Embed Size (px)
Citation preview
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
MİKROBİYEL LİPİTLERİN BİYODİZEL ÜRETİMİNDE KULLANIM
KAPASİTELERİNİN BELİRLENMESİ
Sevgi ERTUĞRUL KARATAY
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2010
Her hakkı saklıdır
i
ÖZET
Doktora Tezi
MİKROBİYEL LİPİTLERİN BİYODİZEL ÜRETİMİNDE KULLANIM KAPASİTELERİNİN BELİRLENMESİ
Sevgi ERTUĞRUL KARATAY
Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ
Tez çalışmasında on üç adet maya, dört adet filamentli fungus ve beş adet termofil siyanobaktari izolatının hücre içi lipit biriktirme kapasiteleri belirlenerek, biyodizel üretiminde kullanım potansiyeline sahip üç adet maya (Candida tropicalis, Candida lypolitica, Rhodotorula mucilaginosa), bir adet filamentli fungus (Aspergillus versicolor) ve üç adet termofil siyanobakteri türü (Synechococcus sp., Cyanobacterium aponinum, Phormidium sp.) seçilmiştir. Seçilen mikroorganizmaların yüksek kapasite ile hücre içi lipit biriktirdiği koşullar belirlenerek bu lipitlerin alkali katalizörle transesterifikasyonları sonucu oluşan metil ester dönüşüm verimleri gaz kromatografisinde hesaplanmıştır. Mayaların ve filamentli fungusların hücre içi lipit birikim kapasiteleri melaslı besiyerinde, siyanobakterilerin hücre içi lipit birikim kapasiteleri ise azot içeren BG-11 besiyerinde kesikli sistem ile belirlenmiştir. Mikroorganizmaların en yüksek seviyede lipit biriktirdiği koşulların bulunması amacıyla pH, karbon çeşidi ve miktarı, azot çeşidi ve miktarı ve inkübasyon süresi için optimum değerler bulunmuştur. C. lypolitica, C. tropicalis, R. mucilaginosa hücreleri, inkübasyon süresinin dördüncü gününde,1 g/L (NH4)2SO4 ve %8 ml melas çözeltisi içeren pH değeri 5’e ayarlanmış besiyerinde en yüksek lipit konsantrasyonuna ulaşmışlardır. En yüksek hücre içi lipit içerikleri ve C16 ve C18 metil ester verimleri C. lipolytica hücreleri için %59.9 ve %84.9, C. tropicalis hücreleri için %46.8 ve %92.3, R. mucilaginosa hücreleri için %69.5 ve %92.3 olarak bulunmuştur. A. versicolor hücreleri ise; 1.0 g/L KNO3, %6 melas çözeltisi içeren pH değeri 4’e ayarlanmış besiyerinde inkübasyon süresinin onuncu gününde %22.8 lipit içeriğine ulaşmıştır. Fungal lipitin %17.2’sini C16, %82.8’ini ise C18 oluşturmaktadır. Synechococcus sp., C. aponinum ve Phormidium sp. hücrelerinin hücre içi lipit oranları 0.25 g/L NaNO3 içeren pH değeri Synechococcus sp. için 7’ye, C. aponinum için 8’e, ve Phormidium sp. için 9’a ayarlanmış BG-11 besiyerlerinde inkübasyon süresinin 15. gününde belirlenmiştir. En yüksek hücre içi lipit içerikleri ve C16 ve C18 metil ester verimleri Synechococcus sp. için %42.8 ve %46.9, C. aponinum için %45.0 ve %67.7, Phormidium sp. için %38.2 ve %90.6 olarak bulunmuştur. Çalışmada kullanılan mikroorganizma lipitlerinin çoğunluğunu C16 ve C18 metil esterlerinin oluşturması, bunların biyodizel üretiminde hammadde olarak kullanılabilirliğini göstermektedir.
Haziran 2010, 110 sayfa
Anahtar Kelimeler: Mikrobiyel lipit, Biyodizel, Lipit birikimi
ii
ABSTRACT
Ph. D. Thesis
DETERMINATION OF THE MICROBIAL LIPID USAGE IN BIODIESEL PRODUCTION
Sevgi ERTUĞRUL KARATAY
Ankara University Graduate School of Naturel and Applied Sciences
Department of Biology
Supervisor: Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ
In the study, the lipid accumulation properties of thirteen yeast, four fungi ve five thermophyl cyanobacteria isolates were determined. Of these microorganisms Candida tropicalis, Candida lypolitica, Rhodotorula mucilaginosa, Aspergillus versicolor, Synechococcus sp., Cyanobacterium aponinum, Phormidium sp. were selected to evaluate biodiesel production capacities. The optimum conditions for the highest lipid production were determined and the extracted lipids were transesterified by an alkali catalyst. Gas Chromatograph was used to determine the methyl ester yields. The lipid accumulation properties of the yeast and fungal cells were determined in molasses medium, whereas BG-11 medium was used for the lipid accumulation properties of cyanobacteria in a batch system. In order to determine the optimum conditions for the highest lipid accumulation, pH, incubation time, different carbon and nitrogen sources and amounts were examined Candida lipolytica, Candida tropicalis, Rhodotorula mucilaginosa cells reached their maximum lipid accumulation in the media 1 g/L (NH4)2SO4 and 8% molasses solution at pH 5 after four days incubation time. The maximum lipid contents and C16 and C18 methyl ester yields were measured as 59.9% and 84.9% for C. lypolitica, 46.8% and 93.2% for C. tropicalis, 69.5% and 92.3% for R. mucilaginosa. A. versicolor fungal pellets were reached their maximum lipid content as 22.8% in the media containing 1.0 g/L KNO3 and 6% molasses solution at pH 4 after ten days incubation time. The fungal lipid contains C16 methyl ester as 17.2% and C18 methyl ester as 82.8%.
The lipid concentrations of Synechococcus sp., Cyanobacterium aponinum and Phormidium sp. were determined in the BG-11 media containing 0.25 g/L NaNO3 and pH values of the media was 7 for Synechococcus sp., 8 for Cyanobacterium aponinum and 9 for Phormidium sp. the fifteenth incubation time. The maximum lipid contents and C16 and C18 methyl ester yields were measured for Synechococcus sp. as 42.8% and 46.9%, for Cyanobacterium aponinum as 45.0 % and 67.7%, for Phormidium sp. as 38.2% and 90.6%, respectively. The composition of the lipids of the microorganisms that were used in the thesis showed that they are favourable feedstocks for biodiesel production. June 2010, 110 pages
Key Words: Single cell oil, Biodiesel, Lipid accumulation
iii
TEŞEKKÜR
Tez çalışmamın her aşamasında yakın ilgi ve desteğini gördüğüm, çalışmalarımın yönlendirilmesi ve sonuçlandırılmasında çok büyük emeği geçen ve aynı zamanda kendimi geliştirmem için beni sürekli teşvik eden, her konuda destekleyen ve yönlendiren tez danışmanım Sayın Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ’e (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı), tezimin hazırlanması sırasında her türlü olanağı sağlayan Ankara Üniversitesi Biyoloji Bölümü’ne, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne, çalışmalarım sırasında beni maddi olarak destekleyen TÜBİTAK BİDEB’e, deneylerim sırasında yardım ve desteğini gördüğüm bütün laboratuvar arkadaşlarıma, her konuda ve her zaman desteklerini aldığım ve tezimin hazırlandığı sürede gösterdikleri sabır, ilgi ve hoşgörüden dolayı anneme, babama, eşime ve kardeşime sonsuz şükran ve teşekkürlerimi sunarım.
Sevgi ERTUĞRUL KARATAY
Ankara, Haziran 2010
iv
İÇİNDEKİLER
ÖZET ................................................................................................................................. i ABSTRACT ..................................................................................................................... ii TEŞEKKÜR ................................................................................................................... iii ŞEKİLLER DİZİNİ ....................................................................................................... vi ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................... viii 1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ............................................................................................... 3 2.1 Biyodizel ve Üretimi .................................................................................................. 3 2.2 Triaçilgliserollere Uygulanan Kimyasal Modifikasyonlar .................................... 3 2.2.1 Transesterifikasyonu etkileyen faktörler ............................................................. 6 2.3 Biyodizel Üretiminde Kullanılan Hammaddeler ................................................. 12 2.3.1 Bitkisel yağların biyodizel üretiminde kullanımı .............................................. 12 2.3.2 Hayvansal yağların biyodizel üretiminde kullanımı ......................................... 13 2.3.3 Atık yağların biyodizel üretiminde kullanımı ................................................... 13 2.3.4 Mikrobiyel yağların biyodizel üretiminde kullanımı ........................................ 14 2.4 Biyodizel Üretiminde Kullanılan Mikroorganizmalar ........................................ 15 2.4.1 Bakteriler .............................................................................................................. 15 2.4.2 Funguslar .............................................................................................................. 16 2.4.3 Mikroalgler ........................................................................................................... 16 2.5 Mikroorganizmalarda Lipit Biyosentezi ............................................................... 17 2.6 Hammaddenin Yağ Asidi Dağılımı ve Biyodizelin Yakıt Kalitesi ...................... 19 2.7 Biyodizelin Depolanması ........................................................................................ 25 2.8 Fungal Lipitlerin Hammadde Olarak Kullanıldığı Çalışmalar .......................... 25 2.9 Mikroalg Lipitlerinin Hammadde Olarak Kullanıldığı Çalışmalar .................. 29 2.10 Tez Çalışmasında Kullanılan Mikroorganizmalar…………………………….35 2.10.1 Funguslar……………………………………………………………………….35 2.10.2 Mikroalgler…………………………………………………………………......36 3. MATERYAL ve YÖNTEM ...................................................................................... 38 3.1 Materyal ................................................................................................................... 38 3.1.1 Mikroorganizma kaynağı .................................................................................... 38 3.2 Yöntem ..................................................................................................................... 38 3.2.1 Saf kültürlerin eldesi ............................................................................................ 38 3.2.2 Saf kültürlerin tanılamaları ................................................................................ 40 3.2.3 Yüksek kapasite ile lipit üreten mikroorganizma seçimi ................................. 40 3.2.4 Mikrobiyel lipit üretimi için optimum koşulların belirlenmesi ....................... 42 3.2.5 Transesterifikasyon reaksiyonu .......................................................................... 44 3.2.6 Analiz yöntemleri ................................................................................................. 45 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ................................................................................... 49 4.1 İzolasyon ve Tanılama ............................................................................................ 49 4.2 Besiyeri Bileşimlerinin Belirlenmesi ...................................................................... 49 4.3 Maya Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması .................. 50 4.3.1 Yüksek kapasitede lipit üreten maya hücrelerinin seçimi ............................... 50 4.3.2 Maya hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine ortam pH’ının
etkisinin belirlenmesi .......................................................................................... 52
v
4.3.3 Maya hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine azot miktarının etkisinin belirlenmesi .......................................................................................... 53
4.3.4 Maya hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine karbon miktarının etkisinin belirlenmesi .......................................................................................... 50
4.3.5 Maya hücrelerinin gelişimine ve lipit üretimine inkübasyon süresinin etkisinin belirlenmesi .......................................................................................... 56
4.3.6 Maya hücrelerindeki lipitlerin yağ asidi metil esteri dağılımları .................... 60 4.4 Fungus Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması ............... 63 4.4.1 Yüksek kapasitede lipit üreten fungus hücrelerinin seçimi ............................. 63 4.4.2 A. versicolor hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine ortam pH’ının
etkisinin belirlenmesi .......................................................................................... 64 4.4.3 Farklı azot kaynaklarının fungal lipit birikimine etkisi ................................... 65 4.4.4. A. versicolor hücrelerinin lipit biriktirme kapasiteleri üzerine azot ve
karbon miktarının etkisinin belirlenmesi ......................................................... 66 4.4.5 Fungal hücrelerin lipit birikimine inkübasyon süresinin etkisinin
belirlenmesi .......................................................................................................... 67 4.4.6 A. versicolor hücrelerindeki lipitlerin yağ asidi metil esteri dağılımları ......... 68 4.5 Mikroalg Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması ............ 70 4.5.1 Yüksek kapasitede lipit üreten mikroalg hücrelerinin seçimi ve bu
hücrelerin lipit biriktirme kapasitesi üzerine ortam pH’ının etkisinin belirlenmesi .......................................................................................................... 70
4.5.2 Mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine inkübasyon süresinin etkisinin belirlenmesi .......................................................................... 71
4.5.3 Mikroalg hücrelerinin gelişme ve lipit biriktirme kapasitesi üzerine azot miktarının etkisinin belirlenmesi ....................................................................... 72
4.5.4 Triakontanol hormonunun mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine etkisinin belirlenmesi ........................................................... 76
4.5.5 Triakontanol hormonu ve NaHCO3’ın mikroalg hücrelerinin lipit
biriktirme kapasitesi üzerine etkisinin belirlenmesi ........................................ 77 4.5.6 Mikroalg hücrelerindeki lipitlerin yağ asidi metil esteri dağılımları .............. 79 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ........................................................................................... 82 5.1 Fungus Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması ............... 82 5.1.1 Besiyerinin bileşimi .............................................................................................. 82 5.1.2 pH değeri etkisi ..................................................................................................... 86 5.1.3 Besiyerindeki karbon çeşidi ve miktarı .............................................................. 87 5.1.4 Besiyerindeki azot çeşidi ve miktarı ................................................................... 89 5.1.5 Biriktirilen lipitlerin yağ asidi dağılımları ......................................................... 90 5.2 Mikroalg Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması ............ 93 5.2.1 pH değeri etkisi ..................................................................................................... 93 5.2.2 Besiyerindeki karbon çeşidi ve miktarı .............................................................. 94 5.2.3 Besiyerindeki azot çeşidi ve miktarı ................................................................... 96 5.2.4 Biriktirilen lipitlerin yağ asidi dağılımları ......................................................... 98 KAYNAKLAR ............................................................................................................ 100 ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................. 109
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Transesterifikasyon reaksiyonunun genel denklemi .......................................... 5 Şekil 2.2 Alkali katalizör ile yapılan biyodizel üretiminin şematik gösterimi .................. 9 Şekil 2.3 Lipaz katalizi ile yapılan biyodizel üretiminin şematik gösterimi ................... 10 Şekil 2.4.a Hücre dışı, b. Hücre içi lipaz üretiminin karşılaştırılması ............................ 10 Şekil 4.1 Farklı glukoz konsantrasyonlarının maya hücrelerinin lipit biriktirme
kapasiteleri üzerine etkisi .............................................................................. 55 Şekil 4.2 C. lypolitica hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna
inkübasyon süresinin etkisi ........................................................................... 56 Şekil 4.3 C. lypolitica hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna 4
g/L glukoz içeren ortamda inkübasyon süresinin etkisi ................................ 57 Şekil 4.4 C. tropicalis hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna
inkübasyon süresinin etkisi ........................................................................... 58 Şekil 4.5 C. tropicalis hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna 4
g/L glukoz içeren ortamda inkübasyon süresinin etkisi ................................ 58 Şekil 4.6 R. mucilaginosa hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit
konsantrasyonuna inkübasyon süresinin etkisi ............................................. 59 Şekil 4.7 R. mucilaginosa hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit
konsantrasyonuna 4 g/L glukoz içeren ortamda inkübasyon süresinin etkisi .............................................................................................................. 59
Şekil 4.8 Candida lypolitica hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri ......................................................................... 61
Şekil 4.9 Candida tropicalis hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri ......................................................................... 61
Şekil 4.10 Rhodotorula mucilaginosa hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri ........................................ 62
Şekil 4.11 A. versicolor hücrelerinin lipit konsantrasyonuna besiyeri pH’ının etkisinin belirlenmesi .................................................................................... 64
Şekil 4.12 A. versicolor hücrelerinin lipit konsantrasyonuna inorganik azot kaynaklarının etkisinin belirlenmesi ............................................................. 65
Şekil 4.13 A. versicolor hücrelerinin lipit konsantrasyonuna organik azot kaynaklarının etkisinin belirlenmesi ............................................................. 66
Şekil 4.14 A. versicolor hücrelerinin içerdikleri lipit konsantrasyonuna inkübasyon süresinin etkisi ............................................................................................... 68
Şekil 4.15 Aspergillus versicolor hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri ........................................ 69
Şekil 4.16 Azot içeren BG 11 besiyerinde geliştirilen mikroalg hücrelerinin farklı pH değerlerinde gösterdikleri hücre gelişimleri .................................. 71
Şekil 4.17 Farklı miktarlarda azot içeren BG 11 besiyerinde geliştirilen Synechococcus sp. hücrelerinin gösterdikleri hücre gelişimleri ................... 73
Şekil 4.18 Farklı miktarlarda azot içeren BG 11 besiyerinde geliştirilen C.aponinum hücrelerinin gösterdikleri hücre gelişimleri.............................. 74
Şekil 4.19 Farklı miktarlarda azot içeren BG 11 besiyerinde geliştirilen Phormidium sp. hücrelerinin gösterdikleri hücre gelişimleri ........................ 75
Şekil 4.20 Mikroalg hücrelerinin gelişimlerine triakontanol etkisi ................................ 76
vii
Şekil 4.21 Synechococcus sp.hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri ......................................................................... 80
Şekil 4. 22 Cyanobacterium aponinum hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri ........................................ 80
Şekil 4.23 Phormidium sp. hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri ......................................................................... 81
viii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Alkali maddelerin ve enzimin katalizlediği transesterifikasyon reaksiyonlarının karşılaştırılması .................................................................. 11
Çizelge 2.2 ASTM biyodizel standardı ........................................................................... 21 Çizelge 2.3 EN 14214 biyodizel standardı ...................................................................... 22 Çizelge 2.4 EN 14213 biyodizel standardı ...................................................................... 23 Çizelge 2.5 Bazı bitkisel yağların ve dizel yakıtın fiziksel ve kimyasal özellikleri ....... 24 Çizelge 2.6 Tez çalışmasında kullanılan maya ve filamentli fungusların
sınıflandırılması ............................................................................................ 36 Çizelge 2.7 Tez çalışmasında kullanılan mikroalglerin sınıflandırılması ....................... 37 Çizelge 3.1 Tez çalışmasında kullanılan mikroorganizmalar ve kaynakları................... 39 Çizelge 4.1 Farklı besiyeri bileşimlerinin maya hücrelerinin lipit birikimi üzerine
etkisi …………………………………...…………………………………...50 Çizelge 4.2 Farklı maya türlerinin melaslı besiyerinde gelişimlerinin 2. ve 4.
günlerinde gösterdikleri lipit içerikleri.......................................................... 47 Çizelge 4.3 C.lipolytica, C.tropicalis ve R.mucilaginosa hücrelerinin lipit
konsantrasyonuna besiyeri pH’ının etkisinin belirlenmesi ........................... 52 Çizelge 4.4 C.lipolytica, C.tropicalis ve R.mucilaginosa hücrelerinin lipit
konsantrasyonuna başlangıç (NH4)2SO4 konsantrasyonunun etkisinin belirlenmesi ................................................................................................. 53
Çizelge 4.5 C.lipolytica, C.tropicalis ve R.mucilaginosa hücrelerinin lipit konsantrasyonuna başlangıç melas konsantrasyonunun etkisinin belirlenmesi ................................................................................................. 55
Çizelge 4.6 Melaslı besiyerinde geliştirilen C. lipolytica, C. tropicalis ve R. mucilaginosa hücrelerinin biriktirdikleri lipitlerin yağ asidi metil esteri dağılımları ..................................................................................................... 60
Çizelge 4.7 Farklı fungus türlerinin melaslı besiyerinde gelişimlerinin 10. günlerinde gösterdikleri lipit konsantrasyonları............................................ 63
Çizelge 4.8 Aspergillus versicolor hücrelerinin lipit konsantrasyonuna başlangıç KNO3 ve melas konsantrasyonlarının etkisi .................................................. 67
Çizelge 4.9 Melaslı besiyerinde geliştirilen A. versicolor hücrelerinin biriktirdiği lipitin yağ asidi metil esteri dağılımı………………………………………..69
Çizelge 4.10 Farklı mikroalg hücrelerinin lipit konsantrasyonuna ortam pH’ının etkisinin belirlenmesi .................................................................................... 70
Çizelge 4.11 Azot içeren BG 11 besiyerinde geliştirilen mikroalg hücrelerinin artan inkübasyon süresinde içerdikleri lipit miktarları........................................... 72
Çizelge 4.12 Synechococcus sp. hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine artan inkübasyon süresi ve azot miktarının etkisinin belirlenmesi ........................ 73
Çizelge 4.13 Cyanobacterium aponinum hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine artan inkübasyon süresi ve azot miktarının etkisinin belirlenmesi... 74
Çizelge 4.14 Phormidium sp. hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine artan inkübasyon süresi ve azot miktarının etkisinin belirlenmesi ........................ 75
Çizelge 4.15 Triakontanolün mikroalg hücrelerinin lipit üretimine (%) etkisi ............... 77 Çizelge 4. 16 Synechococcus sp. hücrelerinin gelişimleri ve lipit biriktirme
kapasiteleri üzerine triakontanol içeren ve içermeyen ortamlarda artan NaHCO3 etkisinin belirlenmesi ..................................................................... 78
ix
Çizelge 4.17 Cyanobacterium aponinum hücrelerinin gelişimleri ve lipit biriktirme kapasiteleri üzerine triakontanol içeren ve içermeyen ortamlarda artan NaHCO3 etkisinin belirlenmesi ..................................................................... 78
Çizelge 4.18 Phormidium sp. hücrelerinin gelişimleri ve lipit biriktirme kapasiteleri üzerine triakontanol içeren ve içermeyen ortamlarda artan NaHCO3
etkisinin belirlenmesi .................................................................................... 78 Çizelge 4.19 BG-11 besiyerinde geliştirilen mikroalg hücrelerinin biriktirdiği lipitin
yağ asidi metil esteri dağılımları ................................................................... 82
1
1. GİRİŞ
Günümüzde hızla gelişen sanayi ve artan özel tüketim ihtiyaçlarının karşılanmasına
yönelik enerji arzının önemli bir bölümü petrokimyasal ürünlerden sağlanmaktadır.
Petrol ve türev ürünlerinin sınırlı doğal kaynaklardan üretiliyor olması enerji talebinin
karşılanmasına yönelik bir takım farklı stratejiler geliştirilmesini mecbur kılmaktadır.
Yenilenebilir ve yüksek verimli enerji kavramı 21. yüzyılın alternatif enerji üretimi
konusundaki çalışmaların temelini oluşturmaktadır. Bu durum özellikle son zamanlarda
petrol temelli yakıtlarda görülen yüksek fiyat artışları ile daha da önemli hale gelmiştir.
Bu çalışmaların başında da biyodizelin içinde bulunduğu biyolojik materyalden
sağlanan yenilenebilir enerji kaynaklarının kullanımı gelmektedir.
Ticari olarak bitkisel yağlardan üretilen biyodizel, pek çok Avrupa ülkesinde 1988
yılından beri alternatif bir yakıt olarak kullanılmaktadır. Uzun zincirli yağ asitlerinin
transesterifikasyonu sonucunda oluşan metil esterleri olarak tanımlanan biyodizelin
avantajları arasında biyolojik olarak parçalanabilmesi ve petrodizel yakıtlarla
karşılaştırıldığında daha zararsız gaz emisyonları oluşturması sayılabilir. Fakat
biyodizel üretiminde kullanılan yağ hammaddesinin pahalı olması petrol türevli
yakıtlarla rekabet edemeyip pazarda hak ettiği yeri alamamasına neden olmaktadır.
Biyodizelin üretim maliyetini düşürebilmek için son yıllarda pek çok çalışma
yapılmıştır. Bu konuda yapılan bazı çalışmalar biyodizelin bitkisel yağlardan farklı
olarak mikrobiyel yağlardan da üretilebileceği gösterilmiştir. Biyodizelin günümüzde
kullanılan petrol temelli yakıtların yerini alabilmesi için ticari ölçekte üretilebilmesi,
petrol temelli yakıtlardan ucuz olması, yanma kalitesi bakımından günümüzde
kullandığımız yakıtlarla aynı standardı taşıması gerekmektedir. Bu amaçla yürütülen
araştırmalardan bazıları mikrobiyel lipitlerden biyodizel eldesi fikrini ortaya atmıştır.
Mikroorganizmalar bitkilere kıyasla; daha fazla lipit içermeleri, gelişim süreçlerinin
daha kolay olması, değişen mevsim ve iklim şartlarından etkilenmemeleri ve kısa
sürede çok miktarda üretilebilmeleri nedeniyle daha avantajlı olmaktadırlar.
2
Tüm canlılar zarları, yapısal ve fonksiyonel görevlerini yerine getirebilmek için lipit
sentezlemek zorundadır. Fakat az sayıda mikroorganizma lipitleri depo maddesi olarak
biriktirebilir. Yüksek lipit içeriğine sahip mikroorganizmalarda biriktirilen lipit daima
triaçilgliserol formundadır. Genellikle bakteriler triaçilgliserol üretmezler, bunun yerine
poli beta hidroksi bütirat ve alkanoat depo etmektedirler. Bu sebeple lipit biriktirme
özelliği sadece bazı maya, fungus ve mikroalglerde görülmektedir. Bu özelliği taşıyan
mikroorganizmalara “yağlı mikroorganizmalar” denmektedir.
Gerçekleştirilen bu tez çalışması kapsamında, maya, fungus ve daha önce literatür
çalışmalarında yer almayan termofil özellikteki mikroalglerin lipit üretim kapasiteleri,
biyodizele hammadde olması bakımından ilk defa çalışılmıştır. Bu mikroorganizmaların
en yüksek kapasitede lipit ürettiği deneysel koşullar (pH, inkübasyon süresi, farklı azot
ve karbon kaynakları, farklı azot ve karbon miktarları) tespit edilmiştir. Denenen her bir
mikroorganizmanın en yüksek kapasitede lipit ürettiği optimum şartlar kesikli kültür
sistemi ile belirlendikten sonra buradan elde edilen lipit alkali bir katalizör ile
transesterifikasyona uğratılmıştır. Transesterifikasyon reaksiyonu sonucunda oluşan
metil esterleri Gaz Kromatografi’de belirlenmiştir.
Gerçekleştirilen bu tez çalışması ile mikrobiyel lipitlerden biyodizel üretimi
teknolojisine önemli bir katkı sağlanacağı düşünülmektedir.
3
2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1 Biyodizel ve Üretimi
Biyodizel, bitkisel veya hayvansal yağların uzun zincirli yağ asitlerinin metil
esterlerinden oluşturulan ve “B100” şeklinde formüle edilen yakıt türüdür. Günümüzde
biyodizel yakıt özellikleri Amerika’da ASTM D6751, Avrupa ülkelerinde ise EN 14214
standardına göre belirlenmektedir (Knothe 2010).
Biyodizel, petrol dizellerle karşılaştırıldığında biyolojik olarak parçalanabilir, zehirsiz
özellikte ve daha düşük emisyon profiline sahiptir. Biyodizel kullanımı tarım, ekonomik
gelişme ve çevre arasında dengenin kurulmasını sağlamaktadır (Meher vd. 2006).
Günümüzde biyodizel petrol temelli dizel yakıtların yerini tamamen alamasa bile,
üretimini destekleyen birçok neden vardır. Bu nedenlerin başında bitkisel ve hayvansal
yağların üretimi için pazar oluşturması, ülkelerin petrol ithalatına olan bağımlılığını
azaltması, yenilenebilir özelliği ve kapalı karbon döngüsü sayesinde küresel ısınmaya
katkı sağlamaması, petrol temelli dizelle karşılaştırıldığında tüm CO2 emisyonunu 78%
oranında azaltması, karbon monoksit, yanmamış hidrokarbon ve tanecikli emisyon
çıkışının normal dizel yakıtından daha düşük olması gelmektedir. Bu özellikleri
sayesinde normal dizel yakıta %1–2 oranında biyodizel eklendiğinde, zayıf yağlama
özellikleri ile yakıtı modern ultra düşük sülfür dizel yakıtında olduğu gibi kabul
edilebilir yakıt haline dönüştürebilir. Buna karşın biyodizelin bir çok emisyon testi
nitrojen oksitlerin çok az miktarda da olsa arttığını göstermektedir (Gerpen 2005).
2.2 Triaçilgliserollere Uygulanan Kimyasal Modifikasyonlar
Bitkisel yağlar genellikle serbest yağ asitleri, fosfolipitler, steroller, su, odorantlar ve
diğer bileşikleri içermektedir. Bu yüzden yağ direk yakıt olarak kullanılamamaktadır
Dizel bir yakıtla kıyaslandığında bitkisel yağlar 10-20 kat daha yüksek bir viskoziteye
sahiptir (Meher vd. 2006). Dizel yakıtların yerine kullanılan triaçilgliserollerin yüksek
4
viskoziteye, düşük uçuculuğa ve çoklu doymamış yapıya sahip olmaları kullanımları
sırasında bazı problemlere sebep olmaktadır. Bitkisel yağların ve yağ atıklarının dizel
yakıtların performansına yaklaşabilmesi için sözkonusu bu triaçilgliserollere bazı
kimyasal modifikasyonların uygulanması gerekmektedir (Srivastava ve Prasad, 2000).
Bu gibi problemlerin çözülebilmesi için uygulanan kimyasal modifikasyonlar dilüsyon,
mikro-emülsifikasyon, piroliz ve transesterifikasyon olmak üzere 4 grupta
toplanabilmektedir (Demirbaş 2005).
Dilüsyon; triaçilgliserollerin dizel bir yakıt, etanol veya başka bir çözücü ile
seyreltilmesidir (Srivastava ve Prasad 2000).
Mikro-Emülsifikasyon; bitkisel yağların yüksek viskozite sorununu çözmek için
metanol, etanol ve 1-bütanol gibi solventlerle mikroemülsiyonları oluşturulmaktadır.
Mikroemülsiyonlar isotropik, saydam veya yarı saydam, yağ, su ve sürfaktantların
dağılmasında termodinamik olarak kararlı ve çoğunlukla “kosurfaktant” olarak
adlandırılan küçük amfifilik moleküllerdir (Fukuda vd. 2001).
Piroliz; Fukuda vd. (2001) gerçekleştirdikleri çalışmada piroliz işlemini hava veya
nitrojen püskürtmesi varlığında termal enerji uygulamak suretiyle yağların kimyasal
değişikliğe uğratılması şeklinde tanımlamışlardır. Çalışmada ayrıca, dizel makineler
için uygun ürünlerin elde edilmesi amacıyla triaçilgliserollerin pirolizi hakkında birçok
araştırma yapıldığı, yağ asitlerinin ısıya maruz bırakıldıklarında yapılarında önemli
değişiklikler olduğu vurgulanmıştır. Pirolize uğramış yağların saf bitkisel yağlarla
karşılaştırıldığında düşük viskoziteye ve yüksek setan numarasına sahip olması, bu
yağların, kabul edilebilir miktarlarda sülfür, su, sediment ve bakır korozyon değerlerine
sahipken; kül ve karbon kalıntısı bakımından tercih edilmemesi çalışmada belritilen
hususlar arasındadır. Tüm bunlara ek olarak aynı çalışmada, bu ürünlerin kimyasal
olarak petrol türevi olan gazolin ve dizel yakıtlara kimyasal olarak benzese de termal
süreç sırasında oksijenin uzaklaştırılması oksijenlenmiş yakıtın kullanımının sağladığı
çevresel faydayı yok etmiş olacağı belirtilmiştir.
5
Şekil 2.1 Transesterifikasyon reaksiyonunun genel denklemi
Transesterifikasyon; triaçilgliserollerin dizel yakıtların yerine kullanılabilmesi için
gereken kimyasal modifikasyonlar arasında en çok tercih edilen anahtar basamak
niteliğindeki yöntem transesterifikasyondur. Transesterifikasyon, triaçilgliserollerin
viskozitesinin düşürülmesinde ve böylelikle yenilenebilen yakıtların makine
performansını arttırmada fiziksel özelliklerinin geliştirilmesi amacıyla kullanılmaktadır
(Fukuda vd. 2001).
Transesterifikasyon reaksiyonu üç tane ardışık tersinir reaksiyondan oluşmaktadır. Bu
süreçte, triaçilgliserol; her bir basamakta 1 mol alkil esterinin oluştuğu adım adım
diaçilgliserol, monoaçilgliserol ve son olarak gliserole dönüştürülür (Helwani vd. 2009).
Diğer bir tanımla Şekil 2.1’de de görüldüğü gibi lipitlerde bulunan gliseritlerin bir
katalizör varlığında bir alkol ile reaksiyona girerek ester ve gliserol oluşturmasıdır.
Reaksiyonda kullanılan katalizör, reaksiyonun hızını ve verimini arttırmaktadır.
Transesterifikasyon reaksiyonu geri dönüşümlü bir reaksiyon olması nedeniyle, ortamda
bulunan aşırı alkol tepkimeyi ileri yön lehine çevirebilir. Bu amaçla kullanılan alkoller
genellikle 1 ve 8 arasında karbon atomuna sahip primer ve sekonder monohidrik alifatik
alkollerdir. Alkol olarak metanol, etanol, propanol, bütanol ve amil alkol
kullanılmaktadır. En çok kullanılan alkoller metil alkol ve etil alkoldür. Ticari
uygulamalarda sıklıkla tercih edilen alkol ise ucuz olmasından dolayı metil alkoldür
(Fukuda vd. 2001, Banerjee ve Chakraborty 2009).
Bu katalizörlere ek olarak mikrobiyel lipazlar da katalizör olarak kullanılabilmektedir
(Kaieda vd. 2001). Lipazlar (EC 3.1.1.3) hidroliz, alkoliz, esterifikasyon ve karboksilik
asitlerin transesterifikasyon reaksiyonlarını katalizleyen enzimler olarak bilinmektedir.
GliserolesteriasidiYağAlkoltTrigliseri
OHCHRCOORROOCCH
OHCHRCOOROHRROOCCH
Katalizör
OHCHRCOORROOCCH
−−−−−
−+−−⇔+−−
−−−−−
2'
332
'2
'2
2'
112
||
3
||
6
Bu enzimler biyodizel üretiminde rol alan esterifikasyon ve transesterifikasyon
reaksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılabilecek en iyi ve kararlı biyolojik
katalizörlerdir (Tan vd. 2010).
Banerjee ve Chakraborty (2009) yılında gerçekleştirdikleri çalışmada,
transesterifikasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra oluşan ürünlerin; ester karışımı,
gliserol, reaksiyona girmemiş alkol, katalizör ve tri, di, ve monoaçilgliseroller olduğu
belirtmişlerdir. Çalışmada monoaçilgliserollerin ester karışımında bulanıklığa sebep
olduğu, transesterifikasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra karışım oda sıcaklığına
getirildiğinde ester fazı ve gliserol fazı ayrıldığı ve gliserolün ağırlığından dolayı alt
fazda toplandığı ifade edilmiştir. Reaksiyonda yan ürün olarak oluşan gliserol ilaç, gıda
ve kozmetik endüstrilerinde kullanılmaktadır. Aynı çalışmada bir çok araştırmacının saf
ester elde etmenin zor olduğunu, esterlerin genellikle di, ve monoaçilgliserollerle
birlikte bulunduğunu belirttiği görülmektedir.
2.2.1 Transesterifikasyonu etkileyen faktörler
Transesterifikasyon reaksiyonunu etkileyen faktörler reaksiyon sıcaklığı, kullanılan
alkolün bitkisel yağa oranı, kullanılan katalizör tipi, miktarı ve çalkalama hızı olmak
üzere 4 ana başlık altında toplanabilmektedir (Meher vd. 2006, Banerjee ve Chakraborty
2009).
a) Reaksiyon sıcaklığı; Transesterifikasyon reaksiyonunu etkileyen önemli
parametrelerin başında sıcaklık gelmektedir (Banerjee ve Chakraborty 2009).
Transesterifikasyon kullanılan yağ çeşidine bağlı olarak farklı sıcaklıklarda
gerçekleşebilir. Yeterli süre verildiği takdirde reaksiyon oda sıcaklığında
gerçekleşebilmektedir. Yapılan birçok çalışmada reaksiyon sıcaklığı metanolün
kaynama sıcaklığına yakın noktada tutulmuştur. Eğer reaksiyon yüksek basınç (9000
KPa) ve yüksek sıcaklık (240 ºC) altında gerçekleşmemişse serbest yağ asitlerinin ön
işlemle ayrılması gerekmektedir. Sonuç olarak; transesterifikasyon reaksiyonu oda
sıcaklığından alkolün kaynama noktasına ve hatta daha fazlasına kadar olan sıcaklıklara
kadar değişebilmektedir. Kullanılan alkolün kaynama noktasına kadar olan sıcaklıklara
7
kadar diğer parametreler değiştirilmediği sürece sıcaklık biyodizel verimini olumlu
yönde etkilemektedir (Ma ve Hanna 1999, Banerjee ve Chakraborty 2009).
b) Kullanılan alkolün bitkisel yağa oranı; biyodizel oluşumunu etkileyen diğer bir
önemli faktör de kullanılan alkolün triaçilgliserole oranıdır. Teorik olarak
transesterifikasyon reaksiyonunun gerektirdiği sitokiyometrik oran 3 mol yağ asidi
esteri ve 1 mol gliserol oluşması için, 3 mol alkol ve 1 mol triaçilgliseroldür.
Transesterifikasyon reaksiyonunda kullanılan alkol miktarının arttırılması
triaçilgliserollerin kısa sürede esterlere dönüşümü ile sonuçlanır. Alkol: triaçilgliserol
oranının 3’ün üzerinde olması ile reaksiyon hızı maksimuma ulaşır. Ortama daha fazla
alkol eklenmesi verimi arttırmadığı gibi reaksiyon sonucunda alkolün geri kazanımını
zorlaştırmaktadır. Alkol: triaçilgliserol oranı kullanılan katalizörle de yakından
ilişkilidir. Alkali karakterde bir katalizörün transesterifikasyon reaksiyonunda
kullanılması durumunda genellikle bu oran 6:1 iken; kızartma yağı gibi fazla serbest
yağ asidi içeriğine sahip yağların asit karakterde bir katalizörle transesetrifikasyon
reaksiyonuna uğratılması durumunda oran 15:1 olarak değişebilmektedir. Soya yağının
transesterifikasyonunda katalizör olarak asit kullanılması durumunda 30:1 oranında
bütanol ve soya yağı gerekirken, alkali ile katalizlenen reaksiyonda aynı zamanda ve
aynı oranda ester elde edebilmek için 6:1 oranı gerekmektedir (Ma ve Hanna 1999,
Leung vd. 2010).
c) Kullanılan katalizör tipi ve miktarı; kullanılan katalizör türü hammadde olarak
kullanılan yağın çeşidine göre değişmektedir. Transesterifikasyonda kullanılan
katalizörler alkali, asit ve enzim olarak sınıflandırılmaktadır.
Baz ile katalizlenen transesterifikasyon: Alkali katalizör olarak sodyum hidroksit,
potasyum hidroksit, karbonatlar, sodyum metoksit, sodyum etoksit, sodyum propoksit,
sodyum bütoksit gibi sodyum potasyum alkoksitler kullanılabilmektedir. Genellikle
kullanılan katalizörler sodyum hidroksit ve potasyum hidroksittir. Bu katalizörlerin
yaygın olarak kullanılma nedenleri; düşük sıcaklık ve atmosferik basınçta reaksiyonu
katalizleyebilmeleri, kısa sürede yüksek dönüşüm verimi elde edilmesi, yaygın olarak
kullanılabilir ve ekonomik olmasıdır. Bunlara ek olarak asidik bir katalizörle
8
gerçekleştirilen reaksiyona göre 4000 kat daha hızlı olabilmektedir. Fakat bazik bir
katalizör ancak, serbest yağ içeriği %0.5’den az olan veya asit değeri 1 mg KOH/g olan
rafine bitkisel yağların transesterifikasyonunda kullanılabilmektedir.
Serbest yağ asidi gliserol omurgasından kesilmiş uzun karbon zinciri içermektedir.
Bazen karboksilik asit olarak isimlendirilebilirler. Eğer biyodizel üretiminde hammadde
olarak kullanılacak yağ, fazla miktarda oleik asit gibi serbest yağ asidi içeriyorsa alkali
katalizör sabun oluşturmak için serbest yağ asitleri ile reaksiyona girer ki, bu
istenmeyen bir durumdur. Çünkü bu durum transesterifikasyon reaksiyonunu
hızlandıran katalizörü deaktive edecektir. Buna ek olarak aşırı sabun oluşumu yağ asidi
metil esteri oluşum verimini düşürecek, biyodizelin saflaştırılma sürecini
zorlaştırılacaktır (Banerjee ve Chakraborty, 2009, Lam vd. 2010). Şekil 2.2’de alkali
özellikte bir katalizörle reaksiyonun nasıl gerçekleştirildiği şematize edilmiştir.
Asit ile katalizlenen transesterifikasyon: Genellikle kullanılan katalizörler sülfürik ve
hidroklorik asittir. Bazik katalizörlere göre iki önemli avantajı vardır; birincisi
hammaddede bulunan serbest yağ içeriğinden etkilenmez, ikincisi ise esterifikasyon ve
transesterifikasyon reaksiyonlarını birlikte katalizleyebilmeleridir. Esterifikasyon, bir
alkol ve bir asit (serbest yağ asidi) varlığında esterin oluşturulduğu kimyasal bir
reaksiyondur. Yağda bulunan serbest yağ asidi %1’den daha fazla ise asidik bir
katalizör reaksiyon için daha uygundur. Ek olarak tek basamaklı bir süreçten oluşan
asidik katalizleme, serbest yağ asitlerini metil esterlerine çevirmek için ekstra basamak
gerektiren bazik katalizlemeye göre daha ekonomiktir. Fakat asit bir katalizörün
kullanıldığı sistem ticari uygulamalar için uygun değildir. Çünkü, reaksiyon hızı
düşüktür, yüksek sıcaklık ve alkol:yağ oranına ihtiyaç vardır. Katalizörün ortamdan
ayrılması çevresel endişeler ve korozyon problemleri taşımaktadır (Lam vd. 2010).
9
Şekil 2.2 Alkali katalizör ile yapılan biyodizel üretiminin şematik gösterimi
Asit-Baz ile katalizlenen transesterifikasyon (2 basamak): Bu tür reaksiyonda yüksek
serbest yağ içeriğine sahip hammaddede bulunan serbest yağ asitleri asidik bir
katalizörün rol aldığı esterifikasyon reaksiyonu ile esterlere çevrilir. Bu şekilde
hammaddedeki serbest yağ asidi içeriği %0.5-1’ye indirildiği zaman transesterifikasyon
reaksiyonuna bazik bir katalizör ile devam edilebilir (Lam vd. 2010).
Enzim (biyokatalizör) ile katalizlenen transesterifikasyon: Lipazlar hidroliz, alkolizis,
asidolizis gibi reaksiyonların yanı sıra esterifikasyon ve transesterifikasyon gibi
reaksiyonları da katalizleyebilen enzimlerdir. Lipazlar (triaçilgliserol açilhidrolazlar; EC
3.1.1.3) uzun zincirli yağ asitlerinin gliserol esterlerini parçalayan enzimlerdir. Lipazlar
endüstride ve tıpta oldukça geniş uygulama alanı bulan biyokatalizörlerdir. Bu enzimler
bakteri, fungus, maya, hayvan ve bitki kaynaklı olabilir. Bakterilerden elde edilen
lipazlar ökaryotik organizmalardan elde edilenlere göre daha fazla olduğu için
mikrobiyel lipazlar daha çok ilgi çekmiştir. Lipazların biyolojik uyumluluğu ve
parçalanabilirliği tarımsal ve tıbbi uygulamalarda istenen özellikleri arasında yer
almaktadır. Hem hücre içinde hem de hücre dışında salgılanan lipazlar
triaçilgliserollerin transesterifikasyon reaksiyonunu etkili bir şekilde
katalizleyebilmektedir (Iso vd. 2001, Jaeger ve Eggert 2002).
Transesterifikasyon reaksiyonunda katalizör olarak lipazların kullanımının avantajları
arasında; immobilize edildikleri takdirde defalarca kullanılabilmeleri, reaksiyonda
kullanılan çözücülerden etkilenmemeleri, yüksek konsantrasyonda kullanılabilmeleri,
Alkali+MeOH
yağlar transesterifikasyon Reaksiyon karışımının ayrılması
MeOH buharlaştırılması (üst faz) MeOH buharlaştırılması (alt faz)
MeOH
yıkama
Gliserol saf eldesi
Sabunlaşmış ürün
Metil esterleri
Alkali atıksu
gliserol
10
enzimin doğal yapısından kaynaklanan büyük bir termal kararlılık sağlamaları ve
katalizörden ürünün ayrımının kolay olması sayılabilmektedir. Biyokatalizör
kullanımının dezavantajları olarak da; pahalı olmaları, yağ molekülünün hacmi
sebebiyle başlangıçta biraz aktivite kaybı olması ve immobilizasyon sırasında enzimin
her alana düzgün dağılamaması gösterilebilir (Marchetti vd. 2007). Şekil 2.3’de lipaz
enziminin katalizör olarak kullanıldığı transesterifikasyon reaksiyonu, Şekil 2.4’de ise
mikroorganizmadan hücre içi ve hücre dışı lipaz eldesi karşılaştırılmaktadır. Alkali
karakterde bir katalizör ve lipaz enzimiyle gerçekleştirilen transesterifikasyon
reaksiyonun birbirine karşı üstünlükleri Çizelge 2.1’de gösterilmiştir (Fukuda vd. 2001).
Şekil 2.3 Lipaz katalizi ile yapılan biyodizel üretiminin şematik gösterimi
Lipazın saflaştırılması Lipazın immobilizasyonu
geliştirme ayırma
�ekstraksiyon �adsorbsiyon �kromotografi �kristalizasyon
�çapraz bağlama �kovalent bağlama �tutuklama
geliştirme ve immobilizasyon
ayırma transesterifikasyon
a
b
yağlar transesterifikasyon
Reaksiyon karışımının ayrılması
Gliserol saf eldesi
(alt faz)
Üst faz Metil esterleri
gliserol
Lipaz+MeOH
esterifikasyon
Şekil 2.4.a. Hücre dışı, b.Hücre içi lipaz üretiminin karşılaştırılması
11
Çizelge 2.1 Alkali maddelerin ve enzimin katalizlediği transesterifikasyon reaksiyonlarının karşılaştırılması
Özellik Alkali kataliz Lipaz kataliz
Reaksiyon sıcaklığı 60 – 70 oC 30 – 40 oC
Hammaddedeki serbest yağ asidi sabunlaşmış ürün metil ester
Ham maddedeki su reaksiyonu engeller etkilemez
Metil ester eldesi normal yüksek
Gliserol geri kazanımı zor kolay
Metil esterlerin saflaştırılması tekrarlı yıkayarak yıkamadan
Katalizör maliyeti ucuz nispeten pahalı
Süperkritik yöntem ile katalizlenen transesterifikasyon: Transesterifikasyon reaksiyonu
normal şartlar altında heterojen katalizörler ile gerçekleşebileceği gibi, süperkritik
metanol ile katalizör olmadan da gerçekleşebilmektedir. Transesterifikasyon reaksiyonu
bu yöntem ile yüksek sıcaklık ve basınç altında (250 °C ve 10 MPa) ve metanolün
alkole oranının 42:1 olduğu şartlarda gerçekleştirilebilir. Bu şartlarda metanol-
triaçilgliserol karışımı homojen bir faz oluşturur ve raksiyonun tamamlanması için
katalizöre gerek kalmaz. Bu avantajların yanı sıra, yüksek maliyet, fazla metanol
kullanımı ve gliserol ayrımının zor olması bu yöntemin başlıca dezavantajlardır
(Marulanda vd. 2010).
d) Çalkalama hızı; transesterifikasyon reaksiyonunda karıştırma işlemi çok önemlidir.
Çünkü yağlar sodyum hidroksit ve metanol çözeltisinde karışmazlar. İki faz karıştığı
anda reaksiyon başlar ve bu aşamadan sonra karıştırmaya gerek yoktur.
Transesterifikasyon reaksiyonunda hammadde olarak hayvansal yağların kullanıldığı
bazı çalışmalarda karıştırma işlemi olmadan reaksiyon gözlemlenememiştir (Meher vd.
2006).
12
2.3 Biyodizel Üretiminde Kullanılan Hammaddeler
Her ne kadar 1930 ve 1940’larda acil durumlarda bitkisel yağlar dizel yakıt kaynağı
olarak kullanılsa ve biyodizel sadece bitkisel yağların metil esterleri olarak bilinse de,
alternatif yakıtın sahip olması gereken önemli özelliklerin başında ekonomik olması
gelmektedir (Fernández-Álvarez vd. 2007, GuanHua vd. 2010).
Bu bağlamda biyodizel maliyetinin en büyük kısmını, üretiminde kullanılan
hammaddenin maliyeti belirlemektedir. Şöyleki, hammadde maliyetindeki artış
biyodizel fiyatını %40 oranında etkilemektedir. Bu durum biyodizel üretiminde
hammadde seçiminin son derece önemli olduğunu vurgulamaktadır (Yan ve Lin 2009).
2.3.1 Bitkisel yağların biyodizel üretiminde kullanımı
Bitkisel yağların yakıt olarak kullanımı günümüzden yüzyıl öncesine dayanmaktadır.
Dizel motorun mucidi Rudolf Diesel ilk kez sıkıştırmalı ateşleme yapan motorda yer
fıstığı yağını kullanmıştır. O dönemde insanlar tarafından bitkisel yağların dizel motor
yakıtı olarak kullanımın önemsiz olduğu düşünülse de bu yağların zaman ilerledikçe
petrol ve kömür kadar önemli olacağını söylemiştir (Panwar vd. 2010). Fakat
günümüzde petrol ürünleri çok daha ucuz olduğu için bu tür yakıtlar henüz bu ürünlerin
yerini alamamıştır. Bitkisel yağlar alternatif yakıtların geliştirilmesinde göze çarpsa da
özellikle direk enjeksiyon yapan makinelerde birçok problemle karşılaşılmaktadır. Bu
problemlerin başında; koklaşma ve enjektörlerde çok ses çıkarma, karbon kalıntıları,
yağdan dolayı oluşan yapışma, bitkisel yağ kontaminasyonu sonucu oluşan kalınlaşma
ve jelleşme ve yağlama problemleri gelmektedir (Meher vd. 2006).
Bitkisel yağların özellikle de hayvansal yağların kullanımındaki diğer önemli
dezavantajlar dizel yakıttan 11-17 kat daha fazla olan yüksek viskozite ve motorda
kalıntıların kalmasına sebep olan düşük uçuculuktur. Bu problemlerin sebebi büyük
triaçilgliserol molekülü ve yüksek moleküler ağırlığıdır. Bu problemler motorların
modifiye edilmesiyle az veya çok aşılabilir. Almanya ve Malezya’da Elsbett ve yine
13
Almanya ve Amerika’da Diesel Morten und Geraetebau Gmbh (DMS) firmalarının
oluşturduğu modifiye motorlar farklı oranlarda bitkisel yağ ile çalıştırıldıkları zaman
başarılı performans göstermektedir (Srivastava ve Prasad 2000, Meher vd. 2006).
2.3.2 Hayvansal yağların biyodizel üretiminde kullanımı
Biyodizelin yüksek kaliteye sahip, pahalı bitkisel yağlardan yapılıyor olmasından
kaynaklanan yüksek üretim maliyeti, yemeklik olmayan yağların hammadde olarak
kullanımıyla indirgenebilmektedir (Kondamudi vd. 2009).
Literatürde hayvansal yağların biyodizel üretiminde kullanımları ile ilgili yapılan
çalışmaların başında kuyruk yağı ve tavuk artıklarından kalan yağların kullanımı
gelmektedir. Başta kuyruk yağı olmak üzere hayvansal yağlar insanların beslenme
alışkanlıklarına bağlı olarak kullanım miktarı değişmektedir ve sabun endüstrisi üretilen
hayvansal yağın tamamını alamamaktadır (Bhatti vd. 2008).
Bu yağların C14:0, C16:0 ve C18:0 gibi doymuş yağ asitlerinden oluşması yüksek setan
numarasına sahip olmasını ve doymamış yağlara göre oksidasyona daha az yatkın
olmasını sağlamaktadır. Fakat bu özelliğin yüksek sıcaklıklarda kristalize olma eğilimi
göstermesi önemli bir dezavantajdır (Alptekin ve Çanakcı 2010).
2.3.3 Atık yağların biyodizel üretiminde kullanımı
Günümüzde bitkisel yağ fiyatlarındaki hızlı artış, biyodizel üretiminde bu yemeklik
yağlar yerine kızartma yağları gibi atık yağların kullanımı gibi alternatif çözümler
bulmayı gerektirmektedir (Chung vd. 2009).
Biyodizel üretiminde maliyetin yaklaşık %75 kadarını hammaddenin oluşturması göz
önüne alındığında, bitkisel yağların hammadde olarak kullanılması biyodizelin fiyatını
petrol kaynaklı dizele göre 1.5 kat daha pahalı kılmaktadır. Buna karşın atık kızartma
yağlarının fiyatı bitkisel yağlardan 2-3 kat daha ucuzdur. Ayrıca atık kızartma
14
yağlarından ve bitkisel yağlardan üretilen biyodizel kalitesinin benzer olması bu
yağların değerlendirilmesi için uygun bir çalışma koşuludur (Phan ve Phan 2008).
Yiyeceklerin kızartılması sırasında bitkisel yağlar çok yüksek sıcaklıklara maruz
kalırlar. Bu esnada hidroliz, polimerizasyon ve oksidasyon meydana gelir ve yağın hem
kimyasal hem de fiziksel yapısı bozulur. Nem ve oksidasyon varlığında triaçilgliserolün
hidrolize olması sebebiyle yağ içersindeki serbest yağ asidi miktarı artar. Serbest yağ
asidi ve su içeriğinin transesterifikasyon reaksiyonu üzerinde negatif etkisi vardır.
Ayrıca yağ asidi esterleri ve gliserolün ayrılmasını engeller. Kızartma yağlarında
dimerik ve polimerik asit ve gliseritlerin oluşumu yağın viskozitesini önemli ölçüde
arttırır. Böylece moleküler kütle ve iyot değerleri düşerken, sabunlaşma değeri ve
yoğunluğu artar. Bu durum biyodizelin oluştuğu transesterfikasyon reaksiyonunun
direkt olarak meydana gelmesini engeller. Bu yüzden asit karakterde bir katalizörle
serbest yağ asidi içeriğinin azaltılması gerekmektedir. Hem atık yağların hem de
hayvansal yağların doymuşluk oranları yüksektir. Bu sebeple bu yağlardan üretilen
biyodizelin soğuk akış özellikleri ele alınmalıdır (Çanakcı 2007, Enweremadu ve
Mbarawa 2009).
2.3.4 Mikrobiyel yağların biyodizel üretiminde kullanımı
Biyodizel üretiminde kullanılan hammaddenin pahalı olması ve hammadde maliyetinin
toplam üretim maliyetinin %70–75’ini oluşturması sebebiyle biyodizel kullanımı fosil
yakıt kullanımına göre ekonomik değildir. Bu yüzden biyodizel günümüzde sıklıkla
kullanılan bir yakıt değildir. Bu sorunun çözümü daha ucuz hammadde sağlanmasıdır.
Dünyada insan nüfusunun hızla artmasıyla tarım için daha fazla alana ihtiyaç
duyulacaktır. Bu sorun günümüzde dahi Asya’da görülmektedir. Burada bitkisel yağ
fiyatları daha fazladır. İlerleyen yıllarda bu eğilimin dünyanın geri kalan kısmında da
görüleceği düşünülmektedir. Bu noktadan yola çıkılarak mikrobiyel lipitlerden üretilen
biyodizel diğer enerji formlarına yardımcı bir alternatif bir enerji kaynağı olarak ön
plana çıkmaktadır (Ma ve Hanna 1999).
15
Mikrobiyel yağlar (tek hücre yağları) birçok mikroorganizma tarafından üretilmektedir
ve bu yağların biyodizel üretiminde hammadde olarak çok yüksek bir potansiyele sahip
olacağı düşünülmektedir. Çünkü mikroorganizmalar değişen mevsim ve iklim
şartlarından etkilenmezler, hücrelerinde yüksek miktarda lipit içeriğine sahiptirler, kısa
sürede çok miktarda üretilebilmektedirler (Xue vd. 2006).
2.4 Biyodizel Üretiminde Kullanılan Mikroorganizmalar
Hücrelerindeki lipit içerikleri %20’yi geçen mikroorganizmalar bulunmaktadır. Bu
mikroorganizmalardan elde edilen ve tek hücre yağları (SCO) olarak isimlendirilen
mikrobiyel yağlar günümüzde tüm dünyada yoğun ilgi görmektedir. Her ne kadar
mikroalgler, Bacillus cinsine ait bakteriler, fungus ve mayalar gibi birçok
mikroorganizma lipit depo edebilme özelliğine sahip olsa da bu mikroorganizmaların
tamamı biyodizel üretiminde kullanılamamaktadır. Tek hücre yağı ilk ticari üretimi
1995 yılına kadar başlayamamıştır ve maliyeti fazla olduğu için 6 yıl önce bu üretim
durdurulmuştur. Günümüzde birçok maya ve mikroalg türü bitkisel yağalara benzer
nitelikte lipit üretebilmektedir. Ürettikleri bu lipitin miktarı ve içeriği sıcaklık, pH,
inkübasyon süresi gibi geliştirildikleri ortam şartlarına göre değişmektedir (Meng
2009).
Son yıllarda literatürde yapılan çalışmalarda fungus ve mikroalglerin biyodizel
üretiminde yağ kaynağı olarak kullanımının avantajları önemle vurgulanmaktadır.
Şüphesiz bu avantajların en başında kolay üretilebilmeleri, üretimleri sırasında çok
ilgiye gerek duyulmaması, besiyerlerinin ucuz olması ve insan tüketimi için uygun
olmayan sularda (atıksular gibi) geliştirilebilmeleri gelmektedir (Mata vd. 2010).
2.4.1 Bakteriler
Bakteriler genellikle triaçilgliserol üretmezler bunun yerine polibeta hidroksi bütirat ve
alkanoat depo ederler. Bu yüzden yağ biriktirme özelliği sadece bazı maya, fungus ve
alglerde görülmektedir (Ratledge 2004).
16
Her ne kadar mikroalgler hücrelerinde yüksek miktarda lipit biriktirebilse de,
geliştirilebilmeleri bakterilere göre daha uzun zaman almakta ve büyük arazilere ihtiyaç
duyulmaktadır. Genellikle bütün bakterilerin lipit içeriklerinin ortalama %20-40 olması
nedeniyle mikroalglerden düşük olduğu bilinse de çok kısa sürede gelişebilmeleri bu
mikroorganizmaları biyodizel üretiminde hammadde olarak kullanılabilirliğini akla
getirmektedir. Fakat birçok bakteri genellikle lipit üreticisi değildir. Sadece birkaç
bakteri türü hücrelerinde karışık lipoid yapılar (polihidroksialkanoat)
biriktirebilmektedir. Bu yapılarda dış zarda olduğu için ekstrakte edilmeleri çok zordur.
Bu sebeple yüksek lipit içeriğine sahip bakterilerin biyodizel üretiminde hammadde
olarak kullanımının hiçbir ticari önemi yoktur (Meng vd. 2009).
2.4.2 Funguslar
1980’li yıllardan bu yana funguslar (tek hücreli mayalar ve filamentli funguslar) ilgi
çeken yağlı mikroorganizmalar olmuştur. Rhodosporidium sp., Rhodotorula sp, ve
Lypomyces sp. gibi bazı maya türleri hücrelerinde kuru ağırlıklarının %70’i kadar lipit
biriktirebilme yeteneğine sahiptir. Yüksek lipit içeriğine sahip funguslara örnek olarak
Mortierella sp. cinsine ait türler verilebilmektedir. Yağlı mayalar ve küfler çoklu
doymamış yağ asitlerince zengin triaçilgliserol biriktirmektedirler. Bu hücrelerde en
fazla rastlanan yağ asitleri arasında C18:1, C18:2, C16:0, C16:1 gelmektedir. Bu bilgiler
ışığı altında yağlı maya ve fungusların biyodizel üretimi için alternatif yağ kaynakları
olduğu söylenebilmektedir (Meng vd. 2009).
2.4.3 Mikroalgler
Mikroalgler zaman zaman gıda ve kimyasal madde üretiminde kullanılmaktadır. Ama
son yıllarda mikroalglerin enerji kaynağı olarak kullanımı revaçtadır. Şöyle ki; bu
mikroorganizmalar metan üretimi için parçalanabilir, fotosentetik olarak hidrojen
üretebilirler veya bazı algler sıvı yakıt üretiminde yağ kaynağı olarak kullanılabilirler.
Mikroalglerin avantajları; fotosentetik olarak gelişebildikleri için karbon kaynağına
ihtiyaç duymamaları ve daha önceki tüketimlerin ürünü olan karbondioksiti enerji
17
kaynağı olarak kullanıp karbondioksit nötralizasyonunu sağlamalarıdır (Sawayama
1995, Chen 1996, Hirano vd. 1998, Lorenz ve Cysewski 2000, Scragg vd. 2003)
Mikroalglerin biriktirdikleri lipitler genellikle (>%80) triaçilgliserol formunda olup 16
ve 18 numaralı karbon atomlarınca zengin yağ asitleri içermektedir. Alg hücrelerinin
ortalama lipit içeriği %1 ile %70 oranında değişse de, optimum koşullar sağlandığında
%90 oranında lipit biriktirebilen mikroalgler de vardır (Meng vd. 2009).
Mata vd. (2010) mikroalglerin biyodizel üretiminde kullanımlarını anlattıkları detaylı
çalışmalarında mikroalglerin, tarımsal ürünlerle ve diğer sucul bitkilerle
karşılaştırıldığında gelişme hızları çok büyük olduğunu bildirmişlerdir. Bununla birlikte
biyodizel üretimi için kullanılan tarımsal hammaddelerle karşılaştırıldığında gelişimleri
için kolza için ayrılan alandan 49, soya fasulyesi için ayrılan alandan 132 kat kadar daha
küçük alana ihtiyaç duydukları için mikroalglerin biyodizel üretiminde hammadde
olarak kullanımı sayesinde ekilebilir alanların biyodizel üretimine hammadde
yetiştirmek için ayrılması önemli ölçüde azaltılacağını belirtmişlerdir. Aynı çalışmada
bazı alg ve siyanobakteri türlerinin yüksek lipit içeriğine sahip olduğu ve optimum
şartlarda bu fotosentetik mikroorganizmaların aynı alanda geliştirilen bitki sisteminden
100 kat daha fazla lipit üretebildiğini bildirmişlerdir. Araştırıcılar, alglerden üretilen
biyodizelin sülfür içermediğini ve petrol kaynaklı dizel yakıtlar gibi performans
gösterebildiğini, partikül, CO, hidrokarbon ve SOx emisyonlarının az olmakla birlikte
NOx emisyonunun bazı motor türlerinde fazla olabildiğini ifade etmişlerdir.
2.5 Mikroorganizmalarda Lipit Biyosentezi
Gelişme ortamındaki besin dengesizliği yağlı mikroroganizmalarda lipit birikimini
tetiklemektedir. Genellikle azot olmak üzere anahtar bir besin maddesi azalıp, karbon
miktarı artınca, hücreler karbonu kullanıp yağ şeklinde depo ederler. Bu durum lipit
biriktirebilen maya ve filamentli funguslarda görülmektedir. Bu canlılarda karbonun
fazlalığı biyokütle oluşturmadan ziyade, lipit birikimine kanalize edildiği için gelişme
hızı lipit biyosentezinden düşüktür (Ratledge ve Wynn 2002).
18
Heterotrof gelişen alglerde ise bu durum görülmez. Heterotrof alg, gelişirken lipit
biriktirir, lipit biriktirme özelliği azot kaynağının tükenmesine bağlı değildir. Hücreler
karbonu hızlıca kullanır, yeni hücrelere çevirir, fazla karbonun depolanma mekanizması
yağa dönüştürülmesi ile bulunur (Ratledge ve Wynn 2002).
Kısa karbon zincirli yağ asitlerinin oluşumu bitki, hayvan, fungus, bakteri ve alg
hücrelerinde birbirine benzemektedir. Örneğin, yeşil alg hücrelerinde palmitoleik, oleik,
linoleik ve linolenik yağ asitlerinin sentezi, bitki ve maya hücrelerindekine
benzemektedir (Ratledge ve Wynn, 2002). Yüksek kapasitede lipit biriktirebilme
özelliğine sahip bir mikroorganizma hücresinde sırasıyla aşağıda ifade edilen kaskat
reaksiyonları gerçekleşmektedir (Ratledge 2004).
1. Ortamdaki azot miktarı azalınca yağlı hücrede AMP deaminaz aktivitesi 5 kat artar.
2. Artan AMP deaminaz aktivitesi hücrenin ve mitokondrinin AMP içeriğini azaltır.
3. Mitokondride azalan AMP içeriği yağlı hücrelerde bulunan izositrat dehidrogenaz
enzimini durdurur. Çünkü bu enzim aktivitesi için AMP ye aşırı derecede bağımlıdır.
4. Sonuçta izositrat metabolize edilemez, biriktirilir. Akonitaz aracılığı ile sitrik aside
dengelenir.
5. Bu yüzden mitokondride sitrat biriktirilir.
6. Mitokondriyel membrvea sitratın dışarıya taşınması için etkili bir akış sistemi
bulunmaktadır. Sitrat malat ile değiştirilir.
7. Sitrat sitozole gelir ve ATP sitrat liyaz tarafından bağlanır, asetil CoA ve oksaloasetat
oluşturulur.
8. Asetil CoA yağ asidi biyosentezi için kullanılır.
9. Oksaloasetat ise malat dehidrojenaz ile sitrat akış sisteminde kullanılacak malata
dönüştürülür.
Aynı şartlarda geliştirilen fungusların bazılarının lipit biriktirirken, bazılarının
biriktirememesinin nedeni 4 farklı başlık altında toplanabilir (Ratledge ve Wynn 2002):
19
1. Besiyerindeki azot miktarı azaldığında, yağlı olmayan türler glukoz asimilasyonunu
durdururlar. Bu yüzden yağ asidi biyosentezinin öncü maddesi olan asetat üniteleri
oluşmamış olur.
2. Yağlı maya hücrelerinde yağ asidi biyosentezinde ilk enzim olan asetilCoA
karboksilaz enzimi çok çalışıyor olabilir. Yağlı olmayan mayalarda yağ asidi sintazın
son ürünü olan yağ açil CoA esteri tarafından inhibe ediliyor olabilir.
3. Yağlı olmayan mayalarda lipit oksidayonu ile birlikte gerçekleşen işe yaramayan lipit
biyosentez döngüsü olabilir. Bu yüzden net bir lipit akümülasyonu sağlanmaz.
4. Ara metabolizma her iki grupta da farklı regüle ediliyor olabilir. Örneğin yağlı
türlerde karbonun asetilCoA’ya akışı arttırılmışken, yağlı olmayan türlerde hücresel
regülasyonlar ile azaltılmış olabilir.
2.6 Hammaddenin Yağ Asidi Dağılımı ve Biyodizelin Yakıt Kalitesi
Günümüzde kullanılan petrol temelli dizel yakıtın yerini alabilmesi için üretilen
biyodizelin; yoğunluk, akışkanlık, yanma noktası, yanma değeri vb. özelliklerin
bilinmesi gerekmektedir. Biyodizeldeki önemli yakıt kriteri triaçilgliserollerin kalıntısı
ve biyodizel kısmındaki gliseritler olarak iş gören gliserole bağlıdır. Yağ asidi metil
esteri formundaki biyodizel yakıt, birçok ülkede üretilmektedir. Amerika Birleşik
Devletleri’nde ilgili standart ASTM Biodiesel Standard D 6751 iken, Avrupa Birliği
Ülkelerinde araç kullanımına yönelik standart Standard EN 14214, ısınmaya yönelik
standart Standard EN 14213’tür. ASTM ve EN standartlarına göre biyodizelin asit sayı
limiti uyumlu olup 0.5 değerindedir (Knothe 2006, Meng vd. 2009).
Mikrobiyel yağlar çoklu doymamış yağ asidi içeriğince zengin oldukları için birçok
bitkisel yağdan farklılık göstermektedir. Yakıt olarak kullanılmak üzere tasarlanmış
biyodizel için böyle bir sınırlama yoktur fakat kabul edilebilir olanlar göstergesi iyot
değeri olan yağın doymamışlık oranı ile ilgili kriterleri yerine getirenlerdir. EN 14214
ve EN 14213 standartlarına göre biyodizelin iyot değeri 120 ve 130 g iyot/100 g
biyodizel şeklinde olmalıdır (Meng vd. 2009).
20
Biyodizel özelliği yağ asidi metil esterlerinin bileşenlerine bağlı olarak değişmektedir
(Knothe 2005). En önemli özelliklerin başında ateşleme kalitesi (örneğin setan sayısı),
soğuk-akış özellikleri ve oksidatif kararlılık gelmektedir. Lipitlerde doymuşluğun ve
yağ asidi dağılımının transesterifikasyon yöntemi ile biyodizel üretiminde önemli bir
etkisi olmasa da, yakıtın özelliklerini doğrudan ilgilendirmektedir. Örneğin, doymuş
yağlardan üretilen biyodizel yüksek setan sayısına ve çok güçlü oksidatif kararlılığa
sahipken daha düşük yanma özellikleri gösterir. Doymuş yağlardan üretilen biyodizel
çevresel sıcaklıklarda jelleşme eğilimi göstermektedir. Uzun zincirli doymamış yağ
asidi bakımından zengin hammaddeden üretilen biyodizel ise soğuk-akışkan özelliğe
sahiptir. Fakat bu yağ asitlerinin de okside olma eğilimi diğerlerine göre çok yüksektir.
Bu yüzden biyodizelin uzun süreli depolanması sürecinde problemler yaşanabilmektedir
(Hu vd. 2008). ASTM ve EN standartlarında dikkate alınan özellikler Çizelge 2.2-
2.4’de verilmiştir (Knothe 2006).
21
Çizelge 2.2 ASTM biyodizel standardı
Özellik Test Yöntemi Sınırlar Birim
alevlenme noktası
su ve sediment
kinematik akışkanlık (40 ºC)
D 93 130.0 (en düşük) ºC
D 2709 0.050 (en yüksek) %hacim
D 445 1.9-6.0 mm2/s
sülfatlanmış kül D 874 0.020 (en yüksek) %kütle
sülfür D 5453 0.015 (en yüksek S15)
%kütle 0.05 (en yüksek S500)
bakır korozyon
setan sayısı
sislenim noktası
karbon kalıntısı
D 130 No 3 (en yüksek)
D 613 47 (en düşük)
D 2500 ºC
D 4530 0.050 (en yüksek) %kütle
asit sayısı D 664 0.50 (en yüksek) mg KOH/g
serbest gliserin
toplam gliserin
fosfor içeriği
sodyum/potasyum
distilasyon sıcaklığı
D 6584 0.020 %kütle
D 6584 0.240 %kütle
D 4951 0.001 (en yüksek) %kütle
UOP 391 5 (en yüksek) ppm
D 1160 360 (en yüksek) ºC
22
Çizelge 2.3 EN 14214 Avrupa biyodizel standardı
Özellik Test Yöntemi Sınırlar Birim
ester içeriği
yoğunluk (15 ºC)
kinematik akışkanlık (40 ºC)
EN 14103 96.5 (en düşük) %mol/mol
ENISO 3675; ENISO 12185
860-900 kg/m3
ENISO 3104; ISO 3105
3.5-5.0 mm2/s
alevlenme noktası ENISO 3679 120 (en düşük) ºC
sülfür içeriği ENISO 20846; ENISO 20884
10.0 (en yüksek S15) mg/kg
karbon kalıntısı setan sayısı sülfatlanmış kül su içeriği
ENISO 10370 0.30 (en yüksek) %mol/mol
ENISO 5165 51 (en düşük)
ISO 3987 0.02 (en yüksek) %mol/mol
ENISO 12937 500 (en yüksek) mg/kg
toplam kontaminasyon EN 12662 24 (en yüksek) mg/kg
bakır korozyon oksidatif kararlılık (110 ºC) asit değeri iyot değeri linolenik asit içeriği
ENISO 2160 1 derecesi
EN 14112 60.0 dk sa
EN 14104 0.50 (en yüksek) mgKOH/g
EN 14111 120 (en yüksek) gI2/100g
EN 14103 12.0 (en yüksek) %(mol/mol)
çift bağlı FAME içeriği >= 4 1 (en yüksek) %(mol/mol)
metanol içeriği EN 14110 0.20 (en yüksek) %(mol/mol)
monoaçilgliserol içeriği EN 14105 0.80 (en yüksek) %(mol/mol)
diaçilgliserol içeriği EN 14105 0.20 (en yüksek) %(mol/mol)
triaçilgliserol içeriği EN 14105 0.20 (en yüksek) %(mol/mol)
serbest gliserin EN 14105 0.020 (en yüksek) %(mol/mol)
toplam gliserin EN 14105 0.25 (en yüksek) %(mol/mol)
I. grup metaller (Na+K) EN 14108 5.0 (en yüksek) mg/kg
II. grup metaller (Ca+Mg) prEN 14538 5.0 (en yüksek) mg/kg
fosfor içeriği EN 14107 10.0 (en yüksek) mg/kg
soğuk filtre tıkama noktası EN 116 - ºC
akış noktası ISO 3016 0 (en yüksek) ºC
ısıl değer DIN 51900 35 (en düşük) MJ/kg
23
Çizelge 2.4 EN 14213 Avrupa Biyodizel Standardı
Özellik Test Yöntemi Sınırlar Birim
ester içeriği
yoğunluk (15 ºC)
kinematik akışkanlık (40 ºC)
EN 14103 96.5 (en düşük) %mol/mol
ENISO 3675; ENISO 12185
860-900 kg/m3
ENISO 3104; ISO 3105
3.5-5.0 mm2/s
alevlenme noktası ENISO 3679 120 (en düşük) ºC
sülfür içeriği ENISO 20846; ENISO 20884
10.0 (en yüksek S15) mg/kg
karbon kalıntısı setan sayısı sülfatlanmış kül su içeriği
ENISO 10370 0.30 (en yüksek) %mol/mol
ENISO 5165 -
ISO 3987 0.02 (en yüksek) %mol/mol
ENISO 12937 500 (en yüksek) mg/kg
toplam kontaminasyon EN 12662 24 (en yüksek) mg/kg
bakır korozyon oksidatif kararlılık (110 ºC) asit değeri iyot değeri linolenik asit içeriği
ENISO 2160 - derecesi
EN 14112 4.0 sa sa
EN 14104 0.50 (en yüksek) mgKOH/g
EN 14111 130 (en yüksek) gI2/100g
EN 14103 - %(mol/mol)
çift bağlı FAME içeriği >= 4 1 (en yüksek) %(mol/mol)
metanol içeriği EN 14110 - %(mol/mol)
monoaçilgliserol içeriği EN 14105 0.80 (en yüksek) %(mol/mol)
diaçilgliserol içeriği EN 14105 0.20 (en yüksek) %(mol/mol)
triaçilgliserol içeriği EN 14105 0.20 (en yüksek) %(mol/mol)
serbest gliserin EN 14105 0.02 (en yüksek) %(mol/mol)
toplam gliserin EN 14105 - %(mol/mol)
I. grup metaller (Na+K) EN 14108 - mg/kg
II. grup metaller (Ca+Mg) prEN 14538 - mg/kg
fosfor içeriği EN 14107 - mg/kg
soğuk filtre tıkama noktası EN 116 - ºC
akış noktası ISO 3016 0 (en yüksek) ºC
ısıl değer DIN 51900 35 (en düşük) MJ/kg
24
Biyodizel yakıtlar viskozitesi dizel yakıta yakın olan değişik bitkisel yağlardan
üretilebilir. Bu yakıtların hacimsel ısıtma değerleri biraz düşüktür fakat yüksek setan
numarası ve ateşleme noktasına sahiptir. Biyodizelin özellikleri dizel yakıta benzediği
için eğer ihtiyaç artarsa dizel yakıtın yerine kullanılabilecek adaydır. Çizelge 2.4 de
biyodizel ve dizel yakıtın özellikleri karşılaştırılmıştır (Fukuda vd. 2001).
Çizelge 2.5 Bazı bitkisel yağların metil esterlerinin ve dizel yakıtın fiziksel ve kimyasal özellikleri
Bitkisel yağ metil esteri
Setan sayısı
Alt ısıl değer (MJ/l)
Bulutlanma noktası (oC)
Alevlenme noktası (oC)
Yoğunluk (g/l)
Sülfür (wt%)
Yerfıstığı 54 33.6 5 176 0.883 -
Soya yağı 45 33.5 1 178 0.885 -
Babassu 63 31.8 4 127 0.879 -
Palmiye 62 33.5 13 164 0.880 -
Ay çiçeği 49 33.5 1 183 0.860 -
İç yağı - - 12 96 - -
Kolza tohumu 51-59.7
32.8 - - 0.882 -
Kullanılmış Kolza 53 36.7 - 192 0.895 0.002
Kullanılmış Mısır 63.9 42.3 - 166 0.884 0.0013
Dizel yakıt 51 35.5 - - 0.830 -
25
2.7 Biyodizelin Depolanması
Biyodizelin kalitesini etkileyen diğer bir önemli faktör de depolanmasıdır. Bitkisel yağ
türevleri maddeler hidrolitik ve oksidatif reaksiyonlara girme eğilimindedirler.
Doymamışlık dereceleri onların termal ve/ veya oksidatif polimerizasyona uğramalarına
neden olur ve bu durumda yakıt, sistemde özellikle enjeksiyon pompalarında
çözünmeyen ürünlerin oluşmasına sebep olur. Araştırıcılar uzun süreli depolama
sırasında biyodizelin nötralizasyon ve peroksit sayılarını elde etmişlerdir (Meher vd.
2006).
2.8 Fungal Lipitlerin Hammadde Olarak Kullanıldığı Çalışmalar
Bazı funguslar, birçok farklı karbon kaynağını kullanarak kesikli sistemde
geliştirildiklerinde kısa sürede çok miktarda biyokütle oluşturabilmektedirler.
Hücrelerinde yüksek miktarlarda bitkisel yağlara benzer özellikler gösteren yüksek lipit
birikitirebilmektedirler (Vicente vd. 2009). Bu nedenle son yıllarda mikrobiyel lipitlerin
biyodizel üretiminde hammadde olarak kullanımı ile ilgili yapılan çalışmalarda fungal
hücreler araştırıcıların ilgisini çekmektedir.
Li vd. (2007) yaptıkları çalışmada; karbon kaynağı olarak 10-400 g/L arasında değişen
glukoz oranlarını kullandıkları çalışmada Rhodosporidium toruloides Y4 mayasının
mikrobiyel lipit üretimini araştırmışlardır. Çalışmada pH’ı 5.5 ve 12 g/L (NH4)2SO4
içeren besiyerinde maya hücrelerinin ortamda 150 g/L glukoz varlığında en iyi gelişme
gösterdikleri, artan glukoz konsantrasyonlarının hücre gelişimini inhibe ettiği
bildirilmiştir. 25 gün süreyle inkübe edilen kesikli beslemeli kültürlerde ise kuru
biyokütle ve hücresel lipit içeriği sırayla 151.5 g/L ve %48 olarak bulunmuştur.
Araştırıcılar, kesikli beslemeli sistemde 134 saat süreyle geliştirdikleri Rhodotorula
toruloides Y4 hücre lipitlerinin 16 ve 18 karbon atomlarından oluşan uzun zincirli yağ
asitlerinden oluştuğunu göstermişlerdir. Gelişme periyodu boyunca miristik, palmitik,
palmitoleik ve linolenik asidin başlıca sabit yağ asitleri olduğu bulunmuştur. İlerleyen
26
inkübasyon süresinde oleik asit içeriğinde azalma görülürken, stearik asit içeriğinde
artış görülmüştür. Gelişme sürecinin erken döneminde linoleik asit miktarında artış
görülürken, geç döneminde azalma görülmüştür.
Liu ve Zhao (2007) Lypomyces starkeyi ve Rhodotorula toruloides maya hücrelerinin
lipit üretimlerini pH’ı 6 olan, 70 g/L glukoz, 2.0 g/L (NH4)2SO4 içeren besiyerinde
araştırmışlar ve lipit içeriklerini sırasıyla %50.2 ve %58.0 olarak bulmuşlardır.
Araştırıcılar, Lypomyces starkeyi hücrelerinden elde ettikleri lipitin %0.4 miristik asit,
%33.0 palmitik asit, %4.8 palmitoleik asit, %0.4 heptadekanoik asit, %4.7 stearik asit,
%55.1 oleik asit, %1.6 linoleik asit; Rhodotorula toruloides hücrelerinden elde ettikleri
lipitin ise %0.7 miristik asit, %24.3 palmitik asit, %1.1 palmitoleik asit, %0.6
heptadekanoik asit, %7.7 stearik asit, %54.6 oleik asit, %2.1 linoleik asit içerdiğini
göstermişlerdir.
Hansson ve Dostálek (1986) gerçekleştirdikleri çalışmada; Cryptococcus albidus var.
albidus mayasının nitrojen sınırlı ortamda (1 g/L) hücre gelişimine ve yağ asidi
kompozisyonuna ksiloz, glukoz, maltoz, laktoz, nişasta, mannitol, gliserol ve etanol gibi
farklı karbon kaynaklarının etkisini araştırmışlardır. Çalışmada besiyerine nişasta 15
g/L, etanol 10 g/L olarak eklenirken, diğer karbon kaynaklarının besiyerindeki oranları
0.67 mol karbon/L olarak ayarlanmıştır. Maya hücreleri etanol dışında tüm karbon
kaynaklarını kullanmış, etanol içeren ortamda gelişememiştir. Çalışmada en fazla
biyomasın glukoz varlığında 8.3 g/L, en düşük biyomasın ise 1.5 g/L olarak bulunduğu
gösterilmiştir. Gliserol içeren ortamda hücre gelişimi az olmasına rağmen en fazla lipit
üretimi %43.8 olarak bu besiyerinde görülmüştür. Glukoz içeren ortamda lipit üretimi
%40.1 olarak belirlenirken, en düşük lipit üretimi %26.3 olarak laktoz içeren
besiyerinde gözlenmiştir.
Araştırıcılar Cryptococcus albidus var. albidus mayasının yağ asidi dağılımına ortamda
karbon kaynağı olarak 20 g/L glukoz varken, NH4Cl, (NH4)2SO4, üre, L-glutaminat, L-
arjinin, L-ornitin, L-prolin gibi farklı azot kaynaklarının etkisini araştırmışlardır.
Ortamdaki başlangıç azot konsantrasyonu 0.019 mol azot/L olarak ayarlanmıştır.
27
Hücreler organik azot kaynağında geliştirildikleri zaman C18:0 oranı %5.6 olurken,
organik azot kaynaklarında yaklaşık %10.5 olarak bildirilmiştir. Besiyerinde L-arjinin
veya L-ornitin kullanıldığında C16:0 miktarında haifi bir düşme görülürken C18:2
miktarında artış görülmüştür. Denenen tüm azot kaynaklarında yağ asitlerinin
doymamışlık miktarı aynı bulunmuştur.
Çalışmada maya hücrelerinden elde edilen lipitlerde görülen başlıca yağ asitleri C16:0,
C16:1, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3 olarak belirlenmiştir. Kullanılan karbon kaynakları
farklı olmasına rağmen, bu farklı besiyerlerinde geliştirilen hücrelerdeki yağ asidi
dağılımları birbirine çok benzemektedir.
Evans ve Ratledge (1983) tarafından gerçekleştirilen çalışmada; glukoz, sukroz, laktoz,
ksiloz ve etanol gibi farklı karbon kaynaklarının Candida curvata mayasının lipit
biriktirma kapasitesi üzerine etkisini araştırmışlardır. Araştırıcılar karbon kaynakalrını
besiyerine 30 g/L olacak şekilde eklemişlerdir. Kesikli kültürde geliştirdikleri maya
hücrelerinin yüksek karbon/azot oranında yüksek lipit biriktirebildiklerini görmüşlerdir.
İnkübasyon süresinin 30. saatinden sonra ortamdaki azotun bittiğini bildirmişerdir.
Çalışma sonucunda biyokütle üretiminde en etkili karbon kaynağının laktoz; lipit
üretiminde en etkili karbon kaynağının ksiloz olduğu bildirilirken hem biyokütle hem de
lipit üretiminin ortamda etanol varken en düşük miktarda olduğu bulunmuştur.
Biyokütle üretimleri glukoz, sukroz, laktoz, ksiloz ve etanol içeren ortamda sırasıyla
10.2, 11.2, 12.5, 9.9, 8.5 g/L olarak bildirilirken, lipit üretimleri sırasıyla %33.2, %37.4,
%39.2, %48.6, ve %30.1 olarak bildirilmiştir.
Araştırıcılar, Candida curvata mayasından elde ettikleri lipitin başlıca bileşenleri olan
C16:0, C18:0, C18:1, C18:2 yağ asidi oranlarının azot sınırlı şartlarda kesikli ve sürekli
sistemde değişken olduklarını bildirmişlerdir. Kesikli sistemde glukoz içeren
besiyerinde bu yağ asitlerinin dağılımı sırasıyla %33.0, %12.0, %42.9, %7.3 iken,
sukroz içeren besiyerinde %32.4, %11.3, %42.0, %6.7; laktoz içeren besiyerinde %32.5,
%11.0, %49.0, %6.0; ksiloz içeren besiyerinde %41.2, %14.0, %43.0, %3.5; etanol
içeren ortamda ise %26.5, %12.5, %49.0, %8.9 olarak bildirilmiştir. Fakat kemostat
kültürde nitrojen sınırlı ortamda yağ asidi kompozisyonu sabittir. En fazla C18:0 yağ
28
asidi ve en düşük C18:2 yağ asidi ksilozda geliştirilen hücrelerde sırasıyla %15 ve %4
olarak bildirilirken; etanol içeren besiyerinde geliştirilen hücrelerde %51 oranında
C18:1 ve %25 oranında C16:0 görüldüğü bildirilmiştir.
Vicente vd. (2009) filamentli yapıya sahip Mucor circinelloides fungusunu biyodizel
üretiminde hammadde olarak kullanımını gösterdikleri çalışmalarında üç farklı solvent
sisteminin fungus hücrelerinden lipit ekstraksiyonu üzerine etkisini araştırmışlardır.
Çalışmada pH’ı 4.5’ e ayarlanmış 10 g/L glukoz içeren minimal besiyerinde 3 gün
süreyle geliştirilen hücrelerden kloroform:metanol, kloroform:metanol:su ve n-hekzan
çözücüleri ile elde edilen lipit verimleri sırasıyla %19.9, %19.0 ve %15.3 olarak
belirlenmiştir. Fungal lipiti oluşturan başlıca yağ asitlerinin sırasıyla %37.1 oranında
C18:1, %14.3 oranında C18:2 ve %18.5 oranında C18:3 olduğunu belirlemişlerdir.
Peng ve Chen (2008); kızıl ötesi reflektans spektrofotometresi ile yağ biriktirme
kapasitesine sahip fungusların hücre içi lipit miktarını belirlemeye yönelik çalışmalar
gerçekleştirmişlerdir. Çalışmalarında izole ettikleri Microsphaeropsis sp. Phomopsis
sp., Cephalosporium sp., Sclerocystis sp. ve Nigrospora sp. funguslarının yanı sıra diğer
bir yağlı fungus olan Mortierella ramanniana fungusunu da kullanmışlardır. Bu
fungusların lipit içerikleri belirtilen yöntemle sırasıyla %7.51, %5.12, %6.98, %5.90,
%5.87, %6.95 olarak bulunmuştur.
Economou vd. (2010) gerçekleştirdikleri çalışmada; sorgum pekmezi ile hazırladıkları
pH’ı 6 olan yarı katı besiyerinde Mortierella isabellina fungusunu 8 gün boyunca
geliştirmişler ve bu fungusun lipit biriktirme kapasitesini biyodizel üretiminde
hammadde olması bakımından incelemişlerdir. Çalışmada azot miktarındaki azalmaya
bağlı olarak lipit birikiminin arttığı ve en yüksek lipit veriminin 11 g/100 g substrat
olduğu bildirilmiştir. Araştırıcılar fungal lipitin 14-24 arasında karbon atomu içeren yağ
asitlerinden oluştuğunu bildirmiştir. Başlıca görülen yağ asitlerinin palmitik ve oleik
asit olduğunu bildirmişlerdir. Besiyerindeki su içeriği %88, %92 ve %98 olduğunda
palmitik asit içeriği %27–34, % 24–35, %26–39; oleik asit içeriği ise %49–54, %49–
55 ve %37–53 olarak bildirilmiştir. Araştıcılara göre fungal lipit içersinde uzun alifatik
29
zincirlerin bulunmuyor olması bu hammaddeden üretilecek biyodizelin yüksek kalitede
olacağını göstermektedir.
2.9 Mikroalg Lipitlerinin Hammadde Olarak Kullanıldığı Çalışmalar
Fotosentetik mikroorganizmaların (algler veya siyanobakteriler) biyodizel üretiminde
hammadde olarak kullanımlarının birçok avantajı vardır. Bunların başında hektar başına
düşen lipit veriminin bitkilerle kıyaslandığında yaklaşık 100 kat daha fazla olması
gelmektedir. Bu özelliği fotosentetik mikroorganizmalara kazandıran, kısa sürede
çoğalabilmeleri, sürekli olarak üretilebilmeleri ve homojen fizyolojik yapıya sahip
olmalarıdır.
Algler farklı yapıda lipitler oluşturabilmek için yapı maddesi olarak yağ asitlerini
sentezlerler. En çok sentezlenen yağ asitleri yüksek bitkilerde olduğu gibi C16 ve C18
zincir uzunluğundadır (Ohlrogge ve Browse, 1995). Yağ asitleri doymuş veya
doymamış olabileceği gibi, doymamış yağ asitlerindeki çift bağın konumu ve sayısı
farklılık gösterebilmektedir. Çalışılan birçok alg türünde genellikle doymuş ve bir tane
çift bağa sahip doymamış yağ asitlerinin olduğu bildirilmiştir (Borowitzka, 1988).
Siyanobakterilerde rastlanan başlıca yağ asitleri C16:0, C16:1 ve C18:1 olarak
bildirilmiştir (Cobelas ve Lechado, 1989, Hu vd. 2008).
Yüksek yapılı bitkilerin aksine alglerde yağ asidi dağılımda çok büyük farklar vardır.
Bazı alg ve siyanobakteriler orta uzunlukta karbon zincirine sahip yağ asitlerini (C10;
C12 ve C14 vb.) sentezleyebilirken, bazıları çok uzun karbon zincirine sahip yağ
asitlerini (>C20) üretebilmektedir (Hu vd. 2008).
Günümüzde mikrobiyel biyodizel hem bilim insanlarının hem de mühendislerin ilgisini
çekmektedir. Bu bağlamda akla gelen en önemli soru mikrobiyel biyodizel üretimi için
hangi fotosentetik mikroorganizmanın kullanılması gerektiğidir. Günümüzde ökaryotik
Chlorella sp. ve Spirulina sp. fotosentetik algleri yapılarının iyi bilinmesinden dolayı
30
araştırmalarda tercih edilmektedir. Bunlara alternatif olarak Synechocystis sp. gibi
fotosentetik siyanobakteriler de dikkat çekmektedir.
Algler depo maddesi olarak yüksek miktarda lipit içerebilirler fakat bunu stres
koşullarında ve yavaş gelişiyorken yaparlar. Bu durumun aksine siyanobakteriler
lipitleri, yüksek oranda fotosentez ve yüksek gelişme hızıyla ilgili olan tilakoid
membranlarında biriktiriler. Bu yüzden fotosentetik bakteriler yüksek miktarda lipit
üretimi için idealdirler. Üstelik siyanobakteriler, genetik manipülasyonlarla lipit üretim
kapasitelerinin iyileştirilmesine ökaryotik alglerden daha uygundur. Örneğin, Vermaas
yaptığı çalışmada (1998) Synechocystis sp. siyanobakterisinin mutantını oluşturarak lipit
içeriğini %50’ye çıkarmıştır (Rittman, 2008).
Scragg vd. (2003) yaptıkları çalışmada; Chlorella vulgaris gibi 5-10 mikrometre çaplı
bazı tek hücreli aglerin emülsiyon bir yakıt olabileceklerini göstermişlerdir. Modifiye
edilmemiş tek silindirli dizel bir makinede denenen emülsiyon, transesterifikasyona
uğratılmış kanola yağı, sürfektant ve C. vulgaris hücrelerinden oluşan bir bulamaçtan
oluşmaktadır. Oluşturulan yakıtın yanması ve emisyonu incelendiğinde dizel yakıtla
kıyaslandığında CO miktarının yüksek (1904 ppm), NOx emisyonunun ise daha düşük
(239 ppm) olduğu bildirilmiştir. Dizel yakıtın viskozitesi 2.6 cP iken alg bulamaçı ve
biyodizel karışımından oluşan emülsiyonun viskozitesi 490 cP olarak bildirilmiştir.
Yakıt tüketimi, ısıl değer ve yakıt kullanımı dizel motorda sırasıyla 0.78 l/saat, 43.3 kJ
g-1, 33.8 kJ/saat iken, %80 biyodizel+%20 alg bulamaçından oluşan yakıtın tüketimi,
ısıl değeri ve yakıt kullanımı 1.06 l/saat, 31.6 kJ g-1, 33.5 kJ/saat olarak bulunmuştur.
Xu vd. (2006) gerçekleştirdikleri çalışmada, Chlorella protothecoids mikroalg
hücrelerini hetetrofik olarak geliştirmişler ve en yüksek lipit içeriğini %55.2 olarak
bulmuşlardır. Fermentörde büyük ölçekle geliştirdikleri hücrelerden n-kekzan ile lipit
eksktrakte etmişlerdir. Elde ettikleri lipitleri asidik bir katalizörle transesterifikasyona
uğratarak biyodizele dönüştürmüşlerdir. Oluşturdukları biyodizel 0.864 kg L-1
yoğunluğunda üst ısıl değere (41 MJ kg-1) ve 5.2x10-4 Pas (40 ºC) viskozite değerine
sahiptir.
31
Literatürde yapılan çalışmalar genellikle ökaryotik mikroalglerin lipit içeriklerini
belirlemeye yöneliktir. Fakat son iki yılda yapılan çalışmalar yukarıda bahsedilen
özelliklerden dolayı mikrobiyel biyodizel yapımında siyanobakterilerin kullanımının
daha avantajlı olduğunu düşündürmesine rağmen literatürde konuyla ilgili çalışma
bulunmamaktadır.
Samorì vd. (2010) yaptıkları çalışmada, Botryococcus braunii mikroalginin hücresinde
biriktirdiği yağı farklı solventler kullanarak ekstrakte etmişlerdir. Bu amaçla sıvı alg
kültürlerinde n-hekzan ile yaptıkları lipit ekstraksiyonunda mikroalgin %5.6 lipit
biriktirdiğini ancak solvent olarak 1,8-diazabicyclo-[5.4.0]-undec-7-ene maddesini
kullandıklarında bu oranın %8.2’ ye çıktığını bulmuşlardır. Aynı alg kültürünün
dondurularak kurutulmuş örneklerinde n-hekzan ekstraksiyonu ile %7.8, 1,8-
diazabicyclo-[5.4.0]-undec-7-ene ekstraksiyonu ile %16 lipit verimi elde etmişlerdir.
Çalışmada azot kaynağı olarak 0.2 g/L KNO3 kullanmışlardır.
Converti vd. (2009) yaptıkları çalışmada, sıcaklığın Nannochloropsis oculata ve
Chlorella vulgaris hücrelerinin lipit içeriği üzerine etkisini 14 günlük inkübasyon süresi
sonunda belirlemişlerdir. Ortam sıcaklığı 20 ºC’den 25 ºC’ye çıkarıldığı zaman N.
oculata lipit içeriğinin %7.90’dan %14.92’ye çıktığı, 25 ºC’den 30 ºC’ye çıkarıldığında
ise C. vulgaris hücrelerinin lipit içeriğinin %14.71’den %5.90’a düştüğü
gözlemlenmiştir. Elde ettikleri lipitin metanol ile transesterifikasyonu sonucunda her iki
mikroalg hücresinde de yüksek miktarda palmitik asit (tüm lipitin yaklaşık olarak %60
mol/mol) varlığını göstermişlerdir. Araştırıcılara göre C. vulgaris hücrelerinde linolenik
asit miktarı Avrupa biyodizel yönetmeliğinin standartlarını taşımakta fakat N. oculata
hücrelerinden sağlanan linolenik asite ek işlem uygulanması gerekmektedir.
Morowwat vd. (2010) yaptıkları çalışmada biyodizel üretiminde hammadde olarak
kullanılmak üzere çeltik tarlasından Chlamydomonas mikroalgi izole etmişlerdir.
Hücreler durgun faza ulaştıktan sonra lipit ekstraksiyonları yapılmıştır. Ekstrakte edilen
lipitler esterifiye edilmiş ve gaz kromotografi cihazında yağ asidi metil esterlerine
bakılmıştır. İzole edilen suşta toplam yağ asidi içeriği %25 olarak belirlenmiştir. Başlıca
yağ asidi dağılımı %9.8 dokosanoik asit, %6.6 tetradekanoik asit, %8.3 tetrakosanoik
32
asit, %12.3 eikosanoik asit, %19.1 heneikosanoik asit, %8.1 nonanoic asit, %4.2
dodekanoik asit, %5.6 heksadekanoik asit, %5.4 pentadekanoik asit olarak bulunmuştur.
Araştırıcılar çeltik tarlasından izole ettikleri için bu mikroalgin gelişimi için ucuz ve
basit bir besiyeri olduğunu ve Chlamydomonas sp. nin biyodizel üretiminde hammadde
olarak kullanımını belirtmişlerdir.
Lee vd. (2010) yaptıkları çalışmada; Botryococcus sp., Chlorella vulgaris, ve
Scenedesmus sp. hücrelerinden daha etkin şekilde lipit elde edebilmek için farklı
yöntemlerle (otoklavlama, mikrodalga, sonikasyon ve %10 NaCl solüsyonuna maruz
bırakma) hücreleri parçalamışlardır. Çalışmada BG-11 besiyerinde geliştirilen
Botryococcus sp. hücreleri 14 gün, Chlorella vulgaris, ve Scenedesmus sp. hücreleri 7
gün süreyle inkübe edilmiştir ve bu hücrelerden 1:1 oranında kloroform: metanol
solüsyonu ile lipit ekstraksiyonu yapılmıştır. Araştırıcılar lipit veriminin alg türüne ve
ekstraksiyon yöntemine göre değiştiğini bulmuşlardır. Mikrodalga fırın yöntemi
denenen tüm türlerde en yüksek lipit eldesini sağlamıştır. En yüksek lipit içeriği %28.6
olarak Botryococcus sp. hücrelerinden diğerlerinin yaklaşık iki kat oranında elde
edilmiştir. Çalışmada, denenen her üç mikroalg hücresinin lipit içeriğinde de oleik ve
linoleik asitlerin daha fazla görüldüğü bildirilmiştir. Oleik asit Botryococcus sp.
Chlorella vulgaris, ve Scenedesmus sp. hücrelerinde sırasıyla %55.7, %16.3 ve %57.2
iken, linoleik asit %34.2, %79.4 ve %36.8’dir.
Chinnasamy vd. (2010) halı endüstrisinden çıkan atık suyunu mikroalg hücrelerinin
gelişimi ve biyodizel üretimi için kullandıkları çalışmalarında atıksuyundan 13 adet
mikroalg izole etmişlerdir (Botryococcus braunii, Chlorella protothecoides, Chlorella
saccharophila var. saccharophila, Chlorella vulgaris, Cricosphaera carterae,
Dunaliella tertiolecta, Nannochloris oculata, Spirulina platensis, Spirulina maxima,
Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii Phaeodactylum tricornutum, Pleurochrysis
carterae). Bu mikroalglerden oluşan konsorsiyumun atıksuda bulunan besinin %96’dan
daha fazlasını kullandıklarını göstermişlerdir. Oluşturulan bu konsorsiyumdan elde
edilen lipitten %63.9 biyodizel verimi elde edilmiştir. Yapılan araştırmada izolasyon ve
zenginleştirme çalışmaları için BG-11 besiyeri kullanılmıştır. Çalışmada Botryococcus
braunii, Chlorella saccharophila, Dunaliella tertiolecta, Pleurochrysis carterae ve
33
mikroalglerden oluşan konsorsiyum gelişimleri ve lipit biriktirme kapasiteleri
bakımından incelenmiştir. BG11, işlenmiş atıksu ve işlenmemiş atıksu besiyerlerinde
geliştirilen Botryococcus braunii mikroalginin lipit konsantrasyonu sırasıyla %13.5,
%9.5, %13.2; Chlorella saccharophila mikroalginin lipit konsantrasyonu sırasıyla
%12.9, %17.0, %18.1; Dunaliella tertiolecta mikroalginin lipit konsantrasyonu sırasıyla
%12.8, %12.2, %15.2; Pleurochrysis carterae mikroalginin lipit konsantrasyonu
sırasıyla %9.7, %11.8, %12.0; konsorsiyumun ise %10.9, %12.2, %12.0 olarak
belirlenmiştir.
Çalışmada algal konsorsiyumun metil esterlerinin çoğunluğunu %15.47 oranında C18:3
(linolenik), %10.54 oranında C18:2 (linoleik), %20.62 oranında C16:0 (palmitik),
%10.58 oranında C18:1 (oleik) ve %6.47 oranında C16:1 (palmitoleik) asidin
oluşturduğu görüşmüştür. Doymamış yağ asitlerinin oranı ise %65.8 olarak
belirlenmiştir.
Damiani vd. (2010) yaptıkları çalışmada; 14 günlük inkübasyon süresi sonucunda
metanol ile yapılan ekstraksiyonlar ile farklı stres koşullarının Haematococcus pluvialis
mikroalginin lipit içeriğine ve kompozisyonuna etkisini araştırmışlardır. Çalışmada
hücreler azot kaynağı olarak NaNO3’ün kullanıldığı Bold’s Bazal Medium’da
geliştirilmiştir. Çalışmada azotun yeterli olduğu ortamda sürekli yüksek ışık şiddeti A
stresi; azotun sınırlı olduğu ortamda sürekli yüksek ışık şiddeti B stresi olarak
tanımlanmıştır. Strese maruz bırakılmayan kontrol hücrelerinde lipit konsantrasyonu
%15.61 iken; A stresine maruz bırakılan hücrelerde %34.85, B stresine maruz bırakılan
hücrelerde %32.99 olarak belirlenmiştir.
Widjaja vd. (2009) yaptıkları çalışmada; Chlorella vulgaris mikroalginin lipit üretimine
CO2, azot sınırlaması, inkübasyon süresi ve ekstraksiyon yöntemi gibi faktörlerin
etkisini araştırmışlardır. Çalışmada azot kaynağı olarak NaNO3 kullanılmış ve hücreler
modifiye edilmiş Fitzgerald besiyerinde geliştirilmiştir. Lipit analizleri sırasında
kurutma sıcaklığının (0, 60, 80, 100 ºC) lipit kompozisyonunun yanı sıra lipit içeriğini
de etkilediğini bulmuşlardır. Çok düşük sıcaklıkta vakum altında kurutmanın en iyi
sonucu verdiğini, 60 ºC’de lipit kompozisyonunun değişmediğini ama toplam lipit
34
içeriğinin düşmeye başladığını bildirmişlerdir. Yüksek sıcaklıkta kurutulan hücrelerde
triaçilgliserol içeriğinde azalma gözlenmiştir. Lipit analizi için hazırlanan örneklerin
daha küçük toz haline getirilmesi ultrasonikasyon yönteminde lipit içeriğini ve
ekstraksiyon süresini etkilememiştir. Ortamda CO2 konsantrasyonunun arttırılması
hücre gelişimini arttırdığından lipit üretimini de arttırmıştır.
Hsieh ve Wu (2009) yaptıkları çalışmada; Chlorella sp. mikroalginin farklı ortam
şartlarında lipit ve biyokütle üretimini araştırmışlardır. Kesikli sistemde 0.025 ve 0.2
g/L üre içeren Walne’s solüsyonu ve vitamin solüsyonu içeren yapay deniz suyunda 6
gün süreyle geliştirilen hücrelerde biyokütle konsantrasyonu ve lipit içeriği sırasıyla
0.464–2.027 g/L ve 0.661–0.326 g/g olarak bulunmuştur. En yüksek lipit prodüktivitesi
0.1 g/L üre içeren ortamda 0.124 g/dL olarak bulunmuştur.
Wang vd. (2010) yaptıkları çalışmada; bileşimindeki azot kaynağı NH4Cl olan Tris-
Asetat-Fosfor (TAP) besiyerinde üretilen Chlorella mikroalginin gelişmesi için
kullanılmış gübrenin besin olarak kullanılmasının etkinliği araştırılmıştır. Farklı
oranlarda seyreltilmiş kullanılmış gübrenin hücre gelişim hızı, besin maddesinin
kullanım etkinliği, algal yağ asidi içeriği ve dağılımı üzerine etkileri 21 günlük
inkübasyon süresi boyunca araştırılmıştır. Daha az seyreltilmiş örneklerde gelişme
hızının daha düşük olduğu görülmüştür. Yağ asidi dağılımına bakıldığında
oktadekadienoik asit (C18:2) ve heksadekanoik asit (C16:0) lerin en fazla bulunduğu
görülmüştür. C18:2 miktarı denenen tüm koşullarda %27.2 -%33.4 oranında; C16:0 ise
%20.6-%26.0 aralığında değişmiştir. Her iki yağ asidinin miktarı da daha seyreltilmiş
oranlarda artmıştır. Seyreltme oranlarının arttırılmasıyla toplam yağ asidi içeriği
%9.0’dan %13.7’ye çıkarılmıştır.
Xin vd. (2009) gerçekleştirdikleri çalışmada atıksu arıtımını ve biyodizel üretimini aynı
anda yapmak amacıyla Scenedesmus sp. LX1 mikroalgini evsel bir atıkta
geliştirmişlerdir. Araştırıcılar inkübasyon süresinin 10. gününde ortamda azot
miktarının azalmasına bağlı olarak mikroalgin lipit içeriğini %14’ten %31’e çıkardığı
bildirmişlerdir. Çalışmada Scenedesmus sp. mikroalginin yanı sıra 11 adet farklı
mikroalg hücresi (Chlorella vuglaris, Chlorella sorokiniana, Schizochytrium sp.,
35
Dunaliella primolecta, Spirulina platensis, Phaeodactytuum ericornutum, Isochorysis
sp. Nitzschia hantzschiana, Cyclotella hebeiana, Botryococcus braunii, Botryococcus
braunii) de bu amaç için denenmiştir. Fakat bu hücrelerin evsel atıkta geliştirildikleri
zaman az biyokütle oluşturabilmiş ve ancak %24-%26 lipit içeriği gösterebilmişlerdir.
Chiu vd. (2009) yaptıkları çalışmada, CO2 havalandırmasının yarı sürekli kültür sistemi
ile modifiye edilmiş yapay deniz suyunda geliştirilen Nannochloropsis oculata
mikroalginin hücre gelişimine ve lipit birikimine olan etkisini araştırmışlardır.
Araştırıcılar farklı gelişme fazlarının hücrelerin lipit içeriğine olan etkisini
araştırdığında, logaritmik fazdan durgun faza geçildiğinde lipit içeriğinin %30.8’den
%50.4’e çıktığı gözlenmiştir. Dört farklı CO2 konsantrasyonunun (%2, %5, %10, %15)
denendiği çalışmada en yüksek biyokütle ve lipit verimine %2 CO2 varlığında ulaşıldığı
bildirilmiştir.
Gerçekleştirilen tez çalışmasında literatürde daha önce çalışılmamış farklı maya,
filamentli fungus ve mikroalg hücreleri olmak üzere yüksek miktarda lipit biriktirebilme
kapasitesine sahip mikroorganizmaları seçmek hedeflenmiştir. Eldesi ve üretim maliyeti
kolay olan bu biyokütlenin en yüksek kapasitede lipit ürettiği şartlar belirlenerek,
biyodizel üretimi için hammadde olarak kullanılabileceğinin gösterilmesi
amaçlanmıştır.
2.10 Tez Çalışmasında Kullanılan Mikroorganizmalar
2.10.1 Funguslar
Funguslar, ökaryot canlılardır ve kendi aralarında küf, mantar ve mayalar olmak üzere
başlıca üç grupta incelenmektedirler. 1.5 milyon türden oluştuğu tahmin edilen
fungusların yaklaşık olarak 100 000 tanesi tanımlanmıştır (Madigan vd. 2009).
36
Funguslar çok çeşitli habitatlara sahiptir. Bazı funguslar sucul ortamlarda yaşarken
birçoğu karasaldır. Toprakta ve ölü bitki artıklarında yaşayarak organik karbon
mineralizasyonunda önemli rol oynarlar (Madigan vd. 2009).
Tek hücreli funguslar olarak bilinen mayaların birçoğu Ascomycetes sınıfına aittir.
Hücreleri genellikle oval veya silindir şeklindedir. Maya hücreleri genellikle tek
hücreler halinde bölünmektedir (http://www.doctorfungus.org/thefungi/index.htm,
2010). Çizelge 2.5’de tez çalışmasında kullanılan fungusların taksonomik
sınıflandırılması verilmiştir.
Çizelge 2.6 Tez çalışmasında kullanılan maya ve filamentli fungusun sınıflandırılması
C. tropicalis C. lypolitica R. mucilaginosa A.versicolor
Alem Fungi Fungi Fungi Fungi
Şube Ascomycota Ascomycota Basidiomycota Ascomycota
Sınıf Ascomycetes Ascomycetes Urediniomycetes -
Ordo Saccharomycetales Saccharomycetales Sporidiales Eurotiales
Familya Saccharomycetaceae Saccharomycetaceae Sporidiobolaceae Trichocomaceae
Cins Candida Candida Rhodotorula Aspergillus
2.10.2 Mikroalgler
Mikroalgler, tatlı su ve denizlerde yaşayan mikroskobik alglerdir. Tek hücre veya grup
halinde bulunabilmektedirler. Fotosentez yapabilme özelliğinde olup yaklaşık olarak
atmosferik oksijenin yarısını üretirken, fototrofik gelişebilmek için karbondioksiti
kullanırlar. 200 000 -800 000 türü olduğu tahmin edilen mikroalglerin 35 000 tanesi
tanımlanmıştır. Ökaryotik mikroalglerin başlıca örnekleri arasında Chlorella sp. ve
Spirulina sp. gelmektedir (http://en.wikipedia.org/wiki/microalgae, 2010,
(http://www.algaebase.org, 2010).
Prokaryotik mikroalgler olarak bilinen siyanobakteriler, filogenetik ağaçta gram pozitif
bakterilere yakındır. Siyanobakteriler oksijenik fototrofturlar. Ökaryotik fototrofların
37
fotosentetik organeli olan kloroplastın siyanobakterilerle ilişkili olduğu
düşünülmektedir. Siyanobakteriler, dünya üzerindeki ilk oksijenik fototroflar olduğu
için evrim açısından önemli canlılardır. Siyanobakteriler filamentli veya tek hücreli
olabileceği gibi koloni de oluşturabilmektedir (Madigan vd. 2009,
http://en.wikipedia.org/wiki/Cyanobacteria, 2010). Çizelge 2.6’da tez çalışmasında
kullanılan siyanobakterilerin taksonomik sınıflandırılması verilmiştir.
Çizelge 2.7 Tez çalışmasında kullanılan mikroalglerin sınıflandırılması
Synechococcus sp. C. aponinum Phormidium sp.
Alem Bacteria Bacteria Bacteria
Şube Cyanobacteria Cyanobacteria Cyanobacteria
Sınıf Cyanophyceae - Cyanophyceae
Ordo Synechococcales Chroococcales Oscillatoriales
Familya Synechococcaceae - Phormidiaceae
Cins Synechococcus Cyanobacterium Phormidium
38
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1 Materyal
3.1.1 Mikroorganizma kaynağı
Gerçekleştirilen tez çalışmasında lipit biriktirme özellikleri araştırılan
mikroorganizmalar Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoteknoloji Araştırma
Laboratuvarı kültür koleksiyonundan sağlanmıştır. Çalışmada 13 adet farklı maya
hücresi, 4 adet farklı fungus hücresi ve 3 tanesi termofil özellikte olmak üzere 5 adet
farklı mikroalg hücresinin lipit biriktirme kapasiteleri araştırılmıştır. Çizelge 3.1 de tez
çalışmasında kullanılan mikroorganizmalar gösterilmektedir.
3.2 Yöntem
3.2.1 Saf kültürlerin eldesi
Atıksulardan alınan toprak ve su örneklerinde bulunan karışık mikrobiyel kütle, pH
değeri 5’e ayarlanmış melaslı agara ekilmiştir. İnkübasyon periyodu sonunda (7 gün)
tek koloni olarak gözlemlenen koloniler saflaştırılmıştır. Çalışma sonucunda lipit
biriktirme özelliklerinin incelenmesi bakımından 3 adet farklı maya ve 1 adet fungus
hücresi izole edilmiştir.
Mikroorganizmalar 3 ayda bir aynı besiyerine ekilip yenilenerek, 4 ºC’de saklanmıştır.
Melaslı Besiyeri Bileşimi
Bileşen Miktar
KH2PO4………………………….............................0.5 (g/l)
(NH4)2SO4………………………………………………………………...1.0 (g/l)
Melas çözeltisi………………………………………%8 (v/v)
Agar…………………………………………………15 (g/l)
39
Çizelge 3.1 Tez çalışmasında kullanılan mikroorganizmalar ve kaynakları
Mayalar
Candida utilis Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Schizosaccharomyces cerevisia Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Kluyveromyces marxianus Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Saccharomyces cerevisia Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Candida sp. Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Candida lambica Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Candida lipolytica Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Candida sp. Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Candida tropicalis Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Candida membranaefaciens Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
1 numaralı izolatı (maya) Atıksudan izole edilmiştir
2 numaralı izolat (maya) Atıksudan izole edilmiştir
3 numaralı izolat (maya) Atıksudan izole edilmiştir
Funguslar
Tramates versicolor Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Rhizophus oryzae Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
Rhizophus arrhizus Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
1 numaralı izolat (fungus) Atıksudan izole edilmiştir
Mikroalgler
1 numaralı mikroalg Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
2 numaralı mikroalg Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
3 numaralı mikroalg Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
4 numaralı mikroalg Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
5 numaralı mikroalg Laboratuvar Kültür Koleksiyonu
40
3.2.2 Saf kültürlerin tanılamaları
Tez çalışmasında izole edilen mikroorganizmalar morfolojik ve bazı fizyolojik
özelliklerine göre teşhis edilmiştir. Buna ek olarak diğer suşlara göre daha yüksek
kapasitede lipit biriktirebilme özelliğine sahip olan maya hücresinin tanılanması 18S
rDNA dizi analizine göre Refgen’de yapılmıştır. Çalışmada kullanılan primerler;
Forward 5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’, Reverse 5’-GGT CCG
TGT TTC AAG ACG G-3’dir (Ertuğrul vd. 2009).
Tez çalışmasında izole edilen ve laboratuvar kültür koleksiyonundakilere göre daha
fazla lipit biriktirebilme özelliği gösteren fungal izolatın tanılanması da 5.8S rDNA dizi
analizine göre Refgen’de yapılmıştır. Çalışmada kullanılan primerler; Forward (5′→3′)
ITS1 5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′, Reverse (5′→3′) ITS4 5′-TCC TCC
GCT TTT GAT ATG C-3′ dir (Taştan vd. 2010).
Tez çalışmasında kullanılan ve yüksek kapasitede lipit biriktirebilme özelliğine sahip 1
ve 5 numaralı mikroalg hücrelerinin tanılanması morfolojik ve fizyolojik özelliklerine
göre; 3 numaralı mikroalg hücresinin tanılanması Refgen’de Forward (5′→3′) AGA
GTT TGA TCM TGG CTC AG, Reverse (5′→3′) TAC GGY TAC CTT GTT ACG
ACT T primerleri kullanılarak yapılmıştır.
3.2.3 Yüksek kapasite ile lipit üreten mikroorganizma seçimi
Biyodizelin üretim sürecinde maliyetin büyük bir bölümünü hammaddenin oluşturduğu
göz önünde bulundurularak, maya ve fungus hücrelerinin mikrobiyel lipit üretim
kapasitelerinin belirlenmesi çalışmaları melaslı sıvı besiyerinde gerçekleştirilmiştir.
Tez çalışmasında mikroalg hücreleri gelişim ve lipit üretim kapasitelerinin belirlenmesi
amacıyla azot içeren BG-11 besiyerinde geliştirilmiştir.
41
BG 11 Besiyeri Bileşimi
Bileşen Miktar(g/L)
NaNO3...........................................................................1.5
MgSO4.7H2O.................................................................0.075
K2HPO4.........................................................................0.04
CaCl2.2H2O....................................................................0.03
Na2CO3..........................................................................0.02
Sitrik asit........................................................................6.0
Ferrik amonyum sitrat....................................................6.0
Na2EDTA.......................................................................1.0
Eser element A5 karışımı……………...........................1.0 ml/L
Eser element A5 karışımı Miktar(g/L)
H3BO4...........................................................................2.86
MnCl2.4H2O..................................................................1.81
NaMoO4.2H2O...............................................................0.39
ZnSO4.7H2O..................................................................0.222
CuSO4.5H2O..................................................................0.079
Co(NO3)2.6H2O.............................................................0.049
Mikrobiyel lipit üretiminin belirlenmesi çalışmaları, 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik
besiyerlerinde 30 ºC’de ve 100 rpm karıştırma hızındaki çalkalayıcıda (New Bruswick
Scientific Innova 4230) maya hücreleri için 6, fungus hücreleri için 10 gün boyunca
gerçekleştirilmiştir.
Mikroalg hücrelerinin lipit üretim kapasitelerinin belirlenmesi çalışmaları da 250 ml’lik
erlenlerdeki 100 ml’lik besiyerlerinde 30 ºC’de 2400 lux ışık şiddetindeki iklim
dolabında (Lab Line) 30 gün boyunca gerçekleştirilmiştir.
42
3.2.4 Mikrobiyel lipit üretimi için optimum koşulların belirlenmesi
Üretim koşulları
Tez çalışması süresince yapılan tüm deneylerde maya ve fungus hücreleri melaslı sıvı
besiyerinde, 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik besiyerlerinde 30 ºC’de ve 100
devir/dakika karıştırma hızındaki çalkalayıcıda (New Bruswick Scientific Innova 4230)
geliştirilmiştir. Tez çalışması süresince yapılan tüm deneylerde mikroalg hücreleri 250
ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik besiyerlerinde 30 ºC’de 2400 lux ışık şiddetindeki iklim
dolabında (Lab Line) geliştirilmiştir.
Besiyeri bileşiminin etkisi
Maya hücrelerinde biriktirilen lipit miktarına mikroorganizmanın geliştiği besiyerinin
etkisini belirlemek amacıyla iki farklı maya hücresi pH değeri 5’e ayarlanmış hem
melaslı hem de zengin besiyerine inoküle edilmiştir. Maya hücreleri 250 ml’lik
erlenlerdeki 100 ml’lik besiyerlerinde 30 ºC’de ve 100 devir/dakika karıştırma hızındaki
çalkalayıcıda (New Bruswick Scientific Innova 4230) 6 gün boyunca geliştirilmiş ve 3.
ve 6. gün sonunda lipit analizleri yapılmıştır.
Zengin Besiyeri Bileşimi
Bileşen Miktar (g/l)
Glukoz………………………………………………..20
Pepton………………………………………………...10
Maya özütü…………………………………………....3
Besiyeri pH değerinin etkisi
Besiyerinin başlangıç pH değerinin mikrobiyel lipit üretimi üzerindeki etkisini
belirlemek amacıyla maya hücreleri için 4, 5, 6, ve 7 pH değerleri, fungus hücreleri için
43
4, 5, ve 6 pH değerleri, mikroalg hücreleri için ise 6, 7, 8, ve 9 pH değerleri
denenmiştir.
Azot miktarı ve çeşidinin etkisi
Farklı azot konsantrasyonlarının maya hücrelerinin lipit üretimi üzerine etkisini
araştırmak amacıyla her bir maya hücresi için elde edilen optimum pH değerinde 0.5,
1.0, ve 1.5 g/L olmak üzere üç farklı (NH4)2SO4 konsantrasyonları denenmiştir. Fungal
hücrelerin lipit üretimlerini arttırmak amacıyla (NH4)2SO4’a ek olarak dört tanesi
inorganik iki tanesi organik olmak üzere farklı azot kaynakları besiyerine eklenmiştir.
Daha sonra yapılan çalışmalarda en yüksek seviyede lipit üretimi sağlayan azot
çeşidinin üç farklı konsantrasyonları (0.5, 1.0, ve 1.5 g/L) denenmiştir.
Mikroalg hücrelerinin lipit üretimine azot miktarının belirlenmesi adına yapılan
çalışmalarda besiyerine eklenen NaNO3’ın 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 g/L olmak üzere dört farklı
konsantrasyonu denenmiştir.
Karbon miktarının etkisi
Maya hücrelerinin lipit üretimine besiyerindeki karbon miktarının etkisini belirlemek
için yapılan çalışmalarda optimum pH ve azot konsantrasyonunda 4 günlük inkübasyon
süresi boyunca %6, %8, ve %10 olmak üzere üç farklı melas solüsyonuna ek olarak 2,
4, ve 6 g/L glukoz miktarının da etkisi belirlenmiştir. Fungal hücrelerin lipit üretimine
farklı karbon miktarlarının etkisini belirlemek için yapılan çalışmalarda optimum pH ve
azot konsantrasyonunda 8 günlük inkübasyon süresi boyunca %6, %8, ve %10 olmak
üzere üç farklı melas solüsyonu denenmiştir. Mikroalg hücrelerinin lipit üretimine
karbon miktarının etkisini belirlemek için yapılan çalışmalarda optimum pH ve azot
konsantrasyonunda 30 günlük inkübasyon süresi boyunca NaHCO3’ın üç farklı
konsantrasyonu (34, 43, 51 ppm) besiyerine eklenmiştir. Mikroalglerle yapılan
çalışmalarda buna ek olarak triakontanol hormonunun lipit verimi üzerindeki etkisine de
bakılmıştır.
44
İnkübasyon süresinin etkisi
İnkübasyon süresinin maya hücrelerinin lipit üretimine etkisini belirlemek için yapılan
çalışmalarda optimum pH, azot ve karbon konsantrasyonunda geliştirilen kültürlerden 2,
4, ve 6. günlerde örnekler alınarak lipit ekstraksiyonu yapılmıştır. İnkübasyon süresinin
fungus hücrelerinin lipit üretimine etkisini belirlemek için yapılan çalışmalarda
optimum pH, azot ve karbon konsantrasyonunda geliştirilen kültürlerden 4, 6, 8, ve 10.
günlerde örnekler alınarak lipit ekstraksiyonu yapılmıştır. İnkübasyon süresinin
mikroalg hücrelerinin lipit üretimine etkisini belirlemek için yapılan çalışmalarda
optimum pH ve azot konsantrasyonunda geliştirilen kültürlerden 10, 15, 20 ve 30.
günlerde örnekler alınarak lipit ekstraksiyonu yapılmıştır.
3.2.5 Transesterifikasyon reaksiyonu
Tez çalışmasında kullanılan mayalar, en yüksek lipit içeriğine ulaştıkları pH 5, 1 g/L
(NH4)2SO4 ve %8 melas içeren besiyerinde 4 gün boyunca 250 ml’lik erlenlerdeki 100
ml’lik besiyerlerinde 30 ºC’de ve 100 devir/dakika karıştırma hızındaki çalkalayıcıda
(New Bruswick Scientific Innova 4230) geliştirilmiş ve biriktirdikleri lipit ekstrakte
edilmiştir.
Tez çalışmasında kullanılan fungus, en yüksek lipit içeriğine ulaştığı pH 4, 1 g/L KNO3
ve %6 melas içeren besiyerinde 8 gün boyunca 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik
besiyerlerinde 30 ºC’de ve 100 rpm karıştırma hızındaki çalkalayıcıda (New Bruswick
Scientific Innova 4230) geliştirilmiş ve biriktirdiği lipit ekstrakte edilmiştir.
Tez çalışmasında kullanılan her bir mikroalg hücresi maksimum lipit biriktirebildikleri
pH (Synechococcus sp. için pH 7, Cyanobacterium aponinum için pH 8, Phormidium
sp. için pH 9), azot konsantrasyonu (0.25 g/L NaNO3) ve inkübasyon süresinde (15 gün)
geliştirilmiştir. Bunlara ek olarak denenen her üç mikroalg için de en yüksek seviyede
lipit üretebildikleri optimum şartlarda besiyerine 10 ppm triakontanol hormonu ve üç
farklı (34, 43, 51 ppm) NaHCO3 konsantrasyonu eklenmiştir. Bahsedilen bu
45
besiyerlerinde 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik besiyerlerinde 30 ºC’de 2400 lux ışık
şiddetindeki iklim dolabında (Lab Line) geliştirilen mikroalg hücrelerinden lipit
ekstraksiyonları yapılmıştır.
Maya, fungus ve mikroalg hücrelerinden elde edilen lipit transesterifikasyon
reaksiyonuna uğratılmış ve oluşan yağ asidi metil esterleri Gaz Kromatografi cihazında
belirlenmiştir (Karatay ve Dönmez 2010).
3.2.6 Analiz yöntemleri
Optik yoğunluğun belirlenmesi
İnkübasyon süresi boyunca erlenlerde geliştirilen maya hücrelerinden belirli zaman
aralıklarında alınan örnekler, 5000 devir/dakika’da 10 dakika santrifüjlenmiştir. Çökelti,
fizyolojik tuzlu su ile yıkanmış ve gerekli seyreltmeler yapıldıktan sonra optik yoğunluk
600 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak belirlenmiştir (Karatay ve Dönmez
2010).
Kuru ağırlığın belirlenmesi
Geliştirilen fungus ve mikroalg hücreleri boş ağırlığı alınmış alüminyum folyolara
aktarılarak etüvde (Nüve FN 400) 80 ºC’de bir gece boyunca kurutulmuş ve tartılmıştır
(Karatay ve Dönmez 2010).
Maya hücrelerinden lipit elde edilmesi
Lipit analizleri maya hücreleri için Bligh ve Dyer (1959) lipit ekstraksiyon yöntemine
göre yapılmıştır.
Maya hücrelerinden lipit elde edilmesi için iki kez aktifleştirilmiş kültürler 250 ml
hacmindeki erlenlerde 100 ml olarak hazırlanmış melaslı sıvı besiyerlerine %2 oranında
46
ekilmiştir. Mikrobiyel lipit eldesi için 11 adet farklı maya hücresinin gelişimlerinin
dördüncü gününde aşağıdaki işlemler yapılmıştır:
a) Besiyeri 10.000 x g’de 5 dakika santrifüj yapılarak uzaklaştırılmıştır.
b) 1 gram ağırlığındaki çökelti 1 ml kloroform ve 2 ml metanol ile 4 saat karıştırılmıştır.
c) 1 ml kloroform ve 1 ml distile su eklenerek 30 dakika boyunca oda sıcaklığında
karıştırılmıştır.
d) Karışım Whatman no 1 filtre kağıdından geçirilmiştir.
e) Filtrat dereceli cam kaba koyulup, tabakaların ayrımı sağlanarak metanol-su tabakası
uçurulmuştur.
f) Filtrenin üstünde kalan biyokütle 1 ml kloroform ile tekrar ekstrakte edilip, 2.5 ml
kloroform ile çalkalanmış ve ilk ekstraksiyonun kloroform tabakası ile birleştirilmiştir.
g) Kloroform ekstraktları darası bilinen tüplere alınmış ve 40 ºC’de uçurularak elde
edilen lipit gravimetrik olarak tayin edilmiştir.
Fungus hücrelerinden lipit elde edilmesi
Fungus hücrelerinin lipit analizleri Zhu vd. (2002) yöntemine göre yapılmıştır.
Fungus hücrelerinden lipit elde edilmesi için iki kez aktifleştirilmiş kültürler 250 ml
hacmindeki erlenlerde 100 ml olarak hazırlanmış melaslı sıvı besiyerlerine ekilmiştir.
Mikrobiyel lipit eldesi için 4 adet farklı fungus hücresinin gelişimlerinin onuncu
gününde aşağıdaki işlemler yapılmıştır:
a) Besiyeri 10.000 x g’de 30 dakika santrifüj yapılarak uzaklaştırılmıştır.
b) Çökelti alınmış ve 70 ºC’de bir gece boyunca kurutulmuştur.
c) Kurutulan fungal hücreler havanda dövülerek toz haline getirilmiştir.
d)Toz halindeki bu hücrelerden 50 mg alınarak 2:1 oranında karıştırılan
kloroform:metanol karışımı ile 1 saat boyunca muamele edilmiştir.
e) 10.000 x g’de 5 dakika santrifüj yapılarak toz haldeki hücre solventten ayrılmıştır.
47
f) Kloroform:metanol karışımı darası alınmış tüpe aktarılmış, 50 ºC’de solventin
uzaklaştırılması sağlanmıştır.
g) Ekstrakte edilen lipit gravimetrik olarak ölçülmüştür.
Mikroalg hücrelerinden lipit elde edilmesi
Mikroalg hücrelerinin içerdikleri lipit miktarı Xu vd. (2006) kullandıkları yönteme göre
belirlenmiştir.
Mikroalg hücrelerinden lipit elde edilmesi için iki kez aktifleştirilmiş kültürler 250 ml
hacmindeki erlenlerde 100 ml olarak hazırlanmış sıvı BG-11 besiyerlerine %5 oranında
ekilmiştir. Mikrobiyel lipit eldesi için 5 adet farklı mikroalg hücresinin gelişimlerinin
otuzuncu gününde aşağıdaki işlemler yapılmıştır:
a) Besiyeri 10.000 x g’de 30 dakika santrifüj yapılarak uzaklaştırılmıştır.
b) Çökelti alınmış ve 70 ºC’de bir gece boyunca kurutulmuştur.
c) Kurutulan mikroalg hücreleri havanda dövülerek toz haline getirilmiştir.
d)Toz halindeki bu hücrelerden 50 mg alınarak 2:1 oranında karıştırılan
kloroform:metanol karışımı ile 1 saat boyunca muamele edilmiştir.
e) 10.000 x g’de 5 dakika santrifüj yapılarak toz haldeki hücre solventten ayrılmıştır.
f) Kloroform:metanol karışımı darası alınmış tüpe aktarılmış, 50 ºC’de solventin
uzaklaştırılması sağlanmıştır.
g) Ekstrakte edilen lipit gravimetrik olarak ölçülmüştür.
Mikrobiyel lipitlerin transesterifikasyonu
Optimum şartlarda geliştirilen maya, fungus ve mikroalg hücrelerinden elde edilen
lipitler, ISO-5509,2000 yöntemine göre aşağıda belirtilen şekilde transesterifikasyon
reaksiyonuna uğratılmıştır.
48
a) 0.1 gr yağ 15 ml'lik ağzı kapaklı plastik santrifüj tüpüne alınmıştır.
b) Üzerine 10 ml n-hekzan eklenmiş ve kuvvetlice karıştırılmıştır.
c) 0.5 ml 2N metanollü KOH çözeltisi eklenmiştir ve karıştırılmıştır.
d) Üst faz berraklaşana kadar karanlık ortamda 2 saat bekletilmiştir.
e) Üst fazdan 1 µl örnek gaz kromatografi cihazına enjekte edilmiştir.
Yağ asidi metil esterlerinin Gaz Kromatografi cihazında analizi
Mikrobiyel lipitlerin transesterifikasyon reaksiyonu sonucu oluşan metil esterleri Gaz
Kromatografi cihazı ile belirlenmiştir (Karatay ve Dönmez 2010). Transesterifikasyon
reaksiyonundan sonra, üst fazdan 1 µl örnek alınmış ve metillenmiş bu yağ asitleri GC-
2010 gas-chromatograph (Shimadzu, Japan) ile analiz edilmiştir. Gaz Kromatografi
cihazında sıcaklığı 240 ºC olan Alev İyonlaştırmalı Dedektör (FID) ve TR-CN100, 60
m x 0.25 mm x 0.20 mm (Teknokroma) kolonu ve taşıyıcı gaz olarak N2 kullanılmıştır.
Yağ asidi pikleri karışık yağ asidi metil esteri standardına göre belirlenmiştir (37 Comp.
FAME Mix 10 mg/ml in CH2CL2; Supelco, USA).
49
4. ARAŞTIRMA BULGULARI
Tez çalışmasında maya, fungus ve mikroalglerin yüksek kapasite ile hücre içi lipit
biriktirdiği koşullar belirlenerek, gaz kromatografisinde oluşan metil esterlerinin
bulunması ile biyodizel olarak kullanım kapasiteleri gösterilmiştir.
4.1 İzolasyon ve Tanılama
Tez çalışmasında kullanılmak üzere 3 adet farklı maya izole edilmiştir. Bu izolatlar
arasından en yüksek kapasitede lipit üreten 1 numaralı izolat 18S rDNA dizi analizine
göre Refgen’de tanılanmış ve bu izolatın Rhodotorula mucilaginosa olduğu
belirlenmiştir.
Tez çalışmasında kullanılmak üzere 1 adet fungus izole edilmiştir ve 5.8S rDNA dizi
analizine göre Refgen’de tanılanmıştır. Tanılama işlemi sonucunda bu fungal izolatın
Aspergillus versicolor olduğu belirlenmiştir.
Tez çalışmasında kullanılan ve yüksek kapasitede lipit biriktirebilme özelliğine sahip 3
numaralı mikroalg hücrelerinin tanılanması Refgen’de tanılanmıştır. Tanılama işlemi
sonucunda bu mikroalgin Cyanobacterium aponinum olduğu belirlenmiştir. Çalışmada
kullanılan 1 ve 5 numaralı mikroalglerin tanılanmaları ise morfolojik ve fizyolojik
özelliklerine göre yapılmış ve 1 numaralı mikroalgin Synechococcus sp., 5 numaralı
mikroalgin Phormidium sp. olduğu belirlenmiştir.
4.2 Besiyeri Bileşimlerinin Belirlenmesi
Çalışmada seçilen iki farklı maya türü pH 5’de hem melaslı besiyerinde hem de zengin
besiyerine 2/100 oranında ekilmiştir. Denemeler, 250 ml lik erlenlerdeki 100 ml lik
besiyerlerinde, 100 rpm çalkalama hızındaki inkübatörde, 30 ºC de gerçekleştirilmiştir
Gelişme periyodunun 3. ve 6. gününde maya hücrelerinin içerdikleri toplam lipit
miktarları Çizelge 4.1’de gösterilmiştir.
50
Çizelge 4.1 Farklı besiyeri bileşimlerinin maya hücrelerinin lipit birikimi üzerine etkisi
4.3 Maya Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması
4.3.1 Yüksek kapasitede lipit üreten maya hücrelerinin seçimi
Hücrelerin lipit içeriği, yaş hücre ağırlığına tekabül eden kuru hücre ağırlığı başına
düşen lipit miktarı olarak yüzde cinsinden hesaplanmıştır (Li vd. 2007).
13 maya suşunun lipit biriktirme kapasiteleri pH’ı 6’ya ayarlanmış melaslı
besiyerlerinde inkübasyon sürelerinin ikinci ve dördüncü günlerinde belirlenmiştir. lipit
konsantrasyonlarının % olarak ifade edildiği Çizelge 4.2’de Candida lypolitica,
Candida tropicalis ve Rhodotorula mucilaginosa (1 numaralı izolat)’ın diğer hücrelere
göre daha fazla miktarda lipit ürettiği görülmektedir. Bu sebeple besiyerinin başlangıç
pH’ının, (NH4)2SO4, melas ve glukoz konsantrasyonun ve inkübasyon süresinin maya
hücrelerinin içerdikleri lipit miktarına olan etkilerinin araştırıldığı çalışmalarda bu üç
maya kullanılmıştır.
Maya 3. gün lipit konsantrasyonu (%) 6. gün lipit konsantrasyonu (%)
melaslı besiyeri zengin besiyeri melaslı besiyeri zengin besiyeri
R. mucilaginosa 21.3 ±2.4 7.9 ±1.7
7.7 ±1.5
17.9 ±2.1
S. cerevisia
10.1 ±2.2
11.9 ±1.9
10.5 ±1.4
6.5 ±1.1
51
Çizelge 4.2 Farklı maya hücrelerinin melaslı besiyerinde gelişimlerinin 2. ve 4.
günlerinde gösterdikleri lipit içerikleri (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH 6).
Maya
Lipit konsantrasyonu (%)
2. gün 4. gün
Candida utilis 15.4 ±1.2 17.4 ±2.2
Schizosaccharomyces cerevisia 16.1 ±0.9 35.8 ±2.5
Kluyveromyces marxianus 18.6 ±1.8 9.8 ±1.1
Saccharomyces cerevisia 8.9 ±1.3 27.5 ±3.2
Candida sp. 21 ±1.4 22.8 ±2.2
Candida lambica 34.8 ±3.4 25.8 ±3.0
Candida lipolytica 13.8 ±1.5 37.1 ±3.4
Candida sp. 36 ±3.2 35.4 ±3.7
Candida tropicalis 23.1 ±2.6 41.2 ±3.1
Candida membranaefaciens 29.6 ±3.3 20.7 ±2.6
R. mucilaginosa (1 numaralı izolat)
20.4 ±2.7 51.7 ±4.4
2 numaralı izolat 17.4 ±2.1 25.6 ±2.8
3 numaralı izolat 19.1 ±2.7 25.2 ±2.1
52
4.3.2 Maya hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine ortam pH’ının etkisinin belirlenmesi
Besiyeri pH değerinin maya hücrelerinin lipit birikimine etkisi melaslı besiyerinde
inkübasyon süresinin dördüncü gününde bulunmuştur. Bu amaçla deneyler başlangıç
pH değerleri 4, 5, 6 ve 7’ye ayarlanmış besiyerlerinde yapılmıştır. Çizelge 4.3’de
görüldüğü gibi C. lypolitica hücreleri pH 4, 6, ve 7’ de sırasıyla %31.5, %37.1, ve
%34.4 oranında lipit biriktirebilmiştir. Hücreler en yüksek lipit içeriğine %59.9 oranıyla
pH’ ı 5 olan besiyerinde ulaşmıştır. C. tropicalis ve R. mucilaginosa hücrelerinde de
buna benzer eğilim gözlenmiştir ve her iki maya hücresi de maksimum lipit içeriklerine
sırasıyla %46.8 ve %69.5 olarak pH 5 değerinde ulaşabilmiştir. C. tropicalis hücreleri
lipit bileşiklerini sentezlerken ortamın pH değerindeki değişikliklerden çok fazla
etkilenmemiştir. Öte yandan R. mucilaginosa hücreleri ortamın pH değerinden
etkilenmiş, C. lipolytica hücrelerinin lipit birikiminde ise pH 5 değerinin altında ve
üstünde keskin bir düşüş gözlenmiştir.
Çizelge 4.3 C.lipolytica, C.tropicalis ve R.mucilaginosa hücrelerinin lipit konsantrasyonuna besiyeri pH’ının etkisinin belirlenmesi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika)
Lipit konsantrasyonu
(%)
pH C.lipolytica C.tropicalis R.mucilaginosa
4 31.5 ±2.7 44.8 ±3.1 50.8 ±3.7
5 59.9 ±3.2 46.8 ±3.9 69.5 ±4.9
6 37.1 ±3.9 41.2 ±3.0 51.7 ±3.3
7 34.4 ±3.6 42.0 ±2.9 64.5 ±4.7
53
4.3.3 Maya hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine azot miktarının etkisinin belirlenmesi
Besiyerinde artan azot miktarının C.lipolytica, C.tropicalis, R.mucilaginosa
hücrelerindeki lipit birikimine etkisini incelemek amacıyla üç farklı (NH4)2SO4
konsantrasyonu (0.5, 1.0, ve 1.5 g/L) melaslı besiyerine eklenmiştir. Her üç maya
hücresinin lipit içeriğinin (NH4)2SO4 miktarı 1.5 g/L olduğu zaman azaldığı
görülmüştür. Çizelge 4.4’de C. lypolitica ve R. mucilaginosa hücrelerinin lipit
içeriklerinin (NH4)2SO4 konsantrasyonunun 0.5 g/L olması durumunda da azaldığı
görülmektedir. Örneğin 0.5 g/L (NH4)2SO4 varlığında C. lypolitica hücreleri %24.6, R.
mucilaginosa hücreleri %39.6 oranında lipit biriktirebilmektedir. Diğer taraftan C.
tropicalis hücreleri 0.5 ve 1.0 g/L (NH4)2SO4 varlığında birbirine yakın miktarda lipit
üretmişlerdir. Çizelge 4.4’de C.lipolytica C.tropicalis R.mucilaginosa hücrelerinin de
en yüksek lipit içeriklerine 1.0 g/L (NH4)2SO4 varlığında sırasıyla %59.9, %46.8.
%69.5 olarak ulaştıkları görülmüştür.
Çizelge 4.4 C.lipolytica, C.tropicalis ve R.mucilaginosa hücrelerinin lipit konsantrasyonuna başlangıç (NH4)2SO4 konsantrasyonunun etkisinin belirlenmesi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5).
Lipit konsantrasyonu
(%)
(NH4)2SO4 (g/L)
C.lipolytica C.tropicalis R.mucilaginosa
0.5 24.6 ±2.7 45.6 ±3.7 39.6 ±2.9
1.0 59.9 ±3.2 46.8 ±3.9 69.5 ±4.9
1.5 32.6 ±3.0 12.4 ±1.7 40.8 ±3.8
54
4.3.4 Maya hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine karbon miktarının etkisinin belirlenmesi Maya hücrelerinin lipit üretimlerine karbon miktarının etkisini belirlemek amacıyla üç
farklı oranda melas solüsyonu içeren besiyerleri hazırlanmıştır. Çizelge 4.5’de
çalışmalar sonucunda C.lipolytica C.tropicalis R.mucilaginosa maya hücrelerinin
maksimum lipit biriktirebilmeleri için optimum melas çözeltisi oranı %8 olarak
bulunmuştur. Besiyerindeki melas miktarı azaltıldığı zaman maya hücrelerinde daha az
oranda lipit birikimi olduğu gözlenmiştir. Öte yandan besiyerindeki melas miktarı %10’
a çıkarıldığı zaman melasın hücre gelişimi üzerine olan toksik etkisinden kaynaklanan
düşük lipit üretimi elde edilmiştir. Melasın bu toksik etkisine rağmen maya hücrelerinin
%10 melas içeren besiyerinde %6 oaranında melas içeren besiyerine kıyasla daha fazla
lipit biriktirebildiği gözlenmiştir.
Besiyerindeki artan karbon miktarının C.lipolytica, C.tropicalis ve R.mucilaginosa
hücrelerinin lipit içeriğine etkisini belirlemek amacıyla büyüme ortamına 2, 4, ve 6 g/L
olacak şekilde glukoz eklenmiştir. Bu besiyerinde geliştirilen mayaların inkübasyon
sürelerinin 4. gününde lipit analizi yapılmıştır. Sonuçta her üç maya hücresinin de 4.
gün sonunda ortamda 4 g/L glukoz varken daha yüksek kapasitede lipit biriktirebildiği
gözlenmiştir. Bu durum C.lipolytica, C.tropicalis hücrelerinde daha net anlaşılırken,
R.mucilaginosa hücrelerinin 4. gün sonunda ürettikleri lipit miktarları 2 ve 4 g/L glukoz
içeren ortamda birbirine oldukça yakın olmuştur. Şekil 4.1’de her üç maya hücresinin de
ortamda 6 g/L glukoz varken 4. gün sonunda daha az lipit üretebildiği bulunmuştur.
55
Çizelge 4.5 C.lipolytica, C.tropicalis ve R.mucilaginosa hücrelerinin lipit konsantrasyonuna başlangıç melas konsantrasyonunun etkisinin belirlenmesi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5; 1 g/L (NH4)2SO4).
Lipit konsantrasyonu
(%)
Melas solüsyonu (% v/v)
C.lipolytica C.tropicalis R.mucilaginosa
6 ml 16.3 ±1.7 24.2 ±2.9 38.5 ±3.3
8 ml 59.9 ±3.2 46.8 ±3.9 69.5 ±4.9
10 ml 32.1 ±2.8 26.6 ±2.8 49.3 ±3.8
Şekil 4.1 Farklı glukoz konsantrasyonlarının maya hücrelerinin lipit biriktirme kapasiteleri üzerine etkisi
0
10
20
30
40
50
60
70
C. tropicalis C. lipolytica R. mucilaginosa
% lip
it k
onsantrasyonu
2 g/L 4 g/L 6 g/L
glukoz
56
4.3.5 Maya hücrelerinin gelişimine ve lipit üretimine inkübasyon süresinin etkisinin belirlenmesi
Gelişim süresinin maya hücrelerinin lipit biriktirme kapasitelerine etkisini belirlemek
için inkübasyon süresinin 2, 4, ve 6. günlerinde lipit analizleri yapılmıştır. Şekil 4.2’de
C.lipolytica hücreleri en yüksek lipit içeriklerini %38.6 olarak inkübasyon süresinin 4.
gününde göstermişlerdir. Şekil 4.3’de gelişme ortamına 4 g/L glukoz eklendiği zaman
C.lipolytica hücreleri yine 4. gün sonunda %37.5 oranında lipit içeriği göstermişlerdir.
Glukoz içeren ve içermeyen besiyerlerinde geliştirilen hücrelerin mikrobiyel gelişme
durumlarına bakıldığında, her ikisinin de 4. gün sonunda en yüksek seviyeye ulaştığı
görülmektedir.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 4 6inkübasyon süresi (gün)
mik
robiy
el geliş
me (O
D600)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
% lip
it k
onsantrasyonu
mikrobiyel gelişme lipit konsantrasyonu
Şekil 4.2 C. lypolitica hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna inkübasyon süresinin etkisi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5; 1 g/L (NH4)2SO4; 8% melas solüsyonu).
57
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 4 6inkübasyon süresi (gün)
mik
robiy
el geliş
me (O
D600)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lipit k
onsantrasyonu (%
)
mikrobiyel gelişme (glukoz +)
lipit konsantrasyonu (glukoz +)
Şekil 4.3 C. lypolitica hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna 4 g/L glukoz içeren ortamda inkübasyon süresinin etkisi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5; 1 g/L (NH4)2SO4; 8% melas solüsyonu).
Şekil 4.4’de C.tropicalis hücrelerinin glukoz içeren ve içermeyen ortamdaki lipit
içeriklerine bakıldığı zaman, glukoz içermeyen ortamda en yüksek lipit içeriği %42
olarak 4. gün sonunda elde edilmiştir. Şekil 4.5’de glukoz içeren ortamda ise %43.1
olan bu değere daha hızlı sürede yani inkübasyon süresinin 2. gününde ulaşılmış ve
ilerleyen günlerde lipit içeriğinde hızlı bir düşüş gözlenmiştir. Glukoz içermeyen
ortamda ise hem lipit içeriği hem de mikrobiyel gelişme hızı 4. ve 6. günlerde birbirine
yakın olmuştur.
R. mucilaginosa hücrelerinin glukoz içeren ve içermeyen ortamda 2. gün sonunda
biriktirdikleri lipit miktarları birbirine yakındır. Şekil 4.6’da glukoz içermeyen ortamda
bu hücrelerin 4. gün sonunda daha fazla lipit ürettiği gözlemlenmiştir. Bu hücrelerin
gösterdikleri en yüksek lipit içerikleri glukoz içeren ortamda %49.2, içermeyen ortamda
ise %55.7 olarak bulunmuştur. Şekil 4.7’de hücre gelişimleri ise her iki ortamda
birbirine benzemekle birlikte glukoz içermeyen ortamda küçük miktarda fazlalık
görülmektedir.
58
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 4 6inkübasyon süresi (gün)
mik
robiy
el geliş
me (O
D600)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
% lip
it k
onsantrasyonu
mikrobiyel gelişme lipit konsantrasyonu
Şekil 4.4 C. tropicalis hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna inkübasyon süresinin etkisi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5; 1 g/L (NH4)2SO4; 8% melas solüsyonu).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 4 6inkübasyon süresi (gün)
mik
robiy
el geliş
me (O
D600)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
lipit k
onsantrasyonu (%
)
mikrobiyel gelişme (glukoz +)
lipit konsantrasyonu (glukoz +)
Şekil 4.5 C. tropicalis hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna 4 g/L glukoz içeren ortamda inkübasyon süresinin etkisi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5; 1 g/L (NH4)2SO4; 8% melas solüsyonu).
59
Şekil 4.6 R. mucilaginosa hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna inkübasyon süresinin etkisi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5; 1 g/L (NH4)2SO4; 8% melas solüsyonu).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 4 6inkübasyon süresi (gün)
mik
robiy
el geliş
me (O
D600)
0
10
20
30
40
50
60
lipit k
onsantrasyonu (%
)
mikrobiyel gelişme (glukoz +)
lipit konsantrasyonu (glukoz +)
Şekil 4.7 R. mucilaginosa hücrelerinin gelişimine ve içerdikleri lipit konsantrasyonuna 4 g/L glukoz içeren ortamda inkübasyon süresinin etkisi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5; 1 g/L (NH4)2SO4; 8% melas solüsyonu).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 4 6inkübasyon süresi (gün)
mik
robiy
el geliş
me (O
D600)
0
10
20
30
40
50
60
70
% lip
it k
onsantrasyonu
mikrobiyel gelişme lipit konsantrasyonu
60
4.3.6 Maya hücrelerindeki lipitlerin yağ asidi metil esteri dağılımları
En yüksek seviyede lipit üretimi için sağlanan optimum koşullarda melaslı besiyerinde
geliştirilen C. lipolytica, C. tropicalis ve R. mucilaginosa hücrelerinden elde edilen
lipitlerin transesterfikasyonu sonucu elde edilen yağ asidi metil esterleri Çizelge 4.6’da
görülmektedir. Her üç maya hücresinin de 16 ve 18 numaralı karbon atomlarına sahip
yağ asidince zengin olmaları bu maya hücrelerinin biyodizel üretiminde kullanılabilecek
hammaddeler olduğunu göstermektedir. Şekil 4. 8’de C. lipolytica hücrelerinden toplam
%84.9, Şekil 4.9’da C. tropicalis hücrelerinden toplam %93.2 ve Şekil 4.10’da R.
mucilaginosa hücrelerinden toplam %92.3 oranında metil esteri elde edildiği
görülmektedir. C. lipolytica, C. tropicalis ve R. mucilaginosa hücrelerinden elde edilen
lipitlerin doymuşluk oranları ise sırasıyla %64.1, %92.7, %66.3 olarak bulunmuştur.
Çizelge 4.6 Melaslı besiyerinde geliştirilen C. lipolytica, C. tropicalis ve R. mucilaginosa hücrelerinin biriktirdikleri lipitlerin yağ asidi metil esteri dağılımları
Yağ asidi metil esteri (%) C. lipolytica C. tropicalis R. mucilaginosa
laurik asit (C12:0) 15.1 - -
miristik asit (C14:0) - 5.3 2.8
palmitik asit (C16:0) 21.6 29.7 26.2
palmitoleik asit (C16:1) 5.2 5.0 -
heptadekanoik asit (C17:0) - 1.5 -
cis-10-heptadekanoik asit C17:1) - - 4.9
stearik asit (C18:0) 27.1 56.2 37.3
oleik asit (C18:1n9c) 19.0 2.3 22.3
linoleik asit (C18:2n6c) 12.0 - 6.5
61
Şekil 4.8 Candida lypolitica hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonuc oluşan metil esterleri
Şekil 4.9 Candida tropicalis hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri
62
Şekil 4.10 Rhodotorula mucilaginosa hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri
63
4.4 Fungus Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması
4.4.1 Yüksek kapasitede lipit üreten fungus hücrelerinin seçimi
Hücrelerin lipit içeriği, yaş hücre ağırlığına tekabül eden kuru hücre ağırlığı başına
düşen lipit miktarı olarak yüzde cinsinden hesaplanmıştır (Zhu vd. 2002).
Tez çalışmasında kullanılmak üzere yüksek kapasite ile lipit üretimi yapabilen fungusu
seçebilmek için dört farklı fungal tür pH’ı 5’ e ayarlanmış melaslı besiyerine ekilmiş ve
gelişimlerinin 10. gününde lipit ekstraksiyonları yapılmıştır. Lipit içeriklerinin % olarak
belirtildiği Çizelge 4.7’de Aspergillus versicolor (1 numaralı fungus izolatı)’ın
diğerlerine göre daha fazla kapasitede lipit üretebildiği görülmektedir. Bu yüzden
besiyerinin başlangıç pH’ının, azot çeşidinin, melas ve azot konsantrasyonunun ve
inkübasyon süresinin fungus hücrelerinin içerdikleri lipit miktarına olan etkilerinin
araştırıldığı çalışmalarda Aspergillus versicolor kullanılmıştır.
Çizelge 4.7 Farklı fungus türlerinin melaslı besiyerinde gelişimlerinin 10. günlerindeki lipit konsantrasyonları (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH 5).
Fungal tür
Lipit konsantrasyonu (%)
Tramates versicolor 7.8 ±0.4
Rhizophus oryzae 8.1 ±0.3
Rhizophus arrhizus 7.3 ±0.5
Aspergillus versicolor (1 numaralı izolat) 9.1 ±0.5
64
4.4.2 A. versicolor hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine ortam pH’ının etkisinin belirlenmesi
Besiyerinin başlangıç pH değerinin A. versicolor hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi
üzerine etkisi melaslı besiyerinde 8. gün sonunda yapılan denemelerle belirlenmiştir. Bu
amaçla besiyerinin başlangıç pH değerleri 3, 4, 5, ve 6’ya ayarlanmıştır. Fungus
hücreleri ortamın pH değeri 3 olduğu zaman gelişememiştir. Bu yüzden lipit analizleri
yapılamamıştır. Şekil 4.11’de de belirtildiği gibi A. versicolor hücreleri pH 5 ve pH 6
değerindeki besiyerlerinde sırasıyla %7.9 ve %4.3 oranında lipit biriktirebilmiştir.
Fungal hücreler en yüksek lipit içeriklerini %9.7 olarak pH değeri 4’e ayarlanmış
besiyerinde göstermişlerdir. Yapılan çalışmalarda A. versicolor hücrelerinin lipit
bileşenlerini üretirken ortamın pH değerinden oldukça etkilendikleri görülmüştür.
Çünkü besiyerinin pH değeri 4’ün üzerine çıktığı zaman lipit içeriğinde önemli bir
azalma elde edilmiştir.
Şekil 4.11 A. versicolor hücrelerinin lipit konsantrasyonuna besiyeri pH’ının etkisinin belirlenmesi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika).
0
2
4
6
8
10
12
% lip
it k
onsantrasyonu
pH 4 pH 5 pH 6
65
4.4.3 Farklı azot kaynaklarının fungal lipit birikimine etkisi
Farklı azot kaynaklarının A. versicolor hücrelerinin lipit üretimine etkisini belirlemek
için yapılan çalışmada NH4Cl3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4NO3, üre ve peynir altı suyu
tozu olmak üzere altı farklı azot kaynağı denenmiştir. İki tanesi organik, diğerleri
inorganik olan bu azot kaynakları pH’ı 4’e ayarlanmış melaslı besiyerlerine 1 g/L
oranında eklenmiş ve gelişimlerinin 8. günü sonunda lipit ekstraksiyonları yapılmıştır.
Şekil 4.12’de besiyerine (NH4)2SO4 ve NH4NO3 eklendiğinde fungal hücrelerin lipit
üretimlerinin sırasıyla %9.7 ve %10.2 olarak ölçüldüğü ve birbirine oldukça yakın
olduğu görülmektedir. Ortamda NH4Cl3 bulunduğu zaman fungal lipit üretiminin %12.8
değerine yükseldiği bulunmuştur. En yüksek fungal lipit içeriği 1 g/L KNO3 varlığında
%17.0 olarak belirlenirken, en düşük lipit birikimi Şekil 4.13’te de belirtildiği gibi
organik bir azot kaynağı olan peynir altı suyu tozu varlığında %4.1 ve üre varlığında
%6.9 olarak ölçülmüştür.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
% lip
it k
onsantrasyonu
NH4Cl (NH4)2SO4 KNO3 NH4NO3
Şekil 4.12 A. versicolor hücrelerinin lipit konsantrasyonuna inorganik azot kaynaklarının etkisinin belirlenmesi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika: 1 g l-1).
66
0
1
2
3
4
5
6
7
8
üre peynir altı suyu tozu
% lipit konsantrasyonu
Şekil 4.13 A. versicolor hücrelerinin lipit konsantrasyonuna organik azot kaynaklarının etkisinin belirlenmesi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika: 1 g l-1).
4.4.4 A. versicolor hücrelerinin lipit biriktirme kapasiteleri üzerine azot ve karbon miktarının etkisinin belirlenmesi
Gerçekleştirilen tez çalışmasında A. versicolor hücrelerinin lipit biriktirme kapasiteleri
üzerine azot ve karbon miktarının etkisinin belirlenmesi amacıyla üç farklı melas ve
KNO3 konsantrasyonu denenmiştir. En yüksek seviyede hücresel lipit birikimi için
optimum şartların sağlanması amacıyla %6, 8, ve 10 ml melas solüsyonu içeren pH’ı
4’e ayarlanmış besiyerlerine 0.5, 1.0, ve 1.5 g/L KNO3 konsantrasyonları eklenmiştir.
Çalışma sonucunda en düşük fungal lipit birikimi Çizelge 4.8’de bildirildiği gibi %10
melas solüsyonu ve 0.5 g/L KNO3 içeren ortamda %14.8 olarak bulunmuştur. Aynı
melas konsantrasyonunda 1.0 g/L KNO3 varlığında lipit üretiminin %16.4’e çıktığı
gözlenmiştir. Öte yandan %8 oranında melas solüsyonu içeren besiyerlerinde artan
KNO3 konsantrasyonlarında elde edilen lipit verimlerinin birbirine çok yakın olduğu
görülmektedir. Yapılan çalışmada fungus hücrelerinin besiyerinde %6 oranında melas
solüsyonu olduğu zaman diğer melas oranlarına göre daha fazla miktarda lipit
üretebildiği görülmüştür. En yüksek lipit üretimi 1.0 g/l KNO3 ve %6 melas solüsyonu
içeren besiyerinde %20.6 olarak belirlenmiştir. Başlangıçtaki azot konsantrasyonunun
1.0 g/L’ den 1.5 g/L’ ye çıkmasıyla birlikte denenen tüm melas solüsyonu
67
konsantrasyonlarında hücresel lipit biriktirme kapasitesinin azaldığı elde edilen sonuçlar
arasındadır.
4.4.5 Fungal hücrelerin lipit birikimine inkübasyon süresinin etkisinin belirlenmesi
Gelişim süresinin A. versicolor hücrelerinin lipit biriktirme kapasitelerine etkisini
belirlemek için inkübasyon süresinin 4, 6, 8, ve 10. günlerinde lipit analizleri
yapılmıştır. A. versicolor hücreleri biyokütlelerini gelişimlerinin ancak 4. gününde
arttırabildikleri için lipit ekstraksiyonlarına bu günden başlanmıştır. Şekil 4.14’te fungal
hücrelerin artan inkübasyon sürelerinde içerdikleri lipit miktarları verilmiştir. En düşük
lipit üretimi gelişimin 4. gününde %18.6 olarak bulunmuştur. İnkübasyon süresinin
ilerleyen günlerinde fungal lipit üretiminde çok önemli değişimler olmamakla birlikte 6,
8, ve 10. günlerde sırasıyla %21.0, %21.6, ve %22.8 oranlarında lipit birikimleri
gözlenmiştir.
Çizelge 4.8 Aspergillus versicolor hücrelerinin lipit konsantrasyonuna başlangıç KNO3
ve melas konsantrasyonlarının etkisi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:4)
melas solüsyonu (% v/v)
KNO3 (g/L)
Lipit konsantrasyonu (%)
6%
0.5 18.2 ± 0.4
1.0 20.6 ± 0.8
1.5 15.4 ± 0.3
8%
0.5 17.2 ± 0.5
1.0 17.6 ± 0.4
1.5 16.8 ± 0.7
10%
0.5 14.8 ± 0.5
1.0 16.4 ± 0.3
1.5 15.4 ± 0.2
68
0
5
10
15
20
25
4 6 8 10
inkübasyon süresi (gün)
% lip
it k
onsantrasyonu
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
kuru
ağırlık (m
g/L
)
lipit konsantrasyonu mikrobiyel gelişme
Şekil 4.14 A. versicolor hücrelerinin içerdikleri lipit konsantrasyonuna inkübasyon süresinin etkisi (T: 30±1 °C; Çalkalama hızı: 100 devir/dakika; pH:5; 1 g l-1 KNO3; 6% melas solüsyonu).
4.4.6 A. versicolor hücrelerindeki lipitlerin yağ asidi metil esteri dağılımları
Çizelge 4.9’da en yüksek seviyede lipit üretimi için sağlanan optimum koşullarda
melaslı besiyerinde geliştirilen A. versicolor hücrelerinden elde edilen lipitlerin
transesterifikasyonu sonucu elde edilen yağ asidi metil esterleri görülmektedir. Fungal
lipitin 16 ve 18 numaralı karbon atomlarına sahip yağ asidince zengin olmaları A.
versicolor hücrelerinin biyodizel üretiminde kullanılabilecek hammaddeler olduğunu
göstermektedir. Şekil 4. 15’de fungal hücrelerden elde edilen lipitin doymuşluk oranının
%27.1 olduğu görülmektedir. Fungal lipitin %17.2 C16, %82.8 kadarı ise C18 metil
esterinden oluşmaktadır.
69
Çizelge 4.9 Melaslı besiyerinde geliştirilen A. versicolor hücrelerinin biriktirdiği lipitin yağ asidi metil esteri dağılımı
Şekil 4.15 A. versicolor hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri
Yağ asidi metil esteri (%) A. versicolor
palmitik asit (C16:0) 17.2
stearik asit (C18:0) 9.9
oleik asit (C18:1n9c) 41.1
linoleik asit (C18:2n6c) 31.8
70
4.5 Mikroalg Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması
4.5.1 Mikroalg hücrelerinin seçimi ve pH etkisi
Laboratuvar kültür koleksiyonunda bulunan mikroalg hücrelerinin lipit içeriklerinin
belirlendiği çalışmada 5 adet mikroalg 20 gün süreyle pH değeri 6, 7, 8, ve 9’a
ayarlanmış BG-11 besiyerinde geliştirilmiştir. Çizelge 4.10’da termofil özellik gösteren
Synechococcus sp., Cyanobacterium aponinum ve Phormidium sp. mikroalglerinin
diğerlerine göre daha yüksek kapasitede lipit biriktirebildiği gözlenmiştir. Çalışma
sonucunda denenen tüm mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitelerinin besiyeri
pH değerinden önemli miktarda etkilenmediği görülmüştür. Bu yüzden mikroalglerin
lipit biriktirme kapasitesi üzerine ortam pH’ının etkisinin belirlenmesi için Şekil 4.16’da
belirtilen mikroalg hücrelerinin gelişimleri göz önünde bulundurularak Synechococcus
sp., Cyanobacterium aponinum ve Phormidium sp. mikroalgleri için sırasıyla pH 7, pH
8 ve pH 9 değerlerinde çalışmaların yapılması uygun bulunmuştur.
Çizelge 4.10 Farklı mikroalg hücrelerinin lipit konsantrasyonuna ortam pH’ının etkisinin belirlenmesi (1.5 g/L NaNO3, 2400 lux, 30 ºC, 20 gün)
mikroalg pH
6 7 8 9
Synechococcus sp. 19.2 ±1.7 20.0 ±2.3 19.5 ±2.1 18.6 ±1.3
2 numaralı mikroalg 12.4 ±2.3 12.9 ±1.1 11.9 ±1.4 11.8 ±1.0
Cyanobacterium aponinum 32.7 ±2.7 30.3 ±2.4 34.0 ±3.3 32.8 ±3.2
4 numaralı mikroalg 17.1 ±1.8 17.0 ±1.6 17.8 ±2.1 17.3 ±1.9
Phormidium sp. 29.9 ±2.5 29.7 ±2.8 29.6 ±3.2 30.0 ±2.2
71
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
Synechococcus
sp.
2numaralı
mikroalg
C. aponinum 4numaralı
mikroalg
Phormidium sp.
kuru
ağırlık (g/L
)
pH 6 pH 7 pH 8 pH 9
Şekil 4.16 Azot içeren BG 11 besiyerinde geliştirilen mikroalg hücrelerinin farklı pH değerlerinde gösterdikleri hücre gelişimleri (1.5 g/L NaNO3, 2400 lux, 30 ºC,20 gün)
4.5.2 Mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine inkübasyon süresinin etkisinin belirlenmesi
İnkübasyon süresinin mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitelerine etkisini
belirlemek için 1.5 g/L NaNO3 içeren, pH değeri Synechococcus sp. için 7’ye,
Cyanobacterium aponinum için 8’e ve Phormidium sp. için 9’a ayarlanmış BG-11
besiyerinde inkübasyon süresinin 10, 15, 20 ve 30. günlerinde lipit analizleri
yapılmıştır.
Çalışmalar sırasında 10. günde lipit analizi yapılabilecek kadar biyokütlenin elde
edilememesi sebebiyle analiz yapılamamıştır. Çizelge 4.11’de en yüksek lipit üretimi
15. gün sonunda Synechococcus sp. için %30.8, Cyanobacterium aponinum için % 37.2
ve Phormidium sp. için % 35.8 olarak bildirilmiştir. C. aponinum ve Phormidium sp.
hücrelerinde gelişim sürelerinin 15 ve 20. günlerinde lipit üretimi bakımından önemli
bir fark görülmemesine rağmen Synechococcus sp. hücrelerinde ilerleyen inkübasyon
süresinde lipit üretiminde düşüş gözlenmiştir. Bununla birlikte her üç mikroalgin de en
düşük lipit içerikleri inkübasyon süresinin 30. gününde elde edilmiştir.
72
Çizelge 4.11 Azot içeren BG 11 besiyerinde geliştirilen mikroalg hücrelerinin artan inkübasyon süresinde içerdikleri lipit miktarları (1.5 g/L NaNO3, 2400 lux, 30 ºC)
mikroalg Inkübasyon süresi
15. gün 20. gün 30. gün
Synechococcus sp. 30.8 ±2.9 22.6 ±1.8 20.2 ±1.6
Cyanobacterium aponinum 37.2 ±3.7 36.4 ±3.1 29.6 ±2.8
Phormidium sp. 35.8 ±3.2 33.2 ±2.7 28.8 ±2.4
4.5.3 Mikroalg hücrelerinin gelişme ve lipit biriktirme kapasitesi üzerine azot miktarının etkisinin belirlenmesi
Mikroalg hücrelerinin gelişme ve lipit biriktirme kapasitesi üzerine azot miktarının
etkisinin belirlemek amacıyla BG-11 besiyerlerine 0.25, 0.5, 1.0, ve 1.5 g/L olmak
üzere artan NaNO3 konsantrasyonları eklenmiş ve besiyerleri her mikroalgin gelişiminin
en yüksek olduğu pH değerlerine ayarlanmıştır. Bu besiyerlerinde inkübasyon süresinin
10, 15, 20 ve 30. günlerinde lipit analizleri yapılmıştır. Şekil 4.17 - 4.19’da daha önce
yapılan deneylerde olduğu gibi her üç mikroalg hücresi de gelişimlerinin 10.günlerinde
lipit analizi yapılabilecek kadar biyokütle üretemediği görülmektedir. Bu yüzden 10.
günde lipit analizi yapılamamıştır.
Çizelge 4.12’de Synechococcus sp. mikroalg hücresinin artan inkübasyon süresinde
farklı azot miktarlarında içerdiği lipit konsantrasyonu gösterilmektedir. Buna göre en
yüksek lipit üretiminin 0.25 g/l NaNO3 içeren besiyerinde gelişimin 20. gününde %44.4
olduğu görülmüştür. Fakat endüstriyel boyutta lipit üretiminde erken inkübasyon
süresinin öneminin göz önünde bulundurulması ve 15. gündeki lipit miktarının %42.8
olması bu mikroalg ile yapılacak ilerleyen çalışmaların 15. gün sonunda yapılmasını
sağlamıştır. Yapılan çalışmalarda besiyerindeki azot miktarının arttırılmasının hücre içi
lipit konsantrasyonunda önemli oranda azalmaya sebep olduğu bulunmuştur.
73
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
10 15 20 25 30inkübasyon süresi (gün)
kuru
ağırlık (g/L
)
0.25 g/L 0.5 g/L 1.0 g/L 1.5 g/L
NaNO3
Şekil 4.17 Farklı miktarlarda azot içeren BG-11 besiyerinde geliştirilen Synechococus sp. hücrelerinin gelişimleri (2400 lux, 30 ºC) Çizelge 4.12 Synechococcus sp. mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine
artan inkübasyon süresi ve azot miktarının etkisinin belirlenmesi (2400 lux, 30 ºC)
NaNO3 miktarı (g/l) Inkübasyon süresi
15. gün 20. gün 30. gün
0.25 42.8±3.1 44.4±3.7 27.6±2.7
0.5 32.4±3.0 27.4±2.6 42.8±3.3
1.0 31.8±2.9 31.4±2.5 27.0±2.2
1.5 30.8±2.9 22.6±1.8 30.2±1.6
Çizelge 4.13’de C. aponinum mikroalginin artan inkübasyon süresinde farklı azot
miktarlarında içerdiği lipit miktarları gösterilmektedir. Bu mikroalg hücresinin de en
yüksek lipit konsantrasyonu 15. gün sonunda en düşük NaNO3 konsantrasyonu olan
0.25 g/L içeren besiyerinde elde edilmiştir. 0.5, 1.0, ve 1.5 g/L NaNO3 varlığında artan
inkübasyon sürelerinde lipit miktarları birbirine benzese de ortamda 0.25 g/L NaNO3
74
varken gelişimin ilerleyen günlerinde lipit miktarında önemli düşüş görülmektedir.
Nitekim bu mikroalg ile yapılan çalışmada en düşük lipit üretim yüzdesi %21.6 olarak
0.25 g/L NaNO3 içeren ortamda 20. gün sonunda elde edilmiştir.
Çizelge 4.14’de Phormidium sp. mikroalg hücresinin artan inkübasyon süresinde farklı
azot miktarlarında içerdiği lipit miktarları gösterilmektedir. Denenen her NaNO3 miktarı
için inkübasyon süresinin 15. gününde birbirine benzer değerler elde edilse de 0.25 g/L
NaNO3 varlığında en yüksek lipit üretim verimi %38.2 olarak bulunmuştur.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
10 15 20 25 30inkübasyon süresi (gün)
kuru
ağırlık (g/L
)
0.25 g/L 0.5 g/L 1.0 g/L 1.5 g/L
NaNO3
Şekil 4.18 Farklı miktarlarda azot içeren BG-11 besiyerinde geliştirilen C. aponinum hücrelerinin gelişimleri (2400 lux, 30 ºC) Çizelge 4.13 Cyanobacterium aponinum hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine artan inkübasyon süresi ve azot miktarının etkisinin belirlenmesi (2400 lux, 30 ºC)
NaNO3 miktarı (g/l) Inkübasyon süresi
15. gün 20. gün 30. gün
0.25 45.0±4.0 21.6±1.4 24.0±1.8
0.5 30.2±2.6 31.2±2.2 29.0±1.7
1.0 35.4±3.0 24.4±2.5 32.4±2.9
1.5 37.2±3.7 36.4±3.1 29.6±2.8
75
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
10 15 20 25 30inkübasyon süresi (gün)
kuru
ağırlık (g/L
)
0.25 g/L 0.5 g/L 1.0 g/L 1.5 g/L
NaNO3
Şekil 4.19 Farklı miktarlarda azot içeren BG 11 besiyerinde geliştirilen Phormidium sp. hücrelerinin gösterdikleri hücre gelişimleri (2400 lux, 30 ºC) Çizelge 4.14 Phormidium sp. mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine artan inkübasyon süresi ve azot miktarının etkisinin belirlenmesi (2400 lux, 30 ºC)
NaNO3 miktarı (g/l) Inkübasyon süresi
15. gün 20. gün 30. gün
0.25 38.2±3.9 24.4±2.2 34.2±3.4
0.5 33.6±3.0 27.6±2.8 26.4±2.5
1.0 37.0±3.3 24.0±2.4 24.2±2.4
1.5 35.8±3.2 33.2±2.7 28.8±2.4
76
4.5.4 Triakontanol hormonunun mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Triakontanol hormonunun mikroalg hücre gelişimi ve lipit biriktirme kapasitesine
etkisini incelemek amacıyla yapılan çalışmada 0.25 g/L NaNO3 içeren her bir mikroalg
hücresi için uygun pH değerine ayarlanmış BG-11 besiyerlerine 10 ppm triakontanol
hormonu eklenmiştir. Şekil 4.20’de her ne kadar triakontanol hormonunun C. aponinum
ve Phormidium sp. mikroalglerinin hücre gelişimlerini olumlu yönde arttırdığı görülse
de hormonlu ve hormonsuz besiyerlerinde geliştirilen her üç mikroalgin de hücre
gelişiminde çok net bir fark elde edilememiştir. Bu duruma paralel olarak her üç
mikroalg hücresi için de lipit üretim kapasiteleri triakontanol içeren ve içermeyen
ortamlarda birbirine çok benzer görülmüştür. Çizelge 4.15’de triakontanol içeren ve
içermeyen ortamlarda hücre içi lipit konsantrasyonlarının birbirine çok yakın olduğu
gösterilmektedir.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Synechococcus sp. C. aponinum Phormidium sp.
kuru
ağırlık (g/L
)
triakontanol +
triakontanol -
Şekil 4. 20 Mikroalg hücrelerinin gelişimlerine triakontanol etkisi (10 ppm Triakontanol, 2400 lux, inkübasyon süresi: 15 gün, 30 ºC)
77
Çizelge 4.15 Triakontanol hormonunun mikroalg hücrelerinin lipit konsantrasyonuna (%) etkisi (10 ppm Triakontanol, 2400 lux, inkübasyon süresi: 15 gün, 30 ºC)
mikroalg triakontanol (+) triakontanol (-)
Synechococcus sp. 38.1±1.4 40.1±2.4
Cyanobacterium aponinum 43.3±2.9 43.7±2.5
Phormidium sp. 39.2±2.7 35.2±1.0
4.5.5 Triakontanol hormonu ve NaHCO3’ın mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Yapılan çalışmalarda hem triakontanol içeren hem de içermeyen mikroalg besiyerlerine
34, 43, 51 ppm olmak üzere NaHCO3 eklenmiştir. Fakat Çizelge 4.16 - 4.18’de verilen
bilgiler denenen üç farklı NaHCO3 konsantrasyonunun da triakontanol içeren veya
içermeyen ortamlarda mikroalg hücrelerinin lipit üretimini arttırdığına yönelik bir
bulguya rastlanmadığını göstermektedir.
78
Çizelge 4. 16 Synechococcus sp. hücrelerinin gelişimleri ve lipit konsantrasyonları üzerine triakontanol içeren ve içermeyen ortamlarda artan NaHCO3
etkisinin belirlenmesi (2400 lux, inkübasyon süresi: 15 gün, 30 ºC; pH 7)
NaHCO3 (ppm) triakontanol (+) triakontanol (-)
34 40.7±2.5 40.3±2.9
43 40.2±2.1 38.8±1.9
51 42.5±2.0 40.5±1.7
Çizelge 4.17 Cyanobacterium aponinum hücrelerinin gelişimleri ve lipit konsantrasyonları üzerine triakontanol içeren ve içermeyen ortamlarda artan NaHCO3 etkisinin belirlenmesi (2400 lux, inkübasyon süresi: 15 gün, 30 ºC; pH 8)
NaHCO3 (ppm) triakontanol (+) triakontanol (-)
34 48.8±3.4 43.8±2.7
43 44.5±2.9 44.0±2.6
51 46.1±3.2 44.4±2.8
Çizelge 4.18 Phormidium sp. hücrelerinin gelişimleri ve lipit konsantrasyonları üzerine triakontanol içeren ve içermeyen ortamlarda artan NaHCO3 etkisinin belirlenmesi (2400 lux, inkübasyon süresi: 15 gün, 30 ºC; pH 9)
NaHCO3 (ppm) triakontanol (+) triakontanol (-)
34 35.2±2.7 33.7±1.8
43 35.0±1.9 35.9±1.5
51 38.1±2.9 36.1±2.1
79
4.5.6 Mikroalg hücrelerindeki lipitlerin yağ asidi metil esteri dağılımları
Çizelge 4.19’da en yüksek seviyede lipit üretimi için sağlanan optimum koşullarda BG-
11 besiyerinde geliştirilen mikroalg hücrelerinden elde edilen lipitlerin
transesterifikasyonu sonucu elde edilen yağ asidi metil esterleri görülmektedir.
Çalışmada kullanılan mikroalg lipitlerinin C16 ve C18 numaralı karbon atomlarınca
zengin olmaları bu hücrelerinin biyodizel üretiminde kullanılabilecek hammaddeler
olduğunu göstermektedir.
Şekil 4.21 – 23’de Synechococcus sp. mikroalg lipitinin C16 ve C18 metil esteri içeriği
%46.9 olarak bulunurken, toplam doymuş yağ asidi oranı %74.5’dir. C. aponinum
mikroalg lipitinin C16 ve C18 metil esteri içeriği %51.3, toplam doymuş yağ asidi oranı
ise %77.9 olarak elde edilmiştir. Phormidium sp. mikroalg lipiti ise %91.4 oranı ile
denenen mikroalg hücreleri arasında en yüksek C16 ve C18 metil esteri içeriğine sahip
olmuştur. Bu mikroalgin toplam doymuş yağ asidi oranı ise diğerlerine göre daha
yüksek olup %84.7 olarak elde edilmiştir.
Çizelge 4.19 BG-11 besiyerinde geliştirilen mikroalg hücrelerinin biriktirdiği lipitin yağ asidi metil esteri dağılımları
Yağ asidi metil esteri (%) Synechococcus sp. C. aponinum Phormidium sp.
kaprilik asit (C10:0) 23.8 18.3 -
miristik asit (C14:0) 23.8 8.3 4.1
palmitik asit (C16:0) 13.7 21.9 33.0
palmitoleik asit (C16:1) 20.0 6.6 3.8
cis-10heptadekanoik asit(C17:1) 2.9 5.6 5.3
stearik asit (C18:0) 13.2 29.4 47.6
oleik asit (C18:1n9c) - 5.0 6.2
linoleik asit (C18:2n6c) - 4.8 -
araşidonik asit (C20:4n6) 2.6 - -
80
Şekil 4.21 Synechococcus sp. hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri
Şekil 4. 22 C. aponinum hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri
81
Şekil 4.23 Phormidium sp. hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucu oluşan metil esterleri
82
5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Hammaddenin pahalı ve yaşamsal olması biyodizelin ticari olarak üretilebilmesini
sınırlandırmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalarla biyodizelin üretim maliyetini
düşürmek amacıyla hammadde olarak mikrobiyel lipitlerin kullanımları ön plana
çıkmıştır. Farklı mikrobiyel türlerin biyodizel üretiminde kullanım kapasitelerinin
araştırıldığı tez çalışmasında, R. mucilaginosa, C. tropicalis, C. lipolytica, A. versicolor,
Synechococcus sp., C. aponinum, Phormidium sp. mikroorganizmalarının, düşük
maliyetli besiyerlerinde uygun koşullarda en yüksek seviyede lipit biriktirebilme
kapasiteleri ve bu lipitlerin yağ asidi metil esterlerine (biyodizel) dönüşüm verimleri
belirlenmiştir.
5.1 Fungus Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması
Gerçekleştirilen tez çalışmasında daha önce literatürde lipit biriktirme özelliği biyodizel
üretiminde hammadde olması bakımından incelenmemiş olan C. tropicalis hücrelerinin
lipit konsantrasyonları iyileştirilmiştir. Buna ek olarak tez çalışmasında R. mucilaginosa
ve C. lipolytica hücreleri için literatürde belirtilen çalışmalardan daha yüksek miktarda
lipit konsantrasyonu elde edilmiştir. Tez çalışmasında lipit biriktirme özelliği arttırılan
filamentli bir fungus olan A. versicolor hücreleri ise biyodizel üretiminde hammadde
olması bakımından literatürde ilk kez incelenmiştir.
Gerek maya hücrelerinin gerekse filamentli fungusların hücre içi lipit
konsantrasyonlarını ve biyodizel üretiminde hammadde olarak kullanımlarını farklı
gelişme koşulları ve lipitlerin yağ asidi dağılımları belirlemektedir.
5.1.1 Besiyerinin bileşimi
Her ne kadar glukoz mikrobiyel lipit birikimi için bilinen en uygun karbon kaynağı olsa
da, mikrobiyel lipitlerin biyodizel üretiminde hammadde olarak kullanımında
karşılaşılan en önemli engel maliyettir. Çözüm yolu ise mikrobiyel gelişme için ucuz
83
besiyerlerinin kullanımıdır. Bu sebeple araştırıcılar söz konusu sorunun aşılabilmesi için
fungus hücrelerini hem gliserol gibi glukoza benzer şekilde metabolize edilebilen
besiyerlerinde hem de endüstriyel atıkların karbon kaynağı olarak kullanıldığı
besiyerlerinde geliştirmeye çalışmışlardır.
Xue vd. (2006) tarafından yapılan çalışmada; Rhodotorula glutinis, Candida utilis ve
Saccharomyces cerevisiae türüne ait iki suştan elde ettikleri lipitin biyodizel üretiminde
hammadde olarak kullanımını araştırmışlardır. Çalışmada maliyeti düşürmek amacıyla
maya hücrelerinin gelişimi için seyreltilmiş monosodyum glutamat atıksuyu
kullanmışlardır. Çalışmada kullandıkları dört farklı maya hücresinin gelişimlerini 2.
günden itibaren 6 gün süreyle takip etmişlerdir. İnkübasyon süresinin ilk iki gününde
maya hücrelerinin biyokütlelerini yeni ve zengin bir besiyeri ile kıyaslandığında
dezavantajları bulunan bu ortamda oldukça yavaş arttırdıkları gözlemlenmiştir. Denenen
tüm maya hücreleri inkübasyon sürelerinin 5. gününde hem gelişimlerinin hem de lipit
konsantrasyonlarının en yüksek değerine ulaşmış ve ortamda kullanılabilir besin
kalmadığı için ilerleyen zamanda gelişimlerinde düşüş gözlenmiştir. Çalışmada
Rhodotorula glutinis’in denenen diğer maya türlerine göre daha fazla biyokütle
oluşturduğu ve en yüksek lipit konsantrasyonunu %9.04 olarak gösterdiği bulunmuştur.
Xue vd. (2008) yaptıkları çalışmada ise; Rhodotorula glutinis’in monosodyum glutamat
atıksuyunda ürettiği lipit miktarını ortama %4 (w/v) glukoz ilave ederek %20 oranına
kadar çıkarmışlardır.
Angerbauer vd. (2008) yaptıkları çalışmada; Lipomyces starkeyi mayasının 40 g/L
glukoz içeren gelişme ortamına lağım pisliği eklemiş ve bunun hücre gelişimini inhibe
etmediğini gösterip lipit üretim kapasitesini belirlemiştir. Araştırıcılar bu mayanın en
yüksek lipit üretimini %68 olarak bulmuşlardır.
Zhu vd. (2008) çalışmalarında; Trichosporon fermentans maya hücrelerinin en yüksek
kapasitede lipit ürettiği besiyeri koşullarını araştırmışlardır. Araştırıcılar T. fermentans
hücrelerini %15 toplam şeker konsantrasyonuna sahip işlenmiş melas atığında
84
geliştirmişler ve 12.8 g/L lipit verimi elde etmişlerdir. İşlenmiş melasa farklı şekerlerin
ilave edilmesiyle hücrelerin lipit içeriği %50 oranlarına kadar arttırılmıştır.
Papanikolaou ve Aggelis (2002) yaptıkları çalışmada Yarrowia lipolytica mayasının
lipit üretim kapasitesini gliserolün karbon kaynağı olarak bulunduğu ortamda
araştırmışlardır. Bu besiyerinde geliştirilen maya hücrelerinin lipit içeriği %43 olarak
bulunmuştur.
Easterling vd. (2008) yaptıkları çalışmada; gliserolün besiyerinde tek başına ve ikincil
bir substrat olarak kullanımının Rhodotorula glutinis mayasının gelişimi ve yağ asidi
kompozisyonu üzerine etkisini araştırmışlardır. Karbon kaynağı olarak gliserolün tek
başına kullanıldığı durumda maya hücrelerinin %25 oranında lipit biriktirebildiklerini
göstermişlerdir.
Li vd. (2009) yaptıkları çalışmada; deniz balığının yüzeyinden izole ettikleri
Rhodotorula mucilaginosa TJY15a maya hücrelerinin oranında manyok kökünden
çıkarılan nişastayı veya glukozu besiyeri bileşeni olarak kullanarak yüksek miktarda
lipit üretebildiğini göstermişlerdir. Gerçekleştirilen çalışmada kesikli kültür sistemi ile
geliştirilen hücrelerin %47.9, geri beslemeli kültürde geliştirilen hücrelerin ise %52.9
oranında lipit üretebildikleri bulunmuştur.
Rupcic vd. (1996), %1 oranında metanolün karbon ve enerji kaynağı olarak kullanıldığı
ortamda C. lypolitica hücrelerinin lipit içeriklerini %4.9 olarak bulmuşlardır.
Peng ve Chen (2008) gerçekleştirdikleri çalışmada buğday kepeği ile hazırladıkları katı-
sıvı gelişem ortamında filamentli bir fungus olan Microsphaeropsis sp. hücrelerinin lipit
biriktirme kapasitelerini incelemişlerdir. En yüksek lipit içeriği inkübasyon süresinin 9.
gününde %10.2 olarak bildirilmiştir.
Papanikolaou vd. (2008), yaptıkları çalışmada Mortierella isabellina ATHUM 2935
fungusunu biyodizelin üretimi sırasında oluşan ve ikincil bir atık olan gliserolü karbon
85
kaynağı olarak kullanıldığı azot sınırlı ortamda geliştirdiklerinde yüksek gliserol
varlığında (100 g/L) hücrelerde biriktirilen lipit miktarını %51 olarak bulmuşlardır.
İnkübasyon süresinin 13. gününde ortamda 50.5 g/L gliserol varlığında hücrede
biriktirilen lipit miktarı %36.9, 420 g/L gliserol varlığında %51.7, 380 g/L gliserol
varlığında ise %50.0 olarak bildirilmiştir.
Veré vd. (2009) yaptıkları çalışmada; iki adet Lentinula edodes ve iki adet Aspergillus
niger suşunun lipit biriktirme özelliklerini incelemişlerdir. Çalışmada L. edodes
fungusunun 20 g/L gliserol, 4 g/L (NH4)2SO4 ve 2 g/L maya özütü içeren besiyerinde 1
gram biyokütlede 0.1 g lipit ürettiğini bulmuşlardır. A. niger hücreleri ise 30 ve 60 g/L
gliserol, 0.5 g/L (NH4)2SO4 ve 0.5 g/L maya özütü içeren besiyerinde 1 gram
biyokütlede 0.41 ve 0.57 g lipit üretmişlerdir.
Gerçekleştirilen tez çalışmasında 13 adet farklı maya hücresinin lipit konsantrasyonları
biyodizel üretiminde hammadde olması bakımından incelenmiştir. Çalışmada
mikroorganizmaların geliştirilmesi için kullanılacak besiyerinin belirlenmesi için
literatürde hücresinde yüksek miktarda lipit biriktirebilme özelliğine sahip olduğu
bilinen (R. mucilaginosa) ve literatürde hücresinde sadece %10 oranında lipit
biriktirdiği bilinen (S. cerevisiae) iki adet maya hücresi melaslı ve zengin besiyerlerinde
geliştirilmiştir. İnkübasyon süresinin 3. gününde S. cerevisiae hücreleri iki farklı
besiyerinde de yaklaşık olarak birbirinin aynı (%10) lipit konsantrasyonunu gösterirken,
R. mucilaginosa hücreleri melaslı besiyerinde zengin besiyerine oranla yaklaşık 3 kat
daha fazla konsantrasyonda lipit biriktirmiştir (%21.3). Fungus hücrelerinin
gelişmesinde karbon ve enerji kaynağı olarak ikincil bir atık olan melasın kullanılması
ve melaslı besiyerinde geliştirilen bu hücrelerin yüksek miktarda lipit biriktirebilmesi
biyodizel üretiminin ticari önem kazanmasında en büyük engel olan maliyetin
düşürülebileceğini göstermektedir.
İkincil bir atık olan melaslı besiyerinde geliştirilen C. lypolitica, C. tropicalis ve R.
mucilaginosa hücrelerinde en yüksek lipit konsantrasyonu sırasıyla %59.9, %46.8 ve
%69.5 olarak bulunmuştur. Tez çalışmasında kullanılan bu üç maya hücresinin sadece
melas içeren ortamda sadece 4 gün süresince geliştirilmesiyle literatürde maya hücreleri
86
ile yapılan çalışmalarda belirtilen konsantrasyonlardan daha yüksek lipit
konsantrasyonu elde edilmiştir.
Tez çalışmasında daha önceden içerdiği lipitlerin biyodizel üretiminde hammadde
olması bakımından incelenmemiş olan A. versicolor hücrelerinin de en yüksek lipit
konsantrasyonu melas içeren besiyerinde 10 günlük inkübasyon süresi sonunda %22.8
olarak belirlenmiştir.
5.1.2 pH değeri etkisi
Yapılan çalışmalarda besiyeri pH değerinin fungus hücrelerinin hem gelişim hem de
lipit biriktirme kapasiteleri üzerine etkisi ortaya konmuştur. Literatürde maya
hücrelerinin lipit biriktirebilmesi için optimum pH değerleri 5.0–6.0 arasında
bildirilirken (Xue vd. 2006, Angerbauer vd. 2008, Easterling vd. 2009; Li vd. 2009),
filamentli fungus hücreleri için ise 4.0- 6.0 değerleri arasında bildirilmiştir
(Papanikolaou vd. 2008, Vicente vd. 2009, Veré vd. 2010).
Xue vd. (2006) Rhodotorula glutinis mayasının lipit konsantrasyonunu monosodyum
glutamat atıksuyu içeren ortamda araştırdıkları çalışmada besiyeri pH değeri 2.5 olduğu
zaman hücre gelişiminin çok düşük, pH 4.5 – 7.0 aralığında ise dengede kaldığını
göstermişlerdir. Çalışmada hücre gelişimi ve lipit konsantrasyonunun en yüksek
değerine pH 5.5’te ulaşılmıştır.
Zhu vd. (2008) yaptıkları çalışmada; Trichosporon fermentans maya hücrelerinin lipit
biriktirme kapasitesi üzerine ortam pH değerinin etkisini araştırdıkları çalışmada pH 4-
10 aralığında çalışmışlar ve maya hücrelerinin pH 6.5 değerinde %62.4 oranıyla en
yüksek lipit içeriğine ulaştıklarını görmüşlerdir.
Angerbauer vd. (2008) yaptıkları çalışmada; Lipomyces starkeyi mayasının gelişme
ortamındaki karbonun azota oranı 100 iken besiyerinin pH derecesini 5.0, 5.5, 6.0, 6.5
87
ve 7.0 değerlerine ayarlamış ve en yüksek lipit konsantrasyonunu %56 oranı ile pH 5
değerinde bulmuşlardır.
Çalışma sonucunda, denenen her 3 maya hücresinin de en yüksek lipit içeriğine pH 5
değerinde ulaştığı bulunmuştur. A. versicolor hücreleri ise en yüksek lipit
konsantrasyonlarını pH 4 değerinde göstermişlerdir.
5.1.3 Besiyerindeki karbon çeşidi ve miktarı
Fungal hücrelerin lipit birikimini sağlamak için kullanılan başlıca karbon kaynağı
glukozdur. Araştırıcılar farklı karbon kaynaklarının fungal lipit birikimi üzerine etkisini
de araştırmışlardır.
Zhu vd. (2008) yaptıkları çalışmada; Trichosporon fermentans maya hücrelerinin lipit
üretimine glukoz, sükroz, ksiloz, laktoz ve fruktoz gibi farklı karbon kaynaklarının
etkisini araştırmışlardır. Denenen tüm karbon kaynakları maya hücrelerinin yüksek lipit
içeriğine ulaşmasını sağlamıştır. Besiyerindeki karbonun azot miktarına oranı 108
olduğunda lipit içeriğinin az olduğu, 140’a çıktığı zaman hızla arttığı ve en yüksek
seviyesine ulaştığı görülmüştür. Bu oran daha da arttırıldığınde lipit içeriğinde az da
olsa düşüş gözlenmiştir. Bunun sebebinin yüksek miktardaki glukozun yüksek osmotik
basınca sebep olması veya glukozun aşırı kullanımının besiyeri pH değerinde ani düşüşe
(pH 3.5) yol açmasının olabileceği bildirilmiştir.
Easterling vd. (2009) gerçekleştirdikleri çalışmada Rhodotorula glutinis mayasının lipit
üretimini arttırmak amacıyla; dektroz ve ksilozu tek başlarına, ikisini birlikte ve
dekstroz ve ksilozu gliserol ile birlikte karbon kaynağı olarak kullanmışlardır. Maya
hücreleri inkübasyon süresinin 1. gününde dekstroz, ksiloz, gliserol, dekstroz ve ksiloz,
ksiloz ve gliserol, dekstroz ve gliserol içeren ortamlarda sırasıyla %16, %12, %25, %10,
%21, ve %34 oranında lipit biriktirmiştir. İnkübasyon süresinin 2. gününde gliserol
içeren ortamda %12.97, dekstroz içeren ortamda %8.56, ksiloz içeren ortamda %9.08 ve
dekstroz ile birlikte ksiloz içeren ortamda ise %1.11 oranında lipit artışı elde edilmiştir.
88
Her ne kadar gliserol tek başına kullanıldığında daha fazla lipit üretildiği gösterilse de
bu deneydeki standart sapmaların çok büyük olması nedeniyle karbon kaynakları tek
başına kullanıldığında mı yoksa gliserol ile birlikte kullanıldığı zaman mı daha fazla
lipit üretildiğine dair kesin bir sonuç elde edilememiştir. Buna rağmen gliserol içeren
ortamda geliştirilen maya hücreleri dekstroz içeren ve ksiloz içeren besiyerinde
geliştirilen maya hücrelerinden daha fazla lipit üretmiştir.
Angerbauer vd. (2008) yaptıkları çalışmada; Lipomyces starkeyi mayasının gelişme
ortamındaki karbonun azota oranını glukoz ilavesi ile 15, 20, 30, 60 ve 150 olarak
ayarlamış ve en yüksek lipit oranını %68 olarak besiyerindeki karbonun azota oranının
150 olduğu durumda elde etmişlerdir.
Li vd. (2009) yaptıkları çalışmada; Rhodotorula mucilaginosa TJY15a maya
hücrelerinin lipit üretimine farklı karbon kaynaklarının etkisini incelemişlerdir.
Araştırıcılar sukroz, glukoz, ksiloz, ve manyok nişastasını karbon kaynağı olarak
kullanmıştır. Maya hücrelerinin ortamda %2 oranında manyok nişastası varken %45.9
oranında yani diğer karbon kaynaklarına oranla daha fazla lipit biriktirebildiği
gözlenmiştir. Maya hücreleri glukoz, ksiloz ve sukroz içeren ortamda yaklaşık olarak
sırasıyla %35, %30 ve %25 oranında lipit biriktirebilmiştir.
Fakas vd. (2009) yaptıkları çalışmada Mucorales cinsine ait Mortierella isabellina
ATHUM 2935 ve Cunninghamella echinulata ATHUM 4411 iki yağlı fungusun azotun
sınırlı olduğu ksiloz, gliserol ve glukoz içeren ortamda lipit biriktirme kapasitelerini
incelemişlerdir. Araştıcılar azot kaynağı olarak 0.5 g/L miktarında (NH4)2SO4 ve maya
özütü kullanmışlardır.
Çalışmada her iki fungal hücrenin gelişimi için uygun substratın glukoz olduğu
bildirilmiştir. M. isabellina hücreleri glukoz içeren ortamda 27 g/L, C. echinulata
hücreleri ise 15 g/L toplam misel oluştururken, içerdikleri lipit miktarları sırasıyla
%46.0 ve %44.6 olarak bildirilmiştir. En yüksek lipit birikiminin ise ksiloz içeren
ortamda ise C/N oranı 285 iken M. isabellina hücrelerinde inkübasyon süresinin 9. günü
sonunda %65.5, C. echinulata hücrelerinde ise inkübasyon süresinin 8. günü sonunda
89
%57.7 oranında olduğu gözlenmiştir. Gliserol içeren ortamda geliştirilen hücrelerde ise
hem hücre gelişimi hem de lipit biriktirme kapasiteleri daha az görülmüştür.
Gerçekleştirilen tez çalışmasında, karbon kaynağı olarak kullanılan melas çözeltisinin
farklı konsantrasyonları denendiğinde her üç maya hücresinin de düşük melas
konsantrasyonunda %8 melas içeren ortama göre daha az miktarda lipit biriktirdiği
görülmüştür. Çünkü mikroorganizmalar ortamda ancak fazla miktarda karbon varsa
hücrelerinde lipit biriktirebilmektedirler. Ortamda karbonun arttırılması adına melas
konsantrasyonu arttırıldığında, içerdiği fenolik maddelerden kaynaklanan toksik etki
sebebiyle hücre gelişimi inhibe olmuş ve dolayısıyla lipit birikimi azalmıştır. Melasa ek
olarak ortama glukoz eklenmesi lipit konsantrasyonunu arttırmamıştır.
Çalışmada A. versicolor hücrelerinin maya hücrelerinin aksine denenen en düşük melas
konsantrasyonu olan %6’da en yüksek lipit konsantrasyonuna ulaştığı, daha yüksek
melas varlığında giderek azalan lipit konsantrasyonu içerdiği gözlenmiştir.
5.1.4 Besiyerindeki azot çeşidi ve miktarı
Literatürde yapılan çalışmalarda maya hücrelerinde lipit birikimini arttırmak için
kullanılan başlıca azot kaynağı (NH4)2SO4 olarak bildirilmiştir (Papanikolaou ve
Aggelis 2002, Yong-Hong vd. 2006, Li vd. 2007, Papanikolaou vd. 2008). Filamentli
fungus hücrelerinde ise (NH4)2SO4’e ek olarak maya özütü de hücresel lipit birikimi
için kullanılmıştır (Fakas vd. 2009, Veré vd. 2010).
Zhu vd. (2008) yaptıkları çalışmada; Trichosporon fermentans maya hücrelerinin lipit
biriktirme özellikleri üzerine pepton, üre, (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3 gibi farklı azot
kaynaklarının etkisini belirlemişlerdir. Çalışmada en yüksek lipit konsantrasyonu %54.9
oranıyla pepton içeren besiyerinde görülmüştür. Üre içeren besiyerinde %23.0 oranında
lipit konsantrasyonu elde edilirken, (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3 içeren besiyerlerinde
lipit konsantrasyonları sırasıyla %12.4, %15.7, %14.8 olarak bulunmuştur. Çalışmada
90
organik azot kaynağının maya hücrelerinin lipit üretimini olumlu yönde etkilediği
görülmüştür.
Li vd. (2009) tarafından yapılan çalışmada; Rhodotorula mucilaginosa TJY15a maya
hücrelerinin lipit üretimine organik (maya özütü ve pepton) ve inorganik (NaNO3,
(NH4)2SO4, NH4NO3) farklı azot kaynaklarının etkisini incelemişlerdir. Çalışma
sonucunda R. mucilaginosa TJY15a hücrelerinin lipit üretimi için en uygun azot
kaynağının maya özütü olduğunu bulmuşlardır. Maya hücreleri %2 manyok nişastası ve
%0.33 maya özütü içeren ortamda %47.9 oranında lipit biriktirmişlerdir. Azot kaynağı
olarak NaNO3 içeren ortamda maya hücreleri yaklaşık %30 oranında lipit biriktirirken,
pepton, (NH4)2SO4 ve NH4NO3 içeren ortamlarda birbirine benzer (yaklaşık %20)
oranda lipit biriktirmişlerdir.
Gerçekleştirilen tez çalışmasında, maya hücrelerinin lipit konsantrasyonlarının
belirlenmesi için azot kaynağı olarak (NH4)2SO4 kullanılmıştır. Besiyerinde (NH4)2SO4
miktarında sınırlandırmaya gidilmesi her üç maya hücresinin de daha yüksek oranda
lipit biriktirmesiyle sonuçlanmıştır.
A. versicolor hücrelerinin lipit konsantarsyonlarına farklı azot kaynaklarının etkisi
araştırıldığında genel olarak inorganik azot kaynaklarının organik azot kaynaklarına
göre daha düşük lipit içeriği oluşturduğu görülmüştür.
5.1.5 Biriktirilen lipitlerin yağ asidi dağılımları
Biyodizel üretiminde kullanılan hammaddenin yağ asidi dağılımı; sabunlaşma numarası,
iyot değeri ve setan numarasını etkilediği için yakıt kalitesinin belirlenmesinde önemli
yere sahiptir.
Xue vd. (2006) Rhodotorula glutinis hücrelerinden ekstrakte ettikleri lipitleri Gaz
Kromatografi’de analiz etmişlerdir. Sonuçta bu maya hücrelerinden elde ettikleri lipitin
91
bitkisel yağlara benzediğini ve 16 ve 18 numaralı karbon atomları bakımından zengin
olduğunu ve %92.4 oranında yüksek metil esteri oluşturduğunu göstermişlerdir.
Zhu vd. (2008) yaptıkları çalışmada; Trichosporon fermentans maya hücrelerinin
gelişiminde 20 ºC’den 35 ºC’ye çıkılması durumunda lipit içerisindeki doymamış yağ
asitlerinin oranının %71.8’den %52.0’a düştüğünü bildirmişlerdir. Çalışmada elde
ettikleri lipit bileşenlerinin başında palmitik asit, stearik asit, oleik ve linoleik asit
gelmektedir. Doymamış yağ asitlerinin toplam yağ asitlerine oranı %64 olarak
bulunmuştur.
Papanikolaou ve Aggelis (2002) yaptıkları çalışmada Yarrowia lipolytica mayasından
elde ettikleri lipitte %45 oleik ve %15 linoleik asit belirlemişlerdir. Aynı mayayı glukoz
içeren besiyerinde geliştirdiklerinde yağ asidi kompozisyonunun değiştiğini
görmüşlerdir.
Easterling vd. (2008) gerçekleştirdikleri çalışmada farklı karbon kaynağı içeren
ortamlarda geliştirilen Rhodotorula glutinis mayasından elde ettikleri lipitlerin metil
esterlerini belirlemişlerdir. En yüksek doymamış yağ asidi miktarı %53 oranıyla sadece
gliserol içeren ortamda, en düşük doymamış yağ asidi miktarına ise %25 oranıyla ksiloz
içeren ortamda elde edilmiştir. Çalışmada farklı karbon kaynaklarında geliştirilen
Rhodotorula glutinis hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucunda
görülen başlıca yağ asitleri palmitik asit, stearik asit, oleik asit, linoleik asit olarak
bildirilmiştir.
Angerbauer vd. (2008) yaptıkları çalışmada; Lipomyces starkeyi mayasından elde
ettikleri lipitin biyodizel üretimine hammadde olarak kullanımı ile ilgili yaptıkları
çalışmada toplam doymuş yağ asidi miktarını %70 olarak buldukları için yüksek setan
numarasına sahip metil esterleri gibi çok iyi yanma özelliğine sahip olduğunu ifade
etmişlerdir. Bu özellik aynı zamanda oluşan biyodizelin düşük sıcaklık davranışına
sebep olmakla birlikte bu sorunun mineral dizel ile karıştırıldığında aşılacağını
göstermektedir. Çalışmada elde edilen yağ asidi dağılımı; %0.9 miristik asit, %55.93
palmitik asit, %1.85 palmitoleik asit, %13.8 stearik asit, %25.89 oleik asit, <%0.1
92
linoleik asit;%0.12 linolenik asit, %0.48 arakidonik asit, %0.18 gadoleik asit, %0.48
behenik asit olarak bulunmuştur.
Li vd. (2010) yaptıkları çalışmada; Rhodotorula mucilaginosa TJY15a maya
hücrelerinin elde ettikleri lipitin transesterifikasyon reaksiyonu sonucunda %85.8
oranında C16:0 ve C18:1 metil esteri oluşturduğunu bulmuşlardır.
Fakas vd. (2009); Mortierella isabellina ATHUM 2935 ve Cunninghamella echinulata
ATHUM 4411 funguslarının lipit biriktirme kapasitelerini araştırdıkları çalışmalarında,
her iki fungal lipitin kullanılan karbon kaynağından bağımsız olarak birbirine benzer
dağılım gösterdiğini bildirmişlerdir. Hücre gelişiminin başında lipit içeriği %10
değerinin altındayken linoleik asit ve γ-linolenik asit konsantasyonlarının fazla
olduğunu bildirmişlerdir. Hücre lipit içeriği %20’yi geçtiğinde ise bu iki yağ asidi
miktarında düşüş olduğu fakat oleik ve palmitik asit içeriğinin arttığı gözlenmiştir. Her
iki fungus hücresi için de gelişimin tüm evrelerinde oleik asitin başlıca yağ asidi
bileşeni olduğu belirtilmiştir.
Gerçekleştirilen çalışmada C. lypolitica hücrelerinden eld edilen lipitin doymuşluk oranı
%63.8, C. tropicalis hücrelerinden elde edilen lipitin %92.7, R. mucilaginosa
hücrelerinden elde edilen lipitin ise %66.3 olduğu saptanmıştır. Denenen her üç maya
hücre lipitlerinin de başlıca bileşenleri C16:0 (palmitik asit) ve C18:0 (stearik asit)
olması sebebiyle biyodizel üretiminde önemli hammaddeler olabileceği
düşünülmektedir. Özellikle C. tropicalis hücrelerinden elde edilen lipit başta olmak
üzere her üç maya hücresinden de elde edilen lipitlerin doymuş yağ asitlerinden
oluşuyor olması, bu lipitlerden üretilecek biyodizelin yüksek setan sayısına ve çok
güçlü oksidatif kararlılığa sahip olabileceğini göstermektedir. Bu yüzden uzun süreli
depolanması sırasında daha az sorunla karşılaşılacağı düşünülmektedir.
A. versicolor hücrelerinden elde edilen lipitin transesterifikasyonu sonucunda belirlenen
başlıca yağ asitleri oleik ve linoleik asit olması sebebiyle fungal lipitte doymamış yağ
asidi oranının %72.9 olduğu görülmüştür.
93
5.2 Mikroalg Hücrelerinin Lipit Biriktirme Kapasitelerinin Araştırılması
Literatürde tez çalışmasında kullanılan siyanobakterilerin biyodizel üretiminde
hammadde olarak kullanımına ilişkin çalışma bulunmamaktadır. Siyanobakterilerin
lipitleri tilakoid memranlarında biriktirmeleri ve genetik manipülasyonlara daha uygun
olmaları mikrobiyel biyodizel yapımında bu mikroorganizmaların kullanımının daha
avantajlı olduğunu düşündürmesine rağmen literatürde konuyla ilgili çalışma
bulunmamaktadır. Literatürde yapılan çalışmalar başta Chlorella sp. olmak üzere
genellikle ökaryotik mikroalglerin lipit içeriklerini belirlemeye yöneliktir. Ökaryotik
mikroalg hücrelerinin hücre içi lipit konsantrasyonlarını ve biyodizel üretiminde
hammadde olarak kullanımlarını farklı gelişme koşulları ve lipitlerin yağ asidi
dağılımları belirlemektedir.
5.2.1 pH değeri etkisi
Ökaryotik mikroalgler ile yapılan çalışmalarda pH etkisinin belirlenmediği fakat tek pH
değerinin kullanıldığı çalışmalar bulunmaktadır. Literatürde besiyerinin pH değerinin
farklı mikroalg hücrelerinin lipit biriktirme kapasitelerine etkisini belirlemek için
yapılan çalışmalarda genel olarak 4.9-8.3 aralığında bulunan pH değerleri denenmiştir.
Samorì vd. (2010) yaptıkları çalışmada, Botryococcus braunii mikroalginin hücresinde
biriktirdiği yağı farklı solventler kullanarak ekstrakte ettikleri çalışmalarında mikroalg
hücrelerini pH değeri 7.5’e ayarlanmış besiyerinde geliştirmişlerdir.
Chinnasamy vd. (2010) halı endüstrisinden çıkan atık suyunu mikroalg hücrelerinin
gelişimi ve biyodizel üretimi için kullandıkları çalışmalarında atıksuyundan 13 adet
mikroalg izole etmişler ve bu farklı mikroalg hücrelerini pH değeri 7’ye ayarlanmış
besiyerinde geliştirmişlerdir.
94
Damiani vd. (2010) farklı stres koşullarının Haematococcus pluvialis mikroalginin lipit
içeriğine ve kompozisyonuna etkisini araştırdıkları çalışmada besiyeri pH değerini 7’ye
ayarlamışlardır.
Widjaja vd. (2009) yaptıkları çalışmada C. vulgaris hücrelerinin NaNO3 içeren
besiyerinde hücre içi lipit konsantrasyonlarını araştırmışlar ve pH değeri 5-8 arasındaki
tüm pH değerleirnde hücrelerin iyi geliştiğini göstermişlerdir.
Gerçekleştirilen tez çalışmasında siyanobakteri hücrelerinin gelişmesi ve en yüksek
seviyede lipit konsantrasyonuna ulaşabilmesi gerekli pH değerleri Synechococcus sp.
için pH 7, Cyanobacterium aponinum için pH 8, Phormidium sp. için ise pH 9 olarak
bulunmuştur.
5.2.2 Besiyerindeki karbon çeşidi ve miktarı
Araştırıcılar çalıştıkları ökaryotik mikroalg hücrelerinin lipit üretim verimini arttırmak
amacıyla besiyerine karbon kaynağı ilaveleri yapmışlardır. Ökaryotik mikroalg
hücrelerinin lipit üretim verimini arttırmak amacıyla en çok kullanılan inorganik karbon
kaynağı CO2’dir.
Converti vd. (2009) yaptıkları çalışmada, sıcaklığın ve farklı azot konsantrasyonlarının
Nannochloropsis oculata ve Chlorella vulgaris hücrelerinin lipit içeriği üzerine etkisini
14 günlük inkübasyon süresinde araştırdıkları çalışmalarında mikroalg hücrelerinin
gelişmeleri için tek karbon kaynağı olarak sadece havada bulunan yaklaşık 300 ppm
miktarındaki CO2’yi kullanmışlardır. Araştıcılar en yüksek lipit konsantrasyonunu
Nannochloropsis oculata hücreleri için %15.31 ve Chlorella vulgaris hücreleri için ise
%16.41 olarak bulmuşlardır.
Gao vd. (2010) yaptıkları çalışmada, Chlorella protothecoides mikroalgini organik bir
karbon kaynağı olan glukoz kullanarak hetetrofik olarak geliştirmişler ve hücrelerin
yüksek lipit içeriğine ulaştıklarını bulmuşlar. Çalışmada 120 saat sonunda 10 g/L
95
glukoz, sukroz ve fruktoz içeren ortamda hücre yoğunluğu sırasıyla 3.7, 3.9, 1.2 g/L,
lipit içeriği ise %53.3, %52.7, %37.7 olarak bulunmuştur. Çalışmada lipit verimini
arttırmak ve maliyeti azaltmak amacıyla karbon kaynağı olarak sorgum pekmezi
kullanılmıştır.
Yoo vd. (2010) yaptıkları çalışmada; modifiye edilmiş Chu 13 besiyerinde
geliştirdikleri Botryococcus braunii ve BG-11 besiyerinde geliştirdikleri Chlorella
vulgaris, ve Scenedesmus sp. mikroalglerini %10 CO2 içeren ortamda inkübasyon
süresinin 7. ve 14. günlerinde gelişme ve lipit biriktirme kapasiteleri bakımından
incelemişlerdir. Lipit ekstraksiyonları 2:1 kloroform:metanol ile yapılmıştır. B. braunii
inkübasyon süresinin sonunda 5.51 mg L-1d-1 (biyokütlenin %21’i kadar), C. vulgaris
6.91 mg L-1d-1, Scenedesmus sp. ise 20.65 mg L-1d-1 (biyokütlenin %9’u kadar), lipit
üretkenliği göstermiştir.
Ota vd. (2009) gerçekleştirdikleri çalışmada, inorganik karbon ve nitrat varlığında
CO2’ye toleransı fazla bir yeşil alg olan Chlorococcum littorale’nin fototrofik yağ asidi
üretimini araştırmışlardır. Nitrojen sınırlamasının olmadığı ortamda farklı CO2
konsantrasyonlarında logaritmik gelişme fazında yağ asidi içeriği sabit kalırken, azot
sınırlaması olduğunda CO2 konsantrasyonundaki azalmaya yağ asidi içeriğinin arttığı
görülmüştür. Çalışmada azot sınırlaması olduğunda HCO3/CO2 oranının yağ asidi
üretimini kontrol eden faktör olduğu bildirilmiştir. %5 CO2 konsantrasyonunda
maksimum lipit içeriği %34 olarak elde edilmiştir. Gaz Kromatografi cihazında
Chlorococcum littorale’nin C14:0, C16:0, C16:1, C16:2, C16:3, C16:4, C18:0, C18:1,
C18:2, C18:3, C18:4 yağ asitlerinden oluştuğu bildirilmiştir.
Oh vd. (2009) yaptıkları çalışmada; fototrofik ve heterotrofik gelişme koşullarının geri
beslemeli kütürde geliştirilen Porphyridium cruentum mikroalginin lipit üretimi üzerine
etkisini araştırmışlardır. Araştırıcılar en yüksek lipit konsantrasyonunu inkübasyon
süresinin 15. gününde tek karbon kaynağının CO2 olduğu ortamda %19.3 olarak 12:12
ışık:karanlık periyodunda geliştirilen hücrelerden elde etmişlerdir. 10g/L glukoz
varlığında karanlık ortamda geliştirilen hücrelerde lipit konsantrasyonu %10.9 olarak
bulunurken, karbon kaynağı olarak gliserolün kullanıldığı hetetrofik gelişmede hem
96
hücre gelişimi hem de lipit üretimi (%2.2) glukoza göre daha düşük seviyede elde
edilmiştir. Artan inkübasyon süresinin lipit birikimine etkisini belirlemek için 5, 10, 15,
2, 25 gün süreyele geliştirilmiş ve en yüksek biyokütle ve lipit eldesine 15. günün
sonunda ulaşılmıştır. P. cruentum mikroalginin içerdiği lipitlerin %30’u C16 ve C18:1
den oluşmaktadır.
Gerçekleştirilen tez çalışmasında Synechococcus sp., Cyanobacterium aponinum ve
Phormidium sp siyanobakteri hücrelerinin geliştikleri ortama ilave karbon kaynağı
olarak üç farklı konsantrasyonda (34, 43, 51 ppm) NaHCO3 eklenmiştir. Fakat
çalışmada denenen her üç siyanobakteri türünün de besiyerindeki farklı NaHCO3
konsantrasyonlarından etkilenmediği görülmüştür.
5.2.3 Besiyerindeki azot çeşidi ve miktarı
Gao vd. (2010) yaptıkları çalışmada Chlorella protothecoides hücrelerinin gelişimi için
azot kaynağı olarak maya özütü kullanılmıştır. Sorgum pekmezi içeren ortama 1, 2, ve 3
g/L maya özütü eklenmiş ve sırasıyla 5.30, 5.85, 6.00 g/L biyokütle; %50.2, %49.2 ve
%48.9 lipit içeriği elde edilmiştir.
Damiani vd. (2010) yaptıkları çalışmada; 14 günlük inkübasyon süresi sonucunda
metanol ile yapılan ekstraksiyonlar ile farklı stres koşullarının Haematococcus pluvialis
mikroalginin lipit içeriğine ve kompozisyonuna etkisini araştırmışlardır. Çalışmada
hücreler azot kaynağı olarak NaNO3’ün kullanıldığı Bold’s Bazal Medium’da
geliştirilmiştir. Çalışmada azotun yeterli olduğu ortamda sürekli yüksek ışık şiddeti A
stresi; azotun sınırlı olduğu ortamda sürekli yüksek ışık şiddeti B stresi olarak
tanımlanmıştır. Strese maruz bırakılmayan kontrol hücrelerinde lipit konsantrasyonu
%15.61 iken; A stresine maruz bırakılan hücrelerde %34.85, B stresine maruz bırakılan
hücrelerde %32.99 olarak belirlenmiştir.
Widjaja vd., (2009) yaptıkları çalışmada C. vulgaris hücrelerinin NaNO3 içeren
besiyerinde hücre içi lipit konsantrasyonlarını araştırmışlardır. Azot sınırlı ortamda
geliştirilen mikroalg hücrelerinde toplam lipit içeriğinde artma görülmüştür. Bu ortamda
97
geliştirilen hücrelerde yağ asidi dağılımı serbest yağ asidince zengin lipitlerden daha
fazla oranda triaçilgliserol içeren lipitlere dönüşmüştür. Azot sınırlı ortamda hücre
gelişmesi yavaş olsa da daha yüksek lipit içeriği gözlendiği için inkübasyon süresinin
etkisi belirlenirken bu durum göz önünde bulundurulmuştur. Araştırıcılar azot sınırlı
ortamda inkübasyon süresinin 7. gününde lipit içeriğinin arttığını, 17. gününde ise bu
artışın daha da ilerlediğini bulmuşlardır. Lipit prodüktivitesinin ise normal besiyerinden
7 günlük azot sınırlı ortama geçildiğinde azaldığı, ama uzun süren azot sınırlı duruma
geçildiğinde tekrar arttığı görülmüştür. Mikroalg hücrelerinin lipit içeriği 15 günlük
inkübasyon süresi sonunda %26.71, 20 günlük inkübasyon süresi sonunda ise %29.53
olarak bulunmuştur.
Pruvost vd. (2009) yaptıkları çalışmada fotobiyoreaktörde bold basal besiyerinde pH
7.5’te geliştirdikleri Neochloris oleoabundans mikroalginin lipit biriktirme (özellikle
triaçilgliserol) kapasitesini araştırmışlardır. Ortamdaki azot sınırlandırmasının lipit
birikimi üzerine etkisi araştırıldığında, herhangi bir mineral sınırlandırılmasının
olmadığı besiyerinde geliştirilen hücrelerde biriktirilen en yüksek toplam lipit %23,
triaçilgliserol %3 bulunurken, azotun sınırlandırıldığı ortamda geliştirilen hücrelerdeki
en yüksek toplam lipit %37, triaçilgliserol ise %18 olarak bulunmuştur.
Hsieh and Wu (2009) kesikli sistemde geliştirdikleri Chlorella sp. mikroalginin farklı
ortam şartlarında lipit ve biyokütle üretimini araştırdıkları çalışmalarında azot kaynağı
olarak üre kullanmışlardır. Araştırıcılar üre sınırlandırılmasının geişme ve lipit birikimi
üzerine etkisini bulmak için 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, ve 0.2 g/L olmak üzere farklı üre
konsantrasyonları denemişlerdir. Çalışma sonunda üre konsantrasyonundaki artışın
hücrelerin lipit içeriğinde azalmaya sebep olduğunu bulmuşlardır. Mikroalg hücreleri 6
günlük inkübasyon süresi sonunda en yüksek lipit içeriğine ortamda 0.025 g/L üre
varlığında 0.661 g/g olarak ulaşmışlardır.
Gerçekleştirilen tez çalışmasında Synechococcus sp., Cyanobacterium aponinum ve
Phormidium sp. siyanobakteri hücrelerinin ulaştıkları en yüksek lipit
konsantrasyonunun bulunması için azot içeren BG-11 besiyerine 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 g/L
olmak üzere farklı konsantrasyonlarda NaNO3 eklenmiştir. Denenen üç siyanobakteri
98
hücresinin de inkübasyon süresinin 15. gününde besiyerindeki azot sınırlandırılmasına
paralel olarak hücre içi lipit konsantrasyonunu arttırdığı görülmüştür.
5.2.4 Biriktirilen lipitlerin yağ asidi dağılımları
Damiani vd. (2010) yaptıkları çalışmada; Haematococcus pluvialis mikroalginin
denenen tüm koşullarda yağ asidi dağılımının birbirine benzemekle birlikte başlıca
bileşenlerin palmitik, stearik, oleik, linoleik, linolenik ve linolelaidik asit olduğunu
bulmuşlardır. Doymuş yağ asidi oranı A stres ortamı, B stres ortamı ve kontrol
ortamında sırasıyla %30.36, %29.62 ve %27.81 olarak bildirilmiştir. Çalışmada bulunan
başlıca yağ asidi metil esterleri olan C16:0 için kontrol, A stres ve B stres ortamlarında
sırasıyla %22.49, %18.87, %21.29; C18:0 için %3.15, %7.07, %5.69; C18:1n9c için
%19.36, %18.25, %18.35; C18:2n6t için %6.67, %5.37, %7.57; C18:2n6c için ise
%20.23, %22.06, %22.9 olarak bulunmuştur.
Gao vd. (2010) yaptıkları çalışmada, Chlorella protothecoides mikroalginden elde
edilen lipitleri asit bir katalizör varlığında transesterifikasyon reaksiyonuna
uğratmışlardır. Hem glukoz hem de sorgum pekmezi içeren ortamda geliştirdikleri
hücrelerden ekstrakte edilen lipitlerin transesterifikasyon reaksiyonu sonucunda en fazla
oleik, linoleik ve setan asit metil esterlerini bulunmuştur. Bu oranlar glukoz içeren
ortamda sırasıyla %53.75, %19.48, %11.34 iken sorgum pekmezi içeren ortamda
geliştirilen hücrelerde %66.80, %15.12, %12.66 olarak gözlenmiştir.
Yoo vd. (2010) çalışmada denedikleri her üç mikroalg türü içinde (Botryococcus
braunii, Chlorella vulgaris ve Scenedesmus sp.) bulunan yağ asidi metil esterleri C16:0,
C16:1, C18:0, C18:1, ve C18:2 olarak bildirilmiştir. Bu yağ asitleri arasından palmitik,
oleik ve linoleik asit en fazla yağ asitleriyken, palmitoleik ve stearik asit daha az
bulunmuştur. C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, ve C18:2 yağ asitleri Botryococcus braunii
mikroalginde sırasıyla % 29.5, %3.4, %1.0, %44.9, %21.2; Chlorella vulgaris’de
%24.0, %2.1, %1.3, %24.8, %47.8; Scenedesmus sp. mikroalginde ise %36.3, %4.0,
%2.7, %25.9, %31.1 olarak bildirilmiştir.
99
Gerçekleştirilen çalışmada Synechococcus sp. hücrelerinden elde edilen lipitin
doymuşluk oranı %74.5, Cyanobacterium aponinum hücrelerinden elde edilen lipitin
%77.9, Phormidium sp. hücrelerinden elde edilen lipitin ise %84.7 olarak elde
edilmiştir. Çalışmada kullanılan her üç siyanobakteri hücre lipitlerinin de başlıca
bileşenlerinin C16:0 (palmitik asit) ve C18:0 (stearik asit) olması sebebiyle biyodizel
üretiminde önemli hammaddeler olabileceği düşünülmektedir. Her üç siyanobakteri
hücresinden de elde edilen lipitlerin doymuş yağ asitlerinden oluşuyor olması, bu
lipitlerden üretilecek biyodizelin yüksek setan sayısına ve çok güçlü oksidatif kararlılığa
sahip olabileceğini göstermektedir. Bu yüzden uzun süreli depolanması sırasında daha
az sorunla karşılaşılacağı düşünülmektedir.
100
KAYNAKLAR Alptekin, E. and Canakci, M. 2010. Optimization of pretreatment reaction for methyl
ester production from chicken fat. Fuel, in press.
Aksu, Z. and Dönmez, G. 2000. Combined effects of sucrose and copper(II) ions on the growth and copper(II) bioaccumulation properties of Candida sp. J Chem. Technol. Biotechnol. 75 , 847-853.
Angerbauer, C., Siebenhofer, M., Mittelbatch, M. and Guebitz, G.M. 2008. Conversion of sewage sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production. Bioresour. Technol. 99, 3051-3056.
Anonymous. 2010. Web sitesi: http://www.doctorfungus.org/thefungi/index.htm. Erişim tarihi:09.06.2010
Anonymous. 2010. Web sitesi: http://en.wikipedia.org/wiki/microalgae Erişim tarihi:09.06.2010
Anonymous. 2010. Web sitesi: http://www.algaebase.org Erişim tarihi:09.06.2010
Anonymous. 2010. Web sitesi: http://en.wikipedia.org/wiki/Cyanobacteria Erişim tarihi:09.06.2010
Banerjee, A. and Chakraborty, R. 2009. Parametric sensitivity in transesterification of waste cooking oil for biodiesel production—A review. Resources, Conservation and Recycling, 53, 490-497.
Basha, S.A., Gopal, K.R. and Jebaraj, S.A 2009. Review on biodiesel production, combustion, emissions and performance, Renew. Sust. Energy Rev. 13 1628–1634.
Bhatti, H.N., Hanif, M.A., Qasim, M. and Rehman, A. 2008. Biodiesel production from waste tallow. Fuel, 87, 2961-2966.
Bligh, E. G. and Dyer, W. J. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37; 911-917.
Borowitzka, M. 1988. Fats, oils and hydrocarbons in microalgal biotechnology. Cambridge, UK: Cambridge University Pres, 257-287.
Canakci, M. 2007. The potential of restaurant waste lipids as biodiesel feedstocks Bioresour. Technol,98 , 183-190.
101
Chen, F. 1996. High cell density culture of microalgae in heterotrophic growth Trends in Biotechnology, Volume 14, 421-426.
Chınnasamy, S., Bhatnagar, A., Hunt, R. W. and Das K.C. 2010. Microalgae cultivation in a wastewater dominated by carpet mill effluents for biofuel applications. Bioresource Technology .101, 3097–3105
Chıu, S.Y., Kao, C.Y., Tsai M.T., Ong, S.C., Chen, C.H. and Lin,C.S. 2009. Lipid accumulation and CO2 utilization of Nannochloropsis oculata in response to CO2 aeration. Bioresource Technology 100, 833–838.
Chung, K.H., Kim, J., and Lee, K.Y. 2009. Biodiesel production by transesterification of duck tallow with methanol on alkali catalysts. Biomass and Bioenergy. 33, 155-158.
Cobelas, M.A. and Lechado, J.Z., 1989. Lipids in microalgae: a review. Biochemistry. Gracas. 40, 118-145.
Convertı, A., Casazza, A.A., Ortiz, E.Y., Perego.P. and Borghi, M.D. 2009. Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production. Chemical Engineering and Processing. 48,1146–1151.
Damianı, M.C., Popovich, C.A., Constenla, D. and Leonardi, P.I. 2010. Lipid analysis in Haematococcus pluvialis to assess its potential use as a biodiesel feedstock. Bioresource Technology, in pres
Demirbaş, A. 2005. Biodiesel production from vegetable oils via catalytic and non-catalytic supercritical methanol transesterification methods. Prog. Energ. Combust. 31, 466-487.
Easterling, E.R., French, W.T., Hernveez, R. and Licha, M. 2009. The effect of glycerol as a sole and secondary substrate on the growth and fatty acid composition of Rhodotorula glutinis. Bioresour. Technol. 100, 356-361.
Economou, C.N., Marki, A, Aggelis, G., Pavlou, S. and Vayenas, D.V. 2010. Semi-solid state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil, Bioresour. Technol. 101 1385–1388.
Ertuğrul, S., San N.O., and Dönmez, G. 2009. Treatment of dye (Remazol Blue) and heavy metals using yeast cells with the purpose of managing polluted textile wastewaters. Ecological Engineering, 35;128-134.
102
Enweremadu, C.C. and Mbarawa, M.M. 2009. Technical aspects of production and analysis of biodiesel from used cooking oil—A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 13, 2205-2224.
Evans, C.T. and Ratledge, C. 1983. A comparison of the oleaginous yeast, Candida curvata, grown on different carbon sources in continuous and batch culture. Lipids, 18, 623-629.
Fakas, S., Papanikolaou, S., Batsos, A., Galiotou-Panayotou, M., Mallouchos A. and Aggelis, G. 2009. Evaluating renewable carbon sources as substrates for single cell oil production by Cunninghamella echinulata and Mortierella isabellina, Biomass Bioenergy, 33 573 – 580.
Fernández-Álvarez, P., Vila, J., Garrido, J.M., Grifoll, M,. Feijoo, G. and Lema, J.M. 2007. Evaluation of biodiesel as bioremediation agent for the treatment of the shore affected by the heavy oil spill of the Prestige, J. Hazard. Mater. 147, 914-922.
Fukuda, H., Kondo, A. and Noda, H. 2001. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. Journal of Bioscience and Bioengineering, 92, 405–416.
Gao, C., Zhai, Y., Ding, Y. and Wu, Q. 2010. Application of sweet sorghum for biodiesel production by heterotrophic microalga Chlorella protothecoides. Applied Energy. 87, 756–761.
Gerpen, J.V. 2005. Biodiesel processing and production. Fuel Processing Technology. 86, 1097-1107.
GuanHua, H.. Chen, F., Wei, D.,. Zhang, X., Chen, G. 2010. Biodiesel production by microalgal biotechnology, Appl. Energy. 87 , 38-46.
Hansson, L. and Dostálek, M. 1986. Effect of culture conditions on fatty acid composition in lipids produced by the yeast Cryptococcus albidus var. albidus. JAOCS, 63, 1179-1184.
Helwani, Z., Othman, M.R,. Aziz, N., Fernveo, W.J.N. and Kim, J.2009. Technologies for production of biodiesel focusing on green catalytic techniques:A review. Fuel Processing Technology, 90, 1502-1504.
Hirano, A., Hon-Nami, K., Kunito, S., Hada, M. and Ogushi, Y. 1998. Temperature effect on continuous gasification of microalgal biomass: theoretical yield of methanol production and its energy balance Catalysis Today, 45, 399-404.
Hsieh, C.H. and Wu, W.T. 2009. Cultivation of microalgae for oil production with a cultivation strategy of urea limitation. Bioresource Technology. 100, 3921–3926,
103
Hu, Q., Sommerfeld, M., Jarvis, E., Ghirardi, M., Posewitz, M., Seibert, M., and Darzins, A. 2008. Microlagal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal, 54, 621-639.
Illman, A.M., Scragg, A.H. and Shales, S.W. 2000. Increase in Chlorella strains calorific values when grown in low nitrogen medium. Enzyme and Microbial Technology 27, 631–635.
Iso, M., Chen, B., Eguchi, M., Kudo, T. and Shrestha, S. 2001. Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase. Journal of Molecular Catalysis, 16; 53-58.
Jaeger, K.E. and Eggert, T. 2002. Lipases for biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 13; 390-397.
Kaıeda, M., Samukawa, L.T., Kondo, L.K. and Fukuda, H. 2001. Effect of Methanol and Water Contents on Production of Biodiesel Fuel from Plant Oil Catalyzed by Various Lipases in a Solvent-Free System. Journal Of Bıoscıence and Bıoengıneerıng. 91, 12-15.
Karatay, S. E. and Dönmez, G. 2010.Improving the lipid accumulation properties of the yeast cells for biodiesel production using molasses, Bioresource Technology, 101; 7988-7990
Knothe, G. 2005. Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters. Fuel Processing Technology, 86, 1059-1070.
Knothe, G. 2006. Analyzing biodiesel:standards and other methods. J Am Oil Chem Soc, 83, 823–33.
Knothe, G. 2010. Biodiesel and renewable diesel: A comparison. Progress in Energy and Combustion Science. 36, 364-373.
Kondamudi, N., Strull, J., Misra, M., and Mohapatra, S.K. 2009. A green process for producing biodiesel from feather meal. J Agric Food Chem, 57, 6163–6166.
Lam, M.K., Lee, K.T., and Mohamed, A.R. 2010. Homogeneous, heterogeneous and enzymatic catalysis for transesterification of high free fatty acid oil (waste cooking oil) to biodiesel: A review. Biotechnology Advances, 28, 500-518.
Lee, J.Y., Yoo, C., Jun, S.Y., Ahn, C.Y. and O. H.M. 2010. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresource Technology .101 , S75–S77.
104
Leung, Y.C.D., Wu, X. and Leung, M.K.H. 2010. A review on biodiesel production using catalyzed transesterification. Applied Energy, 87, 1083-1095.
Li, M., Liu, G.L., Chi, Z. and Chi, Z. M. 2010. Single cell oil production from hydrolysate of cassava starch by marine-derived yeast Rhodotorula mucilaginosa TJY15a, Biomass Bioenergy 34 , 101-107.
Li, Y., Zhao, Z.K. and Bai, F. 2007. High-density cultuvation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture. Enzyme Microb. Tech. 41, 312-317.
Liu, B. and Zhao, Z.K., 2007. Biodiesel production by direct methanolysis of oleaginous microbial biomass. J Chem. Technol. Biotechnol. 82, 775-780.
Liu, Z.Y., Wang, G.C., Zhou, B.C. 2008. Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris. Bioresource Technology 99, 4717–4722.
Lorenz, R.T., and Cysewski, G.R. 2000. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends in Biotechnology, Volume 18, 160-167.
Ma, F. and Hanna, M.A. 1999.Biodiesel production: a review. Bioresource Technology, 70, 1–15.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., and Parker, J. 2009. Brock Biology of Microorganisms, Twelfth edition. Pearson Education, USA.
Marchetti, J.M., Miguel, V.U., and Errazu, A.F. 2007. Possible methods for biodiesel production. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 11, 1300-1311.
Marulanda, V.F., Anitescu, G., and Tavlarides, L.L. 2010. Investigations on
supercritical transesterification of chicken fat for biodiesel production from low-cost lipid feedstocks. The Journal of Supercritical Fluids, 54, 53-60.
Mata, T.M., Martins, A.A., and Caetano, N. S. 2010. Microalgae for biodiesel
production and other applications: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 14, 217-232.
Meher, L.C., Sagar, V.D., and Naik, S.N. 2006. Technical aspects of biodiesel production by transesterification. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 10, 248-268.
Meng, X., Yang, J., Xu, X., Zhang, L., Nie, Q., and Xian, M. 2009. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renewable Energy, 34, 1-5.
105
Morowvat, M.H., Rasoul-Amini, S. and Ghasemi. Y. 2010. Chlamydomonas as a ‘‘new” organism for biodiesel production. Bioresource Technology. 101, 2059–2062.
Oh, S.H., Han,J.G., Kim,Y., Ha, J.H., Kim, S.S., Jeong, M.H., Jeong, H.S., Kim, N.Y., Cho, J.S., Yoon, W.B., Lee, S.Y.,Kang, D.H. and Lee H.Y. 2009. Lipid production in Porphyridium cruentum grown under different culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108, 429–434.
Ohlrogge, J., and Browse, J. 1995. Lipid biosynthesis. Plant Cell, 7, 957-970.
Ota M., Kato, Y., Watanabe, H., Watanabe, M., Sato, Y.,Smith Jr. R. L. and Inomata H. 2009. Fatty acid production from a highly CO2 tolerant alga, Chlorocuccum littorale,in the presence of inorganic carbon and nitrate. Bioresource Technology 100, 5237–5242.
Paika, M.J., Kim, H., Lee, J., Brve, J. and Kim, K.R. 2009.Separation of triacylglycerols vande free fatty acids in microalgal lipids by solid-phase extraction for separate fatty acid profiling analysis by gas chromatography. Journal of Chromatography A, 1216, 5917–5923.
Panwar, N.L., Hemant, Y. Shrirame, N.S., Jindal, R.S. and Kurchania, A.K. 2010. Performance evaluation of a diesel engine fueled with methyl ester of castor seed oil. Applied Thermal Engineering. 30, 245–249.
Papanikolaou, S. Fakas, S. Fick, M. Chevalot I., Galiotou-Panayotou, M., Komaitis, M. Marc, I. and Aggelis, G. 2008.Biotechnological valorisation of raw glycerol dischargedafter bio-diesel (fatty acid methyl esters) anufacturing process: Production of 1,3-propanediol, citric acid and single cell oil, Biomass Bioenergy. 32 60–71.
Papanikolaou, S. and Aggelis, G. 2002. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresour. Technol. 82, 43-49.
Pasqualino, J. C., Montane´, D. and Salvado´, J. 2006. Synergic effects of biodiesel in the biodegradability of fossil-derived fuels, Biomass Bioenergy 30, 874–879.
Peng, X., and Chen, Y. 2008. Single cell oil production in solid-state fermentation by Microsphaeropsis sp. from steam-exploded wheat straw mixed with wheat bran. Bioresour. Technol. 99, 3885-3889.
Peng, X. and Chen, H. 2008. Rapid estimation of single cell oil content of solid-state fermented mass using near-infrared spectroscopy, Bioresour. Technol. 99 8869–8872.
106
Phan, A.N., and Phan, T.M. 2008. Biodiesel production from waste cooking oils. Fuel, 87, 3490-3496.
Pruvost J., Van Vooren, G., Cogne, G. and Legrve, J. 2009. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology 100, 5988–5995.
Ratledge, C. 2004. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for Single Cell Oil production, Biochimie. 86 , 807–815.
Ratledge, C., and Wynn, J.P. 2002. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Advances in Applied Microbiology, 51, 1-80.
Rippka, R. 1988. Isolation and purification of Cyanobacteria, Meth Enzymol.167, 3–27.
Rittman, B. E. 2008. Opportunities for renewable bioenergy using microorganisms. Biotechnology and Bioengineering, 100, 203-212.
Rupcic, J., Blagovic, B. and Maric, V. 1996. Cell lipids of the Candida lipolytica yeast grown on methanol. J. Chromatogr. 755, 75-80.
Samori, C. , Torri, C. , Samorì, G. Fabbri, D., Galletti, P., Guerrini, F.,Pistocchi, R. and Tagliavini E. 2010. Extraction of hydrocarbons from microalga Botryococcus braunii with switchable solvents. Bioresource Technology. 101, 3274-3279.
Sawayama, S., Inoue, S., Dote, Y., and Yokoyama, S.Y. 1995. CO2 fixation and oil production through microalga. Energy Convers Manag, 36, 729–731.
Scragg, A.H., Morrison, J. and Shales S.W. 2003.The use of a fuel containing Chlorella vulgaris in a diesel engine. Enzyme and Microbial Technology 33, 884–889.
Srivastava, A. and Prasad, R. 2000. Triglycerides-based diesel fuels. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 4, 111-133.
Tan, T., Lu, J., Nie, K., Deng, L., and Wang, F. 2010. Biodiesel production with immobilized lipase: A review. Biotechnology Advances, in press.
Taştan, B. E., Ertuğrul, S., and G. Dönmez, 2010. Effective bioremoval of reactive dye and heavy metals by Aspergillus versicolor ,Bioresour. Technol. 101, 870-876.
Veré, A., Diamantopoulou, P., Philippoussis, A., Sarris, D., Komaitis, M. and Papanikolaou, S. 2010. Biotechnological conversions of bio-diesel derived waste
107
glycerol into added-value compounds by higher fungi: production of biomass, single cell oil and oxalic acid, Industrial Crop. Product. in press.
Vermaas W. 1998. Gene modifications and mutation mapping to study the function of photosystem II. Meth Enzymol, 297,293–310.
Vicente, G., Bautista, L.F., Rodríguez, R., Gutiérrez, F.J., Sádaba, I., Ruiz-Vázquez, R.M., Torres-Martínez, S. and Garre, V. 2009. Biodiesel production from biomass of an oleaginous fungus, Biochem. Eng. J. 48 , 22–27.
Wang, L., Li, Y., Chen, P., Min, M., Chen, Y., Zhu, J. and Ruan R. R. 2010. Anaerobic digested dairy manure as a nutrient supplement for cultivation of oil-rich green microalgae Chlorella sp. Bioresource Technology 101, 2623–2628.
Widjaja, A., Chien, C.C. and Ju, Y.H. 2009. Study of increasing lipid production from fresh water microalgae Chlorella vulgaris. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers 40, 13–20.
Xin, L., Hong-ying H. and Jia, Y. 2009. Lipid accumulation and nutrient removal properties of a newly isolated freshwater microalga, Scenedesmus sp. LX1, growing in secondary effluent. New Biotechnology.
Xu, H., Miao, X. and Wu, Q. 2006.High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. Journal of Biotechnology. 126, 499–507
Xue, F., Miao, J., Zhang, X., Luo, H. and Tan, T. 2008. Studies on lipid production by Rhodotorula glutinis fermentation using monosodium glutamate wastewater as culture medium. Bioresour. Technol. 99, 5923-5927.
Xue, F., Zhang, X., Luo, H. and Tan, T. 2006. A new method for preparing raw material for biodiesel production. Process Biochem. 41, 1699-1702.
Yan, J., and Lin, T. 2009. Biofuels in Asia, Appl. Energy. 86 , S1-S10.
Yong-Hong, L., Bo, L., Zong-Bao, Z. and Feng-Wu, B. 2006. Optimization of culture conditions for lipid production by Rhodosporidium toruloides. Chinese J. Biotech. 22, 650-656.
Yongsheng, G., Wei, H., Yang. F, Li. D, Fang. W. and Lin, R. 2009. Study on volatility and flash point of the pseudo-binary mixtures of sunflowerseed-based biodiesel + ethanol, J. Hazard. Mater. 167 ,625–629.
108
Yoo, C., Jun, S.Y., Lee, J.Y., Ahn, C.Y. and Oh, H.M. 2010. Selection of microalgae for lipid production under high levels carbon dioxide. Bioresource Technology. 101 ,S71–S74.
Zhu, L.Y., Zong, M.H. and Wu, H. 2008. Efficient lipid production with Trichosporon fermentans and its use for biodiesel preparation. Bioresour. Technol. 99, 7881-7885.
Zhu, M., Zhou, P. P. and Yu L. J.,2002. Extraction of lipids from Mortierella alpina and enrichment of arachidonic acid from the fungal lipids, Bioresour. Technol.84 93-95.
109
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı : Sevgi ERTUĞRUL KARATAY
Doğum yeri : Çekerek
Doğum Tarihi : 22. 11. 1980
Medeni Hali : Evli
Yabancı Dili : İngilizce
Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)
Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü (2002)
Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı
( 2005)
Doktora : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı (2010)
Çalıştığı Kurum :
Ankara Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Araştırma Görevlisi, 2002-
Yayınları (SCI kapsamında)
Karatay, S. E. and Dönmez, G. 2010.Improving the lipid accumulation properties of the yeast cells for biodiesel production using molasses, Bioresource Technology, 101; 7988-7990
Aksu, Z., Ertuğrul, S. and Dönmez, G. 2010. Methlene Blue biosorption by Rhizophus arrhizus: Effect of SDS (sodium dodecylsulfate) surfactant on biosorption properties. Chemical Engineering Journal, 158; 474-481.
Taştan, B.E., Ertuğrul, S. and Dönmez, G. 2010. Effective bioremoval of reactive dye ve heavy metals by Aspergillus versicolor. Bioresource Technology, 101; 870-876.
Aksu, Z., Ertuğrul, S. and Dönmez, G. 2009. Single ve binary chromium(VI) ve Remazol Black B biosorption properties of Phormidium sp.Journal of Hazardous Materials, 168; 310-318.
Verstraete, K., Koch, S., Ertugrul, S., Vveenberghe, I., Aerts, M., Vveriessche, G., Thiede, C. and Savvides, S.N. 2009. Efficient production of bioactive recombinant human Flt3 ligve in E. coli. The Protein Journal, 28;57-65.
110
Ertuğrul, S., San N.O. and Dönmez, G. 2009. Treatment of dye (Remazol Blue) ve heavy metals using yeast cells with the purpose of managing polluted textile wastewaters. Ecological Engineering, 35;128-134.
Ertuğrul, S., Bakır, M. and Dönmez, G. 2008. Treatment of dye – rich wastewater by an immobilized thermophilic cyanobacterial strain: Phormidium sp. Ecological Engineering, 32;244-248.
Aksu, Z., Kılıç, N.K., Ertuğrul, S. and Dönmez, G. 2007. Inhibitory effects of chromium(VI) and Remazol Black B on chromium(VI) and dyestuff removals by Tramates versicolor. Enzyme and Microbial Technology, 40;1167-1174.
Ertuğrul, S., Takaç, S. and Dönmez, G.2007. Isolation of lipase producing Bacillus sp. from olive mill wastewater and improving its enzyme activity. Journal of Hazardous Materials; 149; 720-724.
Ulusal Hakemli Dergilerde Yayınlanan
Ertuğrul, S. ve Dönmez, G.2007. Tekstil Atıksuyu Kaynaklı Bakterilerin Boya ve Boyar Madde Arıtımında Kullanımı, Ankara Üniversitesi Çevre Bilimleri Dergisi, Cilt 1, Sayı 2, Sayfa 75-82.
