Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ANKARA ÜNİVERİSTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
MEMELİ HÜCRELERİNİN FARKLI SUBSTRAT YÜZEYLER ÜZERİNE
ADEZYONUNUN KUARTZ KRİSTAL MİKROBALANS SİSTEMİ İLE
EŞ-ZAMANLI BELİRLENMESİ
Şükran ŞEKER
KİMYA ANABİLİM DALI
ANKARA
2011
Her hakkı saklıdır
i
ÖZET
Doktora Tezi
MEMELİ HÜCRELERİNİN FARKLI SUBSTRAT YÜZEYLER ÜZERİNE
ADEZYONUNUN KUARTZ KRİSTAL MİKROBALANS SİSTEMİ İLE EŞ-ZAMANLI
BELİRLENMESİ
Şükran ŞEKER
Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN
Bu tez çalışmasında kuartz kristaller; kendiliğinden düzenlenen tek tabaka (KDTT),
elektroeğirme, döndürerek kaplama ve damlatma tekniği olmak üzere dört farklı yüzey kaplama
tekniği kullanılarak kaplandı. 11-Merkaptoundekanoik asit (11-MUA), 2-Merkaptoetanol ve 2-
Merkaptoetilamin kullanılarak kristallerin altın elektrot yüzeyleri KDTT tekniği ile modifiye
edildi. Kristal yüzeylerinin modifikasyonu dönüşümlü voltametri deneyleri ile doğrulandı.
Kristal yüzeyleri çeşitli teknikler kullanılarak farklı polimerlerle kaplandı. Kristal yüzeylerini
kaplamak için, elektroeğirme tekniği kullanılarak, poli(D,L-laktik-ko-glikolik asit) (PLGA)
nanolifleri; döndürerek kaplama tekniği kullanılarak, poli(stiren) (PS), poli(kaprolakton) ve
PLGA polimerleri; damlatma tekniği kullanılarak ise, kitosan, hyalüronik asit, kollajen, alginat
ve poli(l-lizin) (PLL) polimerleri kullanıldı. Hazırlanan yüzeylerin topografileri atomik kuvvet
mikroskobu (AKM) ile incelendi. Mezenkimal kök hücreler (MKH), Wistar sıçanların kemik
iliğinden izole edildi. Hücre kültürü şartlarında çoğaltılan hücreler, akış sistemine enjekte
edilerek, her bir yüzey için kristallerin frekansında meydana gelen değişimler, kuartz kristal
mikrobalans (KKM) sistemi ile eş zamanlı olarak belirlendi. KKM bulguları, hücrelerin kristal
yüzeyleri üzerine farklı oranlarda tutunduğunu gösterdi. Elde edilen sonuçlar, yüzey
modifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey üzerindeki hücre
adezyonunun, PLGA film kaplı yüzeye oranla daha fazla olduğunu gösterdi. Çalışmanın ikinci
aşaması olan hücre-ilaç etkileşiminin incelendiği deneylerde ise, MKH üzerine belirli dozlarda
vinblastin, vinorelbin ve kolsişin ilaçları enjekte edilerek, hücrelerin bu anti-mikrotübül
ilaçlarına verdikleri cevaplar KKM sistemi ile belirlendi. Kristallerin frekansında meydana
gelen değişimler, ilaçların mikrotübüllere bağlanarak, hücrelerin yüzey üzerinden ayrılmalarına
sebep olduğunu gösterdi. Elde edilen KKM bulgularının, hücre canlılığı ve mitokondriyal
dehidrogenaz aktivitesi testleri (MTT) ile paralel olduğu belirlendi.
Mayıs 2011, 125 sayfa
Anahtar Kelimeler: Kuartz kristal mikrobalans, Frekans değişimi, Hücre biyosensörü,
Hücre-substrat etkileşimi, Hücre adezyonu, Hücre yayılması, Biyomalzemeler, Anti-
mikrotübül ilaçları, Nanobiyoteknoloji.
ii
ABSTRACT
PhD Thesis
REAL-TİME DETERMİNATİON OF THE ADHESİON OF MAMMALİAN CELLS ON
DİFFERENT SUBSTRATE SURFACES BY QUARTZ CRYSTAL MİCROBALANCE
SYSTEM
Şükran ŞEKER
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Science
Department of Chemistry
Supervisor: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN
In this study, the quartz crystals were coated by using four different surface coating techniques
which are self assembled monolayer (SAM), electrospining, spin coating and casting. The gold
electrode surfaces of crystals were modified with SAM method by using 11-
Mercaptoundecanoic acid (11-MUA), 2-Mercaptoethanol and 2- Mercaptoethylamine. The
modification of crystal surfaces were confirmed with cyclic voltammetry experiments. Crystal
surfaces were coated with different polymers using various techniques. In order to coat the
crystal surfaces; with electrospinning technique Poli(D,L-lactic-co-glycolic asit) (PLGA)
nanofibers, with spin coating technique poly(styrene) (PS), poly(caprolactone) and PLGA, with
dropping technique chitosan, hyaluronic acid, collagen, alginate and poly(l-lysine) (PLL)
polymers were used. The topographic examination of the fabricated surfaces were performed by
atomic force microscopy (AFM). Mesenchymal stem cells (MSCs) were isolated from the bone
marrow of Wistar rats. The proliferated cells under cell culture conditions were injected to the
flow system, and the changes in frequency of crystal for each surface were determined by quartz
crystal microbalance (QCM) system in real time. The QCM findings indicated that the cells
were attached onto the crystal surfaces in different ratios. The obtained results showed that the
surface modification increased the cell adhesion; the cell adhesion on the PLGA nanofiber was
larger than the PLGA film. In the second step of the study, cell-to-drug interaction was
investigated. In the experiments, vinblastine, vinorelbine and colchicine of some dose were
injected to MSCs and the cell response was determined by QCM system. The changes in the
frequency of crystals indicated that, binding of drugs to microtubules caused cells to be
detached from the surface. The obtained QCM data was parallel with the cell viability and
mitocondrial dehidrogenase activity test (MTT).
May 2011, 125 pages
Key Words: Quartz crystal microbalance, Frequency shift, Cell biosensor, Cell-substrate
interaction, Cell adhesion, Cell spreading, Biomaterials, Anti-mikrotübül drugs,
Nanobiotechnology.
iii
TEŞEKKÜR
Bu çalışmanın doktora tezi olarak yürütülmesinde öncü olan ve çalışmanın her
aşamasında değerli önerilerinden yararlandığım danışman hocam
Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN’e (Ankara Üniversitesi Kimya ABD) teşekkürlerimi
sunarım.
Doktora çalışmam boyunca bana her konuda destek olup, yakın ilgi ve yardımlarını
esirgemeyen değerli hocam Doç. Dr. Eser ELÇİN’e (Gazi Üniversitesi Gazi Eğitim
Fakültesi) teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmalarım süresince birçok fedakarlıklar göstererek beni destekleyen aileme
teşekkürlerimi sunarım.
Şükran ŞEKER
Ankara, Mayıs 2011
iv
İÇİNDEKİLER
ÖZET ................................................................................................................................. i
ABSTRACT ...................................................................................................................... ii
TEŞEKKÜR .................................................................................................................... iii
SİMGELER DİZİNİ ...................................................................................................... viii
ŞEKİLLER DİZİNİ ........................................................................................................ ix
ÇİZELGELER DİZİNİ ................................................................................................. xiv
1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1
2. KURAMSAL TEMELLER ......................................................................................... 6
2.1 Piezoelektrik Özellik .................................................................................................. 6
2.2 Kuartz Kristaller ........................................................................................................ 8
2.2.1 Kuartz kristal kesim tipleri .................................................................................... 9
2.2.2 Kristal kesim tipi ile sıcaklık ilişkisi ..................................................................... 11
2.3 Akustik Dalga Cihazları ........................................................................................... 13
2.3.1 Hacim akustik dalga sensörleri ............................................................................. 14
2.3.2 Yüzey akustik dalga sensörleri ............................................................................. 15
2.4 Kuartz Kristal Mikrobalans .................................................................................... 15
2.4.1 Sauerbrey ve Kanazawa eşitliği ............................................................................ 16
2.4.2 KKM biyosensör uygulamaları ............................................................................. 17
2.5 Yüzey Kaplama Yöntemleri ..................................................................................... 25
2.5.1 Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi ................................................... 25
2.5.1.1 Alkantiyol tek tabakalar ..................................................................................... 25
2.5.1.2 Alkilsiloksan tek tabakalar ................................................................................ 27
2.5.2 Polimer kaplama yöntemleri ................................................................................. 28
2.5.2.1 Elektroeğirme yöntemi ....................................................................................... 28
v
2.5.2.2 Döndürerek kaplama yöntemi ........................................................................... 29
2.6 Dönüşümlü Voltametri (Cyclic Voltammetry, CV) ............................................... 30
2.7 Atomik Kuvvet Mikroskobu (Atomic Force Microscopy, AFM) ......................... 31
2.8 Hücre İskeleti ve Hücre Adezyon Molekülleri ....................................................... 34
2.8.1 Hücre adezyon molekülleri .................................................................................. 35
2.9 Anti-Mikrotübül İlaçları ......................................................................................... 36
2.9.1 Taksanlar ................................................................................................................ 38
2.9.2 Vinka alkaloidler ................................................................................................... 38
2.9.2.1 Kolsişin ................................................................................................................ 38
2.9.2.2 Vinorelbin ........................................................................................................... 39
2.9.2.3 Vinblastin ............................................................................................................ 40
3. MATERYAL ve YÖNTEM ........................................................................................ 42
3.1 Madde ve Malzeme ................................................................................................... 42
3.2 Ölçüm Sistemi ve Kuartz Kristaller ........................................................................ 43
3.3 Kristal Yüzeylerinin Kaplanması ............................................................................ 45
3.3.1 Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi ile yüzey modifikasyonu ......... 45
3.3.1.1 Dönüşümlü voltametri ölçümleri ....................................................................... 46
3.3.2 Elektroeğirme (electrospining) tekniği ile yüzey kaplama ................................. 46
3.3.3 Döndürerek kaplama (spin coating) tekniği ile yüzey kaplama ........................ 47
3.3.4 Damlatma tekniği ile yüzey kaplama ................................................................... 47
3.3.4.1 Kitosan film ile kaplama ..................................................................................... 47
3.3.4.2 Hyalüronik asit polimeri ile kaplama ................................................................ 47
3.3.4.3 Kollajen film ile kaplama ................................................................................... 48
3.3.4.4 Alginat film ile kaplama ..................................................................................... 48
3.3.4.5 PLL film ile kaplama .......................................................................................... 48
vi
3.4 Atomik Kuvvet Mikroskobu .................................................................................... 49
3.5 Kaplı Yüzeylerin Kararlılık Testleri ....................................................................... 49
3.6 Sıçan Kemik İliğinden Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ...................... 49
3.6.1 Hücre kültürü ve pasajlama .................................................................................. 50
3.6.2 Tripsinizasyon işlemi ............................................................................................. 50
3.7 Hücre Adezyonunun KKM Sistemi ile Görüntülenmesi ....................................... 50
3.8 Toksisite Testleri ....................................................................................................... 51
3.8.1 MTT testi ................................................................................................................ 52
3.8.2 IC50 değerlerinin hesaplanması ........................................................................... 53
3.9 Hücre-İlaç Etkileşiminin KKM Sistemi ile Görüntülenmesi ................................ 53
4. BULGULAR ................................................................................................................ 55
4.1 Kaplamaların Neden Olduğu Frekans Değişimleri Bulguları .............................. 55
4.2 Kristal Yüzeylerinin AFM Bulguları ...................................................................... 56
4.2.1 Altın yüzeyin AFM bulguları ................................................................................ 56
4.2.2 11-MUA ile modifiye edilen yüzeyin AFM bulguları .......................................... 57
4.2.3 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ........................................... 59
4.2.4 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ........................................ 60
4.2.5 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin AFM bulguları .................................................. 62
4.2.6 PLGA film ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ....................................................... 63
4.2.7 PCL ile kaplı yüzeyin AFM bulguları .................................................................. 65
4.2.8 PS ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ..................................................................... 66
4.2.9 Kitosan ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ............................................................. 68
4.2.10 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ............................................. 69
4.2.11 Kollajen ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ......................................................... 71
4.2.12 Alginat ile kaplı yüzeyin AFM görüntüleri ........................................................ 72
vii
4.2.13 PLL ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ................................................................ 73
4.2.14 Yüzeylerin RMS değerleri ................................................................................... 75
4.3. CV Bulguları ............................................................................................................. 76
4.4 Faz Kontrast Mikroskobu Bulguları ....................................................................... 78
4.4 Hücre Adezyonu Bulguları ....................................................................................... 79
4.4.1 Altın ve alkilsiloksan tek tabaka yüzeyler üzerine hücre adezyonu
bulguları ................................................................................................................. 79
4.4.2 PLGA nanolif ve PLGA film kaplı yüzeyler üzerine hücre adezyonu
bulguları ................................................................................................................. 82
4.4.3 PCL ve PS polimeri ile kaplı yüzeyler üzerine hücre adezyonu sonuçları ....... 84
4.4.4 PLL, kitosan, hyalüronik asit, kollajen ve alginat polimeri ile kaplı
kristal yüzeyinin hücre adezyonu sonuçları ........................................................ 86
4.5 Hücre-İlaç Etkileşimi ile İlgili Araştırma Bulguları .............................................. 90
4.5.1 Faz kontrast mikroskobu bulguları ...................................................................... 90
4.5.2 MTT bulguları ........................................................................................................ 94
4.5.2.1 Faz kontrast mikroskobu bulguları ................................................................... 94
4.5.2.2 MTT hücre canlılık testi sonuçları .................................................................... 98
4.5.3 KKM Bulguları ..................................................................................................... 100
4.5.3.1 Kolsişin’in MKH üzerine etkisi ........................................................................ 100
4.5.3.2 Vinorelbin’in MKH üzerine etkisi .................................................................... 102
4.5.3.3 Vinblastin’in MKH üzerine etkisi .................................................................... 104
5. TARTIŞMA ve SONUÇ ............................................................................................ 107
KAYNAKLAR ............................................................................................................... 115
EKLER ............................................................................................................................ 122
EK 1 Kaplama işlemlerinde kullanılan polimerlerin molekül yapıları .................... 123
EK 2 Kaplamalrın neden olduğu frekans değişimleri ................................................ 124
ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................... 125
viii
SİMGELER DİZİNİ
11-MUA 11-Merkaptoundekanoik asit
AFM Atomik kuvvet mikroskopisi
AMEM Alpha modified eagle’s medium
CV Dönüşümlü voltametri
F Frekans
IC İnhibitör konsantrasyonu
MKH Mezenkimal kök hücre
PCL Poli(kaprolakton)
PLGA Poli(D,L-laktik-ko-glikolik asit)
PLL Poli(l-lizin)
PS Poli(stiren)
PZ Piezoelektrik
QCM Kuartz kristal mikrobalans
R Direnç
RMS Yüzey pürüzlülük değeri
SAM Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka
SAW Yüzey akustik dalga
SEM Taramalı elektron mikroskopisi
TEM Geçirmeli elektron mikroskopisi
TSM Kalınlık kayma modu
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Piezoelektrik etkiyi açıklayan basit moleküler model: a. Doğal molekül,
b. Kuvvet uygulanan molekül, c. Malzeme yüzeyi üzerindeki
polarizasyon etkisi ............................................................................................ 7
Şekil 2.2 Piezolektrik etki ile oluşan elektrik akımı .......................................................... 8
Şekil 2.3 Kuartz kristaldeki SiO2 kafes yapısı ................................................................... 9
Şekil 2.4 Kuartz kristalin optik z-eksenine 35o 10’ açıyla kesimi sonucunda elde
edilen AT-kesim kuartz kristali ........................................................................ 10
Şekil 2.5 Kuartz kristalin titreşim modları ........................................................................ 11
Şekil 2.6 Farklı kesim tipine sahip kristallerin titreşim frekanslarının sıcaklık ile
ilişkisi ............................................................................................................. 12
Şekil 2.7 AT-kesim kristallerin titreşim frekansının sıcaklıkla değişimi .......................... 13
Şekil 2.8 Akustik dalga sistemleri (Akustik rezonatörler) ve dalga yayılımları ............... 14
Şekil 2.9 Kuartz kristali..................................................................................................... 15
Şekil 2.10 Piezoelektrik kuartz kristalin titreşimi sırasında oluşan kayma ....................... 16
Şekil 2.11 KKM enzim sensörü ile glikonik asidin eş zamanlı belirlenmesi.................... 22
Şekil 2.12 KKM hücre biyosensörünün şematik olarak gösterimi ................................... 23
Şekil 2.13 Alkilsiloksan tek tabaka tekniği ile kristal yüzeyinin modifikasyonu ............. 26
Şekil 2.14 Alkilsiloksan tek tabaka ................................................................................... 27
Şekil 2.15 Elektroeğirme yönteminin şematik olarak gösterimi ....................................... 28
Şekil 2.16 Döndürerek kaplama yöntemi ile yüzey kaplama ............................................ 30
Şekil 2.17 AFM sisteminin şematik olarak gösterimi ....................................................... 32
Şekil 2.18 Mikrotübüllerin polimerizasyonu .................................................................... 34
Şekil 2.19 Mikrotübüllerin farklı bölgelerine bağlanan anti-mikrotübül ilaçları .............. 37
Şekil 2.20 Kolsişin molekülünün yapısı ........................................................................... 39
Şekil 2.21 Vinorelbin molekülünün yapısı ....................................................................... 40
Şekil 2.22 Vinblastin sülfat molekülünün yapısı .............................................................. 41
x
Şekil 3.1 Çalışmalarda kullanılan ölçüm sistemi ve kuartz kristali .................................. 43
Şekil 3.2 Kristalin akış hücresi içerisine yerleştirilmesi ................................................... 44
Şekil 3.3 Hücre adezyonu ve hücre-ilaç etkileşimi ölçümleri için deney düzeneği.......... 45
Şekil 3.4 CV ölçümleri için deney düzeneği ..................................................................... 46
Şekil 3.5 Formazan kristallerinin oluşum reaksiyonu ....................................................... 52
Şekil 4.1 Kurartz kristalin altın yüzeyinin üç boyutlu AFM görüntüsü ve
histogram analizi ................................................................................................ 56
Şekil 4.2 Altın yüzeyin kesit analizi ................................................................................. 57
Şekil 4.3 11-MUA ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram
analizi ............................................................................................................. 58
Şekil 4.4 11-MUA ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................................. 58
Şekil 4.5 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve
histogram analizi ............................................................................................ 59
Şekil 4.6 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................... 60
Şekil 4.7 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve
histogram analizi ............................................................................................ 61
Şekil 4.8 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................ 61
Şekil 4.9 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram
analizi ............................................................................................................. 62
Şekil 4.10 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin kesit analizi ................................................... 63
Şekil 4.11 PLGA film kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram
analizi ............................................................................................................. 64
Şekil 4.12 PLGA film ile kaplı yüzeyin kesit analizi........................................................ 64
Şekil 4.13 PCL ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi ........ 65
Şekil 4.14 PCL ile kaplı yüzeyin kesit analizi .................................................................. 66
Şekil 4.15 PS kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi ................ 67
Şekil 4.16 PS ile kaplı yüzeyin kesit analizi ..................................................................... 67
Şekil 4.17 Kitosan ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram
analizi ............................................................................................................. 68
Şekil 4.18 Kitosan ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................................. 69
xi
Şekil 4.19 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve
histogram analizi ............................................................................................ 70
Şekil 4.20 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin kesit analizi ................................................. 70
Şekil 4.21 Kollajen ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram
analizi ............................................................................................................. 71
Şekil 4.22 Kollajen ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................................ 72
Şekil 4.23 Alginat ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram
analizi ............................................................................................................. 73
Şekil 4.24 Alginat ile kaplı yüzeyin kesit analizi .............................................................. 73
Şekil 4.25 PLL ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi ......... 74
Şekil 4.26 PLL ile kaplı yüzeyin kesit analizi................................................................... 74
Şekil 4.27.a. Kaplanmamış kristalin, b. 11-MUA ile kaplı kristalin CV
voltamogramı. ................................................................................................ 76
Şekil 4.28.a. Kaplanmamış kristalin, b. 2-Merkaptoetanol ile kaplı kristalin CV
voltamogramı. ................................................................................................ 77
Şekil 4.29.a. Kaplanmamış kristalin, b. 2-Merkaptoetilamin ile kaplı kristalin CV
voltamogramı. ................................................................................................ 77
Şekil 4.30.a. Sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin 1. Pasajın 10.
gününde, b. 3. Pasajın 10. gününde elde edilen faz kontrast görüntüleri ....... 78
Şekil 4.31.a. Kaplanmamış kristal yüzeyi üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli
besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ....................... 79
Şekil 4.32 11-MUA ile kaplı yüzey üzerine hücresiz (a) ve hücreli besiyeri (b)
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ..................................... 80
Şekil 4.33.a. 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli
besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ....................... 81
Şekil 4.34.a. 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b.
hücreli besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ........... 81
Şekil 4.35.a. PLGA nanolif ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli
besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ....................... 83
Şekil 4.36.a. PLGA film ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli
besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ....................... 84
Şekil 4.37.a. PCL ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ..................................... 85
Şekil 4.38.a. PS ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ..................................... 86
Şekil 4.39.a. PLL ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ..................................... 87
xii
Şekil 4.40 Kitosan ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında
kristaldeki frekans değişimi ........................................................................... 88
Şekil 4.41 Hyalüronik asit ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında
kristaldeki frekans değişimi ........................................................................... 89
Şekil 4.42 Kollajen ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında
kristaldeki frekans değişimi ........................................................................... 89
Şekil 4.43 Alginat ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında
kristaldeki frekans değişimi ........................................................................... 90
Şekil 4.44 Şekil 4.44 Artan kolsişin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök
hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz
kontrast mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d.
150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM ...................................................................... 91
Şekil 4.45 Artan vinorelbin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin
morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast
mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,
e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 92
Şekil 4.46 Artan vinblastin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin
morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast
mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,
e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 93
Şekil 4.47 Artan konsantrasyonlarda kolsişin içeren besiyeri ile 6 saat muamele
edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast
mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,
e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 95
Şekil 4.48 Artan konsantrasyonlarda vinorelbin içeren besiyeri ile 6 saat muamele
edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast
mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,
e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 96
Şekil 4.49 Artan konsantrasyonlarda vinblastin içeren besiyeri ile 6 saat muamele
edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast
mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,
e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 97
Şekil 4.50 Artan kolsişin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen
değişim ........................................................................................................... 98
Şekil 4.51 Artan vinorelbin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana
gelen değişim.................................................................................................. 99
Şekil 4.52 Artan vinblastin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana
gelen değişim.................................................................................................. 99
Şekil 4.53 Hücre ilavesi (1. ok) ve kolsişin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin
frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 101
Şekil 4.54 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine kolsişin ilavesi sonrası kristalin
frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 101
xiii
Şekil 4.55 Hücre ilavesi (1. ok) ve vinorelbin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin
frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 103
Şekil 4.56 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine vinorelbin ilavesi sonrası kristalin
frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 103
Şekil 4.57 Hücre ilavesi (1. ok) ve vinblastin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin
frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 104
Şekil 4.58 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine vinblastin ilavesi sonrası kristalin
frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 105
Şekil 4.59 Kristal yüzeyindeki hücreler üzerine DMSO enjeksiyonu sonucu
kristalin frekansında meydana gelen değişim ............................................... 106
xiv
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 1.1 Çalışmada kullanılan kristal kaplama malzemeleri ve kaplama
yöntemleri........................................................................................................ 5
Çizelge 4.1 Kaplamaların neden olduğu frekans değişimleri ........................................... 55
Çizelge 4.2 Yüzeylerin RMS değerleri ............................................................................. 75
Çizelge 4.3 MKH’lerin IC50 değerleri ............................................................................ 100
1
1. GİRİŞ
Biyosensörler, biyokimyasal sinyaleri ölçülebilir elektrik sinyallerine dönüştürebilen
analitik cihazlardır. Günümüzde biyosensörler basit ve düşük maliyetli olmaları, hızlı
cevap verme süresine sahip olmaları, çok az aktif malzemeye ihtiyaç göstermeleri ve
yüksek hassasiyetli cihazlar olmalarından dolayı, başta klinik teşhisler olmak üzere,
gıda, eczacılık, çevre kirliliği ve ilaç keşfi çalışmalarında yaygın olarak
kullanılmaktadırlar.
Biyosensörler reseptör ve dönüştürücü olmak üzere iki ana yapıdan oluşmaktadır.
Biyoreseptörler analiti tanıyan biyomoleküllerdir. Dönüştürücüler ise biyoreseptörün
analiti tanıdığı anda ürettiği kimyasal veya fiziksel sinyali, elektrik sinyallerine
dönüştüren yapılardır. Biyosensör sistemlerinde, optik, elektrokimyasal, termometrik,
manyetik veya piezoelektrik özelliğe sahip farklı dönüştürücü sistemleri
kullanılmaktadır. Piezoelektrik (PZ) biyosensörlerde kullanılan dönüştürücü sistemini,
piezoelektrik kuartz kristaller oluşturmaktadır.
Kuartz kristal mikrobalans sisteminde, kristal yüzeyi üzerinde meydana gelen herhangi
bir kütle birikimi, kristalin temel titreşim frekansının azalmasına neden olmakta ve bu
değişimden yararlanılarak kalitatif ve kantitatif analizler yapılabilmektedir. KKM’in
diğer sensör sistemleriyle kıyaslandığında sahip olduğu en önemli avantajı, herhangi bir
işaretleme işlemi yapılmadan, analiz edilecek maddelerin eş zamanlı olarak belirlendiği
bir sistem olmasıdır (Bunde vd. 1998). Sistem sahip olduğu bu avantajlarından dolayı,
kimyasal (Chao ve Shih 1998, Shih vd. 2001) ve biyolojik (Minunni vd. 2003)
maddelerin analizlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Katı yüzeyler üzerine hücre adezyonu, hücrelerin biyomalzemelere karşı
davranışlarının belirlenmesinde oldukça önemlidir. Biyomalzemlerin, fiziksel,
kimyasal, mekanik ve termal özellikerinin iyi bilinmesi; allerjik, toksik, karsinojenik
etki göstermemesi gerekmektedir. Biyomalzemelerin fizikokimyasal özelliklerinin ve
2
biyouyumluluklarının belirlenmesinde yeni metodların geliştirilmesi, tıp alanında yeni
biyomalzemlerin kullanıma sunulması amacıyla son derece önemlidir. Malzemelerin
biyouyumluluk özellikleri, yüzey üzerine hücre adezyonuyla yakından ilişkilidir
(Anselme vd. 2005). Biyomalzeme yüzeyi üzerine hücre adezyonunun belirlenmesi
için birçok farklı yöntem kullanılmaktadır. Bu yöntemlerde; enzimatik ayırma veya
fiksasyon sonrasında, işaretlenmiş hücrelerin direkt olarak sayımı, hücre lizisi sonrası
boyanmış hücrelerin spektrofluorimetre ile indirekt olarak sayımı, farklı optik
tekniklerle hücre alan ve yoğunluk ölçümleri ve adezyon kuvvetlerinin analizinde
kullanılan fluoresans yoğunluk ölçümleri yapılmaktadır. Hücre adezyonu
gerçekleştikten sonra, hücreyi yüzeyden ayırma, boyama işlemleri veya fiksasyon
basamakları gibi zaman alıcı işlemlerin uygulanması bu yöntemlerin
dezavantajlarındandır (Fredriksson vd. 1998).
Biyomalzeme araştırma ve geliştirme çalışmalarında karşılaşılan en önemli
problemlerden biri hücre-malzeme ve hücre-ilaç ilişkilerini in vitro ortamda, eş
zamanlı olarak belirleyebilen bir sistemin eksikliğidir (Lord vd. 2006). Kuartz kristal
mikrobalans sistemi, hücreyi yüzey üzerinden ayırmadan ya da herhangi bir işaretleme
işlemi yapmadan hücre adezyonunun eş zamanlı olarak belirlenebildiği bir tekniktir
(Modin vd. 2006).
Kuartz kristal mikrobalans biyosensörlerin hazırlanmasında ilk basamak, kuartz
kristalin uygun bir kaplama malzemesi ile kaplanarak, analiz edilecek maddenin (ya da
hücrenin) sensör yüzeyine doğru bir şekilde bağlanmasını sağlamaktır. Bu amaç için
farklı kaplama teknikleri kullanılmaktadır. Bu çalışmada kuartz kristallerin kaplanması
aşamasında; kendiliğinden düzenlenen tek tabaka, elektroeğirme, döndürerek kaplama
ve damlatma yöntemi olmak üzere dört farklı kaplama yöntemi kullanılmıştır. KKM
hücre sensörü uygulamalarında, kuartz kristalin elektrot yüzeyine kaplanan malzeme,
hücre adezyonunu arttırmak ve bağlanan hücrelerin canlı bir şekilde yüzeyde kalmasını
sağlamak amacıyla oldukça önemlidir (Guo vd. 2008). Aynı zamanda kaplama
malzemesinin viskoelastik özelliklerinin, KKM sensörünün kütle hassasiyeti üzerinde
3
önemli bir rolü bulunmaktadır (Lucklum vd. 2000). Bu sebeple, sensör için en uygun
kaplama malzemesi, bu gibi özellikler göz önünde bulundurularak belirlenmelidir.
İşaretsiz (label-free) hücre temelli teknolojiler ilaç keşfi çalışmalarının önemli bir
parçasını oluşturmaktadır. Bu teknolojinin en önemli avantajlarından biri hücre
cevaplarının belirlenmesinde herhangi bir işaretleme işlemine gerek duyulmamasıdır.
İşaretleme amacıyla kullanılan bazı maddeler hücre davranışlarını etkileyen
fonksiyonlar gösterebilmektedir. Bu durum hücrenin doğal davranışlarını
engellemektedir. Bu teknolojinin diğer bir avantajı ise, hücrelerin noninvaziv (non-
invasive) olarak incelenmesidir (Xi vd. 2008). Bu özellik hücre davranışlarının eş
zamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlamaktadır. Hücresel prosesleri eş zamanlı olarak
görüntüleyen tekniklerin, diğer geleneksel yöntemlerle kıyaslandığında önemli
avantajları bulunmaktadır. Bu teknoloji ile, hücre büyümesi, çoğalması, apoptozis ve
morfolojik değişimler gibi biyolojik olaylar hakkında önemli bilgiler sağlanmaktadır.
Anti-mikrotübül ilaçları kanser tedavisinde kullanılan anti-mitotik özelliğe sahip
maddelerdir. Bu maddeler mikrotübüllere bağlanıp mikrotübüllerin fonksiyonunu
bozarak, mitoz bölünmenin durmasına neden olmaktadır (Jordan ve Wilson 2004). Anti-
mikrotübül ilaçlarına karşı zamanla kazanılan direnç o ilacın etkinliğini azalmaktadır.
Genel olarak üç temel ilaç direnci oluşum mekanizması bulunmaktadır (Checchi vd.
2003). İlk direnç mekanizmasında, hücre membranında yer alan ve bir protein olan P
glikoproteininin fazla miktarda sentezlenmesi ile ilaç direnci ortaya çıkmaktadır. Bu
protein tıpkı bir pompa gibi çalışarak, hücre içerisinden ilaçları hızlı bir şekilde dışarı
atmaktadır. İkinci olarak, alfa ve beta tübülinin alt ünitelerini kodlayan genlerde
meydana gelen mutasyonlardır. Bu gen mutasyonları ilaçların tübüline bağlanmasını
engelleyebilmektedir. Üçüncü olarak ise; memelilerde altı β-tübülin izotipi
bulunmaktadır ve izotiplerin ekspresyonları dokulara özgündür. Bu çeşitlilik nedeniyle
ilaçların etkinlikleri her dokuda farklılık göstermektedir. Geliştirilen dirençlilik pek çok
anti-mikrotübül ilacın hastalar üzerinde beklenen etkisini gösterememesine ve hastalığın
ilerlemesine neden olmaktadır. Artırılan ilaç dozları ise hastalarda görülen yan etkilerin
artmasına neden olmaktadır (Kars vd. 2009). Bu nedenle son yıllarda yeni anti-
4
mikrotübül ilaçlarının geliştirilmesi yönünde önemli çabalar sarf edilmektedir (Checchi
vd. 2003). Kuartz kristal mikrobalans sistemi, kemoterapötik potansiyeli bulunan bazı
maddelerin mikrotübüle bağlanma aktivitelerinin, işaretleme işlemi yapılmadan ve eş
zamanlı olarak incelenebilmesine olanak sağlamaktadır.
Bu çalışma genel olarak iki aşamadan oluşmaktadır: (1) Hücre-malzeme etkileşiminin
incelenmesi, (2) Hücre-ilaç etkileşiminin incelenmesi. Çalışmanın ilk aşamasında
mezenkimal kök hücrelerinin farklı yüzeyler üzerindeki bağlanma oranları KKM
sistemi ile incelendi. Bu amaçla, herhangi bir kaplama işlemi yapılmamış kristal yüzeyi
(altın) ile birlikte toplam 13 farklı yüzey üzerinde çalışıldı (Çizelge 1.1).
Çalışmanın birinci aşaması için, kuartz kristal yüzeyi, dört farklı kaplama tekniği
kullanılarak farklı malzemelerle kaplandı. Kaplamaların neden olduğu frekans
değişimlerini belirlemek amacıyla, kristalin kaplamadan önceki ve sonraki frekansları
ölçülerek frekans değişimleri hesaplandı. Yüzeyi kaplanan kristal, hücre adezyonu
ölçümleri için akış hücresi içerisine yerleştirildi. Akış hücresinin osilatörle bağlantısı
yapılarak karbondioksit inkübatörü içerisine (%5 CO2, 37oC ve %95 nem) yerleştirildi
ve peristaltik pompa ile bağlantısı yapıldı. Akış hücresi içerisinde bulunan kristal yüzeyi
üzerine, peristaltik pompa yardımıyla 0.40 mL/dk hızıyla besiyeri (AMEM) akışı
sağlandı. Wistar sıçanlarının kemik iliğinden standart protokollere uygun olarak izole
edilen mezenkimal kök hücreler, hücre kültürü şartlarında çoğaltıldıktan sonra
tripsinleme işlemi yapıldı. Elde edilen hücre süspansiyonu akış sistemine üç aşamada
ilave edilerek mezenkimal kök hücrelerinin her bir yüzey üzerine bağlanma oranı KKM
sistemi ile belirlendi. Frekans ölçümleri aynı koşullarda hücresiz ortamda
gerçekleştirildi. Ayrıca çalışılan yüzeylerin morfolojileri atomik kuvvet mikroskobu ile
incelendi.
5
Çizelge 1.1 Çalışmada kullanılan kristal kaplama malzemeleri ve kaplama yöntemleri
Kaplama yöntemi Kaplama malzemesi
Kendiliğinden düzenlenen
tek tabaka
11-MUA, 2-Merkaptoetilamin, 2-Merkaptoetanol
Elektroeğirme PLGA
Döndürerek kaplama PLGA, PS, PCL
Damlatma Kitosan, Hyalüronik asit, Kollajen, Alginat, PLL
Çalışmanın ikinci aşamasında ise, PS polimeri ile kaplanan ve akış hücresi içerisine
yerleştirilen kristal üzerinde mezenkimal kök hücrelerinin çoğalması sağlandı. Ardından
kristal yüzeyindeki hücreler üzerine belirli dozlarda anti-mikrotübül ilaçları enjekte
edilerek, hücrelerin bu ilaçlara karşı verdikleri cevaplar KKM sistemi ile belirlendi.
Çalışmada, kolsişin, vinorelbin ve vinblastin olmak üzere üç farklı anti-mikrotübül ilacı
kullanıldı. Bu ilaçlar mikrotübüllerin farklı bölgelerine bağlanarak mikrotübüllerin
polimerizasyonunu inhibe eden maddelerdir (Jordan ve Wilson 2004). Bu çalışmada,
her bir ilacın IC50 değerini hesaplamak amacıyla toksisite testi yapıldı. Bu amaçla,
ilaçların farklı konsantrasyonlarında mezenkimal kök hücrelerinin canlılığını belirlemek
için MTT yöntemi kullanıldı. Aynı zamanda ilaçların farklı konsantrasyonlarının hücre
morfolojilerinde meydana getirdiği değişimler faz kontrast mikroskobu kullanılarak
incelendi.
Bu tez çalışmasının konusu olan, mezenkimal kök hücrelerinin farklı substrat yüzeyler
üzerine adezyonunun ve anti-mikrotübül ilaçlarıyla etkileşiminin, kuartz kristal
mikrobalans sistemi ile eş-zamanlı belirlenmesi bugüne kadar gösterilmiş değildir.
6
2. KURAMSAL TEMELLER
2.1 Piezoelektrik Özellik
Piezoelektrik etki ilk kez 1880 yılında Paul Jacques Curie ve Pierre Curie kardeşlerin,
bazı kristaller üzerinde (kuartz, turmalin, topaz, Rouchelle tuzu vd.) yaptıkları
çalışmalar sonucunda bilimsel olarak kanıtlanmıştır. Piezoelektrik özellik, bazı
kristallerin yüzeylerine mekanik bir kuvvet uygulandığında, kristalin yüzeyleri arasında
bir elektriksel potansiyel farkının oluşması (direkt piezoelektrik etki) şeklinde
tanımlanmıştır. Piezoelektrik etkinin keşfinden bir yıl sonra, Lippmann direkt etki
gösteren kristallerin, ters etki göstermesi gerektiğini öne sürmüş (Lippmann 1881) ve
ters piezoelektrik etki Curie kardeşler tarafından aynı yıl deneysel olarak ispatlanmıştır.
Yunancada ‘bastırmak’ anlamına gelen ‘piezein’ ön ekinden türetilen piezoelektrik
kavramı özetle, üzerine mekanik bir basınç uygulanan bazı kristal ve seramik
malzemelerde bir elektriksel gerilimin oluşması olarak tanımlanmaktadır. Kristalin
yapısında meydana gelen bu şekil değişikliği kalıcı değildir. Kristal uygulanan gerilim
boyunca, orjinal şekli etrafında titreşmektedir. Piezoelektrik özellik; kuarz (SiO2),
turmalin, lityum sülfat, kadminyum sülfit, çinko oksit (ZnO), rochelle tuzu
(NaKC4H4O6-4H2O), baryum titanat (BaTiO3), kurşun zirkonat titanat (PZT) gibi tek
kristal polar eksenine sahip maddelerde görülmektedir.
Şekil 2.1’de piezolektrik etkiyi açıklayan bir moleküler model verilmiştir. Malzeme
üzerine herhangi bir kuvvet uygulanmadığında iç yapıdaki pozitif ve negatif yükler
birbirini dengeleyecek şekilde yerleşmiştir. Bu nedenle negatif ve pozitif yüklerin dış
etkileri karşılıklı olarak etkisiz hale gelmektedir. Sonuç olarak, malzeme elektriksel
olarak nötr özellik göstermektedir. Malzeme üzerine belirli miktarda kuvvet
uygulandığında malzemenin iç yapısı deforme olarak pozitif ve negatif yükler
birbirinden ayrılır ve malzemenin iç yapısında bir dipol meydana gelir. Bir başka
7
deyişle malzeme polarize olur. Bu polarizasyon bir elektrik alanın oluşmasına neden
olur.
Şekil 2.1 Piezoelektrik etkiyi açıklayan basit moleküler model: a. Doğal molekül, b. Kuvvet uygulanan molekül, c. Malzeme yüzeyi üzerindeki polarizasyon etkisi
Şekil 2.2’de piezoelektrik malzeme üzerine belirli şiddette uygulanan kuvvet sonucu
elektrik yükünün oluşumu görülmektedir. Elektrot olarak kullanılan iki metal plaka, zıt
yüklerin bulunduğu yüzey üzerine yerleştirilmiştir. Uygulanan kuvvetin etkisiyle
elektrotlar arasında oluşan gerilim farkını belirlemek amacıyla potansiyometre
kullanılmaktadır. Şekilde görüldüğü gibi, piezoelektrik materyal üzerine uygulanan
kuvvet, malzemenin iç yapısında bir polarizasyon oluşmasına neden olmaktadır. Bu
polarizasyon kondüktörde bulunan serbest yüklerin akışına sebep olan bir elektrik alan
meydana getirmektedir. Malzeme üzerindeki kuvvetin kaldırılması, polarizasyonun sona
ermesine ve yük akışının durmasına neden olmaktadır.
8
Şekil 2.2 Piezolektrik etki ile oluşan elektrik akımı
2.2 Kuartz Kristaller
Piezoelektrik özelliğe sahip kuartz kristali SiO2 monokristalidir. Herbir birim hücresi üç
adet SiO2 molekülünden oluşan kuartz kristali, çoğu kimyasal çözücülerden
etkilenmediği gibi, kristal yapısını çok yüksek sıcaklıklara kadar koruyabilmektedir.
Kuartz kristalin doğada α-kuartz ve β-kuartz olmak üzere iki farklı formu
bulunmaktadır. 573oC inversiyon sıcaklığında α-kuartz, β-kuartza tersinir olarak
dönüşmektedir (Faccio vd. 1995). Kristalin α- formu, 573oC sıcaklığına kadar
piezoelektrik özelliğini kaybetmeden kararlı olabilmektedir. Piezoelektrik sensör
uygulamalarında yüksek sıcaklıklara karşı dayanıklı olması ve suda çözünmemesinden
dolayı, kristalin α-kuartz formu kullanılmaktadır.
9
Şekil 2.3 Kuartz kristaldeki SiO2 kafes yapısı (www.utas.edu.au/sciencelinks)
2.2.1 Kuartz kristal kesim tipleri
Kuartz kristalin farklı açılardan kesimi sonucunda farklı özelliklere ve titreşim
modlarına sahip kristal türleri oluşmaktadır. Kuartz kristalin optik z-eksenine 35o 10’
açıyla kesimi sonucunda AT-kesim kuartz kristali oluşmaktadır (Şekil 2.4).
10
Şekil 2.4 Kuartz kristalin optik z-eksenine 35o 10’ açıyla kesimi sonucunda elde edilen AT-kesim kuartz kristali
SiO2 kristaline enerji verildiğinde, kristal belli frekansta ve belli modlarda titreşmeye
başlamaktadır (Şekil 2.5). Kuartz kristallerin temel titreşim modları (Faccio vd. 1995);
a) Eğilme (bending),
b) Uzama (extension),
c) Yüzey kayma (face shear),
d) Kalınlık kayma (thickness shear)’dır
11
Şekil 2.5 Kuartz kristalin titreşim modları
Kristalin titreşim frekansı, boyutuna, yoğunluğuna, kesim türüne ve titreşim moduna
bağlıdır. TSM (thickness shear modunda) modundaki titreşim hareketi kristal yüzeyine
paraleldir. TSM modu, kütle değişimlerine en hassas titreşim moddur. AT ve BT kesim
kristaller TSM modunda titreşen kristal türleridir. PZ biyosensör çalışmalarında, AT
kesim kristaller kullanılmaktadır.
2.2.2 Kristal kesim tipi ile sıcaklık ilişkisi
Bir kuartz kristalin titreşim frekansı, kristalin yoğunluğuna, kesimine, titreşim moduna
ve geometrik boyutuna bağlı olduğu gibi, sıcaklık, basınç ve nem gibi çevresel koşullara
da bağlıdır. Piezoelektrik sensör çalışmalarında kristalin frekansının ortam koşullarında
kararlı olması son derece önemlidir. Sıcaklık değişimleri kuartz plakanın boyutunu ve
elastiklik sabitini değiştirmektedir. Piezoelektrik uygulamalarda kullanılacak kristalin
türü, bu özellikler göz önüne alınarak seçilmektedir. Şekil 2.6’da farklı kesim tipine
sahip kristallerin, sıcaklık değişimleri sonucunda frekanslarında meydana gelen
değişimler görülmektedir.
12
Şekil 2.6 Farklı kesim tipine sahip kristallerin titreşim frekanslarının sıcaklık ile ilişkisi (www.txc.com.tw/en/d_support/01.html)
Kristalin titreşim frekansının sıcaklıkla önemli ölçüde değiştiği H, BT, GT veya CT
kesim kristaller, sıcaklık sensörleri gibi uygulamalarda tercih edilmektedir.
Piezoelektrik sensör uygulamalarında, kuartz kristallerin mevcut kesim tipleri içinde,
sıcaklık değişimlerinden en az etkilenen, oda sıcaklığında en kararlı kristal tipi olan AT-
kesim kuartz kristalleri tercih edilmektedir. Şekil 2.7’de AT-kesim kristallerin titreşim
frekanslarının sıcaklık değişimleri ile ilişkisi görülmektedir.
13
Şekil 2.7 AT-kesim kristallerin titreşim frekansının sıcaklıkla değişimi (www.hfc.net.cn/en/Terminology.asp)
2.3 Akustik Dalga Cihazları
Genel olarak tüm akustik dalga (acoustic wave) cihazlarında ve sensörlerinde akustik
dalga üretmek için piezoelektrik malzemeler kullanılmaktadır. Akustik dalga sensörleri
ve cihazlarında kullanılan piezoelektrik malzemeler, kuartz (SiO2), lityum tantalat
(LiTaO3) ve lityum niyobat (LiNbO3)’tır.
Mekanik titreşimin modunu belirleyen kesim açısına bağlı olarak, farklı rezonatör
türleri bulunmaktadır (Janshoff vd. 2000). Örneğin TSM (thickness shear mode), FPW
(flexure plate wave), SAW (surface acoustic wave), LW (Love wave), ve SH-APW
(shear horizontal acoustic plate wave), sensör sistemlerinde en sık kullanılan rezonatör
türleridir (Şekil 2.8). TSM modundaki kristalin elektrotları arasına belirli büyüklükte bir
voltaj uygulandığında kristalde bir kayma (shear) deformasyonu meydana gelmektedir.
14
KKM sisteminde TSM modunda titrşen AT-kesim kuartz kristaller kullanılmaktadır ve
bu moddaki titreşim hareketi kuartz kristalin yüzeyine paraleldir.
TSM FPW SAW SH-APW
Şekil 2.8 Akustik dalga sistemleri (Akustik rezonatörler) ve dalga yayılımları
Genel olarak piezoelektrik cihazlar hacim akustik dalga (bulk acoustic wave, BAW) ve
yüzey akustik dalga (surface acoustic wave, SAW) olmak üzere iki sınıfa ayrılmaktadır
(Bunde vd. 1998).
2.3.1 Hacim akustik dalga sensörleri
Hacim akustik dalga sensörler, kalınlık kayma moduna sahip rezonatörlerdir. Bu
sebeple TSM olarak adlandırıldıkları gibi, kütle hassasiyetlerinden dolayı kuartz kristal
mikrobalans olarak da adlandırılmaktadırlar. TSM rezonatörlerinde 5-30 MHz
arasındaki frekans değerlerinde titreşen kristaller kullanılmaktadır. Üretimi ve kullanımı
zor olan daha ince TSM sistemleri ile yüksek frekanslarda çalışabilmek mümkündür.
15
2.3.2 Yüzey akustik dalga sensörleri
Yüzey akustik dalga sistemleri akustik sensörlerin tamamen farklı bir sınıfıdır. Sistemde
elektrotlar kristalin aynı yüzeyi üzerinde bulunmaktadır. Yüzey akustik dalga
sensörlerinde 25-500 MHz frekans değerlerinde titreşen kristaller kullanılmaktadır. Bu
sistemlerin sıvı ile temaslarında yüzey dalgalarında aşırı derecede bir azalma meydana
gelir. Bu sebeple biyosensör uygulamalarında biyolojik çözeltiler yüzey akustik dalga
sistemleri için problemler oluşturduğundan, kuartz kristal mikrobalans sistemi
biyosensör uygulamalarında daha sık kullanılmaktadır.
2.4 Kuartz Kristal Mikrobalans
Kuartz kristal rezonatörler akustik-dalga’ya dayalı sensörler içinde en sık kullanılan
sistemlerdir. Sistemde kuartz kristal iki metal elektrot arasına yerleştirilmiştir (Şekil
2.9). Elektrotlar, kuartz kristalin her iki yüzeyine metal buharının biriktirilmesiyle
hazırlanmaktadır. Kristalin frekans çalışma aralığı yüzeye biriktirilen metal miktarıyla
ayarlanmaktadır. Piezoelektrik sensör uygulamalarında kullanılan kristaller, 10-16 mm
boyutlarında, yaklaşık 0.15 mm kalınlığında disk, kare veya dikdörtgen şeklindedir.
Elektrot olarak kullanılan metaller genel olarak altın, gümüş, platin, aluminyum ve
nikeldir. Altın elektrotlar inert olmaları nedeniyle birçok uygulamada tercih
edilmektedir. Sensör çalışmalarında rezonans frekansları 5, 8, 9 ya da 10 MHz olan
kuartz kristaller tercih edilmektedir.
Şekil 2.9 Kuartz kristali
16
Elektrotlar arasına belirli voltta akım uygulandığında kristal belirli frekansta
titreşmektedir. Bu titreşimden kaynaklanan kayma elektrotlara paralel yöndedir (Şekil
2.10).
Şekil 2.10 Piezoelektrik kuartz kristalin titreşimi sırasında oluşan kayma
2.4.1 Sauerbrey ve Kanazawa eşitliği
Kuartz kristalin yüzeyinde meydana gelen kütle değişimi, kristalin titreşim frekansının
azalmasına neden olur. Kuartz kristalin titreşim frekansı ile, kristal yüzeyinde biriken
maddenin miktarı arasındaki ilişki ilk defa Sauerbrey (Sauerbrey 1959) tarafından
tanımlanmıştır.
∆f = -2.26 x 106 x f02 x (AM∆ )
Sauerbrey eşitliğinde;
∆F, frekans farkı, Hz
∆M, kristal yüzeyine kaplanan ve kristal yüzeyinde adsorblanan kütle, g
A, kristal yüzey alanı, cm2
F0, kristalin temel titreşim frekansı, MHz’dir.
17
Verilen formülden, kuartz kristalin frekansındaki 1 Hz’lik bir değişim ile yüzeyindeki
kütle miktarı arasındaki ilişkinin nanogramlar mertebesinde olduğu bulunabilmektedir.
Sauerbrey eşitliği gaz fazındaki uygulamalar ve kristal yüzeyi üzerindeki sert ve ince
olan kaplamalar için geçerlidir.
Sıvı fazda ise, kütle ve frekans arasındaki bağıntı 1985 yılında Kanazawa ve Gordon
tarafından rapor edilmiştir (Kanazawa ve Gordon 1985). Bu eşitliğe göre, sıvı
ortamlarda kuartz kristalin titreşim frekansı, kullanılan çözeltinin viskozitesine ve
yoğunluğuna bağlıdır.
∆f = -f03/2 x (ρ1η1/πµqρq)1/2
Kanazawa ve Gordon eşitliğinde;
∆F, frekans farkı, Hz
F0, kristalin temel titreşim frekansı, MHz
µq, kristalin kayma (shear) modülü (µq = 2.947x1011 g/cm.s2)
ρq, kristalin yoğunluğu (ρq = 2.648 g/cm3)
ρ1, çözeltinin yoğunluğu, g/cm3
η1, çözeltinin vizkozitesi, g/cm.s’dir.
2.4.2 KKM biyosensör uygulamaları
Piezoelektrik özelliğin sensör teknolojisinde kulanımı gaz fazı ölçümleriyle başlamıştır.
Piezoelektrik kuartz kristaller kullanılarak geliştirilen biyosensörler ilk kez 1964 yılında
W. H. King tarafından, gaz fazındaki kimyasal örneklerin analizinde kullanılmıştır.
18
(O’Sullivan ve Guilbault 1999). Sonraki yıllarda ise, piezoelektrik sensörler, analitik
elektrokimya alanında uygulama alanı bulmuştur (Ward 1995).
Bu uygulamalardan sonra antikor-antijen etkileşimine dayanan piezoelektrik biyosensör
uygulamaları hızla artmıştır. Piezoelektrik immunsensörler genel olarak, analizi
yapılacak antijene spesifik olan antikorlar uygun bir immobilizasyon yöntemi ile kristal
yüzeyi üzerine immobilize edilerek hazırlanmaktadır. Hazırlanan kristal, immobilize
edilen antikora spesifik antijenin bulunduğu çözelti ile muamele edildiğinde, kristal
yüzeyinde antikor-antijen etkileşimi meydana gelmekte ve bu spesifik etkileşim,
kristalin frekansında belli bir azalmaya sebep olmaktadır. Yapılan bir çalışmada,
kendiliğinden düzenlenen tek tabaka tekniği ve polietilenimin (PEI) polimeri
kullanılarak hazırlanan PZ kristal üzerine, insan α-fetoproteinine (AFP) özgü antikorlar,
gluteraldehit ile çapraz bağlama yöntemi kullanılarak immobilize edilmiştir. Çalışmada,
PEI membran üzerine immobilize edilen antikorların, alkantiyol tek tabaka tekniği
kullanılarak hazırlanan kristal üzerine immobilize edilen antikorlardan daha fazla
aktivite gösterdiği KKM sistemi ile belirlenmiştir (Chou vd. 2002).
Başka bir çalışmada ise, dank (denque) virüsünün teşhisine yönelik bir immünsensör
geliştirilmiştir (Su vd. 2003). Çalışmada, dank virüs zar proteini olan protein E ve
virüsün enfekte ettiği hücreler tarafından eksprese edilen NS-1 proteinine (non-structural
1 protein) özgü olan monoklonal antikorlar ile kaplanan KKM sistemi geliştirilmiştir.
Çalışmada üç farklı immobilizasyon yöntemi karşılaştırılmıştır. Bu yöntemler,
gluteraldehit yöntemi, protein A yöntemi ve karbodiimid (1-etil-3-(3-dimetil-amino
propil) karbodiimid, EDC) yöntemleridir. Yapılan çalışmalar sonucunda, kullanılan
immobilizasyon yöntemlerinden protein A yönteminin, diğer yöntemlere oranla daha
etkin olduğu KKM sistemi ile belirlenmiştir. Ayrıca, immün sensörün hassasiyetinin,
ELISA yöntemine oranla 100 kat daha fazla olduğu ve bu sebeple hastalığın erken
safhalarında kanda az miktarda bulunan virüsün KKM sistemi ile kolaylıkla
belirlenebileceği ve hastalığın daha fazla yayılmadan erken dönemde teşhisinin mümkün
olabileceği belirtilmiştir.
19
Piezoelektrik immünsensörlerin bir diğer uygulama alanı ise mikroorganizmaların
belirlenmesine yönelik çalışmalardır. Bu uygulamalardan birinde, Salmonella
typhimurium mikroorganizmasının belirlenmesi amaçlanmıştır (Babacan vd. 2000).
Kristal yüzeyinin kaplanması için iki farklı yöntem kullanılmıştır. Bu yöntemlerden ilki,
polietilenimin ile kaplanan kristalin gluteraldehit ile modifiye edilerek, yüzeyde serbest
aldehit gruplarının oluşturulduğu, PEI-GA yöntemidir. Diğer yöntemde ise, hücre duvarı
proteini olan protein A kaplama materyali olarak kullanılmıştır. Protein A’nın, IgG
molekülünün Fc bölgesi ile etkileşmesini sağlayan bağlanma bölgeleri bulunmaktadır.
Çalışmada, altın elektrotlu piezoelektrik kuartz kristallerin yüzeyine anti-Salmonella
antikorları immobilize edilmiştir. Sonuç olarak, protein A yöntemi ile kaplanan sensör
sisteminin, PEI-GA yöntemi ile kaplanan sistemden daha etkin ve hassas olduğu
belirlenmiştir. Vaughan vd. (2001) tarafından yapılan bir çalışmada ise, Listeria
monocytogenes mikroorganizması; tiyosiyalikasit ile kaplanmış altın elektrodlu kuartz
kristal kullanılarak belirlenmiştir.
Piezoelektrik sensörlerin bir diğer uygulama alanı DNA sensörleridir. Piezoelektrik DNA
sensörlerinde analiz edilecek örneğin DNA dizisine spesifik olan tek zincirli
oligonükleotit probları kristal yüzeyi üzerine immobilize edilmektedir. Hazırlanan kristal,
hedef diziyi bulunduran çözelti ile muamele edildiğinde kristal yüzeyinde meydana gelen
hibridizasyon reaksiyonu, frekansta belli bir azalmaya neden olmaktadır. Kristalin
frekansında meydana gelen bu değişimden yararlanarak klinik örneklerin analizi
mümkün olmaktadır. Zhou vd. (2002) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada, KKM
sistemi ile hepatit B virüsünün (HBV) belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, HBV
nükleik asit probları, altın elektrotlu piezoelektrik kuartz kristaller üzerine immobilize
edilmiştir. Kuartz kristaller, polietilenimin-gluteraldehit yöntemi ve fiziksel adsorpsiyon
yöntemleri kullanılarak hazırlanmıştır. Çalışmanın sonucunda, HBV nükleik asit
problarının immobilizasyonunda PEI-GA yönteminin, fiziksel adsorpsiyon yöntemine
göre daha etkili olduğu KKM sistemi ile belirlenmiştir.
Mannelli vd. (2003) tarafından yapılan bir çalışmada, genetiği değiştirilmiş
organizmaların belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, sensör yüzeyine immobilize
20
edilen tek zincirli DNA probları, organizmanın genomuna transfer edilen genin
sentezinin düzenlendiği, Nos terminatör ve 35S promotör gen bölgelerine spesifik olan
dizilerdir. pBI121 plazmidinden izole edilen bu bölge, PCR ile çoğaltıldıktan sonra, tek
zincir haline getirilip, piezoelektrik kuartz kristal DNA sensörüyle analiz edilmiştir.
Başka bir piezoelektrik DNA sensörü çalışmasında, Akdeniz popülasyonunda β-
Thalessemia hastalığına neden olan, β-globin geninin, kodon 39 bölgesinde, C-T
değişimi sonucu oluşan nokta mutasyonunun belirlenmesi çalışılmıştır. (Minunni vd.
2003). Çalışmada, 39. kodon çevresindeki bölgeye spesifik 25 merli, 5’ ucu
biyotinlenmiş oligonükleotit problar, streptavidin ile kaplanmış altın elektrotlu 10 MHz
AT-kesim kuartz kristalin yüzeyine immobilize edilmiştir. Bu problar, mutasyonlu 39.
kodon bölgesine komplementer (Prob 2) olan ve normal 39. kodon bölgesine
komplementer (prob 1) olan oligonükleotitlerdir. Bu çalışma için, Thalassemia
hastalarının (%100 TAG), taşıyıcıların (%50 CAG + %50 TAG) ve normal bireylerin
kanlarından izole edilen DNA’nın 39. kodon ve çevresindeki gen bölgesi PCR tekniği
kullanılarak çoğaltılmıştır. Probların immobilize edildiği kristaller, çoğaltılan dizileri
içeren çözeltiler ile muamele edilerek, hibridizasyon reaksiyonu KKM sistemi ile
belirlenmiştir.
Bir başka KKM DNA biyosensörü çalışmasında, farklı immobilizasyon yöntemi
kullanılarak immobilize edilen prob oligonükleotitlerinin hibridizasyon reaksiyonu KKM
sistemi ile incelenmiştir (Tombelli vd. 2002). Çalışmanın sonucunda, karboksillenmiş
dekstran tabakasına bağlı streptavidin üzerine, biyotinlenmiş probların immobilizasyonu
ile oluşturulmuş DNA sensörü ile, hibridizasyon reaksiyonunun daha hassas bir şekilde
belirlendiği belirtilmiştir.
KKM enzim sensörünün temel prensibi, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan ürünün
kristal yüzeyi üzerine bağlanması ile, kristalin frekansında meydana gelen değişimin
belirlenmesidir. Bu amaçla enzimatik ürünün kristal yüzeyi üzerine etkin bir şekilde
bağlanabileceği farklı kaplama malzemeleri geliştirilmiştir. Bu kaplama malzemelerinden
biri karbon allotrobu olan fulleren C60’dır (Chuang ve Shih 2001). Fulleren C60, yapı
21
gereği 60 π-elektronu içermektedir. Bu özellik fullerene, amino grubu gibi elektronegatif
gruplara bağlanabilme yeteneği kazandırmıştır. Çalışmada C60 ile kaplı piezoelektrik
kristal, glikozun glikoz oksidaz tarafından yükseltgenmesi sonucu oluşan glikonik asidi
belirlemek amacıyla kullanılmıştır.
Bir başka glikoz sensörü çalışmasında ise, piezoelektrik kristaller fullerenin kriptand
türevi olan fulleren-kriptand 22 maddesi ile kaplanmıştır (Chang ve Shih 2000). Kriptand
22 yapay makrosiklik bir eterdir. Kriptand 22 ve 18-taç-eter gibi makrosiklik polieterler
su ve organik çözücülerde kolaylıkla çözünürler, fakat fulleren ile verdikleri türevler
hidrofobik özellikte maddeler olduklarından suda çözünmezler. Bu özelliklerinden dolayı
kaplama materyali olarak tercih edilmektedirler. Çalışmada, glikoz içeren çözelti içine
belli miktarda immobilize glikoz oksidaz enzimi ilave edilerek reaksiyon başlatılmış ve
reaksiyon sonucu oluşan glikonik asit miktarı frekans değişimi ile belirlenmiştir. Sonuç
olarak, glikonik asidin fulleren-kriptand 22 kaplı piezoelektrik sensör üzerine
adsorpsiyonu sonucunda kristalin frekansında meydana gelen azalmanın kristal
yüzeyinde biriken glikonik asit miktarıyla orantılı olduğu belirlenmiştir.
Aynı kaplama materyali kullanılarak yapılan bir başka çalışmada ise, immobilize ve
çözünmüş üreaza dayalı olarak geliştirilen KKM üre sensörü kullanılarak, üreaz
enziminin üre ile enzimatik reaksiyonu sonucunda oluşan amonyum iyonunun
belirlenmesi hedeflenmiştir (Wei ve Shih 2000). Kanda bulunan bazı metal iyonları,
glikoz, askorbik asit gibi maddelerin frekans değişimine etkileri incelenerek, sensörün
spesifikliği araştırılmıştır. Ayrıca, kaplama miktarı, üreaz aktivitesi, üre konsantrasyonu,
çözücü ve pH parametrelerinin frekans değişimine etkileri incelenmiştir.
KKM enzim sensörü çalışmalarında kristal yüzeyinin kaplanması için diğer bir yaklaşım
ise, elektroeğirme tekniğidir. Elektroeğirme tekniği, yüksek gözenekliliğe sahip ince
kaplamalar elde etmek amacıyla sensör çalışmalarında yaygın olarak kullanılan bir
yöntemdir (Ding vd. 2004). KKM enzim sensörü çalışmasında (Şeker vd. 2010), kuartz
kristaller, C60 molekülünün PLGA polimeri içerisine belirli oranda karıştırılmasıyla
oluşturulan, PLGA-C60 nanolif membran ile kaplanmıştır. Elektroeğirme nanolifler
22
normal film yapısından 10-1000 kat daha fazla yüzey alanına sahiptir. Bu özellik sensör
yüzeyine enzimatik ürünün adsorpsiyon oranının artmasına ve cevap zamanının
kısalmasına neden olmaktadır. Aynı zamanda çalışmada kullanılan bu kaplama materyali
ile; çözelti içerisinde kümeleşme eğiliminde olan C60 molekülünün nanolif içerisinde
daha homojen bir şekilde dağılması sağlanmıştır (Şekil 2.11).
Şekil 2.11 KKM enzim sensörü ile glikonik asidin eş zamanlı belirlenmesi
(Şeker vd. 2010)
Son yıllarda ise sınırlı sayıda olmakla birlikte hücre sensörü çalışmalarına
rastlanmaktadır (Marx vd. 2007). Hücre sensörlerinde genel hedef, hücrelerin bağlanma
ve çoğalma davranışlarını, hücre-malzeme ya da hücre-ilaç etkileşimlerini eş zamanlı
olarak belirlemektir. KKM hücre sensörleri kullanılarak, hücrelerin farklı malzemeler
karşısındaki davranışlarının incelenmesi; büyüme faktörleri, ilaç molekülleri ve
biyolojik öneme sahip olan kimyasalların hücreler üzerindeki etkilerinin eş zamanlı
olarak belirlenmesi mümkün olmaktadır (Marx vd. 2009).
KKM hücre biyosensörü (Şekil 2.12), deney koşullarının zorluklarından dolayı diğer
biyosensör uygulamalarına kıyasla daha az çalışılan bir alandır (Marx 2003). Hücre
23
sensörü çalışmalarında en temel koşul steril hücre kültürü şartlarının sağlanmasıdır (%5
CO2, %95 nem ve 37oC).
KKM hücre sensörleriyle gerçekleştirilmiş sınırlı sayıdaki çalışmalarda kullanılan hücre
kaynaklarından bazıları, MCF-7 hücreleri (Jia vd. 2008), Neuro-2A hücreleri (Khraiche
vd. 2005), osteoblastlar (Redepenning vd. 1993), MDCK I ve II hücreleri (Wegener vd.
2000), fibroblast hücreleri (Lord vd. 2006), MC3T3-E1 hücreleri (Modin vd. 2006),
CHO hücreleri (Fredriksson vd. 1998), VERO hücreleri (Gryte vd. 1993) ve endotel
hücrelerdir (Marx vd. 2003).
Şekil 2.12 KKM hücre biyosensörünün şematik olarak gösterimi
Son on yılda KKM hücre sensörü kullanılarak, kuartz kristal yüzeyi üzerine farklı hücre
türlerinin bağlanma ve çoğalma davranışları eş zamanlı olarak belirlenmiştir. Örneğin
Khraiche vd. (2005) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada neuro-blastoma (Neuro-
2A) hücrelerinin; kaplanmamış ve PLL ile kaplanmış kristal yüzeyleri üzerindeki
bağlanma oranları karşılaştırılmış, PLL kaplı yüzey üzerinde Neuro-2A hücrelerinin
bağlanma oranının daha fazla olduğu belirlenmiştir. Başka bir çalışmada, sıçan epitel
hücreleri (WB F344) ve akciğer melanoma hücrelerinin (B16F10), vitronektin ve
laminin gibi hücre dışı matriks proteinleri ile kaplı kristal yüzeyleri üzerine bağlanma
oranları karşılaşırılmıştır (Fohlerová vd. 2007). McCoy insan fibroblast hücrelerinin
kullanıldığı bir çalışmada, hücrelerin poli(metil metakrilat) (PMMA) ve farklı PMMA
24
türevleri üzerine adezyonu KKM sistemiyle incelenmiş ve sonuçlar hücre sayım
yöntemleriyle karşılaştırıldığında, her iki teknik kullanılarak elde edilen verilerin
birbiriyle paralellik gösterdiği belirlenmiştir (Guillou-Buffello 2005).
Hücre-ilaç etkileşiminin KKM sistemi ile incelendiği bir çalışmada ise, hücre kaynağı
olarak endotel hücreleri kullanılmıştır. Çalışmada, nokodazol (nocodazole) adı verilen
ve hücrelerdeki mikrotübüllerin depolimerizasyonuna neden olan bir ilacın farklı
dozlarında; hücrelerin kristal yüzeyi üzerine bağlanmaları KKM sistemi ile eş zamanlı
olarak incelenmiştir (Marx vd. 2001). Çalışmada KKM kristali üzerine hücreler kültüre
edildikten sonra 2.0 µM nokodazol ilave edilmiştir. Bu doz mikrotübüllerin
polimerizasyonunu etkilemiş ve bu değişim KKM tarafından belirlenmiştir. Eklenen
nokodazol, kristalin frekansında 360 Hz’lik bir düşüşe sebep olmuştur. Kontrol
çalışması olarak nokodazol içermeyen besiyeri ilave edilmiş ve yaklaşık 20 Hz’lik bir
azalma gözlenmiştir. Benzer bir çalışmada ise, iki farklı hücre tipinin (endotel hücre ve
MDA-MB-231 hücreleri) farklı dozlardaki anti-mikrotübül ilaçları (nokodazol ve
taksol) ile etkileşimi incelenmiştir (Marx vd. 2007).
Aynı grup tarafından gerçekleştirilen bir başka çalışmada ise, iki farklı hücre tipinin
(MCF-7 ve MD-MBA-231) paklitaksel (paclitaxel) ve dosetaksel (docetaxel) ilaçlarına
verdikleri cevaplar incelenmiştir (Braunhut vd. 2005). İlk 6 saat mikrotübüllere
bağlanma sonucunda stres fiberlerinin oluşmasıyla, hücrelerin yüzeye daha fazla
tutunması sonucunda frekansta azalma; 6-24 saat süresinde ise, apoptozis dolayısıyla
hücrelerin yüzeyden ayrılması sonucunda frekansta artış meydana geldiği belirlenmiştir.
Ayrıca KKM ölçümleri, hücreler üzerine dosetakselin paklitakselden daha etkili
olduğunu ve MCF-7 hücrelerinin MD-MBA-231 hücrelerine kıyasla taksan sınıfı
ilaçlara daha dirençli olduğunu göstermiştir.
25
2.5 Yüzey Kaplama Yöntemleri
Piezoelektrik sensör uygulamalarında, kuartz kristallerin yüzeyi seçici bir kaplama
malzemesi ile kaplanmaktadır. KKM sensörleri ile ilgili yapılan bir çok çalışmada, analiz
edilecek maddeye spesifik bir kristal yüzeyi oluşturmak için kristal yüzeyi çeşitli yüzey
modifikasyon teknikleri kullanılarak kaplanmaktadır. Kaplama işleminden önce,
kullanılan yöntemden bağımsız olarak, kristal üzerine immobilizasyonu engelleyebilecek
maddeleri uzaklaştırmak için, elektrot yüzeylerinin uygun yöntemlerle temizlenmesi
gerekmektedir. Temizleme işlem için en sık kullanılan çözelti, %30 H2O2 ve %70 H2SO4
içeren piranha çözeltisidir. Genel olarak yüzey kaplama yöntemleri; a) kimyasal
modifikasyon (kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi) ve b) polimer kaplama
yöntemi olmak üzere ikiye ayrılmaktadır.
2.5.1 Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi
Kristal yüzeyinin kimyasal modifikasyonunda, kendiliğinden düzenlenen tek tabaka
(self-assembled monolayer, SAM) tekniği yaygın olarak kullanılan bir kaplama
yöntemidir. Kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar, katı bir yüzey (altın, cam veya
silisyum oksit) ile moleküler fonksiyonel gruplar arasında meydana gelen bir bağlanma
sonucunda, substrat yüzeyi üzerinde belirli bir düzene göre adsorbe olan moleküllerin
oluşturduğu tek tabakalardır. Kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar, altın üzerinde
alkantiyol tek tabakalar ve alkilsiloksan tek tabakalar olmak üzere ikiye ayrılmaktadır.
2.5.1.1 Alkantiyol tek tabakalar
Alkantiyol tek tabakaka yöntemi, altın yüzey üzerine uzun zincirli alkantiyollerin (RSH,
R=X(CH2)n, n=11-18) adsorpsiyonuna dayanmaktadır.
R-SH + Au(0)n R-SAu(I). Au(0)n + ½ H2
26
Altın yüzey üzerine, alkantiyoller kükürt atomları üzerinden koordine olmaktadırlar.
Farklı tiyol çözeltileri kullanımıyla yüzey üzerinde istenilen fonksiyonel gruplara sahip,
dolayısıyla istenilen fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip tek tabakaların oluşturulması
mümkündür. Tek tabakalar oluşturulduktan sonra yüzey uygun kimyasallarla modifiye
edilerek istenilen özelliklere sahip tek tabakalar oluşturulabilmektedir. Tek tabakanın
özellikleri ayrıca, iki veya daha fazla alkantiyol çözeltisi kullanılarak farklı fonksiyonel
grupları içeren tek tabakaların oluşturulmasıyla da kontrol edilebilmektedir. Ayrıca farklı
karbon sayısına sahip olan tiyol bileşikleri kullanımıyla istenilen kalınlıkta yüzeyler elde
edilebilmektedir (Love vd. 2005).
Kuartz kristalin altın elektrot yüzeyi üzerinde düzgün ve sıralı bir tek tabaka elde etmek
amacıyla, kuartz kristal düşük konsantrasyondaki (genellikle 1-2 mM) tiyol çözeltisi
içerisinde oda sıcaklığında belirli bir süre bekletilmektedir (Şekil 2.13). Çözücü olarak
en çok etanol kullanılmaktadır. Yıkama işleminin ardından istenilen fonksiyonel grubu
bulunduran altın yüzeyler (-COOH, -NH2, -OH…) havada kurutularak hazır hale
getirilmektedir.
Şekil 2.13 Alkantiyol tek tabaka tekniği ile kristal yüzeyinin modifikasyonu
Yüzeyin türü ve temizliği, kullanılan tiyol bileşiğinin yapısı ve saflığı, kullanılan çözücü,
bekletme süresi, sıcaklık ve konsantrasyon gibi deneysel faktörlerin bir çoğu alkantiyol
tek tabaka yapısını ve onun oluşum kinetiğini etkilemektedir. Alkantiyol tek tabakalar,
altın ve kükürt atomları arasında oluşan güçlü kovalent bağ sebebiyle birkaç ay etanol
27
veya su içerisinde ya da havada kararlı olarak kalmaktadır. 70oC’dan daha yüksek
sıcaklıklarda altın yüzey üzerindeki tiyoller desorbe olurken, oksijen varlığında UV ışığa
maruz bırakıldıklarında oksidize olurlar.
2.5.1.2 Alkilsiloksan tek tabakalar
Alkilsiloksan tek tabakalar, alkiltriklorosilan (veya alkiltrietoksisilan) ile hidroksillenmiş
yüzey (cam veya silisyum oksit) arasındaki reaksiyon sonucu oluşturulurlar. Bu tek
tabakalar üzerindeki siloksan grupları hem birbirleriyle, hem de yüzey üzerindeki
hidroksil grupları ile çarpraz bağlar yapmaktadır. Bu özelliklerinden dolayı alkantiyol tek
tabakalara oranla termal olarak daha kararlıdırlar.
Şekil 2.14 Alkilsiloksan tek tabaka
Bu tek tabakada, adsorpsiyon için itici güç silanol gruplarına (SiOH) Si-O-Si kovalent
bağıyla bağlanan polisiloksanların ‘in-sitü’ oluşumudur (Maoz ve Sagiv, 1987). Silan
türevlerinin adsorpsiyonu sırasında çözelti içerisindeki suyun miktarı alkantiyol tek
tabakanın düzeni için önemli bir faktördür. Ayrıca bu sistemlerde sıcaklık azaldıkça
reaksiyon kinetiği azalmakta ve oldukça düzensiz yapılar meydana gelmektedir.
28
2.5.2 Polimer kaplama yöntemleri
2.5.2.1 Elektroeğirme yöntemi
Elektroeğirme yönteminin prensibi, kontrollü olarak belirli büyüklükte bir elektriksel
kuvvet uygulanmasıyla, polimer çözeltilerinin başka bir noktaya, yapı ve boyut
değişimiyle transfer edilmesi temeline dayanmaktadır. Yöntemde yüksek elektrostatik
alana (DC voltaj) maruz bırakılan polimer çözeltisinin, benzer yükler ile yüklenerek
ayrışma ve incelme göstermesi sonucu, çok ince lifli yapılar oluşturulabilmektedir.
Sistem temel olarak, yüksek voltaj sağlayacak bir güç kaynağı, polimer çözeltisinin
enjeksiyonu için kullanılacak, çapı küçük olan bir kapiler tüp ya da iğne ve, metal bir
toplayıcı plakadan oluşmaktadır (Huang vd. 2003).
Şekil 2.15 Elektroeğirme yönteminin şematik olarak gösterimi (Şeker vd. 2010)
29
Özetle, polimer çözeltisi bir enjektör içerisine konmakta ve bu enjektörden belirli bir
mesafe uzaklığa toplayıcı bir plaka yerleştirilmektedir. Gerekli yüksek voltajı
sağlayacak güç kaynağının artı ucu enjektörün metal olan ucuna bağlanırken, toplayıcı
plaka ise topraklanmaktadır. Böylece enjektör ve toplayıcı plaka arasında yüksek bir
elektriksel alan elde edilmiş olmaktadır. Yüksek voltajın oluşturduğu elektriksel alan
içerisinde yüklenen polimer çözeltisi, karşı kutup olarak topraklanmış veya zıt kutup ile
yüklenmiş bir metal yüzey üzerine doğru, dönme hareketi ile incelerek nanometre
mertebelerinde lifler oluşturulmaktadır (İnanç vd. 2009).
2.5.2.2 Döndürerek kaplama yöntemi
Döndürerek kaplama yöntemi, kaplama yapılacak yüzey üzerinde homojen ve ince bir
film oluşturmak amacıyla, uygulamalarda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu
yöntemde, en basit şekliyle, kaplama için kullanılacak malzemenin uygun bir çözücü
içinde çözülmesi sonucu elde edilen çözelti, kaplanacak yüzey üzerine
damlatılmaktadır. Merkezkaç kuvvetinin etkisiyle çözeltinin yüzey üzerine tamamen
yayılmasını sağlamak amacıyla, belirli rpm’de dönme hareketi uygulanmaktadır.
Çözücünün buharlaşması ile istenilen incelikte kaplama elde edilebilmektedir. Bu
yöntemle, çözeltinin konsantrasyonu, dönme hızı ve dönme süresi gibi parametreler
optimize edilerek istenilen incelikte kaplamalar elde etmek mümkündür (Flack vd.
1984).
30
Şekil 2.16 Döndürerek kaplama yöntemi ile yüzey kaplama
Genel olarak olarak kaplama işlemi; hazırlanan yüzey üzerine çözelti damlatılması ile
başlayan kaplama işlemi, yüksek hızda döndürme ile çözeltinin yüzey üzerine yayılması
ve fazla çözeltinin uzaklaşması işlemi olmak üzere üç adımdan oluşmaktadır (Şekil
2.16). Merkezi hızlandırma fazla çözeltinin uzaklaştırılmasına ve kalan çözeltinin,
kaplanacak yüzeye ince film şeklinde yayılmasına neden olmaktadır. Film kalınlığı,
kullanılan çözeltinin viskozitesine, kuruma hızına, konsantrasyonuna ve yüzey
gerilimine bağlıdır. Aynı zamanda devir sayısı ve kaplama süresi film kalınlığını
etkileyen faktörlerdendir.
2.6 Dönüşümlü Voltametri (Cyclic Voltammetry, CV)
Voltametri, elektrokimyasal reaksiyonlarla ilgili kalitatif bilgilerin elde edilmesinde
kullanılan en yaygın tekniktir. Aynı zamanda, yükseltgenme ve indirgenme
reaksiyonlarının incelenmesi, yüzeydeki adsorbsiyon olaylarının araştırılması ve
kimyasal olarak modifiye edilen elektrot yüzeylerinde gerçekleşen elektron aktarım
31
mekanizmalarının aydınlatılması gibi çeşitli amaçlar için de yaygın bir şekilde
kullanılmaktadır. Dönüşümlü voltametri, potansiyel taraması süresince, çalışma
elektrodundaki akımın ölçülmesiyle elde edilir. Tarama hızı ile pik yüksekliğinin
değişimi incelendiğinde, difüzyon, adsorpsiyon ve elektron aktarımına eşlik eden
kimyasal reaksiyonlarla ilgili bilgi edinmek mümkündür.
Tiyol tek tabaka filmlerinin elektrokimyasal özelliklerinin araştırılmasında, dönüşümlü
voltametri tekniğinden faydalanılmaktadır. Alkantiyol tek tabaka modifikasyonu
öncesinde ve sonasında kaydedilen dönüşümlü voltamogramların karşılaştırılması
sonucunda, elde edilen kaplamanın özellikleri belirlenebilmektedir. Oldukça kusurlu ve
zayıf kaplanma özelliği sergileyen alkantiyol tek tabaka yapılarında, elektroaktif türler
tek tabakadaki kusurlardan oldukça kolay bir şekilde, elektrot yüzeyine yaklaşarak
elektron transferini gerçekleştirmektedir. Bu durumda elde edilen dönüşümlü
voltamogramda, elektron transferi nedeniyle pik biçimlidir. Çok düzenli, kusursuz tek
tabaka yüzeylerinde redoks türlerinin elektrot yüzeyine yaklaşarak redoks reaksiyonunu
gerçekleştirmesi mümkün değildir. Bu durumda, yüzeyde bariyer olarak davranan tek
tabaka yapısı, redoks türlerinin elektron transferini engellemektedir. Ayrıca uzun
zincirli tiyol tek tabakalarının, kısa zincirli alkantiyol tek tabakalara kıyasla daha etkili
bariyer özellik sergilediği bilinmektedir.
2.7 Atomik Kuvvet Mikroskobu (Atomic Force Microscopy, AFM)
Atomik kuvvet mikoskopi, moleküler boyutta yüzey görüntüleme amacıyla kullanılan,
yüzey topografisini, angstrom (Å) mertebesinden 100 mikrona (µ) kadar
görüntüleyebilen bir tekniktir. 1985’de Binnig, Quate ve Gerber’in yapmış olduğu
çalışmalar sırasında; yalnızca iletken ve yarıiletken yüzeyleri görüntüleyebilen STM’ye
(taramalı elektron mikroskobu) alternatif olarak geliştirilmiştir. AFM ile, seramikler,
kompozitler, camlar, biyolojik örnekler, metaller ve polimerler gibi iletken olmayan
maddeleri görüntülemek mümkündür.
32
Şekil 2.17 AFM sisteminin şematik olarak gösterimi
AFM tekniğinde, yüzeyi tarayan iğne ile yüzeyde bulunan atomlar arasında oluşan
kuvvetlerin ölçülmesi söz konusudur. Birkaç atom genişliğine kadar sivriltilmiş AFM
iğnesi, örnek üzerinde istenilen tarama hızında hareket ettirilerek iğne ve örnek
arasındaki itme ve çekme kuvvetleri piko-newton hassasiyetinde ölçülmektedir. İğne
kantilever denilen bir yaya tutturulmuştur. Kantileverın ucunda ona dik olarak duran
iğne bir yüzeye yaklaştırıldığında, yüzeye temas eder etmez kantilever bükülmeye
başlamaktadır. Kantilever bir yüzey üzerinde gezdirilirken oluşan bükülme, yüzeydeki
atom ve moleküllerin oluşturduğu tepe ve çukurları algılamaktadır
En basit şekliyle, sistemde bulunan bir lazer kaynağından gelen ışın, kantileverden
yansıyarak pozisyona duyarlı fotodetektöre gelmektedir. Bu kantileverin yükseklik
bilgisi bilgisayara gönderilip x ve y pozisyonuna karşı kaydedilmektedir. Uygun bir
bilgisayar programında değerlendirilen bu bilgilerden, üç boyutlu topografik görüntüler
elde edilmektedir (Şekil 2.17).
33
AFM analizlerinde, bir ön örnek hazırlama aşaması olmadığı için biyolojik moleküllerin
üç boyutlu yapısını bozmadan, bulundukları ortamda görüntülenmesi sağlanmaktadır.
Bu özelliği ile alternatifleri olan SEM ve TEM gibi mikroskobik tekniklere önemli bir
üstünlük sağlamıştır. SEM yöntemiyle kıyaslandığında en önemli avantajı, dehidrasyon,
sabitleme ve kaplama işlemi yapılmadan inceleme yapılabilmesidir.
AFM, uygulamaya bağlı olarak birçok modda çalıştırılabilmektedir. Temas modunda
(Contact Mode) kantilever’in ucundaki iğneyle yüzey arasında hafif bir fiziksel temas
meydana gelmektedir. Bu modda iyonik itme kuvvetleri önemli bir rol oynamaktadır.
Temas olmayan modda (Noncontact Mode) ise, atomik kuvvetlerin etkisiyle kantilever
eğilmekte ve böylece örneğe dokunmadan topografik görüntü elde edilmektedir. Bu
amaçla iğne örnekten 50-150 Angstrom uzakta tutulmaktadır. Bu uzaklıkta prob ve
örnek arasında Wan der Waals kuvvetleri etkin olmaya başlamaktadır. Bu modun en
büyük avantajı, iğnenin hasar görmemesi ve yumuşak malzemelerin daha uygun
biçimde ölçülmesidir. İğne örnek etkileşmesi bazı durumlarda örneği bozabilmektedir.
Bu sebeple birçok biyolojik örnek için temas olmayan mod daha uygun olmaktadır.
Dinamik temas modunda (Dynamic contact mode, Tapping Mode) kantilever kendi
rezonans frekansında titreşim hareketi yapmaktadır. Bu titreşim fotodetektör tarafından
ölçülmektedir. İğne örneğe yaklaştığında yüzeyle meydana gelen etkileşimden dolayı
enerji kaybederek kantileverin titreşim şiddetinin azalmasına neden olmaktadır.
Geridöngü mekanizması bu şiddeti sabit tutmak için, yüzey üzerindeki kantileverin
yüksekliğini değiştirmektedir. Meydana gelen değişimden, etkileşim miktarı
belirlenebilmektedir.
34
2.8 Hücre İskeleti ve Hücre Adezyon Molekülleri
Hücre iskeleti, hücre şeklinin korunmasında ve hücre hareketlerinin yerine
getirilmesinde görev almaktadır. Mikrotübüller, mikrofilamanlar ve ara filamanlar hücre
iskeletini oluşturan yapılardır.
Şekil 2.18 Mikrotübüllerin polimerizasyonu
Mikrotübüller mitoz bölünme, hücre-hücre iletişimi, hücre içi taşınma, hücre büyümesi
ve kontrollü hücre ölümü (apotozis) gibi birçok biyolojik prosesde görev alan silindirik
yapılardır. Mirotübüller α-tübülin ve β-tübülin heterodimerlerinin polimerizasyonu
sonucunda oluşan hücre iskeleti elemanıdır (Şekil 2.18). Hücrede gereksinim olduğunda
tübülinler bir araya gelerek yeni mikrotübüller oluşturmakta; uygun koşullarda ise
tekrar parçalanmaktadır.
Mikrofilamanlar aktin molekülünden oluşan ipliksi yapılardır. Hücrenin fonksiyonu ve
şekline göre çok sayıda aktin tipi bulunmaktadır. Bu fibröz elemanlar hücre şeklinin
korunmasında ve makromoleküllerle organellerin hücre içi transportunda rol
oynamaktadırlar.
35
Ara filamanlar mikrotübüller ve mikrofilamanlara benzer şekilde olup 8-10 nm
çapındadırlar. Ara filamanların bulundukları yere göre çeşitli görevleri vardır. Örneğin
epitel hücrelerinde başlıca görevleri mekanik sağlamlılık kazandırmak, su ve ısı kaybını
önlemektir.
2.8.1 Hücre adezyon molekülleri
Hücre adezyonu, hücrelerin özgül olarak dokulara yönlenmelerinde, birbirlerini
tanımalarında, embriyogenez, hücre büyümesi, hücre farklılaşması ve inflamasyon gibi
olguların düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Doku ve hücrelerin
bütünlüğünün ve fonksiyonunun korunabilmesi için hücrenin çevresindeki değişimleri
algılaması ve uygun cevaplar vermesi gerekmektedir. Hücre bunu, yüzeyinde bulunan
hücre adezyon molekülleri aracılığı ile gerçekleştirmektedir.
Hücre adezyon molekülleri, hücre yüzeylerinde bulunan glikoprotein moleküllerinden
oluşan bir gruptur. Hücrelerin, birbirlerine ya da hücre dışı matrikse bağlanmalarını
sağlayan yüzey proteinleridir. Aynı zamanda, hücreler arası sinyal iletiminin
düzenlenmesinde, hücre hareketlerinin organizasyonunda, immün ve inflamatuvar
yanıtın ortaya çıkmasında da önemli rolleri bulunmaktadır.
Adezyon molekülleri; reseptör protein tirozin fosfatazlar, Ig süperailesi, kadherinler,
integrinler, hiyalurinat reseptörleri ve selektinler olmak üzere 6 grupta toplanmaktadır
(Ergüler vd. 2002).
Hücre-matriks temas alanlarında bulunan reseptör protein tirozin fosfatazlar, hücre-
hücre etkileşiminde etkin reseptörler olarak tanımlanmaktadırlar. İmmünoglobülin
süperailesi, hücre içindeki iskelet sistemine bağlanan transmembran glikoproteinlerdir.
Kadherinler, hem adezyon hem de Ca2+ bağlayıcı bölge içerirler. Embriyonik
gelişiminde ve doku organizasyonunda önemli rolleri bulunmaktadır. İntegrinler, hem
36
hücre–hücre, hem de hücre–matriks bağlanmasında görev alan transmembran
glikoproteinlerdir. Hedef hücrelerdeki spesifik ligandlarına bağlanmaktadırlar.
Hyalurinat reseptörleri, hücre dışı matrikste bulunan bir sakkarit komponentidir. Tümör
gelişimi ve iltihaplı durumlar gibi çeşitli patolojik dokularda önemli rolleri
bulunmaktadır. Selektinler, geçici transmembran bağlayıcı glikoproteinlerdir. Kalsiyum
varlığında hücrelerin spesifik oligosakkaritlerini tanıyarak onları başka bir hücreye
bağlamakla görevlidirler. Karbonhidrat bağlayan moleküllerdir. Ligandları genellikle
siyalik glikanlardır. Adezyon moleküllerinin üç karakteristik özelliği bulunmaktadır
(Darka 2003):
1. Transmembranal glikoproteinlerdir. Hücre içini dış ortama bağlarlar. En büyük olan
hücre dışı kısım, membranöz kısım ve hücre içine doğru ilerleyen sitoplazmik
fonksiyonel kısımdan oluşmaktadırlar.
2. Dışarıdan gelen bir uyarının (bu bir hücre veya matrikse bağlı bir molekül olabilir)
hücre dışı kısımda konformasyonel değişime yol açması ile aktive olurlar. Hücre
adezyon molekülüne bağlanan molekül adezyon molekülünün ligandı olarak
isimlendirilir, özgül olması şarttır.
3. Hücre içinde bağlı bulundukları diğer moleküller sayesinde hücre fonksiyonunu
etkileyebilirler. Bazıları hücre iskeleti ile, bazıları da hücresel enzimlerle bağlantılıdır.
Reseptör ligand birleşmesi hücrede morfolojik veya kimyasal bir değişime yol
açmaktadır.
2.9 Anti-Mikrotübül İlaçları
Mikrotübüllere bağlanan ilaçlar kanser tedavilerinde kullanılan önemli anti-mitotik
maddelerdir. Mikrotübüller mitozda sentrozomların oluşmasında görev alırlar. Mitoz
boyunca mikrotübüller sürekli olarak polimerize olmakta ve hızlı bir şekilde
depolimerize olmaktadır. Bu ilaçların çoğu mikrotübüllere bağlanarak bu fonksiyonu
bozduklarından, mitoz bölünmenin durmasına neden olmaktadırlar.
37
Antimitotik ilaçlar mikrotübüllerde tübülin dimerlerinin değişik bölgelerine, farklı
kimyasal mekanizmalarla bağlanarak mikrotübül dinamiğinin bozulmasına neden
olurlar (Şekil 2.19). Örneğin vinblastin, mikrotübüllerin pozitif ucuna bağlanarak
mikrotübül fonksiyonunu engellemektedir. Kolsişin, tübülin dimerleri ile mikrotübül-
kolsişin kompleksi oluşturarak mikrotübül fonksiyonunu durdurmaktadır. Paklitaksel
ise, mikrotübülün iç bölgesine bağlanarak mikrotübül fonksiyonunun bozulmasına
neden olmaktadır (Jordan ve Wilson 2004). Anti-mikrotübül ilaçları genel olarak
taksanlar ve vinka alkoloidler olmak üzere iki sınıfa ayrılmaktadır.
Şekil 2.19 Mikrotübüllerin farklı bölgelerine bağlanan anti-mikrotübül ilaçları
Uzun dönem tedavilerde kanser hücreleri zamanla bu ilaçlara karşı direnç
kazanmaktadır (Drukman ve Kavallaris 2002, Kavallaris 2010). Bu sebeple son yıllarda,
farmasötik alanda kanser tedavilerinde kullanılabilecek anti-mitotik özelliğe sahip
maddelerin keşfi önem kazanmıştır (Paula vd. 2003).
38
2.9.1 Taksanlar
Porsuk ağacından elde edilen diterpen yapısındaki bir bileşiktir. Taksanlar çeşitli
kemoterapi ilaçlarının üretiminde kullanılmaktadır. “Docetaxel, larotaxel, ortataxel,
paclitaxel, tesetaxel” taksan sınıfı bileşiklerin bazılarıdır. Taksan sınıfı ilaçların genel
mekanizması, mikrotübüllere bağlanarak mikrotübül fonksiyonunu bozmaları ve mitoz
bölünmeyi durdurmalarıdır.
2.9.2 Vinka alkaloidler
Vinka alkaloidler, mitoz bölünmede iğ ipliklerinin oluşumu için gerekli olan tübüler
proteinlere bağlanarak, mikrotübül fonksiyonlarını inhibe eden bitkisel kaynaklı
bileşiklerdir. “Vinblastine, vincristine, vinflunine, vindesine ve vinorelbine” bu sınıfa
giren bileşiklerdir. Hücrede mikrotübüllerin depolimerizasyonunu önleyerek stabil
mikrotübül topluluklarının oluşmasına neden olmaktadırlar. Bu durum, mitotik
iğciklerin üretiminin yapılamamasına ve metafaz evresinin bloke olmasına neden
olmaktadır.
2.9.2.1 Kolsişin
Colchicum Autumnale (sonbahar çiçeği) bitkisinden elde edilen, kolsişin, tübülin
dimerlerine bağlanarak mikrotübüllerin polimerizasyonunu inhibe etmektedir. Tübülin
üzerinde kolsişin bağlanma bölgesine bağlanan bileşikler ve kolsişin, toksisitelerinden
dolayı kanser tedavilerinde çok sık kullanılmamaktadır (Jordan ve Wilson 2004).
39
Şekil 2.20 Kolsişin molekülünün yapısı (http://science.jrank.org/article_images/science.jrank.org/colchicine.1.jpg)
Kolsişin mitotik ipliklerin oluşumunu engelleyerek, metafaz safhasında mitoz
bölünmenin durmasına neden olmaktadır. Sonuç olarak, mikrotübüllerin oluşumunu
inhibe etmektedir.
Yıllardır gut tedavisinde kullanılan kolsişin, son 50 yıldır Ailevi Akdeniz Ateşi
(Familial Mediterranean Fever, FMF), Behçet hastalığı, skleroderma, amiloidoz ve
karaciger sirozu tedavilerinde de basvurulan ilaç olmuştur. Günümüzde yapılan
çalışmalar, kolsişinin adezyon önlemede etkin olduğunu göstermiştir (Ben-Chetrit vd.
2006).
2.9.2.2 Vinorelbin
Catharanthus roseus (Cezayir menekşesi) adlı bir bitkiden ekstrakte edilen, yarı sentetik
bir vinka alkoloididir. Tübüline bağlanarak, mikrotübül dinamiğinin bozulmasına ve
mitoz bölünmenin durmasına neden olmaktadır.
40
Şekil 2.21 Vinorelbin molekülünün yapısı (http://www.newdruginfo.com/pharmacopeia/usp28/v28230/usp28nf23s0_m88270.htm)
Vinorelbin vinka alkaloidler ailesinden bir antineoplastik ilaç olmakla birlikte, etkisini,
moleküler olarak, hücrenin mikrotübülleri üzerinde göstermektedir. Tübülin
polimerizasyonunu inhibe ederek, mitotik mikrotübüllere bağlanmakta ve aksonal
miktotübülleri yalnızca yüksek konsantrasyonlarda etkilemektedir. Vinorelbin, mitozu
G2-M evresinde bloke ederek, interfazda ya da sonraki evrelerde hücre ölümüne sebep
olmaktadır (http://www.iegm.gov.tr).
2.9.2.3 Vinblastin
Vinblastin sülfat Vinca rosea Linn (Cezayir menekşesi) bitkisinden elde edilmiş bir
alkoloit tuzudur. Tübülin dimerlerinin β-alt ünitelerinde bulunan vinka bağlanma
bölgesi olarak adlandırılan bir bölgeye bağlanmaktadır. Vinblastinin mikrotübüllere
bağlanması tübülin dimerlerinde konformasyonal bir değişime neden olmaktadır.
41
Şekil 2.22 Vinblastin sülfat molekülünün yapısı (http://www.sigmaaldrich.com/structureimages/57/mfcd00082457.gif)
Doku kültürü çalışmaları, amino asitlerin glutamik asitten sitrik asit döngüsü ve üreye
varan metabolik oluşumunda bir etkisi olduğunu düşündürmektedir. Vinblastin sülfatın
antitümör etkisinin glutamik asit ya da triptofan ile ortadan kalktığı gösterilmiştir
(http://www.iegm.gov.tr).
42
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1 Madde ve Malzeme
Kuartz kristallerin altın yüzeylerinin modifikasyonunda, 11-Merkaptoundekanoik asit
(Sigma), 2-Merkaptoetanol (Sigma) ve 2-Merkaptoetilamin (Sigma); kristal
yüzeylerinin kaplanmasında, poli[(D,L-laktik-ko-glikolik asit) (85:15)] (PLGA; Sigma,
St. Louis, MO, ABD), PS, PCL, kitosan (Fluka), hyalüronik asit (Fluka), kollajen,
alginat (Sigma) ve PLL (Sigma) polimerleri kullanıldı. Bazı polimer çözeltilerinin
hazırlanmasında, diklorometan, tetrahidrofuran, dimetilformamit, toluen, kloroform gibi
organik çözücüler (Sigma, St. Louis, MO, ABD) kullanıldı.
Elektroeğirme işleminde, polimer çözeltisinden lif elde etmek amacıyla 60 kV DC güç
kaynağı (FC60P02, Glassman, ABD), polimer çözeltisini voltaj bölgesine itmek için bir
şırınga pompası (Harvard Apparatus, CH) kullanıldı. Toplayıcı plaka olarak uygun
boyutta kesilen alüminyum folyolar kullanıldı.
Kristal yüzeylerinin sterilizasyon için UV lambalı (254 nm) laminer akış kabini (Nuaire,
Class II, Plymouth, Minnesota, ABD) kullanıldı.
Dönüşümlü voltametri deneylerinde, K3[Fe(CN)6] (potasyum demir III siyanür) (Sigma)
kullanıldı.
Hücre kültürü çalışmalarında, hücrelerin ekilip çoğaltıldığı steril doku kültür kapları
(Corning, NY, ABD), besiyeri olarak, Alpha-MEM (Modified Eagle’s Medium)
(Sigma), besiyeri katkısı olarak L-glutamin, penisilin-streptomisin (antibiyotik-
antimikotik) ve fetal sığır serumu (FCS) (Sigma, St. Louis, MO), hücrelerin
pasajlanması işleminde ise tripsin/EDTA çözeltisi (Sigma) kullanıldı. Çalışmaların
tamamı laminer akışlı steril kabinde (Nuaire, Class II, Plymouth, Minnesota, ABD)
43
yapılmış ve hücre kültürleri ise 37ºC, %5 CO2, %95 nem ortamını sağlayan bir
karbondioksitli inkübatörde (Heracell 240®, Waltham, Massachusetts, ABD)
gerçekleştirildi.
Anti-mikrotübül ilaç olarak, vinblastin sülfat (Sigma), vinorelbin ditartarat (Sigma) ve
kolsişin (Sigma) kullanıldı. İlaçların stok çözeltilerinin hazırlanmasında çözücü olarak
dimetil sülfoksit (Sigma) kullanıldı.
3.2 Ölçüm Sistemi ve Kuartz Kristaller
Frekans ölçüm deneyleri ve dönüşümlü voltametri (cyclic voltammetry) deneylerinde
EQCM (CHI440, CH Instruments) ölçüm sistemi ve 7.995 MHz temel titreşim
frekansına sahip, 5.1 mm çapında, parlatılmış altın elektrotlu, AT-kesim kuartz
kristaller (CHI) kullanıldı (Şekil 3.1).
Şekil 3.1 Çalışmada kullanılan ölçüm sistemi ve kuartz kristali
Hücre-yüzey ve hücre-ilaç etkileşiminin KKM sistemi ile belirlendiği çalışmalarda, akış
hücresinin kullanıldığı bir deney düzeneği hazırlandı. Elektrot yüzeyi kaplanan kuartz
kristal ve akış hücresinin her bir parçası steril edildi. Kristal O-ring’ler yardımıyla akış
hücresi içerisine; kristalin sadece tek yüzeyi sıvı ile temas edecek şekilde yerleştirildi
(Şekil 3.2).
44
Şekil 3.2 Kristalin akış hücresi içerisine yerleştirilmesi
Hücre-malzeme ve hücre-ilaç etkileşiminin incelendiği çalışmalar, şekil 3.3’de şematik
olarak verilen akış sistemli bir KKM düzeneğinde gerçekleştirildi. Özetle, içerisinde
yüzeyi incelenecek kristalin bulunduğu KKM akış hücresi ve osilatör, 37ºC, %5 CO2,
%95 nem ortamını sağlayan bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirildi. Kristalin
yerleştirildiği bölüme, peristaltik pompa (Servatechnik Inc., Oftringen, Almanya)
yardımıyla 4 saat boyunca serumsuz besiyeri akışı (0.40 ml/dk) sağlandı. Bu süre
boyunca kristalin frekansında meydana gelen değişimler bilgisayar programı aracılığıyla
kaydedildi.
45
Şekil 3.3 Hücre adezyonu ve hücre-ilaç etkileşimi ölçümleri için deney düzeneği
3.3 Kristal Yüzeylerinin Kaplanması
3.3.1 Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi ile yüzey modifikasyonu
Kristal yüzeyleri, yüzey modifikasyon ve kaplama işlemlerinden önce piranha çözeltisi
(%30 H2O2 ve %70 H2SO4) ile temizlenip, distile su ile yıkanarak kurutuldu. Yüzey
temizleme işleminin ardından kuartz kristalin altın elektrot yüzeyi kendiliğinden
düzenlenen tek tabaka tekniği kullanılarak modifiye edildi. Bu amaçla, 11-
Merkaptoundekanoik (11-MUA) asit, 2-Merkaptoetanol ve 2-Merkaptoetilamin’in
etanol içerisindeki çözeltileri hazırlandı (1 mM). Yüzeyi temizlenen ve ilk frekansları
(Fo) kaydedilen kristaller, hazırlanan bu tiyol çözeltileri içerisinde bir gece boyunca
bekletildi. Bu sürenin sonunda yüzeyler, etanol ve distile suyla yıkanarak kurumaya
bırakıldı. Kuruyan kristallerin son (F1) frekansları kaydedildi. Bu işlemlerin ardından,
farklı fonksiyonel gruba sahip (-COOH, -OH veya -NH2) kristal yüzeyleri hazırlanmış
oldu.
46
3.3.1.1 Dönüşümlü voltametri ölçümleri
Alkantiyol tek tabaka tekniği ile yüzey modifikasyonunu doğrulamak amacıyla
dönüşümlü voltametri deneyleri yapıldı. Ölçümler, 5 mM K3[Fe(CN)6] çözeltisi içine
daldırılmış üçlü elektrot sistemi ile gerçekleştirildi. Çalışma elektrodu olarak modifiye
edilmiş kuartz kristali, karşıt elektrot olarak platin tel ve, referans elektrot olarak
Ag/AgCl elektrodu kullanıldı.
Şekil 3.4 CV ölçümleri için deney düzeneği
3.3.2 Elektroeğirme (electrospining) tekniği ile yüzey kaplama
Temizlenen ve temizleme işleminden sonra ilk frekans değerleri kaydedilen kuartz
kristaller, elektroeğirme cihazında kaplanmak üzere, toplayıcı plaka üzerine
yerleştirildi. %20’lik poli[(D,L-laktik-ko-glikolik asit) (85:15)] (PLGA) çözeltisi
(Diklorometan, tetrahidrofuran, dimetilforamit, 3:1:1) 10 ml’lik enjektöre alındı ve
enjektör pompasına yerleştirildi. Polimer çözeltisinin yüksek elektrostatik alana (DC
voltaj) maruz bırakılması sonucu oluşan PLGA nanolifler toplayıcı plaka üzerinde
bulunan kristaller üzerinde biriktirildi. Kuruyan kristallerin son frekansları kaydedildi.
47
3.3.3 Döndürerek kaplama (spin coating) tekniği ile yüzey kaplama
Temizlenen ve ilk frekans değerleri kaydedilen kristaller, %1’lik PS (toluende), %1’lik
PCL (kloroformda) ve %2’lik PLGA polimerleri ile döndürerek kaplama cihazı
kullanılarak (Primus SB15) 3000 rpm’de kaplandı. Kuruyan kristallerin son frekansları
kaydedildi.
3.3.4 Damlatma tekniği ile yüzey kaplama
Suda çözünen polimerler damlatma yöntemine göre kristal yüzeyi üzerine kaplandı.
Kaplanacak kristaller temizlendikten sonra %0.1’lik kitosan, hyalüronik asit, kollajen,
alginat ve PLL polimerleri ile kaplandı. Kaplanan film tabakaları farklı çarpraz
bağlayıcılar ile belirli sürelerde muamele edildi. Yıkama işlemlerinin ardından kuruyan
kristallerin son frekansları kaydedildi.
3.3.4.1 Kitosan film ile kaplama
%0.1’lik kitosan çözeltisi hazırlamak için, belirli miktardaki kitosan (Sigma) %1’lik
asetik asit çözeltisi içerisine ilave edildi ve homojen bir çözelti elde edilinceye kadar
manyetik karıştırıcıda karıştırıldı. Hazırlanan bu çözeltinin 5 µL’si kristal yüzeyinin
üzerine mikropipet yardımıyla homojen olarak kaplandı ve bir saat bekletildi. Ardından
çarpraz bağlama işlemi için film tabakası 1 M NaOH ile 30 dakika muamele edildi.
Yıkama işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları kaydedildi.
3.3.4.2 Hyalüronik asit polimeri ile kaplama
%0.1’lik hyalüronik asit çözeltisi, belirli miktardaki hyalüronik asidin (Fluka) saf su
içerisinde çözülmesiyle hazırlandı. Hazırlanan bu çözeltinin 5 µL’si kristal yüzeyinin
48
üzerine mikropipet yardımıyla homojen olarak kaplandı ve bir saat bekletildi. Bir saatin
sonunda 1 M NaOH ile çarpraz bağlama işlemi için 30 dakika muamele edildi. Yıkama
işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları kaydedildi.
3.3.4.3 Kollajen film ile kaplama
%0.1’lik kollajen çözeltisi hazırlamak için, belirli miktardaki kollajen, %0.1’lik asetik
asit çözeltisi içerisine ilave edildi ve homojen bir çözelti elde edilinceye kadar manyetik
karıştırıcıda karıştırıldı. Hazırlanan bu çözeltinin 5 µL’si kristal yüzeyinin üzerine
mikropipet yardımıyla homojen olarak kaplandı ve bir saat bekletildi. Ardından çarpraz
bağlama işlemi için film tabakası %2.5’lik glutaraldehit ile 30 dakika muamele edildi.
Yıkama işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları kaydedildi.
3.3.4.4 Alginat film ile kaplama
%0.1’lik alginat çözeltisi, belirli miktardaki alginat’ın (Sigma) saf su içerisinde
çözülmesiyle hazırlandı. Hazırlanan bu çözeltinin 5 µL’si kristal yüzeyinin üzerine
mikropipet yardımıyla homojen olarak kaplandı ve bir saat bekletildi. Bir saatin
sonunda kaplı kristal, 0.4 M CaCl2 ile çarpraz bağlama işlemi için 30 dakika muamele
edildi. Yıkama işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları
kaydedildi.
3.3.4.5 PLL film ile kaplama
5 µL %0.1 PLL çözeltisi (suda), temizlenen kristal yüzeyi üzerine damlatıldı ve
mikropipet yardımıyla yüzey üzerine homojen bir şekilde kaplanarak bir saat bekletildi.
Yıkama işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları kaydedildi.
49
3.4 Atomik Kuvvet Mikroskobu
Kristal yüzeylerinin kaplama topografisini ve yüzey morfolojisini incelemek amacıyla
Atomik Kuvvet Mikroskobu (Atomic Force Microscopy, AFM) tekniği kullanıldı. Altın
yüzey üzerine hücrelerin bağlanma kapasitesini arttırmak amacıyla kristal yüzeyi farklı
tekniklerle ve polimerlerle kaplanarak farklı yüzey topografileri oluşturuldu. AFM
görüntüleri, kuartz kristalin altın elektrot yüzeyleri üzerinde alındı. Hazırlanan
yüzeylerin AFM görüntüleri, NI-AFM marka (Nanomagnetics Inst.) cihaz ile dinamik
modda ve hava ortamında alındı. Kristal yüzeyleri 40 N/m kuvvet sabiti ile, farklı yüzey
alanlarında, oda sıcaklığında tarandı.
3.5 Kaplı Yüzeylerin Kararlılık Testleri
11-Merkaptoundekanoik asit (11-MUA), 2-Merkaptoetanol ve 2-Merkaptoetilamin ile
modifiye edilen ve farklı polimer malzemelerle kaplanan kristal yüzeylerinin
kararlılıklarını belirlemek amacıyla, kuartz kristaller serum içermeyen besiyeri ile 4 saat
muamele edildi. Bu süre boyunca kristallerin frekansında meydana gelen değişimler
KKM sistemi ile eş zamanlı olarak belirlendi.
3.6 Sıçan Kemik İliğinden Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu
Çalışmada, 8-12 haftalık 200-250 g ağırlığındaki Wistar soyu sıçanların femurlarından,
standart protokollere göre izole edilip stoklanan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri
kullanıldı. Özetle, avertin anestezisi sonrası sıçanın her iki bacağındaki femurlar
çıkarıldı. %70’lik etanol ile etrafındaki yağ ve kas kalıntıları iyice temizlenerek, alt ve
üst kısımlarından kesildi. İçerisinde 5 mL α-MEM bulunan 25 G’lik enjektör yardımıyla
kemik iliği hücreleri santrifüj tüpüne aktarılarak 1100 rpm’de 10 dakika süreyle
santrifüj edildi. Santrifüj sonrası çözeltinin üst kısmı atıldı ve 5’er dakika 1100 rpm’de
3 kere santrifüjleme işlemi yapılarak hücreler besiyeri ile yıkandı.
50
3.6.1 Hücre kültürü ve pasajlama
Yıkama işlemleri ardından elde edilen kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, %20 fetal
sığır serumu, 2 mM L-glutamin, 100 µL/mL penisilin-streptomisin içeren α-MEM
içerisinde, 37oC’da, %5 CO2, %95 hava, %90 nem içeren ortam şartlarında inkübe
edildi. Kültürün üçüncü gününde kültür kabına yapışmayan hücreler, besiyeri
değiştirilerek uzaklaştırıldı. Haftada üç kez besiyeri değiştirilerek, bağlanan hücrelerin
kültürüne devam edildi.
3.6.2 Tripsinizasyon işlemi
Sıçan femurlarından izole edilen kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, %20 fetal sığır
serumu, 2mM L-glutamin, 100 µL/mL penisilin-streptomisin içeren α-MEM içerisinde,
7oC’da, %5 CO2, %95 hava, %90 nem içeren ortam şartlarında inkübe edildi. Hücreler
%80-90 bolluk noktasına geldiğinde %0.25 tripsin ve 1 mM EDTA içeren çözelti
yardımıyla kap yüzeyinden kaldırılarak pasajlama işlemi yapıldı. 2.-4. pasajdaki
mezenkimal kök hücreleri (MKH) kültür kabında bolluk noktasına ulaştıktan sonra,
tripsinizasyonla enzimatik olarak kap tabanından ayrıldı. Elde edilen hücre
süspansiyonu, hücre adezyonunun ve ilaç etkileşiminin incelendiği deneylerde
kullanılmak üzere enjektöre alındı.
3.7 Hücre Adezyonunun KKM Sistemi ile Görüntülenmesi
Hücre adezyonunun incelendiği deneyler için, ilk olarak kristal UV ışıkta (254 nm) 15
dakika; kristal hücresi ve peristaltik pompa aparatları otoklavda (121oC; 15 dk) steril
edildi. Sterilizasyon işlemlerinden sonra, içine kuartz kristal yerleştirilen akış hücresi ve
osilatör, inkübatör içerisine yerleştirildi. Akış hücresine kontrollü miktarda 0.40 mL/dk
hızıyla besiyeri akışı sağlamak amacıyla peristaltik pompa kullanıldı. MKH’leri kültür
kabında bolluk noktasına ulaştıktan sonra, tripsinizasyonla enzimatik olarak kap
51
tabanından ayrıldı. Elde edilen hücre süspansiyonu (3x105 hücre/mL) yaklaşık birer saat
aralıklarla kristal yüzeyine üç aşamada ilave edildi.
3.8 Toksisite Testi
Mezenkimal kök hücrelerinin aktivitesi üzerine, vinblastin, vinorelbin ve kolsişin
ilaçlarının etkisini etkisini incelemek amacıyla toksisite testi yapıldı. Bu amaçla ilk
olarak, ilaçların dimetil sülfoksit (DMSO) içerisindeki stok çözeltileri hazırlandı. Stok
çözeltilerin, farklı hacimlerdeki besiyeri ile seyreltilmesi sonucunda, istenilen
konsantrasyonlardaki (50 µM, 100 µM, 150 µM, 200 µM ve 250 µM) ilaç çözeltileri
hazırlandı.
Kültür kabında doygunluk noktasına ulaşan MKH’ler tripsin/EDTA ile kap tabanından
ayrılarak, 48 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucuğa 2x105 hücre olacak şekilde ekildi ve
4 gün inkübasyona bırakıldı. 4 gün süren in vitro hücre kültürü işleminde, hücrelerin
besiyeri iki günde bir değiştirildi. 4. günün sonunda besiyeri, farklı konsantrasyonlarda
ilaçları içeren besiyeri ile değiştirildi ve hücrelerin 6 saat boyunca bu besiyeri ile
kültürüne devam edildi.
Çalışmada iki ayrı kontrol grubu oluşturuldu. Birinci kontrol grubu normal besiyeri ile
kültürüne devam edilen hücreleri, ikinci kontrol grubu ise, ilaç içermeyen DMSO ile
muamele edilen hücreleri içermiştir. Hücrelerin 6 saat sonundaki morfolojilerindeki
değişimlerin görüntülenmesi inversiyon mikroskobu (Nikon TS-100, Tokyo, Japonya)
ile gerçekleştirilmiştir.
52
3.8.1 MTT testi
Farklı dozlarda anti-mikrotübül ilaçları ile etkileştirilen MKH’lerin, 6 saat sonundaki
mitokondriyel dehidrogenaz aktiviteleri, sarı renkli MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-
2,5-difeniltetrazolyum bromür] tuzunun mitokondriyal enzimler tarafından mor renkli
formazan kristallerine indirgenmesi prensibine dayanan bir test ile belirlenmiştir (Şekil
3.5).
Şekil 3.5 Formazan kristallerinin oluşum reaksiyonu (www.dojindo.com/newimages/MTT-RS)
Bu amaçla, 48 kuyucuklu kültür kabı içerisinde 6 saat boyunca ilaçların farklı dozlarına
maruz bırakılan hücreler faz kontrast mikroskobu ile görüntülendikten sonra
kuyucuklardan besiyerleri uzaklaştırıldı. Hücrelerin serum içermeyen besiyeri ile
yıkanması işleminin ardından, her bir kuyucuğa 30 µL MTT ve 270 µL besiyeri ilave
edilerek 4 saat boyunca 37oC’de karbondioksit inkübatöründe inkübe edildi.
İnkübasyonun ardından oluşan formazan kristalleri faz kontrast mikroskobu ile
görüntülendi. Ardından besiyeri ortamdan uzaklaştırıldı ve oluşan formazan kristalleri,
300 µL MTT çözücüsü (Sigma) ile çözüldükten sonra spektrofotometre cihazı ile
(Biotrak II, Amersham Biosciences) 570 nm dalga boyundaki optik yoğunlukları köre
karşı belirlendi.
53
3.8.2 IC50 değerlerinin hesaplanması
Her bir ilacın inhibitör konsantrasyonu aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır:
OD kontrol: Normal besiyeri ile kültüre edilen hücrelerin optik yoğunluğu
OD örnek: İlaçlı besiyeri ile kültüre edilen hücrelerin optik yoğunluğu
Elde edilen inhibisyon değerleri örneklerde bulunan ilaçların konsantrasyonunun
logaritmasına karşılık grafiğe aktarılıp, grafikten elde edilen doğrunun denklemi
yardımı ile %50’ye karşılık gelen değer grafikten belirlenmiştir. (Şekil 3.6). Grafikten
belirlenen bu değerin antilogaritması alınarak her bir ilaç için IC50 değeri
hesaplanmıştır. Bu miktar da hücre canlılığını %50 engelleyen test bileşiğinin
konsantrasyonunu vermiştir.
3.9 Hücre-İlaç Etkileşiminin KKM Sistemi ile Görüntülenmesi
Hücre-ilaç etkileşiminin eş zamanlı olarak görüntülendiği deneylerde ilk olarak
kristaller %0.1’lik PS polimeri ile 3000 rpm’de kaplandı. Kaplı kristal sterilizasyon
amacıyla UV ışıkta 15 dakika bekletildi. Steril edilen kristal, laminer kabin içerisinde
kristal hücresi içerisine monte edildi. Kristal hücresi inkübatör içerisine yerleştirilerek
osilatör ve peristaltik pompa ile bağlantısı yapıldı. MKH’leri kültür kabında bolluk
noktasına ulaştıktan sonra, tripsinizasyonla enzimatik olarak kap tabanından ayrıldı.
Elde edilen hücre süspansiyonu (3x105 hücre/mL) akış ortamına enjekte edilerek 20 saat
boyunca PS yüzey üzerinde hücrelerin çoğalması sağlandı. 20 saat sonunda PS yüzey
üzerinde yayılan hücrelere, 150 ve 300 µM konsantrasyonda ilaç çözeltileri enjekte
54
edildi. Her aşama sonucunda kristalin frekansında meydana gelen değişimler KKM
sistemi ile belirlendi.
Çalışmanın bu aşaması için iki ayrı kontrol deneyi gerçekleştirildi. Birinci kontrol
deneyinde, PS yüzey üzerine aynı şekilde ekilen hücreler üzerine, ilaç içermeyen
DMSO çözücüsü ilave edilerek frekans değişimleri kaydedildi. İkinci kontrol deneyinde
ise, hücre ekimi yapılmayan PS kaplı yüzey üzerine ilaç enjeksiyonu yapılarak frekans
değişimleri kaydedildi.
55
4. BULGULAR
4.1 Kaplamaların Neden Olduğu Frekans Değişimleri Bulguları
Kaplama işlemleri sonrasında kristalin yüzeyindeki kütle artışı nedeniyle kristalin
titreşim frekansı azalmıştır. Kaplamanın neden olduğu frekans değişiminin belirlenmesi
amacıyla, her bir kristalin kaplama işleminden önceki ve sonraki frekansları ölçülerek
frekans değişimleri (∆F) hesaplanmıştır. Çalışılan her bir yüzey için beş farklı kristalin
frekans farkları hesaplanarak ortalamaları alınmış ve standart sapmaları hesaplanmıştır.
Çizelge 4.1 Kaplamaların neden olduğu frekans değişimleri
a: Beş değer için standart sapma
Kaplama türü Frekans değişimia (Hz)
11-MUA 111±12
2-Merkaptoetanol 67±10
2-Merkaptoetilamin 63±9
PLGA nanolif 226±83
PLGA film 2039±613
PCL membran 3546±304
PS membran 4826±114
Kitosan 6390±1751
Hyalüronik asit 4997±2121
Kollajen 5180±2787
Alginat 5570±3297
PLL 2270±1163
56
4.2 Kristal Yüzeylerinin AFM Bulguları
4.2.1 Altın yüzeyin AFM bulguları
Kuartz kristal yüzeyi üzerinde herhangi bir kaplama işlemi yapılmadan, parlatılmış altın
yüzeyin AFM görüntüsü alındı. Kristal yüzeyi üzerinde 3x3 µm2’lik bir alanda tarama
yapıldı. Histogram analizi ve iki farklı bölgeden alınan kesit analizi sonuçları, yüzeyin
ortalama 3 nm civarında porözite içerdiğini gösterdi.
Şekil 4.1 Kurartz kristalin altın yüzeyinin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
57
Şekil 4.2 Altın yüzeyin kesit analizi
4.2.2 11-MUA ile modifiye edilen yüzeyin AFM bulguları
11-MUA ile modifiye edilen kristal yüzeyinin AFM görüntüleri Şekil 4.3-4.4’de
verilmiştir. Kristal yüzeyi, kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi kullanılarak
hazırlandı. Kristal yüzeyi üzerinde 3x3 µm2’lik bir alanda tarama yapıldı. Görüntüler
yüzey üzerinde homojen bir kaplama gerçekleştiğini; histogram analizi ve iki farklı
bölgeden alınan kesit analizi sonuçları ise, yüzeyde ortalama 7-8 nm kalınlığında bir
kaplama meydana geldiğini gösterdi.
58
Şekil 4.3 11-MUA ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
Şekil 4.4 11-MUA ile kaplı yüzeyin kesit analizi
59
4.2.3 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
Şekil 4.5-4.6’da 2-Merkaptoetanol kaplı yüzeyin AFM görüntüleri verilmiştir. Altın
yüzey 2-Merkaptoetanol çözeltisi kullanılarak modifiye edildi. AFM görüntüleri 3x3
µm2’lik yüzey alanı üzerinde alındı. AFM sonuçları, modifikasyon sonrası yüzey
üzerinde ortalama 4-5 nm kalınlığında sıralı bir kaplama oluştuğunu gösterdi. Kesit
analizi kristal yüzeyi üzerinde 2 farklı bölgede gerçekleştirildi.
Şekil 4.5 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
60
Şekil 4.6 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin kesit analizi
4.2.4 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
2-Merkaptoetilamin ile modifiye edilen kristal yüzeyinin AFM görüntüleri Şekil 4.7-
4.8’de verilmiştir. Kristal yüzeyi, kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi
kullanılarak hazırlandı. Kristal yüzeyi üzerinde 3x3 µm2’lik yüzey alanında tarama
yapıldı. Görüntüler yüzey üzerinde sıralı bir kaplama gerçekleştiğini; histogram analizi
ve iki farklı bölgeden alınan kesit analizi sonuçları ise, yüzeyde ortalama 4-5 nm
kalınlığında bir kaplama meydana geldiğini gösterdi.
61
Şekil 4.7 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
Şekil 4.8 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin kesit analizi
62
4.2.5 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
PLGA nanolif yüzeyin AFM görüntüleri Şekil 4.9-4.10’da verilmiştir. Bu örnek için
kuartz kristaller, elektroeğirme tekniği kullanılarak %20’lik PLGA polimeri ile
kaplandı. Yüzey üzerinde 20x20 µm2’lik bir alanda tarama işlemi yapıldı. Görüntüler
yüzey üzerinde homojen ve gözenekli bir kaplama gerçekleştiğini; histogram analizi ve
iki farklı bölgede gerçekleştirilen kesit analizi sonuçları ise, yüzeyde ortalama 550-700
nm kalınlığında bir kaplama meydana geldiğini gösterdi.
Şekil 4.9 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
63
Şekil 4.10 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin kesit analizi
4.2.6 PLGA film ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
PLGA film ile kaplanan altın yüzeyin topografi sonuçları Şekil 4.11-4.12’de verilmiştir.
Yüzey %2’lik PLGA polimeri ile 3000 rpm’de döndürerek kaplama yöntemi
kullanılarak kaplandı. Ölçümler 20x20 µm2’lik bir alanda gerçekleştirildi. AFM
ölçümleri sonucunda, yüzey üzerinde farklı boyutlarda polimer kümelerinin oluştuğu
gözlendi.
64
Şekil 4.11 PLGA film ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
Şekil 4.12 PLGA film ile kaplı yüzeyin kesit analizi
65
4.2.7 PCL ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
Şekil 4.13-4.14’de PCL polimeri ile kaplanan kristal yüzeyinin AFM görüntüleri
verilmiştir. Kristal yüzeyi %1’lik PCL çözeltisi ile, döndürerek kaplama cihazı
kullanılarak 3000 rpm’de kaplandı. Kristal yüzeyi üzerinde 10x10 µm2’lik yüzey
alanında tarama işlemi yapıldı. Görüntüler yüzey üzerinde homojen bir kaplama
gerçekleştiğini; histogram analizi ve üç farklı bölge üzerinde gerçekleştirilen kesit
analizi sonuçları ise, yüzeyde ortalama 110-150 nm kalınlığında bir kaplama meydana
geldiğini gösterdi.
Şekil 4.13 PCL ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
66
Şekil 4.14 PCL ile kaplı yüzeyin kesit analizi
4.2.8 PS ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
%1’lik PS polimeri ile kaplanan kristal yüzeyinin yüzey topografisi Şekil 4.15-4.16’da
görülmektedir. Kaplama işlemi döndürerek kaplama yöntemine göre 3000 rpm’de
yapıldı. AFM ölçümleri 10x10 µm2’lik yüzey üzerinde gerçekleştirildi. Elde edilen
veriler incelendiğinde yüzey üzerinde 40-50 nm kalınlığında bir kaplama gerçekleştiği
belirlendi.
67
Şekil 4.15 PS ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
Şekil 4.16 PS ile kaplı yüzeyin kesit analizi
68
4.2.9 Kitosan ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
Şekil 4.17-4.18’de %0.1’lik kitosan film kaplı yüzeyin AFM görüntüleri verilmiştir.
Kaplama işlemi, damlatma yöntemi uygulanarak kristal yüzeyi üzerinde yapıldı.
Kaplama işlemi sonunda 1 M NaOH ile 30 dakika ile çarpraz bağlama işlemi yapıldı.
AFM ölçümleri 10x10 µm2’lik yüzey üzerinde gerçekleştirildi. Sonuçlar, kaplamanın
ortalama 20-30 nm kalınlığında olduğunu gösterdi.
Şekil 4.17 Kitosan ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
69
Şekil 4.18 Kitosan ile kaplı yüzeyin kesit analizi
4.2.10 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
Hyalüronik asit film ile kaplanan altın yüzeyin topografi sonuçları Şekil 4.19-4.20’de
verilmiştir. Yüzey %0.1’lik hyalüronik asit polimeri ile damlatma yöntemi kullanılarak
kaplandı. Kaplama sonrasında 1 M NaOH ile çarpraz bağlama işlemi yapıldı. Ölçümler
10x10 µm2’lik bir alanda gerçekleştirildi. AFM ölçümleri, yüzey üzerinde 9-10 nm
kalınlığında bir kaplama meydana geldiğini gösterdi.
70
Şekil 4.19 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram
analizi
Şekil 4.20 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin kesit analizi
71
4.2.11 Kollajen ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
Kollajen film ile kaplanan altın yüzeyin AFM görüntüleri Şekil 4.21-4.22’de verilmiştir.
Yüzey %0.1’lik kollajen polimeri ile damlatma yöntemi kullanılarak kaplandı. Kaplama
sonrasında %2.5’luk glutaraldehit ile çarpraz bağlama işlemi yapıldı. Ölçümler 10x10
µm2’lik bir alanda gerçekleştirldi. AFM ölçümleri sonucunda, yüzey üzerinde 20 nm
kalınlığında bir kaplama meydana geldiği belirlendi.
Şekil 4.21 Kollajen ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
72
Şekil 4.22 Kollajen ile kaplı yüzeyin kesit analizi
4.2.12 Alginat ile kaplı yüzeyin AFM görüntüleri
Şekil 4.23-4.24’de %0.1’lik alginat film kaplı yüzeyin AFM görüntüleri verilmiştir.
Kaplama işlemi, damlatma yöntemi kullanılarak kristal yüzeyi üzerinde yapıldı.
Kaplama işlemi sonunda 0.4 M CaCl2 ile çarpraz bağlama işlemi yapıldı. AFM
ölçümleri 10x10 µm2’lik yüzey üzerinde gerçekleştirildi. Sonuçlar kaplamanın ortalama
5-6 nm kalınlığında olduğunu gösterdi.
73
Şekil 4.23 Alginat ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
Şekil 4.24 Alginat ile kaplı yüzeyin kesit analizi
4.2.13 PLL ile kaplı yüzeyin AFM bulguları
PLL kaplı yüzeyin yüzeyin AFM görüntüleri Şekil 4.25-4.26’da verilmiştir. Yüzey
%0.1’lik PLL polimeri ile damlatma yöntemine göre hazırlandı. AFM ölçümleri 10x10
74
µm2’lik yüzey üzerinde gerçekleştirildi. Histogram analizi ve iki farklı bölgede alınan
kesit analizi sonuçları, kaplamanın ortalama 15-20 nm kalınlığında olduğunu gösterdi.
Şekil 4.25 PLL ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi
Şekil 4.26 PLL ile kaplı yüzeyin kesit analizi
75
4.2.14 Yüzeylerin RMS değerleri
Çalışılan yüzeylerin pürüzlülük oranlarını belirlemek amacıyla kristal yüzeyleri
üzerinde oluşturulan her bir kaplamanın rms (root mean square) değeri belirlenmiştir
(Çizelge 4.2). Çizelgede görüldüğü gibi altın yüzey oldukça düşük bir rms değerine
sahip iken kaplamalar sonrasında yüzeylerin rms değerlerinin arttığı gözlenmiştir.
PLGA nanolif kaplı yüzeyin ölçülen rms değeri diğer yüzeylerin rms değerleri ile
karşılaştırıldığında, nanolif yüzeyin oldukça yüksek rms değerine sahip olduğu
görülmüştür.
Çizelge 4.2 Çalışılan yüzeylerin RMS değerleri
Kaplama türü RMS değerleri (nm)
Altın yüzey 0.8
11-MUA 6.4
2-Merkaptoetanol 8.4
2-Merkaptoetilamin 6.9
PLGA nanolif 303.8
PLGA film 48.7
PCL membran 36.5
PS membran 91.8
Kitosan 28.6
Hyalüronik asit 20.1
Kollajen 20.5
Alginat 17.7
PLL 12.8
76
4.3 CV Bulguları
Tiyol tabakalarının, kristalin altın elektrot yüzeyine adsorpsiyonunu doğrulamak
amacıyla dönüşümlü voltametri deneyleri yapıldı. Bu amaçla, kaplanmamış kristalin ve
yüzeyi modifiye edilmiş kristallerin CV ölçümleri alındı.
Şekil 4.27.a. Kaplanmamış kristalin, b. 11-MUA ile kaplı kristalin CV voltamogramı
a
b
77
Şekil 4.28.a. Kaplanmamış kristalin, b. 2-Merkaptoetanol ile kaplı kristalin CV
voltamogramı
Şekil 4.29.a. Kaplanmamış kristalin, b. 2-Merkaptoetilamin ile kaplı kristalin CV
voltamogramı
a
b
a
b
78
4.4 Faz Kontrast Mikroskobu Bulguları
Sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin, 1. Pasajdaki (10. günde) ve 3. pasajdaki
(10. günde) faz kontrast mikroskobu görüntüleri şekil 4.30’da verilmektedir. Hücrelerin
10-11 gün içerisinde %80-90 bolluk noktasına ulaştığı belirlendi. Fotoğraflarda
görüldüğü gibi 1. Pasajın 10. gününde hücrelerin küresel bir morfolojiye, sonraki
pasajlarda ise iğ şeklindeki karakteristik morfolojiye sahip oldukları görüldü.
Şekil 4.30.a. Sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin 1. Pasajın 10. gününde, b. 3. Pasajın 10. gününde elde edilen faz kontrast görüntüleri
A B
79
4.4 Hücre Adezyonu Bulguları
4.4.1 Altın ve alkantiyol tek tabaka yüzeyleri üzerine hücre adezyonu bulguları
Şekil 4.31.b’de kaplanmamış kristal yüzeyi (altın yüzey) üzerine birer saat aralıklarla
ilave edilen mezenkimal kök hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında
meydana getirdiği değişim görülmektedir. Üç aşamalı hücre ilavesi sonrası kristalin
frekansında meydana gelen azalma, hücrelerin altın yüzey üzerine bağlandığını
göstermektedir. Şekilde görüldüğü gibi birinci aşamada ilave edilen MKH’ler, birinci
saatin sonunda ~48 Hz’lik bir frekans değişimine sebep olmaktadır. Sonraki aşamalarda
ilave edilen hücreler kristalin frekansında daha düşük miktarda değişime neden olduğu
ve dört saatin sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~52 Hz olduğu kaydedilmiştir.
Şekil 4.31.a. Kaplanmamış kristal yüzeyi üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
a
b
80
Farklı fonksiyonel gruplar bulunduran kristal yüzeyleri (sırasıyla –COOH, -OH, -NH2)
üzerinde hücrelerin bağlanma davranışları incelendi. İlk olarak, MKH’lerin 11-MUA ile
modifiye edilerek elektrot yüzeyinde -COOH fonksiyonel grubu oluşturulan yüzey
üzerine adezyonu eş-zamanlı olarak belirlendi (Şekil 4.32). Üç aşamada ilave edilen
hücrelerin, dört saatin sonunda kristalin frekansında ~ 82 Hz’lik bir azalmaya neden
olduğu belirlendi.
Şekil 4.32.a. 11-MUA ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
a
b
81
Şekil 4.33.a. 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli
besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
Şekil 4.34.a. 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli
besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
a
b
a
b
82
Elde edilen grafiklerden (Şekil 4.33.b ve Şekil 4.34.b), 2-Merkaptoetanol (-OH) ve 2-
Merkaptoetilamin (-NH2) yüzeyleri üzerine MKH adezyonunun 11-MUA’e oranla daha
düşük seviyede olduğu (sırasıyla ~ 62 Hz ve ~ 68 Hz) görülmektedir. Elde edilen
sonuçlar kristal yüzeyinin modifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını ve
MKH’lerin –COOH fonksiyonel grubuna sahip yüzeyler üzerine bağlanmaya daha daha
fazla ilgi gösterdiği belirlendi. Her bir yüzey üzerine hücre içermeyen besiyeri
enjeksiyonunun, kristallerin frekansında meydana getirdiği değişimlerin ihmal edilebilir
düzeyde olduğu görüldü.
4.4.2 PLGA nanolif ve PLGA film kaplı yüzeyler üzerine hücre adezyonu bulguları
Şekil 4.35.b’de PLGA nanolif ile kaplı kristal yüzeyi üzerine birer saat aralıklarla ilave
edilen mezenkimal kök hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında meydana
getirdiği değişim görülmektedir. Üç aşamalı hücre ilavesi sonrası kristalin frekansında
meydana gelen azalma, hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir. Grafikte
görüldüğü gibi birinci aşamada ilave edilen MKH’ler, birinci saatin sonunda ~80 Hz’lik
bir frekans değişimine neden olmuştur. Sonraki aşamalarda ilave edilen hücrelerin
kristalin frekansında daha düşük miktarda değişime neden olduğu ve dört saatin
sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~125 Hz olduğu kaydedilmiştir.
83
Şekil 4.35.a. PLGA nanolif ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
Şekil 4.36.b’de ise döndürerek kaplama yöntemi ile oluşturulan PLGA film yüzeyi
üzerindeki hücre adezyonu sonuçları görülmektedir. Grafikte görüldüğü gibi PLGA film
yüzeyi üzerine mezenkimal kök hücrelerinin adezyonu frekansta yaklaşık 40 Hz’lik bir
değişime neden olmuştur.
a
b
84
Şekil 4.36.a. PLGA film ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
Hücresiz ölçümlerde, kristalin frekansında meydana gelen değişimler şekil 4.35.a ve
şekil 4.36.a’da görülmektedir. Frekans değişim sonuçlarına göre, besiyeri içerisinde
bulunan maddelerin, kristal yüzeyi üzerine adsorbe olduğu ve yüzeyin uygulanan
besiyeri akış hızında gerekli mekanik dayanımı gösterdiği belirlendi. Besiyeri içerisinde
bulunan maddelerin adsorpsiyonundan kaynaklanan değişimin (~ 2-3 Hz), kristal yüzeyi
üzerindeki hücre adezyonu sonuçlarıyla karşılaştırıldığında ihmal edilebilir düzeyde
olduğu görüldü.
4.4.3 PCL ve PS polimeri ile kaplı yüzeyler üzerine hücre adezyonu sonuçları
Şekil 4.37.b’de PCL ile kaplı kristal yüzeyi üzerine birer saat aralıklarla ilave edilen
mezenkimal kök hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında meydana getirdiği
değişim görülmektedir. Hücre ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen
azalma, hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir. Birinci aşamada ilave
a
b
85
edilen MKH’ler, ilk saatin sonunda ~110 Hz’lik bir frekans değişimine neden olmuştur.
Sonraki aşamalarda ilave edilen hücrelerin kristalin frekansında daha düşük miktarda
değişime neden olduğu ve dört saatin sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~154 Hz
olduğu belirlenmiştir.
Şekil 4.37.a. PCL ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
Şekil 4.37.a’da hücresiz ölçümde elde edilen frekans değişimi sonuçları görülmektedir.
Besiyeri içerisinde bulunan maddelerin adsorpsiyonundan kaynaklanan değişimin (~ 5
Hz), kristal yüzeyi üzerindeki hücre adezyonu sonuçlarıyla (Şekil 4.37.b)
karşılaştırıldığında ihmal edilebilir düzeyde olduğu görüldü.
Şekil 4.38.b’de PS ile kaplı kristal yüzeyi üzerine ilave edilen mezenkimal kök
hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında meydana getirdiği değişim
görülmektedir. Hücre ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen azalma,
hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir. Birinci aşamada ilave edilen
MKH’ler, ilk saatin sonunda ~115 Hz’lik bir frekans değişimine sebep olmaktadır.
a
b
86
Sonraki aşamalarda ilave edilen hücrelerin kristalin frekansında daha düşük miktarda
değişime neden olduğu ve dört saatin sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~135 Hz
olduğu belirlendi.
Şekil 4.38.a. PS ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
Şekil 4.38.a’da hücresiz ölçümde elde edilen frekans değişimi sonuçları görülmektedir.
Besiyeri içerisinde bulunan maddelerin adsorpsiyonundan kaynaklanan değişimin (~ 5-6
Hz), kristal yüzeyi üzerindeki hücre adezyonu sonuçlarıyla karşılaştırıldığında ihmal
edilebilir düzeyde olduğu görüldü.
4.4.4 PLL, kitosan, hyalüronik asit, kollajen ve alginat polimeri ile kaplı kristal yüzeyinin hücre adezyonu sonuçları
Şekil 4.39.b’de PLL ile kaplı kristal yüzeyi üzerine birer saat aralıklarla ilave edilen
mezenkimal kök hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında meydana getirdiği
a
b
87
değişim görülmektedir. Hücre ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen
azalma, hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir. Birinci aşamada ilave
edilen MKH’ler, ilk saatin sonunda ~90 Hz’lik bir frekans değişimine neden olmuştur.
Sonraki aşamalarda ilave edilen hücrelerin kristalin frekansında daha düşük miktarda
değişime neden olduğu ve dört saatin sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~180 Hz
olduğu belirlenmiştir.
Şekil 4.39.a. PLL ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri
enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
Şekil 4.39.a’da hücresiz ölçümde elde edilen frekans değişimi sonuçları görülmektedir.
Besiyeri içerisinde bulunan maddelerin adsorpsiyonundan kaynaklanan değişimin (~ 5
Hz), kristal yüzeyi üzerindeki hücre adezyonu sonuçlarıyla karşılaştırıldığında ihmal
edilebilir düzeyde olduğu görüldü.
a
b
88
Kitosan, hyalüronik asit, kollajen ve alginat polimeri ile kaplanan yüzey üzerine hücre
enjeksiyonu sonucunda kristaldeki frekans değişimleri Şekil 4.40, 4.41, 4.42 ve 4.43’de
verilmiştir. Çalışmanın bu aşamasında, deney sonrasında kristal yüzeyi üzerinde hücre
adezyonu gerçekleşmesine rağmen anlamlı bir frekans değişimi elde edilememiştir.
Şekil 4.40 Kitosan ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
89
Şekil 4.41 Hyalüronik asit ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi.
Şekil 4.42 Kollajen ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi
90
Şekil 4.43 Alginat ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında kristaldeki
frekans değişimi
4.5 Hücre-İlaç Etkileşimi ile İlgili Araştırma Bulguları
4.5.1 Faz kontrast mikroskobu bulguları
Şekil 4.44, 6 saatin sonunda artan kolsişin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök
hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi göstermektedir. Şekilde
görüldüğü gibi 150 µM kolsişin konsantrasyonuna kadar hücrelerin morfolojilerinde
önemli bir değişim gözlenmezken, bu konsantrasyondan sonra hücrelerin yuvarlak bir
şekil almaya başladığı gözlendi. Daha yüksek ilaç konsantrasyonlarında ise hücre ölümü
sonucu hücrelerin kültür kabından ayrıldığı gözlendi. Faz kontrast mikroskobu
görüntülerinde görüldüğü gibi, normal hücreler tipik iğ şeklinde bir morfolojiye sahip
iken, anti-mikrotübül ilaçlarına maruz kalan hücrelerin yuvarlak bir şekil aldığı
görülmüştür
91
Şekil 4.44 Artan kolsişin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM
A
F E
D C
B
92
Şekil 4.45 Artan vinorelbin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM
A
F E
D C
B
93
Şekil 4.46 Artan vinblastin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM
A
F E
D C
B
94
Şekil 4.45-4.46’da görüldüğü gibi, hücrelerin morfolojilerindeki değişimin 50 µM
vinorelbin ve vinblastin konsantrasyonunda başladığı görülmektedir. Bu
konsantrasyondan sonra hücrelerin yuvarlak bir şekil almaya başladığı görülmektedir.
Daha yüksek ilaç konsantrasyonlarında ise hücre ölümü sonucu hücrelerin kültür
kabından ayrıldığı gözlendi. Kontrol deneylerinde ise hücrelerin iğ şeklinde bir
morfolojiye sahip olduğu gözlendi.
4.5.2 MTT bulguları
4.5.2.1 Faz kontrast mikroskobu bulguları
Farklı konsantrasyonda ilaçlara 6 saat boyunca maruz bırakılan kemik iliği hücrelerinin
MTT boyamaları Şekil 4.47, 4.48 ve 4.49’da verilmiştir. Faz kontrast görüntüleri
incelendiğinde ilaç konsantrasyonun artmasıyla hücre canlılığının ve MTT reaktifinin
etkisiyle oluşan formazan kristallerinin azaldığı gözlendi. MTT sonuçlarına göre,
vinorelbin ve vinblastin’e maruz bırakılan hücrelerin, kolsişine kıyasla daha düşük
mitokondriyel aktiviteye sahip olduğu belirlendi.
95
Şekil 4.47 Artan konsantrasyonlarda kolsişin içeren besiyeri ile 6 saat muamele edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM
A
F E
D C
B
96
Şekil 4.48 Artan konsantrasyonlarda vinorelbin içeren besiyeri ile 6 saat muamele edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM
A
F E
D C
B
97
Şekil 4.49 Artan konsantrasyonlarda vinblastin içeren besiyeri ile 6 saat muamele edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM
A
F E
D C
B
98
4.5.2.2 MTT hücre canlılık testi sonuçları
Anti-mikrotübül ilaçlarının MKH canlılığı üzerine olan sitotoksik etkisini araştırmak
amacıyla yapılan MTT testi sonuçları Şekil 4.50-4.52’de verilmiştir. Her bir doz değeri
için hücre canlılığı hesaplanıp, konsantrasyona karşı grafiğe geçirilmiştir. Grafiklerde
her üç anti-mikrotübül ilacın hücre canlılığına etkisi doza bağlı olarak görülmektedir.
MTT testi ile ilaçların hücre canlılığı üzerine etkisi, hücre morfolojileri üzerine olan
etkileri ile paralellik göstermektedir. Sonuç olarak, kolsişin, vinorelbin ve vinblastin
ilaçlarının MKH hücrelerinin canlılığı üzerinde önemli derecede etkili olduğu belirlendi.
Şekil 4.50 Artan kolsişin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen değişim
99
Şekil 4.51 Artan vinorelbin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen değişim
Şekil 4.52 Artan vinblastin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen değişim
100
Çizelge 4.3 Anti-mikrotübül ilaçlarının MKH’leri üzerindeki IC50 değerleri
Kolsişin için IC50 değeri 255 µM, vinorelbin için 116 µM ve vinblastin için 92 µM
olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3). Bu değerlere göre aynı konsantrasyondaki
vinblastinin, diğer iki ilaca göre daha toksik bir etkiye sahip olduğu belirlenmiştir.
4.5.3 KKM Bulguları
4.5.3.1 Kolsişin’in MKH üzerine etkisi
Şekil 4.53’te görüldüğü gibi akış ortamına hücre enjeksiyonu sonrasında kristalin
frekansında yaklaşık 260 Hz’lik bir azalma meydana geldi. Bu azalma hücrelerin kristal
yüzeyine bağlandığını ve yayıldığını göstermektedir. Hücrelerin yüzey üzerine
bağlanmasının ardından akış ortamına kolsişin’in ilave edilmesinden 6 saat sonra
frekansta, 150 µM için 45 Hz’lik, 300 µM için ise yaklaşık 65 Hz’lik bir azalma
gözlendi. Frekanslardaki bu azalma kolsişin’in, hücrelerin mikrotübüllerine
bağlandığını göstermiştir. Bu azalmanın ardından belli bir süre sonra frekansta 150 µM
için yaklaşık 24 Hz’lik bir artış meydana gelirken, 300 µM kolsişin için yaklaşık 60
Hz’lik bir artış gözlenmiştir. Deneyler sonunda kristallerin frekansında meydana gelen
bu artış, ilaç etkisiyle hücrelerin bir kısmının kristal yüzeyleri üzerinden ayrıldığını
göstermiştir.
İlaç IC 50 (µM)
Kolsişin 255 ± 47
Vinorelbin 116 ± 30
Vinblastin 92 ± 24
101
Şekil 4.53 Hücre ilavesi (1. ok) ve kolsişin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin frekansında
meydana gelen değişim, ( --- 150 µM, --- 300 µM kolsişin)
Şekil 4.54 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine kolsişin ilavesi sonrası kristalin
frekansında meydana gelen değişim
102
Şekil 4.54 ise kontrol deneyinin sonucunu göstermektedir. PS kaplı kristal yüzeyi
üzerine aynı koşullarda 300 µM kolsişin enjeksiyonu yapılarak frekansında meydana
gelen değişim 6 saat boyunca kaydedildi. Grafikte görüldüğü gibi hücre bulunmayan PS
yüzey üzerine kolsişin ilavesi frekansta yaklaşık 5-6 Hz’lik bir değişime sebep
olmuştur.
4.5.3.2 Vinorelbin’in MKH üzerine etkisi
Şekil 4.55, kemik iliği hücrelerinin vinorelbine cevabını göstermektedir. Akış ortamına
hücre enjeksiyonu sonucunda 250 Hz civarında bir azalma gözlenmiştir. PS yüzey
üzerine bağlanan hücreler üzerine 150 µM ve 300 µM konsantrasyonlarında vinorelbin
enjekte edildi ve bu enjeksiyondan 6 saat sonra frekanslarda 150 µM vinorelbin için 60
Hz’lik, 300 µM için 80 Hz’lik bir azalma meydana geldi. Frekanslardaki bu azalma
vinorelbin’in, hücrelerin mikrotübüllerine bağlandığını göstermiştir. İlaç
enjeksiyonundan 12 saat sonra ise sırasıyla 35 Hz ve 69 Hz civarında artışın meydana
gelmesi, vinorelbin etkisiyle hücrelerin kristal yüzeylerinden ayrıldığını göstermiştir.
Şekil 4.56’da görüldüğü gibi PS yüzey üzerine akış ortamında gönderilen 300 µM
vinorelbin, frekansta 4-5 Hz’lik bir azalmaya neden olmuştur.
103
Şekil 4.55 Hücre ilavesi (1. ok) ve vinorelbin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin frekansında meydana gelen değişim, (--- 150 µM, --- 300 µM vinorelbin)
Şekil 4.56 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine vinorelbin ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen değişim
104
4.5.3.3 Vinblastin’in MKH üzerine etkisi
Şekil 4.57, kemik iliği hücrelerinin vinblastin’e olan cevabını göstermektedir. Grafikten
görüldüğü gibi, hücre enjeksiyonu kristallerin frekansında 260 Hz’lik bir azalmaya
sebep olmuştur. Vinblastin enjeksiyonlarından 6 saat sonra ise frekanslarda yaklaşık 85
Hz (150 µM vinblastin için) ve 100 Hz (300 µM vinblastin için) civarında azalmalar
meydana geldi. Frekanslardaki bu azalma vinblastin’in, hücrelerin mikrotübüllerine
bağlandığını göstermiştir. Bu azalmanın ardından belli bir süre sonra frekansta 150 µM
vinblastin için 45 Hz, 300 µM vinblastin için 84 Hz artış gözlendi. Deney sonunda
kristallerin frekansında meydana gelen bu değişimler, ilaç etkisiyle hücrelerin bir
kısmının kristal yüzeyi üzerinden ayrıldığını göstermiştir.
Şekil 4.57 Hücre ilavesi (1. ok) ve vinblastin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin frekansında meydana gelen değişim, (--- 150 µM, --- 300 µM vinblastin)
105
Şekil 4.58 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine vinblastin ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen değişim
Şekil 4.58 kontrol deneyinin sonucunu göstermektedir. PS yüzey üzerine vinblastin
ilavesi, kristalin frekansında 3-4 Hz’lik değişime sebep olmuştur.
106
Şekil 4.59 Kristal yüzeyindeki hücreler üzerine DMSO enjeksiyonu sonucu kristalin frekansında meydana gelen değişim
Şekil 4.59, kemik iliği hücrelerinin DMSO’ya olan cevabını göstermektedir. Akış
ortamına hücre enjeksiyonu sonucunda, kristalin frekansında 260 Hz civarında bir
azalma gözlendi. Ardından PS yüzey üzerine bağlanan hücreler üzerine, akış ortamına
ilave edilen ilaç ile aynı hacimde DMSO enjekte edildi. Bu enjeksiyon sonucunda
kristalin frekansında yaklaşık olarak 10 Hz’lik bir değişim gözlendi.
107
5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Bu çalışmada, sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin farklı malzemeler üzerine
bağlanma oranlarının; vinblastin, vinorelbin ve kolsişin gibi farklı anti-mikrotübül
ilaçları ile etkileşimlerinin, kuartz kristal mikrobalans sistemi ile eş zamanlı olarak
belirlenebildiği bir sistemin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Kuartz kristallerin kaplanması
çalışmalarında, kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi, elektroeğirme yöntemi,
döndürerek kaplama yöntemi ve damlatma yöntemi kullanılmıştır. Çalışma genel olarak
iki aşamada gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasını, mezenkimal kök hücrelerinin
farklı malzemeler üzerindeki bağlanma oranlarının incelendiği hücre-malzeme
etkileşimi deneyleri; çalışmanın ikinci aşamasını ise, kristal yüzeyi üzerinde bulunan
hücrelerin belirli dozlarda anti-mikrotübül ilaçları ile olan etkileşimlerinin incelendiği
hücre-ilaç etkileşimi deneyleri oluşturmaktadır.
Hücre-malzeme etkileşiminin incelendiği deneylerde, hücre enjeksiyonuyla zamanla
frekansta meydana gelen azalma, hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir.
Hücre-yüzey etkileşiminin incelendiği bu deneylerde hücre süspansiyonu birer saat
aralıklarla üç aşamada ilave edilmiştir. Her hücre ilavesi sonrasında, akış ortamındaki
hücre sayısının artmasıyla frekansta belli bir oranda azalma meydana gelmiş olup, dört
saatin sonunda frekans değeri sabit bir değere ulaşmıştır. Elde edilen frekans değişimi
grafikleri sonucunda, akış ortamına yapılan ilk hücre enjeksiyonundan sonra, kristalin
frekansında meydana gelen azalmanın, 2. ve 3. enjeksiyonlara oranla daha fazla olduğu
gözlenmiştir (Şekil 4.31-4.39).
Son yıllarda, çeşitli substrat yüzeyleri üzerinde, yüzey aktif organik moleküller
kullanılarak oluşturulan kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar, biyoteknolojik alanda
önemli potansiyel uygulamaları nedeniyle oldukça fazla ilgi çekmektedir. Silikon
yüzeyler üzerinde silanlar, metaloksitler üzerinde yağ asitleri ve soy metaller üzerinde
tiyoller veya disülfitler gibi tek tabakalar, bu yöntem ile hazırlanan yüzeylerdir. Bunlar
arasında altın üzerinde alkantiyoller, kontrol edilebilen kalınlık ve istenilen fonksiyona
sahip tek tabakalar oluşturabilmek için mükemmel model sistemler olarak ortaya
108
çıkmıştır. Çeşitli amaçlar için tiyol moleküllerinin yüzey özellikleri, alkil zincirin
sonuna bağlı uç grupların kimyasal yapısı değiştirilerek kolayca dizayn
edilebilmektedir.
Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi, biyomalzeme araştırma çalışmalarında,
kullanım amacına göre farklı özelliklere sahip (hidrofobik ya da hidrofilik, yüzey yükü,
yüzey topografisi vb.) termodinamik olarak kararlı yüzeylerin elde edilmesinde yaygın
olarak kullanılan bir yöntemdir (Chaki vd. 2001). Bu yöntemin en önemli
avantajlarından biri, oldukça basit olması ve tiyol çözeltilerinin düşük
konsantrasyonlarının modifikasyon için yeterli olmasıdır. Oluşturulan tek tabakaların
elektrokimyasal karakterizasyonu için dönüşümlü voltametri ya da impedans ölçümleri
gibi teknikler kullanılmaktadır (Ganesh vd. 2006).
Şekil 4.27, 4.28 ve 4.29, modifikasyon öncesi ve sonrası Fe(CN)6-3 çözeltisinde
kaydedilen dönüşümlü voltamogramlarını göstermektedir. Modifiye filmler için
Fe(CN)6-3 çözeltisinde Ag/AgCl referans elektrota karşın +500 ve -500 mV
potansiyelleri arasında kaydedilen voltamogramlar, yüzey modifikasyonunun, elektrot
yüzeyindeki elektron transferini engelleyerek bu redoks türünün dönüşümlü
elektrokimyasal davranışını (elektron transferini) bloke ettiğini göstermektedir.
Modifiye kristallerin CV voltamogramları, kaplanmamış kristalin voltamogramı ile
karşılaştırıldığında; altın yüzeyin iletkenliğinin (kaplanmamış kristal), modifiye
yüzeylerin iletkenliğinden daha az olması, kristal yüzeylerinin kaplanmış olduğunu
doğrulamaktadır. Bu durum AFM görüntülerini destekler bir şekilde, tiyol filmlerinin
düzenli ve sıralı yapıda olmasıyla açıklanabilmektedir. Ayrıca, uzun zincirli alkil tek
tabakanın (11-MUA), kısa zincirli tek tabakalara (2-Merkaptoetanol, 2-
Merkaptoetilamin) kıyasla daha etkili bariyer özellik sergilediği görülmüştür. CV
voltamogramları karşılaştırıldığında, alkantiyol tek tabaka yüzeylerin, altın yüzeye
kıyasla daha az akım yoğunluğuna sahip olması, yüzeylerin düzgün bir şekilde
kaplandığını göstermektedir.
109
Kristal yüzeyi üzerinde 11-MUA, 2-Merkaptoetanol ve 2-Merkaptoetilamin filmlerinin
AFM görüntüleri, referans yüzey olarak alınan kaplanmamış altın yüzeyin AFM
görüntüsü ile karşılaştırıldığında, modifiye yüzeylerin tamamen kaplandığı
belirlenmiştir. Modifiye yüzeylerin AFM görüntüleri, tiyol moleküllerinin altın yüzey
üzerinde düzenli ve sıralı bir şekilde biriktiğini göstermiştir.
Çalışmada kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi kullanılarak –COOH, -OH ve
–NH2 fonksiyonel uç gruplarına sahip yüzeyler oluşturulmuştur. Boş altın yüzey ve
oluşturulan modifiye yüzeyler üzerine hücre adezyonunun, KKM sistemi ile incelendiği
deneylerde elde edilen sonuçlar; kristal yüzeyinin modifikasyonunun hücre adezyonunu
arttırdığı ve MKH’lerin –COOH fonksiyonel grubuna sahip yüzeyler üzerine bağlanma
oranının daha fazla olduğunu gösterdi.
Kuartz kristallerin PLGA polimeri ile kaplanmasında iki farklı teknik kullanılmıştır.
Kristaller birinci yöntemde döndürerek kaplama tekniği ile kaplanarak yüzey üzerinde
ince bir PLGA film tabakası oluşturulmuştur. İkinci yöntemde ise, kristaller
elektroeğirme sistemi kullanılarak PLGA nanolif ile kaplanmıştır. Döndürerek kaplama
yöntemiyle elde edilen PLGA film yüzeyinin ve PLGA’nın elektroeğirme sistemine
uygulanması ile elde edilen nanolif membranların AFM görüntüleri sırasıyla şekil 4.9
ve şekil 4.11’de verilmiştir. Şekil 4.10’da görüldüğü gibi PLGA film yüzeyi üzerinde
farklı boyutlara sahip düzensiz ve rastgele polimer kümeleri oluşmuştur. PLGA
nanolifler elektroeğirme tekniği kullanılarak, kristal yüzeyi üzerinde belirli bir kalınlığa
kadar biriktirilmiştir. Hazırlanan PLGA nanolif membranın AFM görüntüsüne
bakıldığında, nanoliflerin birbirleri üzerindeki yönelmeleri, hücre tutunması ve
yayılmasına elverişli gözenekli yapıları açık bir şekilde görülmektedir.
Elektroeğirme tekniği, oldukça ince polimer lifler hazırlamak amacıyla yaygın olarak
kullanılan bir tekniktir Elektroeğirme yöntemi ile, geniş yüzey alanına ve kontrollü
gözenek boyutuna sahip nanolifler kolaylıkla üretilebilmektedir (Ramakrishna vd 2003).
Biyomalzeme çalışmalarında nanoliflerin tercih edilmesinin en önemli avantajı, hücre
adezyonunda önemli rol oynayan gözenekli bir yüzey topografisine sahip olmalarıdır
110
(Şekil 4.11). Çalışmada, hazırlanan PLGA nanolif ve PLGA film ile kaplı kristal
yüzeyleri üzerine mezenkimal kök hücrelerinin bağlanma oranları KKM sistemi ile
incelenmiştir. Bu iki yüzey için elde edilen frekans değişim grafikleri (Şekil 4.35-Şekil
4.36) incelendiğinde, PLGA nanolif yüzey üzerindeki hücre adezyonunun, PLGA film
yüzey üzerindeki hücre adezyonundan daha fazla olduğu görülmektedir.
Çalışmada kristal yüzeyi suda çözünen polimerlerden olan PLL polimeri ile
kaplanmıştır. PLL polimeri pozitif yüklüdür ve polimer yüzeyine hücrelerin bağlanması,
hücre yüzeyinde bulunan polisakkaritler ve negatif yüklü lipitlerle olan etkileşimler
sonucu gerçekleşmektedir (Frey ve Corn 1996). Bu etkileşimler hücrelerin yüzeye
bağlanma kapasitesinin artmasına neden olmaktadır. PLL polimeri ile elde edilen
sonuçlar (Şekil 4.39) ve kaplanmamış altın yüzey üzerinde elde edilen sonuçlar (Şekil
4.31) karşılaştırıldığında, hücre adezyonunun PLL yüzey üzerinde daha fazla olduğu
belirlenmiştir.
Çalışılan her kristal yüzeyi için dinamik modda alınan AFM görüntüleri Şekil 4.1-
4.26’da verilmiştir. Bu görüntüler örneklerin yüzey yapılarını ve yüzey pürüzlülüğünü
ortaya koymaktadır. AFM ölçümlerinden elde edilen yüzey rms değerleri, yüzey
pürüzlülüğünün en önemli göstergesidir. Yüzeyin rms değerinin yüksek olması, yüzey
pürüzlülüğünün fazla olduğunu göstermektedir. Kaplı yüzeylerin rms değerleri
kaplanmamış altın yüzeyin rms değeri ile karşılaştırıldığında, yüzey kaplamaları
sonrasında pürüzlülüğün arttığı gözlenmiştir (Çizelge 4.2). Kaplı yüzeyler arasında
PLGA nanolif kaplı yüzeyin ölçülen rms değeri, örneğin oldukça yüksek bir yüzey
pürüzlülüğüne sahip olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, PS polimerinin yüzey
pürüzlülüğünün, diğer polimer kaplamaların yüzey pürüzlülüğünden daha fazla olduğu
belirlenmiştir.
Çalışmada kaplı kristal yüzeyleri için kontrol deneyleri gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla
yüzeyler hücre içermeyen besiyeri ile aynı koşullarda muamele edilmiştir. Hücresiz
yapılan deneyler sonucunda yüzeylerin uygulanan besiyeri akış hızında gerekli mekanik
dayanımı gösterdikleri belirlenmiştir. Aynı zamanda bu deneyler sonucunda elde edilen
111
frekans değişimi sonuçları, besiyeri içerisinde bulunan maddelerin, kristal yüzeyleri
üzerine adsorbe olduğunu; besiyeri içerisinde bulunan maddelerin adsorpsiyonundan
kaynaklanan değişimin (~6-10 Hz), kristal yüzeyi üzerindeki hücre adezyonu
sonuçlarıyla karşılaştırıldığında ihmal edilebilir düzeyde olduğunu göstermiştir.
Çalışmada doğal polimer sınıfından olan kitosan, hyalüronik asit, kollajen ve alginat
polimerleri kullanılarak kristal yüzeyleri kaplanmıştır. Doğal polimerlerin
biyouyumluluk özellikleri bu polimerlerin doku mühendisliği ve biyomalzeme
alanındaki kullanım yaygınlığını arttırmıştır. Doğal polimerlerin bu özelliklerine
rağmen, hidrojel yapıda olmalarından ve dolayısıyla su tutma özelliklerinin
bulunmasından dolayı, KKM ölçümlerinde anlamlı bir frekans değişimi elde
edilememiştir. Aynı zamanda yumuşak polimer kaplamalarda kristaldeki akustik enerji
kaybı, sert polimerlere oranla daha fazladır. Bunun sonucu olarak, sensörün hassasiyeti
yumuşak polimer kaplamalara oranla daha azdır (Lucklum ve Hauptmann 2000). Hücre
adezyonu deneyleri sonrasında, kristal yüzeyleri üzerinde hücre adezyonunun
gerçekleşmesine rağmen geçerli frekans değişim grafikleri elde edilememiştir.
Genel olarak hücre tipi ve kaplama malzemesinin yapısı kristalin frekans cevabını
etkilemektedir (Marxer vd. 2003). Hücre sensörü çalışmalarında kristalin frekansında
belli bir artışın meydana gelmesinin birçok sebebi bulunmaktadır. Kaplama
malzemesinin kristal yüzeyi üzerinden ayrılması, hücrelerin kaplama malzemesi ile
etkileşerek, malzemenin vizkoelastik özelliğininin değişimine sebep olması; hücrelerin
kısmen yüzeye bağlanıp, yüzeyden tekrar geri ayrılması gibi durumlar, kristaldeki
frekans artışına sebep olarak gösterilmektedir (Marxer vd. 2003, Fohlerová vd. 2007).
Hücre-ilaç etkileşiminin incelendiği çalışmalarda kristal yüzeyi PS polimeri ile
kaplanmıştır. PS polimeri, inert, ucuz ve kolay bulunabilir bir malzeme olmasından
dolayı çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. PS yapısal olarak hidrofobik
özelliğe sahiptir. PS polimeri ile hazırlanan membranlar, çeşitli yöntemlerle modifiye
edilerek, hücre adezyonu için uygun hale getirilmektedir (Curtis vd. 1983). Bu
yöntemlerden biri yüzeyin belirli bir süre ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakılmasıdır.
112
PS, UV ışığın etkisiyle oksidasyona uğrayarak hidrofilik özellik kazanmaktadır. PS
yüzeye hücre adezyonunun incelendiği bazı çalışmalarda hidrofobik özellikte olan PS
yüzey UV ışığa belirli süre maruz bırakılarak hidrofilik hale getirilmiştir (Fredriksson
vd. 1998, Lord vd. 2006).
Farklı anti-mikrotübül ilaçları ile etkileştirilen mezenkimal kök hücrelerinin in vitro
ortamda hücre canlılığını incelemek amacıyla, hücreler farklı dozlarda kolsişin,
vinorelbin ve vinblastin ilaçlarıyla etkileştirilmiştir. Anti-mikrotübül ilaçlarının
hücrelerin mikrotübüllerine farklı mekanizmalarla bağlanarak, mikrotübül
fonksiyonlarını bozup, mitoz bölünmeyi durdurma potansiyelleri bulunmaktadır.
Çalışmada ilk olarak, ilaçların hücreler üzerindeki bu etkisi ışık mikroskobu ile
incelenmiştir. Işık mikroskobu görüntüleri hücrelerin artan ilaç konsantrasyonunda
yuvarlak bir morfolojiye sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 4.44, 4.45 ve 4.46).
Gözlenen yuvarlak morfoloji hücrelerin yüzey ile bağlantılarının zayıflamış olduğunu
göstermektedir. Yüksek dozlarda ise, hücrelerin nekrotik hücre görünümünde daha
şişkin bir görünüme sahip olduğu belirlenmiştir. Gözlenen morfolojik değişimlerin,
vinblastin ve vinorelbin ilaçları için benzer olduğu gözlenirken, kolsişin’in diğer ilaçlara
göre daha az toksik etki gösterdiği belirlenmiştir.
MTT testi hücrelerin canlılık ve çoğalma oranları hakkında bilgi veren kolorimetrik bir
yöntemdir. Metabolik aktivitesini koruyan sağlıklı hücreler tarafından sarı renkli MTT
reaktifinin indirgenerek, lacivert-mor renkli formazan kristallerinin oluşması prensibine
dayanmaktadır. Bu test farklı dozlarda anti-mikrotübül ilaçlarına maruz bırakılan
mezenkimal kök hücrelerin canlılığı hakkında bilgi vermektedir. Işık mikroskobu
görüntüleri incelendiğinde oluşan formazan kristallerinin yoğunluğunun artan ilaç
konsantrasyonlarıyla azaldığı gözlenmiştir (Şekil 4.47, 4.48 ve 4.49). Aynı
konsantrasyonda kolsişine maruz bırakılan hücrelerin vinorelbin ve vinblastin’e maruz
bırakılan hücrelere oranla daha fazla formazan kristalleri oluşturdukları görülmüştür.
Hücrelerin ilaç yanıtlarının belirlenmesinde biyosensör sistemlerinin kullanılmasının
önemli avantajları bulunmaktadır. KKM hücre biyosensörünün en önemli özelliği
113
kompleks hücre cevaplarının eş zamanlı olarak görüntülenebilmesidir. Diğer önemli bir
avantajı ise, herhangi bir işaretleme işleminin yapılmasına gerek duyulmamasıdır.
Çalışmanın ikinci aşamasında, mezenkimal kök hücrelerinin anti-mikrotübül ilaçlarına
olan cevabı KKM sistemi ile incelenmiştir.
Anti-mikrotübül ilaçlarının mezenkimal kök hücreler üzerine olan sitotoksik etkileri
konsantrasyona bağımlı olarak ortaya çıkmıştır (Şekil 4.50, 4.51 ve 4.52). IC50 değeri
ortamdaki anti-mikrotübül ilaçlarının, hücre canlılığını %50 inhibe ettiği konsantrasyon
olarak tanımlanmaktadır. Kullanılan ilacın IC50 değerinin düşük olması ilacın
toksisitesinin fazla olduğunu göstermektedir. MTT deneylerinde ölçülen absorbans
değerleri, kullanılan ilaç konsantrasyonlarına karşı grafiğe geçirilmiştir. Elde edilen bu
grafikleriden yararlanılarak, her ilaç için IC50 değeri hesaplanmıştır. Anti-mikrotübül
ilaçlarının mezenkimal kök hücreler üzerine etki derecesini belirlemek amacıyla
hesaplanan IC50 değerleri incelendiğinde; ilaçların farklı derecelerde toksisiteye neden
olduğu ve vinblastin’in, kolsişin ve vinorelbin’den daha fazla toksik etkiye neden
olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.3). Artan ilaç miktarına bağlı olarak hücre canlılığında
meydana gelen değişimler incelendiğinde, elde edilen bu sonuçların, ışık mikroskobu
görüntüleri ile paralellik gösterdiği görülmüştür.
Hücre-ilaç etkileşiminin KKM sistemi ile incelendiği çalışmalarda, ilk olarak akış
ortamına mezenkimal kök hücre çözeltisi enjekte edilerek, hücrelerin kristal yüzeyi
üzerine bağlanmaları sağlanmıştır. Hücre ilavesinden yaklaşık 20 saat sonra, kristalin
frekansı sabit bir değere ulaşmıştır. Bu zaman noktasından sonra ortama farklı iki dozda
(150 µM ve 300 µM) ilaç enjeksiyonu yapılarak, hücrelerin vinorelbin, vinblastin ve
kolsişin ilaçlarına olan cevabı, kristalin frekansında meydana gelen değişimler
kaydedilerek görüntülenmiştir (Şekil 4.53, 4.55 ve 4.57). Grafiklerde görüldüğü gibi
ilaç ilavesinin ardından ilk 6 saat içinde frekans değerinin azaldığı gözlenmiş ve her bir
ilaç için kristalin frekans değişimlerinin farklı olduğu görülmüştür. Frekansta meydana
gelen bu azalma anti-mikrotübül ilaçlarının, hücrelerin mikrotübüllerine
bağlanmasından ve bu bağlanma sonucu aktin flamentlerinin ve gerilim fiberlerinin
oluşmasından kaynaklanmaktadır (Marx vd. 2007). 6 saat sonrasında, kristalin
114
frekansında belli bir artışın meydana geldiği gözlenmektedir. İlaçların etkisiyle
hücrelerin apoptozise uğraması ve kristal yüzeyi üzerinde bulunan bu hücrelerin
yüzeyden ayrılması frekans artışının sebebi olarak görülmektedir (Braunhut vd. 2005).
Vinblastin enjeksiyonuyla kristalin frekansında meydana gelen artışın, vinorelbin ve
kolsişine göre daha fazla olduğu belirlenmiştir. 150 µM ilaç enjeksiyonu, 300 µM ilaç
enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında; elde edilen grafikler, frekansların artan ilaç dozuna
bağlı olarak anlamlı değişimler gösterdiğini ifade etmektedir. Elde edilen grafiklere
bakıldığında, hücrelerin bu ilaçlara cevap zamanının yaklaşık 6 saat olduğu
görülmüştür. KKM sistemi ile elde edilen bu sonuçlar MTT testi ve faz kontrast
mikroskobu sonuçları ile doğrulanmıştır.
Hücre-ilaç etkileşiminin incelendiği çalışmalarda, iki kontrol deneyi gerçekleştirilmiştir.
Birinci kontrol deneylerinde, hücre bulunmayan PS yüzey üzerine ilaç enjeksiyonu
yapılarak her bir ilaç molekülünün PS yüzey üzerine bağlanma oranları incelenmiştir.
Şekil 4.54, 4.56 ve 4.58’de görüldüğü gibi önemli bir frekans değişimi (4-7 Hz)
gözlenmemiştir. İkinci kontrol deneyinde ise kristal yüzeyinde bulunan hücreler üzerine
ilaç içermeyen DMSO çözeltisi aynı hacimde eklenerek frekans değişimi
kaydedilmiştir. DMSO enjeksiyonuyla frekansta meydana gelen yaklaşık 10 Hz’lik
değişimin (Şekil 4.59), ilaç enjeksiyonu sonucu meydana gelen frekans değişimleri
(Şekil 4.53, 4.55 ve 4.57) ile kıyaslandığında; DMSO’nun eklenen miktarının hücreler
üzerine önemli bir derecede etkisinin olmadığı belirlenmiştir.
Sonuç olarak, kuartz kristal mikrobalans sisteminin, mezenkimal kök hücrelerinin farklı
yüzeylere bağlanmasının ve anti-mikrotübül ilaçlarına verdikleri cevapların eş zamanlı
görüntülenmesi için uygun bir sistem olduğu görülmüştür. Yukarıdaki verilerle
desteklenen bu yaklaşım, yeni ilaçların kemoterapötik aktivitelerinin farklı hücre türleri
üzerine etkilerinin eş zamanlı olarak incelenebilmesine olanak sağlamaktadır. Ayrıca,
integrinler, hücre iskeleti ya da hücre dışı matrikse bağlanarak etki gösteren bazı
moleküllerin (ilaçlar, proteinler, büyüme faktörleri gibi…) hücrelerle etkileşiminin,
geliştirilen bu biyosensör ile analizinin mümkün olabileceği düşünülmektedir.
115
KAYNAKLAR
Babacan, S., Pivarnik, P., Letcher, S. and Rand, A.G. 2000. Evaluation of antibody
immobilization methods for piezoelectric biosensor application. Biosensor&
Bioelectronics, Vol. 15, pp 615-621.
Ben-Chetrit, E., Bergmann S. and Sood R. 2006. Mechanism of the anti-inflamatory
effect of colchicine in rheumatic disease:a possible new outlook through
microarray analysis. Rheumatology, Vol. 45, pp 274–282.
Braunhut, S.J., McIntosh, D., Vorotnikova, E., Zhou, T. and Marx, K.A. 2005.
Detection of apoptosis and drug resistance of human breast cancer cells to
taxane treatments using quartz crystal microbalance biosensor technology.
ASSAY and Drug Development Technologies, Vol. 3, pp 77-88.
Bunde, R.L., Jarvi, E.J. and Rosentreter, J.J. 1998. Piezoelectric quartz crystal
biosensors. Talanta, Vol. 46, pp 1223-1236.
Chaki, N.K., Aslam, M., Sharma J. and Vijayamohanan K. 2001. Applications of self-
assembled monolayers in materials chemistry. Proc. Indian Acad. Sci.
(Chem. Sci.), Vol. 113, pp 659–670.
Chang, M.S. and Shih, J.S. 2000. Fullerene-cryptand-coated piezoelectric crystal
membrane glucose enzyme sensor. Sensors and Actuators B, Vol. 67, pp
275-281.
Chao, Y.C. and Shih, J. S. 1998. Adsorption study of organic molecules on fullerene
with piezoelectric crystal detection system. Analytica Chimica Acta, Vol.
374, pp 39-46.
Checchi, P.M., Nettles, J.H., Zhou, J., Snyder, J.P. and Joshi, H.C. 2003. Microtubule-
interacting drugs for cancer treatment. Trends in Pharmacological Sciences,
Vol. 24, pp 361-365.
Chou, S.F., Hsu, W.L., Hwang, J.M. and Chen, C.Y. 2002. Determination of α-
Fetoprotein in human serum by a quartz crystal microbalance-based
immunosensor. Automation and Analitical Techniques, 48:6, pp 913-918.
116
Chuang, C.W. and Shih, J.S. 2001. Preparation and application of immobilized C60-
glucose oxidase enzyme in fullerene C60-coated piezoelectric quartz crystal
glucose sensor. Sensors and Actuators B, Vol. 81, pp 1-8.
Curtis, A.S.G., Forrester, J.V., Mclnnes, C. and Lawrie, F. 1983. Adhesion of Cells to
Polystyrene Surfaces. The Journal of Cell Biology, Vol. 97, pp 1500-1506.
Darka, Ö. 2003. Hücre Adezyon Molekülleri ve Enflamasyondaki Rolleri. T Klin
Mikrobiyoloji Enfeksiyon, Vol. 2, pp 36-43.
Ding, B., Kima, J., Miyazaki, Y. and Shiratori, S. 2004. Electrospun nanofibrous
membranes coated quartz crystal microbalance as gas sensor for NH3
detection. J. Sens. Actuators B, Vol. 101, pp 373–380.
Drukman, S. and Kavallaris, M. 2002. Microtubule alterations and resistance to tubulin-
binding agents. Int. J. Oncol. Vol. 21, pp 621–628.
Ergüler, G., Demir, N. and Demir, R. 2002. Structural properties and functions of
adhesion molecules. T Klin J Med Sci., Vol. 22, pp 313-327.
Faccio, M., Feri G., Mancini, F. and Di Rosa, P. 1995. Resonating quartz
sensors.Sensors for Domestic Applications. Eds. D’Amico A. And
Sberveglieri G., WSP, Italy, pp.71-86.
Flack, W., Soong, D., Bell, A. and Hess, D. 1984. A mathematical model for spin
coating polymer resists. J. Appl. Phys., Vol. 56, pp 1199.
Fohlerová, Z., Skládal, P. and Turánek, J. 2007. Adhesion of eukaryotic cell lines on the
gold surface modified with extracellular matrix proteins monitored by the
piezoelectric sensor. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, pp 1896–1901.
Fredriksson, C., Khilman, S., Kasemo, B. and Steel, D.M. 1998. In vitro real-time
characterization of cell attachment and spreading. J Mater Sci Mater Med.
9(12), pp 785-788.
Fredriksson, C., Kihlman, S., Rodahl, M. and Kasemo, B. 1998. The Piezoelectric
Quartz Crystal Mass and Dissipation Sensor: A Means of Studying Cell
Adhesion. Langmuir, Vol. 14, pp 248-251.
117
Frey, B.L. and Corn, R.M. 1996. Covalent attachment and derivatization of poly(l-
lysine) monolayers on gold surfaces as characterized by
polarizationmodulation FT-IR spectroscopy. Anal Chem, Vol. 68, pp 3187–
3193.
Ganesh, V., Pal, S.K., Kumar, S. and Lakshminarayanan, V. 2006. Self-assembled
monolayers (SAMs) of alkoxycyanobiphenyl thiols on gold—A study of
electron transfer reaction using cyclic voltammetry and electrochemical
impedance spectroscopy. Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 296,
pp 195–203.
Gryte, D.M., Ward, M.D., and Hu, W.S. 1993. Real-Time Measurement of Anchorage-
Dependent Cell Adhesion Using a Quartz Crystal Microbalance, Biotechnol.
Prog., Vol. 9, pp 105-108.
Guillou-Buffello, D.L., Helary, G., Gindre, M., Pavon-Djavid, G., Laugier, P. and
Migonney, V. 2005. Monitoring cell adhesion processes on bioactive
polymers with the quartz crystal resonator technique. Biomaterials, Vol. 26,
pp 4197–4205.
Huang, Z.M,, Zhang, Y.Z., Kotaki, M. and Ramakrishna, S. 2003. A review on polymer
nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.
Composites Science and Technology, Vol. 63, pp 2223–2253.
Huang, Z.M., Zhang, Y.Z., Kotaki, M. and Ramakrishna, S. 2003. Composites Science
and Technology, Vol. 63, pp 2223–2253.
İnanç, B., Arslan, Y.E., Şeker, Ş., Elçin, A.E. and Elçin, Y.M. 2009. Periodontal
ligament cellular structures engineered with electrospun poly(DL-lactide-
co-glycolide) nanofibrous membrane scaffolds. J Biomed Mater Res A, Vol.
90,pp 186-195.
Janshoff, A., Galla, H.-J. And Steinem, C. 2000. Piezoelectric Mass-Sensing Devices as
Biosensors-An Alternative to Optical Biosensors? Angew. Chem., Int. Ed.
Engl. Vol. 39, pp 4004–4032.
118
Jia, X., Tan, L., Xie, Q., Zhang, Y. and Yao, S. 2008. Quartz crystal microbalance and
electrochemical cytosensing on a chitosan/multiwalled carbon nanotubes/Au
electrode. Sensors and Actuators B, Vol. 134, pp 273–280.
Jordan, M.A. and Wilson, L. 2004. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature
Reviews/Cancer, Vol. 4, pp 253-265.
Kanazawa, K.K. and Gordon II, J.G. 1985. Frequency of a quartz microbalance in
contact with liquid. Anal. Chem., Vol. 57, pp 1770–1771.
Kars, M., İşeri, Ö., Arpacı, F. ve Gündüz, U. 2009. Meme kanseri MCF-7 hücre
hattında paklitaksel ve vinkristin’e karşı gelişmiş çoklu ilaç direnci
mekanizmalarının mikrodizin analizi ile belirlenmesi. Türk Onkoloji
Dergisi, 24(4), pp 153-158.
Kavallaris, M. 2010. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nature
Reviews Cancer, Vol. 10, pp 194-204.
Khraiche, L.M., Zhou, A. and Muthuswamy, J. 2005. Acoustic sensor for monitoring
adhesion of Neuro-2A cells in real-time. Journal of Neuroscience Methods,
Vol. 144, pp 1–10.
Lippmann, G., 1881. Principe de conservation de l'électricité, Annales de Physique et de
Chimie, 5a Serie 24: pp145-178.
Lord, M.S., Modin, C., Foss, M., Duch, M., Simmons, A., Pedersen, F.S., Milthorpe,
B.K. and Besenbacher, F. 2006. Monitoring cell adhesion on tantalum and
oxidised polystyrene using a quartz crystal microbalance with dissipation.
Biomaterials, Vol. 27, pp 4529–4537.
Love, J.C., Estroff, L.A., , Kriebel, J.K., Nuzzo, R.G.and Whitesides, G.M. 2005. Self-
Assembled Monolayers of Thiolates on Metals as a Form of Nanotechnology.
Chem. Rev., Vol. 105, pp 1103-1169.
Lucklum, R. and Hauptmann, P. 2000. The quartz crystal microbalance: Mass
sensitivity, viscoelasticity and acoustic amplication. J. Sens. Actuators B,
Vol. 70, pp 30-36.
119
Mannelli, I., Minunni, M., Tombelli, S. and Mascini, M. 2003. Quartz crystal
microbalance (QCM) affinity biosensor for genetically modified organism
(GMOs) detection. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 18, pp 129-140.
Maoz, R. and Sagiv, J. 1987. Penetration-controlled reactions in organized monolayer
assemblies. 1. Aqueous permanganate interaction with monolayer and
multilayer films of long-chain surfactants. Langmuir, 3(6), pp 1034-1044.
Marx, K.A, Zhou, T., McIntosh, D. and Braunhut, S.J. 2009. Electropolymerized
tyrosine-based thin films: Selective cell binding via peptide recognition to
novel electropolymerized biomimetic tyrosine RGDY films. Analytical
Biochemistry, Vol. 384, pp 86–95.
Marx, K.A. 2003. Quartz Crystal Microbalance: A Useful Tool for Studying Thin
Polymer Films and Complex Biomolecular Systems at the Solution-Surface
Interface, Biomacromolecules, Vol. 4, No. 5, pp 1099-1120.
Marx, K.A., Zhou, T., Montrone, A., McIntosh, D. and Braunhut, S.J. 2007. A
comparative study of the cytoskeleton binding drugs nocodazole and taxol
with a mammalian cell quartz crystal microbalance biosensor: Different
dynamic responses and energy dissipation effects. Analytical Biochemistry,
Vol. 361, pp 77–92.
Marx, K.A., Zhou, T., Montrone, A., Schulze, H. and Braunhut, S.J. 2001. A quartz
crystal microbalance cell biosensor: detection of microtubule alterations in
living cells at nM nocodazole concentrations. Biosensors & Bioelectronics,
Vol. 16, pp 773–782.
Marx, K.A., Zhou, T., Warren, M. and Braunhut, S.J. 2003. Quartz crystal microbalance
study of endothelial cell number dependent differences in initial adhesion
and steady state gehavior: evidence for cell–cell cooperativity in initial
adhesion and spreading. Biotechnol. Prog., Vol. 19, pp 987–999.
Marxer, C.G., Coen, M.C., Greber, T., Greber, U.F. and Schlapbach, L. 2003. Cell
spreading on quartz crystal microbalance elicits positive frequency shifts
indicative of viscosity changes, Anal Bioanal Chem, Vol. 377, pp 578–586.
120
Minunni, M., Tombelli, S., Scielzi, R., Mannelli, I., Macsini, M. and Gaudiano, C.
2003. Detection of β-Thalassemia by a DNA piezoelectric biosensor
coupled with polymerase chain reaction. Analytica Chimica Acta, Vol. 481,
pp 55-64.
Modin, C., Stranne, A.L., Foss, M., Duch, M., Justesen, J., Chevallier, J., Andersen,
L.K., Hemmersam, A.G., Pedersen, F.S. and Besenbacher, F., 2006. QCM-
D studies of attachment and differential spreading of pre-osteoblastic cells
on Ta and Cr surfaces. Biomaterials, Vol. 27, pp 1346–1354.
Nnávrátilová, I., Skládal, P. and Viklický, V. 2001. Development of piezoelectric
immunosensors for measurement of albuminuria. Talanta, Vol. 55, pp 831-
839.
O’Sullivan, C.K. and Guilbault, G.G. 1999. Commercial quartz crystal microbalances –
theory and applications. Biosensors & Bioelectronics, Vol. 14, pp 663–670.
Redepenning, J., Schlesinger T.K., Mechalke E.J., Puleo, D.A. and Bizios R. 1993.
Osteoblast Attachment Monitored with a Quartz Crystal Microbalance.
Anal. Chem., Vol. 65, pp 3378-3381.
Sauerbrey, G. 1959. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for
microweighing. Z. Phys., Vol. 155, pp 206-222.
Shih, J.S., Chao, Y.C., Sung, M.F., Gau, G.J. and Chiou, C.S. 2001. Piezoelectric
crystal membrane chemical sensors based on fulleren C60. Sensors and
Actuators B, Vol. 76, pp 374-353.
Su, C.C., Wu, T.Z., Chen, L.K., Yang, H.H. and Tai, D.F. 2003. Development of
immunochips for the detection of dengue viral antigens. Analytica Chimica
Acta, Vol. 479, pp 117-123.
Şeker, Ş., Arslan, Y.E. and Elçin, Y.M. 2010. Electrospun Nanofibrous
PLGA/Fullerene-C60 Coated Quartz Crystal Microbalance for Real-Time
Gluconic Acid Monitoring. IEEE Sensors Journal, Vol. 10, pp 1342-1348.
121
Tanaka, M., Mochizuki, A., Motomura, T., Shimura, K., Onishi, M. and Okahata, Y.
2001. In situ studies on protein adsorption onto a poly(2-
methoxyethylacrylate) surface by a quartz crystal microbalance. Colloids
and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, Vol. 193, pp
145-152.
Tombelli, S., Macsini, M. and Turner, A.P.F. 2002. Improved procedures for
immobilisation of oligonucleotides on gold-coated piezoelectric quartz
crystals. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 17, pp 929-936.
Vaughan, R.D., O’Ssullivan, C.K. and Guilbault, G.G. 2001. Development of a quartz
crystal microbalance (QCM) immunosensor for the detection of Listeria
monocytogenes. Enzyme and Microbial Technology, Vol. 29, pp 635-638.
Ward, M.D. 1995. Principles and applications of the electrochemical quartz crystal
microbalance, in: I. Rubenstein (Ed.), Physical Electrochemistry: Principles,
Methods and Applications, Marcel Dekker, Inc., NewYork, pp 293–338.
Wegener, J., Seebach, J., Janshoff, A. and Galla, H.J. 2000. Analysis of the Composite
Response of Shear Wave Resonators to the Attachment of Mammalian
Cells. Biophysical Journal, Vol. 78, pp 2821–2833.
Wei, L.F. and Shih, J.S. 2000. Fullerene-cryptand coated piezoelectric crystal urea
sensor based on urease. Analytica Chimica Acta, Vol. 437, pp 77-85.
Xi, B., Yu, N., Wang, X., Xu, X. and Abassi, Y.A. 2008. The application of cell-based
label-free technology in drug discovery. Biotechnolology Journal, Vol. 3, pp
484–495.
Zhou, X., Liu, L., Hu, M., Wang, L. and Hu, J. 2002. Detection of hepatitis B virus by
piezoelectric biosensor. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
Vol. 27, pp 341-345.
122
EKLER
EK 1 Kaplama işlemlerinde kullanılan polimerlerin molekül yapıları
EK 2 Kaplamaların neden olduğu frekans değişimleri
123
EK 1 Kaplama işlemlerinde kullanılan polimerlerin molekül yapıları
PLGA (http://www.unisa.edu.au/)
PCL (www.polysciences.com)
PS (www.wikilib.com)
Kitosan (www.gmp-chitosan.com)
Hyalüronik asit (www.madsci.org/posts)
Kollajen (http://chempolymerproject.wikispace.com)
Alginat (www.sigmaaldrich.com)
PLL (www.ichemistry.cn/structure)
124
EK 2 Kaplamaların neden olduğu frekans değişimleri
11-MUA 2-Merkaptoetanol F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7990635 7990526 109 7979708 7979653 55 7984332 7984206 126 7983925 7983863 62 7992564 7992446 118 7987109 7987029 80 7987520 7987425 95 7981197 7981124 73 7988892 7988787 105 7984567 7984502 65
2-Merkaptoetilamin PLGA nanolif F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7999876 7999826 50 7986072 7985937 135 7985643 7985571 72 7984252 7983992 260 7990456 7990391 65 7989689 7989402 287 7984590 7984530 60 7982942 7982801 141 7989834 7989764 70 7982988 7982679 309
PLGA membran PCL F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7979057 7976816 2241 7991253 7987909 3344 7980535 7978082 2453 7981487 7977425 4062 7983172 7981966 1206 7984479 7981068 3411 7983567 7981955 1612 7987685 7984109 3576 7983542 7980858 2684 7980285 7976950 3335
PS Kitosan F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7984516 7979563 4953 7980473 7975250 5223 7991130 7986440 4690 7976543 7968574 7969 7987032 7982309 4723 7984563 7978087 6476 7987332 7982452 4880 7984398 7980291 4107 7981712 7976824 4888 7983298 7975123 8175
Hyalüronik asit Kollajen F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7982705 7977424 5281 7981434 7977858 3576 7982834 7981433 1401 7979597 7974845 4752 7977750 7972586 5164 7976654 7975031 1623 7984972 7978462 6510 7975723 7967896 7827 7975518 7968888 6630 7970747 7962624 8123
Alginat PLL F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7980421 7971480 8941 7986578 7982366 4212 7979532 7977333 2199 7992365 7989985 2380 7985443 7976603 8840 7994094 7992444 1650 7981348 7978948 2400 7985609 7984383 1226 7979717 7974247 5470 7993429 7991545 1884
125
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı : Şükran ŞEKER
Doğum Yeri : Ankara
Doğum Tarihi: 08.02.1981
Medeni Hali : Bekar
Yabancı Dili : İngilizce
Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)
Lise : Dikmen Lisesi, (1998).
Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü, (2003).
Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya (Biyokimya)
Anabilim Dalı, (2005).
Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl
Kimyager: Ankara Üniversitesi Kök Hücre Enstitüsü (Şubat 2011’den itibaren).
Araştırma Görevlisi: Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü
Biyokimya Anabilim Dalı (2005-2011).
SCI KAPSAMINDAKİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA MAKALELERİ
B. Inanç, Y.E. Arslan, Ş. Şeker, A.E. Elçin, Y.M. Elçin., “Periodontal ligament cellular
structures engineered with electrospun poly(DL-lactide-co-glycolide) nanofibrous
membrane scaffolds”, J Biomed Mater Res A. 2009 Jul;90(1):186-95.
Ş. Şeker, Y.E. Arslan, and Y.M. Elçin, “Electrospun Nanofibrous PLGA/Fullerene-C60
Coated Quartz Crystal Microbalance for Real-Time Gluconic Acid Monitoring”, IEEE
Sensors Journal, 2010 (10): 1342-1348.