGGAGAAGTGTCGTGCTATGTCTGTGTTCGCCTTCAGCCGGGACATCCGGCCCATGCTGGACTGTGTTCAGGAGCCTTCCGACGACGACTGCTTGCGGAGCGTCCGAGACAACGGCTCTGACCTGGCTGCAGTGGACGACATCAGAGTGGCCTCTGCCTCCAACAAATACGGCCTGCACCCGGTCTTTCACGAGGTGTATGGAGACAAGAAGACACCCCACTATGCCGTCGCTGTGATCAAGAAGGGCACCACTTACAACACTATAGATGACTTGAGAGGCAAAAGGTCATGCCACAATTCTTACGGAACCTTCAGTGGTCTTCACGCACCGCTGTTCTACCTCATCAACAAGGGGAAAATTACCAATTCTAACGGACAGTGCGTTCAAAAGATGTCAGAATTCTTCTCTGCAGGATCATGTTTACCTGGGGTTGATAAGCCAGAAAATAACCCAAAAGGAGATGACGTATCATCGCTGAAGAAACAATGTTTGAGCGACAACA

CTCCTCTGAAATGTCTTCAGGAAGGTCGAGCCGACGTTGTCTTCGTGTCTAGCGCAGACTTAGATAAATACGATGAGTCAGAATACGAACTGCTTTGCCTAAACAGAGAGACGGGTGGTCGCGACAAACTGTCCAACTACCCGACATGTAACATCGTCATGGCACCTTCTAGAGCCTGGCTTTCGGTGAAAACTGTCGAATCTGACGTCTCCATAGCGTTCACTCCATTAAGTCTGGCCAAGTTATTGGAAAAAAGGACTGATCTCTTCAACATTTATGGAGAGTTCTTGAAGAACAATAATATACTTTTTAGTAATGGCGCTACGGGTTTAGAAAGTACGATGAATTTCGACTTCGACAAGTTCAAGACTTATCACGATGTTATTTCTAACTGTGGATTAGCTTAACCGAGATACAAAAAGTGATTGAAATTATTTTTTTAAGTTACGTTTGTTAGTCTGCGGATTAACTTAACCGAGATACAAGATATGAAATTATTTTTTTAAGTTTCGTTTGTTAGTATGTAGGTAACTAACATAGGTTAATTTAATTTGGTTAGATAATGGAAAATCCCATTTCTGAATCTCATCCCATTTAAAAGTCTGAGTTGTATACATACTGACATTATGATAATAAATGAATACTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Şekil: Ephestia transferin sekansının genel veri tabanındaki diğer dizilerle karşılaştırılması RACE tekniği kullanılarak E. kuehniella’ya ait transferin geninin tüm sekansı çıkarılmıştır. Buna göre

tüm cDNA uzunluğu 2458 bç olarak saptanırken, ORF (open reading frame-açık okuma çerçevesi)’nin

uzunluğu 2052 bç olarak bulunmuştur. Saptanan transferin geninin moleküler kütlesi (molecular mass)

76.319 Da olup izoelektrik noktası (isoelectric point) (pI) 8.63 olarak hesaplanmıştır.

5’UTR (5’ transle olmamış bölge)

Kodlama bölgesi 3’ UTR (3’ transle olmamış bölge)

Poly A kuyruğu

80 bp 2052 bp 265 bp 25 bp

Ephestia transferin geninin dizisinin incelenmesi sonucunda 80 bç’lik bir 5’ UTR (5’ transle olmamış

bölge) bulunurken, 3’ ucunda ise 265 bç’lik 3’ UTR (3’ transle olmamış bölge) bulunmaktadır. 3’

RACE kullanılarak yapılan analiz sonucunda transferin geninin 3’ ucunda 25 bç uzunluğunda bir poly

A kuyruğuna sahip olduğu saptanmıştır.

Açık okuma çerçevesi nükleotid ve aminoasit sekanslarıyla birlikte aşağıda verilmiştir.

81 atggctttaaaatatttaccgtggctaattgcattgatcgtttgt

M A L K Y L P W L I A L I V C

126 gttcatagcaaatcaccgtataaaatatgtgtgccggcacaattc

V H S K S P Y K I C V P A Q F

171 atgaaggattgcgagatcatgctggaggtagaaacaaaaagcaag

M K D C E I M L E V E T K S K

216 gagaaactagaatgtgtggcggcccgagatagaatggagtgcctg

E K L E C V A A R D R M E C L

261 cagtacatacaacaacgccaagcggacttcgtccctgtggaccct

Q Y I Q Q R Q A D F V P V D P

306 gaagacatgtatgtggcttccaaaatacccaaccaggacttcgtt

E D M Y V A S K I P N Q D F V

351 ctcttccaagagtacagaactgatgatgagccagatgcggagttc

L F Q E Y R T D D E P D A E F

396 cggtaccaagccgtgattgtggtccacaaggatttgccgatcaat

R Y Q A V I V V H K D L P I N

441 agcttggacggactcaaaggattaaagtcttgccacactggggtc

S L D G L K G L K S C H T G V

486 aacagaaacgtcggatataaaataccactgacaatgctaatgaaa

N R N V G Y K I P L T M L M K

531 cgtgaagtattcccaaaaatgaacaaccgggagatatcgccgaag

R E V F P K M N N R E I S P K

576 gaaaatgagctgaaagcgctatcctcattcttcaagcagtcctgc

E N E L K A L S S F F K Q S C

621 attgtgggctcttggtcgcccgacccaaaggtcaatagtttgtgg

I V G S W S P D P K V N S L W

666 aagaaacaatacagtcagctatgttcgttgtgtcagttccctgat

K K Q Y S Q L C S L C Q F P D

711 aaatgcgactatcctgacgagaacagcggttacgaaggggcgctc

K C D Y P D E N S G Y E G A L

756 agatgcttggcccataatggcggcgaagtcgctttcactaaagtc

R C L A H N G G E V A F T K V

801 ttctacgtccacaaattctttggattacccctaggtacaatccca

F Y V H K F F G L P L G T I P

846 gcatccgcttcatcggaagacccaaccaacttcagatatctccgt

A S A S S E D P T N F R Y L R

891 gttgatggttctaaagtcccggtcggtgatagaagaccatgttca

V D G S K V P V G D R R P C S

936 tgggccgccagaccatggcaaggtctacttggtcataacgatgtt

W A A R P W Q G L L G H N D V

981 ttggctcgtttgacgcccctgagagagaaaattaagcagctttcc

L A R L T P L R E K I K Q L S

1026 aacgctggtgcaaacgcaaaacctggctggtccaccaacgtattg

N A G A N A K P G W S T N V L

1071 ggtctctctgagaaaatccaccatgtggcagataacattcccatc

G L S E K I H H V A D N I P I

1116 aagcctaaggcatacttggacaaagctaattacactgcggtgatt

K P K A Y L D K A N Y T A V I

1161 gaaaggggacatggacctccagaacctattgtcaggatgtgtgtg

E R G H G P P E P I V R M C V

1206 acgtcgaacgtagcgctggagaagtgtcgtgctatgtctgtgttc

T S N V A L E K C R A M S V F

1251 gccttcagccgggacatccggcccatgctggactgtgttcaggag

A F S R D I R P M L D C V Q E

1296 ccttccgacgacgactgcttgcggagcgtccgagacaacggctct

P S D D D C L R S V R D N G S

1341 gacctggctgcagtggacgacatcagagtggcctctgcctccaac

D L A A V D D I R V A S A S N

1386 aaatacggcctgcacccggtctttcacgaggtgtatggagacaag

K Y G L H P V F H E V Y G D K

1431 aagacaccccactatgccgtcgctgtgatcaagaagggcaccact

K T P H Y A V A V I K K G T T

1476 tacaacactatagatgacttgagaggcaaaaggtcatgccacaat

Y N T I D D L R G K R S C H N

1521 tcttacggaaccttcagtggtcttcacgcaccgctgttctacctc

S Y G T F S G L H A P L F Y L

1566 atcaacaaggggaaaattaccaattctaacggacagtgcgttcaa

I N K G K I T N S N G Q C V Q

1611 aagatgtcagaattcttctctgcaggatcatgtttacctggggtt

K M S E F F S A G S C L P G V

1656 gataagccagaaaataacccaaaaggagatgacgtatcatcgctg

D K P E N N P K G D D V S S L

1701 aagaaacaatgtttgagcgacaacactcctctgaaatgtcttcag

K K Q C L S D N T P L K C L Q

1746 gaaggtcgagccgacgttgtcttcgtgtctagcgcagacttagat

E G R A D V V F V S S A D L D

1791 aaatacgatgagtcagaatacgaactgctttgcctaaacagagag

K Y D E S E Y E L L C L N R E

1836 acgggtggtcgcgacaaactgtccaactacccgacatgtaacatc

T G G R D K L S N Y P T C N I

1881 gtcatggcaccttctagagcctggctttcggtgaaaactgtcgaa

V M A P S R A W L S V K T V E

1926 tctgacgtctccatagcgttcactccattaagtctggccaagtta

S D V S I A F T P L S L A K L

1971 ttggaaaaaaggactgatctcttcaacatttatggagagttcttg

L E K R T D L F N I Y G E F L

2016 aagaacaataatatactttttagtaatggcgctacgggtttagaa

K N N N I L F S N G A T G L E

2061 agtacgatgaatttcgacttcgacaagttcaagacttatcacgat

S T M N F D F D K F K T Y H D

2106 gttatttctaactgtggattagcttaa 2132

V I S N C G L A *

Methionin ile başlayıp Alanin ile sona eren transferin dizisini kodlayan aminoasitlerin dizisi aşağıda

verilmiştir.

MALKYLPWLIALIVCVHSKSPYKICVPAQFMKDCEIMLEVETKSKEKLECVAARDRMECLQYIQQRQAD

FVPVDPEDMYVASKIPNQDFVLFQEYRTDDEPDAEFRYQAVIVVHKDLPINSLDGLKGLKSCHTGVNRN

VGYKIPLTMLMKREVFPKMNNREISPKENELKALSSFFKQSCIVGSWSPDPKVNSLWKKQYSQLCSLCQ

FPDKCDYPDENSGYEGALRCLAHNGGEVAFTKVFYVHKFFGLPLGTIPASASSEDPTNFRYLRVDGSKV

PVGDRRPCSWAARPWQGLLGHNDVLARLTPLREKIKQLSNAGANAKPGWSTNVLGLSEKIHHVADNIPI

KPKAYLDKANYTAVIERGHGPPEPIVRMCVTSNVALEKCRAMSVFAFSRDIRPMLDCVQEPSDDDCLRS

VRDNGSDLAAVDDIRVASASNKYGLHPVFHEVYGDKKTPHYAVAVIKKGTTYNTIDDLRGKRSCHNSYG

TFSGLHAPLFYLINKGKITNSNGQCVQKMSEFFSAGSCLPGVDKPENNPKGDDVSSLKKQCLSDNTPLK

CLQEGRADVVFVSSADLDKYDESEYELLCLNRETGGRDKLSNYPTCNIVMAPSRAWLSVKTVESDVSIA

FTPLSLAKLLEKRTDLFNIYGEFLKNNNILFSNGATGLESTMNFDFDKFKTYHDVISNCGLA

MetAlaLeuLysTyrLeuProTrpLeuIleAlaLeuIleValCysValHisSerLysSerProTyrLysIleCysValProAlaGln

PheMetLysAspCysGluIleMetLeuGluValGluThrLysSerLysGluLysLeuGluCysValAlaAlaArgAspArgMe

tGluCysLeuGlnTyrIleGlnGlnArgGlnAlaAspPheValProValAspProGluAspMetTyrValAlaSerLysIlePro

AsnGlnAspPheValLeuPheGlnGluTyrArgThrAspAspGluProAspAlaGluSerArgTyrGlnAlaValIleValVal

HisLysAspLeuProIleAsnSerLeuAspGlyLeuLysGlyLeuLysSerCysHisThrGlyValAsnArgAsnValGlyTyr

LysIleProLeuThrMetLeuMetLysArgGluValPheProLysMetAsnAsnArgGluIleSerProLysGluAsnGluLeu

LysAlaLeuSerSerPhePheLysGlnSerCysIleValGlySerTrpSerProAspProLysValAsnSerLeuTrpLysLysGl

nTyrSerGlnLeuCysSerLeuCysGlnPheProAspLysCysAspTyrProAspGluAsnSerGlyTyrGluGlyAlaLeuA

rgCysLeuAlaHisAsnGlyGlyGluValAlaPheThrLysValPheTyrValHisLysPhePheGlyLeuProLeuGlyThrIl

eProAlaSerAlaSerSerGluAspProThrAsnPheArgTyrLeuCysValAspGlySerLysValProValGlyAspArgAr

gProCysSerTrpAlaAlaArgProTrpGlnGlyLeuLeuGlyHisAsnAspValLeuAlaArgLeuThrProLeuArgGluL

ysIleLysGlnLeuSerAsnAlaGlyAlaAsnAlaLysProGlyTrpPheThrAsnValLeuGlyLeuSerGluLysThrHisHi

sValAlaAspAsnIleProIleLysProLysAlaTyrLeuAspLysAlaAsnTyrThrAlaValIleGluArgGlyHisGlyProLe

uGluProIleValArgMetCysValThrSerAsnValArgAlaGlyGluValSerCysTyrValCysValArgLeuGlnProGly

HisProAlaHisAlaGlyLeuCysSerGlyAlaPheArgArgArgLeuLeuAlaGluArgProArgGlnArgLeuProGlyCys

SerGlyArgHisHisAspValAlaSerAlaSerAsnLysTyrGlyLeuHisProValPheHisGluValTyrGlyAspLysLysT

hrProHisTyrAlaValAlaValIleLysLysGlyThrThrTyrAsnThrIleAspAspLeuArgGlyLysArgSerCysHisAsn

SerTyrGlyThrPheSerGlyLeuHisAlaProLeuPheTyrLeuIleAsnLysGlyLysIleThrAsnSerAsnGlyGlnCysV

alGlnLysMetSerGluPhePheThrAlaGlySerCysLeuProGlyValAspLysProGluAsnAsnProLysGlyAspAsp

ValSerSerLeuLysLysGlnCysLeuSerAspAsnThrProLeuLysCysLeuGlnGluGlyArgAlaAspValAlaPheVa

lSerSerAlaAspLeuAspLysTyrAspGluSerGluTyrGluLeuLeuCysLeuAsnArgGluThrGlyGlyArgAspLysL

euSerAsnTyrProThrCysAsnIleValMetAlaProSerArgAlaTrpLeuSerValLysThrValGluSerAspValSerIle

AlaPheThrProLeuSerLeuAlaLysLeuLeuGluLysArgThrAspLeuPheAsnIleTyrGlyGluPheLeuLysAsnAs

nAsnIleLeuPheSerAsnGlyAlaThrGlyLeuGluSerThrMetAsnPheAspPheAsnLysPheLysThrTyrHisAspV

alIleSerAsnCysGlyLeuAla

Lepidoptera takımına ait böceklerde saptanmış transferin sekansları ile Ephestia’ya ait transferin

sekanslarının karşılaştırılması Clustal W programı ile yapılarak aşağıda verilmiştir

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw).

CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment Manduca ------------------------------------------------------------ Bombyx ------------------------------------------------------------ Galleria CTCGTATCCCTAACGCACAAAATAGATACCTAGTGAATTAATATAAAAGTAACTGGTAGT 60 Choristoneura ------------------------------------------------------------ Chilo ------------------------------------------------------------ Plutella ------------------------------------------------------------ eph ------------------------------------TCGCGGATCCAGACGCTGCGTTTG 24 Manduca -------------------------GAACGAACGTTGG------TCGCCTTGA-CCATGG 28 Bombyx -------------------------CAGAGCTTGTCGG------TTGCCTTGA-CAATGG 28 Galleria TGTCATACAAGTTGTAGTGTGTTTACAAGAGCCGCTGTGT----TCACATTAAACTATGA 116 Choristoneura -------------AGTGTGGACTTGTGGCTGACTTGATCGG---CTGTGTG-GACCATGA 43 Chilo -----------------GGCATTTATCGTGGTCGCGCGCGG---TCGTATGTGACCATGG 40 Plutella -------------TTTGCGAGTTCAGTCGTATGGTCAATGAA--AAATCAGTGACCATGA 45 eph CTGGCTTTGATGAAAAGTATCTCGGCAAGTGTCATCGTGGCCAGTGGTCACACAACATGG 84 *** Manduca CTTTGA---AACTTTTAACTTTGATAGCCCTGACTTGTGCGGCTGCGAATGCAGCTAAAT 85 Bombyx CTTTAA---AATATTTCATTTTGATAACCCTGATTTGTGCATGTGTGAACGCAGCGAAAA 85 Galleria CATTCA---AGTGTATTGTGTTATTGAT--AGCACTGGCCGGTTGTATCTACGGC-AAAC 170 Choristoneura CATTGA---AATATCTC---CTAGTGTTGGTGGCCCTGACCGGAGCG--CACTGC-AAAA 94 Chilo CATCGACAAAATACATCGCGCTTGTTCTTTTGTTTATTGCAAGTGCC--TCGTGC-AAAT 97 Plutella TAGTGAAAATAGCCATTTTGGTGATAGCAATAACGTTCAACGATGTG---TCTGCGAAAA 102 eph CTTTAA---AATATTTACCGTGGCTAAT--TGCATTGATCGTTTGTGTTCATAGC-AAAT 138 * * * * ** *** Manduca CTTCATACAAACTATGCGTGCCAGCAGCATACATGAAGGACTGCGAGCAGATGCTTGAAG 145 Bombyx TTACATATAAAATATGCGTGCCATCACAACACCTGAAAGCGTGTCAGGACATGGTGGATA 145 Galleria CAAATTATAAAATATGCGTGCCCCAAAAATTTTTAAAGGAGTGCGAGCAGATGTTGGAAG 230 Choristoneura CAGCATATAAAATATGTGTTCCTGTGCAGCATTTGAAAGCTTGCCAGGCCATGCTGGAGG 154 Chilo CACCATATAAAATATGTGTACCAA--CAACACCTCAAAGCTTGCGAGGAAATGCTGCAAG 155 Plutella CTTCGTACAAGATCTGCGTACCGTCTCAGTTCATGAAGGCATGTGAACAAATGCTTGAAG 162 eph CACCGTATAAAATATGTGTGCCGGCACAATTCATGAAGGATTGCGAGATCATGCTGGAGG 198 ** ** * ** ** ** * ** * ** * *** * * Manduca TACCCACGAAGTCTAAAGTGGCCTTGGAATGTGTACCGGCTAGAGACAGGGTGGAATGCC 205 Bombyx TTCCGACCAAATCCAAGGTCACACTAGACTGCATTCCCGCCAGAGATAGAATGGAGTGTC 205 Galleria TAGAAACAAAAAGCAAAGCCGTTTTAAAATGTGTAGCAGCTAGGGACCGAGTAGAATGTT 290 Choristoneura TGGAGACCAAAAGCAAGGCGGCATTGGAATGTGTAACCGCTAGAGACAGGGTAGAATGTC 214 Chilo TAGAAACAAAAAGCAAAGTTGCATTAGAATGTATCCCAGCTAGAGACAGAATGGAGTGTT 215 Plutella TGGAAACGAAGAGCAAAGCGATACTGGAATGTTTGCCGGCCAGAGATCGAGTGGAATGCC 222 eph TAGAAACAAAAAGCAAGGAGAAACTAGAATGTGTGGCGGCCCGAGATAGAATGGAGTGCC 258 * ** ** ** * * * ** * * ** * ** * * ** ** Manduca TCAGCTTTGTTCAGCAGCGACAGGCGGACTTCGTCCCCGTCGACCCTGAGGACATGTACG 265 Bombyx TGAATTACGTTCAGCAGAGGCAAGCCGATTTCGTTCCAGTCGACCCGGAAGACATGTACG 265 Galleria TGGATTTTATACTACAGCGTCAAGCTGACTTTGTGCCAGCTGATCCTGAAGATATGTACT 350 Choristoneura TGTATCAAGTGCAGCAGCGGCAGGCGGACTTGGTGCCCGTGGACCCTGAAGACATGTATG 274 Chilo TGAACCATGTACAGCAAAGGCAGGCTGATTTCGTGCCCGTAGACCCTGAGGATATGTACG 275 Plutella TGACCCTGGTGCAGCAACGGCAGGCGGACCTCGTCCCAGTGGACCCTGAAGACATGTACG 282 eph TGCAGTACATACAACAACGCCAAGCGGACTTCGTCCCTGTGGACCCTGAAGACATGTATG 318 * * * ** * ** ** ** * ** ** * ** ** ** ** ***** Manduca TGGCCTCCAAGATCCCCAACCAGGACTTCGTCGTCTTCCAGGAGTACAGGACTGATGAAG 325 Bombyx TGGCCGCCAAAATACCCAATCAGGACTTCGTCGTTTTCCAGGAGTACAGAACCGATGAAG 325 Galleria TAGCGTCTAAAATGCCCAATCAGGATTTTTACGTCTTCCAAGAGTTCAGAACTTATGATG 410 Choristoneura TGGCGACTAACATACCGAACCAAGACTTTGTTCTCTTTCAAGAATACAGGACTGAAGACG 334 Chilo TGGCTACGAAAATACCAAACCAGGACTTCATTCTCTTCCAGGAGTACAGAACTAAGGATG 335 Plutella TGGCGAGTAAGCTGCCCAACCAGGACTTTGTGCTTTTCCAGGAGTTCCGGACCGATGAAG 342 eph TGGCTTCCAAAATACCCAACCAGGACTTCGTTCTCTTCCAAGAGTACAGAACTGATGATG 378 * ** ** * ** ** ** ** ** * ** ** ** * * * ** * ** * Manduca AGCCTGATGCGCCATTCCGTTATGAAGCCGTTATTGTGGTTCACAAAGACCTACCCATCA 385 Bombyx AACCGGATGCGCCTTTCCGTTACGAAGCAGTAATTGTCATCCATAAGGATTTACCGATAG 385 Galleria AACCTGATGCTGAGTTCCGTTACCAAGCTGTTATAGTAGTTCACAAGGATCTCCCGATTA 470 Choristoneura AACCGGACGCGGAATTCCGGTACCAAGCTGTCATTGTGGTCCACAAAGACCTGCCTGTGA 394 Chilo AACCTGACGCGGAGTTCCGTTACGAAGCTGTAATCGTGGTGCACAAGGATCTGCCAGTAA 395 Plutella AGCCGGATGCGGAGTTCCGTTACGAGGCCGTCATAGTTGTTCACAAGGACCTTCCAGTTA 402 eph AGCCAGATGCGGAGTTCCGGTACCAAGCCGTGATTGTGGTCCACAAGGATTTGCCGATCA 438

* ** ** ** ***** ** * ** ** ** ** * ** ** ** * ** * Manduca ACAACTTGGATCAGCTGAAGGGACTGAGGTCTTGCCACACCGGAGTCAATCGTAACGTCG 445 Bombyx ACAATCTGGACCAGCTGAAAGGCTTGAAGTCTTGTCATACTGGAGTTAACAGAAACGTGG 445 Galleria ATAATTTGGACCAACTCAAAGGATTGAAGTCATGTCACACTGGTGTTAATAGAAACGTTG 530 Choristoneura ACAATCTCGACCAGCTGAAAGGTTTGAAGTCCTGCCACACCGGGGTCAACAGAAACGTTG 454 Chilo ACAACTTGGACCAGTTGAAAGGCCTGAAGTCTTGCCACACCGGGGTCAACAGAAACGTGG 455 Plutella CCAACTTGGACCAGCTTAAGGGCTTGAAGTCATGCCATACTGGAATCAATAGAAATGTGG 462 eph ATAGCTTGGACGGACTCAAAGGATTAAAGTCTTGCCACACTGGGGTCAACAGAAACGTCG 498 * * ** * ** ** * * *** ** ** ** ** * ** * ** ** * Manduca GGTACAAGATCCCACTAACGATGTTGATGAAACGTGCCGTGTTCCCGAAAATGAACGACC 505 Bombyx GATACAAGATCCCTCTAACAATGCTGATGAAGCGTGCAGTTTTCCCAAAAATGAACGACC 505 Galleria GTTATAAGATACCATTAACAATGCTGATGAAAAGACCGATATTCCCGAAGATGAACGATC 590 Choristoneura GTTATAAGATACCTCTAACGATGCTGATGAAACGCAACGTGTTCCCCAAAATGAACGACC 514 Chilo GCTATAAGATACCTCTGACTATGCTGATGAAGCGTACCGTATTCCCCAAGATGAATGACT 515 Plutella GGTACAAGATACCACTAACGATGCTGATGAAGCGCTCCGTGTTCCCTGCGATGACAGACC 522 eph GATATAAAATACCACTGACAATGCTAATGAAACGTGAAGTATTCCCAAAAATGAACAACC 558 * ** ** ** ** * ** *** * ***** * * ***** **** * Manduca ACAGCATTTCGCCGAAAGAGAACGAACTGAAAGCGCTATCGACGTTCTTCGCAAAGTCGT 565 Bombyx ACAGCATTTCGCCGAAGGAAAACGAACTAAAAGCCTTGTCGACGTTCTTCACGAAATCTT 565 Galleria ACTCAATATCGCCCAAGGAGAACGAACTAAGAGCCCTGTCCACATTCTTCAAACAGTCCT 650 Choristoneura CCCACTACTCCCCGAAAGAGAACGAGCTGCGGGCGTTCTCCACATTCTTCAAACAGTCCT 574 Chilo ACAGCATATCACCCAAAGAGAATGAATTGCGGGCTCTTTCTACTTTCTTTTCGCAATCGT 575 Plutella GCAGCATCTCTCCTAAAGAGAACGAGCTGAAGGCTCTCTCGACGTTCTTCAGCAAGTCCT 582 eph GGGAGATATCGCCGAAGGAAAATGAGCTGAAAGCGCTATCCTCATTCTTCAAGCAGTCCT 618 ** ** ** ** ** ** * ** * ** * ***** * ** * Manduca GCATCGTCGGCAAATGGTCGCCTGACCCCAAAACCAACTCGGCTTGGAAATCACAATACA 625 Bombyx GCATCGTAGGTAAATGGTCTCCGGATCCGAAAACAAACTCGGCTTGGAAGGCCCAATACA 625 Galleria GCATTGTCGGCACTTGGTCACCAGATGAAAAGACTACCAGAGCTTGGAAATCCCAATATA 710 Choristoneura GCATCGTTGGCAACTGGTCGCCCGATCAGAGGACCAACTCGGCATGGAAGGCGCAATACA 634 Chilo GCATCGTGGGCAAATGGTCGCCAGATCCGAAGACCAATACCGCTTGGAAGGGACAATACA 635 Plutella GCATCGTCGGCCAGTGGTCGCCTGACCCGAAGACCAACACTTTCTGGAAGTCCCAATCCA 642 eph GCATTGTGGGCTCTTGGTCGCCCGACCCAAAGGTCAATAGTTTGTGGAAGAAACAATACA 678 **** ** ** ***** ** ** * * ***** **** * Manduca GCCATTTGTGTTCAATGTGCGAACACCCGGAGCGTTGTGACTATCCCGACAATTACAGCG 685 Bombyx ACAAGCTATGCTCTATGTGCGAACATCCAGAGAGATGCGACTATCCCGACGAATTCAGCG 685 Galleria GCAAACTATGTGCACTGTGCCAACACCCAGACAAATGCGACTATCCGGATGACTTCAGTG 770 Choristoneura GCCAGCTCTGTGCTTTATGCGAGCACCCGGACAAATGCAACTACCCGGACAACTTCAGTG 694 Chilo GGCAACTATGTTCTCTTTGCGAACATCCGGATAAATGTGACTACCCAGACAACTACAGTG 695 Plutella GCAAGCTATGCTCCATGTGCGAGGACCCTGCCAAGTGCGACTACCCCGACAACTACAGCG 702 eph GTCAGCTATGTTCGTTGTGTCAGTTCCCTGATAAATGCGACTATCCTGACGAGAACAGCG 738 * * ** * * ** * ** * ** **** ** ** * *** * Manduca GGTACGAGGGCGCGTTGAGATGCCTCGCCCACAACAACGGGGAGGTCGCGTTCACCAAAG 745 Bombyx GCTACGTGGGCGCATTGAATTGTCTGGCTCACAACAACGGACAAGTCGCCTTCACCAAAG 745 Galleria GTTACGAGGGTGCATTAAGGTGTCTGGCACACAACGGTGGTGAAGTGGCCTTCACTAAAG 830 Choristoneura GTTACGACGGCGCTCTTCGCTGTTTAGCGCACAATGGCGGAGAGGTCGCGTTCACTAAGG 754 Chilo GTTATGAAGGAGCTCTAAGATGTTTGGCTCACAATGGCGGTCAGGTTGCCTTCACCAAAG 755 Plutella GCTACGAGGGCGCGCTGCGCTGCCTGGCGCACAACGGCGGCGACGTGGCCTTCACTAAGG 762 eph GTTACGAAGGGGCGCTCAGATGCTTGGCCCATAATGGCGGCGAAGTCGCTTTCACTAAAG 798 * ** * ** ** * ** * ** ** ** ** * ** ** ***** ** * Manduca TCATATTCACACGTAAATTCTTTGGGCTTCCAGTAGGTACCACTCCAGCGAGTCCATCAA 805 Bombyx TCATATTCACCAGGAAATTCTTCGGATTGCCCGTCGGTACCACTCCAGCGAGTCCTTCAA 805 Galleria TCTTCTTTGTGCACAAATTCTTTGGTCTTCCCTTAGGCACGATACCCGCCAAACCTTCAA 890 Choristoneura TCATCTATGTCCGGAAGTTCTTTGGGCTCCCAGTAGGAACCATCCCAGCCAGCCAATCAT 814 Chilo TCATCTATGTTCGCAAATTCTTCGGGCTCCCGGTCGGAACTATCCCAGCTAGTACGTCAA 815 Plutella TCATCTATGTGCGGAAGTTCTTTGGGCTCCCAGTAGGCACAAGCCCGGCGACTCCTTCTT 822 eph TCTTCTACGTCCACAAATTCTTTGGATTACCCCTAGGTACAATCCCAGCATCCGCTTCAT 858 ** * * ** ***** ** * ** * ** ** * ** ** ** Manduca ACGAAAATCCCGAAGAGTTCAGATATCTCTGCGTGGACGGATCTAAAGCCCCCATCACTG 865 Bombyx ACGAGAACCCTGATGAATACAGGTATCTCTGCGTGGACGGTTCTAAAGTGCCGATAAGGG 865 Galleria CGGAAGACCCGAAACAATTTAGGTACCTTTGCGTTGATGGATCTAAGGTTCCAATTGGTG 950 Choristoneura CGGAGAACCCCGACGAATTCGCATATCTTTGCGCTGACGGGTCTAAAGTGCCGGTCAGAG 874 Chilo ACGAAAACCCCGATGATTTCGCGTACCTCTGCGCTGATGGGTCTAAGGTACCCATCAGGA 875 Plutella CTGAGAACCCGGACAACTTCGCGTACCTTTGCGCGGACGGGTCCAAGGTCCCTATCAGAG 882 eph CGGAAGACCCAACCAACTTCAGATATCTCCGTGTTGATGGTTCTAAAGTCCCGGTCGGTG 918 ** * ** * * ** ** * * ** ** ** ** * ** * Manduca GCAAGG---CTTGTTCATGGGCTGCCAGACCTTGGCAAGGACTGATCGGTCACAATGACG 922 Bombyx ACAAGG---CCTGCTCTTGGGCGGCTAGACCGTGGCAGGGACTGATCGGACATAACGACG 922 Galleria ACAAAC---CTTGTACTTGGGCCGCGAGACCTTGGCAGGGTTTGATTGGGCACAACGATG 1007 Choristoneura AAAAGG---CCTGTTCCTGGGCAGCGAGACCGTGGCAAGGCCTGTTGGGGCACAATGACG 931 Chilo GCACGG---CTTGCTCGTGGGCCGCGAGACCTTGGCAGGGCCTGATGGGCCACAACGATG 932 Plutella GAAAGG---CATGTTCTTGGGCCGCAAGACCGTGGCAGGGGTTGTTGGGACATCAGGACG 939 eph ATAGAAGACCATGTTCATGGGCCGCCAGACCATGGCAAGGTCTACTTGGTCATAACGATG 978 * * ** * ***** ** ***** ***** ** * * ** ** * ** * Manduca TACTTGCCAAACTCGCTCCGCTCAGAGAGAAGGTTAAGCAACTTGCTGATTCTGGTGCAG 982 Bombyx TTCTGGCTAAACTTAGCCCGCTGAGGGAGAAAATAAAGCAGTTGGCTGATGCCGGTTCCT 982 Galleria TCTTAGCTCAACTTTCACCTCTCAGGGAAAAGGTTAAGCAATTGGCTAATGCAGGAGCTA 1067

Choristoneura TTACAGCCAAACTGACGCCTTTGATGGAGAAGATAAAGCAGCTTGCTGTAGCTGGTTGGG 991 Chilo TACTAGTCAGGATATCACCGCTGAGGGAGAAGATAAAGCAACTCTCAGAAATTGGACTCG 992 Plutella TTCTGGCCAAATTGTCGCCTTTGAGGGAGAAGATTAAGCAGCTGTCTAGAGCTGGAGCAG 999 eph TTTTGGCTCGTTTGACGCCCCTGAGAGAGAAAATTAAGCAGCTTTCCAACGCTGGTGCAA 1038 * * * ** * * ** ** * ***** * * ** Manduca CTGACAAA------CCGGAGTGGTTCACCAAAGTCCTTGGTCTATCAGAGAAGATCCACC 1036 Bombyx CAAGCCAA------CCCGAGTGGTTCACCAAAGTTCTAGGGCTATCAGACAAAATCCACT 1036 Galleria GCACCACA------CCAAGCTGGTTCACAAACGTTCTAGGCCTTTCGGAAAAGATGCATC 1121 Choristoneura CCACCCAACCCCCACCAGACTGGTTCACCAACGTACTTGGTCTCACCGATAAGATTCACC 1051 Chilo CAAGCAAG------CCGGAATGGTTCACTAAAGTATTGGGACTCTCCGAGAAGATCAACC 1046 Plutella AATCGAAG------CCGGAGTGGTTCACCAACGTTCTAGGCCTCTCTGAAAAGATCCACT 1053 eph ACGCAAAA------CCTGGCTGGTCCACCAACGTATTGGGTCTCTCTGAGAAAATCCACC 1092 ** **** *** ** ** * ** ** * ** ** ** * Manduca ATGTCGCTGACAATATCCCAATCAAGCCCATCGACTACCTGAACAAGGCTAACTACACGG 1096 Bombyx ACGTGGCCGACAATATTCCGATCAAAGCGATTGACTATTTGAACAAGGCCAACTACACCG 1096 Galleria ACGTCGCAGATAACATTCCAATCCCAACGTTAGACTACCTCAACAAAGCTAACTATACAG 1181 Choristoneura ACGTAGCCGACAATGTTCCCATCGCACCTGCAACATACCTTAAGAAAGCAAACTACACTG 1111 Chilo ACGTAGCAAGAAATGTGCCCATCAAGCCAGTGGACTATTTGAAGAAAGCCAACTACACGG 1106 Plutella TGGTCGCCGACAACATTCCCATTCGTCCCGTCGACTATCTGCAGAAGGCCAACTACACTG 1113 eph ATGTGGCAGATAACATTCCCATCAAGCCTAAGGCATACTTGGACAAAGCTAATTACACTG 1152 ** ** ** * ** ** * ** * * ** ** ** ** ** * Manduca AGGTCATTGAAAGAGGACATGGAGCTCCCGAGCTGGTCGTCAGGCTATGTGTGACGTCAA 1156 Bombyx AAGTCATTGAAAGAGGTCACGGTGCTCCCGAATTGGTCGTCAGATTGTGTGTCACATCAA 1156 Galleria AAGTCATTGAAAGAGGACACGGAGCCCCAGAACTGGTTGTCAGACTGTGCGTGACGTCCA 1241 Choristoneura AGGTCATTGAGAGGGGGCATGGAGTGCCAGAGCCTATTGTCAGGTTATGCGTGACGTCAA 1171 Chilo AGGTCATTGAACGCGGCCATGGACCACCGGAACCCGTGGTAAGGTTGTGCGTGACATCTA 1166 Plutella AGGTCATCGAGAGAGGGCACGGCCCGCCTGAACCTGTTGTGAGACTCTGCGTGACGAGCT 1173 eph CGGTGATTGAAAGGGGACATGGACCTCCAGAACCTATTGTCAGGATGTGTGTGACGTCGA 1212 ** ** ** * ** ** ** ** ** * ** ** * ** ** ** Manduca ACGTGGCATTATCTAAGTGCCGGGCTATGTCCGTGTTCGCATTCAGTAGAGACATCAGGC 1216 Bombyx ACGTGGCTTTAGCCAAATGCAGAGCTATGTCCGTGTTCGCGTTCAGTAGAGACATCAGAC 1216 Galleria ATGTGGCGCTAACGAAATGCAGGACTATGTCTACCTTTGCGTTCAGCAGAGACATTAGGC 1301 Choristoneura ACGTGGCGCTCGCCAAATGCCAAACCATGGCCACCTTTGCCTACAGCCGCGACATCCGCC 1231 Chilo ATGTAGCACTGGCCAAGTGTCACGCCATGTCCGTATTCGCATTCAGCCGTGACATCCGTC 1226 Plutella CGGTGGCGCTGGCGAAATGCCGCGCCATGTCCGTGTTCGCCTTCAGTAGAGACATCCGCC 1233 eph ACGTAGCGCTGGAGAAGTGTCGTGCTATGTCTGTGTTCGCCTTCAGCCGGGACATCCGGC 1272 ** ** * ** ** * *** * ** ** * *** * ***** * * Manduca CGATCCTAGACTGTGTTCAAGAAAACAGCGAAGATGCCTGTCTTAAGAGCGTCCAAGACA 1276 Bombyx CCATCCTGGATTGTGTTCAAGAGGCTTCAGAAACCGACTGCCTTAAAAGCGTTCAAGACA 1276 Galleria CGATATTGGATTGCGTGCAACAAAATTCAGATGAGGAATGTCTTAAAAGCGTACAAGACA 1361 Choristoneura CGAAGCTCGACTGTGTGCAAGAGGCTTCCGAGACAGATTGTCTTAAGAACGTACAAGATA 1291 Chilo CAAAACTCGACTGCGTTCAAGAAGCCTCCGAAGCGGACTGTTTGAAGAGCGTTCAAGATA 1286 Plutella CCCGGCTGGACTGTGTGCAAGAGGCTTCGGAAAGCGATTGCTTGAAAAGTGTCCAAGACA 1293 eph CCATGCTGGACTGTGTTCAGGAGCCTTCCGACGACGACTGCTTGCGGAGCGTCCGAGACA 1332 * * ** ** ** ** * ** * ** * * ** * *** * Manduca ACGGTTCAGATCTTGCCTCAGTAGACGATATGAGAGTAGCTGCAGCGGCTAAGAAGTACA 1336 Bombyx ATGGCTCCGATTTGGCATCAGTCGACGACATGAGGGTAGCTGCAGCAGCAAAGAAATACG 1336 Galleria ATGGTTCAGATCTAACCTCCGTGGATGCTCTGAGAGTAGCGTCAGCAAGCAAGGATTACG 1421 Choristoneura ATGGGTCGGACTTGGCGGCAGTAGACGAGATGAAAGTAGCTCAAGCCGCCAAAAAATACC 1351 Chilo ACGGCTCCGATCTAGCTTCAGTAGACGACTCAAGAGTGGCAGCCGCAGCCAATAAATATA 1346 Plutella ATGGCTCAGACCTGGCGTCAGTAGACGACATGCGGGTAGCGTCAGCATCCAACAAGTACA 1353 eph ACGGCTCTGACCTGGCTGCAGTGGACGACATCAGAGTGGCCTCTGCCTCCAACAAATACG 1392 * ** ** ** * * * ** ** * ** ** ** ** * ** Manduca ACTTACATCCAGTTTTCCACGAAGTGTATGGAGAGCTAAAGACGCCCAACTACGCAGTGG 1396 Bombyx TCTTGCACCCGGTCTTCCACGAGGTATACGGAGAAAAGAAAACTCCTAACTACGCTGTGG 1396 Galleria GCCTCCATCCAGTATTTCACGAAGTGTACGGTGCAAATAAAACATCAAACTACGCCGTAG 1481 Choristoneura ACCTCCACCCAGTTTTCCACGAAGTGTATGGGCCTGAGAAAAAACCGAGATATGCCGTAG 1411 Chilo ATCTACATGCAGTCTTCCACGAAGTGTATGGAGAAAAGAAAACAGCGAAATACGCTGTAG 1406 Plutella ACCTACATCCAGTATTCCACGAGGTATATGGAGTCAGCAAGACCCCTAACTATGCGGTAG 1413 eph GCCTGCACCCGGTCTTTCACGAGGTGTATGGAGACAAGAAGACACCCCACTATGCCGTCG 1452 * ** * ** ** ***** ** ** ** ** * * ** ** ** * Manduca CTGTTGTCAAGAAGGGCA-CTGCCTACAACAAGATCGACGACTTAAGGGGAAAGAAATCT 1455 Bombyx CTGTCGTCAAAAAAGGAA-CATCCTTCAATAAGATGGAAGATTTAAGAGGAAAGAAATCT 1455 Galleria CAGTCATCAAGAAGGGCA-CCAAGTACACAAATATTGAAGATTTGAGAGGAAAACAATCT 1540 Choristoneura CCGTTGTTAAAAAAGAGTTCAACGTTCACGAAACCGGAAGACTTGAGAGGAAAAAG-TCC 1470 Chilo CTGTCGTTAAGAAGGGAA-CAACGTATAACAAAATTGACGACTTGAGGGGAAAGAGGTCC 1465 Plutella CTGTCGTCAAGAAGAATA-CTCAGTATGGAAAGATTGAGGATTTGAGGGGAAACGG-TCC 1471 eph CTGTGATCAAGAAGGGCA-CCACTTACAACACTATAGATGACTTGAGAGGCAAAAGGTCA 1511 * ** * ** ** * * * ** ** ** ** ** ** ** Manduca TGCCACAGCTCTT-ACAGTACTTTCAGCGGTCTGCACGCGCCTCTCTTCTACCTTATTAA 1514 Bombyx TGTCACAGTTCGT-ACGGCACTTTCAGTGGACTTGACGCTCCATTGTATTATCTCATAAA 1514 Galleria TGCCACGACCCAT-TCGGATCATTCAGCGGACTGCACGCACCTCTCTACTATCTCATCAA 1599 Choristoneura TGCCATGATGCTT-TTGGTAGCTTCAGCGGACTGAAAGCGCCACTTTTCTACCTCATAAA 1529 Chilo TGTCACAATCCTT-ATGGAACCTTCAGCGGTCTAGATGCGCCGTTGTTCTACCTCATCAA 1524 Plutella TGTCACAATCCTTTATGGAAGCTTCAGTGGCTTTGATGCCCCTCTGTACTACCTTATTAA 1531 eph TGCCACAATTCTT-ACGGAACCTTCAGTGGTCTTCACGCACCGCTGTTCTACCTCATCAA 1570

** ** * * * ***** ** * * ** ** * * ** ** ** ** Manduca CAAGAGGGC------CATTCAATCTGACCACTGCGTGAAGAACTTGGGAGAATTCTTCTC 1568 Bombyx CAAGAGGAT------CATAAAACCTGATCAATGCATTAAGAACTTTGGTGATTTCTTCTC 1568 Galleria CAAGGGAAAAATAAGCACCAGTTCTAGTGAGTGCGTCAGAGACATTGGCGAGTTCTTC-- 1657 Choristoneura TAAAGGTCT------CATCACACCAGACGATTGTGTTAAGAAGATCGGAACATTCTTCTC 1583 Chilo CAAGAAGAT------CATCAAATCAGACCAGTGCGTCAAGAATTTCGCTGACTTCTTCTC 1578 Plutella TAAGAAAAT------CATAGGCACTGAACAGTGCCTGAAAAAGCTTGGAGAATTTTTCGC 1585 eph CAAGGGGAAAATTACCAATTCTAACGGACAGTGCGTTCAAAAGATGTCAGAATTCTTCTC 1630 ** ** * ** * * * ** *** Manduca AGGCGGATCTTGCTTGCCTGGTGTCGACAAACCCGAAAACAACCCAAGCGGTGATGATGT 1628 Bombyx CGGCGGTTCATGTTTGCCAGGCGTCGACAAACCAGAGAACAATCCCAGCGGTGATGATGT 1628 Galleria -GGCGGCTCATGCCTACCTGGTGTTGATGAGCCGAGATATAATCCGACAGGTGCTGATGT 1716 Choristoneura AGGAGGAGCTTGTTTGCCGGAAGTTGACAAACTCGAAAATAATCCCAAAGGTGATGACGT 1643 Chilo AGGCGGAGTATGTCTACCAGGTGTGGATAAAGCTGAAAACAATCCCAGAGGTGACAACGT 1638 Plutella AGCCGGATCTTGCTTACCTGGAGTAGGCAAATTAGAGAACAACCCTACAGGAGATAATGT 1645 eph TGCAGGATCATGTTTACCTGGGGTTGATAAGCCAGAAAATAACCCAAAAGGAGATGACGT 1690 * ** ** * ** * ** * * * ** ** * ** * * ** Manduca GTCTAAATTGAAGAAGCAATGTGGATCCGACAGCAGCGCTTGGAAGTGCTTGGAAGAGGA 1688 Bombyx ATCATCATTAAAGAAACAATGCGGAAGTGACAGCAGTCCTTGGAAATGTCTTCAGGAAGA 1688 Galleria GTCCAGGCTGAAGAAGCTATGCAAATCTAAGAA---TCCACTGAAGTGTCTTACAGAATC 1773 Choristoneura GTCAATCCTGAAGAAGCAATGTCCCGCTGACAACAAACCCTTGACTTGCCTAAAAGAGGA 1703 Chilo AGCCAATTTGAAGAAACAATGCTCTGGGGATAACAGTCCGTCTAAGTGTCTCGAAGAAAA 1698 Plutella CGATAATCTGAAGAAACAATGTTCTGGAGACAACAGCCCAATAAAATGCTTACAAGAAGA 1705 eph ATCATCGCTGAAGAAACAATGTTTGAGCGACAACACTCCTCTGAAATGTCTTCAGGAAGG 1750 * ***** * *** * * * * ** * ** Manduca CAGAGGAGACGTCGCATTTGTTTCAAGTGCCGATCTGTCCCACTTCGAC-GCCAACCAAT 1747 Bombyx TCGTGGCGATGTCGCTTTTGTGTCGAGTGCTGATTTATCAAACTTTGAT-GCTTCACAAT 1747 Galleria ACAAGCTGATGTTGCATTTGTATCAAGTGCTGACTTGGATAAATATGAC-GAGTCACAAT 1832 Choristoneura TCACGGGGATGGTGCTTTTGTATCCAGCGCCG-CTTACAAAACTTTAACCGCGTCGCAAT 1762 Chilo TCGCGCCGATGTTGCCTTTGTTTCAAGTACCGACTTATCCAACTTCGAT-ACATCACAAT 1757 Plutella CAAAGGAGACATAGCATTTGTGTCAAGTGCTGACCTGAAAAACCTGGAT-GCCTCTCAAT 1764 eph TCGAGCCGACGTTGTCTTCGTGTCTAGCGCAGACTTAGATAAATACGAT-GAGTCAGAAT 1809 * ** * ** ** ** ** * * * * * *** Manduca ACGAGCTGCTCTGCCTGAACCGCGACGCTGGCGGTAGAGATGTTCTCTCCAGTTTCGCCA 1807 Bombyx ATGAGTTGCTCTGTGTGAACCGAGAGACGGGAGGCCGTGACACTCTGTCCAACTATCCTA 1807 Galleria TTGAGCTTCTATGCCTGAACAGAGAAGCAGGTGGTCGCGATAGTCTTTCCAACTACGCTA 1892 Choristoneura ACCAACTACTTTGCCTGAACCGAGACCGCGGCGGACGGGATTCTTTCGCCAACTTTGCCA 1822 Chilo ACGATCTCCTTTGCCTAAACCGGGAATCCGGTGGACGCGACGCACTCACCAACTATGCCA 1817 Plutella ATGAGCTGCTCTGTCTAAACAGAGAGAACGGTGGGCGAGACTCAATAACCAACTACGCTA 1824 eph ACGAACTGCTTTGCCTAAACAGAGAGACGGGTGGTCGCGACAAACTGTCCAACTACCCGA 1869 * * ** ** * *** * ** ** ** * ** * *** * * * Manduca CTTGCAACGTCGCCATGGCCCCGTCCAGGACCTGGGTGGCTGCGAAGGACTTCCTGTCTG 1867 Bombyx CTTGTAACATAGCGATGGCTCCATCCAGAACCTGGCTATCAGCCAAGGACTTTTTATCAG 1867 Galleria CATGCAATGTCGCAATGGCCCCCTCTAGAACATGGCTTGCAGCTAAGAACACTATATCCG 1952 Choristoneura CTTGCAACATTGCCATGATTCCGTCAAGATCCTGGCTGGCCGCTAAAGATTCTCTCTCAG 1882 Chilo CATGCAACATCGCTATGGCCCCCTCAAGGACCTGGATGTCCGCCAAAGACTTTTTAGCTG 1877 Plutella CATGCAACATTGCCATGGCCCCATCCCGAACCTGGCTCTCAGCTAAAGACTTCCTGTCCG 1884 eph CATGTAACATCGTCATGGCACCTTCTAGAGCCTGGCTTTCGGTGAAAACTGTCGAATCTG 1929 * ** ** * * *** ** ** * * *** * * * ** * * Manduca ACGTATCTATCGCCCACACACCATTGAGCCTCGCCCAAATGCTCGCTACGAGACCTGACC 1927 Bombyx ATGTCTCTATTGCCCACACTCCACTCAGCTTAGCACAGTTATTGGACACCAGAACTGACC 1927 Galleria ACGTATCCATAGCACACACTCCATTGAGTTTGGCCAAACTTCTTGATGATAGAACTGACT 2012 Choristoneura ATGTATCCATAGCCCACACGCCTTTGAGTTTAGCTGAACTGCTGGATAAGAAGACAGACC 1942 Chilo ATGTCTCCATAGCCCACACACCGTTGAGCTTGGCCGAACTTTTGGACGAATCTCCCGATT 1937 Plutella ATGTGTCCATAGCACACACTCCGCTGAGCTTAGCACAACTACTGGATACCAGAAAGGATC 1944 eph ACGTCTCCATAGCGTTCACTCCATTAAGTCTGGCCAAGTTATTGGAAAAAAGGACTGATC 1989 * ** ** ** ** *** ** * ** * ** * * * * ** Manduca TCTTCAACATTTACGGAGAGTTCTTGAAGAACAACAATGTTATTTTCAATAATGCCGCTA 1987 Bombyx TGTTCAACATTTACGGAGAATTCTTGAAGAACAACAATGTCATTTTCAATAATGCTGCCA 1987 Galleria TATTCAATATATATGGAGAATTCATAAAGAACGATAATGTTATCTTCAACAATGCTGCAA 2072 Choristoneura TGTTCAATATTTATGGAGAATATTTGAAGAACAATAACGTCATTTTCAATAATGCTGCAA 2002 Chilo TGTTCAATATTTACGGGGAATTCTTGAAGAATAACAACGTTATCTTTAATAATGCTGCAA 1997 Plutella TGTTTAACATTTACGGAGAGTTTTTGAAGAATAATAATGTTATTTTTAATAATGCTGCCA 2004 eph TCTTCAACATTTATGGAGAGTTCTTGAAGAACAATAATATACTTTTTAGTAATGGCGCTA 2049 * ** ** ** ** ** ** * * ***** * ** * * ** * **** ** * Manduca AAGGCTTAGCAACAACTGAGAAACTTGACTTCGAGAAGTTCAAGACCATCCACGACGTCA 2047 Bombyx AAGGATTAGCCACAGTTGAAAATCTTGACTTTGAGAAATTCAAGTCAATCCATGATGTTA 2047 Galleria CAGGGTTGGAAACCACAGAGAAACAAGACTTCGAGAAATTTAATACTATTCACGACGTAA 2132 Choristoneura CAGGTCTAGCGACTACTGAAAAACTTGACTTTGACAAGTTCAAAGCAATCCATGATGTCA 2062 Chilo AGGGATTGGAAACTACAGAGAAACTAGACTTTGAAAAATTCAAAACAATCCATGATGTCA 2057 Plutella CTGGACTGGCCACAACAGAAAAGATGGACTTTGAAAAGTTCAAGGCAATCCATGATGTTA 2064 eph CGGGTTTAGAAAGTACGATGAATTTCGACTTCGACAAGTTCAAGACTTATCACGATGTTA 2109 ** * * * ** ***** ** ** ** ** * ** ** ** * Manduca TCTCTTCATGTGGTCTCGCCTAAT-------------------AGGCATTTATATTTGT- 2087 Bombyx TTTCTTCATGTGGCATAGCTTAAT-------------------AGTCTTAAATGTTTTCA 2088

Galleria TATCAAATTGTGGTATTGCTTGAACTGTATTATCCTATTAATAAAATATAAACATTTTGT 2192 Choristoneura TTTCTAACTGTGGTATTGCCTAAAAT---AAGTTCTCCTAG-CATAGGGACTGACTCACA 2118 Chilo TCAGGAACTGTGGAATTGCTTAATATTTTAAATTAAATTAAACATTTGTAAAGTTAATTA 2117 Plutella TCTCATCTTGTGGTGTCGCATAAAC-----------ATACATGTTAAGTAAATAATTTTA 2113 eph TTTCTAACTGTGGATTAGCTTAACCG----AGATACAAAAAGTGATTGAAATTATTTTTT 2165 * ***** * ** * * Manduca CTAAGTTGTATGGAA-ATA--AAAATCAATCT-------------TTGTTTA---ATGAT 2128 Bombyx CTATTATTAATGAAT-ATTGTACAGCCATTTTATTTCT------CTTGATTT---ACAAT 2138 Galleria ATTATTGTAATGACTGATTCTTGGTACAATTTAATGAAAACAAATCTGATTATGAACATT 2252 Choristoneura CTAACATTAGTATACAAT--AAAAACGAGTCTGATA---------TTAA-------TAAT 2160 Chilo CTAACAGTTTTGTAAGGTT-GAAGAAAAGTCTGATG---------TTTAAATAGCTTGAT 2167 Plutella TAACTAGTTATATTATAGACTACAGATAACATGAAGGC------TCTTTGTAAGTCTGAT 2167 eph TAAGTTACGTTTGTTAGTCTGCGGATTAACTTAACCGAGATACAAGATATGAAATTATTT 2225 * * * * Manduca TTATTA----CACCACTTA---TGACAATAAATAAATAATATTCAA----------CAAA 2171 Bombyx TTCTGA----CATAGCTGT---TGAAAAGATCTGAATAAAAATGAAGTCTGATTTCCAAA 2191 Galleria TTATTAATGACATTACTTAAAATGATAACAAATAAATAAATATAATATTTTCATTTGAAA 2312 Choristoneura CTTTAT----TACATCATCTTACATTGAAAAATAAATAAATTTAAA-----CCAAAAAAA 2211 Chilo CTTTATC---TATCACTTATAAAGATGAAATGAAAATAAATATTAA-----CCATTGAAA 2219 Plutella TTGTATCATAGATTTTATTCGGGCCCCTTACATGAATATAAATAAATATAATCCCGGAAT 2227 eph TTTTAAGTTTCGTTTGTTAGTATGTAGGTAACTAACATAGGTTAATTTAATTTGGTTAGA 2285 * * * * * * * Manduca AAAAAAAAAAAA------------------------------------------------ 2183 Bombyx AAAAAAAAAAAAAA---------------------------------------------- 2205 Galleria AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--------------------------------- 2339 Choristoneura AAAAAAAAAA-------------------------------------------------- 2221 Chilo AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA------------------------------- 2248 Plutella GAAAAAAAAAAAAAAA-------------------------------------------- 2243 eph TAATGGAAAATCCCATTTCTGAATCTCATCCCATTTAAAAGTCTGAGTTGTATACATACT 2345 ** **** Manduca ---------------------------------------------------- Bombyx ---------------------------------------------------- Galleria ---------------------------------------------------- Choristoneura ---------------------------------------------------- Chilo ---------------------------------------------------- Plutella ---------------------------------------------------- eph GACATTATGATAATAAATGAATACTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 2397

Ephestia transferin proteinin diğer transferin proteinleri ile kıyaslanması aşağıda verilmiştir.

CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment * * Manduca MALKLLTLIALTCAAANAAKSSYKLCVPAAYMKDCEQMLEVPTKSKVALECVPARDRVEC 60 Bombyx MALKYFILITLICACVNAAKITYKICVPSQHLKACQDMVDIPTKSKVTLDCIPARDRMEC 60 Chilo -------------------------------------MLQVETKSKVALECIPARDRMEC 23 Plutella MIVKIAILVIAITFNDVSAKTSYKICVPSQFMKACEQMLEVETKSKAILECLPARDRVEC 60 Choristoneura MTLKYLLVLVALTG--AHCKTAYKICVPVQHLKACQAMLEVETKSKAALECVTARDRVEC 58 Galleria MTFKCIVLLIALAG-CIYGKPNYKICVPQKFLKECEQMLEVETKSKAVLKCVAARDRVEC 59 Ephestia MALKYLPWLIALIV-CVHSKSPYKICVPAQFMKDCEIMLEVETKSKEKLECVAARDRMEC 59 *::: **** *.*:.****:** * * Manduca LSFVQQRQADFVPVDPEDMYVASKIPNQDFVVFQEYRTDEEPDAPFRYEAVIVVHKDLPI 120 Bombyx LNYVQQRQADFVPVDPEDMYVAAKIPNQDFVVFQEYRTDEEPDAPFRYEAVIVIHKDLPI 120 Chilo LNHVQQRQADFVPVDPEDMYVATKIPNQDFILFQEYRTKDEPDAEFRYEAVIVVHKDLPV 83 Plutella LTLVQQRQADLVPVDPEDMYVASKLPNQDFVLFQEFRTDEEPDAEFRYEAVIVVHKDLPV 120 Choristoneura LYQVQQRQADLVPVDPEDMYVATNIPNQDFVLFQEYRTEDEPDAEFRYQAVIVVHKDLPV 118 Galleria LDFILQRQADFVPADPEDMYLASKMPNQDFYVFQEFRTYDEPDAEFRYQAVIVVHKDLPI 119 Ephestia LQYIQQRQADFVPVDPEDMYVASKIPNQDFVLFQEYRTDDEPDAEFRYQAVIVVHKDLPI 119 * : *****:**.******:*:::***** :***:** :**** ***:****:*****: Manduca NNLDQLKGLRSCHTGVNRNVGYKIPLTMLMKRAVFPKMNDHSISPKENELKALSTFFAKS 180 Bombyx DNLDQLKGLKSCHTGVNRNVGYKIPLTMLMKRAVFPKMNDHSISPKENELKALSTFFTKS 180 Chilo NNLDQLKGLKSCHTGVNRNVGYKIPLTMLMKRTVFPKMNDYSISPKENELRALSTFFSQS 143 Plutella TNLDQLKGLKSCHTGINRNVGYKIPLTMLMKRSVFPAMTDRSISPKENELKALSTFFSKS 180 Choristoneura NNLDQLKGLKSCHTGVNRNVGYKIPLTMLMKRNVFPKMNDPHYSPKENELRAFSTFFKQS 178 Galleria NNLDQLKGLKSCHTGVNRNVGYKIPLTMLMKRPIFPKMNDHSISPKENELRALSTFFKQS 179 Ephestia NSLDGLKGLKSCHTGVNRNVGYKIPLTMLMKREVFPKMNNREISPKENELKALSSFFKQS 179 .** ****:*****:**************** :** *.: *******:*:*:** :* * * * * * Manduca CIVGKWSPDPKTNSAWKSQYSHLCSMCEHPERCDYPDNYSGYEGALRCLAHNNGEVAFTK 240 Bombyx CIVGKWSPDPKTNSAWKAQYNKLCSMCEHPERCDYPDEFSGYVGALNCLAHNNGQVAFTK 240 Chilo CIVGKWSPDPKTNTAWKGQYRQLCSLCEHPDKCDYPDNYSGYEGALRCLAHNGGQVAFTK 203 Plutella CIVGQWSPDPKTNTFWKSQSSKLCSMCEDPAKCDYPDNYSGYEGALRCLAHNGGDVAFTK 240 Choristoneura CIVGNWSPDQRTNSAWKAQYSQLCALCEHPDKCNYPDNFSGYDGALRCLAHNGGEVAFTK 238 Galleria CIVGTWSPDEKTTRAWKSQYSKLCALCQHPDKCDYPDDFSGYEGALRCLAHNGGEVAFTK 239 Ephestia CIVGSWSPDPKVNSLWKKQYSQLCSLCQFPDKCDYPDENSGYEGALRCLAHNGGEVAFTK 239 **** **** :.. ** * :**::*: * :*:***: *** ***.*****.*:*****

* * * Manduca VIFTRKFFGLPVGTTPASPSNENPEEFRYLCVDGSKAPITGK-ACSWAARPWQGLIGHND 299 Bombyx VIFTRKFFGLPVGTTPASPSNENPDEYRYLCVDGSKVPIRDK-ACSWAARPWQGLIGHND 299 Chilo VIYVRKFFGLPVGTIPASTSNENPDDFAYLCADGSKVPIRST-ACSWAARPWQGLMGHND 262 Plutella VIYVRKFFGLPVGTSPATPSSENPDNFAYLCADGSKVPIRGK-ACSWAARPWQGLLGHQD 299 Choristoneura VIYVRKFFGLPVGTIPASQSSENPDEFAYLCADGSKVPVREK-ACSWAARPWQGLLGHND 297 Galleria VFFVHKFFGLPLGTIPAKPSTEDPKQFRYLCVDGSKVPIGDK-PCTWAARPWQGLIGHND 298 Ephestia VFYVHKFFGLPLGTIPASASSEDPTNFRYLRVDGSKVPVGDRRPCSWAARPWQGLLGHND 299 *::.:******:** **. *.*:* :: ** .****.*: .*:*********:**:* Manduca VLAKLAPLREKVKQLADSGAADKP--EWFTKVLGLSEKIHHVADNIPIKPIDYLNKANYT 357 Bombyx VLAKLSPLREKIKQLADAGSSSQP--EWFTKVLGLSDKIHYVADNIPIKAIDYLNKANYT 357 Chilo VLVRISPLREKIKQLSEIGLASKP--EWFTKVLGLSEKINHVARNVPIKPVDYLKKANYT 320 Plutella VLAKLSPLREKIKQLSRAGAESKP--EWFTNVLGLSEKIHLVADNIPIRPVDYLQKANYT 357 Choristoneura VTAKLTPLMEKIKQLAVAGWATQPPPDWFTNVLGLTDKIHHVADNVPIAPATYLKKANYT 357 Galleria VLAQLSPLREKVKQLANAGASTTP--SWFTNVLGLSEKMHHVADNIPIPTLDYLNKANYT 356 Ephestia VLARLTPLREKIKQLSNAGANAKP--GWSTNVLGLSEKIHHVADNIPIKPKAYLDKANYT 357 * .:::** **:***: * * * *:****::*:: ** *:** . **.***** * * * * Manduca EVIERGHGAPELVVRLCVTSNVALSKCRAMSVFAFSRDIRPILDCVQENSEDACLKSVQD 417 Bombyx EVIERGHGAPELVVRLCVTSNVALAKCRAMSVFAFSRDIRPILDCVQEASETDCLKSVQD 417 Chilo EVIERGHGPPEPVVRLCVTSNVALAKCHAMSVFAFSRDIRPKLDCVQEASEADCLKSVQD 380 Plutella EVIERGHGPPEPVVRLCVTSSVALAKCRAMSVFAFSRDIRPRLDCVQEASESDCLKSVQD 417 Choristoneura EVIERGHGVPEPIVRLCVTSNVALAKCQTMATFAYSRDIRPKLDCVQEASETDCLKNVQD 417 Galleria EVIERGHGAPELVVRLCVTSNVALTKCRTMSTFAFSRDIRPILDCVQQNSDEECLKSVQD 416 Ephestia AVIERGHGPPEPIVRMCVTSNVALEKCRAMSVFAFSRDIRPMLDCVQEPSDDDCLRSVRD 417 ******* ** :**:****.*** **::*:.**:****** *****: *: **:.*:* * * Manduca NGSDLASVDDMRVAAAAKKYNLHPVFHEVYGELKTPNYAVAVVKKGTAYNKIDDLRGKKS 477 Bombyx NGSDLASVDDMRVAAAAKKYVLHPVFHEVYGEKKTPNYAVAVVKKGTSFNKMEDLRGKKS 477 Chilo NGSDLASVDDSRVAAAANKYNLHAVFHEVYGEKKTAKYAVAVVKKGTTYNKIDDLRGKRS 440 Plutella NGSDLASVDDMRVASASNKYNLHPVFHEVYGVSKTPNYAVAVVKKNTQYGKIEDLRGNGP 477 Choristoneura NGSDLAAVDEMKVAQAAKKYHLHPVFHEVYGPEKKPRYAVAVVKKEFNVHETGRLERKKS 477 Galleria NGSDLTSVDALRVASASKDYGLHPVFHEVYGANKTSNYAVAVIKKGTKYTNIEDLRGKQS 476 Ephestia NGSDLAAVDDIRVASASNKYGLHPVFHEVYGDKKTPHYAVAVIKKGTTYNTIDDLRGKRS 477 *****::** :** *::.* **.******* *...*****:** *. : . * Manduca CHSSYSTFSGLHAPLFYLINKRAIQSD--HCVKNLGEFFSGGSCLPGVDKPENNPSGDDV 535 Bombyx CHSSYGTFSGLDAPLYYLINKRIIKPD--QCIKNFGDFFSGGSCLPGVDKPENNPSGDDV 535 Chilo CHNPYGTFSGLDAPLFYLINKKIIKSD--QCVKNFADFFSGGVCLPGVDKAENNPRGDNV 498 Plutella VTILYGSFSGFDAPLYYLINKKIIGTE--QCLKKLGEFFAAGSCLPGVGKLENNPTGDNV 535 Choristoneura CHDAFGSFSGLKAPLFYLINKGLITPD--DCVKKIGTFFSGGACLPEVDKLENNPKGDDV 535 Galleria CHDPFGSFSGLHAPLYYLINKGKISTSSSECVRDIGEFFG-GSCLPGVDEPRYNPTGADV 535 Ephestia CHNSYGTFSGLHAPLFYLINKGKITNSNGQCVQKMSEFFSAGSCLPGVDKPENNPKGDDV 537 :.:***:.***:***** * . .*::.:. **. * *** *.: . ** * :* * * Manduca SKLKKQCGSDSSAWKCLEEDRGDVAFVSSADLSHFDANQYELLCLNRDAGGRDVLSSFAT 595 Bombyx SSLKKQCGSDSSPWKCLQEDRGDVAFVSSADLSNFDASQYELLCVNRETGGRDTLSNYPT 595 Chilo ANLKKQCSGDNSPSKCLEENRADVAFVSSTDLSNFDTSQYDLLCLNRESGGRDALTNYAT 558 Plutella DNLKKQCSGDNSPIKCLQEDKGDIAFVSSADLKNLDASQYELLCLNRENGGRDSITNYAT 595 Choristoneura SILKKQCPADNKPLTCLKEDHGDGAFVSSAAYKTLTASQYQLLCLNRDRGGRDSFANFAT 595 Galleria SRLKKLCKSKN-PLKCLTESQADVAFVSSADLDKYDESQFELLCLNREAGGRDSLSNYAT 594 Ephestia SSLKKQCLSDNTPLKCLQEGRADVVFVSSADLDKYDESEYELLCLNRETGGRDKLSNYPT 597 *** * ... . .** *.:.* .****: . .:::***:**: **** ::.:.* * * Manduca CNVAMAPSRTWVAAKDFLSDVSIAHTPLSLAQMLATRPDLFNIYGEFLKNNNVIFNNAAK 655 Bombyx CNIAMAPSRTWLSAKDFLSDVSIAHTPLSLAQLLDTRTDLFNIYGEFLKNNNVIFNNAAK 655 Chilo CNIAMAPSRTWMSAKDFLADVSIAHTPLSLAELLDESPDLFNIYGEFLKNNNVIFNNAAK 618 Plutella CNIAMAPSRTWLSAKDFLSDVSIAHTPLSLAQLLDTRKDLFNIYGEFLKNNNVIFNNAAT 655 Choristoneura CNIAMIPSRSWLAAKDSLSDVSIAHTPLSLAELLDKKTDLFNIYGEYLKNNNVIFNNAAT 655 Galleria CNVAMAPSRTWLAAKNTISDVSIAHTPLSLAKLLDDRTDLFNIYGEFIKNDNVIFNNAAT 654 Ephestia CNIVMAPSRAWLSVKTVESDVSIAFTPLSLAKLLEKRTDLFNIYGEFLKNNNILFSNGAT 657 **:.* ***:*::.* :*****.******::* ********::**:*::*.*.*. Manduca GLATTEKLDFEKFKTIHDVISSCGLA 681 Bombyx GLATVENLDFEKFKSIHDVISSCGIA 681 Chilo GLETTEKLDFEKFKTIHDVIRNCGIA 644 Plutella GLATTEKMDFEKFKAIHDVISSCGVA 681 Choristoneura GLATTEKLDFDKFKAIHDVISNCGIA 681 Galleria GLETTEKQDFEKFNTIHDVISNCGIA 680 Ephestia GLESTMNFDFDKFKTYHDVISNCGLA 683 ** :. : **:**:: **** .**:*

Şekil: Ephestia kuehniella transferininin filogenetikdeki yeri

4. 2 Ephestia transferin geninin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi

Ephestia transferin geninin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi amacıyla yapılan deneylerde öncelikle

transferin geninin hangi gelişme döneminde ve hangi dokuda en fazla ekspresse olduğu saptanmıştır.

Ardından transferin geninin parazitlenme, yaralanma ve bakteri ile enfeksiyonu gibi farklı koşullardaki

ekspresyon seviyelerinin nasıl değiştiği araştırılmıştır.

4. 2. 1 E. kuehniella’nın farklı dokularında transferin düzeylerinin saptanması

Ephestia kültüründen rastgele seçilen ergin dişilerin baş, toraks, barsak, yağ dokusu ve ovaryleri

disseksiyon pensleri yardımıyla mikroskop altında dissekte edilmiştir. Her bir dokunun temiz olarak

dissekte edilmesine özen gösterilmiştir. Özellikle ovaryler ve barsağın etrafındaki yağ dokuları

temizlenmiştir. Disseksiyon sonrasında elde edilen dokular 1xPBS çözeltisi içerisine konmuş ve RNA

izolasyonuna kadar buz içerisinde muhafaza edilmiştir. RNA izolasyonundan sonra elde edilen RNA

miktarı ölçülmüş ve dokuların çok küçük olmasından dolayı çok az miktarda RNA elde edilmiştir. Bu

nedenle dokulardaki transferin ekspresyon düzeylerinin semi quantitative real time PCR yöntemi ile

saptanmasına karar verilmiştir. RNA izolasyonunda sonra tüm dokuların cDNA’ları sentezlenmiştir.

Öncelikle elde edilen cDNA’lar 1:5 oranında sulandırılarak actin primerleriyle çoğaltılarak kontrol

edilmiştir. Ephestia’nın farklı dokularındaki transferin mRNA miktarını saptamak için yapılan deneyde

her bir doku örneği için hem actinle hem de transferinle 20,23,25,28,30 ve 35 döngülük PCR’lar

yapılmıştır. Yapılan PCR’lar sonunda actin ve transferin için artan faz ve plato fazı tesbit edilmiştir.

Buna göre actin için artan faz 25 döngü olarak belirlenmişken transferin için 30 döngü olarak

bulunmuştur. RT PCR’da actin kullanılmasının amacı PCR yaparken her dokudan eşit düzeyde cDNA

ile başlandığını göstermektir. Elde edilen PCR ürünlerinin % 1,5’luk agaroz jelde görüntülenmesi

sonucunda en fazla transferin ekspresyonu yağ dokusunda bulunurken ikinci olarak ovarylerde

saptanmıştır. Bu deney sonuçları aşağıdaki şekilde verilmiştir.

Şekil 4. 35 E. kuehniella’ya ait farklı dokuların transferin ekspresyon düzeyleri

Yapılan çalışmalar transferinin temel olarak yağ dokularında üretildiğini daha sonra kana salgılandığını

ve burada transferinin demire bağlanarak demiri çeşitli dokulara taşıdığı belirtilmiştir (Hirai et al. 2000,

Harizanova et al. 2005). Kim et al. (2008)’ın Protaetia ile yaptığı çalışmada larvalardan toplanan yağ

dokusu, barsak ve epidermis örnekleri ile yapılan Northern blot sonucunda transferinin en fazla yağ

dokusunda sentezlendiği diğer dokularda bulunmadığı saptanmıştır. Dinglasan et al. (2006) Glossina

dişilerinin orta barsak, yağ dokusuyla beraber süt bezi tübülleri ve üreme sistemi erkeklerinin orta

barsak, yağ dokusu ve üreme sistemini dissekte ederek 25, 28, 30 ve 35 döngü kullanarak semi

kantitatif RT PCR yapmıştır. Bu deney sonucunda dişilerin üreme sistemi ve yağ dokusunda en fazla

1 2 3 4 5

1. Baş 2. Barsak 3. Toraks 4. Yağ dokusu 5. Ovary

Transferin

Actin

düzeyde transferin bulunurken buna karşılık barsakta az düzeyde transferin saptanmıştır. Erkeklerin ise

üreme sisteminde bol miktarda transferine rastlanmıştır. Güz et al. (2007) tarafından Glossina ile

yapılan benzer bir çalışmada yine benzer dokular Northern blot analizi ile incelenmiş ve transferin

dişilerde en fazla yağ dokusunda, yağ dokusuna oranla daha az miktarda üreme sisteminde saptanmıştır.

Aedes aegypti’nin kanla beslenmesinden 24 saat sonra transferinin hangi organda bulunduğunu

saptamak için yapılan çalışmada, transferine en fazla yağ dokusunda ve karkasta (toraks, baş ve

bacaklar) rastlanırken, ovarylerde, orta barsakta ve malpigi tüplerinde hiç rastlanmamıştır (Harizanova

et al. 2005). Benzer sonuçlar Ampasala et al. (2004) tarafından bulunmuştur. Araştırıcı Choristoneura

larvalarında en fazla transferin mRNA ekspresyonunu yağ dokusunda bulurken, çok az miktarda

epidermisde bulmuş, orta barsakta hiç transferine rastlamamıştır. Sonuç olarak Ephestia transferinin en

fazla sırasıyla yağ dokusunda ve ovarylerde bulunması daha önce yapılmış çalışmalara uygunluk

göstermektedir.

4. 2. 2 Ephestia’nın farklı gelişme dönemlerinde transferin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi

Ephestia’nın gelişme dönemleri sırasında transferin mRNA’sının nasıl bir ekspresyon profili çizdiğini

göstermek için yapılan deneyde bir günlük Ephestia yumurtaları, on beş günlük larva, otuz üç günlük

dişi ve erkek larvalar, herhangi yaştaki pupa, dişi ve erkek ergin bireyler Ephestia kültüründen

toplanarak RNA izolasyonları yapılmıştır. İzole edilen RNA’ların nanodropta ölçümler yapıldıktan

sonra her birinden 10 µg alınarak formaldehid içeren jelde yürütülmüştür. Membrana aktarılan

RNA’nın transferin probuyla hibridizasyonu ile Northern blot analizi yapılmıştır. Northern blot analizi

sonucunda transferin ekspresyonunun en fazla görüldüğü dönemler sırasıyla otuz üç günlük larva, otuz

günlük erkek larva ve pupadır. En düşük transferin ekspresyonu ise yumurta ve erginlerde saptanmıştır.

Şekil 4. 36’da ilk sıra Ephestia’nın yumurta, genç larva, dişi ve erkek olgun larva, pupa, dişi ve erkek

ergin bireylerine ait transferin ekspresyonunu ikinci sıra ise Northern blotta kullanılan örneklerin eşit

miktarda RNA’ya sahip olduklarını göstermek amacıyla blotın membrana akratılmadan önce çekilmiş

ribozomal RNA resmini göstermektedir.

yumurta

15 günlük larva

33 günlük larva ♀

30 günlük larva ♂

pupa

Ergin ♀

Ergin ♂

Şekil 4. 36 E. kuehniella’nın farklı gelişme dönemlerinde transferin ekspresyon düzeyleri

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

yumurta

15 günlük larva

33 günlük dişi larva

33 günlük erkek larva

pupa

ergin dişi

ergin erkek

E. kuehniella 'nın farklı gelişme dönemlerindeki

transferin ekspresyon düzeyleri

Şekil 4. 37 Ephestia’nın farklı gelişme dönemlerine ait transferin ekspresyon düzeylerinin ribozomal RNA ile normalize edilmiş grafiği

Yukarıdaki grafik faklı gelişme dönemindeki Ephestia bireyleriyle yapılan Northern blot analizi ile elde

edilen sonuçların ribozomal RNA ile normalize edildikten sonra çizilmiş grafiğini göstermektedir.

Grafiktende anlaşılacağı üzere transferin mRNA’sı yumurtadan başlayarak gelişme dönemleri

ilerledikçe bir artış göstermekte ergin olmaya doğru tekrar azalmaya başlamaktadır. Bir önceki deneyde

transferin ekspresyon seviyesinin en fazla yağ dokularında saptanmasıyla gelişme dönemleri göz

önünde bulundurulursa yağ dokusu arttıkça transferin oranının arttığı sonucu çıkarılabilir.

Ribozomal RNA

Transferin

Yoshiga et al. (1999) Drosophila melanogaster’in embriyo, üçüncü dönem larva, açık ve koyu pupa ve

imagolardaki transferin ekspresyon düzeylerini tespit ettiği çalışmasında transferinin en fazla oranda

pupalarda, daha sonra imagolarda ve üçüncü dönem larvalarda tespit etmiştir. Aynı çalışmada

embriyolarda transferin bulunmamasının nedeni Sarcophaga örneğinde olduğu gibi oogenez sırasında

yumurtanın depoladığı transferini embriyonunda kullanmış olabileceği olarak açıklanmıştır.

Choristoneura fumiferana’nın farklı dönemlerinde transferin mRNA’sını saptamak için yapılan

çalışmada Choristoneura’nın transferin düzeyi dördüncü ve beşinci dönem larvaların ilk günlerinde

artmış sonra tekrar azalmış altıncı dönemde ve pupa döneminin ilk günlerinde ise tekrar artış

göstermiştir (Ampasala et al. 2004). Benzer sonuçlar Harizanova et al. (2005) tarafından bulunmuştur.

Aedes aegypti transferin mesajı ilk olarak üçüncü dönem larvalarda görülürken dördüncü dönem

larvalarda artıp pik yapmıştır. Dördüncü dönemin son döneminde düşen transferin düzeyi pupada ve

ergin dönemde tekrar artmıştır. Apis mellifera’da yapılan Northern blot analizinde Ephestia’dakine

benzer sonuçlar almıştır (Nascimento et al. 2004). Apis’deki transferin ekspresyon düzeyi ikinci dönem

larvada başlamış ve beşinci dönem larvada en yüksek seviyesine ulaşmıştır. Pupa döneminde halen

yüksek olan transferin seviyesi pupa döneminden sonra azalmaya başlamıştır. Başka bir çalışmada

Glossina türlerinin diğer böceklerden farklı bir üreme fizyolojisine sahip olmalarına rağmen benzer

sonuçlar bulunmuştur (Güz et al. 2007). Larval gelişimlerini anne vücudunda tamamlayan Glossina

morsitans dişilerinden birinci, ikinci ve üçüncü dönem larvalar dissekte edilerek dişi bireyler ve

larvalardan ayrı ayrı Northern blot analizinin yapıldığı çalışmada larva dönemlerinde hiç transferin

mRNA’sına rastlanmazken en fazla transferin ekspresyon düzeyi üçüncü dönem larvayı taşıyan

anneden elde edilmiştir. Aynı örneklerin kullanılmasıyla yapılan Western blot analizinde larval

dönemlerde bol miktarda proteine rastlanması ile uterus içerisinde gelişimini tamamlayan larvanın

kendisi için gerekli transferinin anne tarafından sağlandığı ortaya konmuştur. Ayrıca içinde gelişimini

tamamlayan larva dönemleri artan annelerde transferin düzeyinin artması, yağ dokusunun ve

hemolimfin artmasıyla daha fazla transferin üretildiği anlamına gelmektedir.

4. 2. 3 E. coli ile enfekte edilen Ephestia larvalarında transferin düzeyindeki değişimin saptanması

Bakteriyel enfeksiyon sonucunda farklı şekilde ekspresyon gösteren PCR ürünlerinin sekansları

çıkarılmış ve bunlar arasında transferin geninin de yer aldığı belirtilmiştir (Seitz et al. 2003).

Dolayısıyla Ephestia larvalarının laboratuvar streyni E. coli ile enfeksiyonu sonucunda transferin

ekspresyon düzeyinde bir değişiklik olup olmadığı saptanmak istenmiştir. Bu amaçla DH5α streyni LB

ortamında 37 derecede gece boyunca büyütülmüştür. Ertesi gün nanodropta bakteri kültürü ölçülerek

ml’ye 106 bakteri gelecek şekilde PBS çözeltisi içerisinde seyreltilmiştir. Ephestia’ları bakteri ile

enfekte etmek için önce ince uçlu iğne yardımıyla bakteri solüsyonu Ephestia larvalarına enjekte

edilmiştir. Ancak gerek larvaların kısa sürede melanize olmasından dolayı gerekse yaralanmadan dolayı

transferin miktarındaki artış olabileceğinden dolayı farklı bir yöntem uygulanmasına karar verilmiştir.

Bu amaçla Ephestia’nın E. coli ile enfekte edilmesinde Hughes et al. (1981, 1986) tarafından Noctuid

larvalarının Bacillus thruingiensis ve bakulovirus ile enfekte edilmesinde kullanılan ‘droplet feeding’

adı verilen metod kullanılmıştır. Daha önceden metod kısmında açıklandığı gibi 1 ml dd suyun içerisine

0,1 g mavi renkli gıda boyası, 0,1 g sukroz ve 106 bakteri karışımı eklenerek bir karışım hazırlanmıştır.

Yaklaşık 24 saat aç bırakılan Ephestia larvalarının bu solüsyonu içmeleri sağlanmıştır. Mavi boyanın

larva vücudunda görülmesinden sonra denemeye alınan larvalar 3, 6, 12 ve 24 saat sonunda toplanarak

RNA izolasyonları yapılmıştır. Kontrol larva grubuna sadece PBS, sukroz ve boyadan oluşan karışım

verilmiştir. İzole edilen RNA’lardan Northern blot analizi yapılmıştır.

Şekil 4. 38 E. coli ile enfekte olan Ephestia larvalarındaki transferin ekspresyon düzeyinin Northern blot yöntemiyle tespiti 1. E coli+sukroz+boya ile beslendikten 3 saat sonra toplanan Ephestia larvaları 2. E coli+sukroz+boya ile beslendikten 6 saat sonra toplanan Ephestia larvaları 3. E coli+sukroz+boya ile beslendikten 12 saat sonra toplanan Ephestia larvaları 4. E

Transferin

Ribozomal RNA

2 3 4 5 6 7 8 1

coli+sukroz+boya ile beslendikten 24 saat sonra toplanan Ephestia larvaları 5. Sadece sukroz ve boya ile beslendikten 3 saat sonra toplanan Ephestia larvaları 6. Sadece sukroz ve boya ile beslendikten 6 saat sonra toplanan Ephestia larvaları 7. Sadece sukroz ve boya ile beslendikten 12 saat sonra toplanan Ephestia larvaları 8. Sadece sukroz ve boya ile beslendikten 24 saat sonra toplanan Ephestia larvaları

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

E. coli ile enfekte edilmiş E. kuehniella

larvalarında transferin ekspresyon düzeyi

E. coli

Normal

3 saat 6 saat 12 saat 24 saat

Şekil 4. 39 E.coli ile enfekte edilmiş E. kuehniella larvalarında transferin ekspresyon düzeyi

E. coli ile enfekte edilmiş Ephestia larvaları ile yapılan Northern blot sonucunda bakteri kültürü

verilmiş larvalarda transferin düzeyi normal olanlara göre bir artış göstermiştir. Bu artışın en fazla

altıncı saatin sonunda olduğu gözlenmiştir. Kontrol grubuna göre farklı saatlerde toplanan her örnekte

transferin düzeyinde artış gözlenmesine rağmen ilerleyen saatlerde azalan bir artış gözlenmesinin

nedeni ise ilerleyen saatlerde bakterinin böcek vücudundan atılmasıyla açıklamak mümkündür.

Bugüne kadar transferinin antimikrobiyal bir protein olduğunu kanıtlamak için pek çok çalışmanın

yapıldığı yayınlarda böcekler genellikle bir bakteri ya da fungus ile enfekte edildiğinde çoğunlukla

transferin ekspresyon düzeyinde bir artış gözlenmiştir. Aedes aegypti ve Aedes albopictus’un gerek

Northern blot gerekse Western blot analizleri ile normal ve bakteri ile inoküle edilmiş hücre kültürleri

kıyaslandığında bakteri inoküle edilmiş hücrelerde normal hücrelere göre gerek protein gerekse mRNA

seviyelerinde bir artış gözlenmiştir (Yoshiga et al. 1997). Daha sonraki yıllarda aynı araştırıcılar

tarafından Drosophila’nın E. coli ile enfeksiyonu sonucunda transferin ekspresyonu ilk 6 saatte birden

artmış 12 ve 24. saatlerde bu artış giderek azalmıştır (Yoshiga et al. 1999). Law J. H. (2002)

Drosophila melanogaster’in bakteri ile enfeksiyonu sonucunda transferin regülasyonunda bir artış

saptanırken aksine ferritinde bir değişim görülmemiştir. Yine Drosophila genomu kullanılarak

erginlerin Escherichia coli ve Micrococcus luteus enfeksiyonu sonucunda yapılan mikroarray

sonucunda artan genler arasında transferinin de olduğu saptanmıştır (Gregorio et al. 2001). M.

darwiniensis’e ml’de 1,5x108 M. anisopliae konidisi verilmesi sonucunda kontrol gurubuna göre fungus

verilmiş bireylerde transferin ekspresyonu 3,5 kat artış göstermiştir (Thompson et al. 2003). G. m.

morsitans’ın 105 E. coli içeren kanla beslenmesi sonucunda normal kanla beslenenlere göre transferin

ekspresyonunda yaklaşık 2 katı kadar artış saptanmıştır (Güz et. al. 2007). Apis mellifera’nın E coli ve

S. cerevisiae ile enfekte edilmesiyle transferinin transkripsiyonel tepkisi farklı çıkmıştır. E. coli ile

enjeksiyon sonrası transferin mRNA düzeyi yaklaşık % 50 oranında artarken S. cerevisiae ile

enjeksiyon sonrası transferin mRNA düzeyinde bir değişiklik bulunmamıştır. Bu sonuçlara göre

transferinin sadece Gram negatif bakterilere karşı reaksiyon gösterdiği önerilmiştir (Kucharski and

Maleszka, 2003). C. fumiferana’nın Gram pozitif bir bakteri olan Bacillus licheniforis ile ve Gram

pozitif bir bakteri olan E. coli ile ve Botrytis cineria ile enfekte edilmesiyle transferin ekspresyon

düzeyleri araştırılmıştır. Her iki bakteri ile enfeksiyondan 12 ve 24 saat sonra transferin ekspresyonu

artarken Choristoneura’nın fungus ile enfekte edilmesi sonucunda transferin ekspresyonunda bir

değişiklik gözlenmemiştir. Ayrıca hem Gram negatif hem de Gram pozitif bakteriye karşı transferin

mRNA düzeyindeki değişiklik transferinin her iki gruba karşı da duyarlı olduğunu göstermiştir

(Ampasala et al. 2004). Protaetia brevitarsis larvalarına E.coli, Bacillus thrugiensis ve Beauveria

bassiana enjekte ediltikten sonra diğer böceklerde olduğu gibi transferin ekspresyonunda artış

saptanmıştır (Kim et al. 2008). Wang et al. (2007) ise bakteriden farklı olarak Locusta migratoria

hemolimfinin Metarhizium anisopliae ile enfekte edilmesiyle hemolimfin iki boyutlu jel elektroforezi

ile analizi sonucunda artan genler arasında transferininde bulunduğunu saptamıştır. Yine başka bir

çalışmada Galleria mellonella larvalarının Candida albicans ile enfekte edilmesinden sonra hem

hemosit yoğunluğunda artış görülmüş hem de gallerimycin ve transferin gibi genlerin ekspresyonunda

artış görülmüştür (Mowlds and Kavanagh, 2008). Solenopsis invicta’ya entomopatojenik bir fungus

olan B. bassiana’nın farklı dozlarda verilmesiyle eş zamanlı PCR analizi ile transferin ekspresyonunda

kontrol grubuna göre doza bağımlı olarak bir artış saptanmıştır (Valles and Pereira, 2005). Son olarak

G. mellonella’nın Candida albicans ve Saccharomyces cerevisae ile enfeksiyonu sonucu hemolimfde

artış gösteren proteinlerin iki boyutlu jel elektroforezi ve MALDI TOF analizi ile incelenmesi sonucu

artan proteinler arasında transferinin de bulunduğu saptanmıştır (Bergin et al. 2006).

Daha önce yapılan çalışmaların hepsinde E coli ile enfeksiyon sonucunda transferin akut faz bir protein

olarak devreye girerek artmaktadır. Ephestia’nın droplet feeding yöntemiyle vücuduna E coli almasıyla

transferin düzeyindeki artış literatüre uygunluk göstermektedir. Ayrıca bu çalışmada droplet feeding

yönteminin Ephestia’da başarılı bir şekilde uygulandığı gösterilmiştir. Transferinin aynı zamanda

böcekte oluşan yaralanma sonucu bakteriyel enfeksiyonda olduğu gibi artış gösterdiği bildirilmiştir

(Kim et al. 2008). Dolayısıyla Ephestia’da bu yöntemle bakteri ile enfekte edilen larvalardaki transferin

ekspresyonundaki artış yaralanma ile oluşabilecek bir artışdan bağımsız olmuştur.

4. 2. 4 Ephestia larvalarının yaralanmasıyla transferin ekspresyon düzeyindeki değişim

Bazı böceklerin yaralanma sonucunda transferin ekspresyonunda artış saptanmıştır (Kim et al., 2008,

Yoshiga et al., 1999). Ephestia larvalarına steril bir iğne ile yara açılıp 3, 6, 12 ve 24 saat sonunda

kontrol grubuyla birlikte RT PCR ile analiz edilmiştir. Her saat için üç larva toplanıp RNA

izolasyonları yapılmıştır. Bu analiz sonucunda yaralanmış bireylerde kontrol grubuna göre transferin

ekspresyonunda bir artış saptanmıştır. RT PCR’ın kontrolü için actin geni kullanılmıştır. RT PCR

sonucu şekil 4. 40 ve 4. 41’de verilmiştir. Aynı yaştaki Ephestia dişi larvaları ile yapılan deneyde ilk

sıra yaralanmadan 3 saat sonra alınan, ikinci sıra 6 saat sonra alınan, üçüncü sıra 12 saat sonra alınan,

son sıra ise 24 saat sonra alınan örnekleri temsil etmektedir. Hem yaralanmış hem de normal larvalara

ait gerek transferin gerekse actin ekspresyon düzeyleri aşağıdaki şekilde görülmektedir.

Şekil 4 40 Yaralanmış ve normal larvalardaki transferin ekspresyon düzeyi

Transferin (Normal)

Transferin (Yaralanmış larva)

1 2 3 4

1 2 3 4

Şekil: 4. 41 Yaralanmış ve normal larvalardaki actin ekspresyon düzeyi

Oligonükleotid mikroarrayin kullanımıyla Drosophila’da savunma reaksiyonlarının genom düzeyinde

analizi yapılmıştır (De Gregorio et al., 2001; 2002). Bunun sonucunda Drosophila’da yaralanma ve

fungus ile enfeksiyon sonrası indüklenen genler arasında transferinin de olduğu bildirilmiştir. Aynı

çalışmada yaralanmadan 1,5 saat sonra transferin ekspresyon düzeyinde 13 kat artış saptanmıştır.

Yoshiga et al. (1999) tarafından Drosophila erginine steril bir iğne batırılarak bir yara açılmış ve

Northern blot analzi sonucunda yara açılmış sineklerde transferin ekspresyon düzeyinin normal olanlara

göre daha fazla olduğu saptanmıştır. Transferin ekspresyon düzeyinin fazla olmasının nedeni yara

açılmasıyla oluşan melanizasyon sonucunda transferin geninin devreye girmesi olarak açıklanmıştır.

Kim et al. (2008) Protaetia brevitarsis’in yaralanma sonucu transferin ekspresyonunda artış meydana

geldiğini bildirmiştir. Benzer şekilde Apriona germari’nin yaralanmaya karşı hem RNA hem de protein

düzeyinde transferin düzeyinde artış saptanmıştır (Lee et al., 2006).

Drosophila’nın yaralanması sonucu kütikular bariyerinin kırıldığı, kanda melaninin salgılandığı ve

pıhtılaşmanın arttığı bildirilmiştir (Söderhall ve Cerenius, 1998). Melanizasyon olayı sadece yaralanma

sonucu değil aynı zamanda parazitoidlerin kapsüllenme reaksiyonlarına da görev almaktadır.

4. 2. 5 Venturia ile parazitlenmiş Ephestia larvalarındaki transferin ekspresyon profili

Venturia ile parazitlenmiş Ephestia larvalarındaki transferin ekspresyon düzeylerini belirlemek için 33

günlük dişi Ephestia larvaları Venturia ile parazitletilmiştir. Parazitoidin konukçuyu parazitlemesinden

hemen sonra süperparazitizmi önlemek için larvalar çekilerek içinde besin bulunan kaplara konmuştur.

Parazitletmeden hemen sonraki günden başlanarak dokuz gün süreyle her gün gerek parazitlenmiş

larvalardan gerekse kontrol grubundan üç adet larva toplanarak sıvı azot içinde dondurularak -80°C’de

muhafaza edilmiştir. Örnek alınmadan önce parazitlenmenin olup olmadığını kontrol etmek için larvalar

mikroskop altında dissekte edilerek parazitoid yumurtası ve larvası kontrol edilmiştir. Daha sonra aynı

güne ait üç larva aynı tüpe konularak RNA’ları ekstrakte edilmiş ve Northern blot analizi yapılmıştır.

Actin (Normal)

Actin (Yaralanmış larva)

Aşağıdaki şekilde yapılan analiz sonuçları verilmiştir.

Şekil 4. 42 Normal Ephestia larvalarındaki transferin ekspresyonundaki değişimin Northern blot analizi ile saptanması 1: 33 günlük Ephestia larvası 2: 34 günlük Ephestia larvası 3: 35 günlük Ephestia larvası 4. 36 günlük Ephestia larvası 5: 37 günlük Ephestia larvası 6: 38 günlük Ephestia larvası 7: 1 günlük Ephestia pupası 8: 2 günlük Ephestia pupası 9: 3 günlük Ephestia pupası

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Parazitlenmemiş Ephestia larvalarında transferin

ekspresyon düzeyi

Normal

Şekil 4. 43 Normal Ephestia larvalarında transferin ekspresyon düzeyi

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ribosomal RNA

Transferin (normal)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Transferin (parazitli)

Ribosomal RNA

Şekil 4. 44 Parazitlenmiş Ephestia larvalarındaki transferin ekspresyonundaki değişimin Northern blot analizi ile saptanması 1: 33 günlük parazitlenmiş Ephestia larvası 2: 34 günlük parazitlenmiş Ephestia larvası 3: 35 günlük parazitlenmiş Ephestialarvası 4. 36 günlük parazitlenmiş Ephestia larvası 5: 37 günlük parazitlenmiş Ephestia larvası 6: 38 günlük parazitlenmişEphestia larvası 7: 39 günlük parazitlenmiş Ephestia larvası 8: 40 günlük parazitlenmiş Ephestia larvası 9: 41 günlük parazitlenmiş Ephestia larvası

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Parazitlenmiş Ephestia larvalarında transferin

ekspresyon düzeyi

Parazitli

Şekil 4. 45 Parazitlenmiş Ephestia larvalarında transferin ekspresyon düzeyi

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Parazitlenmiş ve normal Ephestia larvalarında

transferin ekspresyon düzeyi

transferin

normal

Şekil 4 47 Parazitlenmiş ve normal Ephestia larvalarında transferin ekspresyon düzeyi

Northern blot sonucunda transferin probuyla elde edilen bantların intensitesi ve membrana aktarılmadan

önce ribozomal RNA’daki bantları intensitesi ölçülerek birbirine olan oranları hesaplanmıştır.

Normalize edilmiş Northern blot sonucunda parazitlenmiş bireylerde normal bireylere göre transferin

ekspresyonu düzeyinde her gün artış görülmüştür. Parazitlenmiş bireylerdeki transferin ekspresyon

profili normal olanlarla paralel bir seyir izlemiştir. Ephestia’nın farklı gelişme dönemleriyle yapılan

Northern blot sonucunda en fazla transferin ekspresyon düzeyi 33 günlük dişi larvalarda saptanmıştır.

Aynı deneyde larva döneminden pupa dönemine geçişte bir azalma gözlenmiştir. Aynı tablo gerek

normal olan bireylerde gerekse parazitlenmiş olan bireylerde görülmüştür. Transferin mRNA seviyesi

ilk gün toplanan larvalarda yani otuz dört günlük larvalarda gerek normalde gerekse parazitlenmişlerde

en fazla çıkmıştır. Parazitlenmiş olan bireylerin ilk günlerdeki artışının literatüre dayalı olarak savunma

reaksiyonundan kaynaklanabileceği düşünülmüştür. (Kim et al. 2005). Daha sonraki günlerdeki artışın

parazitoidin konukçu içerisinde gelişmesini sürdürmek için larva dönemini uzattığından kaynaklanmış

olabileceği düşünülmüştür.

Böceklerde savunma reaksiyonları Lavine et al. (2002) tarafından iki gruba ayrılmıştır. Bunlarda ilki

hücresel reaksiyonlar ikincisi salgısal (hümoral) reaksiyonlardır. Salgısal savunma reaksiyonları

antimikrobiyal peptidlerin üretimiyle ilgili reaksiyonları, kandaki melanizasyon ve kanın pıhtılaşmasını

düzenleyen enzimatik kompleksin üretimiyle ilgili reaksiyonları içermektedir. Bunun aksine hücresel

savunma reaksiyonları fagositozis ve kapsüllenme gibi hemolimfle ilgili savunma reaksiyonlarını

kapsamaktadır. Diğer taraftan Kim et al. (2005) böceklerde savunma reaksiyonlarını hücresel ve

salgısal olarak ayırmayı doğru bulmamıştır. Çünkü araştırıcıya göre hümoral faktörlerin pek çoğu

hemositin fonksiyonunu da etkilemekte ve hemositler hümoral moleküllerin önemli kaynaklarından

birisi olarak bilinmektedir. Ayrıca hücresel ve salgısal savunma reaksiyonlarının ortak bir özelliği de

vücuda giren yabancı maddelerin tanınmasıdır. Hemositler vücuda giren yabancı bir maddeyi direkt ve

indirekt olarak iki şekilde tanıyabilmektedir. Direkt olarak hemositlerin üzerindeki yüzey reseptörleriyle

tanıyabilmekte indirekt olarak ise yabancı maddenin yüzeyine bağlanan hümoral reseptörlerle

tanıyabilmektedirler.

Böceklerde yaygın olarak görülen hemosit tipleri prohemositler, granülositler, plazmatositler,

spherülositler ve oenositoidler olarak saptanmıştır. Bu hemosit tiplerinin Lepidoptera, Diptera

Orthoptera, Blattaria, Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera ve Collembola takımlarında tanımları

yapılmıştır (Ahmad, 1988; Azambuja et al., 1991; Luckhart et al., 1992; Fenoglio et al., 1993;

Sonawane ve More, 1993; Butt ve Shields, 1996; Joshi ve Lambdin, 1996; Hernandez et al., 1999; de

Silva et al., 2000).

Lepidopteranın larva döneminde vücuda giren yabancı maddenin yüzeyine bağlanarak savunma

reaksiyonlarına katılan hemosit tipleri plazmatositler ve granülositler olarak bildirilmiştir (Lackie, 1988;

Ratcliffe, 1993; Strand ve Pech,1995). Lepidoptera takımına ait tanımlanan diğer hemositler

spherulositler, oenositoidler ve prohemositlerdir. Spherulositlerin kütikular komponentleri taşıdıkları

bildirilmiştir (Sass et al. 1994). Oenositoidlerin hemolimfin melanizasyonunda rol oynayan sitoplazmik

fenil oksidazları içerdikleri gösterilmiştir (Ashida ve Dohke, 1980; Iwama ve Ashida, 1986; Jiang et al.,

1997). Prohemositlerin ise sözü edilen hemosit tiplerinin birinden diğerine farklılaştığı belirtilmiştir.

Örneğin Bombyx mori’de prohemositlerin plazmotositlere, granülositlere ya da spherulositlere

farklılaştığı belirtilmiştir (Yamashita ve Iwabuchi, 2001).

Hemositlerin katıldığı temelde savunma reaksiyonları fagositoz, nodül oluşumu ve kapsüllenme

reaksiyonudur (Salt, 1970). Hemositlerin ayrıca böceklerin yaralanmasında pıhtı oluşturarak katıldıkları

bildirilmiştir (Lavine et al. 2002). Fagositoz ise vücuda giren yabancı bir maddenin yutulması olarak

tanımlanmıştır (Salt, 1970). Hemositlerin hem maya, bakteri gibi biyotik etmenleri hemde sentetik iplik

gibi nesneleri fagositledikleri bildirilmiştir (Yokoo et al., 1995; Hernandez et al., 1999; de Silva et al.,

2000). Lepidoptera takımında fagositoz olayında rol alan hemosit tiplerinin granulositler ve

plazmotositler olduğu saptanmıştır (İbrahim ve Kim, 2006). Nodül oluşumu Salt (1970)’a göre

fagositoz ve kapsüllenme reaksiyonunun bir karışımıdır. Nodül oluşumu mikroorganizmalara veya

küçük partiküllere karşı hemositlerin bir küme oluşturmasıdır. Kapsüllenme reaksiyonunda ise

hemositler parazitoid ve nematodlar gibi daha büyük hedeflere bağlanırlar. Lepidoptera takımında

kapsüllenme reaksiyonunda rol alan hemosit tiplerinin hemositler ve plazmatositler olduğu

Drosophila’da ise lamellositler olduğu bildirilmiştir (Schmidt et al., 2001; Vass ve Nippi, 2001).

Böceklerde hümoral diğer bir deyişle salgısal savunma reaksiyonları antimikrobiyal peptidlerin (AMP)

üretimine dayanır. AMP’lerin pek çoğu böceklerde immünite ile ilgili bir uyarı aldıklarında yağ

dokusunda transkribe edilir ve ardından kana salgılanırlar. Drosophila’da saptanan AMP’lerden

Drosomycin, Metchnikowin ve Cecropin özellikle funguslara, Defensin ve Metchnikowin gram pozitif

bakterilere, Attacin, Cecropin, Diptericin ve Drosocin gram negatif bakterilere karşı savunma

reaksiyonlarında rol almaktadır (Bulet et al., 1999; Meister et al., 2000). Bu peptidler oldukça küçük

moleküller olup vücuda giren yabancı maddelerin membranlarının bozulmasına yol açarak onların

gelişmesine engel olurlar (Lemaitre et al., 1996). Ancak son yıllarda transkriptom ve proteom

seviyelerinde yapılan çalışmalarla yukarıda belirtilen AMP’lere yenileri eklenmiştir. Bunlardan birisi

transferin olup daha çok bakteriyel, fungal enfeksiyon ve yaralanma sonucu indüklenen bir protein

olduğu saptanmıştır (De Gregorio et al., 2001,2002; Levy et al., 2004).

Böceklerde transferin ile ilgili yapılan çalışmalardan ilk defa farklı olarak Beerntsen et al. (1994)

tarafından Aedes aegypti ve parazit nematodlardan Dirofilaria immitis ve Brugia pahangi arasındaki

ilişki incelenmiştir. Melanotik kapsüllenme reaksiyonuna yol açan parazit nematodlar ile enfeksiyon

sonrası ve yaralanma sonrası hemolimfdeki proteinlerden birisinin artış gösterdiği saptanmıştır. Aynı

çalışmada bu proteinin tansferin olduğu bildirilmemiş ancak saptanan proteine ait transle edilmiş

protein sekansları verilmiştir. Daha sonraki yıllarda transferin ile ilgili çalışmaların artmasıyla Aedes’de

saptanan bu proteinin transferin olduğu saptanmıştır. Buna benzer bir çalışma Paily et al. (2007)

tarafından yapılmıştır. Bu çalışmada yine parazit nematod olan Wuchereria bancrofti ile vektörü Culex

quinquefasciatus’un enfeksiyonu sonucu transferin proteininde bir artış saptanmıştır. Araştırıcıların bir

önceki çalışmalarında aynı parazit ile enfekte edilen sivrisineklerde granülositlerin sayısında önemli bir

artış saptanmıştır (Paily et al., 2005). Bu artışın antimikrobiyal peptidlerin üretimi için artmış

olabileceği düşünülmüştür. Ayrıca belirtilen parazit ve konukçu ilişkisinde bugüne kadar herhangi bir

melanizasyon ve kapsüllenme reaksiyonu saptanmadığı vurgulanmıştır. Dolayısıyla parazitle

enfeksiyon sırasında potansiyel immün moleküllerinden biri olan transferinin artışının bir savunma

reaksiyonu olabileceği belirtilmiştir.

V. Sonuç ve Öneriler

Sonuç olarak E. kuehniella transferininin tüm cDNA dizisi bulunarak karakterize edilmiş ve diğer

böceklerdeki transferin ile olan ilişkisi ortaya konmuştur. Ephestia transferinin transkripsiyonel profili

belirlenerek bu genin en fazla yağ dokusunda ve ovarylerde transkribe edildiği bulunmuştur. Bu sonuca

paralel olarak en fazla yağ dokusuna sahip dişi larvalarda en fazla transferin mRNA’sına rastlanırken en

düşük mRNA seviyesi yumurta ve erginlerde görülmüştür. Transferinin olası fonksiyonlarını araştırmak

üzere yapılan deneylerde yaralanmış bireylerde ve bakteri ile enfekte edilmiş bireylerde transferin

transkriptinin arttığı saptanmıştır. Son olarak Venturia ile parazitlenmiş bireylerde parazitlenmemiş

olanlara göre transferin ekspresyon düzeyinde bir artış saptanmıştır ve bu artışın ilk günlerde yumurta

ve larvaya karşı bir savunma reaksiyonu olabileceği düşünülmüştür. Ephestia ve endoparazitoidi

Venturia’nın model olarak ele alındığı bu çalışmada Ephestia transferin geninin ilk defa moleküler

karakterizasyonu yapılarak diğer çalışmalardan farklı olarak konukçu parazitoid ilişkisinde savunma

reaksiyonları bakımından transferin geninin olası rolü araştırılmıştır. 2000 yılında Drosophila’nın

genomik sekansının tamamlanmasıyla (Rubin et al., 2000) ve proteomiks, mikroarray ve RNAi (RNA

interference) teknolojilerinin geliştirilmesiyle immün sistem çalışmaları hız kazanmıştır. Ephestia ile

yapılan bu çalışmada transferin geninin transkripsiyonel grafiği belirlenmeye çalışılmıştır. Aynı

çalışmanın protein düzeyinde yapılmasının ya da RNAi teknolojisini kullanarak transferin geninin diğer

genlerin regülasyonu ile olan ilişkisini belirleme açısından faydalı olabileceği düşünülmektedir.

VI. Kaynaklar

Ampasala D. R., Zheng S. C., Retnakaran A., Krell P. J., Arif B. M., Feng Q. L. 2004. Cloning and

expression of a putative transferin cDNA of the spruce budworm, Choristoneura fumiferana. Insect

Biochem Mol Biol. 34(5):493-500.

Bergin D., Murphy L., Keenan J., Clynes M., Kavanagh K. 2006. Pre-exposure to yeast protects larvae

of Galleria mellonella from a subsequent lethal infection by Candida albicans and is mediated by the

increased expression of antimicrobial peptides. Microbes and Infection 8, 2105-2112.

Dinglasan P. S., Guz N., Attardo G., Aksoy S. 2006. Molecular characterization of iron binding proteins

from Glossina morsitans morsitans (Diptera: Glossinidae) Insect Biochemistry and Molecular Biology

(36) 921-933.

Guz, N., Attardo, M. G., Wu, Y., Aksoy, S. 2007. Molecular aspects of transferin expression in the

tsetse fly (Glossina morsitans morsitans). Journal of Insect Physiology 53 (2007) 715-723.

Harizanova N, Georgieva T, Dunkov BC, Yoshiga T, Law J. H. 2005. Aedes aegypti transferin. Gene

structure, expression pattern, and regulation. Insect Mol Biol. Jan;14(1):79-88.

Hughes, P. R., van Beek, N. A. M., and Wood, H. A. 1986. A modified droplet feeding method for

rapid assay of Bacillus thuringiensis and baculoviruses in noctuid larvae. J. Invertebr. Pathol. 48, 87–

192.

Kim B. Y., Lee K. S., Choo Y. M., Kim I., Hwang J. S., Sohn H. D., Jin B. R. 2008 Molecular cloning

and characterization of a transferrin cDNA from the white-spotted flower chafer, Protaetia brevitarsis.

DNA Seq. 19(2):146-50.

Kucharski R, Maleszka R. 2003. Transcriptional profiling reveals multifunctional roles for transferin in

the honeybee, Apis mellifera. J Insect Sci.;3:27.

Lavine M. D. and Strand M. R. 2002. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol

Biol. 2002 Oct;32(10):1295-309.

Law J. H. 2002 Insects, oxygen, and iron. Biochem Biophys Res Commun. Apr 19;292(5):1191-5.

Lee K. S., Kim B. Y., Kim H. J., Seo S. J., Yoon H. J., Choi Y. S., Kim I., Han Y. S., Je H. Y., Lee S.

M., Kim D. H., Sohn H. D., Jin B. R. 2006. Transferrin inhibits stress-induced apoptosis in a betle. Free

Radical Biology & Medicine 41, 1151–1161.

Mowlds P., Barron A., Kavanagh K. 2008. Physical stress primes the immune response of Galleria

mellonella larvae to infection by Candida albicans. Microbes and Infection 10, 628-634.

Ozkan, C. 2007. Effect of food, light and host instar on the egg load of the synovigenic endoparasitoid

Venturia canescens (Hymenoptera: Ichneumonidae) Journal of Pest Science 80:79-83.

Paily K. P., Kumar B. A., Balaraman K. 2007. Transferrin in the mosquito, Culex quinquefasciatus Say

(Diptera: Culicidae), up-regulated upon infection and development of the filarial parasite, Wuchereria

bancrofti (Cobbold) (Spirurida: Onchocercidae). Parasitol Res. 2007 Jul;101(2):32

Thompson G. J., Crozier Y. C. and Crozier R. H. 2003. Isolation and characterization of a termite

transferin gene up-regulated on infection. Insect Molecular Biology 12 (1), 1–7.

Valles S. M. and Pereira R. M. 2005. Solenopsis invicta transferrin: cDNA cloning, gene architecture,

and up-regulation in response to Beauveria bassiana infection. Gene 358, 60-66.

Wang C., Cao Y., Wang Z., Yin Y., Peng G., Li Z., Zhao H., Xia Y. 2007. Differentially-expressed

glycoproteins in Locusta migratoria hemolymph infected with Metarhizium anisopliae. Journal of

Invertebrate Pathology 96, 230–236.

Yoshiga T., Hernandez V. P., Fallon A. M., Law J. H. 1997. Mosquito transferin, an acute-phase

protein that is up-regulated upon infection.Proc Natl Acad Sci U S A. 11;94(23):12337-42.

Yoshiga T., Georgieva T., Dunkov B. C., Harizanova N., Ralchev K., Law J. H. 1999. Drosophila

melanogaster transferin. Cloning, deduced protein sequence, expression during the life cycle, gene

localization and up-regulation on bacterial infection.Eur J Biochem. 260(2):414-20.

VII. Ekler

d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar)

Bu projeden elde edilen sonuçlar Türkiye III. Bitki Koruma Kongresinde sözlü sunum olarak bildirilmiştir. Ephestia kuehniella Transferin Proteininin Moleküler Karakterizasyonu ve Savunma Reaksiyonlarındaki Rolü Nurper Güz ve Neşet Kılınçer Türkiye III. Bitki Koruma Kongresi 15-18 Temmuz 2009, Van

e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler

Desteklenmiş olan bu proje ile Nurper Güz doktora çalışmalarını yürütmüştür.

Nurper Güz’ün Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri doktora tezi: ‘Ephestia kuehniella’da Transferin geninin Moleküler Karakterizasyonu ve Savunma Reaksiyonlarındaki Rolü Üzerinde Araştırmalar’ Son olarak projeden elde edilen veriler yayın haline dönüştürülmüş ve Journal of Insect Physiology

dergisine sunulmuştur. Ancak henüz bir sonuç alınanamamıştır.

‘Molecular characterization of Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae) transferrin and its response

to parasitoid Venturia canescens (Hymenoptera: Braconidae) (Gravenhorst)’ Journal of Insect

Physiology 2010.

NOT: Verilen kesin rapor bir (1) nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, kesin rapor Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD ile birlikte sunulacaktır. Kesin raporda proje sonuçlarını içeren, ISI’ nın SCI veya SSCI veya AHCI dizinleri kapsamında ve diğer uluslar arası dizinlerce taranan hakemli dergilerde yayınlanmış makaleler, III. Materyal ve Yöntem ve IV. Analiz ve Bulgular bölümleri yerine kabul edilir.